Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль транскрипционных факторов Cookie Monster и Cannonball в регуляции экспрессии генов в сперматогенезе Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль транскрипционных факторов Cookie Monster и Cannonball в регуляции экспрессии генов в сперматогенезе Drosophila melanogaster"

На правах рукописи ..............

' У

ЛАКТИОНОВ ПЕТР ПАВЛОВИЧ

РОЛЬ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ COOKIE MONSTER И CANNONBALL В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В СПЕРМАТОГЕНЕЗЕ DROSOPHILA MELANOGASTER

Молекулярная генетика - 03.01.07

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 4 окт im

005535750

Новосибирск - 2013

005535750

Работа выполнена в лаборатории геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск, Россия.

Научный руководитель: Белякнн Степан Николаевич

кандидат биологических наук, зав. лабораторией геномики, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: Омельянчук Леонид Владимирович,

доктор биологических наук, зав. лабораторией генетики клеточного цикла, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Медведев Сергей Петрович,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, г. Москва

Защита диссертации состоится «27» ноября 2013 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.074.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 8/2, т./ф. (383)363-90-45, факс (383) 363-90-78, e-mail: kokoza@mcb.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМКБ СО РАН.

Автореферат разослан «"?> » o'g^-gSjp -Я. 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, /^

кандидат биологических наук <-' (/ ~ ^ ^ Кокоза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из главных направлений функциональной геномики является изучение регуляторных систем, управляющих генетическими и эпигенетическими программами развития организма. Сперматогенез у Drosophila melanogaster является удобной моделью для изучения регуляции экспрессии генов в процессе клеточной дифференцировки. В семеннике дрозофилы можно легко различить все стадии развития клеток зародышевого пути - образование клеток из стволовых предшественников, пролиферацию и терминальную дифференцировку. Терминальная дифференцировка клеток мужского зародышевого пути у D. melanogaster сопровождается перестройкой хроматина, за которой следует активация генов, необходимых для сперматогенеза. Активация генов дифференцировки контролируется несколькими специализированными транскрипционными факторами, которые кодируются так называемыми генами задержки мейоза и которые можно разделить на два класса - aly и сап. Белковые продукты генов aly класса образуют комплекс tMAC (testis-specific meiotic arrest complex), а гены can класса являются семенник-специфичными паралогами (tTAF, testis-specific TBP-associated factors) генов TAF у D. melanogaster. Мутации генов задержки мейоза приводят к инактивации множества генов в семенниках, неспособности клеток зародышевого пути вступить в мейоз и остановке гаметогенеза на стадии сперматоцитов. Было показано, что на фоне мутаций по генам задержки мейоза промоторные области генов дифференцировки остаются связанными белком-репрессором Polycomb, что, по всей вероятности, вызывает подавление экспрессии. В работе Chen et al. [2011] была сформулирована гипотеза, согласно которой активация генов в семенниках зависит от синхронизированного действия белков tMAC и tTAF. Это предположение основано на наблюдении о том, что в отсутствии компонентов tMAC нарушается связывание tTAF с ДНК. Однако существующие данные описывают конечный эффект мутаций, что не дает представления о механизме действия и конкретной роли этих транскрипционных факторов. В первую очередь остаются невыясненными гены-мишени белков, кодируемых генами задержки мейоза. Более того, до сих пор не определено, являются ли эти белки прямыми активаторами или подавляют активность генов-репрессоров в клетках зародышевого пути. Также остается открытым вопрос о том, каким образом эти транскрипционные факторы участвуют в эпигенетической регуляции активности генов. Ответы на эти вопросы позволят приблизиться к пониманию принципов работы регуляторных систем, управляющих генетическими программами дифференцировки клеток зародышевого пути D. melanogaster.

В представленной работе для исследования роли транскрипционных факторов, кодируемых генами задержки мейоза, на первом этапе были установлены гены-мишени транскрипционного фактора Cookie monster (Comr), кодируемого геном, относящимся к aly классу. Картирование Comr проводили методом тканеспецифичного DamlD с последующим анализом методом микрочипов в масштабе генома. Анализ данных о локализации сайтов связывания Comr и экспрессии генов в семенниках мутантов по генам cookie monster (aly класс) и cannonball (сап класс) позволил установить роль Comr и Cannonball (Can) в регуляции экспрессии генов при дифференцировке клеток мужского зародышевого пути и сформулировать гипотезу относительно механизмов активации генов, необходимых для дифференцировки мужских гамет у D. melanogaster.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение роли транскрипционных факторов Comr и Сап в регуляции активности генов в процессе сперматогенеза у D. melanogaster. Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Создать генетическую систему для картирования сайтов связывания транскрипционных факторов методом DamID в клетках мужского зародышевого пути у D. melanogaster.

2. Определить профиль связывания транскрипционного фактора Comr с ДНК терминальных клеток самцов D. melanogaster.

3. Определить эффект связывания Comr на экспрессию генов в сперматоцитах D. melanogaster.

4. Определить регуляторный эффект белка Сап на гены, связанные с белком Comr

Научная новизна. Разработан подход, позволяющий картировать сайты связывания хроматиновых белков с ДНК в отдельных клеточных популяциях в организме D. melanogaster методом DamID. Этим методом впервые были локализованы участки связывания транскрипционного фактора Comr в геноме и выявлены его гены-мишени в терминальных клетках самца D. melanogaster. Показано, что белок Comr является прямым активатором части своих генов-мишеней в сперматоцитах. Выявлен возможный вторичный регуляторный фактор, экспрессия которого контролируется Comr. Предложена модель, описывающая этапы активации семенник-специфичных генов в сперматоцитах D. melanogaster и роль белков tMAC и tTAF в этом процессе.

Научно-практическая ценность. Результаты исследования вносят вклад в современные представления о регуляторных системах, управляющих генетическими и эпигенетическими программами развития клеток. Полученные данные содержат принципиально новую информацию о механизме действия белков комплексов tMAC и tTAF, что значительно расширяет представления о механизмах регуляции генов в семенниках D. melanogaster в процессе клеточной дифференцировки. Разработанная генетическая система для проведения тканеспецифичного DamID может быть использована для исследования транскрипционных факторов и иных ассоциированных с ДНК белков в клетках зародышевого пути у D. melanogaster. Полученная система универсальна и может быть легко адаптирована для исследования тканеспецифичных транскрипционных факторов в других органах D. melanogaster.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. Проведен анализ профиля связывания белка Comr в терминальных клетках самца D. melanogaster. Белок Comr является прямым активатором генов-мишеней в сперматоцитах. Установлено наличие неизвестных ранее вторичных генов-регуляторов транскрипции, находящихся под контролем белков Comr и Сап.

Личный вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа по математической обработке данных выполнена в сотрудничестве с Белякиным С.Н. и Максимовым Д.А. Данные по транскрипции генов в семенниках предоставлены Dr. Н. White-Cooper (Университет Кардиффа, Великобритания).

Апробация работы. Результаты работы представлены в виде стендовых сообщений: на международной конференции по системной биологии дрозофилы (Пултуск, Польша, 2012), на международной конференции «Хромосома-2012»

(Новосибирск, Россия, 2012), на международной конференции «Высокопроизводительное секвенирование в геномике» (Новосибирск, Россия, 2013); а также в устных докладах: на международной конференции по молекулярным механизмам регуляции сперматогенеза «ETW-16» (Эльба, Италия, 2010), на международной конференции «Хромосома-2012» (Новосибирск, Россия 2012).

Публикации. Результаты исследования представлены в 3 статьях и 5 тезисах конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входят 167 ссылок. Работа изложена на 112 страницах печатного текста, содержит 1 таблицу и 12 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии мух. Для проведения сайт-специфичной интеграции генетических конструкций использовали линии мух, несущие сайты интеграции attP40 и attP18, полученные из Bloomington Stock Center (США), описанные в базе данных Flybase (http://flybase.org) и работе Markstein et al. [2008]. Также использовались линии Oregon R, y'w67 (фонд лаборатории), yw; can3 red е/ТМ6С, yw; en comr2'"4" bw/CyO (Предоставлены Dr. Н. White-Cooper, Университет Кардиффа, Великобритания).

Генетические конструкции. Все этапы молекулярного клонирования проводили по стандартным протоколом или в соответствии с рекомендациями фирм-производителей (БиоСилика, Qiagen, Fermentas, Promega). В ходе работы были созданы следующие конструкции: nanos-cre, Ubipro>stop>mCD8-GFP, hsp70>síop>dam, hsp70>stop>dam-comr, полные нуклеотидные

последовательности которых можно найти в базе данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) под номерами КС845567, КС845568, JN993988 и КС845569, соответственно.

Трансформация генома дрозофилы. Введение генетических конструкций проводили при помощи системы attP/attB phiC31-опосредованной трансформации дрозофилы, которая описана в Bischof et al., [2007]. Трансформацию проводили по методике, описанной в Spradling, Rubin, [1982]. Конструкции nanos-cre и Ubipro>stop>mCD8-GFP были встроены в сайт интеграции attP40, а конструкции hsp70>stop>dam-comr и hsp70>stop>dam - в attP18.

Проведение DamID. По 200 пар семенников самцов генотипов y',w67,hsp70>stop>dam-comr/Y; nanos-cre/+ (№1), y',w6?,hsp70>stop>dam/ Y;nanos-cre/+ (№2) ny',w6?,hsp70>stop>dam/y',w67,hsp70>stop>dam; +/+ (№3) собирали диссекцией в охлажденном буфере PBS. Экспериментальный образец ДНК был выделен из семенников самцов генотипа №1, образец, выделенный из семенников самцов генотипа №2, использовали для контроля фонового метилирования, ДНК семенников самцов генотипа №3 использовали в качестве отрицательного контроля. Процедуру DamID проводили согласно методике, описанной в Greil et al. [2006] с последующим анализом полученных результатов с использованием микрочипов D. melanogaster Gene Expression 4х72К Arrays (Nimblegen, Roche). Гибридизацию микрочипов проводили на базе университета г. Торонто (Canadian Drosophila Microarray Centre, http://www.flyarrays.com/). Эксперимент был повторен дважды на независимых биологических образцах. Полученные данные были обработаны с использованием программного

обеспечения ArrayStar (http://vvww.dnastar.com). После проведения коррекции фона и RMA-нормализации для всех точек был посчитан логарифм отношения интенсивностей сигнала в опытном и контрольном образце (Log2(Dam-Comr/Dam)). Результаты были отфильтрованы на воспроизводимость по методу, описанному в Yang et al. [2002]. Данные двух независимых воспроизведений эксперимента были усреднены и сопоставлены с геномными координатами. Интенсивности сигналов от точек, расположенных внутри каждого гена, были усреднены. Экспериментальные данные DamID доступны в базе данных GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под номером GSE49799.

Для определения Comr-связанных, Comr-несвязанных и промежуточных геномных областей мы использовали Скрытую Марковскую модель с тремя состояниями (Hidden Markow Model, НММ). Геном D. melanogaster разбили на отрезки длиной 200 п.н., как описано в Kharchenko et al. [2011]. Для определения исходных параметров НММ геном разделили на участки в 5 т.п.н., перекрывающиеся на 1 т.п.н., для каждого из которых посчитали усредненную интенсивность сигнала (Log2(Dam-Comr/Dam)). Из общего числа выбрали по 2,5% участков, демонстрирующих самую низкую интенсивность сигнала, самую высокую и среднюю по геному, которые были использованы для определения Comr-несвязанных, Comr-связанных и индифферентных районов. Для оптимизации параметров НММ и предсказания по алгоритму Витерби использовали библиотеку «mhsmm» (O'Connell and Hojsgaard, 2011) в оболочке R (http://r-project.org).

Анализ экспрессии генов в семенниках самцов, мутантных по генам сотг н сап проводили методом микрочипов, как описано в Doggett et al. [2011]. Выделение, обработку РНК и гибридизацию кДНК проводили в Glasgow Affymetrix microarray service (http://www.gla.ac.uk/faculties/fbls/functionalgenomicsfacility/). Полученные данные были нормализованы с использованием метода Affymetrix tlOO. Данные для каждого гена представлены в виде логарифма по основанию 2 от отношения интенсивности сигнала в образце семенников мутантов сотг и сап к интенсивности в образце семенников линии дикого типа (Log г(сотгШ), Log 2(can/wt)). Экспериментальные данные доступны в базе данных GEO (http.V/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под номером GSE49563.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Определение сайтов связывания белка Сотг с помощью тканеспецифичного DamID. Для определения профиля связывания белка Сотг с хромосомами в клетках мужского зародышевого пути нами был использован метод DamID, который позволяет картировать сайты связывания хромосомных белков без применения фиксации материала и является альтернативой методу хроматин-иммунопреципитации. Метод основан на использовании химерного полипептида, состоящего из исследуемого белка, соединенного с ДНК-аденин-метилтрансферазой (Dam) Е. coli, способной метилировать аденин в последовательностях GATC. Экспрессия такого полипептида осуществляется при помощи генетической конструкции, введенной в клетку. Химерный полипептид направляется к сайтам связывания исследуемого белка на хромосомах, а присоединенная к нему Dam метилирует последовательности GATC в окрестности этого сайта. В геноме дрозофилы последовательности GATC встречаются в среднем каждые 200-300 п.н., что определяет высокую разрешающую способность метода. Метилированные фрагменты ДНК избирательно выделяют,

амплифицируют и используют в экспериментах с микрочипами для определения геномного расположения фрагментов из обогащенных фракций. Для коррекции фонового метилирования, через все стадии эксперимента проводили контрольный образец, экспрессирующий только Dam.

До настоящего времени, использование метода DamID для определения профиля связывания исследуемого белка в определенных клеточных линиях или тканях организма не представлялось возможным. Это обусловлено тем, что для корректной работы DamID требуется крайне низкий уровень экспрессии химерного белка - в противном случае резко возрастает фоновое метилирование и снижается специфичность метода. В предыдущих исследованиях эмпирически было показано, что поддержание низкой, но достаточной для проведения экспериментов, активности химерного белка обеспечивается базалыюй активностью промотора белка теплового шока hsp70 при 25°С, которая, однако, проявляется во всех клетках организма. Это является препятствием для картирования тканеспецифичных транскрипционных факторов, поскольку химерный белок образуется во всех клетках организма, что может приводить к неконтролируемому искажению картины связывания и не позволить адекватно интерпретировать полученные результаты. Исследуемый транскрипционный фактор Comr in vivo экспрессируется исключительно в клетках мужского зародышевого пути, поэтому необходимо было разработать систему, которая бы позволила проводить DamID только в этих клетках. Поставленная задача была решена в два этапа: в ходе первого этапа была создана генетическая система, позволяющая ограничить экспрессию трансгенов популяцией клеток зародышевого пути и, таким образом, избежать неспецифического сигнала из других клеточных типов. В ходе второго этапа мы адаптировали полученную генетическую систему для проведения DamID в терминальных клетках D. melanogaster.

Для создания генетической системы для запуска эктопической экспрессии трансгенов исключительно в клетках зародышевого пути сконструировали и ввели в геном дрозофилы две конструкции. Первая содержала ген рекомбиназы, фланкированный регуляторными областями гена nanos, белковый продукт которого является специфичным маркером стволовых терминальных клеток в организме D. melanogaster (Рис. 1А). Во второй конструкции под контролем промотора гена Ubi-рбЗЕ был размещен ген репортерного белка mCD8-GFP. Промотор и репортерный ген были разделены стоп-кассетой, состоящей из терминатора транскрипции гена hsp70AB, фланкированного loxP сайтами узнавания рекомбиназы Сге (Рис. 1Б). Промотор гена Ubi-рбЗЕ позволяет активировать репортерный ген во всех клетках организма, однако экспрессия блокируется стоп-кассетой. Под действием рекомбиназы Сге происходит удаление стоп-кассеты и запускается экспрессия репортерного гена.

Чтобы убедиться в том, что под контролем регуляторных областей nanos рекомбиназа Сге способна экспрессироваться и удалять стоп-кассету только в клетках зародышевого пути, мы скрестили линии мух, несущие полученные генетические конструкции. У самцов F¡ были выделены гонады, в которых детектировали флуоресценцию GFP. Было обнаружено, что в семенниках самцов генотипа y'w6?/Y; Ubipro>stop>mCD8-GFP/nanos-cre; +/+ репортерный белок нарабатывался исключительно в клетках зародышевого пути и не экспрессировался в соматических клетках (Рис. 1Г). Флуоресцентный сигнал обнаруживался на стадии сперматогониев (Рис. 1Г, стрелка) и достигал максимума на стадии

первичных сперма гоцнтое. Па рисунке 01-чстливи видны отдельные цисты, содержащие но 16 сперматоцмтов (Рис. II . штриховая линия), экспрессирующих тС08-0РР. В семешиках самцов /«/'/Г; 1:Ырго>мор>тСт-ОРР/ ЦЫрго>*мр--тСГ)8-0(-'Р; */*. используемых в качестве отрицательного контроля, и у которых между иромонром и ренортерным геном присутствует сгоп-кассета. маркерный белок не активировался (Рис. 1Л)- Таким образом было установлено, что конструкция папю-сге обсспечнваст наработку рскомбиназы и эффективное удаление стол-кассеты исключительно в клетках зародышевого пути.

В

nanos-cre

промотор

„.„_. . сг» , З'МТР пшпог

---і

Ubipro >stop >mCD8- GFP

промотор

кяР кяР

hsp 70>stop >darr-comr

промотор

dsrr-comr

✓ * * *

/

tar P кяР

hsp 70>stop>Oam

npouomop

htpTO f—» - >»

dsm

Ubi>tKv>mCD*OfP

кяР кяР

Рис. I. Генетические конструкции для специфическою мечения терминальных клеток самца и проведения тканеспсцифичного ОатЮ. (Л) Конструкция панох-сге: (Б) Конструкция (/Ыргс>$юр >тСй8-0РР: (В) Конструкции для ЮатЮ. Конструкции 1ир70>$1ор ><кзт-сотг н 1ар70>иор>А>т. (Г) Семенник самна генотипа У»'" У; (¡Ь/рго >иор>тС' 1)8-0 РРпшюх-сге; +/+; (Д) Семенник самца генотипа у'н*'/У; ЧЫрго х/ор тСШ-ОГР/ иЫрго>иор>тСй8-ОУР: +/* (см. объяснения в тексте).

Для проведения ткансспсцифичного Dam ID (Рис. 2) в геном дрозофилы ввели две генетические конструкции, одна из которых - описанная выше конструкция nanos-cre (Рис. 1А>. Вторая конструкция содержала минимальный промотор гена Itsp70. стоп-кассету и последовательность, кодирующую либо химерный белок Dam-Comr (hsp70> stop> dam-comr). либо отдельно Dam (hsp70>stop>dam) (Рис. IB). Конструкция lisp70>slop>dam была использована в экспериментах для контроля фонового метилирования. Для проведения DamID

скрещивали самок линии мух, несущих конструкции для DamII) с самцами линии

у .»• /У; nanos-cre, nanas-ere.

А герминальные клетки

—————————

промотор

ОДПР5 Г— ■ ЗШРпшго»

1 ,г

Л

промотор і htp701 ■ П f^d»m-eoror

J tif - -

tarP ~ kmР

проиотор

IWIW r— cr* t З-НТРпию*

^^---1.

промотор

hsp70 j— cUnt-comr

J—-ifiML

tarP

Єї

(дд Д!^

Рис. 2. Схема генетической системы ям проведения DamID в герминальных клетках D. melaitogasier (А) В герминальных клетках нарабатывается рскомбиназа Сгс (изображена в вилс ножниц), котрая удаляет терминатор транскрипции из конструкции hsp70>stop dam-iomr, что приводит к ее активации и наработке химерного белка Dam-Comr. В соматических клетках семенника конструкция nanns-cre неактивна и система не запускается, (Б) Химерный белок Dam-Comr направляется к генам-мишеням белка Comr. a Dam метилирует окружающие последовательности GAIC и геномной ДНК.

У потомков от скрещиваний в клеіках зародышевого пути происходило удаление терминатора и запускалась наработка малых количеств химерного белка (либо Dam) за счет би млі. ной активности промотора hsp70 (Рис. 2А). В результате метилирование ДНК происходило избирательно и клетках зародышевого пути (Рис. 2Б). С помощью этого подхода нами были получены данные о связывании транскрипционным фактором Comr для 11161 из 13653 всех аннотированных в базе данных Flybasc генов О. melanngasier (ht!p://flybasc org). После нормировки и усреднения данных оказалось, «по 3120 ненов проявили более чем двукратное превышение интенсивности сигнала в образцах Dam-Comr по сравнению с контрольными образцами Dam (Uig:<Dam-Сотr/Dam)>I). >та выборка была значительно обогащена семенник-специфичными генами, а именно содержала 5% генов, что приблизительно в два раза выше, чем случайно ожидаемое значение P=3.9F-:-l9). В то же время представленность специфичных для яичников генов в

7

выборке Comr-евязанных генов была более чем в два раза снижена по сравнению со случайно ожидаемой (75 генов, х2, Р=2.5Е-18). Использованные здесь и даіее в работе списки семенник-специфичных генов (1653 гена) и генов, специфически активирующихся в яичниках (907 гена), опубликованы в работе Belyakin et al. [2010].

Активирующая роль белка Сошг в сперматоцитах. Чтобы выявить гены, экспрессия которых зависит от наличия функционального белка Comr, был проведен анализ представленности транскриптов в семенниках мутантов сотґг2~'ш по сравнению с семенниками контрольной линии. Профиль экспрессии генов в семенниках линии сотґ*2''140 получен с использованием микрочипов Affymetrix в лаборатории Dr Н. White-Cooper (Drosophila Genome 1.0 array; http://affymetrix.com). В результате этого анализа была охарактеризована экспрессия 12414 генов. Из них 2706 генов снижали экспрессию у мутантов более чем в 2 раза, а 978 генов - более чем в 8 раз. Чтобы оценить, на какие гены оказывает влияние мутация сотг, был использован упомянутый выше список семенник-специфичных генов. В качестве контрольной группы использовали гены, специфически активные в яичниках дрозофилы. На Рис. ЗА показаны распределения для этих двух категорий генов в зависимости от их экспрессии у мутантов сотг. Третье распределение относится к генам, не попадающим ни в одну из этих категорий. Видно, что гены, активные только в яичниках, распределены симметрично относительно значения Log2(comr/wt)=0. Однако распределение семенник-специфичных генов сильно сдвинуто в сторону отрицательных значений Log2(comr/wt), что свидетельствует об уменьшении их экспрессии у мутантов сотг. На Рис. ЗБ видно, что доля семенник-специфичных генов возрастает со снижением экспрессии у мутантов сотг, в то время как доля генов, экспрессирующихся в яичниках, быстро падает. Таким образом, мутация по гену сотг приводит к снижению уровня экспрессии множества генов, причем доля семенник-специфичных генов возрастает в группе, проявляющей более сильное снижение экспрессии.

Для того чтобы определить, является ли Сотг прямым активатором генов в сперматоцитах D. melanogaster, или осуществляется иной механизм, мы сопоставили полученные данные по экспрессии с результатами DamID белка Сотг. Мы сосредоточились на генах, которые существенно снижают экспрессию у мутантов сотг и проанализировали их связывание с Сотг согласно полученным данным DamID. Среди 978 генов, снижающих уровень экспрессии на фоне мутации более чем в 8 раз, данные DamID о связывании белком Сотг имелись для 881 гена, из которых 700 оказались семенник-специфичными. Из этих 881 гена только 375 (42.5%) демонстрировали повышенный уровень связывания с транскрипционным фактором Comr (Log2(Dam-Comr/Dam)>l), причем 306 из них оказались семенник-специфичными.

С одной стороны, это говорит о том, что 375 генов проявляют связывание с белком Comr, присутствие которого необходимо для их активации, из чего можно сделать вывод, что он является их прямым активатором. С другой стороны, полученные нами результаты говорят о том, что далеко не все семенник-специфичные гены, экспрессия которых падает у мутантов сотг, проявляют связывание с белком Comr. Это указывает на наличие вторичных регуляторов, экспрессия которых в свою очередь зависит от Comr.

аз а»

J

|0.I5 t

0.1 0.06

■ ссмемич-спсцифмчные "ТМИ

□ warn« специфичны* г*м<л'

□ «1UW»ir ГГИЫ

10 -9 -7 -S -« -3

Log^comr/wtJ

100 w so

ro

I «0 g so-

# 40

30

го 10

0- ,-r—

•5 -4 -j -г i о i г з Loq2(comr/wtj

Рис. 3. Влияние мутации сотг ни экспрессию генов в семенниках IX melunogasler. (Л) - Мутация сотг снижает экспрессию семенник-специфичных генон (покачаны черным). Для сравнения показаны гены, специфически активируемые в яичниках (»оказаны белым) и остальные гены D. metanogaster (показаны серым) (Ь) - Доля семенник-специфичных генов увеличивается среди генов, снижающих экспрессию у мутон нов сотг. Гены, специфически ак!ивныс в яичниках, демонстрируют обратную тенденцию.

Идентификации вторичных Сошгмавнснмыт регуляторов ■ ранск-ринцин. Около 6% от всего числа генов £>. те1апо^ах1гг не связывались транскрипционным фактором Сотг (I 1>ат-СотгЛ)ат)<0), но демонстрировали пониженный уровень экспрессии в семенниках сожг-мупигтов (Ьор2(сат/-/ич)<-|). Среди семенник-специфичных генов их доля составляла уже около 19%. ">ги гены зависит от действия Сотг, но не являются его прямыми мишенями. Регуляция гаких генов можез осуществляться вторичными посредниками, то есть семенник-спсцифичиыми транскрипционными факторами, которые сами регулируются белком Сотг. В первую очередь мы обратили внимание на гены задержки мсИоза. Оказалось, что уровень их экспрессии не снижается в семенниках мутантов сотг

по сравнению с семенниками самцов дикого типа, так что, по-видимому, не они играют роль вторичных регуляторов в активации Comr-зависимых генов.

Поиск генов, кодирующих семенник-специфичные транскрипционные факторы, был проведен с использованием ресурса GoMiner, описанного в Zeeberg et al. [2003]. Среди 1653 семенник-специфичных генов было обнаружено 26 генов, имеющих отношение к регуляции транскрипции, включая гены aly и сап классов. Сопоставление данных об экспрессии этих генов у мутантов сотг и о связывании с ними белка Corar выявило, что ген CG9879 проявил самый высокий уровень связывания в экспериментах DamID, а уровень его экспрессии был снижен в 64 раза в семенниках самцов, несущих мутацию гена сотг. Ген CG9879 не исследован, но согласно аннотации в базе данных FlyBase (www.flybase.org), кодируемый им белок имеет гомологию с ТАТА-связывающим белком (TATA-binding protein, ТВР). Эти данные указывают на то, что ген CG9879 может являться вторичным регулятором в генетическом каскаде, приводящем к массовой активации генов в сперматоцитах.

Связывание Сотг не всегда приводит к изменению экспрессии генов.

Среди генов, проявляющих повышенное связывание с белком Сотг, помимо семенник-специфичных были обнаружены гены, активные в яичниках, но не в семенниках. Это может означать, что связывание белка Сотг не обязательно приводит к активации генов. Для исследования этого вопроса мы проанализировали выборку генов, значительно обогащенных по связыванию с белком Comr (Log2(Dam-Comr/Dam)>2). Для 749 из 1029 таких генов имелись экспериментальные данные об экспрессии в семенниках самцов сотг ' . Из этих генов только у 320 (43%) генов наблюдалось более чем двукратное снижение уровня экспрессии на фоне мутации по сотг, а около половины Comr-связанных генов не изменяли уровень экспрессии на фоне мутации по сотг. Из этого следует, что приблизительно в половине случаев связывание Сотг не влияет на активность генов.

Для исследования состава выборки Comr-связанных генов мы провели анализ их экспрессии при помощи базы данных FlyAtlas, которая содержит профили экспрессии всех генов D. melanogaster в различных органах. Группа Comr-связанных (Log2(Dam-Comr/Dam)>2)) состояла из 1029 генов, в качестве контроля использовали выборку Comr-несвязанных (Log2(Dam-Coinr/Dam)<-2)) генов (698 генов). К профилям экспрессии этих генов мы применили метод кластеризации k-means clustering и выделили подгруппы генов, обладающих схожими профилями экспрессии. Среди Comr-связанных генов было выделено три таких подгруппы. Подгруппа III состояла из 323 семенник-специфичных генов, уровень их экспрессии снижался в семенниках самцов сотгпо сравнению с семенниками дикого типа (Рис. 5А). Подгруппа I содержала специфичные для нервной ткани гены, уровень экспрессии которых не изменялся в семенниках на фоне мутации сотг (Рис. 5А). Не изменялся уровень экспрессии и у генов подгруппы И, представители которой неактивны в семенниках и не имеют четко выраженной специфичной экспрессии в других органах (Рис. 5А).

В составе выборки Comr-несвязанных генов (Log2(Dam-Comr/Dam)<-2)) было обнаружено четыре подгруппы генов (IV-VII, Рис. 6А). Подгруппа IV была аналогична подгруппе II Comr-связанных генов. Подгруппа V состояла из семенник-специфичных генов. Гены подгруппы VI активируются в нервной ткани. Подгруппа VII состояла из генов, специфичных для яичников. Уровень

транскрипции генов подгруппы V снижался в семенниках самцов, мутантных по гену сотг. По всей вероятности гены, входящие в состав этой подгруппы, регулируются Сошг-зависимыми вторичными регуляторами транскрипции. Уровень экспрессии генов остальных подгрупп несколько повышался в семенниках мутантных по сотг самцов, что может быть связано с изменением клеточного состава в мутантных семенниках (Рис. 5А).

экспрессия на фоне мутации по сотг

I 2

* о

I ; £

е-

N V VI \Л

Рис. 5. Транскрипционные и эпигенетические особенности Сотг-связанных и Сотг-несвязанных генов (см. объяснения в тексте)

5 "]

£ зо-

5 25.

5 20

• 151

5 ю-

1а

§ гон £

5 юн

НЗМтеЗ в Ьат-мутант» <0-1

¿¿А

I I о

00

(V V VI \л

В результате мы установили, что Сотг-связанные гены обладают различными профилями экспрессии. И по характеру их активности в различных органах можно выделить две относительно гомогенные группы, одна из которых состоит из семенник-специфичных генов (III), а другая - из генов, активирующихся в нервной ткани (I). Причем только гены группы III регулируются белком Сотг. Мы задались вопросом, какие общие свойства могут быть причиной связывания Сотг с генами, имеющими настолько различающиеся паттерны экспрессии? Ранее было показано, что в клетках слюнных желез личинок, которые являются соматическими, семенник-специфичные гены у £>. melcmogaster зачастую содержатся в составе доменов транскрипционно неактивного хроматина, ассоциированных с белком БиШ (Вс1уакт « а1., 2005). Сопоставление данных о связывании генов с белком Сотг в семенниках с данными о связывании белка 8иШ в слюнных железах выявило существенную положительную корреляцию (Максимов и др., 2013). Это свидетельствует о том, что гены, проявляющие в семенниках связывание с Сотг, в слюнных железах имеют тенденцию располагаться в репрессированных доменах хроматина, что может иметь отношение к их регуляции в развитии.

Гены-мншени Сотг располагаются в районах неактивного хроматнна в недифференцированных клетках мужского зародышевого пути. Белок Сотг впервые обнаруживается на стадии первичных сперматоцитов, в которых он необходим для активации нескольких сотен семенник-специфичных генов. На предыдущей стадии сперматогониев эти гены неактивны, причем в подавлении их экспрессии участвует белок Ро1усотЬ.

В работе вап е1 а1. [2010] методом СЫР-вея были установлены профили распределения гистоновых модификаций НЗК27теЗ и НЗК4теЗ в хроматине

семенников самцов, мугантных по гену bam. Мутация по гену bam блокирует переход от стадии сперматогониев к сперматоцитам. Это приводит к тому, что семенники заполняются цистами сперматогониев и не содержат клеток, находящихся на последующих стадиях развития. Поэтому семенники Ъат-мутантных самцов могут быть использованы в качестве модели для изучения структуры хроматина в недифференцированных мужских клетках зародышевого пути.

Мы воспользовались данными Gan et al. [2010], чтобы проверить, не является ли состояние хроматина объединяющим свойством для генов-мишеней белка Comr. Для этого были просуммированы интенсивности сигналов СЫР-seq для НЗК27теЗ и НЗК4теЗ в области ±200 п.н. вокруг сайтов инициации транскрипции для каждого гена D. melanogaster. Триметилирование гистона НЗ по остатку лизина 27 (НЗК27теЗ) наблюдается в транскрипционно неактивных районах хроматина, обогащенных белками группы Polycomb. Напротив, метилирование гистона НЗ по остатку лизина 4 (НЗК4теЗ) характерно для генов, проявляющих повышенный уровень транскрипции и повышенное содержание белков группы Trithorax.

На Рис. 5Б видно, что по сравнению с Comr-несвязанными генами, промоторные области всех Comr-связанных обогащены меткой неактивного хроматина НЗК27теЗ. Кроме того, уровни маркера активного хроматина НЗК4шеЗ, были значительно ниже в группе Comr-связанных генов, чем в группе Comr-несвязанных. Причем эти наблюдения справедливы для всех подгрупп Comr-связанных и Comr-несвязанных генов. Таким образом, в недифференцированных клетках мужского зародышевого пути промоторные области Comr-связанных генов обогащены репрессивной гистоновой меткой. Это свойство наблюдается у всех Comr-связанных генов, вне зависимости от того, экспрессируются ли они в семенниках или нет, и может свидетельствовать о том, что связывание Comr определяется состоянием хроматина.

Транскрипционный фактор Comr связывается с протяженными участками хромосом. Ранее было показано, что репрессированный хроматин в геноме дрозофилы занимает протяженные области хромосом, зачастую достигающие нескольких сотен т.п.н. Поскольку наш анализ показал обогащение Comr-связанных генов гистоновой модификацией, характерной для репрессированных участков генома, мы решили проверить, не располагаются ли эти гены группами в геноме. В результате визуального анализа полногеномного профиля связывания белка Comr при помощи программного обеспечения UCSC genome browser (http://genome.ucsc.edu/) на хромосомах были также обнаружены протяженные непрерывные участки связывания белка Comr. Для объективного определения Comr-связанных, Comr-несвязанных и промежуточных геномных областей мы проанализировали наши данные с использованием Скрытой Марковской модели (Hidden Markow Model, НММ). В результате мы обнаружили 725 геномных областей, обогащенных белком Comr, и 837 областей, с которыми Comr не связывался. Остальные геномные области принадлежали к промежуточному классу. Размеры Comr-связанных и Comr-несвязанных областей значительно отличались: размеры 70% Comr-связанных областей превышали 20 т.п.н., а 30% - 100 т.п.н. Что касается Comr-несвязанных областей, то их размеры были меньше - протяженность только 26% из них превышала 20 т.п.н., и ни одна не достигала 100 т.п.н.

Области связывания Сошг содержали 3036 генов, причем лишь 693 из них были семенник-специфичными. Кроме того, 350 областей связывания Сотг не содержали семенник-специфичных генов. Протяженность 192 таких областей превышала 20 т.п.н., а 37 из них - 100 т.п.н. В составе этих 350 областей связывания Сотг, располагались 638 генов, причем лишь 124 из них снижали уровень экспрессии в два и более раз на фоне мутации сотг. Из этого наблюдения следует, что многие такие области не содержали генов, регулируемых Сотг. Промоторные области таких генов были обогащены репрессивной гистоновой меткой НЗК27теЗ и обеднены активной меткой НЗК4теЗ.

Полученные данные свидетельствуют о том, что Сотг-связанные области образуют протяженные домены, и что Сотг-связанные гены образуют кластеры в их составе. Кроме того, области связывания Сотг обогащены НЗК27теЗ, из чего мы предполагаем, что Сотг, как часть (МАС-комплекса, может участвовать в процессах перестройки хроматина, причем связывание Сотг определяется состоянием хроматина, а именно наличием репрессивной метки НЗК27теЗ.

Активация генов в семенниках О. теЬиюцаМег транскрипционными факторами ИМАС и П'ЛК. Важно отметить, что в отсутствие ГГАР действия только белков комплекса 1МАС не достаточно для активации генов в сперматоцитах дрозофилы. Согласно существующим данным, регуляторное влияние белков П АР и ЙУ1АС в конечном итоге направлено на пересекающиеся группы генов, однако до сих пор остается не изученным вопрос о возможной совместной регуляции генов белками СТАР и ЙМАС. Для исследования механизма совместной регуляции генов-мишеней белками, кодируемыми генами а1у ОМАС) и сап классов (1ТАР), мы сопоставили данные по экспрессии генов в семенниках самцов, мутантных по генам сап и сотг. Мутация гена сап (сап3) вызывала нарушения в транскрипции значительно меньшего числа генов, чем было обнаружено в семенниках сотг-мутантов. 'Гак, лишь 309 генов снижали уровень экспрессии в 8 и более раз. Среди них, 277 (90%) также снижали уровень экспрессии в 8 и более раз и в семенниках сотг-мутантов. Из 779 генов, снижающих экспрессию в 4 и более раз в семенниках сал-мутантов, 702 гена (88%) экспрессировались на таком же или более низком уровне в семенниках сот/2'1140 самцов. Это означает, что активность большинства саи-зависимых генов также зависит и от сотг. Как уже было упомянуто, белок Сотг напрямую связывался приблизительно с 40% генов, снижающих экспрессию в 8 и более раз в семенниках самцов сотгг~~ . Среди 277 генов, снижающих экспрессию не менее чем в 8 раз в семенниках как самцов сап3, так и сотг71'"*0, с белком Сотг были связаны только 112 генов, что также составляет 40%. Оставшиеся 60% генов в этой группе, по-видимому, регулируются при участии вторичных Сотг-зависимых регуляторов, к которым может принадлежать СС9879. Необходимо отметить, что активность гена СС9879 снижается в 8 раз в семенниках самцов, несущих мутацию сап, то есть его активность регулируется как 1МАС, так и ПАР.

ОБСУЖДЕНИЕ

Для понимания роли отдельного транскрипционного фактора в генетической регуляторной сети необходимо обладать тремя типами данных. Во-первых, требуется определить, когда и где он работает в организме. Во-вторых, необходимо установить участки генома, с которыми связывается изучаемый транскрипционный фактор. И в-третьих, надо оценить, какой эффект связывание оказывает на

активность генов-мишеней. Обладая такими данными можно реконструировать часть генной сети, контролируемой исследуемым транскрипционным фактором.

Гены aly и сап классов обладают семенник-специфичным профилем экспрессии и активны только в течение вг-фазы первого деления мейоза сперматоцитов. Следовательно, в организме дрозофилы действие транскрипционных факторов, кодируемых генами задержки мейоза, ограничено одной стадией развития клеток зародышевого пути. Значительно менее определенным является механизм действия этих транскрипционных факторов.

В проведенных ранее работах исследователи предполагали активирующую роль белков tMAC, к которым принадлежит и Comr, опираясь на тот факт, что они ассоциированы с эухроматином, а у мутантов aly класса снижается уровень экспрессии многих генов. Однако такие наблюдения не являются однозначным доказательством активирующей роли продуктов генов aly класса, поскольку на основании имеющихся данных невозможно было исключить возможность активации генов-мишеней посредством подавления неизвестных генных репрессоров. Также, невозможно было исключить и существование tMAC-зависимых вторичных регуляторов, входящих в состав активирующего каскада в сперматоцитах. Более того, все предположения относительно механизма действия белков tMAC строились на основаниях исследования небольшого числа генов, для которых даже не было показано прямого физического взаимодействия с комплексом tMAC.

Проведенное нами картирование сайтов связывания белка Comr в масштабе генома позволило выявить более трех тысяч генов, вблизи которых детектировалось значительное связывание Comr. Проведенный сравнительный анализ связывания Comr с хромосомами и данных об экспрессии генов в семенниках мутантов comr предполагает, что белок Comr действительно необходим для активации генов, с которыми он непосредственно связан. Поскольку многие гены, связанные с Comr, требуют для активации функции tTAF, можно предположить, что, по крайней мере в ряде случаев, связывание Comr необходимо, но не достаточно для их активации.

Интеграция данных о связывании белка Comr с хромосомами и об эффекте мутации на генную активность позволила предположить наличие вторичных генов-регуляторов, экспрессия которых зависит от белка Comr. Действительно, в списке генов-мишеней белка Comr обнаружился ген CG9879, кодирующий семенник-специфичный ТАТА-связывающий белок, экспрессия которого значительно падала как на фоне мутации comr, так и сап. Этот ген не описан в литературе, и полученные нами данные делают его кандидатом на роль вторичного регулятора в каскаде активации генов в сперматоцитах, действующего после генов aly и сап классов (Рис. 6). Выяснение роли CG9879 требует отдельного исследования, однако сам факт того, что в генетическом каскаде, запускаемом генами задержки мейоза, имеются ранее не охарактеризованные вторичные регуляторы, по нашему мнению весьма существенен.

В предыдущих исследованиях было показано, что многие гены, активные исключительно в семенниках D. melanogaster, в соматических клетках располагаются в неактивных хроматиновых доменах. Используя опубликованные паттерны гистоновых модификаций НЗК27теЗ и НЗК.4теЗ в семенниках мутантов bam, мы показали, что в сперматогониях гены, которые после дифференцировки

сперматоцитов будут связываться с белком Comr, обогащены репрессивной модификацией НЗК27шеЗ.

CG9879

Рис. 6. Предполагаемый генетический каскад, регулирующий активность генов в сперматоцитах. В результате действия неизвестного механизма в начале стадии сперматоцитов запускается экспрессия генов tMAC и tTAF, которые активируют свои гены-мишени, среди которых содержатся вторичные регуляторы. Для активации гена CG9879, который может отвечать за активацию tMAC-несвязанных генов, требуются как tMAC, так и белки tTAF.

Полученные нами результаты улучшают понимание механизма массовой активации генов в сперматоцитах D. melanogaster. Для запуска экспрессии генов в сперматоцитах требуется активность обоих классов генов задержки мейоза. Мы убедились в том, что большинство генов, чья активность зависит от действия tTAF, зависели также и от tMAC. В проведенных ранее исследованиях предполагалось, что белки tTAF являются промотор-специфичными и не способны связываться с ДНК в отсутствии tMAC-компонентов. Принимая во внимание полученные данные, можно предположить, что Cornr-связанные гены, активность которых снижается как на фоне мутации сотг, так и сап, напрямую регулируются и tMAC, и tTAF белками. Кроме того, ранее было установлено, что совместное действие генов aly и сап классов необходимо для удаления НЗК27теЗ, белка Polycomb и загрузки на промоторы РНК-полимеразы II, что в конечном итоге приводит к активации генов дифференцировки в сперматоцитах. Опираясь на полученные нами и другими исследователями данные, можно предположить, что на начальном этапе активации белок Comr в составе tMAC связывается с участками транскрипционно неактивного хроматина, обогащенного НЗК27теЗ, что приводит к изменению его структуры. В пользу предположения о способности tMAC изменять свойства хроматина свидетельствует тот факт, что в составе этого комплекса содержится гистоновый шаперон Cafl, являющийся также компонентом других комплексов, способных модулировать структуру хроматина, таких как NURF и PRC2. По нашему предположению, в результате перестройки хроматина становятся доступными сайты связывания промотор-специфичных транскрипционных факторов, таких как семенник-специфичные tTAF. Специфичные транскрипционные факторы активируют свои гены-мишени, среди которых содержатся вторичные регуляторы транскрипции, продолжающие дальнейший активирующий каскад в сперматоцитах. Предложенная модель может являться

основой для дальнейших исследований регуляции генов в процессе сперматогенеза

D. melanogaster и может быть полезна для понимания механизмов генетической

регуляции клеточной дифференцировки.

ВЫВОДЫ

1. Создана система для проведения картирования сайтов связывания транскрипционных факторов методом DamID в клетках мужского зародышевого пути у D. melanogaster.

2. Определен профиль связывания транскрипционного фактора Cookie Monster. Установлено, что Cookie Monster связывается с протяженными участками хромосом, содержащими более трех тысяч генов, промоторные области которых обогащены репрессивной гистоновой модификацией НЗК27теЗ и обеднены меткой активного хроматина НЗК4теЗ в недифференцированных терминальных клетках.

3. Установлено, что активирующее действие белка Cookie Monster осуществляется за счет прямого воздействия на гены-мишени, а также путем активации вторичных регуляторных генов. Кандидатом на роль такого регулятора является ген CG9879.

4. Установлено, что Cannonball участвует как в активации части генов, напрямую активируемых Cookie Monster, так и ряда генов, контролируемых Cookie Monster через вторичные регуляторы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

Статьи:

1. Лактионов П.П., Андреева E.H., Шлома В В., Максимов Д.А., Белякин С.Н. Генетическая система для мечения соматических и терминальных клеточных линий в гонадах Drosophila melanogaster // Цитология. 2013. Т. 55. С. 185189.

2. Максимов Д.А., Лактионов П.П., Белякин С.Н. Доменная регуляция экспрессии генов в районах интеркалярного гетерохроматина Drosophila melanogaster// Цитология. 2013. Т. 55. С. 190-193.

3. Лактионов П.П.. Н. White-Cooper, Максимов Д.А., Белякин С.Н. Транскрипционный фактор Comr играет роль прямого активатора в генетической программе сперматогенеза у D. melanogaster!I Молекулярная биология. Принята к публикации.

Тезисы конференции:

1. Laktionov P.P., Belyakin S.N., Maksimov D.A., Shloma V.V., Zhimulev I.F. Identification of transcriptional regulators for testis-specific gene clusters in Drosophila melanogaster I I 16th European Workshop on Molecular and Cellular Endocrynology of the Testis, 2010, Elba, Italy. P. 76.

2. Лактионов П.П., Максимов Д.А., Белякин С.Н. Роль транскрипционного фактора Cookie monster в регуляции генной экспрессии в процессе сперматогенеза Drosophila melanogaster// Международная конференция «Хромосома-2012», 2012, Новосибирск, Россия. С. 126.

3. Белякин С.Н., Максимов Д.А., Лактионов П.П.. Коряков Д.Е. Регуляция репрессированных районов генома в развитии дрозофилы// Международная конференция «Хромосома-2012», 2012, Новосибирск, Россия. С. 44.

4. Laktionov P.P.. Maksimov D.A., White-Cooper H., Belyakin S.N. Male meiosis arrest factor Cookie monster binds the extensive chromosome regions and counteracts the repression of testis-specific genes// ESF-EMBO Symposium on Systems Biology of Drosophila Development, Pultusk (Poland), May 22-25, 2012.

5- Лактионов П.П.. Максимов Д.А., Белякин C.H. Метод тканеспецифичного DamID для полногеномного картирования сайтов связывания транскрипционных факторов в клетках мужского зародышевого пути D.melanogasterH Международная конференция «Высокопроизводительное секвенирование в геномике», 2013, Новосибирск, Россия. С17.

Подписано в печать 01.10.2013 Формат 60x84 1\16 Усл. печ. л. 1 Объем 16 стр. Тираж 100 экз. Заказ № 162

Отпечатано Омега Принт 630090, г. Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева,6 email: omegap@yandex.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лактионов, Петр Павлович, Новосибирск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

,,, л . На правах рукописи

04201364425 F ^

ЛАКТИОНОВ ПЕТР ПАВЛОВИЧ

РОЛЬ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ COOKIE MONSTER И CANNONBALL В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В

СПЕРМАТОГЕНЕЗЕ DROSOPHILA MELANOGASTER

Молекулярная генетика - 03.01.07

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

к.б.н.

Белякин Степан Николаевич

Новосибирск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................................3

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................9

1.1 Гонады в эмбриональном развитии.......................................................................9

1.2 Морфологическое строение семенников у О. melanogaster..............................12

1.3 Генетический контроль сперматогенеза..............................................................17

1.4 Геномная организация семенник-специфичных генов и предполагаемые механизмы их координированной регуляции...........................................................28

1.5 Гены задержки мейоза...........................................................................................30

1.6 Генетические методы мечения отдельных клеточных популяций и исследования в них функций генов...........................................................................35

1.7 Методы определения сайтов посадки ДНК-связывающих белков...................38

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..............................................................................................58

3.1 Генетическая система для запуска эктопической экспрессии трансгенов исключительно в клетках зародышевого пути.........................................................58

3.2 Генетическая система для проведения БатГО в клетках зародышевого пути Олпе1агк^а81ег..............................................................................................................66

3.3 Связывание Сошг с генами в семенниках у И. melanogaster............................68

3.4 Влияние белка Сошг на экспрессию генов..........................................................71

3.5 Идентификация вторичных Сотг-зависимых регуляторов транскрипции.....74

3.6 Связывание Сошг не всегда приводит к изменению экспрессии генов...........76

3.7 Тканеспецифичная принадлежность Сошг-связанных и Сотг-не связанных генов..............................................................................................................................78

3.8 Гены-мишени Сошг обогащены маркерами неактивного хроматина в недифференцированных клетках мужского зародышевого пути...........................80

3.9 Транскрипционный фактор Сошг связывается с протяженными участками хромосом у D. melanogaster........................................................................................83

3.10 Активация генов в семенниках В. те1апо%а$1ег транскрипционными факторами 1МАС и ГГА!7 комплексов........................................................................85

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................................................88

ВЫВОДЫ........................................................................................................................99

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Одним из главных направлений функциональной геномики является

изучение регуляторных систем, управляющих генетическими и

эпигенетическими программами развития организма. Сперматогенез у

Drosophila melanogaster является удобной моделью для изучения регуляции

экспрессии генов в процессе клеточной дифференцировки. В семеннике

дрозофилы можно легко различить все стадии развития клеток зародышевого

пути - образование клеток из стволовых предшественников, пролиферацию и

терминальную дифференцировку (Fuller, 1993). Терминальная

дифференцировка клеток мужского зародышевого пути у D. melanogaster

сопровождается перестройкой хроматина, за которой следует активация

генов, необходимых для сперматогенеза (Chen et al., 2005; Chen et al., 2011).

Активация генов, дифференцировки контролируется несколькими

t " *' специализированными транскрипционными факторами, которые кодируются

так называемыми генами задержки мейоза и которые можно разделить на два

класса - aly и can (White-Cooper, 2010). Белковые продукты генов а/у-класса

образуют комплекс tMAC (testis-specific meiotic arrest complex), а гены can-

класса являются семенник-специфичными паралогами (tTAF, testis-specific

TBP-associated factors) генов TAF у D. melanogaster (White-Cooper, 2010).

Мутации генов задержки мейоза приводят к инактивации множества генов в

семенниках, неспособности клеток зародышевого пути вступить в мейоз и

остановке гаметогенеза на стадии сперматоцитов (Lin et al., 1996; White-

Cooper, 2010). Было показано, что на фоне мутаций по генам задержки

мейоза промоторные области генов дифференцировки остаются связанными

белком-репрессором Polycomb, что по всей вероятности вызывает

подавление экспрессии. В работе Chen et al. [2011] была сформулирована

гипотеза, согласно которой активация генов в семенниках зависит от

синхронизированного действия белков tMAC и tTAF. Это предположение

основано на наблюдении о том, что в отсутствии компонентов tMAC нарушается связывание tTAF с ДНК. Однако существующие данные описывают конечный эффект мутаций, что не дает представления о механизме действия и конкретной роли этих транскрипционных факторов в регуляции активности генов. В первую очередь остаются невыясненными гены-мишени белков, кодируемых генами задержки мейоза. Более того, до сих пор не определено, являются ли эти белки прямыми активаторами или подавляют активность генов-репрессоров в клетках зародышевого пути. Также остается открытым вопрос о том, каким образом эти транскрипционные факторы участвуют в эпигенетической регуляции активности генов. Ответы на эти вопросы позволят приблизиться к пониманию принципов работы регуляторных систем, управляющих генетическими программами дифференцировки клеток зародышевого пути D. melanogaster.

В представленной работе для исследования роли транскрипционных факторов, кодируемых генами задержки мейоза, на первом этапе были установлены гены-мишени транскрипционного фактора Cookie monster (Comr), кодируемого геном, относящимся к aly классу. Картирование Comr проводили методом тканеспецифичного DamID с последующим анализом методом микрочипов в масштабе генома. Анализ данных о локализации сайтов связывания Comr и экспрессии генов в семенниках мутантов по генам cookie monster {aly класс) и cannonball {сап класс) позволил установить роль транскрипционных факторов Comr и Cannonball (Can) в регуляции экспрессии генов при дифференцировке клеток мужского зародышевого пути и сформулировать гипотезу относительно механизмов активации генов, необходимых для дифференцировки мужских гамет у D. melanogaster.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение роли транскрипционных факторов Cookie Monster (Comr) и Cannonball (Can) в регуляции активности

генов в процессе сперматогенеза у D. melanogaster. Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Создать генетическую систему для картирования сайтов связывания транскрипционных факторов методом DamID в клетках мужского зародышевого пути у D. melanogaster.

2. Определить профиль связывания транскрипционного фактора Comr с ДНК терминальных клеток самцов D. melanogaster.

3. Определить эффект связывания Comr на экспрессию генов в сперматоцитах D. melanogaster.

4. Определить регуляторный эффект белка Сап на гены, связанные с белком Comr

Научная новизна

Разработан подход, позволяющий картировать сайты связывания хроматиновых белков с ДНК в отдельных клеточных популяциях в организме D. melanogaster методом DamID. Этим методом впервые были локализованы участки связывания транскрипционного фактора Comr в геноме и выявлены его гены-мишени в терминальных клетках самца D. melanogaster. Показано, что белок Comr является прямым активатором части своих генов-мишеней в сперматоцитах. Выявлен возможный вторичный регуляторный фактор, экспрессия которого контролируется Comr. Предложена модель, описывающая этапы активации семенник-специфичных генов в сперматоцитах D. melanogaster и роль белков tMAC и tTAF в этом процессе.

Научно-практическая ценность

Полученные в результате исследования вносят вклад в современные представления о регуляторных системах, управляющих генетическими и эпигенетическими программами развития клеток. Полученные данные содержат принципиально новую информацию о механизме действия белков

комплексов tMAC и tTAF, что значительно расширяет представления о механизмах регуляции генов в семенниках D. melanogaster в процессе клеточной дифференцировки. Разработанная генетическая система для проведения тканеспецифичного DamID может быть использована для исследования транскрипционных факторов и иных ассоциированных с ДНК белков в клетках зародышевого пути у D. melanogaster. Полученная система универсальна и может быть легко адаптирована для исследования тканеспецифичных транскрипционных факторов в других органах D. melanogaster.

Публикации

1. Лактионов П.П., Андреева Е.Н., Шлома В.В., Максимов Д.А., Белякин С.Н. Генетическая система для мечения соматических и терминальных клеточных линий в гонадах Drosophila melanogaster II Цитология. 2013. Т. 55. С. 185-189.

2. Максимов Д.А., Лактионов П.П., Белякин С.Н. Доменная регуляция экспрессии генов в районах интеркалярного гетерохроматина Drosophila melanogaster II Цитология. 2013. Т. 55. С. 190-193.

3. Лактионов П.П., Н. White-Cooper, Максимов Д.А., Белякин С.Н. Транскрипционный фактор Comr играет роль прямого активатора в генетической программе сперматогенеза у D. melanogaster!I Молекулярная биология. Принята к публикации.

Апробация работы

Результаты работы представлены на российских и международных конференциях в виде стендовых сообщений: на международной конференции по системной биологии дрозофилы (Пултуск, Польша, 2012), на международной конференции «Хромосома-2012» (Новосибирск, Россия, 2012), на международной конференции «Высокопроизводительное секвенирование в геномике» (Новосибирск, Россия, 2013).; а также в устных

докладах: на международной конференции по молекулярным механизмам регуляции сперматогенеза «ETW-16» (Эльба, Италия, 2010), на международной конференции «Хромосома-2012» (Новосибирск, Россия, 2012).

В материалах этих конференций опубликованы следующие тезисы:

1. Laktionov P.P., Belyakin S.N., Maksimov D.A., Shloma V.V.,

Zhimulev I.F. Identification of transcriptional regulators for testis-

• th specific gene clusters in Drosophila melanogasterll 16 European

Workshop on Molecular and Cellular Endociynology of the Testis, 2010,

Elba, Italy. P. 76.

2. Лактионов П.П., Максимов Д.А., Белякин C.H. Роль транскрипционного фактора Cookie monster в регуляции генной экспрессии в процессе сперматогенеза Drosophila melanogasterll Международная конференция «Хромосома-2012», 2012, Новосибирск, Россия. С. 126.

3. Белякин С.Н., Максимов Д.А., Лактионов П.П., Коряков Д.Е. Регуляция репрессированных районов генома в развитии дрозофилы// Международная конференция «Хромосома-2012», 2012, Новосибирск, Россия. С. 44.

4. Laktionov P.P., Maksimov D.A., White-Cooper H., Belyakin S.N. Male meiosis arrest factor Cookie monster binds the extensive chromosome regions and counteracts the repression of testis-specific genes// ESF-EMBO Symposium on Systems Biology of Drosophila Development, Pultusk (Poland), May 22-25, 2012.

5. Лактионов П.П., Максимов Д.А., Белякин C.H. Метод тканеспецифичного DamID для полногеномного картирования сайтов связывания транскрипционных факторов в клетках мужского зародышевого пути D.melanogasterll Международная конференция «Высокопроизводительное секвенирование в геномике», 2013, Новосибирск, Россия. С17.

Вклад автора

Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа по математической обработке данных выполнена совместно с Белякиным С.Н. и Максимовым Д.А. Данные по представленности транскриптов генов в семенниках предоставлены Dr. Н. White-Cooper (Университет Кардиффа, Великобритания).

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гаметогенез дрозофилы включает в себя все основные этапы дифференцировки клеток из стволовых клеток-предшественников: асимметричное деление стволовых клеток, пролиферацию (стадия митотических делений) и терминальную дифференцировку. Семенники дрозофилы представляют собой удобную модель для изучения механизмов регуляции этих процессов благодаря ряду особенностей. Во-первых, в семенниках £). melanogaster можно легко отличить все стадии развития клеток зародышевого пути, структурные особенности каждой стадии подробно изучены. Во-вторых, какие-либо нарушения в регуляции сперматогенеза, как правило, приводят к отклонениям в морфологии семенников и стерильности, что облегчает поиск ключевых регуляторов этих процессов. В-третьих, многие аспекты развития клеток зародышевого пути достаточно подробно охарактеризованы и могут являться отправной точкой для дальнейших исследований. Кроме того, описано несколько генов, мутации по которым приводят к остановке сперматогенеза на определенных стадиях развития клеток зародышевого пути, что облегчает изучение отдельных субпопуляций клеток зародышевого пути.

Ниже будут описаны основные этапы сперматогенеза и особенности генетической регуляции ключевых стадий развития клеток зародышевого пути.

1.1 Гонады в эмбриональном развитии

Клетки зародышевого пути у £>. melanogaster происходят от полярных клеток, образующихся на заднем полюсе зародыша на ранних этапах эмбриогенеза. На стадии синцитиальной бластодермы полярные клетки первыми обосабливаются от общей цитоплазмы. В процессе целлюляризации

они захватывают полярную плазму эмбриона, в которой содержатся полярные гранулы - электронно-плотные структуры, образованные белками и молекулами мРНК (Mahowald, 2001). Гены, кодирующие компоненты полярной плазмы, могут быть разделены на три группы, в зависимости от процессов, которые они регулируют (Ephrussi, Lehmann, 1992). Первая группа генов участвует в формировании передне-заднего градиента мРНК в ооците (gurken, orb, spindle genes и пр.). Гены второй группы требуются для организации полярной плазмы (oskar, vasa, valois, tudor). Третья группа включает в себя гены nanos и pumilio, белковые продукты которых необходимы для образования абдоминальных сегментов (Mahowald, 2001). Содержимое полярной плазмы нарабатывается питающими клетками и транспортируются в яйцо в течение оогенеза. Определяющим компонентом полярной плазмы является белок Oskar, в зависимости от его концентрации меняется количество полярных клеток, кроме того он отвечает за локализацию в полярной плазме таких белков, как Vasa, Tudor и Valois (Ephrussi, Lehmann, 1992; Thomson, Lasko, 2004). Последние регулируют локализацию и трансляцию мРНК nanos, pgc и gel, которые необходимы для образования полярных клеток и подавления в них транскрипции генов (Lesch, Page, 2012).

От соматических клеток эмбриона клетки-предшественники зародышевого пути отличаются более ранним обособлением, сниженной частотой митотических делений, помимо этого у них не наблюдается транскрипции генов вплоть до стадии гаструляции (Van Doren et al., 1998). Полярные клетки остаются недифференцированными и невосприимчивыми к клеточным сигналам, запускающим дифференцировку соматических клеток. Это состояние полярных клеток достигается путем инактивации РНК-полимеразы II и, по всей вероятности, подавлением экспрессии генов на уровне хроматина (Lesch, Page, 2012). В основе механизма инактивации РНК-полимеразы II лежит действие белка Pgc, который кодируется геном с материнским эффектом pgc (Nakamura et al, 1996). Белок Pgc конкурирует с

РНК-полимеразой II за связывание с комплексом PTEFb и не позволяет ему фосфорилировать Ser2 и Ser5 в составе полимеразы (Hanyu-Nakamura et al., 2008). Это ингибирует образование преинициаторного комплекса и элонгацию транскрипции (Lesch, Page, 2012). В эмбрионах, полученных от самок, несущих мутацию по гену pgc, зиготическая транскрипция в полярных клетках не подавляется, что приводит к их деградации и последующему полному отсутствию клеток зародышевого пути (Deshpande et al., 2004; Martinho et al., 2004). В пользу существования механизма инактивации транскрипции на уровне хроматина свидетельствует тот факт, что у эмбрионов, дефицитных по мРНК nanos и белку Su(var)3-3, в полярных клетках наблюдается повышенное содержание НЗК4мет2-модифицированных гистонов и не подавляется транскрипция генов развития (Schaner et al., 2003; Rudolph et al., 2007). В эмбрионах, полученных от мутантных по гену nanos самок, в полярных клетках наблюдается транскрипция ряда соматических генов, таких как Sex-lethal и генов сегментации (fushi tarazu, even skipped) (Dansereau, Lasko, 2008). Такие клетки не мигрируют к месту образования эмбриональных гонад, претерпевают митотические деления и в конечном итоге элиминируются апоптозом (Dansereau, Lasko, 2008). Поскольку Nanos является ингибитором трансляции, то по всей вероятности, он влияет на транскрипцию генов опосредованно.

В результате гаструляции полярные клетки перемещаются внутрь эмбриона и начинают миграцию к первичным соматическим клеткам гонад. Предшественники соматических клеток гонад имеют мезодермальное происхождение и располагаются билатерально в районе 10-12 парасегментов (Warrior, 1994). Процесс миграции клеток-предшественников зародышевого пути управляется белками Wunen, Wunen2, Hedgehog и Hmgcr (Dansereau, Lasko, 2008). В результате миграции в районе десятого парасегмента с обеих сторон скапливаются клетки-предшественники зародышевого пути и первичные соматические клетки гонад, которые в конечном итоге

формируют компактные эмбриональные гонады (Boyle, DiNardo, 1995; Dansereau, Lasko, 2008).

1.2 Морфологическое строение семенников у D. melanogaster

Семенники взрослых особей D. melanogaster имеют характерную спиралевидную форму с утолщением на апикальном конце. Оболочка семенников дрозофилы о�