Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транскрипционная регуляция кластеров семенник-специфичных генов Stellate y Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Транскрипционная регуляция кластеров семенник-специфичных генов Stellate y Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

ОЛЕНКИНА ОКСАНА МИХАИЛОВНА

ТРАНСКРИПЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ КЛАСТЕРОВ СЕМЕННИК-СПЕЦИФИЧНЫХ ГЕНОВ STELLATE У DROSOPHILA MELANOGASTER

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 г ^ 2015 005558761

МОСКВА —2015

005558761

Работа выполнена в Лаборатории биохимической генетики животных Отдела молекулярной генетики клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Людмила Владимировна ОЛЕНИНА, с. н. с. Лаборатории биохимической генетики животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, академик РАН

Владимир Алексеевич ГВОЗДЕВ зав. Отдела молекулярной генетики клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Андрей Георгиевич ЗАРАЙСКИЙ зав. Лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

доктор биологических наук Алексей Михайлович КУЛИКОВ

зав. Лаборатории эволюционной генетики развития Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биологии гена Российской академии наук

Защита диссертации состоится « » 2015 г. в часов на заседании

диссертационного Совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32. Автореферат разослан «РЬ » ¿ргб^ДМ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

■бшч КРИЦЫН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Расположение генов в геноме эукариот носит неслучайный характер. Для генов, обладающих сходными профилями экспрессии и/или координированной экспрессией, характерно образование кластеров (Hurst et al., 2004). По данным геномного анализа с применением ДНК-микрочипов, свыше 20% генов Drosophila melanogaster образуют коэкспрессирующиеся кластеры, состоящие в среднем из 10-30 генов (Spellman and Rubin, 2002; Boutanaev et al., 2002). Кластеры дуплицированных генов приводят к увеличению сложности организмов и вносят существенный вклад в эволюцию видов. Тандемно организованные семенник-специфичные гены Stellate представляют собой уникальное явление и являются частью генетической системы Ste-Su(Ste), необходимой для поддержания фертильности самцов у Drosophila melanogaster.

Гены Stellate формируют два кластера в Х-хромосоме, один находится в

эухроматине (участок 12Е1-2 карты политенной Х-хромосомы), другой в

гетерохроматине (участок Ь26 митотической прометафазной карты X-

хромосомы) (Hardy et al., 1984; Livak 1984; Palumbo et al., 1994; Tulin et al.,

1997). Различные линии D. melanogaster несут разное число повторов Stellate,

от 15-50 до 150-400 копий (Palumbo et al., 1994). Кодируемый ими белковый

продукт гомологичен регуляторной Р-субъединице протеинкиназы СК2, СК2Р

(Livak 1990; Bozzetti et al., 1995). В Y-хромосоме расположены

высокогомологичные генам Stellate повторы Su(Ste) (Suppressor of Stellate)

также известные как локус crystal (Hardy et al., 1984). Повторы Su(Ste) несут

нарушенные ОРС и не транслируются, но транскрибируются в обоих

направлениях (Balakireva et al., 1992; Aravin et al., 2001). В норме экспрессия

генов Stellate в семенниках подавлена посттранскрипционно с помощью

коротких piPHK, образующихся при процессинге антисмысловых транскриптов

Su(Ste) (Aravin et al., 2001; Vagin et al., 2006). Полная или частичная потеря

повторов Su(Ste) приводит к гиперэкспрессии генов Stellate, к нарушениям

з

мейоза и частичной или полной стерильности самцов. При этом белок Stellate формирует большое количество игловидных или звездчатых кристаллов в сперматоцитах (Hardy et al., 1984; Palumbo et al., 1994; Bozzetti et al., 1995).

Растворимая форма белка Stellate, обнаруженная в ядрах сперматоцитов самцов с делецией повторов Su(Ste), взаимодействует с каталитической а-субъединицей протеинкиназы СК2, СК2а, и вызывает модуляцию фосфорилирования ряда мишеней СК2 в ядре (Egorova et al., 2009). Кроме того, белок Stellate подвергается посттрансляционному триметилированию по остатку лизина К92, структурно мимикрируя триметилирование гистона НЗ по остатку К9 (Egorova et al., 2009). Не исключено, что именно триметилированная форма Stellate играет ключевую роль в аберрантном мейотическом процессе за счёт изменения фосфорилирования ядерных хромодоменных белков, участвующих в когезии и/или расхождении гомологичных хромосом и сестринских хроматид в мейозе.

Повторы Stellate эволюционно фиксированы и сохраняют высокую гомогенность в геноме D. melanogaster (Tulin et al., 1997; Kogan et al., 2000). Гены Stellate представляют собой основную мишень piPHK-сайленсинга в семенниках D. melanogaster (Aravin et al., 2001; Nagao et al., 2010). Т.о. для поддержания фертильности самцов и воспроизводства вида необходима интактная система генов Ste-Su(Ste) и корректная работа piPHK-зависимой машины сайленсинга.

Остаются неизвестными как эволюционный смысл возникновения Ste-Su(Ste) системы, так и точный механизм вызываемого гиперэкспрессией Stellate патогенеза. У других близкородственных видов Drosophila подобной системы не обнаружено. Возникновение, эволюция и регуляция Ste-Su(Ste) системы остается предметом интенсивных исследований (Kalmykova et al., 1997; Kalmykova et al., 2002; Usakin et al., 2005; Nishida et al., 2007; Nagao et al., 2010;

Kogan et al., 2012). Однако до настоящего времени о транскрипционной регуляции экспрессии генов Stellate было известно немного.

В ходе данной работы было проведено функциональное картирование промотора генов Stellate, в результате которого в составе минимального промоторного участка были обнаружены три г/мс-регуляторных элемента, известных как E-боксы (CANNTG). Один и тот же фактор из ядерного экстракта семенников (dUSF, транскрипционный фактор из семейства bHLH, basic Helix-Loop-Helix) взаимодействовал со всеми тремя E-боксами in vitro. С помощью репортерного анализа была показана необходимость E-боксов для семенник-специфической транскрипции с использованием данного промотора in vivo. Полученные данные позволили охарактеризовать новый тип семенник-специфического промотора, определяющего смысловую транскрипцию не только повторов Ste-Su(Ste), но и другого семейства семенник-специфичных генов.

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы являлся анализ семенник-специфичного промотора генов семейства Stellate. Для этого были поставлены следующие задачи:

• картировать г/мс-регуляторные участки в последовательности промотора генов Stellate;

• идентифицировать тканеспецифичный транскрипционный фактор, взаимодействующий с цис-регуляторными участками в промоторе генов Stellate;

• доказать функциональную значимость найденных z/wc-регуляторных участков для транскрипции in vivo с помощью репортерных конструкций;

• провести сравнительный анализ промоторов семейств генов Ste-Su(Ste) и PNACtes;

• сравнить активность репортерных конструкций под промотором генов Stellate, встроенных в аутосомы и в Х-хромосому.

Научная новизна работы

В работе представлен анализ семенник-специфичного промотора генов семейства Stellate. Впервые обнаружены в промоторной области три близко расположенных tywc-регуляторных участка, известных как E-боксы, с которыми взаимодействует один транскрипционный фактор - dUSF семейства bHLH (basic Helix-Loop-Helix). Для dUSF впервые показана его тканеспецифичная экспрессия у D. melanogaster.

С использованием избирательно мутагенизированных репортерных конструкций показано, что для эффективной семенник-специфической транскрипции с промотора Stellate in vivo необходимы ненарушенные Е-боксы, причем наиболее важным регуляторным элементом является Е-бокс 2. Сравнительный анализ последовательностей промоторов генов Stellate, Su(Ste) и PNACtes позволил установить, какие из E-боксов являются общими для всех генных семейств. Был также обнаружен потенциальный сайт связывания неизвестного транскрипционного фактора в промоторной области двух генов семейства PNACtes, несущих делецию Е-бокса 2 в промоторе. Поскольку мы не обнаружили E-боксов в составе известных семенник-специфичных промоторов, то промотор Stellate может рассматриваться как новый тип промотора, ответственный за семенник-специфичную транскрипцию.

С помощью анализа экспрессии репортерных конструкций P{Ste703-lacZ} и P{6Stellate-Ste703-lacZ}, встроенных в различные хромосомы, мы впервые показали, что активность эндогенного промотора семенник-специфичных генов Х-хромосомы определяется контекстом хроматина Х-хромосомы в

терминальных клетках самцов и является сниженной вдвое по сравнению с таковой в аутосомах. Это позволяет говорить о двух уровнях репрессии генов Stellate, один из которых реализуется на уровне хроматина, приводя к частичному подавлению их транскрипции, а другой основан на посттранскрипционном piPHK-сайленсинге, обеспечивающем полную репрессию этих генов.

Практическая значимость

Нарушения слаженного механизма работы генетической системы Ste-Su(Ste) приводит к значительным дефектам сперматогенеза, воспроизводства и поддержания вида. И если о посттранскрипционном сайленсинге генов Stellate с помощью piPHK в настоящий момент известно довольно много, то о регуляции транскрипции генов Stellate данных чрезвычайно мало. В работе охарактеризован новый тип тканеспецифичного промотора, выявлены цис-регуляторные участки и идентифицирован взаимодействующий с ними фактор. Результаты данной работы расширяют наши знания о механизмах тканеспецифичной экспрессии генов, о транскрипционной регуляции разных генных семейств, обладающих одинаковым промотором и о влиянии X-хромосомного контекста на экспрессию Х-сцепленных генов на премейотических стадиях сперматогенеза.

Апробация работы

Работа апробирована на лабораторном семинаре в Отделе молекулярной генетики клетки (ОМГК) ИМГ РАН и на научном коллоквиуме Лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации ИМБ РАН.

Данные, полученные в работе, были представлены на следующих научных симпозиумах и конференциях: Eighteenth IGB meeting "Epigenetic Bases of Genome Reprogramming" (Capri, Italy, 8-11 October, 2005), 48th Annual Drosophila Research Conference (Philadelphia, USA, March 7-11, 2007),

Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of N.I. Vavilov (Kiev, Ukraine, 20-22 September, 2007), на IV Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, Украина, 22-26 сентября, 2008 г.), на Международный научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, Россия, 28 сентября - 1 октября, 2009 г.), на XXV Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», посвященной 30-летию Научно-образовательного центра ИБХ РАН (Москва, Россия, 11-15 февраля, 2013 г).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в международных реферируемых журналах, статья в сборнике трудов международной конференции и глава в серийном издании «Drosophila Melanogaster: Life Cycle, Genetics and Development».

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 147 страницах машинописного текста, содержит 39 рисунков. Список цитированной литературы состоит из 262 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии Drosophila melanogaster

Для Р-элементной трансформации использовали линию Df(1)\Ф7с 23(2)yt в работе обозначена как yw. Линия с делецией большей части повторов Su(Ste) на Y хромосоме cry1 Y - ywf/C(l)DX, yf/cry1 Yy+, описана в работе Palumbo et al., 1994; в работе обозначена как cryА Были использованы линии, несущие конструкции P{Stel34-lacZ} (Aravin et al., 2001), P{Ste703-lacZ} (Аравин и др., 2000) и P{Stel34mut-lacZ} (Aravin et al, 2004), последняя обозначена как Stel34-E3M-lacZ. Для ремобилизации конструкции P{Stel34-lacZ} (получения трансгенных линий с различными местами встройки в геном), была использована линия w*; wppP-'/CyO; ry506 Sb1 Р{Л2-3}99В/ТМ6В, ТЪ1.

Молекулярно-биологические методы

Клонирование, гетерологичную экспрессию в клетках Е. coli, гибридизацию по Саузерну, Вестерн-блот анализ и другие традиционные манипуляции проводили согласно общепринятым методикам. Р-элементную трансформацию эмбрионов дрозофилы проводили по стандартной методике (Rubin and Spradling, 1982). Выделение ядерного экстракта из семенников проводили по методу, описанному в работе Klymenko et al., 2006, с небольшими модификациями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Идентификация чис-регуляторных участков в промоторе генов Stellate

Как показано ранее, репортерные конструкции, несущие в качестве промоторов проксимальные 5'-участки (225 п.н. (пар нуклеотидов) и 134 п.н.) гетерохроматиновых генов Stellate (Ste225-lacZ и Stel34-lacZ), достаточны для высокоуровневой экспрессии ß-галактозидазы в семенниках самцов с делецией локуса crystal (cry'Y) (Aravin et al., 2001). Фрагмент размером 134 п.н., включающий -101 п.н. перед и +33 п.н. после старта транскрипции, может рассматриваться как минимальный промотор генов Stellate. Известно, что многие гены, экспрессирующиеся в семенниках, имеют чрезвычайно короткие промоторы (White-Cooper, 2010).

Для обнаружения г/мс-регуляторных участков в минимальном промоторе генов Stellate был применён EMSA анализ (Electrophoretic Mobility Shift Assay, или гель-шифт). В качестве зондов был использованы четыре радиоактивно меченых по 5'-концу двуцепочечных олигонуклеотида размером 27-37 п.н. (Ste 1, Ste 2, Ste 3 и Ste 4), полностью перекрывающие последовательность минимального промотора гетерохроматиновых генов Stellate (Рис. 1).

Е-бокс 1 Е-бокс 2

GAGTCTAGAG ГГСССАТСТЗ GAAGGGCATG ACAGACTCCT GGCAGGCCTT ТТАСЙАССТО TCAAAAACTC

_. ..................... _ 32

Ste 1 -

Ste 2

+ 1 |ПГ Е-бокс 3 DPE

AAAGAAGAAG ACGATGACTT TGAACTCTAC aIaGTCATATT TCTGTGATgAÄSSAACTGG CÄACATGTCG

--+39

ste 2(i»«. -.;

Ste 3 -

Ste 4

Рис. 1. Схема проксимального промоторного участка гетерохроматиновых генов Stellate. Старт транскрипции (+1) обозначен стрелкой, последовательности Inr и DPE выделены рамками, последовательности Е-боксов - прямоугольниками. Последовательности олигонуклеотидных зондов для гель-шифта (Ste 1, Ste 2, Ste 3 и Ste 4) подчёркнуты.

Мы обнаружили формирование специфичных ДНК-белковых комплексов с одинаковой электрофоретической подвижностью (С1) для зондов Ste 1, Ste 2 и Ste 4 после инкубации их с ядерным экстрактом семенников (Рис. 2). Для зонда Ste 2 характерно образование двух комплексов, помимо комплекса С1, формировался комплекс С2, обладающий большей электрофоретической подвижностью (Рис. 2). Специфичность ДНК-белковых комплексов была подтверждена с помощью контрольных экспериментов: добавления 50-ти кратного избытка немеченого двуцепочечного олигонуклеотида с той же последовательностью было достаточно для эффективного подавления формирования комплексов С1, тогда как добавление такого же избытка немеченого двуцепочечного олигонуклеотида со случайной последовательностью не оказывало влияния на связывание зондов. Эффективность образования комплекса С1 воспроизводимо уменьшается в ряду Ste 2 (1) > Ste 4 (0,71)> Ste 1 (0,1) (в скобках приведена относительная интенсивность сигнала).

Одинаковая подвижность в геле всех трех ДНК-белковых комплексов С1 указывала на то, что один и тот же транскрипционной фактор из ядерного экстракта семенников может связываться с однотипными сайтами в последовательности каждого из трех зондов. Олигонуклеотид Ste 2, формирующий ДНК-белковый комплекс с наибольшей интенсивностью сигнала, содержит палиндромную гексануклеотидную последовательность CACGTG, известную из данных литературы как Е-бокс (Е-бокс 2, -47—42 п.н.) (Рис. 1). Е-боксы являются регуляторными элементами, распознаваемыми транскрипционными факторами семейства bHLH и рядом других факторов (Atchley and Fitch, 1997; Ledent et al., 2002). Выравнивание последовательностей зондов Ste 1 и Ste 4 относительно Ste2 позволило также обнаружить в их составе по одному вырожденному непалиндромному Е-боксу - CATCTG (Е-бокс 1, -87 —82 п.н.) и CAAGTG (Е-бокс 3, +18 — +23 п.н.), соответственно

и

(Рис. 1 и ЗА). Таким образом, были обнаружены три потенциальных цис-регуляторных участка в минимальном промоторе генов Stellate.

ядерный экстракт семенников - + + +- + + + - + + + - + + + + специфический конкурент + +

+ неспецифический конкурент ___ + ___+___+___ +

Рис. 2. Детекция ДНК-белковых комплексов. Показан результат EMSA с радиоактивно-мечеными олигонуклеотидами, перекрывающими минимальный промотор генов Stellate, после инкубации с ядерным экстрактом семенников. Специфичность комплексов подтверждена конкурентным анализом при добавлении 50-ти кратного избытка немеченых специфического (специфический конкурент) или неспецифического (неспецифический конкурент) олигонуклеотидов.

ЕМБА с использованием ядерного экстракта из голов мух и эмбрионального ядерного экстракта выявил формирование ряда других комплексов с отличной от С1 электрофоретической подвижностью. Поэтому белковый фактор, взаимодействующий с зондами 81е 1, 81е 2 и 81е 4, по-видимому, является тканеспецифичным для семенников.

12

Е-бокс 2

Ste 2 GGCCTTTCAGCACGTGTCAAAAACTCAAAGAAGAAG Е-бокс 1

Ste 1 GAGTTCCCATCTGGAAGGGCATGACAGAGTCCTGGCA

Е-бокс 3

Ste 4 TTCTGTGAACAAGTGAACTGGCATCGGT

ядерный экстракт семенников - + + + + + - + + неспецифический конкурент -- + -- -- -+ специфический конкурент • +

С1

ядерный экстракт семенников + + + + + + + конкурент Ste 2 - + - - + -

+ конкурент Ste2mut - _ + _ _ +

Ste 2

|Ste2mut

зонд: Ste 1 I Ste 2 I Ste 4

Рис. 3. Идентификация цис-регуляторных участков в промоторе генов Stellate. (А) Олигонуклеотиды Ste 1, Ste 2 и Ste 4 содержат мотивы, известные как Е-боксы (выделены шрифтом). (Б) Связывание олигонуклеотидного зонда Ste 2 с белком из ядерного экстракта зависит от присутствия ионов Mg2+ и последовательности Е-бокса. При использовании зонда Ste 2mut (с нарушенным Е-боксом) образование комплекса С1 не происходит. (В) Все три олигонуклеотидных зонда, Ste 1, Ste 2 и Ste 4, связываются с одним и тем же фактором из ядерного экстракта семенников. Представлен результат EMSA в присутствии 70-ти кратного молярного избытка немеченых конкурентов Ste 2 или Ste 2mut, а также в их отсутствии. Немеченый Ste 2 конкурирует с меченым за образование комплекса С1. Немеченый Ste 2mut (с нарушенным Е-боксом) не влияет на образование комплекса С1.

Мы показали, что семенник-специфический фактор связывается именно с Е-боксом в последовательности Ste 2, поскольку при использовании в качестве зонда олигонуклеотида Ste 2mut (в котором последовательность Е-бокса 2 CACGTG была заменена на GGCTAT) образование комплекса С1 нарушалось (Рис. ЗБ). Образование комплекса зависело также от присутствия ионов Mg2+ (Рис. ЗБ).

Чтобы подтвердить гипотезу о связывании одного фактора со всеми тремя олигонуклеотидами мы провели EMSA в присутствии 70-ти кратного молярного избытка немеченых конкурентов Ste 2 или Ste 2mut, а также в их отсутствии (Рис. ЗВ). Добавление избытка немеченого Ste 2 эффективно нарушает образование комплекса С1 для всех трех зондов. При этом избыток немеченого Ste 2mut не влияет на образование комплексов. Поскольку олигонуклеотид Ste 2 взаимодействует с фактором из экстракта семенников через Е-бокс (Рис. ЗБ), то и с остальными зондами Ste 1 и Ste 4 он конкурирует благодаря Е-боксу, в отсутствие которого (Ste 2mut) конкуренции не происходит (Рис. ЗВ). Следовательно, все три Е-бокса взаимодействуют с одним и тем же фактором.

Идентификация фактора, связывающего Е-боксы, в промоторе гетерохроматиновых генов Stellate

Е-боксы узнаются транскрипционными факторами обширного семейства белков basic Helix-Loop-Helix (bHLH), а также некоторыми другими белками. Транскрипционные факторы bHLH играют важную роль в регуляции различных клеточных процессов у эукариот. Белки семейства bHLH связываются с Е-бокс-мотивами как гомо- и гетеродимеры или в составе сложных мультибелковых транскрипционных комплексов (Atchley and Fitch, 1997; Legent et al., 2002).

Связывание фактора с Е-бокеами зависело от ионов Mg2+ (Рис. ЗБ). Более быстро мигрирующий комплекс С2 (Рис. 2 и Рис. ЗВ) часто обнаруживался в EMSA с зондом Ste 2. Избыток немеченого специфического конкурента эффективно предотвращал формирование обоих комплексов, С1 и С2 (Рис. 2 и Рис. ЗВ). Такой же избыток неспецифического конкурента не влиял на комплекс С1, тогда как формирование комплекса С2 заметно снижалось. Полуспецифический комплекс С2 становился более заметным при длительном хранении ядерных экстрактов семенников при -70°С, тогда как относительная интенсивность сигнала С1 при этом уменьшалась. Однако, при увеличении концентрации ДТТ (дитиотрейтола) в инкубационной смеси с 1 до 5 мМ и выше удавалось достичь воспроизводимого увеличения содержания комплекса С1 и ослабление сигнала от комплекса С2 (Рис. 4А). Формирование полуспецифичного комплекса С2 может быть объяснено слабым связыванием мономера транскрипционного фактора семейства bHLH с полусайтом Е-бокса, что, возможно, связано с внутримолекулярным окислением сульфгидрильных фупп при длительном хранении экстракта и препятствием для образования димеров фактора для взаимодействия с целым Е-боксом. Подобное влияние окислительно-восстановительных условий среды было ранее описано для фактора USF млекопитающих (Marmillot and Scovell, 1998; Pognonec et al., 1992), так же как и зависимость от ионов Mg" (Bendall and Molloy, 1994). Таким образом, по биохимическим свойствам фактор, взаимодействующий с Е-боксами в промоторе Stellate, похож на USF млекопитающих.

А

Б

ядерный экстракт семенников ДТТ. мМ

+ неспецифический конкурент + специфический конкурент

С1 ■

С2 ■

115 5 5

ядерный экстракт семенников

Т9 анти-dUSF антитела, мкл анти-Prwi антитела, мкл

S1

С1

С2

зонд:

Ste 2

Ste 2

Рис. 4. Идентификация Е-бокс-связывающего фактора ядерного экстракта семенников. (А) Влияние концентрации дитиотрейтола (ДТТ) на взаимодействие фактора с зондом 81е 2. (Б) «Супер-шифт» ЕМ8А при добавлении антител в реакционную смесь. Наблюдается появление нового медленно мигрирующего комплекса 81. при добавлении анти^ШР антител, но не анти-Р11лч антител.

Продукт гена CG 17592 D. melanogaster, dUSF, был предсказан биоинформатическими методами, но биохимически не исследован (Moore et al., 2000), однако EST-библиотеки из семенников взрослых мух содержали клоны ¿/ms/'mPHK. Для подтверждения гипотезы о взаимодействии dUSF с Е-боксами в составе промоторов генов Stellate мы получили мышиные поликлональные антитела против укороченной (peKUSFl) и полноразмерной (peKUSF2) формы рекомбинантного dUSF (Рис. 5) и провели EMSA. Добавление анти-dUSF антител в реакционную смесь вызывало уменьшение сигналов комплексов С1 и С2 и появление более медленно мигрирующего комплекса S) (т.н. "супер-шифт") (Рис. 4Б). Добавление антител к другому ядерному белку, Piwi, не

влияло на образование и миграцию в геле комплексов С1 и С2. Полученные результаты позволяют рассматривать сШБР как транскрипционный фактор из экстракта семенников, ответственный за связывание с Е-боксами и формирование С1 и С2 комплексов.

кДа 250 ■ 150 ' 100 ■ 75

50

37

<f <fT <$> сГ ^ Ч^

антитела:

dUSF

Vasa актин

Рис. 5. Вестерн-блот анализ рекомбинантных белковых фрагментов peKUSFl. peKUSF2 и эндогенного dUSF в лизатах различных тканей мух yw с использованием полученных анти-dUSF антител. Белок с подвижностью около 55-57 кДа детектируется только в лизате семенников. В каркасах наблюдается неспецифическая полоса большей подвижности (*). Антитела к актину использованы для контроля загрузки, антитела к Vasa - для маркировки терминальных тканей.

А

Б

В

сШЭР

Рис. 6. Иммунофлуоресцентное окрашивание семенников уч/ (А, Б) и 82 клеток ОгояорИНа (В) с использованием анти-сЮЗР антител (зеленый сигнал). Хроматин окрашен с помощью БАР1 (голубой). Ядерные оболочки визуализированы с помощью антител к ламину (красный). (А) Диффузное внутриядерное и цитоплазматическое окрашивание (Ш8Р видно в сперматоцитах. (Б) показано увеличенное изображение ядер двух сперматоцитов, обозначенных в (А) белым квадратом. (В) Никакого сигнала сШ8Р в 82 клетках ОгояоркНа не наблюдается.

Экспрессия Stellate происходит в первичных сперматоцитах самцов, с делецией локуса Su(Ste) (Aravin et al., 2004; Bozzetti et al., 1995; Egorova et al., 2009). Иммунофлуоресцентное окрашивание семенников показало присутствие dUSF в ядрах, а также в цитозоле первичных и зрелых сперматоцитов (Рис. 6А, 6Б), подтверждая предположение о том, что dUSF требуется для семенник-специфической транскрипции генов Stellate. Сигнал dUSF в S2 клетках Drosophila не был детектирован (Рис. 6В), в соответствии с отсутствием в них экспрессии dUSF (Рис. 5).

Функциональность г<мс-регуляторных элементов в промоторе генов

Stellate

Для подтверждения функциональности E-боксов в промоторе генов Stellate in vivo использовали конструкцию Stel34-E123M-lacZ, содержащую минимальный промотор генов Stellate с тремя нарушенными E-боксами. С помощью Р-элементной трансформации эмбрионов были получены трансгенные линии, содержащие конструкцию в различных участках генома. Для получения сравнимого количества контрольных линий с интактным промотором была проведена ремобилизация трансгена Stel34-lacZ в ранее полученной линии (Aravin et al., 2001). Трансгенные линии содержали встройку конструкции в аутосоме и были введены в геном самцов с делецией основной части локуса crystal, cry1 Y. Потеря всех трех E-боксов в составе промотора Stellate приводила к снижению экспрессии lacZ в семенниках в среднем до 4%, в сравнении с интактным промотором (Рис. 7 и Рис. 8А).

контрольные Ste134-lacZ¿ ц, yw линии

\-я „<и

м

Ste134-E123-lacZ #2 #1

линии

Рис. 7. Гистохимическое окрашивание семенников мух, несущих конструкцию 81е134-Е123м-1ас2, и контрольных линий мух, субстратом Р-галактозидазы Х^а1. При нарушении всех трёх Е-боксов в конструкции Е123м-1ас2 активность репортёрного гена значительно снижается. Слабый уровень экспрессии наблюдается только в линии №1, в положительном контроле, линии 81е134-1асХ, детектируется сильное окрашивание семенника. Никакой активности не наблюдалось в семенниках мух_ун>, не несущей трансгенную конструкцию.

Активность р-галактозидазы в головах трансгенных мух достоверно не отличалась от активности фермента в контрольной линии yw (не показано), что свидетельствует о специфичности экспрессии в семенниках. Полученные результаты строго свидетельствуют о функциональности E-боксов в составе промотора Stellate in vivo.

А

Ste 134-Е123"-!acZ линии

Ste 134-lacZ линии

Д WOflacZ

ItH

6 8 ОГГ/мг/ч

10 12 14

Ste 134-E2"-lacZ линии

Г д ia<;¿

Ste 134-E3"-lacZ линии

П—Ш

Ste 134-lacZ линии 41-^Ш-iacZ

Эн

2 4 6 8 10 12 ОГТ/мг/ч

Рис. 8. Анализ активности репортерных конструкций in vivo в семенниках. Слева-обозначения и схемы соответствующих трансгенных конструкций, Е-боксы обозначены серыми квадратами. Справа - активность |3-галактозидазы (см. Методы исследования). (А) Резкое уменьшение р-галактозидазной активности при нарушении трёх E-боксов. (Б) Активность Р-галактозидазы при нарушении Е-бокса 2 (конструкция Stel34-E2M-lacZ) падает вдвое. Нарушение Е-бокса 3 (конструкция Stel34-E3M-lacZ) не сказывается на активности Р-галактозидазы.

Только Е-боке 2 содержит каноническую палиндромную последовательность САССТС, известную как сайт узнавания транскрипционными факторами семейства ЬНЬН групп В и С, остальные два Е-

21

бокса являются вырожденными (рис. ЗА). Потеря центрального Е-бокса 2 с заменой его на TGCGAT достоверно (р<0.05) приводила к падению активности |3-галактозидазы на 55% (Рис. 8Б), тогда как разрушение Е-бокса 3 в конструкции Stel34-E3M-lacZ не приводило к достоверному уменьшению активности (3-галактозидазы (Рис. 8Б) и (Aravin et al., 2004). Следовательно, любого из двух Е-боксов, 2-го или 3-го, достаточно для поддержания транскрипции генов Stellate, хотя для высокоуровневой транскрипции необходимо присутствие палиндромного Е-бокса 2.

Дивергенция в промоторной области генов семейства fiNACtes

Обнаружение в Х-хромосоме семенник-специфичных дуплицированных генов [iNACtes с промоторами, гомологичными промоторам генов Stellate (Usakin et al., 2005), позволяет рассмотреть вопрос, касающийся изменчивости г/мс-регуляторных участков в промоторах тканеспецифичных генов. Гены fiNACtes предположительно кодируют белок, гомологичный /?-субъединице комплекса белков, связывающихся с растущей полипептидной цепью (NAC, Nascent polypeptide-Associated Complex). Семейство генов fiNACtes в X-хромосоме представлено пятью копиями, расположенными в секции 12Е X-хромосомы вблизи одного из кластеров генов Stellate (Usakin et al., 2005) и псевдогеном ($NACtes5, расположенным в секции 13Е. Четыре гена (J3NACtes3, PNACtes4 и [3NACtes6, /3NACtes2) образуют два тандемных повтора «голова к хвосту» на расстоянии 65 т.п.н. друг от друга (в противоположной ориентации) (Рис. 9А). /3NACtesl и псевдоген (!NACtes5 являются одиночными копиями (Usakin et al., 2005).

А

ßNACtesl ßNACtes3 /iNACtes4

ßNACtes2 ß/VACtesS

Б

ядерный экстракт семенников + + + + + + + +

специфический крнкурент + +

неспецифический конкурент + + -

конкурент Ste 2 -..+...+

зонд: NAC 1 NAC 2

Рис. 9. (А) Геномная организация кластера генов ßNACtes в X хромосоме. Кластер состоит из единичного гена ßNACtes 1 и двух пар тандемно дуплицированных генов {ßNACtes3 и ßNACtes4; ßNACtesö и ßNACtes2), расположенных «голова к хвосту». (Б) Результаты EMSA с использованием олигонуклеотидных зондов NACI и NAC2. В ядерном экстракте семенников содержится белковый фактор, который специфично взаимодействует с зондом NAC2 с образованием комплекса СЗ.

Ранее показана высокая степень гомологии (до 95%) на протяжении 180 п.н. в промоторных областях генов Stellate и fiNA С tes (Usakin et al., 2005). Установлено, что в промоторах генов [INАС tes наблюдается низкий уровень дивергенции и для 5'-копий тандемов (3,3%), и для З'-копий (1,1%). Однако уровень различий между 5'- и З'-копиями достигал 8,3%. Различия затрагивали последовательности E-боксов. Е-боксы 1 и 2 оказались консервативными только в 5'-копиях обоих тандемов и в одиночном гене [INACtesl, тогда как 3'-копии утратили E-боксы (Рис. 10, внизу). В промоторах pNACtes2 и pNACtes4 Е-бокс 1 был разрушен в результате точечной мутации, а палиндромный Е-бокс 2 полностью исчез в результате делеции 17 п.н. Мы тестировали в EMSA с ядерным экстрактом семенников олигонуклеотиды NACI и NAC2, перекрывающие измененные участки. Только зонд NAC2 (соответствующий области с делецией 17 п.н.) образует специфичный ДНК-белковый комплекс СЗ в ядерном экстракте семенников (Рис. 9Б). Добавление 100-кратного избытка немеченого олигонуклеотида Ste2 не разрушало комплекс СЗ, что свидетельствует о том, что dUSF не взаимодействует с последовательностью NAC2 (Рис. 9Б). Зонд NAC2 содержит протяженный участок, богатый нуклеотидами А и Т (ТТТТТАААААААААА), появившейся в результате делеции 17 п.н. в промоторе. Мы предполагаем, что этот элемент с потенциальной крестообразной структурой может служить сайтом связывания для белков, содержащих AT-hook.

Е-бокс 3 в минимальном промоторе генов Stellate находится за пределами области гомологии с промоторами генов pNACtes, и в промоторах генов PNACtes отсутствует (Рис. 10). В целом, из промоторов генов PNACtes2 и PNACtes4 исчезли функционально значимые г/иорегуляторные элементы генов Stellate.

0

1 -V

£Я

OÜ1 £ 3 Ьч

■S (U

О) ч-t

г </> 01 и

о

0

5 и

<и О

1. +J

Ь 2

01 0) £ -О

<и и

Г" старт транскрипции (ei] [еГ] [ез] расположение Е-боксов

(р) точечная мутация новый сайт связывания для ТФ

i hoppel ~*^^"делеция .........у"'' "" инсерция транспозона

" --- расположение зондов NACI и NAC2

Рис. 10. Сравнительная схема организации промоторных областей генов Ste-Su(Ste) и ßNACtes. Условные обозначения приведены в нижней части схемы. Область гомологии в промоторах выделена серыми прямоугольниками. Нумерация E-боксов соответствует указанной в тексте автореферата. Обозначены положения зондов NACI и NAC2, соответствующих точечной мутации в области Е-бокса 1 и небольшой делеции последовательности, приводящей к потере E-бокса у генов ßNACtes2 и ßNACtes4.

Таким образом, мы показали, что Е-бокс 1 и Е-бокс 2 являются консервативными только для трёх копий генов семейства ßNACtes: ßNACtesl, ßNACtes3 и ßNACtesö, тогда как другие два члена семейства ßNACtes2 и ßNACtes4 свои Е-боксы утратили за счёт точечной замены и небольшой делеции (Рис. 10). Возможно, что потеря Е-боксов и приобретение нового цис-

25

регуляторного участка частью промоторов генов /?NACtes может быть результатом положительного отбора, благоприятствующего фиксации этих изменений.

Репрессия активности трансгенов в Х-хромосоме

В соматических клетках Drosophila гены, расположенные в Х-хромосоме, подвергаются дозовой компенсации, т.е. в соматических клетках у самцов активность генов в единственной Х-хромосоме вдвое выше, чем каждого из генов в Х-хромосоме самок. Дозовая компенсация обеспечивается привлечением к Х-хромосоме самца комплекса белков MSL (male-specific lethal) и ацетилированием гистона Н4 по положению К16 (ацетил-Н4К16) (Gelbart and Kuroda, 2009; Avner and Heard, 2001; Lucchesi et al., 2005). Дозовая компенсация не распространяется на терминальные клетки самцов, где хроматин Х-хромосомы лишен ряда белков комплекса MSL и не обогащен позитивной модификацией ацетил-Н4К16 (Rastelli and Kuroda, 1998; Meiklejohn etal., 2011).

Мы сравнили активность репортерного гена под контролем промотора гетерохроматиновых генов Stellate (в конструкциях P{Ste703-lacZ} и P{6Stellate-Ste703-lacZ}) при встраивании трансгенов в аутосомы и Х-хромосому. Было обнаружено, что экспрессия трансгенов в Х-хромосоме, снижена на 53-63%, по сравнению с экспрессией таких же трансгенов, локализованных в аутосомах (Рис. 11).

ОП* линии P{Ste703-lacZ}

30 т

гл

111

4i

1 2 3 4 5 6 7

Х-Хромосома аутосома

ОП* линии P{65tellate-Ste703-lacZ}

rb

40

fia

la

1 2 3 4 5 6

J I_

Х-Хромосома аутосома

Рис. 11. Анализ активности репортерных конструкций P{Ste703-lacZ} и P{6Stellate-Ste703-lacZ} in vivo в семенниках трансгенных самцов. По оси ординат: полученные значения р-гапактозидазной активности, представленные как ОП*. Анализ экспрессии трансгенов в Х-хромосоме (темно-серые столбики) показал снижение Р-гапактозидазной активности, в среднем на 63% (для конструкций P{Ste703-lacZ}) и на 53% (для конструкций P{6Stellate-Ste703-lacZ}), по сравнению с теми же трансгенными конструкциями в аутосомах (светло-серые столбики).

Таким образом, показано, что в трансгенных конструкциях активность промотора семенник-специфичных генов Х-хромосомы в терминальных клетках определяется контекстом хроматина Х-хромосомы. Можно предположить, что на премейотической стадии сперматогенеза, в первичных сперматоцитах, наблюдается специфическая перестройка хроматина X-хромосомы, проявляющаяся в подавлении экспрессии генов. Это показывает существование двух уровней репрессии генов Stellate, один из которых реализуется на уровне хроматина, приводя к частичному подавлению их транскрипции, а другой основан на посттранскрипционном piPHK-сайленсинге, обеспечивающем полную репрессию этих генов.

Выводы

1. В составе промоторов семенник-специфичных генов Stellate у Drosophila melanogaster обнаружены три консервативных г/мс-регуляторных участка, Е-боксы (CANNTG). Наличие в промоторе генов Stellate двух Е-боксов из трех необходимо и достаточно для семенник-специфичной экспрессии репортерного гена.

2. Транскрипционный фактор dUSF из семейства bHLH экспрессируется в сперматоцитах Drosophila melanogaster и специфично взаимодействует с Е-боксами в составе промотора генов Stellate.

3. Экспрессия трех генов семейства fiNACtes в семенниках определяется Е-бокс-содержащим промотором, гомологичным промотору Stellate. Полученные данные позволили охарактеризовать новый тип семенник-специфичного промотора.

4. Выявлена фиксированная потеря Е-боксов в результате делеции и точечной мутации без изменения остальной последовательности промотора в отдельных копиях семенник-специфичных генов [JNACtes.

5. В терминальных клетках самцов активность промотора семенник-специфичных генов Stellate в трансгенных конструкциях, расположенных на Х-хромосоме, снижена вдвое по сравнению с его активностью в аутосомах, т.е. определяется контекстом хроматина Х-хромосомы в сперматоцитах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи

1. Olenkina P.M., Egorova K.S., Kibanov M.V., Gervaziev Y.V., Gvozdev V.A., Olenina L.V. (2012) Promoter contribution to the testis-specific expression of Stellate gene family in Drosophila melanogaster. Gene, 499(1), 143-153.

2. P.M. Оленкина. K.C. Егорова, A.A. Аравин, H.M. Наумова, B.A. Гвоздев, JI.В. Рленина (2012) Картирование г/ис-регуляторных участков в промоторе семенник-специфичных генов Stellate у Drosophila melanogaster. Биохимия (Москва), том 77, вып. 11, с. 1536 - 1545.

3. Ksenia S. Egorova, Oxana М. Olenkina, Ludmila V. Plenina. Significance of Stellate Genes in Spermatogenesis of Drosophila melanogaster. (Chapter in «Drosophila Melanogaster. Life Cycle, Genetics and Development», ed. M. Spindler-Barth, Nova Science publishers, 2012, p.39-61, ISBN: 978-1-61470426-3.

4. Oxana M. Olenkina. Ludmila V. Olenina, Sergei A. Lavrov, Mikhail S. Klenov, Vladimir A. Gvozdev. Analysis of testis-expressed Stellate genes promoter region in D. melanogaster. В сборнике трудов IV Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, Украина, 22-26 сентября 2008 г.), стр. 352-357.

Тезисы

1. Olenkina P.M., Olenina L.V., Lavrov S.A. and Gvozdev V.A. The study of chromatin structure of Stellate repeats in testes of Drosophila melanogaster. Eighteenth IGB meeting "Epigenetic Bases of Genome Reprogramming", Capri, Italy, 8-11 Pctober 2005, Abstract volume, p.68.

2. Plenkina P.M., Plenina L.V., Lavrov S.A. and Gvozdev V.A. In vitro search of the tissue specific trans-acting factor interacting with regulatory sequences

of the testis expessed Stellate genes in Drosophila melanogaster. 48th Annual Drosophila Research Conference, Philadelphia, USA, March 7-11 2007, Program and Abstract Volume, p. 365B.

3. Lev Usakin, Oxana Olenkina. Vladimir Gvozdev. Evolutionary analysis of the D. melanogaster betaNACtes gene family. 48th Annual Drosophila Research Conference, Philadelphia, USA, March 7-11 2007, Program and Abstracts Volume, p. 675C.

4. L.V. Olenina, P.M. Olenkina, S.A. Lavrov, V.A. Gvozdev. Detection of tissue-specific trans-acting factor interacting with regulatory sequences of Stellate genes of Drosophila melanogaster. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of N.I. Vavilov, Kiev, Ukraine, 20-22 September 2007, Abstract book, M-35, p. 83.

5. Оленкина P.M.. Егорова К.С., Кибанов М.С., Гвоздев В.А., Оленина JI.B. Транскрипционный фактор dUSF взаимодействует с регуляторными последовательностями Е-бокс в промоторной области семенник-специфичных генов Stellate Drosophila melanogaster. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Рвчинникова (Москва, Россия, 28 сентября — 1 октября 2009 г.), стр. 307-309 в сборнике тезисов.

6. Р.М.Рленкина. К.С.Егорова, М.В.Кибанов, Ю.В.Гервазиев, Л.В.Рленина. Транскрипционная регуляция кластеров семенник-специфичных генов Stellate у D.melanogaster. XXV Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», посвященная 30-летию Научно-образовательного центра ИБХ РАН (Москва, Россия, 11-15 февраля, 2013 г.), том 1, стр. 96.

Заказ № 52-Р/01/2015 Подписано в печать 22.01.15 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,4

ООО "Цифровичок", Москва, Большой Чудов пер., д.5 «¡Г-^лХ тел. (495)649-83-30

www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru