Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к сублетальному действию антибиотиков

Ахова, Анна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к сублетальному действию антибиотиков
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к сублетальному действию антибиотиков"

На правах рукописи

АХОВА Анна Викторовна

РОЛЬ ПОЛИАМИНОВ В АДАПТАЦИИ ESCHERICHIA COU К СУБЛЕТАЛЬНОМУ ДЕЙСТВИЮ АНТИБИОТИКОВ

03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 0Е5 2011

Пермь-2011

4854390

Работа выполнена в лаборатории адаптации микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Ткаченко Александр Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпункна Тамара Исаковна доктор медицинских наук, профессор Тимашева Ольга Анатольевна

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва

Защита состоится « № » оглА^ЛА 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, Пермь, ул. Голева, 13. Факс: (342) 280 92 11

Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН: http://www.iegm.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан д^чЗЬаУЯ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Распространение антибиотикоустойчивых форм патогенных микроорганизмов в последнее время происходит в широких масштабах и с высокой скоростью. Знание механизмов, лежащих в основе антибиотикорезистентности, могло бы способствовать ее успешному преодолению и повышению эффективности антибактериальной терапии.

Комплексное воздействие неблагоприятных факторов внешней среды на микроорганизмы способствовало формированию у них универсальных механизмов защиты. Функциональные возможности данных систем адаптации могут быть направлены, среди прочего, на противодействие антибиотикам и являться основой формирования множественной антибиотикорезистентности. Среди таких неспецифических адаптивпых механизмов выделяют ограничение проникновения антибиотиков в клетку, а также их активное выведете из клетки посредством работы помп множественного лекарственного выброса (Сидоренко, Тишков, 2004). В последнее время появляются сообщения о вовлеченности активных форм кислорода (АФК) в антибактериальное действие разных групп антибиотиков (А1ЬеБа еГ а1. 2004; КоЬапзЫ еС а1., 2007). Поскольку действие антибиотиков сопровождается окислительным повреждением бактериальной клетки, функционирование систем антиоксидаптной защиты могло бы вносить вклад в снижение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. В качестве неспецифических адаптогенов, принимающих участие в процессе приспособления разнообразных организмов (от бактерий до растений и млекопитающих) к неблагоприятным условиям среды, рассматривают полиамины (Шгее е/ а1, 2007; Кашпо е( а1, 2008). Биогенные полиамины (путресцин, спермидин, кадаверин) оказывают влияние на устойчивость клеток Е. соЫ к окислительному, кислотному, тепловому и другим видам стресса (Ткаченко и др., 1997, 1998 и др.). Защитное действие полиаминов, основанное, в частности, на их антиоксидантных свойствах (На е1 а1, 1998; Ткаченко и др., 2001) и способности ингибировать проницаемость пориновых каналов клеточной степки ((1е1а\^а, Бекоиг, 1996) послужило основанием

для предположения о возможном участии этих соединений в адаптации бактериальных клеток к действию антибиотиков.

Цель работы - изучение роли полиаминов в формировании адаптивного ответа E.coli на действие антибиотиков, относящихся к различным классам. Основные задачи исследования:

1. Исследовать активность основных ферментов синтеза полиаминов в условиях сублетального действия ß-лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков.

2. Оценить влияние полиаминов на чувствительность Е. coli к антибиотикам разных классов.

3. Исследовать изменение энергетического статуса клеток Е. coli в условиях сублетального действия антибиотиков.

4. Изучить роль полиаминов в защите клеток от окислительного стресса, индуцированного воздействием антибиотиков.

5. Оценить вклад различных полиаминов в регуляцию проницаемости пориновых каналов клеточной стенки Е. coli для антибиотиков.

Научная новизна. Установлено, что в ответ на действие ß-лактамных и фторхинолоновых антибиотиков в клетках Е. coli происходит возрастание активности ключевых ферментов синтеза полиаминов и увеличение их внутриклеточной концентрации. Показано, что накопление в клетках полиаминов (как за счет добавки извне, так и в результате эндогенного синтеза) сопровождается повышением их устойчивости к действию ß-лактамных, фторхиполоновых и аминогликозидных антибиотиков. Впервые показана роль антиоксидантных свойств полиаминов в приспособлении клеток Е. coli к сублетальному действию трех исследованных групп антибиотиков. Выявлена роль путресцина и спермидина в защите бактериальной ДНК от повреждений, вызванных действием антибиотиков, в условиях in vivo. На основании различий эффектов полиаминов получены данные об их функциональной специализации в формировании адаптивного ответа клетки на действие антибиотиков: путресцин и спермидин, преимущественно, оказывают антиоксидантное и ДНК-протекторное

действие, в то время как кадаверин выполняет функции регулятора проницаемости клеточной стенки.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представления о механизмах неспецифического защитного ответа бактериальных клеток на действие разных классов антибиотиков и роли полиамипов в этом процессе.

Материалы диссертации используются в лекционном курсе «Адаптация микроорганизмов к стрессу» на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета.

Выявленная зависимость устойчивости клеток к антибиотикам от содержания полиаминов в среде культивирования свидетельствует о необходимости стандартизации сред по данному параметру при определении антибиотикочувствительности микроорганизмов и является практически значимым результатом.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Воздействие антибиотиков вызывает разобщение энергетического и конструктивного обменов и развитие окислительного стресса в клетках Е. coli, что является сигналом для активации системы синтеза полиаминов.

2. Полиамины повышают устойчивость Е. coli к действию ß-лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков.

3. В условиях окислительного стресса, индуцированного воздействием антибиотиков, полиамины оказывают антиоксидаптное и ДНК-протекторное действие.

4. Выявлена функциональная специализация полиаминов в условиях воздействия антибиотиков: кадаверин, преимущественно, играет роль регулятора проницаемости клеточной стенки, тогда как путресцин и спермидин защищают бактериальную клетку от окислительного повреждения.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на 11-, 12-, 14-ой Путинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007, 2008, 2010); 3-, 4-, 5-ой

международных молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007, 2008, 2009); международной научной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения» (Саранск, 2008); 7-ой международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет» (Пермь, 2008); 3-ей международной конференции молодых ученых «Биология от молекулы до биосферы» (Харьков, Украина,

2008); 3ri Congress of European Microbiologists FEMS (Gothenburg, Sweden,

2009); 35Л FEBS Congress «Molecules of Life» (Gothenburg, Sweden, 2010).

По теме диссертации опубликована 21 печатная работа.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования, их обсуждения, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 34 рисунками. Список литературы включает 259 работ отечественных и зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполпена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Механизмы адаптации микроорганизмов к стрессу», индекс приоритетного направления 5.19,5.21,5.24, номер госрегистрации 01.2.01.2.00 3 06932. Работа дополнительно финансировалась в рамках программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», а также была поддержана грантами РФФИ (04-04-97501, 09-04-99006) и грантом Уральского отделения РАН для молодых ученых.

Список сокращений. АСБ-абсошотно сухая биомасса, АФК-активные формы кислорода, ЛДК-лизиндекарбоксилаза, ОДК-орнитиндекарбоксилаза.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования использованы культуры различных штаммов Escherichia coli (Табл. 1). Бактериальные клетки выращивали на LB-(Luria-Bertani)-6yribOHe при 37°С и частоте вращения 100 об/мин. Биомассу

клеток оценивали по оптической плотности культуры (Амо). Исследуемые антибиотики, принадлежащие к группам фторхинолонов (налидиксовая кислота, левофлоксацин, ципрофлоксацин, пефлоксацин), р-лактамов (цефотаксим, цефепим, цефазолин) и аминогликозидов (иетилмицин, амикацин) вносили в бактериальную культуру при А^хрО.З.

Таблица 1

Бактериальные штаммы, использованные в работе_

Штаммы и плазмиды Генотип Источник

Штаммы:

R091 МС4100 (ARZ5:rpoS742::lac2{ hybr]) R. Hengge, Германия

HS1600 МС4100 (rpoSBr.TnlO) H. Schellhorn, США

ЕН40 GC4468 (lsoxS::lacZ) (soxRS+) В. Demple, США

ЕН200 GC4468 (XsoxS::lacZ) (AsoxRS)

Плазмиды: pBR322 4361-bp rep и гор из pMBl Ыа из Tn3 tet го pSClOl БНИИСПГУ

Корректное сравнение эффектов антибиотиков разных групп возможно лишь при равной силе их воздействия на бактериальные клетки. Исходя из этого, в качестве интегрального параметра, отражающего интенсивность антибактериального воздействия, было выбрано влияние антибиотиков на уровень накопления биомассы. В большей части экспериментов были использованы концентрации антибиотиков, приводящие к 50%-ному ингибированию накопления биомассы к пятому часу культивирования. Данные сублетальные концентрации (представленные в таблице 2 и Рис. 2) подбирались для конкретного штамма и применялись во всех экспериментах, за исключением исследования повреждения ДНК, которое проводили в условиях 80-90%-ного ингибирования роста.

Для получения бактериальных клеток с разным содержанием эндогенных полиаминов культивирование проводили на минеральной синтетической среде М9 (Miller, 1992), содержащей глюкозу (0,4 %) и предшественники полиаминов - орнитин или лизин (10 г/л). Клетки выращивали при 37°С и частоте вращения 100 об/мин до момента максимального накопления полиаминов. После этого клетки отмывали, доводили до А^срОД в свежей среде М9 и подвергали действию антибиотиков.

Уровень экспрессии исследуемых генов оценивали по активности ß-галактозидазы в клетках, несущих слияние промотора соответствующего гена со структурной частью lacZ. Активность ß-галактозидазы определяли в клетках, предварительно обработанных смесью додецилсульфата натрия и хлороформа, методом Миллера (Miller, 1972).

Активность ферментов синтеза полиаминов клеточного экстракта оценивали по накоплению конечного продукта - путресцина или кадаверина, синтезированного in vitro в орнитин- или лизиндекарбоксилазной реакции (Ткаченко, Чудинов, 1989). Анализ полиаминов проводили методом ТСХ и ВЭЖХ их дансил-производных (Ткаченко и др., 2006). Определение концентрации белка проводили методом Лоури (Lowry et al., 1951). Содержание адениловых нуклеотидов оценивали методом ВЭЖХ с использованием диодно-матричного детектора.

Антибиотикочувствительность оценивали по значениям минимальной подавляющей концентрации антибиотика методом серийных разведений в бульоне, а также диско-диффузионным методом в соответствии с Методическими указаниями (МУК 4.2.1890-04,2004).

Детектирование гидроксильного радикала проводили флуоресцентным методом с использованием 3'-(р-гидроксифенил)флуоресцеина (SetsuMnai et al, 2003).

Транспортную активность пориновых каналов внешней мембраны Е. coli определяли в соответствии с модифицированным методом Циммермана и Росселета (Nikaido et al., 1983).

Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса с применением набора GenElute Plasmid Miniprep Kit («Sigma»). Статистическая обработка результатов исследований была проведена с использованием пакета программ Statistica for Windows 5.0 (StatSoft Inc., 1995). На статистических рисунках приведены средние данные из серии однотипных экспериментов (не менее трех) в формате среднее ± ошибка среднего. В таблицах данные представлены в формате среднее ± среднее квадратическое отклонение. Нестатистические рисунки демонстрируют один

типичный эксперимент из серии. Оценка статистической значимости различий средних сравниваемых групп произведена с использованием непарного t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние антибиотиков на активность системы синтеза полиаминов. Из девяти исследованных антибиотиков только аминогликозиды не оказывали существенного влияния на содержание клеточных полиаминов (Табл. 2).

Таблица 2

Влияние антибиотиков на содержание полиаминов в клетках Е. coli R091

2 час 4 час 6 час

Контроль 63,9+18,73 48,3±26,16 33,3±12,20

Цефепим (0,07 мкг/мл) 92,4±5,58 36,2±12,83 23,4±4,80

Цефотаксим (0,07 мкг/мл) 102,6±32,37 38,8±10,42 32,7±13,65

Цефазолин (2 мкг/мл) 136,3±5б,55 39,4±15,00 60,5±21,50

Левофлоксацин (0,012 мкг/мл) 110,б±1б,42 15,5±1,54 32,8+13,27

Ципрофлоксацин (0,008 мкг/мл) 8б,2±9,13 31,4±7,39 19,7±6,12

Пефлоксацин (0,036 мкг/мл) 97,5±24,26 43,9+14,20 32,5+13,44

Налидиксовая к-та (4 мкг/мл) 80,9±23,62 30,4+4,86 24,3+4,47

Амикацин (0,6 мкг/мл) 55,4±18,85 17,5±4,08 39,8+7,91

Нетилмицин (0,3 мкг/мл) 67,8+15,88 78,0+29,56 72,7+47,74

КАДАВЕРИН (нмоль/мг АСБ)

Контроль 35,1+15,57 20,2±8,88 27,7±9,69

Цефепим 133,4±39,96 183,0±60,92 203,7±73,35

Цефотаксим 54,8±22,46 91,5±25,30 121,3±43,38

Цефазолин 70,7±44,01 84,7±49,02 95,5±54,69

Левофлоксацин 57,4±18,33 92,8±21,79 149,б±38,16

Ципрофлоксацин 63,2±16,43 115,8±33,49 158,1±31,2б

Пефлоксацин 6б,8±11,74 158,9±53,31 179,0*66,78

Налидиксовая к-та 63,2±16,82 98,5±17,93 94,2±28,97

Амикацин 48,9±17,22 28,7+7,15 55,1+8,06

Нетилмицин 33,0±14,58 16,7+6,36 38,0+11,00

СПЕРМИДИН (нмоль/мг АСБ)

Контроль 26,9±10,26 29,4±18,57 22,8+7,48

Цефепим 43,4±6,98 31,0±9,70 28,3+5,94

Цефотаксим 48,4±21,14 26,5±7,29 18,0+5,61

Цефазолин 64,8±3,68 23,5±6,15 29,6±4,85

Левофлоксацин 61,2±34,50 18,0+2,69 32,4±13,70

Ципрофлоксацин 33,3±3,57 31,2+10,20 20,4±7,79

Пефлоксацин 33,7±13,68 29,5±14,30 29,2+16,61

Налидиксовая к-та 25,4±6,12 31,1±9,92 23,7+10,98

Амикацин 26,0±4,74 10,8+2,36 35,2±0,62

Нетилмицин 25,6±12,30 24,2±10,84 31,3±20,63

Жирным курсивом выделены значения, статистически значимо отличающиеся от контроля.

Все другие антибиотики вызывали 1,5-2-кратное возрастание концентрации путресцина и кадаверина по сравнению с контролем уже ко второму часу после их внесения. Кроме того, большая часть фторхинолонов и Р-лактамов инициировала накопление спермидина.

Наблюдаемое изменение концентрации клеточных полиаминов обусловлено возрастанием активности ферментов их синтеза. Повышение активности ключевого фермента синтеза путресцина и спермидина, орнитиндекарбоксилазы (ОДК), в клетках, подвергнутых действию цефотаксима и левофлоксацина, в отличие от нетилмицина (Рис. 1), согласуется с данными по накоплению полиаминов (Табл. 2).

I 8

5 *

0) 6 ю

■i5 t;

I 4

л 2 i-

1 1 ш

1°

Рис. 1. Изменение орнитиндекарбоксилазной активности в клетках Е. coli R091 в ответ на сублетальное действие антибиотиков. 1 - контроль, без добавок, 2 - цефотаксим, 3 - левофлоксацин, 4 - нетилмицин. * - отсутствие статистически значимого отличия от контроля.

Фермент синтеза кадаверина, лизиндекарбоксилаза (ЛДК), представлен у Е. coli двумя изоформами - CadA и LdcC (Kikuchi et al, 1998). Данные изоферменты различаются оптимумами pH, что позволило оценить влияние антибиотиков на активность каждого из них (Рис. 2А). Все исследованные антибиотики, за исключением аминогликозидов, индуцировали

лизиндекарбоксилазную активность в клетках Е. coli. Фторхинолоны и ß-лактамы вызывали равнозначное изменение активности CadA. В то же время, степень влияния на активность LdcC зависела от класса антибиотиков: фторхинолоны оказывали более выраженный стимулирующий эффект по сравнению с ß-лактамами.

1 2 3 4 5 6

Рис. 2. Влияние сублетальных концентраций цефотаксима (1), цефазолина (2), левофлоксацина (3), пефлоксацина (4), нетялмицияа (5) и амикацина (6) на активность лизиндекарбоксилаз (А) и экспрессию генов soxS и rpoS (Б). Активность ЛДК и экспрессия гена rpoS определена в клетках Е. coli R091. Экспрессия гена soxS определена в клетках Е. coli EH4Û, подвергнутых действию 0,07 мкг/мл цефотаксима, 2 мкг/мл цефазолина, 0,018 мкг/мл левофлоксацина, 0,042 мкг/мл пефлоксацина, 0,3 мкг/мл нетилмицина, 0,6 мкг/мл амикацина Уровень индукции - отношение активности фермента в клетках культуры, выращенной в присутствии антибиотика, к его активности в клетках контрольной культуры.

Различие в степени индукции двух изоформ ЛДК в ответ на добавку антибиотиков разных классов предполагает наличие различных механизмов регуляции их активности в данных условиях. Известно, что в регуляции экспрессии генов cadA и IdcC принимают участие транскрипционные регуляторы SoxS и RpoS, соответственно (Kikuchi et ai, 1998; Kim et al., 2006). Исследование экспрессии генов, кодирующих данные транскрипционные регуляторы, показало, что индукция гена soxS, в равной мере, происходит в ответ на добавку и ß-лактамных, и фторхинолоновых

антибиотиков. Вместе с тем, повышение экспрессии rpoS паблюдалось, преимущественно, под действием фторхинолонов. Такая специфичность может быть связана со строением молекулы антибиотиков данного класса, которые по своей структуре близки к 4-хинолонам - сигнальным молекулам «системы ощущепия кворума» (quorum sensing), обладающим способностью влиять на экспрессию rpoS у псевдомонад (Pesci et al., 1999; Diggle et al., 2003). Исследование лизиндекарбоксилазной активности в клетках дефицитных по soxS или rpoS подтвердило участие данных транскрипционных регуляторов в индукции ЛДК в ответ на действие антибиотиков (Табл. 3). В клетках с делецией rpoS активность LdcC была значительно снижена, а отсутствие гена soxS сопровождалось снижением способности CadA индуцироваться в ответ на добавку антибиотиков.

Таблица 3

Участие транскрипционных регуляторов вохв и 11ро8 в регуляции активности лизиндекарбоксилаз в клетках Е.соЦ в ответ на добавку __левофлоксацина_

Штамм Е. coli Активность LdcC, нмоль/мг АСБ Активность CadA, нмоль/мг АСБ

контроль левофлоксацин контроль левофлоксацин

R091 (rpoS+) HS 1600 (rpoS-) 2,9±0,11 0,7зЮ,21л 5,1±0,96* 0,9±0,26л 3,0+0,22 2,7±0,71 4,4+0,29* 5,5+0,59*

EH40 (soxS+) EH200 (soxS-) 14,7+1,89 13,4+0,80 24,2±1,22* 27,3±ЭД5* 16,4+0,79 14,1±0,50 22,2±0,95* 16,0±1,01Л

* - статистически значимое отличие от контрольной культуры без добавки антибиотика, л - статистически значимое отличие от соответствующего показателя в клетках дикого типа.

Если для CadA индуцирующие условия были установлены ранее (Meng, Bennett, 1992; Kim et al., 2006), об LdcC было известно лишь то, что ее содержание в клетке возрастает при переходе к стационарной фазе роста (Kikuchi et al., 1998). Нами установлено, что индуцирующим фактором для LdcC является воздействие ß-лактамных и, в особенности, фторхинолоновых антибиотиков.

Возрастание внутриклеточного содержания полиаминов в ответ на добавку ß-лакгамов и фторхинолонов послужило основанием для дальнейшего изучения их роли в адаптации Е. coli к действию антибиотиков.

Влияние полиаминов на устойчивость Е. coli к действию антибиотиков. На основе анализа коллекции микроорганизмов лаборатории адаптации микроорганизмов ИЭГМ выбран штамм (Е. coli ЕН40), базовое содержание кадаверина в клетках которого в отсутствие стрессорных воздействий было почти в 3 раза выше, чем в клетках Е. coli R091, на котором проведена основная часть экспериментов по данной работе. Определение антибиотикочувствителыюсти этих штаммов диско-диффузионным методом показало, что клетки с повышенным содержанием кадаверина были менее чувствительны к действию фторхинолонов (Табл. 4).

Сравнение антибиотикочувствителыюсти (диаметр зон подавления роста, мм) штаммов Е. coli с разным уровнем эндогенного кадаверина

* - статистически значимое отличие от контрольной культуры штамма Е. соН 11091.

Оценка устойчивости клеток Е. соН К091 в зависимости от внутриклеточного пула эндогенных полиамгашв подтвердила обнаруженную закономерность (Рис. ЗБ). Для получения клеток с разным содержанием полиаминов их культивировали в присутствии предшественников полиаминов - лизина или орнитина. Наличие в среде культивирования орнитина приводило почти к трехкратному увеличению внутриклеточной концентрации путресцина, а добавка лизина сопровождалась накоплением эндогенного кадаверина, который не обнаруживался в клетках, выращенных в отсутствие аминокислот. На фоне накопления в клетках путресцина происходило снижение их чувствительности к представителям всех трех исследованных групп антибиотиков. Наличие кадаверина обеспечивало повышение устойчивости к действию фторхинолона и |3-лактама.

Таблица 4

Антибиотик

Ecoli R091 E-coli ЕН40

Ципрофлоксацин

Левофлоксацин

Пефлоксацин

Налидиксовая кислота

Цефотаксим

Цефексим

Цсфазолин

Амикацин

Гентамицин

37,6+1,2 31,7+4,0*

38,3+0,5 34,0+1,0*

35,6±1,2 33,4+0,75*

23,5±1,б 22,0±1,0

29,3+0,8 29,2±2,7

23,8±1,2 24,3±1,2

21,0±1,4 22,5±1,9

22,5±1,5 22,2+1,5

20,8+1,6 18,0+0,6

В последующих экспериментах проведена оценка влияния добавки

экзогепных полиаминов на устойчивость Е. coli к антибиотикам. Присутствие

в среде культивирования путресцина повышало выживаемость клеток Е. coli,

подвергнутых действию ß-лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных

антибиотиков (Рис. ЗА).

I I путресцин У///Л кадаверин .....HS контроль Т

123 123 LB LBnT

123 123

М9 М9ЛИЗ

Рис. 3. Влияние полиаминов на выживаемость клеток Е. coli R091, подвергнутых действию левофлоксацина (1), амикацина (2) и цефотаксима (3). При культивировании на LB-бульопе в присутствии 10 мМ путресцина (ПТ) выживаемость определена через 60 минут после добавки антибиотиков (Табл. 2). Выживаемость клеток, выращенных на среде М9 в присутствии 10 г/л орнитина (Орн) или лизина (Лиз), определена на второй час действия 0,030 мкг/мл левофлоксацина, 2 мкг/мл цефотаксима и 2,5 мкг/мл амикацина. * - отсутствие статистически значимых отличий от контроля без антибиотика.

Определение минимальных подавляющих концентраций методом двукратных серийных разведений показало, что в присутствии полиаминов в среде происходит пропорциональное их концентрации снижение чувствительности клеток к трем исследованным группам антибиотиков (Табл. 5). Обращает на себя внимание то, что максимальный эффект оказывал

спермидип, который в концентрации 5 мМ повышал минимальные подавляющие концентрации антибиотиков в 4 раза.

Таблица 5

Изменение минимальных подавляющих концентраций антибиотиков

Концентрация пшгваминов, мМ Левофлоксацин Цефотаксим Нетилмицин

Контроль 0 0,012 0,078 0,12

Путресцин 5 0,012 0,078 0,12

10 0,025 0,15 0,5

50 0,05 0,31 1

Спермидин 5 0,05 0,31 0,5

10 0,05 0,31 0,5

25 0,1 0,31 1

Кадаверин 10 0,012 0,078 0,12

25 ' 0,012 0,078 0,25

50 0,025 0,15 0,5

Таким образом, накопление в клетках полиаминов сопровождается повышением их устойчивости к действию р-лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков. Положительный эффект варьирует в ряду различных полиаминов и зависит от класса антибиотика.

Развитие окислительного стресса как следствие разобщения обменных процессов в результате сублетального действия антибиотиков. В последнее время появляются данные о вкладе окислительного повреждения в бактерицидное действие антибиотиков разных классов (КоЬапвЫ е* а1, 2007). В наших экспериментах по изучению сублетального действия антибиотиков также наблюдалось развитие окислительного стресса, о чем свидетельствует увеличение внутриклеточной концентрации АФК и индукция регулона антиоксидантной защиты ¡охЙЯ. Установлено, что фторхинолоны и Р-лактамы, в отличие от аминогликозидов, вызывают повышение экспрессии мхБ (Рис. 2Б, 4Б). В то же время, увеличение количества гидроксильных радикалов регистрировалось в клетках, подвергнутых действию всех трех исследованных групп антибиотиков (Рис. 4А). Отсутствие индукции гена на фоне повышения количества АФК в ответ на добавку аминогликозидов может быть связано с особенностями антибактериального действия данных препаратов. Аминогликозиды, как известно, нарушают процесс трансляции, что ведет к остановке синтеза белков, в том числе и Р-

галактозидазы, по активности которой судят об интенсивности считывания гена $0x5. По всей вероятности, отсутствие отклика полиаминсинтезирующей системы в случае действия аминогликозидов (Табл. 2) также связано с общим угнетением синтеза белка и не является специфическим ответом на действие данной группы антибиотиков.

Рис. 4. Влияние антибиотиков на уровень продукции гидроксильных радикалов (А) и экспрессии гена soxS (Б). Конт - культура без добавки антибиотиков. Уровень продукции гидроксильных радикалов определен в клетках Е. coli R091, экспрессии гена soxS - в клетках Е. coli ЕН40.

Развитие эндогенного окислительного стресса в условиях действия антибиотиков - явление неспецифическое, поскольку не зависит от класса антибиотика, а только от силы антибактериального воздействия (Рис. 4). По-видимому, это является частным проявлением закономерности, описанной T.G. Aidsworth с соавторами: сублетальное воздействие любой природы сопровождается развитием в клетках эндогенного окислительного стресса, который является одной из причин их гибели. Предполагается, что накопление АФК в данных условиях происходит вследствие разобщения конструктивного и энергетического обменов (Aidsworth et al., 1999). Индикатором такого разобщения является изменение внутриклеточной концентрации адениловых нуклеотидов, в частности АТФ (Atkinson et al., 1968). Нами показано, что действие трех исследованных групп антибиотиков

сопровождается увеличением внутриклеточной концентрации общего пула адениловых нуклеотидов (Табл. 6). Сопоставление нескольких показателей во времени показало, что начало возрастания концентрации АТФ, указывающего на разобщении обменных процессов, совпадало с моментом замедления роста бактериальной культуры и сопровождалось индукцией свидетельствующей о начале развития окислительного стресса (Рис. 5).

Таблица 6

Влияние антибиотиков на содержание адениловых нуклеотидов в клетках Е. coli R091

Антибиотики Концентрация адениловых нуклеотидов, нмоль/мг АСБ

АТФ АДФ

Контроль 5,4±0,97 0,3±0,10

Цефотаксим 9,6±1,42 0,6+0,05

Левофлоксацин 10,7+1,60 0,6±0,12

Пефлоксацин 8,0±0,06 0,4+0,03

Нетилмицин 6,9+0,57 0,6±0,21

Амикацин 9,0+0,46 0,7+0,06

Жирным курсивом выделены значения, статистически значимо отличающиеся от контроля.

Время, мин

Рис. 5. Влияние левофлоксацина на изменение оптической плотности культуры Е. coli, внутриклеточного пула АТФ и экспрессии гена soxS. 1 - контроль, без добавок, 2 - левофлоксацин. Стрелкой обозпачен момент внесения антибиотика.

Известно, что важным положительным регулятором ОДК на уровне активности фермента является АТФ (Holtta et al, 1972; Ткаченко и др., 1989). Поэтому накопление аденозинтрифосфата в клетке вследствие разобщения обменных процессов под действием антибиотиков можно рассматривать как сигнал к запуску синтеза путресцина и спермидина (Рис. 1).

Поскольку установлено, что ген cadA находится под контролем транскрипционного активатора SoxS (Kim et al., 2006), повышение активности лизиндекарбоксилазы CadA в условиях воздействия антибиотиков можно расценить как неспецифический ответ на эндогенный окислительный стресс.

Таким образом, действие антибиотиков сопровождается разобщением конструктивного и энергетического обменов, накоплением АТФ и развитием окислительного стресса, что является сигналом для активации ферментов синтеза полиаминов.

Антиоксидантные свойства полиампнов при адаптации Е. coli к действию антибиотиков. Помимо аптиоксидантных ферментов, существенную роль в защите от АФК играют низкомолекулярные антиоксиданты способные снижать количество свободных радикалов в клетке. Известно, что такими свойствами обладают полиамины (На et al., 1998). Поэтому повышение устойчивости клеток Е. coli к действию антибиотиков в присутствии полиаминов может быть обусловлено их антиоксидантной активностью.

Добавка полиаминов снижала силу окислительного стресса, вызванного действием антибиотиков, что проявлялось в уменьшении продукции гидроксильных радикалов и экспрессии генов антиоксидантной защиты (soxS) (Рис. 6). Наиболее выраженное действие на экспрессию гена soxS оказывал спермидин, что соответствует способности разных полиаминов реагировать с супероксидными радикалами in vitro (Ткаченко, Федотова, 2007). Результаты флуоресцентного анализа показали, что наиболее эффективно продукцию гидроксильных радикалов снижала добавка путресцина и спермидина, тогда как кадаверин значимого влияния не оказывал.

. 350 i

d> >

§ 300

о •з

g. 250

о >

с;

■е-

jq 200

н о

1 150 и

т ш 1-

S 100

контроль I I левофлоксацин I I амикацин ■■ цефотаксим

г 150

<0 О. 0)

120 С S

90 ф

V) X

о <0

и; s

о ф

а. с

о х

1234 1234 1234

1 2 3 4 1 2 3 4

Рис. 6. Влияние полиаминов на продукцию гидроксильных радикалов (А) и экспрессию гена soxS (Б), вызванных сублетальным действием антибиотиков. 1 - без полиаминов, 2-10 мМ путресцина, 3-10 мМ спермидина, 4-10 мМ кадаверина. Контроль - культура без добавок. * -отсутствие статистически значимых отличий от культуры без полиаминов (1).

В силу своей высокой реакционноспособности АФК могут взаимодействовать с различными компонентами клетки. Известно, что одними из первых атаке АФК подвергаются нуклеиновые кислоты. Результатом такого взаимодействия может стать появление разрывов в молекуле ДНК (Nunoshiba et al, 1999). С целью изучения повреждающего воздействия антибиотиков на ДНК in vivo был проведен анализ плазмидной ДНК, выделенной из клеток, трансформированных pBR322, которые были подвергнуты действию антибиотиков. Повреждения регистрировались по появлению характерного «шмера» по ходу продвижения фракций ДНК в агарозном геле, интенсивность которого служила показателем силы повреждающего воздействия.

Воздействие на бактериальные клетки всех трех исследованных классов антибиотиков, вне зависимости от специфического механизма их антибактериального действия, вызывало фрагментацию бактериальной ДНК (Рис. 7). Как продемонстрировано на примере левофлоксацина, путресцин и

спермидин в концентрации 10 мМ практически полностью снимали повреждающий эффект антибиотика, что выражалось в исчезновении «шмера» на электрофореграмме, тогда как кадаверин не оказывал выраженного действия на степень повреждения ДНК (Рис. 8).

Рис. 7. Повреждение ДНК Е. соИ 1Ю91 рВЮ22 при воздействии разных классов антибиотиков.

Контроль - без антибиотиков, ЦФТ - 0,7 мкг/мл цефотаксима, ЛФЦ - 0,024 мкг/мл левофлоксацина, АМЦ - 1 мкг/мл амикацина.

Контроль ЦФТ ЛФЦ АМЦ

ДНК-протекторное действие известного антиоксиданта - тиомочевины (КоЬапБк! ег а1., 2007) подтверждает окислительную природу повреждений ДНК в условиях воздействия антибиотиков (Рис. 8).

контроль_ левофлоксацин И к левофлоксацин

ПТ СД КД ПТ СД КД I СД Т10 Т50Т100

Рис. 8. Влияние полиаминов и тиомочевины на степень повреждения ДНК Е. coli R091 pBR322 в присутствии 0,024 мкг/мл левофлоксацина.

Контроль (к) - без антибиотика, ПТ - 10 мМ путресцина, КД - 10 мМ кадаверина, СД - 10 мМ спермидина, TIO, Т50, Т100 - 10, 50, 100 мМ тиомочевины, соответственно.

Сравнение защитного действия тиомочевины и спермидина в отношешш ДНК показало, что эффективность последнего была на порядок выше. Исходя из того, что полиамины и тиомочевина обладают примерно равными возможностями «гасить» свободные радикалы in vitro (Das, Misra, 2004), можно предположить, что защитное действие полиаминов основывается не только на их способности нейтрализовать АФК. ДНК-протекторное действие полиаминов может быть обусловлено также их способностью непосредственно взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами (Abraham, Pihl, 1981). В пользу последнего свидетельствует отсутствие ДНК-протекторного эффекта у кадаверипа, который обладает меньшим сродством к ДНК (Liquori et al., 1967). Способность полиаминов взаимодействовать с ДНК обеспечивает высокие локальные концентрации полиаминов и дает им конкурентное преимущество в связывании по сравнению с иопами металлов с переменной валентностью - источниками электронов в реакции образования гидроксилышх радикалов, а также вызывает компактизацию ДНК и экранирование сайтов для атаки АФК (Spotheim-Maurizot et al, 1995).

Таким образом, в условиях окислительного стресса, вызванного действием антибиотиков, полиамины, главным образом путресцин и спермидин, оказывают антиоксидантный эффект.

Роль полиаминов в ограничении проницаемости внешней мембраны Е. coli для антибиотиков. Ограничение проницаемости внешней мембраны широко используется грамотрицательными микроорганизмами как средство адаптации ко многим видам стресса и связано с регуляцией количества и транспортной активности пориновых белков. Существенную роль в регуляции порнпового транспорта играют полиамины, обладающие способностью взаимодействовать с пориновыми каналами и блокировать их просвет (delaVega, Delcour, 1996). На первых этапах воздействия антибиотиков мы наблюдали противоположно направленное изменение степени пориновой проницаемости и уровня накопления эндогенных путресцина и спермидина. Одпако корреляционной зависимости между данными параметрами

установить не удалось. В то же время, изучение влияния индуцированного антибиотиками накопления эндогенных полиаминов на изменение пориновой проницаемости выявило достоверную отрицательную корреляцию (1^-0,485 при р<0,03) между транспортной активностью пориновых каналов и внутриклеточной концентрацией кадаверина (Рис. 9). Это дает основание считать, что именно кадаверин играет роль основного регулятора проницаемости пориновых каналов в ряду других полиаминов.

1 8

Т"

s 7

0 S

S 6

1 4

-а

о о

* 3

250

200 < L.

150 § z

100 |

50 с

2 час

4 час

6 час

Рис. 9. Изменение проницаемости клеточной стенки (1), содержания кадаверина (2), путресцина (3) и спермидина (4), вызванное сублетальным действием пефлоксацина. Момент внесения антибиотика обозначен стрелкой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что полиамины принимают активное участие в адаптации Е. coli к действию антибиотиков. Накопление полиаминов в бактериальных клетках (как за счет эндогенного синтеза, так и в результате добавки извне) обеспечивает повышение их устойчивости. Более детальное изучение роли полиаминов в приспособлении к действию антибиотиков показало их участие, по меньшей мере, в трех адаптивных механизмах: 1) ограничении проницаемости

клеточной стенки для антибиотиков, 2) аптиоксидантной защите клетки, 3) протекторном действии, направленном на сохранение целостности ДНК. В формировании адаптивного ответа Е. соИ на действие антибиотиков кажется обоснованной следующая цепь событий (Рис. 10). Воздействие антибиотика на клетки микроорганизмов вызывает разобщение энергетического и конструктивного обменов, что сопровождается накоплением АТФ и развитием эндогенного окислительного стресса. Это является сигналом для активации ферментов синтеза полиаминов и накопления полиаминов в клетках. Кадаверин, преимущественно, играет роль регулятора проницаемости поринов внешней мембраны, тогда как путресцин и спермидин защищают бактериальную клетку от окислительного повреждения.

Рис. 10. Роль полиаминов в адаптивном ответе Е. coli на действие антибиотиков. ПТ - путресцин, СД - спермидин, КД - кадаверин, AM -аминогликозиды, ß-JI - ß-лактамы, ФХ - фторхинолоны. Серые стрелки -стимулирующее действие, черные стрелки - репрессирующее действие.

Таким образом, совокупным результатом действия описанных механизмов является то, что полиамины повышают устойчивость клеток Е. coli к действию ß-лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что результатом сублетального воздействия фторхинолонов, р-лактамов и аминогликозидов на клетки микроорганизмов является разобщение обменных процессов, приводящее к накоплению АТФ и развитию эндогенного окислительного стресса.

2. Сублетальное действие р-лактамных и фторхинолоновых антибиотиков индуцирует в клетках Е. coli активность ферментов синтеза полиаминов, включая орнитиндекарбоксилазу, изоферменты лизиндекарбоксилазы CadA и LdcC, что приводит к внутриклеточному накоплению полиаминов.

3. Показано, что полиамины оказывают антиоксидантпый эффект, снижая количество АФК в клетках Е. coli в условиях развития эндогенного окислительного стресса, вызванного воздействием антибиотиков.

4. Адаптивные функции полиаминов в условиях воздействия антибиотиков специализированы: путресцин и спермидин, преимущественно, выступают в роли протекторов ДНК, защищая ее от разрывов, индуцированных АФК, в то время как кадаверин выполняет функции регулятора проницаемости поринов внешней мембраны, ограничивая транспорт аптибиотиков в бактериальную клетку.

5. Установлено, что возрастание содержания полиаминов в клетках микроорганизмов приводит к повышению их устойчивости к воздействию антибиотиков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Ткаченко А.Г., Шумков М.С., Ахова А.В. Путресцин как модулятор содержания oS-субъединицы РНК-полимеразы в клетках Escherichia coli при кислотном стрессе // Биохимия. - 2006. - Т. 71, № 2. - С. 237-246.

2. Ткаченко А.Г., Шумков М.С., Ахова А.В. Адаптивные функции полиаминов Е. coli при сублетальных воздействиях антибиотиков // Микробиология. - 2009. - Т. 78, № 1. - С. 32-41.

3. Ахова А.В., Ткаченко А.Г. Лизиндекарбоксилазная активность как фактор резистентпости Escherichia coli к фторхинолонам // Микробиология. -2009. - Т. 78, № 5. _ с. 636-640.

Публикации в других сборниках и журналах

4. Ахова А.В., Шумков М.С., Ткаченко А.Г. Роль полиаминов в формировании множественной аптибиотикоустойчивости у Escherichia coli

// Матер. Всероссийской научной конференции «Современные проблемы медицинской микробиологии». - С.-Петербург, 2007. - С. 153-155.

5. Ахова A.B., Шумков М.С. Лизиндекарбоксилазы как фактор адаптации Escherichia coli к действию сублетальных концентраций антибиотиков // Матер. 11-ой Путинской международной конф. молодых учёных «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2007. - С. 230-231.

6. Ахова A.B., Ткаченко А.Г. Регуляция активности лизиндекарбоксилаз Escherichia coli в условиях действия сублеталышх концентраций антибиотиков // Матер, региональной конф. молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии». -Пермь, 2007. - С. 40-41.

7. Ахова A.B. Роль окислительного стресса в формировании адаптивной реакции Escherichia coli на воздействие сублеталызой концентрации различных классов антибиотиков // Матер. Ш Международной молодёжной конф. «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва,

2007.-С. 4-6.

8. Ахова A.B. Механизмы неспецифической антибиотикоустойчивости у Escherichia coli: роль транскрипционных регуляторов SoxS и RpoS // Матер. 1-ой Всероссийской молодежной научной конф. «Молодежь и наука на Севере». - Сыктывкар, 2008. - С. 16-17.

9. Ахова A.B., Шумков М.С., Нестерова Л.Ю., Федотова М.В., Ткаченко А.Г. Роль глобального транскрипционного регулятора RpoS в адаптации Escherichia coli к действию антибиотиков // Матер. Международной научной конф. «Проблемы биоэкологии и пути их решения» - Саранск,

2008.-С. 299-300.

10.Ахова A.B., Федотова М.В., Шумков М.С., Нестерова Л.Ю., Ткаченко А.Г. Антиоксидаптпая функция полиаминов в адаптации Escherichia coli к сублетальному действию антибиотиков И Матер. VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет». -Пермь, 2008. - С. 30.

11. Ахова A.B., Шумков М.С., Нестерова Л.Ю., Федотова М.В., Ткаченко А.Г. Адаптивные функции RpoS и полиамшюв в клетках Escherichia coli при сублетальном воздействии фторхинолоновых антибиотиков II Матер. VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет». - Пермь, 2008. - С. 31.

12.Ахова A.B., Федотова М.В., Шумков М.С., Нестерова Л.Ю., Ткаченко А.Г. Роль системы защиты от окислительного стресса в формировании неспецифической антибиотикоустойчивости Escherichia coli II Матер. VII

Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет». - Пермь, 2008. - С. 62.

13.Ахова А.В., Федотова М.В. Индукция генов антиоксидантной защиты как адаптивная реакция E.coli на действие антибиотиков // Матер. 12-ой Пущинской международной конф. молодых учёных «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2008. - С. 68-69.

14.Ахова А.В., Федотова М.В. Роль антиоксидантной системы защиты в формировании неспецифической антибиотикорезистентности Е. coli // Матер. IV Молодёжной конф. «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва, 2008. - С. 56-57.

15.Федотова М.В., Ахова А.В. Роль полиамипов в формировании неспецифической антибиотикоустойчивости Е. coli II Матер. Ш Международной конференции молодых ученых «Биология от молекулы до биосферы». - Харьков, 2008. - С. 236-237

16.Ахова А.В., Зырянова Е.В. Разобщение энергетического и конструктивного обменов как причина развития окислительного стресса при сублетальном действии антибиотиков // Матер. П Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009». - Пермь, 2009. - С. 189-191

17.Shumkov М., Akhova A., Tkachenko A. Polyamine influence on Е. coli antibiotic resistance under sublethal fluoroquinolone treatment [computer file] / // Abstracts of the 3rd Congress of European Microbiologists FEMS 2009. -Gothenburg, Sweden, 2009. - 1 CD-ROM.

18.Ахова A.B., Шумков M.C., Зырянова E.B. Роль полиаминов в защите бактериальной ДНК от повреждающего действия фторхинолонов // Матер. V Молодежной конф. «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва, 2009. - С. 9.

19.Ахова А.В., Шумков М.С., Зырянова Е.В. Антиоксидантные функции полиаминов в адаптации Escherichia coli к действию антибиотиков II Матер. 14-ой Пущинской международной конф. молодых учёных «Биология - наука XXI века».- Пущино, 2010. - С. 5.

20.Ткаченко А.Г., Ахова А.В. Антистрессорные функции полиаминов в защите микроорганизмов от антибиотиков // Матер. VII Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». - Минск, Беларусь, 2010. - С. 164-166.

21.Akhova A., Shumkov М., Tkachenko A. Polyamine protective functions under antibiotic-mediated bacterial DNA damage II Abstracts of the 35th FEBS Congress: FEBS Journal. - 2010. - V. 277. - Supplement 1. - P. 93.

АХОВА Анна Викторовна

РОЛЬ ПОЛИАМИНОВ В АДАПТАЦИИ ESCHERICHIA COU К СУБЛЕТАЛЬНОМУ ДЕЙСТВИЮ АНТИБИОТИКОВ

Автореферат

Подписано в печать 11.01.2011. Тираж 110 экз. Усл. печ. л. 1,0. Формат 60x84/16. Набор компьютерный. Заказ № 2/2011.

Отпечатано в типографии издательства «Книжный формат» Адрес: г. Пермь, ул. Пушкина, 80.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ахова, Анна Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

Список сокращений.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Роль полиаминов в жизнедеятельности микроорганизмов.

1.1.1. Биогенные полиамины и пути регуляции их внутриклеточной концентрации.

1.1.2. Физиологическая роль полиаминов.

1.1.3. Роль полиаминов в адаптации к стрессу.

1.2. Механизмы антибактериального действия основных групп бактерицидных антибиотиков.

1.2.1. ß-лактамы.

1.2.2. Аминогликозиды.

1.2.3. Хинолоны.

1.2.4. Окислительное повреждение как неспецифический механизм действия антибиотиков разных групп.

1.2.4.1. Механизмы образования активных форм кислорода и их токсическое действие на основные компоненты клетки.

1.2 4 2. Развитие эндогенного окислительного стресса под действием разнообразных стрессовых факторов.

1.2.4.3. Формирование окислительного стресса в условиях воздействия антибиотиков разных групп.

1.3. Механизмы устойчивости бактерий к антибиотикам.

1.3.1. Механизмы специфической устойчивости.

1.3.1.1. Модификация мишени действия.

1.3.1.2. Ферментативная инактиваг\ия антибиотика.

1.3.2. Механизмы неспецифической устойчивости, основанные на функционировании систем адаптации к различным видам стресса.

1.3.2.1. Механизмы множественной лекарственной устойчивости, основанные на ограничении поступления ксенобиотиков в клетку.

1.3.2.2. Активный выброс ксенобиотиков из клетки. Многоцелевые системы выброса.

1.3.2.3. RpoS - глобальный транскрипционный регулятор общего стрессового ответа.

1.3.2.4. MarA/SoxS/Rob — транскрипционные регуляторы множественной антибиотикорезистентности.

1.3.2.5. Влияние полиаминов на устойчивость бактерий к антибиотикам.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Культивирование микроорганизмов.'.1.

2.3. Определение активности ß-галактозидазы.

2.4. Определение содержания полиаминов в клетке.

2.5. Определение активности ферментов синтеза полиаминов.

2.6. Определение концентрации белка.

2.7. Определение содержания адениловых нуклеотидов в клетках.

2.8. Подсчет числа живых клеток.

2.9. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

2.10. Определение содержания активных форм кислорода в клетках.

2.11. Транспортная активность пориновых каналов.

2.12. Оценка повреждения ДНК при действии антибиотиков.

2.13. Статистическая обработка.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГЛАВА 3. Полиамины как фактор устойчивости Е coli к антибиотикам.

3.1. Влияние антибиотиков на активность системы синтеза полиаминов.

3.2. Участие транскрипционных регуляторов SoxS и RpoS в регуляции активности лизиндекарбоксилаз.

3.3. Влияние полиаминов на устойчивость Е. coli к антибиотикам.

3.3.1. Эффект естественного содержания эндогенных полиаминов на степень устойчивости Е coli к антибиотикам.

3.3.2. Влияние экзогенных полиаминов на устойчивость Е coli к антибиотикам.

ГЛАВА 4. Роль полиаминов в адаптации Е. coli к окислительному стрессу, вызванному действием антибиотиков.

4.1. Развитие окислительного стресса как следствие разобщения обменных процессов в результате сублетального действия антибиотиков.

4.1.1. Антибиотики разных классов вызывают усиление продукции активных форм кислорода в клетках Е. coli.1.

4.1.2. Изменение энергетического состояния клеток Е. coli в условиях сублетального действия антибиотиков.

4.2. Роль антиоксидантных свойств полиаминов в адаптации Е coli к действию антибиотиков.

4.3. Сравнение антиоксидантных свойств полиаминов и тиомочевины в условиях действия антибиотиков.

ГЛАВА 5. Роль полиаминов в защите ДНК от повреждающего воздействия антибиотиков

5.1. Сублетальное действие антибиотиков вызывает фрагментацию бактериальной ДНК

5.2. Роль полиаминов в защите ДНК от разрывов, индуцированных сублетальным действием антибиотиков.

5.3. Сравнение ДНК-защитных свойств полиаминов и тиомочевины в условиях действия антибиотиков.

ГЛАВА 6. Ограничение проницаемости внешней мембраны Е coli как механизм защиты от действия антибиотиков.

ГЛАВА 7. Обсуждение результатов.

7.1. Роль полиаминов в формировании адаптивного ответа Е. coli на действие различных групп антибиотиков.

7.2. Антиоксидантное действие полиаминов при адаптации Е. сок к воздействию антибиотиков.

7.3. Влияние полиаминов на окислительное повреждение бактериальной ДНК, вызванное воздействием антибиотиков разных классов.

7.4. Роль полиаминов в ограничении проницаемости внешней мембраны Е. coli для 1 антибиотиков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к сублетальному действию антибиотиков"

Актуальность проблемы. Распространение патогенных микроорганизмов, обладающих устойчивостью к антибиотикам, в последнее время происходит в широких масштабах и с высокой скоростью (Drlica, Malik, 2003; Yamane et al., 2005; Kong et al., 2009). Знание механизмов, лежащих в основе антибиотикорезистентности, могло бы способствовать ее успешному преодолению, и, следовательно, повышению эффективности антибактериальной терапии.

Комплексное воздействие факторов внешней среды на микроорганизмы в местах естественного обитания способствовало формированию у них универсальных механизмов защиты, обеспечивающих выживание в разнообразных стрессовых ситуациях. Функциональные возможности данных систем адаптации к различным неблагоприятным факторам среды могут быть направлены, среди прочего, на противодействие антибиотикам и являться основой формирования неспецифических механизмов антибиотикорезистентности. Среди таких неспецифических адаптивных механизмов выделяют ограничение проникновения антибиотиков в клетку, а также их активное выведение из клетки посредством работы помп множественного лекарственного выброса (Сидоренко, Тишков, 2004).

В последнее время появляются сообщения о вовлеченности активных форм кислорода (АФК) в антибактериальное действие разных групп антибиотиков (Albesa et al. 2004; Kohanski et al., 2007). Поскольку действие антибиотиков сопровождается окислительным повреждением бактериальной клетки, функционирование систем антиоксидантной защиты могло бы вносить вклад в снижение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

В качестве неспецифических адаптогенов, принимающих участие в процессе приспособления разнообразных организмов (от бактерий до

44 растений и млекопитающих) к неблагоприятным условиям среды, все чаще

1< ! рассматривают полиамины (Rhee et al., 2007; Kusano et al., 2008). Биогенные полиамины (путресцин, спермидин и кадаверин) оказывают влияние на устойчивость клеток Е. coli к окислительному, кислотному, тепловому и другим видам стресса (Ткаченко^ и< др., 1997, 1998-и др.)- Поликатионная природа полиаминов обусловливает возможность их взаимодействия' с отрицательно заряженными' группами биополимеров* клетки (Igarashi, Kashiwagi, 2010). Результатом таких взаимодействий является значительное влияние полиаминов на1 основные клеточные процессы (транскрипция;

- . трансляция, транспорт и др.) как в нормальных условиях существования, так и при адаптации к действию»неблагоприятных факторов среды.

Защитное действие полиаминов, основанное, в частности, на их антиоксидантных свойствах (На et al., 1998а; Ткаченко и др., 2001) и способности ингибировать проницаемость пориновых каналов клеточной стенки (delaVega, Delcour, 1996)» послужило основанием для предположения о возможном участии этих соединений'в адаптации бактериальной клетки к действию антибиотиков.

Существующие на данный момент работы, посвященные изучению влияния полиаминов на устойчивость микроорганизмов к антибиотикам, малочисленны и довольно противоречивы (Zakrevskii et al1976; Kwon, 2007). Тем не менее, они демонстрируют способность полиаминов оказывать влияние на антибиотикочувствительность бактериальных клеток, хотя < результат этого влияния и механизмы, лежащие в его основе, остаются малоизученными.

Цель работы - изучение роли полиаминов в формировании адаптивного ответа Е. coli на действие антибиотиков, относящихся к различным классам. Основные задачи исследования:

2. Оценить влияние полиаминов на чувствительность Е. coli к антибиотикам разных классов.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы. Установлено, что в ответ на действие ß-лактамных и фторхинолоновых антибиотиков в клетках Е. coli происходит возрастание активности ключевых ферментов синтеза полиаминов и увеличение их внутриклеточной концентрации. Показано, что накопление в клетках полиаминов (как за счет добавки извне, так и в результате эндогенного синтеза) сопровождается повышением их устойчивости к действию ß-лактамных, фторхинолоновых и аминогликозидных антибиотиков. Впервые показана роль антиоксидантных свойств полиаминов в приспособлении клеток Е. coli к сублетальному действию трех исследованных групп антибиотиков. Выявлена роль путресцина и спермидина в защите бактериальной ДНК от повреждений, вызванных действием антибиотиков, в условиях in vivo. На основании различий эффектов полиаминов сделано предположение об их функциональной специализации в формировании адаптивного ответа клетки на действие антибиотиков: путресцин и спермидин, преимущественно, оказывают антиоксидантное и ДНК-протекторное действие, в то время как кадаверин выполняет функции регулятора проницаемости клеточной стенки.

Полученные результаты расширяют представления о механизмах неспецифического защитного ответа бактериальных клеток на действие разных классов антибиотиков и роли полиаминов в этом процессе.

Основные положения, выносимые на защиту.

3. В условиях окислительного стресса, индуцированного воздействием антибиотиков, полиамины оказывают антиоксидантное и ДНК-протекторное действие.

4. Выявлена функциональная специализация полиаминов в условиях воздействия антибиотиков: кадаверин, преимущественно, играет роль регулятора проницаемости клеточной стенки, путресцин и спермидин защищают бактериальную клетку от окислительного повреждения.

Список сокращений

АСБ - абсолютно сухая биомасса АФК - активные формы кислорода

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ЛДК - лизиндекарбоксилаза

МПК - минимальная подавляющая концентрация

ОДК - орнитиндекарбоксилаза

ТСХ - тонкослойная хроматография

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ахова, Анна Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что результатом сублетального воздействия фторхинолонов, ß-лактамов и аминогликозидов на клетки микроорганизмов является разобщение обменных процессов, приводящее к накоплению АТФ и развитию эндогенного окислительного стресса.

2. Сублетальное действие ß-лактамных и фторхинолоновых антибиотиков индуцирует в клетках Е. coli активность ферментов синтеза полиаминов, включая орнитиндекарбоксилазу, изоферменты лизиндекарбоксилазы CadA и LdcC, что приводит к внутриклеточному накоплению полиаминов.

3. Показано, что полиамины оказывают антиоксидантный эффект, снижая количество АФК в клетках Е. coli в условиях развития эндогенного окислительного стресса, вызванного воздействием антибиотиков.

4. Адаптивные функции полиаминов в условиях воздействия антибиотиков специализированы: путресцин и спермидин, преимущественно, выступают в роли протекторов ДНК, защищая ее от разрывов, индуцированных АФК, в то время как кадаверин выполняет функции регулятора проницаемости поринов внешней мембраны, ограничивая транспорт антибиотиков в бактериальную клетку.

119

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что полиамины принимают активное участие в адаптации Е. coli к действию антибиотиков разных классов. Помимо действия на специфическую мишень антибиотики оказывают общее неспецифическое влияние на бактериальную клетку, которое выражается в разобщении обменных процессов и повышении внутриклеточной генерации АФК. Как неспецифический защитный ответ на это повышается активность ферментов синтеза полиаминов и накопление данных поликатионов в бактериальной клетке.

Накопление вследствие разобщения энергетического и конструктивного обменов в бактериальной клетке АТФ, которая является положительным регулятором орнитиндекарбоксилазы на уровне активности фермента (Ткаченко, Чудинов 1989; Holtta et al., 1972), можно рассматривать как сигнал к увеличению синтеза путресцина и спермидина в ответ на действие антибиотиков.

Повышение продукции АФК под действием антибиотиков приводило к развитию в клетках оксилительного стресса и индукции генов антиоксидантной защиты яохДО-регулона. Активатор транскрипции генов данного регулона, SoxS, вовлечен в регуляцию активности фермента синтеза кадаверина - лизиндекарбоксилазы CadA. Следовательно, опосредованное транскрипционным регулятором SoxS повышение активности CadA и катализируемого ею синтеза кадаверина можно рассматривать как неспецифический ответ бактериальной клетки на окислительный стресс, вызванный воздействием антибиотиков. Нам удалось установить, что в ответ на действие антибиотиков также повышалась активность второй лизиндекарбоксилазы - LdcC, о которой было известно лишь то, что ее содержание в клетке возрастает при переходе к стационарной фазе роста (Kikuchi et al., 1998). Возрастание активности LdcC было обусловлено с увеличением содержания с -субъединицы РНК-полимеразы (rpoS) в клетках и было характерно, в большей степени, для фторхинолоновых антибиотиков. Такая специфичность может быть связана со строением молекулы антибиотиков данной группы, которые по своей структуре очень близки к сигнальным молекулам «системы ощущения кворума» (quorum sensing), относящихся к классу 4-хинолонов (Pesci et al., 1999).

Накопление полиаминов наблюдалось в условиях действия всех исследованных антибиотиков, за исключением аминогликозидов, добавка которых не вызывала повышения ни активности ферментов синтеза полиаминов, ни экспрессии адаптивных генов soxS и rpoS. По всей вероятности, это не является специфической реакцией на действие данных антибиотиков, а связано с общим угнетением синтеза белка аминогликозидами.

Повышение содержания полиаминов в бактериальных клетках (как за счет эндогенного синтеза, так и в результате добавки извне) обеспечивало снижение их чувствительности ко всем трем исследованным группам антибиотиков. Более детальное изучение роли полиаминов в приспособлении к действию антибиотиков показало их участие, по меньшей мере, в трех адаптивных механизмах: 1) ограничении проницаемости клеточной стенки Е. coli для антибиотиков, 2) антиоксидантной защите клетки, 3) протекторном действии, направленном на сохранение целостности структуры ДНК. При этом наблюдалась специализация функций различных полиаминов в реализации ими защитных механизмов.

Изучение влияния индуцированного антибиотиками накопления полиаминов на изменение пориновой проницаемости выявило отрицательную корреляцию между транспортной активностью пориновых каналов и внутриклеточной концентрацией кадаверина, в отличие от путресцина и спермидина. Это позволяет рассматривать именно кадаверин как основной ограничитель проницаемости пориновых каналов из числа полиаминов.

Накопление в бактериальных клетках АФК, сопровождавшее воздействие всех исследованных антибиотиков, вносило свой вклад в эффективность антибактериального действия препаратов. В связи с этим одной из причин ослабления бактерицидного действия антибиотиков при добавке полиаминов могло быть уменьшение окислительного повреждения микробной клетки. Снижение в присутствии полиаминов продукции гидроксильных радикалов и экспрессии гена антиоксидантной защиты (soxS), индуцированных добавкой антибиотиков, наглядно демонстрировало проявление данными поликатионами антиоксидантных свойств. Значительное увеличение в бактериальной клетке продукции АФК отражалось на основных клеточных компонентах, в частности ДНК, фрагментация которой наблюдалась под действием всех исследованных антибиотиков. Одним из направлений защитного действия полиаминов в данных условиях было сохранение целостной структуры нуклеиновых кислот. Более эффективное действие оказывали путресцин и спермидин, которые, благодаря строению своих молекул, обладают большим сродством к ДНК по сравнению с кадаверином (Liquori et al., 1967).

На основе полученных нами результатов и исследований других авторов . роль полиаминов в адаптивном ответе Е. coli на действие антибиотиков разных классов в обощенном виде можно представить следующим образом (Рис. 34). Воздействие антибиотиков вызывает нарушение сопряжения энергетического и конструктивного обменов (приводящее к накоплению АТФ), повышение генерации АФК и развитие эндогенного окислительного стресса в клетках Е. coli. Как адаптивная реакция на эти события повышается активность ферментов синтеза полиаминов, что приводит к их накоплению в бактериальных клетках. Полиамины оказывают антиоксидантное действие, снижая количество АФК, что способствует уменьшению окислительного повреждения компонентов клетки, в частности ДНК. Кроме того, ДНК-протекторное действие полиаминов, в частности путресцина и спермидина, может быть обусловлено их способностью непосредственно связываться с нуклеиновыми кислотами. Кадаверин, выполняя функции регулятора проницаемости пориновых каналов, ограничивает транспорт антибиотиков в бактериальную клетку.

Рис. 34. Роль полиаминов в адаптивном ответе Е. coli на действие антибиотиков.

ПТ - путресцин, СД - спермидин, КД - кадаверин, AM - аминогликозиды, ß-JI - ß-лактамы, ФХ - фторхинолоны. Серые стрелки - стимулирующее действие, черные стрелки - репрессирующее действие. ,,>

Следовательно, такой общий механизм адаптивного ответа на стресс как активация системы синтеза полиаминов задействован в приспособлении: Е. coli к действию антибиотиков разных классов. Защитное действие полиаминов реализуется, как минимум, за счет ограничения транспорта антибиотиков в клетку и посредством противодействия окислительному повреждению клеточных компонентов, в частности ДНК. Снижение чувствительности бактериальных клеток к антибиотикам в результате повышения синтеза полиаминов на уровне физиологического ответа предполагает возможность отбора устойчивых форм, обладающих повышенной активностью полиаминсинтезирующей системы за счет изменений на генетическом уровне.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ахова, Анна Викторовна, Пермь

1. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий // Биохимия. - 2001. - Т. 66, № 5. - С. 592-609.

2. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890-04) // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2004. - Т. 6. -С. 306-359.

3. Сидоренко С.В., Тишков В.И. Молекулярные основы резистентности к антибиотикам // Успехи биологической химии. 2004. - Т.44. - С. 263306.

4. Страчунский JT.C., Козлов С.Н. Современная антимикробная химиотерапия. Руководство для врачей. М.: Боргес. - 2002. - 432 с.

5. Ткаченко А.Г. Механизмы защитных функций полиаминов Е. coli от токсического эффекта параквата, индуцирующего супероксидный стресс // Биохимия. 2004. - Т. 69, № 2. - С. 234-242.

6. Ткаченко А.Г., Нестерова Л.Ю. Полиамины как модуляторы экспрессии генов окислительного стресса у Escherichia coli II Биохимия. 2003. - Т. 68, № 8. - С. 1040-1048.

7. Ткаченко А.Г., Пожидаева О.Н., Шумков М.С. Роль полиаминов в формировании множественной антибиотикоустойчивости Escherichia coli в условиях стрессорных воздействий // Биохимия. 2006. - Т. 71, № 9.-С. 1287-1296.

8. Ткаченко А.Г., Пшеничнов М.Р., Нестерова Л.Ю. Путресцин как фактор защиты Escherichia coli от окислительного стресса // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 4. - С. 487-494.

9. Ткаченко А.Г., Пшеничнов М.Р., Салахетдинова О .Я. Роль транспорта путресцина и калия в регуляции топологического состояния ДНК в процессе адаптации Escherichia coli к температурному стрессу // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 5. - С. 601-606.

10. Ткаченко А.Г., Федотова М.В. Зависимость защитных функций полиаминов Escherichia coli от силы стрессорных воздействий супероксидных радикалов // Биохимия. 2007. - Т. 72, № 1. - С. 128136.

11. Ткаченко А.Г., Чудинов А.А. Изменение пула полиаминов в процессе перехода от анаэробных к анаэробным условиям и локализация ферментов их синтеза в клетках Escherichia coli II Микробиология. — 1989 а. Т. 58, № 6. - С. 885-891.

12. Ткаченко А.Г., Чудинов А.А. Обмен полиаминами между клеткой и средой как один из факторов, определяющих развитие культур Е. coli с подпиткой // Микробиология. 1989 б. - Т. 58, № 4. - С. 584-590.

13. Ткаченко А.Г., Чудинов А.А. Роль системы синтеза полиаминов в энергетическом сопряжении у Escherichia coli II Докл. Акад. Наук СССР. 1989 в. - Т. 305, № 1. - С. 219-222.

14. Ткаченко А.Г., Чудинов А.А. Участие путресцина в антипортерном механизме транспорта калия у Е. coli и его роль в регуляции клеточного рН // Микробиология. 1993. - Т. 62, № 4. - С. 654-661.

15. Ткаченко А.Г., Шумков М.С. Роль путресцина в регуляции уровня gs-субъединицы РНК-полимеразы в клетках Escherichia coli при переходе к стационарной фазе // Биохимия. 2004. - Т. 69, № 8. - С. 1079-1087.

16. Чудинов А.А., Чудинова Л.А., Коробов В.П. Метод определения низкомолекулярных олигоаминов в различном биологическом материале // Вопросы мед. химии. 1984. - Т. 30, № 4. - С. 127-132.

17. Эйделыптейн М.В. {3-лактамазы аэробных грамотрицательных бактерий: характеристика, основные принципы классификации, современные методы выявления и типирования // Антибиотикорезистентность. 2001. - Т. 3, № 3. — С. 223-242.

18. Abraham Е.Р., Chain Е., Fletcher С.М., Florey H.W., Gardner A.D., Heatley N.G. Further observations on penicillin // Eur. J. Clin. Pharmacol. — 1941. -V. 42.-P. 3-9.

19. Abraham K.A., Pihl A. Role of polyamines in macromolecular synthesis // Trends Biochem. Sci. 1981. - P. 106-107.

20. Achouak W, Heulin T., Pages J.M. Multiple facets of bacterial porins // FEMS Microbiol. Lett.-2001.-V. 199, N1.-P. 1-7.

21. Acosta M.B., Ferreira R.C., Ferreira L.C., Costa S.O. Intracellular polyamine pools, oligopeptide-binding protein A expression, and resistance to aminoglycosides in Escherichia coli II Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2005. -V. 100, N7.-P. 789-93.

22. Aiassa V., Barnes A.I., Albesa I. Resistance to ciprofloxacin by enhancement of antioxidant defenses in biofilm and planktonic Proteus mirabilis II Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010. - V. 393, N 1. - P. 84-8.

23. Albesa I., Becerra M.C., Battan P.C., Paez P.L. Oxidative stress involved in the antibacterial action of different antibiotics // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2004.- V. 317, N2.-P. 605-9.

24. Aldsworth T.G., Sharman R.L., Dodd E.R. Bacterial suicide through stress // Cell. Mol. Life Sci. 1999. - V. 56. - P. 378-383.

25. Alekshun M.N., Levy S.B. Regulation of chromosomally mediated multiple antibiotic resistance: the mar regulon // Antimicrob. Agents Chemother. -1997. V. 41, N 10. - P. 2067-75.

26. Alekshun M.N., Levy S.B., Mealy T.R., Seaton B.A., Head J.F. The crystal structure of MarR, a regulator of multiple antibiotic resistance, at 2.3 A resolution // Nat. Struct. Biol. 2001. - V. 8, N 8. - P. 710-4.

27. Ambler R.P. The structure of beta-lactamases // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1980. -V. 289, N 1036. - P. 321-31.

28. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen T.Mí Oxidants, antioxidants and' degenerative disease of aging H Proc. Nat; Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90.. P. 7915-7922.

29. Armstrong-Buisseret L., Cole M.B., Stewart G.S. A homologue to the; Escherichia coli alkyl hydroperoxide reductase AhpC is induced by osmotic upshock in Staphylococcusaureus J7 Microbiology. — 1995. — V. 141. — P. 1655-61.

30. Asuquo A.E., Pilddock; L.Ji Accumulátionv and'killing kineticsof fifteen? quinolones for Escherichia coli, Staphylococcus aureus and: Pseudomonas aeruginosa II J. Antimicrob. Chemother. 1993. - V. 31, N 6. - P. 865-80.

31. Barnes A.I., Herrero EL., Albesa I. New aspect of the synergistic antibacterial action, of ampicillin and gentamicin // Int. J. Antimicrob. Agents. — 2005. V. 26, N2. - P. 146-51.

32. Battán P.G., Barnes A.I., Albesa V. Resistance to oxidative stress caused by ceftazidime and piperacillin in a biofilm of Pseudomonas II Luminescence; — 2004. V. 19, N 5. - P. 265-70.

33. Bedard J., Bryan L.E. Interaction of the fluoroquinolone antimicrobial agents ciprofloxacin and enoxacin with liposomes // Antimicrob. Agents Chemother. 1989. - V. 33, N 8. - P. 1379-82.

34. Bloomfield V.A. DNA condensation // Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. - V. 6.-P. 334-341.

35. Borodina T.A., Lehrach H., Soldatov A.V. DNA purification on homemade silica spin-columns II Anal. Biochem. 2003. - V. 321. - P. 135-137.

36. Bower J.M., Mulvey M.A. Polyamine-mediated resistance of uropathogenic Escherichia coli to nitrosative stress // J. Bacterid. 2006. — V. 188, N 3. — P. 928-33.

37. Bryan L.E., Kowand S.K., Van Den Elzen H.M. Mechanism of aminoglycoside antibiotic resistance in anaerobic bacteria: Clostridium perfringens and Bacteroides fragilis // Antimicrob. Agents Chemother. — 1979.-V. 15, N 1. —P. 7-13.

38. Bryan L.E., Kwan S. Roles of ribosomal binding, membrane potential, and electron transport in bacterial uptake of streptomycin and gentamicin // Antimicrob. Agents Chemother. 1983. -V. 23, N 6. - P. 835-45

39. Bryans M., Harley E., Gilmour S.K. Elevated cellular poly amine levels enhance promoter activity in vivo II Biochem. Biophys. Res. Commun. -1996.-V. 226. P. 618-625.

40. Burstein C., Tiankova L., Kepes A. Respiratory control in Escherichia coli K 12 // Eur. J. Biochem. 1979. - V. 94, N 2. - P. 387-92.

41. Candeias L.P., Patel K.B., Stratford M.R., Wardman P. Free hydroxyl radicals are formed on reaction between the neutrophil-derived species superoxide anion and hipochlorous acid // FEBS Lett. 1993. - V. 333. - P. 151-153.

42. Chapman J.S., Georgopapadakou N.H. Routes of quinolone permeation in Escherichia coli'H Antimicrob. Agents Chemother. 1988. - V. 32, N 4.1. P. 438-42. . ' . ' •

43. Chevalier J., Mallea M., Pages J.M; Comparative aspects of 1iie diffusion of norfloxacin; cefepime and! spermine : througlT the F porin.; channel5 of Enterobacter cloacae'llBiochem: J.- 2000:;-V. 348; №1. -P. 223-7.

44. Childs A.C., Mehta D.J., Gerner E.W. Polyamine-dependent gene expression // Cell. Mol. Life Sci. 2003. - V. 60, N 7. - P. 1394-406.

45. Cohen S. What do the polyamines do? // Nature. 1978. - V. 274. - P. 209210.

46. Corbett . K.D:, Berger J.M. Structure, molecular mechanisms and evolutionary relationships in DNA topoisomerases // Annu. Rev. Biophys. Biom; Struct. -2004. -V. 33 P. 95-118.

47. Criswell D., Tobiason V.L., Lodmell J.S., Samuels D.S. Mutations conferring aminoglycoside and spectinomycin resistance in« Borrelia burgdorferi II Antimicrob. Agents Chemother. 2006. - V. 50, N 2. - P. 445-52.

48. Damper P.D., Epstein W. Role of the membrane potential in bacterial resistance to aminoglycoside antibiotics // Antimicrob: Agents Chemother. -1981.-V. 20,N6.-P. 803-8.

49. Das K.C., Misra H.P. llydroxyl radical scavenging and singlet oxygen . quenching properties of polyamines // Mol. Cell: Biochem: — 2004. V. 262,1. N1-2.-P. 127-33.

50. Davies J., Wright G.D. Bacterial resistance to aminoglycoside antibiotics // Trends Microbiol. 1997. - V. 5, N 6. - P. 234-40.

51. Delihas N., Forst S. MicF: an antisense RNA gene involved in response of Escherichia coli to global stress factors // J. Mol. Biol. 2001. - V. 313, N l.-P. 1-12.

52. Demple B., Halbrook J. Inducible repair of oxidative DNA damage in Escherichia coli II Nature. 1983. - V. 304, N 5925. - P. 466-8.

53. Ding H., Hidalgo E., Demple B. The redox state of the 2Fe-2S. clusters in SoxR protein regulates its activity as a transcription factor // Biol. Chem. -1996. V. 52. - P. 33173-33175.

54. Dodd C.E., Richards P.J., Aldsworth T.G. Suicide through stress: a bacterial response to sub-lethal injury in the food environment // Int. J. Food Microbiol. 2007. - V. 120, N 1-2. - P. 46-50.

55. Douki T., Bretonniere Y., Cadet J. Protection against radiation-induced degradation of DNA bases by polyamines // Radiation Research. 2000. - V. 153.-P. 29-35.

56. Drlica K., Malik M. Fluoroquinolones: action and resistance // Curr. Top Med. Chem. 2003. - V. 3, N 3. - P. 249-82.

57. Drlica K., Malik M., Kems R.J., Zhao X. Quinolone-mediated bacterial death // Antimicrob. Agents Chemother. 2008. - V. 52, N 2. - P. 385-92.

58. Drlica K., Zhao X. DNA gyrase, topoisomerase IV, and the 4-quinolones // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. -V. 61. - P. 377-392.

59. Dukan S., Nyström T. Oxidative stress defense and deterioration of growth-arrested Escherichia coli cells // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274, N 37. - P. 26027-32.

60. Dwyer DJ., Kohanski M.A., Collins J.J. Role of reactive oxygen species in antibiotic action and resistance // Curr. Opin. Microbiol. — 2009. V. 12, N 5.-P. 482-9.

61. Echandi G., Algranati I.D. Defective 30S ribosomal particles in a polyamine auxotroph of Escherichia coli // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. -V. 67, N 3. - P.1185-91.

62. Esposito D., Del Vecchio P., Barone G. Interactions with natural polyamines and thermal stability of DNA. A DSC study and a theoretical reconsideration // J. Am. Chem. Soc. 1997. - V. 119. - P. 2606-2613.

63. Feniouk B.A., Suzuki T., Yoshida M. Regulatory interplay between protonmotive force, ADP; phosphate, and subunit epsilon in bacterial ATPtsynthase // J. Biol. Chem. 2007. - V. 282, N 1. - P. 764-72.

64. Fleming A. On the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special reference to their use in the isolation of B. influenzae // Br. J. Exp. Pathol. 1929. - V. 10. - P. 226-36.

65. Flink I., Pettijohn D.E. Polyamines stabilise DNA folds // Nature. 1975. -V. 253, N5486.-P. 62-3.

66. Fourmy D., Recht M.I., Blanchard S.C., Puglisi J.D.' Structure of the A site of Escherichia coli 16S ribosomal RNA complexed with an aminoglycoside antibiotic // Science. 1996. -V. 274, N 5291. -P. 1367-71.

67. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases // Ann. Rev. Biochem. 1995. - V. 64. - P. 97-112.

68. Fridovich I. The biology of oxygen radicals // Science. 1978. - V. 201. - P. 875-880.

69. Galimand M., Courvalin P., Lambert T. Plasmid-mediated high-level resistance to aminoglycosides in Enterobacteriaceae due to 16S rRNA methylation // Antimicrob. Agents Chemother. 2003. - V. 47, N 8. - P. 2565-71.

70. Geiger L.E., Morris D.R. Stimulation of deoxyribonucleic acid replication fork movement by spermidine analogs in polyamine-deficient Escherichia coli //J. Bacteriol. 1980. -V. 141. - P. 1192-1198.

71. Georgopapadakou N.H., Liu F.Y. Penicillin-binding proteins in bacteria // Antimicrob. Agents Chemother. 1980. - V. 18, N 1. - P. 148-57/

72. Godsey M.H., Zheleznova-Heldwein E.E., Brennan R.G. Structural biology of bacterial multidrug resistance gene regulators // J. Biol. Chem. 2002. -V. 277,N43.-P. 40169-72.

73. Goffin C., Ghuysen J.M. Multimodular penicillin-binding proteins: an enigmatic family of orthologs and paralogs // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -1998.-V. 62,N4.-P. 1079-93.

74. Goldemberg S.H., Algranati I.D. Polyamine requirement for streptomycin action on protein synthesis in bacteria // Eur. J. Biochem. -1981.-V. 117, N2.-P. 251-5.

75. Gonsales-Flecha B., Demple B. Metabolic sources of hydrogen peroxide in, aerobically growing Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 13681-13687.

76. Gort A., Imlay J. Balance between endogenous superoxide stress and antioxidant defenses // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 1402-1410.

77. Goss W., Deitz W., Cook T. Mechanism of action of nalidixic acid on Escherichia coli. II. Inhibition of deoxyribonucleic acid synthesis // J. Bacteriol. 1965. -V. 89. - P. 1068-1074.

78. Goswami M., Jawali N. Glutathione-mediated augmentation of beta-lactam antibacterial activity against Escherichia coli I I J. Antimicrob. Chemother. -2007. — V. 60,N1.-P. 184-5.

79. Goswami M., Mangoli S.H., Jawali N. Effects of glutathione and ascorbic acid on streptomycin sensitivity of Escherichia coli // Antimicrob. Agents Chemother. 2007. - V. 51, N 3. - P. 1119-22.

80. Goswami M., Mangoli S.H., Jawali N. Involvement of reactive oxygen species in the action of ciprofloxacin against Escherichia coli II Antimicrob. Agents Chemother. 2006. - V. 50, N 3. - P. 949-54.

81. Grant C.M., Maclver F.H., Dawes I.W. Glutathione is an essential metabolite required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Curr. Genet. 1996. - V. 29, N 6. - P. 511-5.

82. Greenway D.L., England R.R. The intrinsic resistance of Escherichia coli to various antimicrobial agents requires ppGpp and sigma s // Lett. Appl. Microbiol. 1999. - V. 29, N 5. - P. 323-6.

83. Grkovic S., Brown M.H., Skurray R.A. Regulation of bacterial drug export systems // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. - V. 66, N 4. - P. 671-701.

84. Grossowicz N., Ariel M. Mechanism of protection of cells by spermine against lisozyme-induced lysis // J. Bacterid. 1963. - V. 85. - P. 293-300.

85. Ha H.C., Sirisoma N.S., Kuppusamy P., Zweier J.L., Woster P.M., Casero R.A. The natural polyamine spermine function directly as a free radical scavenger // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998a. - V. 95. - P. 11140-11145.

86. Hancock R.E., Farmer S.W., Li Z.S., Poole K. Interaction of aminoglycosides with the outer membranes and purified lipopolysaccharide and OmpF porin of Escherichia coli I I Antimicrob. Agents Chemother. -1991. V. 35, N 7. - P. 1309-14.

87. Harder K .J., Nikaido H., Matsuhashi M. Mutants of Escherichia coli that are resistant to certain beta-lactam compounds lack the ompF porin // Antimicrob. Agents Chemother. 1981. - V. 20, N 4. - P. 549-52.

88. Hassett D.J., Imlay J.A. Bactericidal antibiotics and oxidative stress: a radical proposal // ACS Chem. Biol. 2007. - V. 2, N 11. - P. 708-10.

89. Hausladen A., Fridovich I. Superoxide and peroxinitrite inactive aconitases, but nitric oxide does not // Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 29405-29408.

90. Hengge-Aronis R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the sigma(S) (RpoS) subunit of RNA polymerase // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. - V. 66, N 3. - P. 373-95.

91. Henle E.S., Linn S. Formation, prevention, and repair of DNA damage by iron/hydrogen peroxide // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272, N 31. - P. 1909519098.

92. Herbst E.J., Snell E.E. Putrescine as a growth factor for Haemophilus parainfluenzae I I J. Biol. Chem. 1948. - V. 176. - P. 989-990.

93. Hirai K., Aoyama H., Irikura T., Iyobe S., Mitsuhashi S. Differences in susceptibility to quinolones of outer membrane mutants of Salmonella typhimurium and Escherichia coli I I Antimicrob. Agents Chemother. 1986. -V. 29, N3.-P. 535-8.

94. Holmes V.F., Cozzarelli N.R. Closing the ring: links between SMC proteins and chromosome partitioning, condensation and supercoiling // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 1322-1324.

95. Holtje J.V. From growth to autolysis: the murein hydrolases in Escherichia coli // Arch. Microbiol. 1995. - V. 164, N 4. - P. 243-54.

96. Holtje J.V. Streptomycin uptake via an inducible polyamine transport system in Escherichia coli U Eur. J. Biochem. — 1978. V. 86, N 2. - P. 345-51.

97. Holtta E., Janne J., Pispa J. Ornitine decarboxylase from Escherichia colt stimulation of the enzyme activity by nucleotides // Biochem. Biophis. Res. Commun. 1972. - V. 47-P. 1165-1171.

98. Igarashi K., Kashiwagi K. Characteristics of cellular polyamine transport in prokaryotes and eukaryotes // Plant Physiol. Biochem. 2010. - V. 48, N 7. -P. 506-12.

99. Igarashi K., Kashiwagi K. Modulation of cellular function by polyamines // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2010. - V. 42, N 1. - P. 39-51.

100. Igarashi K., Kashiwagi K. Polyamines: Mysterious Modulators of Cellular

101. Imlay J.A. Pathways of oxidative damage // Annu. Rev. Microbiol. 2003. -V. 57.-P. 395-418.

102. Imlay J. A., Fridovich I. Assay of metabolic sources of hydrogen peroxide in aerobically growing Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 6957-6965.

103. Iyer R., Delcour A.H. Complex inhibition of ompF and ompC bacterial porins by polyamines // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272, N 30. - P. 1859518601.

104. Iyer R., Williams C., Miller C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli II J. Bacteriol. 2003. - V. 185, N 22. - P. 6556-61.

105. Job V., Carapito R., Vernet T., Dessen A., Zapun A. Common alterations in PBPla from resistant Streptococcus pneumoniae decrease its reactivity toward beta-lactams: structural insights I I J. Biol. Chem. 2008. - V. 283, N 8.-P. 4886-94.

106. Jung I.L., Oh T. J., Kim I. G. Abnormal growth of polyamine-deficient Escherichia coli mutant is partially caused by oxidative stress-induced damage // Arch. Biochem. Biophys. 2003. - V. 418. - P. 125-132.

107. Kakeda M., Ueguchi C., Yamada H., Mizuno T. An Escherichia coli curved DNA-binding protein whose expression is affected by the stationary phasespecific sigma factor sigma S // Mol. Gen. Genet. 1995. - V. 248, N 5. - P. 629-34.

108. Kaplan F., Kopka J., Haskell D.W, Zhao W., Schiller K.C., Gatzke N., Sung D.Y., Guy C.L. Exploring the temperature-stress metabolome of Arabidopsis // Plant Physiol. 2004. - V. 136, N 4. - P. 4159-68.

109. Kashiwagi K., Miyaji A., Ikeda S., Tobe T., Sasakawa C., Igarashi K. Increase of sensitivity to aminoglycoside antibiotics by polyamine-induced protein (oligopeptide-binding protein) in Escherichia coli II J. Bacterid. -1992.-V. 174, N 13.-P. 4331-7.

110. Kashiwagi K., Shibuya S., Tomitori H., Kuraishi A., Igarashi K. Excretion and uptake of putrescine by the PotE protein in Escherichia coli I I J. Biol. Chem.- 1997.-V. 272, N 10. P.6318-23.

111. Kato J., Nishimura Y., Imamura R., Niki H., Hiraga S., Suzuki H. New topoisomerase essential for chromosome segregation in E. coli II Cell. -1990. V. 63. — P. 393—404.

112. Keeney D., Ruzin A., McAleese F., Murphy E., Bradford P.A. MarA-mediated overexpression of the AcrAB efflux pump results in decreased susceptibility to tigecycline in Escherichia coli II J. Antimicrob. Chemother. — 2008. —V. 61, N 1. —P. 46-53.

113. Khodursky A.B., Zechiedrich E.L., Cozzarelli N.R. Topoisomerase IV is a target of quinolones in Escherichia coli H Proc. Natl. Acad. Sei. US A.-1995. V. 92, N 25. - P. 11801-5.

114. Kikuchi Y., Kojima H., Tanaka T., Takatsuka Y., Kamio Y. Characterization of a second lysine decarboxylase isolated from Escherichia coli I I J. Bacteriol. 1997. -V. 179, N 14. - P. 4486-92.

115. Kikuchi Y., Kurahashi O., Nagano T. RpoS-dependent expression of the second lysine decarboxylase gene in Escherichia coli II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. - V. 62, N 6. - P. 1267-70.

116. Kim I.G., Oh T.J. SOS induction of recA by UV-zy-irradiation and mitomicin C is mediated by polyamines in Escherichia coli K-12 // Toxicol. Lett.-2000.-V. 116.-P. 143-149.

117. Rim J.S., Choi S.H., Lee J.K. Lysine decarboxylase expression by Vibrio vulnificus is induced by SoxR in response to superoxide stress // J. Bacteriol. — 2006. — V. 188, N24.-P. 8586-92.

118. Kobayashi Y., Nakae T. The mechanism of ion selectivity of OmpF-porin pores of Escherichia coli II Eur. J. Biochem. — 1985. V. 151, N 2. - P. 2316.

119. Kohanski M.A., Dwyer D.J., Hayete B., Lawrence C.A., Collins J J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics // Cell. 2007. - V. 130, N 5. - P. 797-810.

120. Kolodkin-Gal I., Sat B., Keshet A., Engelberg-Kulka H. The communication factor EDF and the toxin-antitoxin module mazEF determine the mode of action of antibiotics // PLoS Biol. -2008. V. 6, N 12. e319.

121. Kong K.F., Schneper L., Mathee K. Beta-lactam antibiotics: from antibiosis to resistance and bacteriology // APMIS. 2010. - V. 118, N 1. - P. 1-36.

122. Korshunov S., Imlay J.A. Detection and quantification of superoxide formed within the periplasm of Escherichia coli II J. Bacteriol. 2006. - V. 188, N 17.-P. 6326-6334.

123. Koutsolioutsou A., Pena-Llopis S., Demple B. Constitutive soxR mutations contribute to multiple-antibiotic resistance in clinical Escherichia coli isolates // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. - V. 49, N 7. - P. 274652.

124. Kurihara S., Oda S., Kato K., Kim H.G., Koyanagi T., Kumagai H., Suzuki H. A novel putrescin utilization pathway involves y-glutamilated intermediates of Escherichia coli K-12 // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280, N 6. - P. 4602-4608.

125. Kusano T., Berberich T., Tateda C., Takahashi Y. Polyamines: essential factors for growth and survival // Planta. 2008. - V. 228, N 3. - P. 367-81.

126. Kwon D.H, Lu C.D. Polyamines induce resistance to cationic peptide, aminoglycoside, and quinolone antibiotics in Pseudomonas aeruginosa PAOl // Antimicrob. Agents Chemother. 2006 6. - V. 50, N 5. - P. 161522.

127. Kwon D.H., Lu C.D. Polyamine effects on antibiotic susceptibility in bacteria // Antimicrob. Agents Chemother. 2007. - V. 51, N 6. - P. 20707.

128. Kwon D.H., Lu C.D. Polyamines increase antibiotic susceptibility in Pseudomonas aeruginosa II Antimicrob. Agents Chemother. — 2006 a. V. 50, N5. P. 1623-7.

129. Lange R, Hengge-Aronis R. The cellular concentration of the sigma S subunit of RNA polymerase in E. coli is controlled at the levels of transcription, translation, and protein stability // Genes and Dev. 1994. - V. 8.-P. 1600-1612.

130. Lemonnier M., Lane D. Expression of the second lysine decarboxylase-gene of Escherichia coli II Microbiology. 1998. - V. 144, N 3. - P. 751-60.

131. Li X.Z., Nikaido H. Efflux-mediated drug resistance in bacteria // Drugs. — 2004. V. 64, N 2. - P. 159-204.

132. Liochev S.I., Fridovich I. Superoxide and Iron: partners in crime // JUBMB Life. 1999. - V. 48. - P. 157-161.

133. Liquori A.M., Constantino L., Crescenzi V., Elia V., Giglio E., Putiti R., De Santis Savino M., Vitagliano V. Complexes between DNA and polyamines: a molecular model // Mol. Biol. 1967. - V. 24. - P. 113-122.

134. Liu X., Ferenci T. An analysis of multifactorial influences on the transcriptional control of ompF and ompC porin expression under nutrient limitation // Microbiology. 2001. - V. 147, N 11. - P. 2981-9.

135. Loewen P.C., Hengge-Aronis R. The role of the sigma factor sigma S (KatF) in bacterial global regulation // Annu. Rev. Microbiol. 1994. - V. 48. - P. 53-80.

136. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.G. Protein measurement with the Folin Phenol Reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193.-P. 265-275.

137. Lupo S., Aranda C., Miranda-Ham L., Olivera H., Riego L., Servin L., Gonzalez A. Tirosine is involved in protection from oxidative stress in S. cerevisiae II Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43. - P. 453-463.

138. Magnet S., Blanchard J.S. Molecular insights into aminoglycoside action* and resistance // Chem. Rev. 2005. - V. 105, N 2. - P. 477-98.

139. Maiale S., Sánchez D.H., Guirado A., Vidal A., Ruiz O.A. Spermine accumulation under salt stress // J. Plant Physiol. — 2004; -V. 161, N 1. — P. 35-42.

140. Malik M., Hussain S., Drlica K. Effect of anaerobic growth on quinolone lethality with Escherichia coli H Antimicrob. Agents Chemother. 2007. -V. 51.-P. 28-34.

141. Malik M., Lu T., Zhao X., Singh A., Hattan C., Domagala J., Kerns R., Drlica K. Lethality of quinolones against Mycobacterium smegmatis in the presence or absence of chloramphenicol // Antimicrob. Agents Chemother.2005. V. 49. - P. 2008-2014.

142. Martin R.G., Gillette W.K., Rosner J.L. Promoter discrimination by the related transcriptional activators MarA and SoxS: differential regulation by differential binding // Mol. Microbiol. 2000. - V. 35, N 3. - P. 623-34.

143. Martínez-Martínez L., Pascual A., Jacoby G.A. Quinolone resistance from a transferable plasmid // Lancet. -1998. V. 351, N 9105. - P. 797-9.

144. Matagne A., Lamotte-Brasseur J., Frere J.M. Catalytic properties of class A p-lactamases: efficiency and diversity // Biochem. J. 1998. - V. 1. - P. 581-98.

145. Matin A. The molecular basis of carbon-starvation-induced general resistance in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1991. - V. 5, N 1. - P. 310.

146. Mazzariol A., Cornaglia G., Nikaido H. Contributions of the AmpC beta-lactamase and the AcrAB multidrug efflux system in intrinsic resistance of Escherichia coli K-12 to beta-lactams // Antimicrob. Agents Chemother. — 2000 a. V. 44, N 5. - P. 1387-90.

147. Mazzariol A., Tokue Y., Kanegawa T.M., Cornaglia G., Nikaido H. Highlevel fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Escherichia coli overproduce multidrug efflux protein AcrA // Antimicrob. Agents Chemother. 2000 6. - V. 44, N 12. - P. 3441-3.

148. Meier A., Kirschner P., Bange F.C., Vogel U., Böttger E.C. Genetic alterations in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis', mapping of mutations conferring resistance // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. -V. 38, N2.-P. 228-33.

149. Meng S.Y., Bennett G.N. Nucleotide sequence of the Escherichia coli cad operon: a system for neutralization of low extracellular pH // J. Bacteriol. -1992. V. 174, N 8. - P.2659-69.

150. Merrikh H., Ferrazzoli A.E., Bougdour A., Olivier-Mason A., Lovett S.T. A DNA damage response in Escherichia coli involving the alternative sigma factor, RpoS // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 2009. V. 106, N 2. - P. 611-6.

151. Messner K.R., Imlay J.A. The identification of primary sites of superoxide and hydrogen peroxide formation in the aerobic respiratory chain and sulfite reductase complex of Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1999. -V. 274, N 15.-P. 10119-10128.

152. Metzner M., Germer J., Hengge R. Multiple stress signal integration in theQregulation of the complex a "dependent csiD-ygaF-gabDTP operon in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 2004. - V. 51, N 3. - P. 799-811.136 ;.'.'

153. Miller C., Thomsen L.E., Gaggero C., Mosseri R., Ingmer H:, Cohen S.N. SOS response induction by beta-lactams and bacterial defense against' antibiotic lethality // Science. 2004. - V. 305, N 5690.-P. 1629-31.

154. Miller J.H. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N;Y.:- 1992. - 466 p;

155. MilovicV.Polyamines in the gut lumen: bioavailability andbiodistribution // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2001. - V. 13, N 9. - P. 1021-5.

156. Minton K.M., Tabor H., Tabor C.W. Paraquat toxicity is increased in , Escherichia coli defective in the synthesis of polyamines//Proc. Natl. Acad:

157. Sci. USA: 1990. - V. 87. - P. 2851-2855:

158. Morris DIR., Koffron K.L. Putrescine biosynthesis in Escherichia colv regulation through pathway selection // J. Biol; Chem. 1969. - V. 244. - P. 6094-6099: ;

159. Mortimer P.G., Piddock L.J. The accumulation of five antibacterial agents in. porin-deficient mutants of Escherichia coli II J; Antimicrob. Chemother. — 1993. -V. 32, N 2. P. 195-213. '

160. Munro; G.F., Hercules K., Morgan J., Sauerbier W. Dependence of the putrescine content of Escherichia coli on the osmotic strength of the medium // J. Biol. Chem. 1972. - V. 247. - P. 1272-1280.

161. Newcomb T.G., Loeb L.A. Oxidative DNA damage and mutagenesis // From: DNÀ damage and repair, Ed. by: Nickoloff and Hockstra. liumana Press Inc.,,Totowa. NJ: - 1998; - P: 65-83 .

162. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited//Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2003.- V. 67, N4. -P. 593-656.

163. Nikaido H. Preventing drug access to targets: cell surface permeability barriers and active efflux in bacteria // Sèmin; Cell Dev. Biol: — 2001. V.12, N3.-P. 215-23. . •'

164. Nikaido H., Rosenberg Y.E., Foulds J. Porin channels in Escherichia coli: studies with (3-Lactams in intact cells // J. Bacteriol. 1983. - V: 153. - P. 232-240. •

165. Nikaido H., Song S.A., Shaltiel E., Nurminen M. Outer membrane of Salmonella XIV. Reduced transmembrane diffusion rates in porin-deficiënt mutants // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. - V. 76, N 2. - P. 324-30= !

166. Nikaido H., Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability // Microbiol. Rev. 1985. - V. 49, N 1. - P. 1 -32.

167. Noller H;F. Ribosomes. Drugs and the RNA world // Nature. 1991. - V. 353,N6342.-P. 302-3.

168. Nunoshiba T., Obata F., Boss A.C., Oikawa S., Mori T., Kawanishi S., Yamamoto K. Role of iron and superoxide for generation of hydroxy! radicalj oxidative DNA lesions, and mutagenesis in Escherichia coli II BioL Chem. 1999. - V. 274.- P. 34832-34837.

169. Päez P.L., Becerra M.C., Albesa-1. Effect of the association of reduced glutathione and ciprofloxacin on the antimicrobial activity in Staphylococcus aureus II FEMS Microbiol. Lett. 2010. - V. 303, N 1. - P. 101-5.

170. Patten C.L., Kirchhof M.G., Schertzberg M.R., Morton R.A., Schellhorn H.E. Microarray analysis of RpoS-mediated gene expression in Escherichia coli K-12 // Mol. Genet. Genomics. 2004. - V. 272, N 5. - P. 580-91.

171. Paulsen I.T., Brown M.H., Skurray R.A. Proton-dependent multidrug efflux systems // Microbiol. Rev. 1996. - V. 60, N 4. - P. 575-608.

172. Peter H.W., Wolf H.U., Seiler N. Influence of polyamines on the bivalent-cation-activited ATPases // Hope-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1973. - V. 354.-P. 1146-1148.

173. Piddock L.J., Johnson M.M. Accumulation of 10 fluoroquinolones by wildtype or efflux mutant Streptococcus pneumoniae // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - V. 46, N 3. - P. 813-20.

174. Pillai S.P., Shankel D.M. Effects of antimutagens on development of drug/antibiotic resistance in microorganisms // Mutat. Res. — 1998. V. 402, N1-2.-P. 139-50.

175. Pohlhaus J., Kreuzer K.N. Norfloxacin-induced DNA gyrase cleavage complexes block Escherichia coli replication forks, causing doublestranded breaks in vivo II Mol. Microbiol. 2005. - V. 56. - P. 1416-1429.

176. Pomposiello P.J., Bennik M.H., Demple B. Genome-wide transcriptional profiling of the Escherichia coli responses to superoxide stress and sodium salicylate // J. Bacteriol. 2001. - V. 183, N 13. - P. 3890-902.

177. Pratt L.A., Hsing W., Gibson K.E., Silhavy T.J. From acids to osmZ: multiple factors influence synthesis of the OmpF and OmpC porins in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1996. - V. 20, N 5. - P. 911-917.

178. Price M., Reiners J.J., Santiago A.M., Kessel D. Monitoring singlet oxygen•'.■■■' 139 . • . . ■,.'.,and hydroxyl radical formation- with fluorescent probes during photodynamic therapy // Photochemestry and Photobiology. 2009. - V. 85.-P. 1177-1181.

179. Privalle C.T., Fridovich 1. Induction of superoxide dismutase in Escherichia coli by heat shock // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1987.-V. 84, N 9.-P.2723-6.

180. Sabo D.L., Boeker E.A., Byers B., Waron H., Fischer E.H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase // Bibchemestry.- 19741-V. 13. Pi.662-670:

181. Saier M.H., Paulsen I.T. Phylogeny of multidrug transporters // Semin. Cell Dev. Biol. 2001. - V. 12, N 3. - P. 205-13.

182. Saier M.H., Paulsen I.T., Sliwinski M.K., Pao S.S., Skurray R.A., Nikaido H. Evolutionaiy origins of multidrug and drug-specific efflux pumps in bacteria// FASEB J. 1998. - V. 12, N3. - P. 265-74.

183. Samartzidou H., Delcour A.H. Excretion of endogenous cadaverine leads to a decrease in porin-mediated outer membrane permeability // J. Bacterid. — 1999.-V. 181, N3.- P. 791-8;

184. Sawai T., Hirama Rv Rawana N.,,Kaneko M., TaniyasuiF., InamL A. Outer membrane permeation of beta-lactamantibiotics in Escherichia coli; Proteus, mirabilis, and Enterobacter cloacae II Antimicrob. Agents Chemother. — 1982. V. 22, N 4. - P. 585-92. .

185. Schnappinger D., Hillen W. Tetracyclines: antibiotic action, uptake,, and resistance mechanisms // Arch. Microbiol. — 1996. V. 165; N 6; - P. 359- 69. '■•;■•■ " V": ."■■ :■ '

186. Schneider B.L., Ruback S., Kiupakis A.K., Käsbariän H;, Pybus G., Reitzer L. The Escherichia coli gabDTPC operon: specific gamma-aminobutyratc catabolism and nonspecific induction // J. Bacteriol. 2002. - V. 184, N24. -P. 6976-6986. • :.

187. Sechi A.M., Cabrini L., Landi L., Pasquali P;, Lenaz G. Inhibition of phospholipase A-2 and phospholipase C by polyamines // Arch. Biochem. Biophys. 1977. - V. 186. -P. 248-254.

188. Setsukinai K., Urano Y., Kakinuma K., Majima H.J., Nagano T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species // Ji Biol. Chem. 2003. - V. 278,N 5.-P. 3170-3175.

189. Shaibe E., Metzer E., Halpcrn Y.S. Metabolic pathway for the utilization of L-arginine, L-ornithine, agmatine, and putrescine as nitrogen sources in Escherichia coli K-12 // J. BacterioL — 1985. — V. 63, N 3. — P. 933-7.

190. Shaw K.J., Rather P.N., Hare R.S., Miller G.H. Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of theaminoglycoside-modifying enzymes // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57, N 1. -P. 138-63.

191. Shen L.L., Baranowski J., Pernet A.G. Mechanism of inhibition of DNA gyrase by quinolone antibacterials: specificity and cooperativity of drug binding to DNA // Biochemistry. 1989. - V. 28, N 9. - P. 3879-85.

192. Sigler K., Chaloupka J., Brozmanova J., Stadler N., Hofer M. Oxidative stress in microorganisms // Folia Microbiol. 1999. - V. 44, N 6. - P. 587624.

193. Smit J., Kamio Y., Nikaido H. Outer membrane of Salmonella typhimurium: chemical analysis and freeze-fracture studies with lipopolysaccharide mutants I I J. Bacteriol. 1975. - V. 124. - P. 942-958.

194. Snyder M., Drlica K. DNA gyrase on the bacterial chromosome: DNA cleavage induced by oxolinic acid // J. Mol. Biol. 1979. - V. 131. - P. 287302.

195. Soksawatmaekhin W., Kuraishi A., Sakata K., Kashiwagi K., Igarashi K. Excretion and uptake of cadaverine by CadB and its physiological functions in Escherichia coli II Mol. Microbiol. 2004. - V. 51, N 5. - P. 1401-12.

196. Spotheim-Maurizot M., Ruiz S., Sabattier R., Charlier M. Radioprotection of DNA by polyamines // Int. J. Radiat. Biol. 1995. - V. 68, N 5. - P. 571-7.

197. Storz G., Imlay J.A. Oxidative stress // Curr. Opin. Microbiol. 1999. - V. 2. -P. 188-194.

198. Storz G., Tartaglia L.A., Farr S.B., Ames B.N. Bacterial defenses against oxidative stress II Trends Genet. 1990. - V. 6. - P. 363-368.

199. Sy D., Hugot S., Savoye C., Ruiz S., Charlier M., Spotheim-Maurizot M. Radioprotection of DNA by spermine: a molecular modelling approach // Int. J. Radiat. Biol. 1999. - V. 75, N 8. - P. 953-61.

200. Tabor C.W., Tabor H. Formation of 1.4-diaminobutane and of spermidine by an ornithine auxotroph of Escherichia coli grown on limiting ornithine or arginine // J. Biol. Chem. 1969. - V. 244. - P. 6383-6387.

201. Tabor C.W., Tabor H. Polyamines // Ann. Rev. Biochem. 1984. - V. 53. -P. 749-790.

202. Tabor C.W., Tabor H. Polyamines in microorganisms // Microbiol. Rev. -1985.-V. 49.-P. 81-99:

203. Tabor H., Tabor C.W. Biosynthesis and metabolism of 1,4-diaminobutane, spermidine, spermine, and related amines // Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1972. -V. 36. - P. 203-68.

204. Termini J. Hydroxiperoxide-induced DNA damage and mutations I I Mutation Research. 2000. - V. 450. - P. 107-124.

205. Thomas T.J., Messner R.P. Structural specifity ofpolyamines in left-handed Z-DNA formation. Immunological and spectroscopic studies // J. Mol. Biol. 1988. - V. 201.-P. 463-467.

206. Tipper D.J. .Strominger J.L. Mechanism of action of penicillins: a proposal based on their structural similarity to acyl-D-alanyl-D-alanine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1965. V. 54, N 4. - P. 1133-41.

207. Tipper D.J., Strominger J.L. Biosynthesis of the peptidoglycan of bacterial cell walls. XII. Inhibition of cross-linking by penicillins and cephalosporins: studies in Staphylococcus aureus in vivo II J: Biol. Chem. — 1968. — V. 243, N11.-P. 3169-79.

208. Tkachenko A., Nesterova L., Pshenichnov M. The role of natural polyamine putrescine in defense against oxidative stress in E. coli II Arch. Microbiol.-2001.-V. 176.-P. 155-157.

209. Tran J.H., Jacoby G.A., Hooper D.C. Interaction of the plasmid-encoded quinolone resistance protein Qnr with Escherichia coli DNA gyrase // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. - V. 49, N 1. - P. 118-25

210. Vaara M., Vaara T. Polycations sensitize enteric bacteria to antibiotics // Antimicrob. Agents Chemother. 1983. -V. 24, N 1. - P. 107-13.

211. Vologodskii A.V., Cozzarelli N.R. Conformational and thermodynamic properties of supercoiled DNA // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. -1994.-V. 23.-P. 609-643.

212. Wang X., Shi G., Xu' Q., Hu J. Exogenous polyamines enhance copper tolerance of Nymphoides peltatum II J. Plant Physiol. 2007. - V. 164, N 8. -P. 1062-70.

213. Webber M.A., Piddock L.J. Absence of mutations in marRAB or soxRS in acrS-overexpressing fluoroquinolone-resistant clinical and veterinary isolates of Escherichia coli II Antimicrob. Agents Chemother. 2001. - V. 45,N5.-P. 1550-2.

214. Weisblum B., Davies J. Antibiotic inhibitors of the bacterial ribosome // Bacteriol. Rev. 1968. - V. 32. - P. 493-528.

215. Wentzell L., Maxwell A. The complex of DNA gyrase and quinolone drugs on DNA forms a barrier to the T7 DNA polymerase replication complex // J. Mol. Biol. 2000. -V. 304. - P. 779-791.

216. Woodmansee A.N., Imlay J.A. Reduced flavins promote oxidative DNA damage in NON-respiring Escherichia coli by delivering electrons to intracellular free iron // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277, N 37. - P. 3405534066.

217. Wright J.M., Boyle S.M. Negative control of ornithine decarboxylase and arginine decarboxylase by adenosine-3,5-monophosphate in E. coli II Mol. Gen. Genet. 1982". - V. 186. - P. 482-487.

218. Yamaguchi A., Hiruma R., Sawai T. Phospholipid bilayer permeability of beta-lactam antibiotics // J. Antibiot. (Tokyo). 1982. - V. 35, N 12. - P. 1692-9.

219. Yamamoto Y., Miwa Y., Miyoshi K., Furuyama J., Ohmori H. The Escherichia coli IdcC gene encodes another lysine decarboxylase, probably a constitutive enzyme I I Genes Genet. Syst. 1997. - V. 72, N 3. - P. 16772.

220. Yamane K., Wachino J., Doi Y., Kurokawa H., Arakawa Y. Global spread of multiple aminoglycoside resistance genes // Emerg. Infect. Dis. 2005. — V. 11,N6.-P. 951-3.

221. Yoshimura F., Nikaido H. Diffusion of beta-lactam antibiotics through the porin channels of Escherichia coli K-12 // Antimicrob. Agents Chemother. — 1985.-V. 27, N1.-P. 84-92.

222. Zakrevskii V.I., Finn G.R., Kharats K.S. Polyamines in microorganisms sensitive and resistant to antibiotics // Antibiotiki. 1976. - V. 21, N 4. - P. 323-5.

223. Zechiedrich E.L., Khodursky A.B., Cozzarelli N.R. // Topoisomerase IV, not gyrase, decatenates products of site-specific recombination in Escherichia coli // Genes Dev. 1997. - V. 11. - P. 2580-2592.

Информация о работе

Ахова, Анна Викторовна
кандидата биологических наук
Пермь, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Роль полиаминов в адаптации Escherichia coli к сублетальному действию антибиотиков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно