Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli

Шумков, Михаил Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli"

OUJu^-1------//а правах pyxormjii

ШУМКОВ Михаил Сергеевич

ПОЛИАМИНЫ КАК ФАКТОР МНОЖЕСТВЕННОЙ СТРЕССОРНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ESCHERICHIA COLI

03 00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 МАЙ 2007

Пермь - 2007

003059998

Работа выполнена в лаборатории адаптации микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Ткаченко Александр Георгиевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Пшеничнов Роберт Алексеевич доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна

Ведущая организация:

Институт биохимии им А Н Баха РАН, Москва

Защита состоится 2007 г в -^часов на заседании

диссертационного совета Д 004 019 01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу 614081, Пермь, ул Голева, 13 Факс (342) 244 67 11

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН http //www íegm ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Автореферат разослан "

QM^ß-eAJt' 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, чл -корр РАН

Ившина Ирина Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Исследования в области микробиологии и молекулярной биологии обеспечили значительный прогресс в изучении генов и закодированных в них белков, участвующих в адаптации микроорганизмов к различным видам стресса Вместе с тем, вопрос о механизмах, лежащих в основе регуляции стрессорных реакций, во многом остается малоизученным В частности, недостаточно полно исследована роль нормальных продуктов обмена веществ в тонкой настройке адаптивного ответа клетки Среди факторов метаболической природы в последние годы особенно возрос интерес к биогенным полиаминам Имеются данные об их влиянии на клеточные процессы про- и эукариот Известно, что полиамины не только участвуют в регуляции нормального клеточного цикла (Yoshida et al, 2004; Igarashi, 2006), но и выполняют важные функции в канцерогенезе (Tatib et al, 1998, Sandgren, Belting, 2003) На основании широкого спектра генов, регулируемых полиаминами, в последнее время выделена отдельная структурная единица, объединяющая их в единую регуляторную систему -полиаминовый модулон (Yoshida et al, 2004) Особенности молекулярной структуры полиаминов определяют их способность взаимодействовать с отрицательно заряженными компонентами клетки (Kashiwagi et al, 1986). Имеются данные о специфическом влиянии полиаминов на транскрипцию некоторых генов (Lindemose et al, 2005) и их участии в регуляции вторичной структуры тРНК, рРНК и мРНК (Igarashi, Kashiwagi, 2000) Эти свойства полиаминов, а также влияние, которое они оказывают на адаптацию клеток Escherichia coh к осмотическому, тепловому и другим видам стрессовых воздействий (Ткаченко и др, 1997, 1998, Ткаченко, Федотова, 2007), обосновывают необходимость изучения их роли при переходе бактериальной культуры к стационарной фазе роста и углеводному голоданию, в адаптации к кислотному стрессу и действию антибиотиков

Цель настоящей работы - изучение роли полиаминов в формировании множественной стрессорной устойчивости клеток Е coh Основные задачи исследования: 1 Исследовать влияние полиаминов на экспрессию rpoS в условиях перехода культуры Е coll к стационарной фазе роста и голоданию по глюкозе

'Л

2 Оценить роль полиаминов в повышении устойчивости Е coli к действию органических кислот

3 Изучить влияние различных стрессовых воздействий на уровень антибиотикорезистентности клеток Е coli

4 Исследовать изменения экспрессии rpoS и внутриклеточного содержания полиаминов в условиях воздействия на клетки Е coli различных антибиотиков

5 Оценить возможность участия полиаминов в регуляции пориновой проницаемости клеточной стенки Е coli в условиях добавки антибиотиков

Научная новизна. Установлено, что полиамины принимают участие в формировании адаптивного ответа Е coli при переходе к стационарной фазе роста и углеводному голоданию, в условиях воздействия органических кислот и антибиотиков Впервые показано участие полиаминов в ингибировании протеолиза и выявлена их положительная модулирующая активность в отношении экспрессии rpoS на уровнях транскрипции, трансляции и стабильности белка С помощью сконструированного полиаминзависимого мутанта Е coli, несущего rpoS lacZ слияние, установлено усиление стимулирующего эффекта полиаминов на уровень экспрессии rpoS в ряду кадаверин—>путресцин—>спермидин На основании различий регуляторных эффектов полиаминов продемонстрирована их функциональная специализация в реализации адаптивных функций в условиях стресса Показано, что путресцин и спермидин играют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, в то время как кадаверин выполняет функции ингибитора поринового транспорта

Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы диссертации используются в лекционном курсе «Адаптация микроорганизмов к стрессу» на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета На их основе возможна разработка рекомендаций по профилактике развития сопряженной с антибиотикотерапией множественной лекарственной устойчивости микроорганизмов

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Полиамины выполняют функции положительных модуляторов экспрессии rpoS, обеспечивая адаптацию клеток Е coli к действию

органических кислот, в условиях перехода к стационарной фазе роста и голодания по глюкозе

2 Резистентность клеток Е coli к действию фторхинолоновых антибиотиков возрастает в условиях кислотного, осмотического и теплового стрессов

3. Полиамины повышают устойчивость Е coli к действию ß-лактамных и фторхинолоновых антибиотиков, транспортируемых в цитоплазму через пориновые каналы, но не задействованы в адаптации к аминогликозидам, проникающим в клетку путём диффузии через липидный бислой

4 В клетках Е coli, подвергнутых действию ß-лактамных и фторхинолоновых антибиотиков путресцин и спермидин выполняют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, тогда как у кадаверина преобладают функции ингибитора транспортной активности пориновых каналов

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на V и VI международных конференциях «Проблемы загрязнения окружающей среды», Волгоград-Пермь, 2001, Пермь-Казань-Пермь, 2005, 6-ой, 8-ой, 9-ой и 10-ой Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 2002, 2004, 2005 и 2006, Межрегиональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002 По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, заключения и выводов Работа иллюстрирована 4 таблицами и 31 рисунком. Список литературы включает 251 наименование, из них 15 отечественных и 236 зарубежных авторов

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Механизмы адаптации микроорганизмов к стрессу», индекс приоритетного направления 5 19, 5 21, 5 24, номер госрегистрации 01 2 01 2 00 3 06932 Работа дополнительно финансируются в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН

«Молекулярная и клеточная биология», а также поддержана грантами РФФИ (04-04-97501, 05-04-48091, 04-04-96062, 07-04-96003) и департаментом Пермского края по науке и образованию

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования использованы культуры различных штаммов Escherichia coli (табл 1), которые выращивали в синтетической питательной среде М-9 или LB бульоне при 37°С Биомассу клеток оценивали по оптической плотности (OD60o) Влияние кислотного стресса на культуру Е cok изучали при внесении в среду сукцината, формиата и ацетата натрия Антибиотики (левофлоксацин, пефлоксацин, цефотаксим, цефазолин, ампициллин и нетромицин) добавляли в сублетальных концентрациях, использование которых приводило к 30-50%-ному подавлению накопления биомассы в культуре Е coli после 2 часов культивирования Уровень экспрессии генов rpoS и osmY исследовали с использованием их транскрипционных и трансляционных lacZ слияний и оценивали по активности ß-галактозидазы методом Миллера (Miller, 1992) Содержание полиаминов определяли тонкослойной хроматографией их дансшшрованных производных (Чудинов и др, 1984) и высокоэффективной жидкостной хроматографией с использованием хроматографа высокого давления LC-lOAvp (Shimadzu, Япония) Выделение плазмидной ДНК проводили традиционным методом щелочного лизиса (Харди, 1989) Трансформацию клеток Е coli плазмидой pBR322 осуществляли при действии теплового шока в среде с СаСЬ (Маниатис и др , 1984) Транспортную активность пориновых каналов внешней мембраны Е coli определяли в соответствии с модифицированным вариантом метода Циммермана и Росселета (Nikaido et al, 1983) Минимальную ингибиторную концентрацию антибиотиков выявляли микрометодом серийных разведений в соответствии с методическими рекомендациями (Методические указания МУК 4 2 1890-04) Концентрацию ацетата определяли колориметрическим методом Роуза (Rose, 1955)

Таблица 1

Штаммы Е. colt и плазмиды, использованные в работе

Штамм,

Генотип Источник

плазмида

Штамм

R0200 MC4100(\RZ5 rpoS742 lacZ) Muffler et al,

R090 MC4100(A.RZ5 ,rpoS3 79 /acZfhybr]) 1997

R091 MC4100(>.RZ5 .rpoS742 lacZ{hybr])

(pBR322)

МС4100 F- A(arg-lac)U169 araD139 rpsL150 ptsF25 flbB5301 rbsR deoC relAl

MC4100DE3Y MC4100, но DE3 osmY lacZ Chen et al, 2003

pSOPR трансформирован плазмидой pSOPR

HS1600DE3Y MC4100DE3 rpoS13 TnlOosmY lacZ Chen, Schellhorn,

pRPOS 2003

М2073 GC4468 (Str-R) mar* marR lacZ Martin, Rosner,

(pBR322) 2002

M2076 N7840 (ДmarRAB ) marR lacZ mar, rob*, sox*, (Str-R)

N7840 GC4468 (Str-R) mar, rob*, sox*, (Kan-R)

HT306 thr-1, araC14, AspeD98, A(gpt-proA)62, lacYl, gin V44(AS), galK2(Ос), X, AfSpeB-SpeA)97, A(SpeC-glcB)63, rpsL25(strR), xylA5, mtl-l, thi-1, ampCp-1, cadA2 Tabor et al, 1980

SHT03 HT306, но lacZ DE3 (XRZ5 rpoS742 lacZ[hyhr]) Данная работа

SHT25/2 HT306, но lacZ DE3 (A.RZ5 rpoS742 lacZ)

Плазмида

pBR322 43 61-bp rep и гор из pMBl Ыа из ТпЗ let из pSClOl БНИИСПГУ

pRPOS 1298-bp ЕсоШ фрагмент из pGCl, Chen, Schellhorn,

клонированный в рЕТ21, Т71ас промотор 2003

в ориентации гена rpoS

pSOPR рЕТ21, содержащая 1042-bp £coRI фрагмент из pGC2a в ориентации, противоположной Т71ас промотору Chen et al, 2003

Примечание Название плазмиды, заключенное в скобки (табл 1), означает использование в экспериментах как плазмидного, так и бесплазмидного штаммов

Автор выражает искреннюю благодарность Роберту Дж Мартину из Национального института здоровья (Бесезда, США) за предоставленные штаммы Е coli М2073, М2076 и N7840, Регине Хенгге из берлинского университета (Берлин, Германия) за предоставленные штаммы Е coli R0200, R090 и R091, Герберту Тэйбору из Национального института здоровья

(Бесезда, США) за штамм НТ306, а также Хербу Шеллхорну из университета МакМастер (Гамильтон, Канада) за штаммы Е coli HS1600DE3Y pRPOS и MC4100DE3Y pSOPR

Статистическая обработка результатов исследований проведена с использованием пакетов стандартных программ Statistica for Windows 5,0 (StatSoft, Inc , 1995) и Statistica 6,0 (StatSoft, Inc, 2001). Приведены средние данные из серии однотипных экспериментов (не менее трех) Вертикальными отрезками на рисунках обозначены величины среднего квадратического отклонения (о), в таблицах данные также представлены в формате среднее±а Оценка статистической значимости различий сравниваемых групп произведена с использованием непарного и парного t-критериев Стьюдента Для множественных сравнений использовали критерий Ньюмена-Кейлса или вводили поправку Бонферрони Различия считали значимыми при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование полиаминов как фактора регуляции экспрессии rpoS при переходе культуры Escherichia coli в стационарную фазу роста. Исчерпание источника питания, накопление конечных продуктов метаболизма или иные факторы, действующие на бактериальную культуру в природной среде, нередко приводят к прекращению роста и переходу культуры в стационарную фазу Причины этого разнообразны, но все они активируют единый механизм множественной стрессорной устойчивости (Jenkins et al, 1988, Matin, 1991), в основе которого лежит изменение содержания в клетке (Дсубъединицы РНК-полимеразы, кодируемой геном rpoS (Lange, Hengge-Aronis, 1991) Реакция os на многие сигналы возможна, благодаря сложной системе ее регуляции, в которой участвует большое число разнообразных факторов, в том числе нормальных продуктов метаболизма, таких как полиамины

Исследование роли полиаминов в регуляции экспрессии rpoS проведено с использованием штаммов Е coli, позволяющих определить вклад транскрипции (R0200), трансляции (R090) и стабильности белка (R091) в накопление os в клетке Несмотря на то, что на уровне транскрипции стимулирующего действия путресцина не обнаружено, он оказывал существенный статистически значимый положительный эффект на трансляцию и стабильность белка as как в лимитированных по глюкозе, так и нелимитированных культурах Е coli (табл 2)

Таблица 2

Модулирующий эффект путресцииа в отношении экспрессии rpoS Е. coli на уровнях транскрипции (R0200), трансляции (R090) и белковой стабильности (R091) в зависимости от содержания глюкозы в среде

Добавка Конц-ия Уровень индукции rpoS Е coli

путресцииа (5 мМ) глюкозы в среде, % R0200 R090 R091

0,13 1,8±0,26 1,6±0,08 3,9±0,74

0,4 2,0±0,32 1,9±0,12 3,5±0,77

+ 0,13 1 ,б±0,07 1,8±0,19 4,5±0,57

0,4 1,8±0,09 1,8±0,10 5,7±2,17

Эффект путресцииа, % от контроля 0,13 0,4 отсутствует отсутствует 11,2* отсутств 17,0* 64,8*

Стимулирующий эффект путресцииа рассчитан по средним значениям уровня индукции гроБ * - статистически значимые различия экспрессии гроБ в культурах Е сок, содержащих и не содержащих путресцин

Примечание Уровень индукции - отношение максимальной величины р-галактозидазной активности в стационарной фазе роста к ее минимальной величине в начале экспоненциальной фазы

Приведенные данные были получены с использованием штаммов, способных к нормальному синтезу полиаминов, что затрудняло выявление эффекта этих соединений ввиду присутствия в клетках их существенного эндогенного пула и послужило причиной для проведения серии экспериментов на сконструированных нами полиаминдефицитных мутантах Е coli, несущих rpoS lacZ генные слияния

При таком подходе действие экзогенных добавок полиаминов на экспрессию rpoS было обнаружено не только на уровнях регуляции трансляции и стабильности а8, но и при транскрипции этого гена (табл 3) Характерная прямая зависимость экспрессии rpoS от концентрации добавленных полиаминов (см табл 3) при повышении их концентраций выше 10 мкМ сменялась эффектом насыщения На основании неравнозначного влияния эквимолярных количеств полиаминов на экспрессию rpoS в экспоненциальной фазе роста (рис 1) можно прийти к заключению об усилениии их регуляторного эффекта в ряду кадаверин—>путресцин—> спермидин

Таблица 3

Роль полиаминов в регуляции экспрессии rpoS периодических культур полиаминдефицитных штаммов Е. coli, несущих транскрипционное (SHT25/2) и трансляционное (SHT03) rpoS::lacZ генные слияния

Штамм Полиамин Степень стимуляции экспрессии rpoS ('%) в зависимости от концентрации полиаминов, мкМ

0,2 1 5 10 50 100

Путресцин 10±2 25±1 54±13 61±13а

SHT25/2 Кадаверин 32±8 53±5 53±Юа 61±13

Спермидин 5±2* 40±1 84±5 83±5а

Путресцин 48±4 125±16 188±26

SHT03 Кадаверин 76±1 95±8 102±9 а 117±8

Спермидин 16±8 49±7 106±12 107±15а

* - отсутствие статистически значимых различий с контролем,а - отсутствие различий с группой с добавлением меньшей концентрации полиаминов

Рис 1 Роль эквимолярных концентраций полиаминов в регуляции экспрессии rpoS периодической культуры полиаминдефицитного штамма Е. coli SHT03.

1-10 мкМ спермидина, 2-10 мкМ путресцина, 3-10 мкМ кадаверина Стрелка обозначает момент внесения полиаминов

Таким образом, путресцин, кадаверин и спермидин оказывают статистически значимый, концентрационно-зависимый эффект на экспрессию rpoS, сменяющийся эффектом насыщения Отсутствие статистически значимых различий степени стимуляции экспрессии rpoS в культурах Е coli SHT25/2 и SHT03 при внесении одинаковых концентраций

спермидина (см табл 3) свидетельствует о его преимущественном участии в регуляции транскрипции rpoS, в то время как путресцин и кадаверин проявляют индуцирующую активность как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях

Исследование роли полиаминов в адаптации клеток Е. coli к кислотному стрессу. Рост периодической культуры Е coli на синтетической среде с глюкозой сопровождается постепенным ее закислением вследствие накопления продуктов обмена, среди которых доминируют органические кислоты, в первую очередь, ацетат, сукцинат и формиат (el-Manci, Holms, 1989) Внесение сукцината в культуру Е coli в экспоненциальной фазе роста вызывало выраженное зависимое от концентрации возрастание экспрессии rpoS (рис 2) на уровнях трансляции (до 50%) и стабильности белка (до 300%) Добавки ацетата и формиата приводили к аналогичному эффекту, что согласуется с данными литературы (Schellhorn, Stones, 1992, Hengge-Aroms, 2002)

Сукцинат, мМ

Рис. 2 Влияние сукцината на экспрессию гроБ на уровнях транскрипции (1), трансляции (2) и стабильности белка Яров (3) в экспоиециалыюй фазе роста.

* - статистически значимые отличия от контроля, ** - статистически значимые отличия от предыдущей концентрации сукцината

Исследование роли путресцина в регуляции экспрессии гроЗ в

условиях кислотного стресса, индуцированного внесением сукцината,

показало отсутствие его стимулирующего влияния на транскрипцию и

трансляцию гроЗ. Однако на уровне стабильности белка путресцин обеспечивал статистически значимое повышение экспрессии (рис. 3) до 100% и более В условиях добавки ацетата он вызывал принципиально сходный эффект.

140

120

12 3 12 3 12 3

А Б В

Рис. 3. Роль путрсснина в регуляции экспрессии rpoS на уровне стабильности белка в экспоненциальной фазе роста Е. coli R091 при кислотном стрессе, индуцированном добавкой су кии пата.

/ - стимулирующий эффект путресцина в концентрации А - 5 мМ, Ь - 10 мМ, В - 15 мМ; 2 - влияние 5 мМ сукцината; 3 - совокупный эффект путресцина в тех же концентрациях и 5 мМ сукцината. * - статистически значимые отличия от культуры с добавкой путресцина, ** - отличия от культуры с добавлением сукцината.

Таким образом, в присутствии различных органических кислот полиамины воздействуют на экспрессию rpoS по единому механизму, обусловленному положительной модуляцией стабильности os.

Выраженная индукция rpoS при действии ацетата в экспоненциальных культурах Е. coli вызывала падение общего пула путресцина (в клетках и среде) и внутриклеточного содержания спермидина (рис. 4). В отличие от этого, искусственное отключение экспрессии rpoS, регистрируемое по снижению уровня экспрессии RpoS-зависимого гена osmY, индуцировало возрастание концентрации путресцина и спермидина в клетке по сравнению с контролем (рис, 5). Добавка путресцина в контрольную культуру вызывала концентрационно-эависимое возрастание экспрессии гена-мишени,

подтверждая стимулирующее воздействие этого диамина на экспрессию гроЗ (см, рис. 5).

Рис. 4. Изменение содержания гсолиамннов в эксноненциалыю растущих клетках Е. coli штаммов R0200, R090 и R091 при добавке ацетата.

А - контроль, без ацетата, Б - культуры с добавкой 50 мМ ацетата. 1 - внутриклеточная концентрация путресцина, 2 спермидина, 3 -накопление путресцина в среде. * - статистически значимые различия содержания полиаминов в культурах с добавкой 50 мМ ацетата (Б) s сравнении с контролем (А).

Показанная отрицательная корреляция уровня экспрессии rpoS и накопления путресцина и спермидина в клетках (г=-0,54 и г=-0,76, соответственно) свидетельствует в пользу существования у Е. coli механизма кислотоустойчивости, связанного с деградацией полиаминов. Это согласуется с тем, что гены, кодирующие белки, ответственные за катаболизм путресцина, gabDTPC (Schellhorn el al., 1998; Baca-DeLancey ei al,, Î999), включены в оперон, находящийся под контролем (^-зависимых промоторов, что может приводить к их индукции в стрессорных ситуациях, повышающих содержание os в клетке, в том числе - в условиях действия органических кислот (Metzner el al., 2004),

Таким образом, в условиях кислотного стресса добавка путресцина, посредством положительной регуляции содержания as, индуцирует гены собственного катаболизма, продукты которых участвуют в регуляции клеточного рП и поддержании гомеостаза полиаминов в клетке.

240

U <

160 i

12 3 4

5 6

7 8

Рис. 5. Влияние отключения rpoS на экспрессию гена-мишени ostn }' и содержание полиаминов в -экспоненциально растущих клетках Е. coli MC410ÖDE3Y pSOPR.

Уровень экспрессии osmY: У - в контрольной культуре, 2 - при отключении rpoS, 3 - а контрольной культуре с добавлением 5 мМ путресцина, 4 - то же с 10 мМ путресцина. Внутриклеточное содержание путресцина: 5 - r контрольной культуре, 6 - при отключении rpoS, Внутриклеточное содержание спсрмидина: 7 - в контрольной культуре, 8 - при отключении rpoS. * - статистически значимое отличие от контрольной культуры.

На основе собственных данных и анализа литературы может быть представлена следующая обобщённая схема, описывающая участие полиаминов в кислотоустойчивое™ Е, coli (рис. 6). Органические кислоты индуцируют экспрессию rpoS, что способствует активации систем деградации путресцина до у-аминобутирата (Metzner et al., 2004). При переамин ирован и и последнего а-кетоглутарат превращается в глутамат, вступающий в реакцию дскарбоксилирования (Jung, Kim, 2003а), которое осуществляется при участии двух изоферментов GadAB и сопровождается связыванием протонов из цитоплазмы, составляя основу защиты Е. coli от кислотного стресса на минимальных питательных средах. При этом добавка экзогенного путресцина как положительного модулятора rpoS и субстрата для деградации усиливает описанные процессы. Прекращение действия кислотного стресса способствует замедлению деградации путресцина. Поскольку глутамат является отправной точкой пути образования орнитина, его поток из реакции декарбоксилирования направляется на синтез

путресципа, вследствие чего происходит восполнение пула полиаминов в клетке к обеспечивается гомеостатичеекая регуляция их внутриклеточного содержания.

Рис. 6. Схема регуляции внутриклеточного pH Е. colU включающая пути катаболизма и биосинтеза пу тресни на.

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот. Пояснения даны в тексте.

Исследование пол нами нов как фактора множественной антибиотикоустойчивости Е. coli. В последнее время в литературе появляются данные, указывающие на возможность участия <т -субъединицы РНК-полимеразы в формировании множественной лекарственной устойчивости Е. coli (Greenway, England, 1999; Rami et ai, 2005; Murakami et al., 2005). Результаты наших экспериментов с использованием генетических конструкций, позволяющих управлять экспрессией rpoS, свидетельствуют, что продукт данного гена, os-субъединица РНК-полимеразы принимает участие в формировании множественной антибиотикоустойчивости (рис. 7).

В условиях осмотического (рис. 8), теплового и кислотного стрессов (рис. 9), приводящих к повышению содержания о5-субъ единицы РНК-полимеразы в клетке (Hengge-Aronis, 2002), наблюдается увеличение резистентности Е. coli к действию фторхинолоновых антибиотиков в 2-4 раза по сравнению с контролем. В то же время, минимальные ингибиторные концентрации (МИК) ß-лактамных антибиотиков не изменяются.

4-кратное возрастание МИК левофлоксанина но мере снижения pH (рис. 10) сопровождалось увеличением внутриклеточной концентрации кадаверина, в 4 раза более высоким (при рН=5,5) в условиях добавки левофлоксацина (см. рис. 10). Это послужило основанием для предположения о том, что в отсутствие кислотного стресса антибиотики также способны индуцировать накопление полиаминов, что обеспечивает более высокую антибиотикоустойчивость бактериальной клетки.

Путь биосинтеза путресципа

s -

8 о

0.00

12 3 4 12 3 4 RpoS- RpoS+

Рис, 7 Зависимость резистентности Е. coli HS16U(lDE3Y pRPOS к левофлоксацнну (/), нефотаксиму (2), цефазолнну (i) и нетромицииу (4) от индукции rpoS.

Примечание-, микроорганизмы культивировали в колбах на среде М-9. Экспрессию rpoS индуцировали добавлением к одной из культур 0,3 мМ ИПТГ (RpoS+), вторую оставляли интактной (RpoS-). По достижении максимальной индукции rpoS клетки освобождали от среды и использовали для определения МИ К с добавкой ИПТГ к индуцированным клеткам.

4 Л ii к

s ¡

и *

2 5 S &

я ж ж

1 ; S

ÍÍ

с И

0,40- ■ 1,8

0,35 0,30 • 1,5 Ц Я >

0,25- ■1,2 'Í

0,20 0,15 ■ ■0,9 * о 8 0,6 f

0,10 ■ 0,05 1 « К ■0,3 S

0,00 ■ -J.ri.rw. 0.0

f г

12 f 2 12 ЛФЛ ПФЛ ЦФТ ЦФЗ Рис 8. Изменение чувствительности Е. coli М2073 к антибиотикам в условиях осмотического стресса, вызванного внесением 0,25 М NaCL

! - контрольная культура, 2 - культура в условиях осмотического стресса; ЛФЛ - левофлоксацин, ГТФЛ - пефлоксацин, ЦФТ - цефотаксим, ЦФЗ -цефазолик.

•х

S «

sc к

о t

3 S

0,05

0,04

0,03

0,02

0,01

0,00

1 2 Контроль

12 3 4 Этанол 4%

Рис. 9. Изменение чувствительности Е. coli к левофлоксацину в условиях теплового (4% этанола) и кислотного (рН=5,8) стрессов и добавки путресцина (ПТ),

/ Е. coli М2073, 2-Е. coli М2076, 3 - Е. coli М2073 + 5 мМ ПТ, 4 - Е. coli М2076 + 5 мМ ПТ. Контроль - отсутствие стрессового воздействия.

7 А 7,0 6.6 6.4

5,5 pH

Рис. 10, Резистентность Е. coli M2Ö73 к левофлоксацнну (jf) и изменение содержании кадаверина в клетках в отсутствие (1) и в присутствии (2) антибиотика в зависимости от pH среды,

* - статистически значимое отличие указанной группы от контроля.

Примечание: культуры микроорганизмов взяты для анализа из лунок иммунологических планшетов в экспериментах по определению МИК.

Результаты исследований показали статистически значимое возрастание внутриклеточных концентраций полиаминов в ответ на добавку р-лактампых и фторхинолоновых антибиотиков в отсутствие других стрессовых воздействий (рис. 11), При этом достижение максимального внутриклеточного уровня путресцина и спермидина наблюдалось уже на 2-ой час после добавки антибиотиков и существенно опережало по времени возрастание концентрации кадаверина, которое отмечено к 6-му часу после добавки (см. рис. 11). Максимальная индукция экспрессии гроЗ в ответ на добавку фторхинолоновых и р-лактамных антибиотиков наблюдалась уже к 4-му часу после их внесения (рис. 12), то есть следовала за возрастанием концентраций путресцина и спермидина и предшестовала накоплению кадаверина. Это свидетельствует о функциональной специализации полиаминов в механизме формирования устойчивости к антибиотикам.

спермидин путресцин кадаверин

Рис. 11. Изменение внутриклеточного содержании полиаминов в условиях воздействия сублетальных концентрации антибиотиков на культуры Е. coli R0200 и R091 в среде LB.

1 - контроль, без антибиотика, 2 - 0,7 м кг/мл цефотаксима; 3 - 8 мкг/мл цефазолина; 4-120 мкг/мл ампициллина; 5 - 0,012 мкг/мл лееофлоксацина; 6 - 0,038 мкг/мл пефлоксацима; 7 - 0,08 мкг/мл нстромииина. Светлые столбцы - через 2 часа после добавки антибиотика, тёмные - через 6 часов. * - статистически значимое отличие от контроля; + - отличие от той же группы, взятой через 2 часа после добавки антибиотика.

1 2 3 4 5 6

Рис. 12, Изменение экспрессии rpoS в культуре Е. coli R091 через 2 (светлые сгилбцы), 4 (тёмные столбцы) и 6 (заштрихованные столбцы) часов после внесения антибиотиков в среду культивнрааанмн (I.R-бульон).

1 - контроль, без добавок; 2 - 0,7 мкг/мл цефотаксима; 3 - 8 мкг/мл цефазолина; 4 - 120 мкг/мл ампициллина; J - 0,012 мкг/мл левофлоксацина; 6 0,038 мкг/мл пефлоксацима; 7 — 0,08 мкг/мл нетромицина. * - отсутствие статистически значимых различий данной группы с контролем; + -отсутствие различий с данной группой, взятой на второй час; А - отсутствие различий с данной группой в предыдущий период времени.

Фторхинолоны по структуре близки к сигнальным молекулам системы ощущения кворума, относящимся к классу 4-хинолонов (Pesci et al., 1999), которые могут воздействовать на экспрессию rpoS (Diggle et al,, 2003; Yang et al., 2006). Этот механизм, по-видимому, лежит в основе индукции rpoS (см. рис. 12), положительно модулируемой пузресцином и спермидином, что повышает экспрессию генов-мишеней г/)о5-регулона, в том числе Idc, кодирующего ли зинде карбоне и лазу (Kikuchi et al., 1998). Накопление кадаверина снижает транспортную активность пориновых каналов Е. coli (рис. 13) и, замедляя проникновение антибиотиков в клетку (рис. 14), способствует повышению лекарственной устойчивости (см. рис. 10).

Добавка к культуре Е. coli ß-лактамных антибиотиков, как и внесение фторхи полонов, вызывала изменение внутриклеточных концентраций полиаминов, причём их временная динамика была выражена более ярко (см. рис. 11). Вместе с тем, статистически значимое влияние антибиотиков этой группы на содержание <rs в клетке отмечается лишь в первые часы после их

добавки (см рис 12) Это дает основание утверждать, что RpoS-зависимый

механизм адаптации Е сок к ß-лактамным антибиоткам не является

основным и действует наряду с каким-то иным, не связанным с os, но

включающим участие полиаминов 1501

£ о

ш -о

О о4

* -Г

s «

& к

О S"

С g

о 5

S 33

125

100

0 50 100 200 300 Концентрация кадаверина, мМ Рис 13 Зависимость активности поринового транспорта от концентрации экзогенного кадаверина в культуре Е. coli М2073 pBR322.

Показаны средние значения коэффициентов проницаемости, выраженные в процентах по отношению к контролю (транспорт в отсутствие кадаверина)

Рис 14 Изменение активности поринового транспорта при действии антибиотиков в культуре Е. coli R091 pBR322 в среде LB. 1 -

контроль, без добавок, 2 - добавка 0,038 мкг/мл пефлоксацина * -статистически значимые отличия от контрольной культуры

Нстромицин, в отличие от других исследованных антибактериальных препаратов, не только не приводил к возрастанию внутриклеточных концентраций полиаминов (см рис 11), но и вызывал статистически значимую репрессию rpoS (см рис 12) Адаптация бактериальной клетки к действию этого антибиотика, очевидно, осуществляется без участия полиаминов

Таким образом, полиамины принимают участие в формировании устойчивости Е coli к действию фторхинолоновых и ß-лактамных антибиотиков При этом наблюдается специализация их функций, когда путресцин и спермидин преимущественно играют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, а кадаверин, в первую очередь, выполняет функции ингибитора поринового транспорта

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о значительной роли полиаминов в формировании множественной стрессорной устойчивости Е coli В условиях перехода культур Е coli к стационарной фазе роста и глюкозному голоданию путресцин, кадаверин и спермидин оказывают стимулирующий эффект на экспрессию rpoS Для спермидина он проявляется преимущественно в регуляции транскрипции, для путресцина и кадаверина - на уровнях трансляции и стабильности белка По возрастанию стимулирующего эффекта на экспрессию rpoS исследованные полиамины можно расположить в ряд кадаверин—»путресцин—►спермидин В условиях кислотного стресса, когда действие продуктов метаболизма Е coli, ацетата, формиата и сукцината, индуцирует процесс трансляции мРНК rpoS и приводит к повышению стабильности RpoS, полиамины препятствуют протеолизу as. На основании полученных результатов и данных литературы предлагается схема, иллюстрирующая участие полиаминов в адаптации Е coli к кислотному стрессу на минеральной среде с глюкозой Формирование адаптивного ответа Е coli на различные стрессорные воздействия сопровождается повышением антибиотикоустойчивости, происходящем при участии кадаверина, накапливающегося в клетке в результате активации синтеза as Этот же механизм функционирует при действии ß-лактамных и фторхинолоновых антибиотиков в отсутствие других видов стресса При этом наблюдается специализация функций

различных полиаминов в реализации ими защитных механизмов Путресцин и епермидин преимущественно играют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, тогда как кадаверин блокирует пориновую проницаемость клеточной стенки Е coli, что позволяет рассматривать сДзависимую систему его синтеза как механизм формирования устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.

Таким образом, изучение роли полиаминов в условиях стационарной фазы роста, приспособлении к углеводному голоданию, действию антибиотиков и слабых кислот свидетельствует об их участии, по меньшей мере, в двух адаптивных механизмах: (1) регуляции уровня экспрессии rpoS при действии спермидина и путресцина, (2) ограничении пориновой проницаемости внешней мембраны Е coli посредством блокирования работы поринов при участии кадаверина Тесное взаимодействие RpoS, как глобального регулятора общего стрессового ответа, и полиаминов, регуляторная активность которых лежит в основе функционирования полиаминового модулона, предоставляет бактериальной клетке широкий спектр адаптивных возможностей и позволяет выработать адекватные приспособительные реакции в ответ на разнообразные стрессорные воздействия

ВЫВОДЫ

1 Установлено, что полиамины оказывают стимулирующий эффект на экспрессию rpoS в клетках Е coli при переходе к стационарной фазе роста и в условиях голодания по глюкозе на уровнях регуляции транскрипции, трансляции и стабильности белка При этом величина стимулирующего эффекта полиаминов возрастает в ряду кадаверин—»путресцин—»епермидин

2 Экспериментально показано, что путресцин стимулирует экспрессию rpoS, индуцированную кислыми продуктами обмена, на уровне белковой стабильности, что приводит к усилению RpoS-зависимой деградации полиаминов, которая играет роль в адаптации Е coli к кислотному стрессу

3 Выявлено, что воздействие кислотного, теплового и осмотического стрессов на клетки Е coli сопровождается возрастанием устойчивости бактерий к фторхинолоновым антибиотикам

4 Установлено, что ответная реакция Е coli на воздействие сублетальных концентраций ß-лактамньгх и фторхинолоновых антибиотиков включает

возрастание внутриклеточного содержания путресцина и спермидина, которые играют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, что не наблюдается при добавке аминогликозидов

5 Показано, что содержание кадаверина в клетках Е coli в условиях воздействия на них сублетальных концентраций фторхинолоновых и ß-лактамных антибиотиков находится под контролем (Асубъединицы РНК-полимеразы

6 Установлено, что кадаверин, в отличие от экспрессионных модуляторов путресцина и спермидина, преимущественно выполняет функции ингибитора транспортной активности пориновых каналов Е coli, повышая выживаемость бактериальных клеток в условиях воздействия фторхинолоновых и ß-лактамных антбиотиков

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Шумков М С , Ткаченко А Г , Нестерова JI.IO Роль полиаминов в транскрипционной регуляции csiD, гена адаптации Escherichia coli к стрессу углеводного голодания//В кн Проблемы загрязнения окружающей среды Тез.У Междунар конфер -Пермь, 2001. - С 107

2 Шумков М С, Нестерова JIЮ, Ткаченко А Г Путресцин как модулятор экспрессии rpoS и csiD генов адаптации Escherichia coli к стационарной фазе//В кн Биология - наука XXI века 6-я Пущинская школа-конфер молодых ученых - Пущино, 2002 - Т 1 - С 348

3 Шумков М С Путресцин как модулятор экспрессии rpoS гена адаптации Escherichia coli к различным типам стационарной фазы//В кн Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии Матер межрегион конфер молодых ученых - Пермь, 2002 - С. 73-75

4 Ткаченко А Г , Чудинов А А , Пшеничнов М Р , Нестерова Л Ю , Шумков М С Полиамины как регуляторы адаптивных ответов микроорганизмов на стресс углеводного голодания//В кн • Региональный конкурс РФФИ-Урал. Результаты научных исследований, полученные за 2001 г Аннотационные отчеты - Пермь, 2002 - С 108-111

5 Ткаченко А Г, Шумков М С, Чудинов А А Полиамины как регуляторы адаптивных ответов микроорганизмов на стресс углеводного голодания/УВ кн. Региональный конкурс РФФИ-Урал Результаты научных

исследований, полученные за 2002 г Аннотационные отчеты - Пермь, 2003 -С 229-233.

6 Ахова А В , Шумков М С Продукты обмена периодической культуры Escherichia coli как индукторы гена rpoS в условиях стационарной фазы//В кн Биология - наука XXI века 8-я Путинская школа-конфер молодых ученых - Пущино, 2004 - С 42

7 Шумков М С Путресцин как модулятор экспрессии гена rpoS в периодической культуре Escherichia coli в условиях добавки ацетата//Там же -С. 73

8. Ткаченко А Г., Шумков М С Роль путресцина в регуляции уровня as-субъединицы РНК-полимеразы в клетках Escherichia coli при переходе к стационарной фазе//Биохимия. - 2004 -Т 69, вып 8 - С 1079-1087

9 Ткаченко А Г, Шумков М С, Чудинов А А Полиамины как регуляторы адаптивных ответов микроорганизмов на стресс углеводного голодания//В кн Региональный конкурс РФФИ-Урал Результаты научных исследований, полученные за 2003 г. Аннотационные отчеты - Пермь, 2004 -С 204-212

10 Шумков М С , Ахова А.В Продукты обмена периодической культуры Escherichia coli как регуляторы экспрессии гена rpoS/ГВ кн Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии - Екатеринбург-Пермь УрО РАН, 2004 - С 47-59.

11 Шумков М С Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к кислотному стрессу//В кн.. Биология - наука XXI века 9-я Междупар Пущинская школа-конфер молодых ученых - Пущино, 2005 - С 105.

12 Ахова А В , Шумков М С , Чугаева Т А , Ткаченко А Г Полиамины как факторы адаптации Е coli к кислотному стрессу//В кн. Проблемы загрязнения окружающей среды- Матер. VI Междунар конфер - Пермь, 2005 - С 55

13. Ткаченко А Г., Шумков М.С , Ахова А.В Путресцин как модулятор содержания aS-субъединицы РНК-полимеразы в клетках Escherichia coli при кислотном стрессе//Биохимия - 2006. - Т 71, вып. 2 - С. 237-246 14 Шумков М С Путресцин как положительный модулятор экспрессии гена rpoS Escherichia coli//В кн Биология - наука XXI века 10-я Пущинская школа-конфер молодых ученых -Пущино, 2006 - С 221

15 Ткаченко А Г, Пожидаева ОН, Шумков М.С Роль полиаминов в формировании множественной антибиотикоустойчивости Escherichia coli в условиях стрессорных воздействий//Биохимия - 2006 - Т 71, вып 9 - С 1287-1296

16 Ткаченко А Г, Шумков М С , Чудинов А А Полиамины как факторы адаптации микроорганизмов к кислотному стрессу//В кн • Региональный конкурс РФФИ-Урал Результаты научных исследований, полученные за 2005 г Аннотационные отчеты - Пермь, Екатеринбург, 2006 - С 199-202

Подписано в печать 27 04 2007 Тираж 110 экз Формат 90X60/16 Уел печ л 1,5 Бумага ВХИ Набор компьютерный Заказ № 262-к/2007

Издательский дом "Пресстайм" Адрес. 614025, г Пермь, ул Героев Хасана, 105

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шумков, Михаил Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Адаптация клеток Escherichia coli к стационарной фазе роста. as-субъединица РНК-пол имеразы.

1.1.1. Общие механизмы адаптации микроорганизмов к стрессу.

1.1.2. & -субъединица РНК-пол имеразы.

1.1.3. Транскрипционная регуляция as.

1.1.4. Трансляционная регуляция rpoS.

1.1.5. Регуляция стабильности RpoS-белка.

1.1.6. Регуляция активности с

1.2. Механизмы адаптации Escherichia coli к кислотному стрессу.

1.2.1. Условия развитию кислотного стресса in situ.

1.2.2. Системы кислотоустойчивости Е. coli.

1.3. Механизмы множественной устойчивости Escherichia coli к антибиотикам, основанные на ограничении их поступления в клетку и активном выбросе.

1.3.1. Ограничение поступления ксенобиотков в клетку.

Структурные особенности поринов.

Регуляг^ыя пориноеого состава мембраны.

1.3.2. Активный выброс из клетки. Многоцелевые системы выброса и их регуляция.

1.4. Роль полиаминов в обеспечении процессов жизнедеятельности микроорганизмов.

1.4.1. Виды биогенных полиаминов. Пути регуляции их внутриклеточной концентрации.

1.4.2. Биосинтез и деградация полиамипов.

1.4.3. Физиологическая роль полиаминов.

Взаимодействие полиаминов с ДНК.

Влияние полиаминов на биосинтез нуклеиновых кислот.

Влияние полиаминов на белковый обмен.

Взаимодействие с мембранами и регуляция синтеза фосфолипидов „

Роль полиаминов врегуляг^ии транспортных процессов.

Роль полиаминов в адаптации к стрессу.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследовании.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Культивирование микроорганизмов.

2.3. Определение активности р-галактозидазы.

2.4. Определение содержания полиамипов в клетке и среде.

2.5. Выделение плазмидпой ДНК из клеток Е. coli.

2.6. Трансформация Е. coli плазмидпой ДНК.

2.7. Транспортная активность пориновых каналов.

2.8. Минимальная ингибиторная концентрация антибиотиков.

2.9. Определение концентрации ацетата.

2.10. Статистическая обработка.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГЛАВА 3. Полиамипы как фактор регуляции экспрессии rpoS при переходе культуры Escherichia coli в стационарную фазу.

3.1. Роль экзогенных полиамипов в регуляции транскрипции rpoS в зависимости от фазы роста периодической культуры Е. coli и глюкозного голодания.

3.2. Полиамипы как фактор посттранскрипциоппой регуляции rpoS.

3.3. Роль полиамипов в регуляции экспрессии rpoS п клетках полиаминдефицитпых мутантов Е. coli.

ГЛАВА 4. Роль полиамипов в адаптации Е. coli к кислотному стрессу

4.1. Влияние продуктов обмена Escherichia coli на экспрессию rpoS.

4.2. Зависимость экспрессии rpoSoт органических кислот как продуктов обмена Е. coli.

4.3. Полиамины как элемент системы адаптации клетки к кислотному стрессу, вызванному действием органических кислот.

4.4. Зависимость внутриклеточного содержания полиаминов от экспрессии rpoS.

ГЛАВА 5. Полиамипы как фактор устойчивости Е. coli к антибиотикам.

5.1. Роль полиаминов в формировании антибиотикорезистентности Е. coli в условиях стрессовых воздействий.

5.2. Зависимость внутриклеточного содержания полиамипов от действия антибиотиков.

5.3. Эффект антибиотиков па уровень экспрессии rpoS.

5.4. RpoS как фактор адаптации Е. coli к разным группа антибиотиков.„89 5.4. Ограничение проницаемости внешней мембраны Е. coli как механизм защиты от антибиотиков.

ГЛАВА 6. Обсуждение результатов.

6.1. Роль полиаминов в регуляции экспрессии rpoS при переходе культуры Escherichia coli в стационарную фазу.

6.2. Путресцип как фактор адаптации Escherichia coli к кислотному стрессу.

6.3. Полиамины как фактор развития множественной антибиотикоустойчивости Escherichia coli.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli"

Актуальность проблемы. Изучение процессов адаптации к неблагоприятным факторам среды в настоящее время является одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений физиологии микроорганизмов. Настоящая диссертационная работа посвящена исследованию приспособительных механизмов, задействовапых при переходе культуры Е. coli к стационарной фазе роста и голоданию по глюкозе как физологическим состояниям, с которыми бактерии часто сталкиваются в природных местообитаниях (Nystrom, 2004а; Shleeva et al., 2004). В адаптации к различным видам стресса бактерии нередко используют общие механизмы защиты (Hengge-Aronis, 2002). В частности, это справедливо для кислотного стресса (Foster, 2004). Способность Е. coli преодолевать низкие значения рН желудка и выживать в окружении слабых органических кислот в кишечнике определяет возможность её устойчивости к действию кислот, используемых в качестве консервантов в пищевой промышленности. В связи с этим, исследование механизмов приспособления микроорганизмов к неблагоприятному влиянию закисления среды приобретает практическое значение с точки зрения борьбы с кишечными инфекциями. Поскольку в поддержании гомеостаза внутриклеточного рН нередко принимают участие клеточные структуры, ответственные за антибиотикоустойчивость (Lewinson et al., 2004; Krulwich et al., 2005), это создаёт возможность длительной персистенции антибиотикорезистентных микрооргаиизмов в природных условиях даже в случае ограничения использования антибиотиков с целыо ослабления их селективного давления. Изучение механизмов, участвующих в формировании аптибиотикорезистептпости, в том числе, в условиях стрессорных воздействий, делает данную работу ещё более актуальной.

Исследования в области микробиологии и молекулярной биологии обеспечили значительный прогресс в изучении генов и закодированных в них белков, участвующих в адаптации микроорганизмов к различным видам стресса. Вместе с тем, вопрос о механизмах, лежащих в основе регуляции стрессорных реакций, во многом остается малоизученным. В частности, недостаточно полно исследована роль нормальных продуктов обмена веществ в тонкой настройке адаптивного ответа клетки. Среди факторов метаболической природы в последние годы особенно возрос интерес к биогенным полиамипам. Имеются данные об их влиянии на клеточные процессы про- и эукариот. Известно, что полиамины не только участвуют в регуляции нормального клеточного цикла (Yoshida et al., 2004; Igarashi, 2006), но и выполняют важные функции в канцерогенезе (Tatib et al., 1998; Sandgren, Belting, 2003). На основании широкого спектра генов, регулируемых полиаминами, в последнее время выделена отдельная структурная единица, объединяющая их в единую регуляторную систему -полиаминовый модулон (Yoshida et al., 2004). Особенности молекулярной структуры полиаминов определяют их способность взаимодействовать с отрицательно заряженными компонентами клетки (Kashiwagi et al., 1986). Имеются данные о специфическом влиянии полиаминов па транскрипцию некоторых генов (Lindemose et al., 2005) и их участии в регуляции вторичной структуры тРНК, рРНК и мРНК (Igarashi, Kashiwagi, 2000). Эти свойства полиаминов, а также влияние, которое они оказывают на адаптацию клеток Escherichia coli к осмотическому, тепловому и другим видам стрессовых воздействий (Ткаченко и др., 1997, 1998; Ткаченко, Федотова, 2007), обосновывают необходимость изучения их роли при переходе бактериальной культуры к стационарной фазе роста и углеводному голоданию, в адаптации к кислотиому стрессу и действию антибиотиков.

Цель настоящей работы - изучение роли полиамипов в формировании множественной стрессорпой устойчивости клеток Е. coli.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать влияние полиамипов на экспрессию rpoS в условиях перехода культуры Е. coli к стационарной фазе роста и голоданию по глюкозе.

2. Оценить роль полиамипов в повышении устойчивости Е. coli к действию органических кислот.

3. Изучить влияние различных стрессовых воздействий на уровень антибиотикорезистентпости клеток Е. coli.

4. Исследовать изменения экспрессии rpoS и внутриклеточного содержания полиаминов в условиях воздействия па клетки Е. coli различных антибиотиков.

5. Оценить возможность участия полиамипов в регуляции пориновой проницаемости клеточной стенки Е. coli в условиях добавки антибиотиков.

Научная новизна. Установлено, что полиамииы принимают участие в формировании адаптивного ответа Е. coli при переходе к стационарной фазе роста и углеводному голоданию, в условиях воздействия органических кислот и антибиотиков. Впервые показано участие полиаминов в ингибировапии протеолиза и выявлена их положительная модулирующая активность в отношении экспрессии rpoS на уровнях транскрипции, трансляции и стабильности белка. С помощью сконструированного полиаминзависимого мутанта Е. coli, несущего rpoS::lacZ слияние, установлено усиление стимулирующего эффекта полиамипов на уровень экспрессии rpoS в ряду кадаверин—>путресцип—>спермидин. На основании различий регуляторных эффектов полиамипов продемонстрирована их функциональная специализация в реализации адаптивных функций в условиях стресса. Показано, что путресцип и спермидип играют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, в то время как кадаверин выполняет функции ингибитора поринового транспорта.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Материалы диссертации используются в лекционном курсе «Адаптация микроорганизмов к стрессу» на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета. На их основе возможна разработка рекомендаций по профилактике развития сопряжённой с антибиотикогерапией множественной лекарственной устойчивости микроорганизмов.

Основные положения, выносимые па защиту.

1. Полиамины выполняют функции положительных модуляторов экспрессии rpoS, обеспечивая адаптацию клеток Е. coli к действию органических кислот, в условиях перехода к стационарной фазе роста и голодания по глюкозе.

2. Резистентность клеток Е. coli к действию фторхииолоновых антибиотиков возрастает в условиях кислотного, осмотического и теплового стрессов.

3. Полиамины повышают устойчивость Е. coli к действию (3-лактамных и фторхииолоновых антибиотиков, транспортируемых в цитоплазму через пориновые каналы, но не задействованы в адаптации к амипогликозидам, проникающим в клетку путём диффузии через липидпый бислой.

4. В клетках Е. coli, подвергнутых действию (З-лактамных и фторхииолоновых антибиотиков путресцин и спермидин выполняют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, тогда как у кадаверина преобладают функции ингибитора транспортной активности пориновых каналов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шумков, Михаил Сергеевич

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что полиамипы оказывают стимулирующий эффект на экспрессию rpoS в клетках Е. coli при переходе к стационарной фазе роста и в условиях голодания по глюкозе на уровнях регуляции транскрипции, трансляции и стабильности белка. При этом величина стимулирующего эффекта полиаминов возрастает в ряду кадаверин—>путресции—>спермидин.

2. Экспериментально показано, что путресцин стимулирует экспрессию rpoS, индуцированную кислыми продуктами обмена, па уровне белковой стабильности, что приводит к усилению RpoS-зависимой деградации полиамипов, которая играет роль в адаптации Е. coli к кислотному стрессу.

3. Выявлено, что воздействие кислотного, теплового и осмотического стрессов на клетки Е. coli сопровождается возрастанием устойчивости бактерий к фторхинолоновым антибиотикам.

4. Установлено, что ответная реакция Е. coli на воздействие сублетальных концентраций (З-лактампых и фторхиполоповых антибиотиков включает возрастание внутриклеточного содержания путресцина и спермидина, которые играют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, что не наблюдается при добавке аминогликозидов.

5. Показано, что содержание кадаверина в клетках Е. coli в условиях воздействия па них сублетальпых концентраций фторхинолоновых и [3-лактампых антибиотиков находится под контролем а8-субъедипицы РИК-полимеразы.

6. Установлено, что кадаверин, в отличие от экспрессионпых модуляторов путресцина и спермидина, преимущественно выполняет функции ингибитора транспортной активности пориновых каналов Е. coli, повышая выживаемость бактериальных клеток в условиях воздействия фторхиполоповых и р-лактамиых антбиотиков.

121

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что полиамины принимают активное участие в адаптации Escherichia coli к стационарной фазе, кислотному стрессу и действию антибиотиков.

В условиях стационарной фазы и глюкозного голодания путресцин, кадаверин и спермидии оказывают статистически значимый, зависимый от концентрации стимулирующий эффект на экспрессию rpoS. Для спермидина он проявляется преимущественно на уровне транскрипции, для путресцина и кадаверина - па всех уровнях регуляции. Действие полиамипов обнаруживается, начиная с уровня микромолярпых концентраций и сменяется эффектом насыщения. По убыванию стимулирующего эффекта эквимолярных концентраций исследованных полиаминов на экспрессию rpoS их можно расположить в ряд спермидин-путресцин-кадаверин.

Постепенное закисление среды в процессе периодического культивирования, связанное с накоплением в ней конечных продуктов метаболизма Е. coli, выступает в качестве фактора активации экспрессии rpoS. Среди составляющих культуральной жидкости наибольшая роль в этом процессе принадлежит слабым органическим кислотам. Формиат и сукцинат индуцируют процесс трансляции мРНК rpoS и повышают стабильность белка о о . Ацетат, кроме того, способен увеличивать уровень транскрипции исследуемого гена. В формирование адаптивного ответа в условиях кислотного стресса, вызванного этими органическими соединениями, существенный вклад вносят полиамипы. Они препятствуют протеолизу RpoS и участвуют в ^-зависимом механизме кислотоустойчивое™, который сопровождается их расщеплением.

Важным итогом участия полиамипов в формировании адаптивного ответа Е. coli в условиях стрессовых воздействий является повышение антибиотикоустойчивости как следствие накопления в клетке кадаверина, в основе которого лежит активация синтеза os. Этот же механизм функционирует при действии [З-лактамов и фторхинолонов в отсутствие других видов стресса. При этом наблюдается специализация функций различных полиаминов в реализации ими защитных механизмов. Путресцин и спермидин в условиях действия сублетальных концентраций антибиотиков преимущественно выполняют функции положительных модуляторов экспрессии rpoS; кадаверин обладает способностью блокировать пориновую проницаемость клеточной стенки Е. coli. Значительно более высокая резистентность Е. coli к действию антибиотиков при сверхэкспрессии rpoS и падение интенсивности пори ново го транспорта в условиях добавки фторхинолонов дают основание рассматривать (^-зависимую систему синтеза кадаверина как важный механизм формирования устойчивости микроорганизмов к антибактериальным веществам.

Таким образом, изучение роли полиаминов в приспособлении к стационарной фазе, углеводному голоданию, действию антибиотиков и слабых кислот показывает их участие по меньшей мере в трех адаптивных механизмах: 1) регуляции уровня экспрессии rpoS и генов rpoS-pe гул она при действии сперм и дина и путресцина; 2) ограничении норм новой проницаемости внешней мембраны Е. coli посредством блокирования работы пори нов при участии кадаверина; 3) формировании петли гомеостати ческой регуляции внутриклеточного содержания полиамипов, принимающей участие в оптимизации pi I цитоплазмы за счёт механизмов синтеза и деградации путресцина (рис, 31).

Рис. 31. Роль полиаминов is формировании адаптации Е. coli к стационарной фазе, кислотному стрессу и действию антибиотиков. 111 путресцин, СД спермидин. КД кадаверин. Стрелки стимулирующее воздействие, ромб репрессирующее. Объяснения в тексте. стационарная фаза разоощение энергетического и KoncTDVKTHBHoro метаболизма голодание

Действие любого стресса (рис. 31) приводит к разобщению энергетического и конструктивного метаболизма. Следствием этого является активация системы синтеза полиамипов, в результате чего в клетке накапливаются путресцин и образующийся из него спермидин. Высокое содержание полиаминов стимулирует индуцированную стрессовым воздействием экспрессию rpoS. Это приводит к активации транскрипции gs-зависимых генов и синтезу соответствующих адаптивных белков, что приводит к повышению выживаемости бактерий.

В условиях снижения внутриклеточного рН значительную регуляторную роль играют не только сами полиамипы, по и продукты их метаболизма. Белки, образующиеся в результате экспрессии контролируемых RpoS генов деградации путресцина, принимают участие в переаминировании у-аминобутирата (продукта расщепления путресцина) и синтезе глутамата, необходимого для работы основной системы кислотоустойчивости Е. coli на минимальных питательных средах.

Полиаминзависимая адаптация Е. coli к антибиотикам, транспортируемым в клетку через порипы, является существенным компонентом механизмов антибиотикоустойчивости. Она осуществляется на основе снижения проницаемости клеточной стенки. Это происходит не только за счёт блокирования работы пориновых каналов при участии кадаверина, синтезируемого находящейся под контролем RpoS лизипдекарбоксилазой Ldc, но и в результате отрицательной регуляции экспрессии ompF, происходящей при участии os.

Таким образом, тесное взаимодействие RpoS, как глобального регулятора общего стрессового ответа, и полиамипов, регуляторная активность которых лежит в основе функционирования полиаминового модулоиа, предоставляет бактериальной клетке широкий спектр адаптивных возможностей и позволяет выработать адекватные приспособительные реакции в ответ па разнообразные стрессовые воздействия.

120

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шумков, Михаил Сергеевич, Пермь

1. Маниатис Г. Молекулярное клонирование / Г. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сембрук//М., Мир. - 1984. - С. 240-242.

2. Определение чувствительности микроорганизмов к бактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890-04)//Клин. микробиол. антимикроб, химиотер. 2004. - Т. 6. С. 306-359.

3. Сидоренко С.В. Молекулярные основы резистентности к антибиотикам / С.В. Сидоренко, В.И. Тишков//Успехи биологической химии. 2004. -Т. 44. - С. 263-306.

4. Ткаченко А.Г. Зависимость защитных функций полиаминов Escherichia coli от силы стрессорпых воздействий супероксидных радикалов / А.Г. Ткаченко, М.В. Федотова//Биохимия. 2007. - Т. 72. -№ 1.-С. 128-136.

5. Ткаченко А.Г. Механизмы защитных функций полиаминов Escherichia coli от токсического эффекта параквата, индуцирующего супероксидный стресс / А.Г. Ткаченко//Биохимия. 2004. - Т.69. -С.234-242.

6. Ткаченко А.Г. Обмен путресцина и калия между клеткой и средой как фактор адаптации Eschirichia coli к гиперосмотическому шоку / А.Г. Ткаченко, О.Я. Салахетдинова, М.Р. Пи1еничнов//Микробиология. -1997.-Т.4.-N. З.-С. 329-334.

7. Ткаченко А.Г. Распределение полиамипов у Escherichia coli и их роль в обмене калия между клеткой и средой в процессе аэробно-апаэробпых переходов / А.Г. Ткаченко, А.А. Чудинов, О.Я. Салахетдипова/УМикробиология. 1996. - Т 65. - N. 1. - С. 10-14.

8. Ткаченко А.Г. Роль внутриклеточного пула полиамипов в регуляции конструктивного обмена Escherichia coli в процессе аэробно-анаэробных переходов / А.Г. Ткаченко, А.А. Чудинов, Н.С. Чурилова/УМикробиология. 1989. - Т. 58. - N 5. - С. 709-715.

9. Ткаченко А.Г. Роль системы синтеза полиаминов в энергетическом сопряжении у Escherichia coli / А.Г. Ткаченко, А.А. Чудинов//Доклады АН СССР. 1989. - Т. 305. - С. 219-222.

10. Ткаченко А.Г. Роль транспорта путресцина и калия в адаптации Escherichia coli к голоданию по аммонию / А.Г. Ткаченко, О.Я. Салахетдипова, М.Р. Пшепичпов//Микробиология. 1996а. - Т. 65. - № 6. - С. 740-744.

11. Ткаченко, А.Г., Нестерова, JI.IO. Полиамины как модуляторы экспрессии генов окислительного стресса у Escherichia coli / А.Г. Ткаченко, JI.IO. Нестерова//Биохимия. 2003. - Т. 68. - С. 1040-1048.

12. Харди К.Дж. Выделение бактериальных плазмид / К.Дж. Харди//Плазмиды. Методы. Москва: Мир, 1989. - С. 11-18.

13. Чудинов А.А. Метод определения низкомолекулярных олигоаминов в различном биологическом материале / А.А. Чудинов., JI.A. Чудинова, В.П. Коробов//Вопросы мед. химии. 1984. - Т. 30. - N 4. - С. 127-132.

14. Abraham К.А. Role of polyamines in macromolecular synthesis / K.A. Abraham, A. Pihl//Trends Biochem. Sci. 1981. - P. 106-107.

15. Achouak W. Multiple facets of bacterial porins / W. Achouak, T. Heulin, J.-M. Pages//FEMS Microbiol. Letters. 2001. - V. 199. - P. 1 -7.

16. Aldsworth T.G. Bacterial suicide through stress / T.G. Aldsworth, R.L. Sharman, E.R. Dodd//Cell. Mol. Life Sci. 1999. - V. 56. - P. 378-383.

17. Alekshun M.N. Alteration of the Repressor Activity of MarR, the Negative Regulator of the Escherichia coli marRAB Locus, by Multiple Chemicals In Vitro / M.N. Alekshun, S.B. Levy//J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 46694672.

18. Alekshun M.N. Rerulation of chromosomally mediated multiple antibiotic resistance: the mar regulon / M.N. Alekshun, S.B. Levy//Antimicrob. Agents Chemother. 1997. - V. 41. - P. 2067-2075.

19. Aim K. Topoisomerase II is nonfunctional in polyamine depleted cells / K. Aim, P. Berntsson, S.M. Oredsson//J. Cel. Biochem. 1999. - V. 75. - P. 4655.

20. Andersen K.B. Are growth rates of Escherichia coli in batch cultures limited by respiration? / K.B. Andersen, K. von Meyenburg//J. Bacteriol. 1980. -V. 144.-P. 114-123.с

21. Arnqvist A. c*-dependent growth-phase induction of the csgBA promoter in• 70 *

22. Eschericia coli can be achieved in vivo by a in the absence of the nucleoid-associated protein H-NS / A. Arnqvist, A. Olsen, S. Normark//Mol. Mocrobiol.- 1994.-V. 13.-P. 1021-1032.

23. Baca-DeLancey R.R. Escherichia coli genes regulated by cell-to-cell signaling / R.R. Baca-DeLancey, M.M. South, X. Ding, P.N. Rather//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 4610-4614.

24. Bachrach U. Function of naturally occurring polyamines / U. Bachrach//N.Y.: Academic Press. Inc. 1973.

25. Baronofsky J.J. Uncoupling by acetic acid limits growth of and acetogenesis by Clostridium thermoaceticum / J.J. Baronofsky, W.J.A. Schreurs, E.R. Kashket//Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 48. - P. 1134-1139.

26. Baskett R.C. Shigella flexnery inhibition by acetic acid / R.C. Baskett, D.J. Hentges//Infect. Immun. 1973. - V. 8. - P. 91-97.

27. Benz R. Structure and functions of porins from Gram-negative bacteria / R. Benz//Annu. Rev. Microbiol. 1988. - V. 42. - P. 359-93.

28. Bloomfield U.A. Interaction of polyamines with polynucleotides / U.A. Bloomfield, R.W. Wilson//Polyamines in biology and medicine. Eds. Morris D.R., Marton L.J. - N.Y.: Marcel Dekker Inc. - 1987. - P. 183-206.

29. Booth I.R. Regulation of cytoplasmic pH in bacteria / I.R. Booth//Microbiol. Rev. 1985.-V. 49. - P. 359-378.

30. Bowman W.II. Spermidine biosynthesis. Purification and properties of propilamine transferase from Escherichia coli / W.H. Bowman, H. Tabor//J. Biol. Chem. 1973. - V. 248. - N. 7. - P. 2480-2486.

31. Bryans M. Elevated cellular polyamine levels enhance promoter activity in vivo / M. Bryans, E. Harley, S.K. Gilmour//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - V. 226. - P. 618-625.

32. Camilli A. Bacterial small-molecule signaling pathways / A. Camilli, B.L. Bassler//Science. 2006. - V. 311. - N. 5764. - P. 1113-1116.

33. Castanie-Cornet M.-P. Control of Acid Resistance in Escherichia coli / M.-P. Castanie-Cornet, T.A. Penfound, D. Smith, J.F. Elliott, et al.//J. Bacteriol.- 1999.-V. 181.-N. 11.-P. 3525-3535.

34. Chen G.Z. Patten C. L., and Schellhorn, H. E. Controlled expression of an rpoS Antisense RNA can inhibit RpoS function in Escherichia coli / G.Z. Chen, C.L. Patten, H.E. Schellhorn//Antimicrob. Agents Chemother. -2003.- V.47.-N. ll.-P. 3485-3493.

35. Chen G. Schellhorn Controlled induction of the RpoS regulon in Escherichia coli, using an RpoS-expressing plasmid / G. Chen, H.E. Schellhorn//Can. J. Microbiol. 2003. - V. 49. - P. 733-740.

36. Cherrington C.A. Organic acides: chemistry, antibacterial activity and practical applications / C. A. Cherrington, M. Hilton, G.C. Mead, I. Chopra//Adv. Microb. Phisiol. 1991. - V. 32. - P. 87-108.

37. Chorpa I. Transport of antibiotics into bacteria / I. Chorpa, P. Ball//Adv. Microb. Phisiol. 1982. - V. 23. P. 183-240.

38. Coffino P. Regulation of cellular polyamines by antizyme / P. Coffino//Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2001. - V. 2. - P. 188194.

39. Cohen S. What do the polyamines do? / S. Cohen//Nature. 1978. - V. 274. -P. 209-210.

40. Cohen S.P. Salicylate Induction of Antibiotic Resistance in Escherichia coli: activation of the mar Operon and a war-Independent Pathway / S.P. Cohen, S.B. Levy, J. Foulds, J.L. Rosner//J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 78567862.

41. Corella D. Effect of poliamine levels on the degradation of short-lived and long-lived proteins in cultured L-132 human lung cells / D. Corella, M. Guillen, J.M. Hernandes, et al.//Biochem. J. 1998. - V. 334. - P. 367-375.

42. Cummings J. H. Short chain fatty acides in human large intestine, portal, hepatic and venous blood / J. H. Cummings, E.W. Pomare, W.J. Branch, C.P.E. Naylorr, etal.//Gut. 1987. - V. 28. - P. 1221-1227.

43. Delcour A.H. Solute uptake through general porins / A.H. Delcour/VFrontiers in Bioscince. 2003. - V. 8. - P. 1055-1071.

44. Delcour A.H. Structure and function of pore-forming beta-barrels from bacteria / A.H. Delcour//J. Mol. Micro. Biotechnol. 2002. - V. 4. - P. 1-10.

45. Diaz-Guerra L. appR gene product activates transcription of microcine C7 plasmide genes / L. Diaz-Guerra, F. Moreno, J.L. SanMillan//J. Bacteriol. -1989.-V. 171.-P. 2906-8.

46. Esposito D. Interactions with natural polyamines and thermal stability of DNA. A DSC study and a theoretical reconsideration / D. Esposito, P. Del Vecchio, G. Barone//J. Am. Chem. Soc. 1997. - V. 119. - P. 2606-2613.

47. Eswaran J. Three's company: component structures bring a closer view of tripartite drug efflux pumps / J. Eswaran, E. Koronakis, M.K. Biggins, et al.//Curr. Opin. Struct. Biol. 2004. - V. 14. - N. 6. - P. 741-747.

48. Fang F.C. The alternative a factor KatF (RpoS) regulates Salmonella virulence / F.C. Fang, S.J. Libby, N.A. Buchmeier, et. al.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992.-V. 89.-P. 11978-82.

49. Fang M. ppGpp-dependent leuO expression in bacteria under stress / M. Fang, A. Majumder, K.-J. Tsai, et al.//Biochem. Biophys. Res. Commun. -2000. V. 276. - P. 64-70.

50. Fiedorow P. The influence of polyamines on polymerase chein reaction (PCR) / P. Fiedorov, Szweykowska-Kulinska//Acta Biochemica polonica.1997.-V. 44.-N. l.-P. 83-88.• s

51. Fischer D. The general stress sigma factor a of Escherichia coli is inducedduring diauxic shift from glucose to lactose / D. Fischer, A. Teich, P. Neubauer, et al.//J. Bacteriol. 1998 (Dec.). - V. 180. - N. 3. - P. 6203-6206.

52. Flink I. Polyamines stabilize DNA folds /1. Flink, D.E. Pctijohn//Nature. -1975. V. 253. - P. 62-63.

53. Foster J.W. Escherichia coli acide resistance: tales of an amateur acidophile / J.W. Foster//Nat. Rev. Microbiol. 2004. - V. 2. - P. 898-907.

54. Fuschs E. In vitro synthesis of T3 and T4 RNA polymerase at low magnesium concentration / E. Fuschs, C.M. Fuschs//FEBS Lett. 1971. - V. 19.-P. 159-162.

55. Gale E.F. The bacterial amino acid decarboxylases / E.F. Gale//Adv. Enzymol. 1946. - V. 6. - P. 1-32.

56. Goldemberg S.H. Lysine decarboxylase mutants of E. coli: evidence for two enzyme forms / S.H. Goldembcrg//J. Bactcriol. 1980. - V. 141. - P. 14281431.

57. Goswami M. Involvement of reactive oxygen species in the action of ciprofloxacin against Escherichia coli / M. Goswami, S.H. Mangoli, N. Jawali//Antimicrob. Agents Chemother. 2006. - V. 50. - N. 3. - P. 949-954.

58. Gottesman S. Proteolysis in bacterial regulatory circuits / S. Gottesman//Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2003. - V. 19. - P. 565-87.

59. Gottesman S. Small RNA Regulators and the Bacterial Response to Stress / S. Gottesman, C.A. McCullen, M. Guillier, et al.//Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol.-2006.-V. 71.-P. 1-11.

60. Greenway D.L.A. The intrinsic resistanse of Escherichia coli to various antimicrobial agents requires ppGpp and oS / D.L.A. Greenway, R.R. England//Lett. Appl. Microbiol. 1999. - V. 29. - P. 323-326.

61. Grkovic S. Brown M. H., Skurray R. A. Regulation of Bacterial Drug Export Systems / S. Grkovic, M.H. Brown, R.A. Skurray//Mol. Biol. Rev. -2002.-P. 671-701.

62. Gross C.A. Bacterial sigma factors / C.A. Gross, M. Lonetto, R. Losick// Transcriptional Regulation. Ed. McKnight S.L. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 1992. - P. 129-176.

63. Gross R. Families of bacterial signal-transducing proteins / R. Gross, B. Arico, R. Rappuoli//Mol. Microbiol. 1989. - V. 3. - P. 1661-1667.

64. Grossowicz N. Mechanism of protection of cells by spermine against lisozyme-induced lysis / N. Grossowicz, M. Ariel//J. Bacteriol. 1963. - V. 85.-P. 293-300.

65. Han L. Changes in intracellular metabolite pools, and acetate formation in Escherichia coli are associated with a cell-dcnsity-depcndent switch / L. Han, S.-O. Enfors, L. Haggstrom//Biotech. Lett. 2002. - V. 24. - P. 483488.

66. Hancock R.E. Interaction of aminoglycosides with the outer membranes and purified lipopolysaccharide and OmpF porin of Escherichia coli / R.E.

67. Hancock, S.W. Fanner, Z.S. Li, et al.//Antimicrob. Agents Chemoter. -1991. V. 35. - N. 7. - P. 1309-14.

68. Heby O. Observations on the affinity between polyamines and nucleic acid / 0. Heby, J. AgrelWHope-Seyleir's Z. Physiol. Chem. 1971. - V. 352. - P. 29-38.

69. Heller J.S. Purification and properties of the antizymes of E.coli to ornithine decarboxylase / J.S. Heller, D.A. Kyriakidis, E.S. Cannelakis//Biochim. Biophys. Acta. 1982. - V. 760. - P. 154-162.

70. Hengge R. and B. Bukau. Proteolysis in procaryotes: protein quality control and regulatory principles / R. Hengge, B. Bukau//Mol. Microbiol. 2003. -V. 49.-N. 6.-P. 1451-1462.

71. Hengge-Aronis R. Back to log phase: gs as a global regulator in the osmotic control of gene expression in Escherichia coli / R. Hengge-Aronis//Mol. Microbiol. 1996. - V. 21. - N. 5. - P. 887-893.

72. Hengge-Aronis R. Osmotic regulation of /^oS-dependent genes in Escherichia coli / R. Hengge-Aronis, R. Lange, N. Henneberg, et al.//J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 259-265.

73. Hengge-Aronis R. Signal transduction and regulatory mechanisms involvedоin control of the a (RpoS) subunit of RNA polymerase / R. Hengge-Aronis//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. - P. 373-395.

74. Hengge-Aronis R. The general stress response in Escherichia coli / R. Hengge-Aronis//Bacterial stress responses. Eds. Storz G., Hengge-Aronis R. - Washington, D.C. - ASM Press. - 2000. - P. 161-178.

75. Herbst E.J. The Gram reaction and cell composition: diamines and polyamines / E.J. Herbst, R.H. Weaver, D.L. Keister//Arch. Biochem. Biophys. 1958. - V. 75. - P. 171-177.

76. Heyde M. Regulation of major outer membrane porin proteins of Escherichia coli K12 by pi I / M. Heyde, R. Portalier // Molecular Gen. Genet.(Historical Archive). 1987. - V. 208. - P. 511-517.

77. Hirsch M. Stationary-phase regulation of RpoS translation in Escherichia coli / M. Hirsch, T. Elliott//J. Bacteriol. 2005. - V. 187. - N. 21. - P. 720413.

78. Hirshfield I.N. Isolation and characterization of mutant of Escherichia coli blocked in the synthesis putrescine / I.H. Hirshfield, H.J. Rosenfeld, Z. Leifer, et al.//J. Bacteriol. 1970. - V. 101.-N. 3.-P. 125-730.

79. Holms H. Flux analysis and control of the central metabolic pathways in Escherichia coli III. IIolms//FEMS Microbiol. Rev. 1996. - V. 19. - P. 85116.

80. Holms W.H. The central metabolic pathways of Escherichia coli: relationship between flux and control at a branch point, efficiency of convertion to biomass, and excretion of acetate / W.I I. Holms//Curr. Top. Cell. Regul. 1986. - V. 28. - P. 59-105.

81. Holtta E. Ornitine decarboxylase from Escherichia coli: stimulation of the enzyme activity by nucleotides / E. Holtta, J. Janne, J. Pispa//Biochem. Biophis. Res. Commun. 1972. - V. 47 - P. 1165-1171.

82. Holtta E. The regulation of polyamine synthesis during the stringent control in Escherichia coli / E. Holtta, J. Janne, J. Pispa//Biochem. Biophis, Res. Commun. 1974. - V. 59 - P. 1104-1 111.

83. Howell M.L. Sequence-dependent effects of spermine on the thermodynamics of the B-DNA to Z-DNA transition / M.L. Howell, G.P. Schroth, P.S. Ho//Biochemistiy. 1996. - V. 35. - P. 15373-15382.

84. Igarashi K. Physiological functions of polyamines and regulation of polyamine content in cells / K. Igarashi//Yakugaku Zasshi. 2006. - V. 126. -N. 7. - P. 455-71.

85. Igarashi K. Polyamines: Mysterious Modulators of Cellular Functions / K. Igarashi, K. Kashiwagi//Biochem. and Biophis. Research Commun. 2000. -V. 271.-P. 559-564.

86. Ishihama A. Functional modulation of Escherichia coli RNA polymerase / A. Ishihama//Annu. Rev. Microbiol. 2000. - V. 54. - P. 499-518.

87. Ishihama A. Subunit assembly of Escherichia coli RNA polymerase / A. Ishihama//Adv. Biophis. 1981. - V. 14. - P. 1-35.

88. Iyer R. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli / R. Iyer, C. Williams, C. Miller//! Bacter. 2003. - V. 185. -N. 22.-P. 6556-6561.

89. Iyer R. Complex inhibition of ompF and ompC bacterial porins by polyamines / R. Iyer, A.H. Delcour//J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - N. 30. -P. 18595-18601.

90. Iyer R. Molecular basis for the Poliamine-OmpF porine interections: inhibitor and mutant studies / R. Iyer, Z. Wu, P.M. Woster, et al.//J. Mol. Biol. 2000. - V. 297. - P. 933-945.

91. Jap B.K. Structure and functional mechanism of porins / B.K. Jap, P.J. Walian//Physiol. Rev. 1996. - V. 76. - P. 1073-1088.

92. Jenkins D.E. Role of RpoH, a heat shock regulator protein, in Escherichia coli carbon starvation protein synthesis and survival / D.E. Jenkins, E. Auger, A. Matin//J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 1992-1996.

93. Jenkins D.E. Starvation-induced crossed protection against heat or H202 challenge in Escherichia coli / D.E. Jenkins, J.E. Schultz, A. Matin//J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 3910-14.

94. Jishage M. Regulation of sigma factor competition by the alarmone ppGpp / M. Jishage, K. Kvint, V. Shingler, et al.//Genes. Dev. 2002. - V. 16. - P. 1260-1270.

95. Jung I. L. Polyamines and glutamate decarboxylase-based acid resistance in Escherichia coli / I.L. Jung, I. G. Kim//J. Biol. Chem. 2003a. - V. 278. - N. 25. - N. :22846-22852.

96. Karpetsky T.P. Polyamines, ribonucleases and the stability of RNA / T.P. Karpetsky//Mol. Cell Biochem. 1977. - V. 17. - P. 89-99.

97. Kashiwagi K. Adjustment of polyamine content in Escherichia coli / K. Kashiwagi, K. Igarashi//J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 3131-3135.

98. Kashiwagi K. Apparently polyamine transport by proton motive in force in polyamine-deficient Escherichia coli / K. Kashiwagi, H. Kobayashi, K. Igarashi//J. Bacteriol. 1986. - V. 165. - P. 972-977.

99. Kihara M. Cytoplasmic pH mediates pH taxis and weak acid repellent taxis in bacteria / M. Kihara, R.M. Macnab//J. Bacteriol. 1981. - V. 145. - P. 1209-1221.

100. Kikuchi Y. RpoS-dependent expression of the second lysine decarboxylase gene in Escherichia coli / Y. Kikuchi, O. Kurahashi, T. Nagano, et al.//Biosci. Biotcchnol. Biochem. 1998. - V. 62. - N. 6. - P. 1267-70.

101. Kim S.-N. Identification of the polyamine induced proteins in Escherichia coli / S.-N. Kim, J.-H. Lee, D.-K. Rhee//Molecules and Cells. 1999. - V. 9. -N. 2.-P. 219-224.

102. Kirkpatrick C. Acetate and formate stress: opposite responses in the proteome of Escherichia coli / C. Kirkpatrick, L.M. Maurer, N. E. Oyelakin, et al.//J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 6466-6477.

103. Koebnik R. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell / R. Koebnik, K.P. Locher, P. Van Gelder//Mol. Microbiol. 2000. - V. 37. - P. 239-253.

104. Kolter R. Genetics of ribosomally sinthcsizes peptide antibiotics / R. Kolter, F. Moreno//Annu. Rev. Microbiol. 1992. - V. 46. - P. 141-63.

105. Krulwich T.A. Do physiological roles foster persistence of drug/multidrug-efflux transporters? A case study / T.A. Krulwich, O. Lewinson, E. Padan, et al.//Nat. Rev. Microbiol. 2005. - V. 3. - N. 7. - P. 566-572.

106. Kurihara S. A novel putrescin utilisation pathway involves y-glutamilated intermediates of Escherichia coli K-12 / S. Kurihara, S. Oda, K. Kato, et al.//J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - N. 6. - P. 4602-4608.

107. Lange R. Identification of a central regulator of stationary phase gene expression in Escherichia col / R. Lange, R. Hengge-Aronis//Mol. Microbiol. 1991. - V. 5. - P. 49-59.

108. Lange R. The cellular concentration of the as subunit of RNA-polymerase in Escherichia coli is controlled at the levels of transcription, translation and protein stability / R. Lange, R. Hengge-Aronis//Genes. Dev. 1994. - V. 8. -P. 1600-1612.

109. Laurie A. The role of the alarmone (p)ppGpp in sigmaN for core RNA polymerase / A. Laurie, L.M.D. Bernardo, C.C. Sze, et aI.//J. Biol. Chem. -2003.-V. 278.-P. 1494-503.

110. Lee I.S. The stationarty phase sigma factor os (RpoS) is required for a sustained acid tolerance response in virulent Salmonella typhimurium / I.S. Lee, J. Lin, H.K. Hall, et al.//Mol. Microbiol. 1995. - V. 17. - P. 155-167.

111. Lemonnier M. Expression of the second lysine decarboxylase gene of Escherichia coli IM. Lemonnier, D. Lane//Microbiology. 1998. - V. 144. -N. 3.-P. 751-60.

112. Lewinson O. Alkalitolerance: a biological function for a multidrug transporter in pH homeostasis / O. Lewinson, E. Padan, E. Bibi//Proc. Nat. Acad. Sci. Usa. 2004. - V. 101. - N. 39. - P. 14073-14078.

113. Lin J. Comparative analysis of extreme acide survival in Salmonella typhimurium, Shigella flexnery and Escherichia coli / J. Lin, I.S. Lee, J. Frey, et al.//J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 4097-4104.

114. Lindemose S. Polyamines preferentially interact with bent adenine tracts in double-stranded DNA / S. Lindemose, P.E. Nielsen, N.E. Mollegaard//Nucleic Acids Research. 2005. - V. 33. - N. 6. - P. 17901803.

115. Liquori A.M. Complexes between DNA and polyamines: a molecular model / A.M. Liquori, L. Constantino, V. Cresconzi, et al.//Mol. Biol. 1967. - V. 24.-P. 113-122.

116. Liu X.Q. An analysis of multifactorial influences on the transcriptional control of ompF and ompC porin expression under nutrient limitation / X.Q. Liu, T. Ferenci//Microbiology Sgm. 2002. - V. 147. - P. 2981-2989.

117. Loewen P.C. Genetic mapping of katF, a locus that with katE affects the synthesis of a second catalase species in Escherichia coli / P.C. Loewen, B.L. Triggs//J. Bacteriol. 1984. - V. 160. - P. 668-75.

118. Loewen P.C. Regulation in the RpoS regulon of Escherichia coli / P.C. Loewen, B. ITu, J. Strutinsky, et al.//Can. J. Microbiol. 1998. - V. 44 - P. 707-717.с

119. Loewen P.C. The role of the sigma factor a (KatF) in bacterial global regulation / P.C. Loewen, R. Hengge-Aronis//Annu. Rev. Microbiol. 1994. - V. 48. - P.53-80.

120. Lu B. Polyamine inhibition of estrogen receptor (ER) DNA-binding and ligand-binding functions / Lu В., X. Liang, G.K. Scott, et al.//Breast Cancer Res. Treat. 1998. - V. 48. - P. 243-257.

121. Ma D. Genes acrA and acrB encode a stress-induced efflux systems of Escherichia coli / D. Ma, D.N. Cook, M. Alberti, et al.//Microbiol. 1995. -V. 16.-N. l.-P. 45-55.

122. Ma D. The local repressor AcrR plays a modulating role in the regulation of acrAB genes of Escherichia coli by global stress signals / D. Ma, D.M. Alberti, C. Lynch, et al.//Mol. Microbiol. 1996. - V. 19. - P. 101-112.

123. Ma Z. Collaborative regulation of Escherichia coli glutamate-dependent acid resistance by two AraC-like regulators, GadX and GadW (YhiW) / Z. Ma, H. Richard, D.L. Tucker, et al.//J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P.7001-7012.

124. Ma Z. GadE (YhiE) activates glutamate-decarboxylase-dependent acid resistance in Escherichia coli К12. / Ma Z., Gong S., Richard H., et al.//Mol. Microbiol. 2003b. - V. 49. - P. 1309-1320.

125. Maeda H. Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase / H. Maeda, N. Fugita, A. Ishihama//Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 3497-3503.

126. Majumder A. LeuO expression in response to starvation for branch-chain amino acids / A. Majumder, M. Fang, K.-J. Tsai, et al.//J. Biol. Chem. -2001.-V. 276.-P. 19046-19051.

127. Markham G.D. S-adenosylmethionine synthetase from E.coli / G.D. Markham, E.W. Hafner, C.W. Tabor, et al.//J. Biol. Chem. 1980. - V. 255. - P. 9082-9092.

128. Martin R.G. Autoactivation of the marllAB multiple antibiotic resistance operon by the MarA transcriptional activator in Escherichia coli / R.G. Martin, K. W. Jair, R.E. Wolf, et al.//J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 22162223.

129. Matin A. The molecular basis of carbon-starvation-induced general resistance in Escherichia coli / A. Matin//Mol. Microbiol. 1991. - V. 5. - P. 3-10.

130. Mazzariol A. Iligt-level fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Escherichia coli overproduce multidrug efflux protein AcrA / A. Mazzariol, Y. Tokue, T.M. Kanegawa, et al.//Antimicrob. Agents Chemother. 2000.1. V. 44. p. 3441-3443.

131. McCleary W.R. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators / W.R. McCleary, J.B. Stock//J. Biol. Chem. 1994. - V. 269.-P. 31567-31572.

132. Metzner M. Multiple stress signal integration in the regulation of theQcomplex a "dependent csiD-ygaF-gabDTP operon in Escherichia coli / M. Metzner, J. Germer, R. Hengge//Mol. Microbiol. 2004. - V. 51. - N. 3. - P. 799-811.

133. Mika F. A two-component phosphotransfer network involving ArcB, Arc A, and RssB coordinates synthesis and proteolysis of sigma(S) (RpoS) in E. coli / F. Mika, R. Hengge//Gene Develop. 2005. - V. 19. - N. 22. - P. 27702781.

134. Miller J.H. Experiments in molecular genetics / J.II. Miller//Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1992.

135. Minton K.M. Paraquat toxicity is increased in Escherichia coli defective in the synthesis of polyamines / К. M. Minton, II. Tabor, C.W. Tabor//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 2851-2855.

136. Morris D.R. Biosynthetic and biodegradative ornithine and arginine decarboxylases from Escherichia coli / D.R. Morris, E.A. Boeker//Methods in Enzymology. 1983. - V. 94. - P. 125-134.

137. Morris D.R. Putrescine biosynthesis in Escherichia coli regulation through pathway selection / D.R. Morris, K.L. Koffron//J. Biol. Chem. 1969. - V. 244. - P. 6094-6099.

138. Morris D.R. Regulation of amino acid decarboxylation / D.R. Morris, R.H. Fillingame// Ann. Rev. Biochem. 1974. - V. 43. - P. 303-321.

139. Muffler A. Heat shock regulation of a turnover: a role for DnaK and• S 32relationship between stress responses mediated by a and a in Escherichia coli / A. Muffler, M. Barth, C. Marschall, ct al.//J. Bacteriol. 1997. - V. 179. -N. 2. - P. 445-452.с

140. Muffler A. Post-transcriptional osmotic regulation of the a subunit of RNA polymerase in Escherichia coli / A. Muffler, D.D. Trauslen, R. Lange, et al.//J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 1607-1613.

141. Muffler A. The response regulator RssB controls stability of the sigma(S) subunit of RNA polymerase in Escherichia coli / A. Muffler, D. Fischer, S. Altuvia, et al.//EMBO J. 1996.- V. 15.-P. 1333-1339.

142. Mukhopadhyay S. Identification and characterisation of hydrogen peroxide-sensitive mutants of Escherichia coli: genes that require / S. Mukhopadhyay, I I.E. Schellhorn//J. Bacteriol. 1997. - V. 179 - P. 330-338.

143. Mulvey M.R. Regulation of transcription of katE and katF in Escherichia coli / M.R. Mulvey, J. Switala, A. Borys, et al.//J. Bacteriol. 1990. - V. 172-P. 6713-6720.

144. Munro G.F. Dependence of the putrescine content of Escherichia coli on the osmotic strength of the medium / G.F. Munro, K. Hercules, J. Morgan, et al.//J. Biol. Chem. 1972. - V. 247. - P. 1272-1280.

145. Murakami K. Role of RpoS gene of Pseudomonas aeruginosa in antibiotic tolerance / K. Murakami, T. Ono, D. Viducic, et al.//FEMS Microbiol. Lett. 2005. - V. 242-N. 1 - P. 161-167.

146. Nair S. Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase / S.Nair, S.E. FinkeWJ. Bacteriol. 2004. - V. 186-N. 13 - P. 4192-4198.

147. Neidhardt F.C. The genetics and regulation of heat shock proteins / F.C. Neidhardt, R.A. Van Bogelen, V. Vaughn//Ann. Rev. Genet. 1984. - V. 18 - P. 295-329.

148. Neves P. Interaction between quinolones antibiotics and bacterial outer membrane porin OmpF / P. Neves, E. Berkane, P. Gameiro//Biophysical Chem. 2005. - V. 113. - P. 123-128.

149. Nikaido H. AcrAB and related multidrug efflux pumps of Escherichia coli / H. Nikaido, I I.I. Zgurskaya//J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 3. -P. 215-218.

150. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited / II. Nikaido//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. - V. 67. - N. 4. - P. 593-656.

151. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability H. Nikaido, M. Vaara//Microbiol. Rev. 1985. - V. 49 - P. 1-32.

152. Nikaido H. Outer membrane / H. Nikaido 11 Escherichia coli and Salmonella, Cellular and molecular biology. Eds. Neidhardt, F.C. - Washington, DC: ASM Press. - 1996.-P. 29-47.

153. Nikaido IT Porin Channels in Escherichia coli: Studies with |3-Lactams in intact cells / I I. Nikaido, Y.E. Rosenberg, J. Foulds//J. Bacteriol. 1983. - V. 153.-P. 232-240.

154. Norel F. The putative sigma factor KatF (RpoS) is required for the transcription of the Salmonella typhimurium virulence gene spvB in Escherichia coli / F. Norel, V. Robbe-Saule, M.Y. Popoff, et al.//FEMS Microbiol. Lett. 1992. - V. 99. - P. 271-276.

155. Nystrom T. Growth versus maintenance: a trade-off dictated by RNA polymerase availability and sigma factor competition? / T. Nystrom//Mol. Microbiol. 2004b - V. 54 - N. 4 - P. 855-862.

156. Nystrom T. Isolation and properties of a mutant of Escherichia coli with an insertional inactivation of the uspA gene, which encodes a universal stress protein / T. Nystrom, F.C. Neidhardt//J. Bacteriol. 1993. - V. 175. -P.3949-3956.

157. Nystrom Т. Stationary-phase phisiology / Т. Nystrom//Annu. Rev. Microbiol. 2004a. - V. 58. - P. 161-181.

158. Nystrom T. Viable but non-culturablc bacteria: programmed survival forms or cells at death's door? / T. Nystrom//BioEssays. 2003. - V. 25. - P.204-211.

159. Oh T.J. The expression of Escherichia coli SOS genes recA and uvrA is inducible by poliamines / T.J. Oh, I.G. Kim//Biochem. Biophis. Res. Commun. 1999. - V. 264. - P. 584-589.

160. Olson E. Influence of pH on bacterial gene expression / E. 01son//Mol. Microbiol.- 1993.-V. 8.-P. 5-14.

161. Palanimurugan R. Polyamines regulate their synthesis by inducing expression and blocking degradation of ODC antizyme / R. Palanimurugan, H. Schill, K. Hofmann, R.J. Dohmen//EMBO J. 2004. - V. 23. - N. 24. -P.4857-4867.

162. Paulsen I.T. Proton-dependent multidrug efflux systems / I.T. Paulsen, M.H. Brown, R.A. Skurray//Microbiol. Rev. 1996. - V. 60. - P. 575-608.

163. Pesci E.C. Quinolone signaling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa / E.C. Pesci, J.B.J. Milbank, J.P. Pearson, et aI.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - N. 20. - P.l 1229-11234.

164. Peter H.W. Influence of polyamines on the bivalent-cation-activited ATPases / II.W. Peter, H.U. Wolf, N. Sciler//Hope-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1973. - V. 354.-P. 1146-1148.

165. Peterson C.N. Escherichia coli starvation diets: essential nutrients weigh in distinctly / C.N. Peterson, M.J. Mandel, T.J. Sylhavy//J. Bacteriol. 2005. -V. 187.-N. 22. - P.7549-7553.

166. Pomposiello P.J. Genome-wide transcriptional profiling of the Escherichia coli responses to superoxide stress and sodium salicylate / P.J. Pomposiello,

167. M.H. Bennik, В. Demple//J. Bacteriol. 2001. - V. 183 - N. 13. - P.3890-3902.

168. Pratt L.A. From acids to osmZ: multiple factors influence synthesis of OmpF and OmpC porins in Escherichia coli / L.A. Pratt, W. FIsing, K.E. Gibson, et aI.//Mol. Microbiol. 1996. - V. 20. - P. 911-917.

169. Putman M. Molecular properties of bacterial multidrug transporters / M. Putman, H. W. van Veen, W. N. Konings//Mol. Biol. Rev. 2000. - V. 64. -P. 672-693.

170. Rach I. Paraquat resistance of Horseweed (Erigeron canadensis L.) is not caused by polyamines / I. Rach, D. Lasztity, E. Darco, et al.//Pesticide Biochemistry and Physiology. 2000. - V. 68. - P. 1-10.

171. Rahmati S. Control of the AcrAB multidrug efflux pump by quorum-sensing regulator SdiA / S. Rahmati, S. Yang, A.L. Davidson, et al.//Mol. Microbiol. 2002. - V. 43. -N. 3. - P. 677-685.

172. Reeve C.A. Role of protein degradation in the survival of carbon-starved Escherichia coli and Salmonella typhimurium / C.A. Reeve, A.T. Bockman, A. Matin//J. Bacteriol. 1984a. - V. 157. - P.758-63.

173. Reeve C.A. Role of protein synthesis in the survival of carbon-starved Escherichia coli K12 / C.A. Reeve, P.S. Amy, A. Matin//J. Bacteriol. -1984b.-V. 160.-P.1041-46.

174. Repoila F. Signal transduction cascade for regulation of RpoS: temperature regulation of DsrA / F. Repoila, S. Gottesman//J. Bacteriol. 2001 - V. 183. -P.4012-4023.

175. Repoila F. Small non-coding RNAs, co-ordinators of adaptation processes in Escherichia coli: the RpoS paradigm / F. Repoila, N. Majdalani, S. Gottesman//Mol. Microbiol. 2003. - V. 48. - N. 4. - P.855-861.

176. Reyes-Dominguez Y. Plasmid DNA-supercoiling and gyrase activity in Escherichia coli wild-type and rpoS stationary-phase cells / Y. Reyes-Dominguez, G. Contreras-Ferrat, J. Ramirez-Santos, et al.//J. Bacteriol. -2003.-V. 185.-N.3.-P. 1097-1100.

177. Rhee S. A novel DNA-binding motif in MarA: the first structure for an AraC family transcriptional activator / S. Rhee, R.G. Martin, J. L. Rosner, et al.//Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. - V. 95. - P. 10413-10418.

178. Richard H. Escherichia coli Glutamate- and arginine-dependent acid resistance systems increase internal pH and reverse transmembrane potential / H. Richard, J.W. Foster//J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186. - N. 18. - P. 60326041.

179. Rockabrand D. Roles of DnaK and RpoS in starvation-induced thermotolerance of Escherichia coli / D. Rockabrand, K. Livers, 'Г. Austin, et al.//J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P.846-854.

180. Roe A.J. Perturbation of anion balance during inhibition of growth of Escherichia coli by weak acids / A. J. Roe, D. McLaggan, I. Davidson, et al.//J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - N. 4. - P. 767-772.

181. Rose T.A. / T.A. Rose//Methods in Enzymology. Eds. Colowick S.P., Kapian N.O. - N.Y.: Academ. Press., - 1955. - V. Vol. 1, p. 591.

182. Rosner J.L. Dual regulation of inaA by the multiple antibiotic resistance (mar) and superoxide (soxRS) stress response systems of Escherichia coli / J.L. Rosner, J.L. Slonczewski//J.Bactcriol. 1994. - V. 176. - P. 6262-6269.

183. Roy M. Polyamines, both common and uncommon, under heat stress in rice (Orisa saliva) callus / M.Roy, B. Ghosh//Phisiologia Plantarum. 1996. - V. 98.-P. 196-200.

184. Rui S. Topoisomerase function during bacterial responses to environmental challenge / S. Rui, Y.C. Tse-Dinh//Front. Biosci. 2003. - V. 8. - P. D210-D221.

185. Russell J.B. The effect of fermentation acids on bacterial growth / J.B. Russell, F. DiezGonzalez//Advances in Microbial Physiology. 1998. - V. 39. - P. 205-234.

186. Saier M.H. Phylogeny of multidrug transportes / M.H. Saier, I.T. Paulsen//Semin. Cell. Dev. Biol. 2001. - V. 12. - P. 205-213.

187. Salmond C.V. The effect of food preservatives on pH homeostasis in Escherichia coli / C.V. Salmond, R.G. Kroll, I.R. Booth//J. Gen. Microbiol. 1984.-V. 130.-P. 2845-2850.

188. Samartzidou II. Cadaverin inhibition of porin plays a role in cell survival at acidic рН / H. Samartzidou, M. Mehrazin, Z. Xu, et al.//J. Bacteriol. 2003. -V. 185. -N. l.-P. 13-19.

189. Samartzidou H. Excretion of endogenous cadaverine leads to a decrease in porin-mediated outer membrane permeability / H. Samartzidou, A.H. Delcour//J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - N. 3. - P. 791-798.

190. Sandgren S. Suramin selectively inhibits carcinoma cell grouth that is dependent on extracellular polyamines / S. Sandgren, M.Belting//Anticancer Research. 2003. - V. 23. - P. 1223-1228.

191. Schellhorn II.E. Identification of concerved, RpoS-dependent stationary-phase genes of Escherichia coli / I I.E. Schellhorn, J.P. Audia, L.I. Wei, et al.//J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 6283-6291.

192. Schellhorn H.E. Regulation of katF and katE in Escherichia coli K-12 by weak acides / II.E. Schellhorn, V. L. Stones//J. Bacteriol. 1992. - V. 174. -P. 4769-4776.

193. Schneider B.L. The Escherichia coli gabDTPC operon: specific y-aminobutyrate catabolism and nonspecific induction / B.L. Schneider, S. Ruback, A.K. Kiupakis, et al.//J. Bacter. 2002. - V. 184. - N. 24. - P. 69766986.

194. Schumann W. Regulation of the heat shock response in Escherichia coli and Bacillus sub til is / W. Schumann//J. Biosci. 1996. - V. 21. - N. 2. - P. 133148.

195. Sechi A.M. Ingibition of phospholipasc A-2 and phospholipase С by polyamines / A.M. Scchi, L. Cabrini, L. Landi, et al.//Arch. Biochem. Biophys. 1977. - V. 186. - P. 248-254.

196. Shingler V. Signal sensing by sigma 54-dependent regulators: derepression as a control mechanism / V. Shingler//Mol. Microbiol. 1996. - V. 19. - P. 400-16.

197. Sledjesky D.D. The small RNA, DsrA, is essential for the low temperature exprssion of RpoS during exponential growth in E. coli / D.D. Sledjesky, A. Gupta, S. Gottesman//EMBO J. 1996. - V. 15. - P. 3993-4000.

198. Smit J. Outer membrane of Salmonella typhimurium: chemical analisis and frceze-fracture studies with lipopolysaccharide mutants / J. Smit, Y. Kamio, H. Nikaido//J. Bacteriol. 1975. - V. 124. - P. 942-958.

199. Souzu II. Fluorescence polarization studies on E. coli membrane stability and relation to the resistence of the cell to freezethawing. III.Stabilization of the membranes by polyamines / H. Sousu//Biochem. Biophys.Acta. 1986. -V. 861.-P. 361-367.

200. Spotheimmaurizot M. Radioprotection of DNA by polyamines / M. Spotheimmaurizot, S. Ruiz, R. Sabattier, et al.//Radiat. Biol. 1995. - V. 68. -P. 571-577.

201. Stewart N. Loss of topoisimerase I function affects the RpoS-dependent and GAD systems of acid resistence in Escherichia coli / N. Stewart, J.Y. Feng, X.P. Liu, et al.//Microbiology-SGM. 2005. V. 151. - N. 8. - P. 2783-2791.

202. Sullivan K.M. Influence of cation size and charge on the extrusion of a salt-dependent cruciform / K.M. Sullivan, M.J. Lilley//J. Mol. Biol. 1987. - V. 193.-P. 397-404.

203. Tabor C.W. Formation of 1.4-diaminobutane and of spermidine by an ornithine auxotroph of Escherichia coli grown on limiting ornithine or arginine / C.W. Tabor, II. Tabor//J. Biol. Chem. 1969. - V. 244. - P. 63836387.

204. Tabor C.W. Polyamines / C.W. Tabor, H. Tabor//Ann. Rev. Biochem. -1984.-V. 53.-P. 749-790.

205. Takayanagi Y. Structure of the 5' upstream region and the regulation of the rpoS gene of Escherichia coli / Y. Takayanagi, К. Tanaka, H. Takahashi//Mol. Gen. Genet. 1994. - V. 243. - P. 525-531.

206. Tatib A. Polyamines induce malignant transformation in cultured NIIT 3T3 fibroblasts / A. Tatib, U. Bachrach//The Internetionel Journal of Biochemistry and Cell Biology. 1998. - V. 30. - P. 135-146.

207. Tenson 'Г. Antibiotics and the ribosome / T. Tenson, A. Mankin//Mol. Microbiol. 2006. - V. 59. - N. 6. - P. 1664-1677.

208. Thomas T. Polyamines in cell growth and cell death: molecular mechanisms and therapeutic applications / T. Thomas, T.J. Thomas//Cellular and Molecular Life Sciences. 2001. - V. 58. - P. 244-258.

209. Thomas T.J. Structural specifity of polyamines in left-handed Z-DNA formation. Immunological and spectroscopic studies / T.J. Thomas, R.P. Messner//J. Mol. Biol. 1988. - V. 201. - P. 463-467.

210. Tkachenko A. The role of the natural polyamine putrescin in defense against oxidative stress in Escherichia coli / A. Tkachenko, L. Nesterova, M. Pshenichnov//Arch. Microbiol. 2001. - V. 176. - P. 155-157.

211. Touati E. Plciotropic mutations in appR reduce pll 2.5 acide phosphatase expression and restore succinate utilisation in CPR-deficient strains of Escherichia coli / E. Touati, E. Dassa, P.L. Boquet//Mol. Gen. Genet. -1986. -V. 202.-P. 257-64.

212. Travers A. DNA supercoiling a global transcriptional regulator for enterobacterial growth? / A. Travers, A., and G. Muskhelishvili // Nat. Rev. Microbiol. - 2005. - V. 3. - N. 2. - P. 157-169.

213. Tucker D.L. Genes of the GadX-GadW Regulon in Escherichia coli / D.L. Tucker, N. Tucker, Z. Ma, et al.//J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - N. 10. - P. 3190-3201.

214. Tuveson R.W. Genetic control of near-UV (300-400 nm) sensitivity independent of the recA gene in strains of Escherichia coli К 12 / R.W. Tuveson, R.B. Jonas//Photochem. Photobiol. 1979. - V. 30. - P. 667-76.

215. Venturi V. Regulation of quorum sensing in Pseudomonas / V. Venturi//FEMS Microbiol. Rev. 2006. - V. 30. - N. 2. - P. 274-91.

216. Waters C.M. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria / C.M. Waters, B.L. Bassler//Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2005. - V. 21. - N. 1. - P. 319-346.

217. Weber I I. Genome-wide analysis of the general stress response network in Escherichia coli: as-dependent genes, promoters, and sigma factor selectivity / H. Weber, T. Polen, J. Heuveling, et al.//J. Bacteriol. 2005. -V. 187.-N. 5.-P. 1591-1603.

218. Weerasinghe J.P. Stationary phase expression of the arginine biosynthetic operon argCBIi in Escherichia coli / J.P. Weerasinghe, T. Dong, M.R. Schertzberg, et al.//BMC Microbiology. 2006. - V. 6. - P. 14.

219. Weichart D. Global role for ClpP-eontaining proteases in stationary-phase adaptation of Escherichia coli / D. Weichart, N. Querfurth, M. Dreger, et al.//J. Bacteriol. 2003. - V. 185. -N. 1,- P. 115-125.

220. Wertheimer S.J. Putrescine and spermidine sensitivity of lysine decarboxylase in Escherichia coli: evidence for a constitutive enzyme and its mode of regulation / S.J. Wertheimer, Z. Leifer//Biochem. Biophis. Res. Commun. 1983. - V. 114. - P. 882-888.

221. Wolfe A.J. The acetate switch / A.J. Wolfe//Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2005.-V. 69.-N. l.-P. 12-50.

222. Workum M. DNA supercoiling depends on the phosphorylation potential in Escherichia coli / M. Workum, S.J.M. van Dooren, N. Oldenburg, et al.//Mol. Microbiol. 1996. - V. 20. - N. 2. - P. 351-360.

223. Wosten M.M. Eubacterial sigma-factors / Wosten M.M.//FEMS Microbiol. Rev. 1998.-V. 22. - P. 127-150.

224. Wright J.M. Negative control of ornithine decarboxylase and arginine decarboxylase by adenosine-3:5-monophosphate in E.coli / J.M. Wright, S.M. Boyle//Mol. Gen. Genet. 1982. - V. 186. - P. 482-487.

225. Yamaguchi A. Difference in pathway of Escherichia coli outer membrane permeation between penicillins and cephalosporins / A. Yamaguchi, N. Tomiyama, R. Iliruma, et al.//FEBS Lett. 1985. - V. 181. - N. l.-P. 143148.

226. Yamamoto K. Functional characterisation in vitro of all two-component signal trunsduction systems from Escherichia coli / K. Yamamoto, K. Hirao, T. Oshima, et al.//J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - N. 2. - P. 1448-1456.

227. Yang S. Quorum sensing and multidrug transporters in Escherichia coli / S. Yang, C.R. Lopez, E.L. Zechiedrich//PNAS. 2006. - V. 103. - N. 7. - P. 2386-2391.

228. Yohannes E. Polyamine stress at high pi I in Escherichia coli K-12 / E. Yohannes, A.E. Thurber, J.C. Wilks, et al.//BMC Microbiology 2005. - V. 5.-P. 59.

229. Yoshida M. A unifying model for the role of polyamines in bacterial cell growth, the polyamine modulon / M. Yoshida, K. Kashiwagi, A. Shigemasa, et al.//J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - N. 44. - P. 46008-46013.

230. Yura T. Regulation of heat-shock response in bacteria / T. Yura, H. Nagai, H. Mori//Annu. Rev. Microbiol. 1993. - V. 47. - P. 321-50.

231. Zhang A.X. The OxyS regulatory RNA represses rpoS translation and binds the Hfq (HF-I) protein / A.X. Zhang, S. Alluvia, A. Tiwari, et al.//EMBO J. -1998.-V. 17.-P. 6061-6068.

Информация о работе

Шумков, Михаил Сергеевич
кандидата биологических наук
Пермь, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы