Особенности механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью РНК-интерференции у Drosophila melanogaster

Котельников, Роман Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью РНК-интерференции у Drosophila melanogaster
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью РНК-интерференции у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

□□3483222

Котельников Роман Николаевич

Особенности механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью РНК-интерференции у Drosophila melanogaster

(03.00.03 - молекулярная биология)

1 9 МОЯ 2DCD

Автореферат диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2009

003483222

Работа выполнена в Лаборатории биохимической генетики животных Института молекулярной генетики РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Клёнов М.С.

Научный консультант:

доктор биологических наук, академик РАН Гвоздев В.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Евгеньев М.Б.

кандидат биологических наук, Каменский П.А.

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН

Защита состоится <<^У» ^ I 2009 г. в /1 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Учереждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарта РАН по адресу г. Москва, ул. Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учереждения Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарта РАН

Автореферат разослан 2\ 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного сое кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

РНК-интерференция (РНКи) представляет собой подавление экспрессии с помощью коротких РНК. Феномен РНКи был обнаружен в опытах на нематоде в 1998 году. Последующие исследования показали, что короткие РНК вовлечены в регуляцию экспрессии у большинства эукариот. Без понимания процесса РНКи невозможна сколько-нибудь полная картина регуляции генов. Например, у человека по некоторым оценкам каждый третий ген регулируется с помощью РНКи. В медицине РНКи может использоваться для создания противовирусных препаратов и высокоспецифичиой терапии ряда заболеваний. Изучение нарушений процессов РНКи, наблюдаемых во многих раковых заболеваниях, предоставляет удобный инструмент для распознавания типов опухолей и позволяет полнее понять механизмы канцерогенеза. В лабораторной практике РНКи широко используется для высокоспецифичного «нокдауна» генов, что позволяет, в частности, проводить систематичное определение их функций. За последние 11 лет выявлены основные механизмы РНКи, обнаружены разные типы коротких РНК и специфичные для этого процесса группы белков.

В основе механизма РНКи лежит функционирование репрессивных эффекторных комплексов RISC (RNA induced silencing complex), каждый из которых содержит короткую РНК, направляющую комплекс для сайленсинга комплементарных мишеней. К настоящему моменту у животных выделяют три основных класса репрессивных коротких РНК: siRNA (short interfering RNA), raiRNA (microRNA) и piRNA (PIWI interacting RNA). siRNA принимают участие в защите клетки от вирусов и, как недавно обнаружено в опытах на дрозофиле и мышах, могут защищать организм от транспозиций мобильных элементов в соматических тканях (endo-siRNA). miRNA являются широко распространённым регулятором экспрессии собственных генов организма и необходимы для процессов развития, дифференцировки и поддержания внутриклеточного гомеостаза. piRNA функционируют в составе эволюционно консервативной системы, направленной на репрессию мобильных элементов в терминальных тканях многоклеточных животных, а нарушение их функции приводит к транспозиционному взрыву и, как следствие, к утрате плодовитости.

Короткие РНК различаются не только функционально, но и по механизму образования. При заражении клетки РНК-вирусами может образовываться двухцепочечная РНК (дцРНК), из которой клеточная эндорибонуклеаза Dicer (от английского dice - резать на мелкие кусочки), относящейся к семейству РНКазШ, вырезает siRNA. siRNA также

вырезаются из введённой в клетку искусственно синтезированной дцРНК. miRNA вырезаются из закодированных в геноме РНК-предшественников в результате двух последовательных стадий процессинга, осуществляемых РНКазамиШ Drosha и Dicer. Длина piRNA больше (25-30 нт.), чем длина siRNA и miRNA (21-23 нт.). Механизм образования piRNA является в настоящий момент предметом активного изучения и, по-видимому, сильно отличается от механизма биогенеза siRNA и miRNA. Например, показано, что Dicer не принимает участия в образовании piRNA.

Образующиеся короткие РНК включаются в состав RISC, причём обычно каждому типу коротких РНК соответствует свой специализированный RISC. Ключевым компонентом этого комплекса является белок Argonaute (Ago), который специфично связывает короткую РНК. Семейство белков Ago включает подсемейство собственно Ago и подсемейство PIWI. siRNA и miRNA связываются белками Ago подсемейства. Если siRNA или miRNA, находящиеся в составе RISC, полностью комплементарны РНК-мишени, то Ago производит эндонуклеазное расщепление мишени, а при неполной комплементарности происходит подавление трансляции. В некоторых случаях, работающие в ядре эффекторные комплексы, могут связываться с новообразованными транскриптами и вызывать гетерохроматинизацию прилегающего хроматина. В настоящий момент не ясно, чем предопределяется выбор между транскрипционным сайленсингом или деградацией транскриптов в ядре и почему клетке «удобнее» использовать тот или иной механизм.

piRNA связываются белками подсемейства PIWI и механизм подавления экспрессии в этом случае изучен менее полно, чем для siRNA или miRNA. Существующие скудные данные указывают как на возможность деградации мРНК мобильных элементов, так и на возможность их транскрипционного сайленсинга. Белки подсемейства PIWI у дрозофилы (Aub, Ago3 и Piwi) и крысы (Riwi) обладают эндонуклеазной активностью. В яичниках и семенниках дрозофилы белки Aub и Ago3 локализуются преимущественно в перинуклеарных гранулах (структура, называемая «nuage», от франц. «облако»), что предполагает скорее посттранскрипционный механизм сайленсинга. С другой стороны, в яичниках дрозофилы белок Piwi локализуется в ядрах. Мутация в гене spn-E, который необходим для образования и/или стабилизации piRNA, приводит к «открыванию» хроматина мобильных элементов. В семенниках мышей показана роль piRNA в метилировании ДНК мобильных элементов. Таким образом, потенциально piRNA могут подавлять экспрессию как с помощью деградации мРНК, так и на транскрипционном уровне, посредством эпигенетических модификаций, но вклад каждого из этих механизмов в сайленсинг мобильных элементов не ясен.

piRNA впервые были обнаружены в Лаборатории биохимической генетики животных Института молекулярной генетики РАН при изучении системы подавления экспрессии семенник-специфичных повторяющихся генов Stellate (Aravin et al. 2001; Aravin et al. 2004). Эти piRNA продуцируются повторами Su(Ste) (Suppressor of Stellate), которые расположены на Y-хромосоме и имеют 90% гомологии с генами Stellate, которые расположены на X-хромосоме и кодируют белок Stellate, гомологичный регуляторной р субъединице казеин киназы 2. piRNA Su(Ste) связываются белком Aub. Делеция повторов Su(Ste) или мутация в гене aub ведёт к исчезновению piRNA Su(Ste) в семенниках и значительному увеличению количества мРНК Stellate, что вызывает накопление белка Stellate в кристаллах, приводя к нарушению сперматогенеза и стерильности самцов. Было показано, что комплекс piRNA Su(Ste) и белка Aub способен деградировать мРНК Stellate in vitro (Nishida et al. 2007). Данная работа посвящена изучению Su(Ste) piRNA-зависимого механизма подавления экспрессии генов Stellate in vivo.

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы являлось исследование особенностей механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью piRNA Su(Ste). Были поставлены следующие задачи:

1. Оценить вклад транскрипционного и посттранскрипционного сайленсинга в Su(Ste) piRNA-зависимую репрессию генов Stellate. Для этого следовало сравнить степень увеличения количества сплайсированных и несплайсированных транскриптов Stellate в семенниках дрозофилы при делеции повторов Su(Ste) или мутации в гене aub. Обнаружение сопоставимого возрастания количества сплайсированных и несплайсированных транскриптов будет свидетельствовать о транскрипционной регуляции, а возрастание только уровня сплайсированных транскриптов укажет на посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов Stellate;

2. Разработать способ раздельной детекции транскриптов эу- и гетерохроматиновых генов Stellate и сравнить механизм их репрессии с помощью piRNA Su(Ste);

3. Определить, происходит ли деградация транскриптов Stellate в ядрах терминальных клеток семенников;

4. Сравнить особенности piRNA- и siRNA-зависимого подавления экспрессии репортёрной конструкции Ste-lacZ.

Научная новизиа результатов исследования

Показано, что piRNA Su(Ste) подавляют экспрессию генов Stellate в основном с помощью деградации мРНК, происходящей не только в цитоплазме, но и в ядрах

сперматоцитов. Экспрессия эу- и гетерохроматиновых генов Stellate подавляется примерно в равной степени, что указывает на отсутствие влияния структуры хроматина на piRNA-зависимую регуляцию. Обнаружено сходство механизмов piRNA- и siRNA-зависимой репрессии репортёрной конструкции Ste-lacZ. Полученные данные позволяют предположить, что piRNA, подобно siRNA, вызывают деградацию только немаскированных трансляционно активных транскриптов.

Практическая ценность работы

Полученные данные позволяют прояснить особенности механизма подавления экспрессии с помощью эволюционно консервативной системы РНКи у дрозофилы, что может быть использовано в изучении процессов жизнедеятельности терминальных клеток человека, в регуляции которых РНКи играет существенную роль.

Апробация работы

Работа апробирована на лабораторном семинаре в отделе молекулярной генетики клетки ИМГ РАН. Данные, представленные в работе, докладывались на конференции, посвящённой механизмам РНК-интерференции (Keystone Symposia, США, 2005), на конференциях для молодых учёных (Пущино, 2005, 2006; Киев, 2007), на конкурсе работ молодых учёных на соискание стипендий фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Из них научных статей 3 и тезисов научных конференций 4.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа изложена на 109 страницах машинописного текста и содержит главы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Диссертация содержит 19 рисунков, 1 таблицу и 230 литературных ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ piRNA Su(Ste) вызывают деградацию мРНК Stellate

Задача данной работы состояла в оценке вклада транскрипционного и посттранскрипционного механизмов в Su(Ste) piRNA-зависимую репрессию генов Stellate. Методом количественного ОТ-ПЦР в реальном времени (кОТ-ПЦР) изучили эффект делеции повторов Su(Ste) или мутации aub'""*"' на количество сплайсированных и несплайсированных транскриптов Stellate в семенниках. Ранее было показано (Aravin et al. 2001, Aravin et al. 2004), что делеция локуса Su(Ste) или мутация aub""1"'1 приводят к исчезновению piRNA Su(Ste). Если бы piRNA Su(Ste) подавляли только транскрипцию генов Stellate, то нарушение сайленсинга вызывало бы сходное возрастание количеств сплайсированных и несплайсированных транскриптов. Обнаружено, что как делеция повторов Su(Ste), так и мутация aub'""11'1 приводят к незначительному увеличению количества несплайсированных транскриптов, в то время как количество сплайсированных транскриптов сильно возрастает (в 10-50 раз) (рис. 1). Таким образом, посттранскрипционная деградация мРНК является основным механизмом подавления экспрессии генов Stellate.

□ несплаисир ованные

■ сплайсиров энные

Рис. 1. Делеция повторов Su(Ste) или мутация в гене aub вызывает преимущественное увеличение

количества сплайсированной, но не несплайсированной мРНК Stellate в семенниках дрозофилы. Показано, во сколько раз увеличивается количество сплайсированной (темные столбцы) или несплайсированной (светлые столбцы) эухроматиновой (эу) или гетерохроматиновой (гетеро) мРНК Stellate при делеции повторов Su(Ste) (по сравнению с мухами дикого типа) или при мутации в гене aub (мутация -sting-1, сравнивали гомозигот по мутации с гетерозиготами) по данным кОТ-ПЦР.

делеция Su(Ste) мутация aub

CiitjJI

гранскршшни

эухроматиновая копия Stellate

гетерохроматиновая копия Stellate

г* 1 РЦ jQ;s полиЛ

мннт^^ннинннннв нннк—^ t ^

•4—

Рис. 2. Схема эу- и гетерохроматиновых копий генов Stellate и положение праймеров, использованных для кОТ-ПЦР. Подобраные праймеры обозначены цифрами 1-6. Пары праймеров 1/3 и 2/3 использованы для амплификации эухроматиновых копий Stellate, поскольку праймер 3 комплементарен последовательности, которая отсутствует в гетерохроматиновых копиях. Праймеры 1/3 (эу спл) амплифицируют преимущественно сплайсированные транскрипты, поскольку для эухроматиновых копий Stellate их количество значительно больше, чем несплайсированных. Праймеры 2/3 (эу неспл) амплифицируют только несплайсированные транскрипты. Пары праймеров 1/4 (гет сум) или 5/6 (гет неспл) позволяют амплифицировать сумму или несплайсированные транскрипты гетерохроматиновых копий Stellate, соответственно, поскольку 3' концевые нуклеотиды праймеров 4 и 6 комплементарны единичным нуклеотидным заменам, различающим оба типа Stellate (показаны большими буквами). При вычитании количества несплайсированных транскриптов из суммы получали количество сплайсированных транскриптов гетерохроматиновых копий Stellate.

Геном Drosophila melanogaster содержит два кластера генов Stellate, расположенные в эухроматиновом регионе 12Е (3ySte) или дистапьном гетерохроматине X хромосомы (reTSte). Благодаря единичным нуклеотидным заменам, различающим этих кластеры, удалось подобрать праймеры, которые раздельно детектируют оба типа транскриптов Stellate (рис. 2). ПЦР анализ с использованием в качестве матриц плазмид, содержащих эу-или гетерохроматиновые копии Stellate или повтор Su(Ste) подтвердил специфичность праймеров (рис. ЗА). Чтобы подтвердить локализацию детектируемых копий Stellate в эу-или гетерохроматине, был использован подход, основанный на явлении недорепликации гетерохроматиновой ДНК в ядрах клеток слюнных желёз личинок. В этих ядрах эухроматиновая ДНК подвергается множественной политенизации, в то время как гетерохроматиновая ДНК не реплицируется. Проведён количественный ПЦР в реальном времени с использованием ДНК, выделенной из слюнных желёз или из целых мух, и с праймерами к эу- или гетерохроматиновым копиям Stellate или к гену Adh, который находится в эухроматине и использовался в качестве маркёра ДНК, подвергающейся

политенизации. Для всех использовавшихся пар праймеров к Stellate рассчитывали соотношения Ste/Adh, а затем делили полученное отношение Ste/Adh в ДНК из слюнных желёз на отношение Ste/Adh в ДНК из целых мух и выражали в % (рис. ЗБ). Если результат заметно меньше 100%, значит данная пара праймеров амплифицирует копии Stellate, расположенные в гетерохроматине, если около 100%, значит копии находятся в эухроматине. Полученные результаты подтвердили, что праймеры для суммарных и несплайсированных транскриптов гетерохроматиновых Stellate (гет сум и гет неспл, соответственно) детектируют копии, расположенные в гетерохроматине, а праймеры для сплайсированных и несплайсированных транскриптов эухроматиновых Stellate (эу спл и эу неспл, соответственно) детектируют копии, расположенные в эухроматине. С помощью кОТ-ПЦР обнаружили, что делеция повторов Su(Ste) и мутация aub"'"''1 приводят к сходному увеличению количества сплайсированных транскриптов эу- и гетерохроматиновых Stellate, но не влияют на количество несплайсированных транскриптов (рис. 1). Эти данные показывают, что локализация копий Stellate в эу- или гетерохроматине не влияет на механизм подавления их экспрессии, что хорошо согласуется с посттранскрипционным механизмом репрессии генов Stellate.

Используемый методический подход впервые позволил оценить вклад транскрипционного и посттранскрипционного механизмов в piRNA-зависимую репрессию. Предполагается, что обнаруженное подавление экспрессии генов Stellate именно через деградацию мРНК необходимо для высокого уровня их репрессии. По-видимому, подавление транскрипции не могло бы обеспечить необходимый уровень репрессии генов Stellate, поскольку, при этом механизме, эффекторный комплекс обнаруживает локус-мишень за счёт связывания с РНК, которая транскрибируется этим локусом. Вследствие этого, такая репрессия требует частичной транскрипции подавляемого локуса и, вероятно, множественность повторов Stellate приводит к тому, что такая транскрипция давала бы слишком высокий уровень мРНК Stellate. С другой стороны, посттранскрипционная деградация мРНК Stellate в ядре (см. ниже) и селективная деградация цитоплазматических транскриптов доступных для аппарата трансляции (см. ниже) обеспечивают очень сильную репрессию белка Stellate (согласно Вестерн анализу, проведённому JI.B. Олениной, при делеции повторов Su(Ste) уровень белка Stellate возрастает более чем в 200 раз), что может быть необходимо для нормальной жизнедеятельности терминальных тканей самцов.

А.

пары праймеров

гет сум .'гш неспл 3V спл эу неспл

нла шида с плазм идя с hetSte плазм ила с Su(Ste) + + + - -+ + + - + -+ - - + - + . . +

продукт — — — —

Б.

Ф неспл сул неспл спя неспл суи неспл спл

^ безинсерции 6 reTSfe

Sfe в эухроматине

Рис. 3. Проверка специфичности нар праймеров, детектирующих эу- или гетерохроматиновые копии генов Stellate. А. ПЦР анализ с плазмидами, несущими эу- или гетерохроматиновые копии генов Stellate или повтор Su(Ste), подтверждает специфичность праймеров для несплайсированпой (эу неспл, гет неспл) или сплайсированной/суммарной (эу спл, гет сум) мРНК Stellate. Б. Проверка локализации детектируемых копий Stellate в эу- или гетерохроматине. Приведены расчётные значения, полученные в результате деления отношения Stellate/Adh в слюнных железах на это отношение в целых мухах. Этот тест подтверждает, что пары праймеров гет неспл и гет сум или эу неспл и эу спл детектируют копии генов Stellate, расположенные в гетеро- или эухроматине, соответственно. При использовании линии мух, несущих трансген с шестью повторами гетерохроматиновых генов Stellate в эухроматине хромосомы 3, происходит увеличение расчетных значений для праймеров специфичных к гетерохроматиновым копиям Stellate, что подтверждает обоснованность использования данного теста.

piRNA-зависимая деградация мРНК Stellate может происходить как в цитоплазме, так и в ядрах

Показано, что siRNA могут вызывать деградацию РНК мишеней как в цитоплазме, так и в ядрах (Zeng et al. 2002; Robb et al. 2005). Представляло интерес выявить, может ли в ядрах происходить деградация мРНК Stellate при участии piRNA Su(Ste). Из лизатов семенников мух с делецией повторов Su(Ste) и мух дикого типа были получены ядерная и цитоплазматическая фракции. Результаты кОТ-ПЦР показали, что делеция повторов Su(Ste) вызывает возрастание количества сплайсированных гетерохроматиновых Stellate в цитоплазматической и ядерной фракциях в 38 и 13 раз, соответственно (рис. 4А). Похожий результат был получен для эухроматиновых Stellate. Чистота разделения фракций была проверена с помощью Вестерн анализа с антителами против ламина и у-тубулина, которые локализуются, соответственно, в ядре и цитоплазме (рис. 4Б). Согласно методике фракционирования ядерная фракция не должна содержать ядерных мембран. Чтобы это оценить, был проведён Вестерн анализ с антителами против калнексина, который является трансмембранным белком эндоплазматического ритикулума (рис. 4Б). Контаминация ядерной фракции цитоплазматическими РНК была оценена с помощью Нозерн анализа с зондами к цитоплазматической лизиновой тРНК или митохондриальной метиониновой тРНК (рис. 4Б). Согласно данным Вестерн и Нозерн анализов, степень загрязнения ядерной фракции цитоплазмой не превышала 10% (рис. 4Г). Таким образом, вызванное делецией повторов Su(Ste) значительное накопление транскриптов Stellate в ядерной фракции не может быть объяснено цитоплазматическим загрязнением. Это позволяет заключить, что деградация мРНК Stellate происходит как в цитоплазме, так и в ядрах.

Рис. 4 (см. на следующей странице). Деградация мРНК Stellate, вызванная piRNA Su(Ste), происходит как в цитоплазме, так и в ядрах. А. Делеция повторов Su(Ste) приводит к возрастанию количества сплайсированных эухроматиновых (эу) и гетерохроматиновых (гетеро) транскриптов Stellate как в ядерной (яд), так и в цитоплазматической (цит) фракциях, выделенных из семенников дрозофилы. Б. Оценка чистоты ядерной и цитоплазматической фракций. Вверху: Нозерн анализ с зондами, комплементарными митохондриальной метиониновой тРНК (mt tRNA М) и цитоплазматической лизиновой тРНК (tRNA К). Внизу: Вестерн анализ с антителами против ламина (ядерный белок), у-тубулина (цитоплазматический белок) и калнексина (трансмембранный белок эндоплазматического ретикулума). В. piRNA Su(Ste) и белок Aub обнаруживаются как в ядерной, так и в цитоплазматической фракциях. Вверху: Нозерн анализ с РНК зондом, комплементарным сумме piRNA Su(Ste). В середине: Нозерн анализ с ДНК олигонуклеотидом, комплементарным уникальной Su(Ste)-4 piRNA. Внизу: Вестерн анализ с антителами против белка Aub. Г. Содержание митохондриальной метиониновой тРНК (из Б) и Su(Ste) piRNA (из В) в ядерной фракции в сравнении с цитоплазматической фракцией. Д. Калибровочный Нозерн анализ (зонд к митохондриальной метиониновой тРНК) демонстрирует, что сигнал, полученный после гибридизации, коррелирует с количеством РНК, взятым для анализа. Этот эксперимент показывает, что Нозерн анализ может быть эффективно использован для сравнения количеств тРНК и piRNA Su(Ste) в ядерной и цитоплазматической фракциях.

^ г;

5 У- 5

увеличение уровня мРНК Stellate при делеции повторов Su(Ste)

( ( 3

интенсивность сигнала (условные единицы)

количество РНК в ядерной фракции по сравнению с цитоплазматической фракцией

(в %)

■ □

« 3

К I i I

§ >

> 2

( (

Деградацию мРНК Stellate осуществляет эффекторный комплекс, ключевыми компонентами которого являются Su(Ste) piRNA и белок Aub. Учитывая, что деградация происходит как в цитоплазме, так и ядрах, ожидалось обнаружить piRNA Su(Ste) и белок Aub в обоих компартментах. С помощью Нозерн анализа piRNA Su(Ste) выявлены как в ядерной, так и в цитоплазматической фракциях (рис. 4В). В качестве зондов использовали рибопробу, детектирующая сумму piRNA Su(Ste), или олигонуклеотидный зонд комплементарный Su(Ste)-4 piRNA, которая является наиболее представленной среди piRNA иммунопреципитирующихся с белком Aub. Количество piRNA Su(Ste) в ядерной фракции лишь в 2 раза меньше, чем в цитоплазме (рис. 4Г), что исключает возможность объяснить присутствие piRNA в ядрах цитоплазматической контаминацией. Результаты Вестерн анализа указывают на примерно равную концентрацию белка Aub в ядерной и цитоплазматической фракциях (рис. 4В). Поскольку общее количество белка, выделенное из ядер сперматоцитов, было примерно в 10 раз меньше, чем количество белка, выделенное из цитоплазмы, можно заключить, что примерно 1/10 часть от общего количества белка Aub находится в ядрах сперматоцитов, а 9/10 в цитоплазме.

С помощью иммуноокрашивания была изучена локализация белка Aub в семенниках (рис. 5А). Основной сигнал от Aub обнаруживается в районе ядерной оболочки и напоминает так называемый nuage, являющийся распространённой перинуклеарной структурой, обнаруживаемой вокруг ядер терминальных клеток многих организмов. При более подробном рассмотрении видно, что «кольцеобразный» сигнал состоит из диффузного и гранулярного компонентов. Отсутствие «перинуклеарного» сигнала в семенниках мутантных по Aub мух подтверждает специфичность иммуноокрашивания (рис. 5А). Обнаруженная колокализация Aub и ламина В, который является ядерным белком связанным с внутренней ядерной мембраной, позволяет предположить, что часть белка Aub может находиться в ядре (рис. 5А). Для того, что дополнительно изучить этот вопрос, было проведено иммуноокрашивание препаратов выделенных ядер (рис. 5Б). Aub детектировался преимущественно в виде гранул, которые колокализуются с ламиной. Интенсивность сигнала от Aub была значительно слабее, чем в семенниках, что согласуется с оценками результатов фракционирования, согласно которым количество белка Aub в ядрах сперматоцитов может быть примерно на порядок меньше, чем в цитоплазме. Исходя из результатов фракционирования и иммуноокрашивания, можно предположить, что небольшая часть комплексов piRNA-Aub находится вблизи внутренней мембраны ядер сперматоцитов, где может вызывать деградацию мРНК Stellate.

Полученные указания на возможность присутствия белка Aub в ядрах терминальных клеток семенников согласуются с ранее полученными данными о том, что антисмысловые

транскрипты Зи(81е), являющиеся предшественниками р11^А, обнаруживаются только в ядрах сперматоцитов (Агаут ег а1. 2004). Можно предположить, что нарезание антисмысловьгх транскриптов происходит непосредственно в ядрах сперматоцитов, сопровождаясь одновременной загрузкой новообразованных р1ЯКА в белок АиЬ.

А. анти-АиЬ анти-ламин В наложение

Рис. 5. Иммуноокрашивание семенников и выделенных ядер с антителами к АиЬ. А. Локализация белка АиЬ в семенниках. Проведено иммуноокрашивание семенников с антителами против АиЬ (показано красным) и ламина (показано зелёным), который является ядерным белком. Специфический сигнал от белка АиЬ был выявлен путём сравнения иммуноокрашиваний семенников мух дикого типа с семенниками мух с мутацией в гене аиЬ (использованы трансгетерозиготы аиЬИ"/аиЬви2, обозначенные -/-). Шкала - 10 рт. Б. Локализация АиЬ в выделенных ядрах. Ядерная фракция была окрашена с антителами против АиЬ и ламина. Сигналы от АиЬ, напоминающие точки, колокапизуются с ламином.

Изучение регуляции экспрессии репортёрной конструкции Ste-IacZ

Для характеристики особенностей подавления экспрессии генов Stellate были использованы репортёрные конструкции Ste-lacZ, несущие часть гена Stellate, слитую с репортёрным геном lacZ, кодирующим р-галактозидазу. Использовали два трансгенных репортёра: Ste703-lacZ (предоставлена А. Тулиным) и Stel34-lacZ (Aravin et al. 2001), которые содержат целый или 101 нуклеотид промотора Stellate и 141 или 33 нуклеотида транскрибируемой последовательности Stellate, соответственно. С помощью полуколичественного ОТ-ПЦР и метода количественной оценки активности (5-галактозидазы, обнаружено, что при делеции повторов Su(Ste) количество мРНК Ste-lacZ увеличивается в 1,5 раза, а уровень Р-галактозидазы в 4-7 раз (рис. 6А,Б). Если бы piRNA Su(Ste) подавляли транскрипцию конструкций Ste-lacZ, то при делеции повторов Su(Ste) обнаруживалось бы пропорциональное возрастание уровня мРНК Ste-lacZ и р-галактозидазы. Обнаруженное незначительное увеличение уровня мРНК Ste-lacZ по сравнению с количеством белка указывает на преимущественно посттранскрипционную регуляцию экспрессии конструкций, что согласуется с данными, полученными для эндогенных Stellate. Непропорционально высокое возрастание уровня белка было обнаружено и для эндогенных Stellate. При делеции повторов Su(Ste) увеличение количества белка Stellate (>200 раз, данные Л.В. Олениной) заметно превышало увеличение уровня мРНК Stellate (30-50 раз, рис. 1). Более слабая степень дерепрессии конструкции Ste-lacZ по сравнению с эндогенными Stellate может быть объяснена структурой репортёрных конструкций, которые содержат лишь часть последовательности Stellate.

С целью определить причины непропорционально меньшего по сравнению с белком изменения уровня мРНК Ste-lacZ, в культуре клеток S2 дрозофилы подавляли экспрессию репортёрной конструкции hsp70-Ste-lacZ. Клетки котрансфецировали пдазмидой, несущей конструкцию hsp70-Ste-lacZ, и гомологичной дцРНК, нарезающейся в клетках с образованием siRNA. Конструкция hsp70-Ste-lacZ содержала промотор гена теплового шока hsp70 и первые 585 нт. транскрибируемой последовательности Stellate, слитые с репортёрным геном lacZ. Котрансфекция плазмиды hsp70-Ste-lacZ и одной из дцРНК (Su(Ste), Ste или lacZ) вела к 7-10 кратному уменьшению активности Р-галактозидазы, но не более, чем 1,5-2 кратному уменьшению количества мРНК Ste-lacZ (рис. 7А). Таким образом, обнаружено сходство эффектов piRNA Su(Ste) в семенниках и siRNA Su(Ste) в культуре клеток на экспрессию репортерной конструкции Ste-lacZ. Согласно литературным данным, в культуре клеток S2 дрозофилы siRNA вызывают деградацию гомологичной мРНК. Чтобы оценить эффективность такой деградации в используемых экспериментальных условиях, провели нокдаун экспрессии плазмиды hsp70- GFP с помощью дцРНК GFP и обнаружили

А.

Б.

□ мРНК Ste-lacZ

дикий деления тип Su(Ste)

■ активность ß-галактозидазы

Stel34-lacZ

Ste703-lacZ

lacZ lacZ

Рис. 6. Экспрессия трансгенной репортёрной конструкции Ste-lacZ в семенниках при делении повторов Su(Ste). А. Окрашивание на активность ß-галактозидазы в семенниках мух, несущих трансгенные репортёрные конструкции Ste703-lacZ или Stel34-lacZ. Б. Возрастание уровня мРНК Ste-lacZ (светлые столбцы) и активности ß-галактозидазы (тёмные столбцы) в семенниках мух при делеции повторов Su(Ste).

уменьшение уровня мРНК GFP в 10 раз (рис. 7Б).Следовательно, значительная фракция мРНК Ste-lacZ не доступна для деградации с помощью siRNA-содержащих эффекторных комплексов. Чтобы оценить, ответственна ли за защиту мРНК Ste-lacZ от деградации последовательность Stellate, был проведён нокдаун плазмиды hsp70-lacZ, не содержащей последовательности Stellate, с помощью дцРНК lacZ. Обнаружено уменьшение уровня мРНК lacZ в 5 раз (рис. 7В), что значительно сильнее эффекта дцРНК lacZ на количество мРНК Ste-lacZ (уменьшение в среднем в 1,3 раза). Можно предположить, что неизвестный маскирующий белковый комплекс связывает определённый мотив в РНК Stellate и тем самым защищает значительную часть мРНК Ste-lacZ от деградации. В то же время остальная часть мРНК Ste-lacZ транслируются и может подвергаться siRNA-зависимой деградации. Подобная избирательность репрессии ранее была обнаружена в яичниках дрозофилы, где трансляционно не активные мРНК не подвергались деградации, а после снятия трансляционного блока становились мишенями для siRNA (Kennerdell et al. 2002).

Схожесть результатов, полученных при исследовании piRNA- и siRNA-зависимой репрессий конструкции Ste-lacZ, позволяет предположить, что и в семенниках только

немаскированная фракция тотальной цитоплазматической мРНК Ste-lacZ и Stellate подвергается piRNA-зависимой деградации и трансляции.

дцРНК

□ мРНК Ste-lacZ ■ активность ß-галактозидазы

GFP Su(Ste) Ste lacZ

□ мРНК lacZ

■ активность ß-галактозидазы

дцРНК ДЦРНК

Рис. 7. siRNA-зависимая репрессия репортёрной конструкции Ste-lacZ & культуре клеток S2. А. Уровень мРНК Ste-lacZ (светлые столбцы) и активность ß-галактозидазы (тёмные столбцы) при котрансфекции плазмиды hsp70-Ste-lacZ и одной из дцРНК: GFP (нет гомологии с мРНК Ste-lacZ, используется как отрицательный контроль, принят за 100%), Su(Ste), Ste или lacZ. При нарезании дцРНК образуются siRNA, которые, как видно из Б и В, вызывают эффективную деградацию комплементарной мРНК. Б. Уровень мРНК GFP при котрансфекции плазмиды hsp70-GFP и дцРНК GFP или Su(Ste). В. Уровень мРНК lacZ (светлые столбцы) и активность ß-галактозидазы (тёмные столбцы) при котрансфекции плазмиды hsp70-lacZ и дцРНК GFP или lacZ.

Полученные результаты позволили охарактеризовать особенности малоисследованного механизма подавления экспрессии генов с помощью piRNA. Это даёт возможность объяснить отсутствие значительной piRNA-зависимой авторегуляции экспрессии повторов Su(Ste). Ранее было обнаружено (Vagin et al. 2006), что количество смысловых транскриптов Su(Ste) при мутации в гене aub увеличивается в 5 раз слабее, чем количество мРНК Stellate, несмотря на то, что piRNA Su(Ste) имеют более высокую степень комплементарное™ с мРНК Su(Ste). Объяснить этот результат можно тем, что повторы Su(Ste) содержат нуклеотидные замены, ведущие к возникновению сайтов альтернативного сплайсинга и преждевременным стоп кодонам (Balakireva et al. 1992), в результате чего эффективность трансляции мРНК Su(Ste) может быть ниже, чем эффективность трансляции мРНК Stellate. Видимо, piRNA Su(Ste) преимущественно вызывают деградацию более активно транслирующейся мРНК Stellate.

Зависимость Su(Ste) piRNA-инициированной деградации мРНК Ste-lacZ и Stellate от состава рибонуклеопротеидных комплексов хорошо согласуется с существующими представлениями о механизмах репрессии с помощью siRNA и miRNA. В литературе представлены данные о регуляторных белках, которые связываются с мРНК вблизи сайтов отжига miRNA (в 3' НТО) и могут препятствовать посадке эффекторного комплекса (Kedde et al. 2007). По-видимому, процессы сайленсинга с помощью коротких РНК, как и другие основные пути регуляции экспрессии, сами подвергаются активной регуляции и, таким образом, встраиваются в состав единой регуляторной сети, определяющей жизнедеятельность клетки.

выводы

Изучены особенности механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью piRNA Su(Sle) у Drosophila melanogaster.

1) Делеция повторов Su(Ste) или мутация в гене aub приводят к значительному накоплению сплайсированных, но не несплайсированных транскриптов эу- и гетерохроматиновых копий генов Stellate в семенниках. Полученные данные показывают, что piRNA Su(Ste) преимущественно вызывают деградацию мРНК Stellate.

2) Накопление сплайсированных транскриптов Stellate, вызванное делецией повторов Su(Ste), происходит не только в цитоплазматической, но и в ядерной фракциях, выделенных из семенников. Следовательно деградация транскриптов Stellate может происходить как в цитоплазме, так и в ядрах семенников Drosophila melanogaster.

3) Подавление экспрессии репортёрной конструкции Ste-lacZ как с помощью piRNA в семенниках, так и с помощью siRNA в культуре клеток сопровождается непропорционально сильным снижением активности р-галактозидазы по сравнению со снижением уровня мРНК Ste-lacZ.

4) В культуре клеток siRNA вызывают значительное падение уровня мРНК lacZ и существенно меньшее уменьшение количества мРНК Ste-lacZ, что указывает на роль последовательности Stellate в защите мРНК от деградации, направляемой siRNA. Предполагается, что существует пул нетранслирующихся транскриптов Ste-lacZ, который оказывается защищенным от деградации, вызванной как piRNA, так и siRNA.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

статьи:

1) Vagin, V.V., Klenov, M.S., Kalmykova, A.I., Stolyarenko, A.D., Kotelnikov. R.N.. and Gvozdev, V.A. (2004). The RNA interference proteins and vasa locus are involved in the silencing of retrotransposons in the female germline of Drosophila melanogaster. RNA Biol 1, 54-58.

2) P.H. Котельников. С.Г. Шпиз, А.И. Калмыкова, В.А. Гвоздев (2006). Белки, связывающие РНК, в процессах РНК-интерференции. Молекуляр. биология. 40, 595-608.

3) Kotelnikov. R.N.. Klenov, M.S., Rozovsky, Y.M., Olenina, L.V., Kibanov, M.V., and Gvozdev, V.A. (2009). Peculiarities of piRNA-mediated post-transcriptional silencing of Stellate repeats in testes of Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res 37, 3254-3263.

Доклады на научных конференциях:

1) Vasily Vagin, Oxana Olenkina, Sergei Ryazansky, Roman Kotelnikov. Alia Kalmykova, Vladimir Gvozdev and Phillip Zamore. Production and function of rasiRNAs in Drosophila. Diverse Roles of RNA in Gene Regulation Keystone Symposia, Beaver Run Resort, Breckenridge, Colorado, USA, Abstract Book, 2005, стр. 69.

2) Котельников P.H. Исследование роли генов системы РНК-интерференции в регуляции экспрессии генов Stellate и мобильных элементов у D.melanogaster. 9-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино-на-Оке, Сборник тезисов, 2005, стр. 33.

3) Котельников Р.Н. Изучение регуляции экспрессии репортёрной конструкции Ste-lacZ у D.melanogaster. 10-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино-на-Оке, Сборник тезисов, 2006, стр. 24.

4) Kotelnikov R.N.. Gvozdev V.A. RNAi causes Stellate mRNA degradation in D.melanogaster. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120* anniversary of M.I.Vavilov, 20-22.9.2007, Kiev, Ukraine, Abstract Book, стр. 66.

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, Д.37А Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Котельников, Роман Николаевич

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи работы.

1.3. Научная новизна результатов исследования.

1.4. Практическая ценность.

1.5. Апробация работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Общая характеристика РНК-иптерференции.

2.1. siRNA.

2.1.1. Образование siRNA и загрузка в RISC.

2.1.2. Механизмы подавления экспрессии с помощью siRNA.'.

2.2. miRNA.

2.2.1. Образование miRNA.

2.2.2. Взаимодействие miRNA с мРНК.

2.2.3. Механизмы подавления экспрессии с помощью miRNA.

2.2.3.1. Слайсер-зависимая деградация мРНК.

2.2.3.2. Подавление инициации трансляции.

2.2.3.3. Постинициаторное подавление трансляции.

2.2.3.4. Слайсер-независимая деградация мРНК.

2.2.3.5. Активация трансляции.

2.2.4. Сравнение miRNA и siRNA-зависимого сайленсинга.

2.3. piRNA.

2.3.1. Характеристика piRNA и белков подсемейства Piwi.

2.3.2. Образование piRNA.

2.3.3. Механизмы подавления экспрессии с помощью piRNA.

2.3.4. Функции piRNA и белков подсемейства Piwi.

2.3.5. piRNA Su(Ste) подавляют экспрессию генов Stellate.

2.4. Локализация процессов РНК-интерференции.

2.4.1. Действие siRNA и miRNA в цитоплазме.

2.4.2. Действие siRNA и miRNA в ядре.

2.4.3. Локализация процессов piRNA-зависимой репрессии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью РНК-интерференции у Drosophila melanogaster"

1.1. Актуальность проблемыРНК-интерференция (РНКи) представляет собой подавление экспрессии генов, мобильных элементов и вирусов с помощью гомологичных коротких РНК (Ghildiyal and Zamore, 2009). К настоящему моменту у животных выделяют три основных класса репрессивных коротких РНК: siRNA (short interfering RNA), miRNA (microRNA) и piRNA (PIWI interacting RNA). piRNA активно изучаются в последние несколько лет, однако механизмы репрессии с помощью piRNA изучены гораздо меньше, чем для siRNA и miRNA. piRNA функционируют в составе эволюционно консервативной системы, подавляя экспрессию мобильных элементов в терминальных тканях животных. Нарушение функции piRNA приводит к транспозиционному взрыву и, как следствие, к утрате плодовитости. piRNA, как и другие классы коротких PIIK, действуют в составе комплексов RISC (RNA induced silencing complex). В состав этих комплексов входят белки семейства Argonaute (Ago), которые связывают короткие РНК. piRNA связываются белками Ago, относящимся к подсемейству PIWI. Механизм сайленсинга мобильных элементов с помощью piRNA изучен недостаточно. Существующие скудные данные указывают на то, что piRNA могут вызыпачь как деградацию мРНК мобильных элементов, так и их транскрипционный сайлепсинг. Белки подсемейства PIWI у дрозофилы (Aub, Ago3 и Piwi) и крысы (Riwi) обладают эндонуклеазной активностью (Gunawardane et al., 2007; Lau et al., 2006: Nishida et al., 2007; Saito et al., 2006). В яичниках и семенниках дрозофилы белки Aub и Ago3 локализуются преимущественно в ' перинуклеарных гранулах (структура, называемая «nuage», от франц. «облако»), что предполагает скорее посттранекрипционный механизм сайленсинга. С другой стороны, в яичниках дрозофилы белок Piwi локализуется в ядрах. Мутация в гейе spn-E, который необходим для образования и/или стабилизации piRNA, приводит к «открыванию» хроматина мобильных элементов (Klenov et al., 2007). В семенниках мышей показапа роль piRNA в метилировании ДНК мобильных элементов. Таким образом, потенциально piRNA могут подавлять экспрессию как с помощью деградации мРНК, так и на транскриицио'Шюм уровне, посредством эпигенетических модификаций.piRNA впервые были обнаружены в Лаборатории биохимической генетики животных Института молекулярной генетики РАН при изучении системы подавления экспрессии семенник-специфичных повторяющихся генов Stellate (Aravin et al. 2001; Aravin et al. 2004). Эти piRNA продуцируются повторами Su(Ste) (Suppressor of Stellate), которые расположены на Y-хромосоме и имеют 90% гомологии с генами Stellate, которые расположены на Х-хромосоме и кодируют белок Stellate, гомологичный регуляторной Р субъединице казеин киназы 2 (Bozzetti et al., 1995). piRNA Su(Ste) связываются белком Aub. Делеция повторов Su(Ste) или мутация в гене aub ведёт к исчезновению piRNA Su(Ste) в семенниках и значительному увеличению количества мРНК Stellate, что вызывает накопление белка Stellate в кристаллах, приводя к нарушению сперматогенеза и стерильности самцов. Как и в случае piRNA-зависимого подавления экспрессии мобильных элементов, механизм репрессии генов Stellate с помощью piRNA Su(Ste) изучен недостаточно. Показано, что комплекс piRNA Su(Ste) и белка Aub способен деградировать мРНК Stellate in vitro (Nishida et al., 2007). Данная работа посвящена сравнению вклада механизмов деградации мРНК и репрессии транскрипции в Su(Ste) piRNA-зависимый сайленсинг генов Stellate.

1.2. Цели и задачи работыЦелью настоящей работы являлось исследование особенностей механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью piRNA Su(Ste). Были поставлены следующие задачи:1. Оценить вклад транскрипционного и посттранскрипционного сайленсинга в Sa(Ste) piRNA-зависимую репрессию генов Stellate. Для этого следовало сравнить степень увеличения количества сплайсированных и несплайсированных транскриптов Stellate в семенниках дрозофилы при делеции повторов Su(Ste) или мутации в гене aub. Обнаружение сопоставимого возрастания количества сплайсированных и несплайсированных транскриптов будет свидетельствовать о транскрипционной регуляции, а возрастание только уровня сплайсированных транскриптов укажет на посттранскрипционную регуляцию экспрессии генов Stellate;2. Разработать способ раздельной детекции транскриптов эу- и гетерохроматиновых генов Stellate и сравнить механизм их репрессии с помощью piRNA Su(Ste);3. Определить, происходит ли деградация транскриптов Stellate в ядрах терминальных клеток семенников;4. Сравнить особенности piRNA- и siRNA-зависимого подавления экспрессии репортёрной конструкции Ste-lacZ.

1.3. Научная новизна результатов исследованияПоказано, что piRNA Su(Ste) подавляют экспрессию генов Stellate в основном с помощью деградации мРНК, происходящей не только в цитоплазме, но и в ядрах сперматоцитов. Экспрессия эу- и гетерохроматиновых генов Stellate подавляется примерно в равной степени, что указывает на отсутствие влияния структуры хроматина на piRNA-зависимую регуляцию. Обнаружено сходство механизмов piRNA- и siRNA-зависимой репрессии репортёрной конструкции Ste-lacZ. Полученные данные позволяют предположить, чго piRNA, подобно siRNA, вызывают деградацию только немаскированных трансляционно активных транскриптов.

1.4. Практическая ценностьПолученные данные позволяют прояснить особенности механизма подавления экспрессии с помощью эволюционно консервативной системы РНКи у дрозофилы, чго может быть использовано при изучении биологических процессов в терминальных клетках человека, в регуляции которых РНКи играет существенную роль.

1.5. Апробация работыРабота апробирована на лабораторном семинаре в отделе молекулярной генетики клетки ИМГ РАН. Данные, представленные в работе, докладывались на конференции, посвященной механизмам РНК-интерференции (Keystone Symposia, США, 2005), на конференциях для молодых учёных (Пущино, 2005, 2006; Киев, 2007), на конкурсе работ молодых учёных на соискание стипендий фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, 2008).

Структура и объём диссертацииДиссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста и содержит главы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Диссертация содержит 19 рисунков, 1 таблицу и 241 литературную ссылку.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Котельников, Роман Николаевич

Заключение

В обзоре литературы представлено многообразие механизмов подавления экспрессии с помощью коротких РНК у дрозофилы, млекопитающих и, в меньшей степени, у других организмов. Короткие РНК могут вызывать деградацию полностью комплементарной РНК и/или подавлять транскрипцию гомологичного гена. Частичная комплементарность короткой РНК и мРНК может приводить к подавлению трансляции и/или к деградации мРНК. Наличие альтернативных

механизмов ставит вопрос о вкладе того или иного механизма в суммарную репрессию. Задачей данной диссертационной работы было сравнение вклада деградации мРНК или подавления транскрипции в Su(Ste) piRNA-зависимую репрессию генов Stellate.

В разделе 1.4 обзора литературы рассмотрена локализация процессов РНКи. Очевидно, что подавление транскрипции происходит при помощи комплексов RISC, находящихся в ядре, а подавление трансляции при помощи RISC, находящихся в цитоплазме. Во многих случаях остаётся открытым вопрос о компартменте, в котором происходит деградация РНК-мишени. Считается, что большая часть такой деградации происходит в цитоплазме клеток, однако показано существование процессов деградации РНК-мишени и в ядрах. В данной работе определяли локализацию процессов деградации мРНК Stellate.

В настоящее время активно изучаются принципы взаимодействия коротких РНК с РНК-мишенями. Такие исследования проводятся в основном для miRNA (раздел 2.2.2.). Обнаружено, что главную роль в узнавании мишеней играет 5' часть miRNA. Для эффектовной посадки miRISC комплементарный сайт-мишень в мРНК должен быть расположен в З'НТО и иметь определённое нуклеотидпое окружение. В меньшей степени изучены механизмы регуляции таких взаимодействий. Взаимодействие miRNA с мишенью может ингибироваться регуляторными белками, связывающимися с мРНК вблизи места посадки miRISC. В то же время, почти совсем не изучены закономерности процессов взаимодействия коротких РНК с мРНК-мишенями, являющимися объектами других регуляторных систем. Наши данные на примере механизма сайленсинга генов Stellate частично заполняют этот пробел и позволяют предположить, что трансляционно репрессированные мРНК не подвергаются piRNA-зависимой репрессии.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Линии Drosophila melanogaster и генетические скрещивания

Линии трансгенных мух, несущих одиночную инсерцию реггортёрной конструкции Ste703-lacZ или Stel34-lacZ на хромосомах 3 или 2, соответственно, были любезно предоставлены А. Тулиным и А. Аравиным. Репортёрные конструкции Ste703-lacZ и Stel34-lacZ содержат целый или 101 нуклеотид промотора Stellate и 141 или 33 нуклеоти"да транскрибируемой последовательности Stellate, соответственно, слитые с репортёрным геном lacZ. В состав репортёрной конструкции Ste703-lacZ входили шесть гетерохроматиновых генов Stellate. В результате скрещиваний были получены линии, несущие одну из конструкций в гомозиготном состоянии и делецию локуса Su(Ste) на Y хромосоме.

3.2. Использованные праймеры

Праймеры для количественного ПЦР в реальном времени

Праймеры к Stellate (см. рис 8)

1 5A AGTCTG АТАС AC AGCTGG ACGG AGC G

2 5'-CGCTTGCACTTGCAGTACCTAG

3 5-CCTGACCAATATTCCGATATTCTTTGGC

4 5'-GGGTCGTCCAGGGGCGATC

5 5-GTAATTCTCCGAATATAGTC

6 5-CGATTTGAGTTGCATCAAGGCTTTCA

Другие праймеры

Adh-d3 5'-CGGCATCTAAGAAGTGATACTCCCAAAA Adh-r3 5-TGAGTGTGCATCGAATCAGCCTTATT

Праймеры для полуколичественного ПНР

Праймеры для получения ПЦР продукта, использованного в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной РНК T7-DSS1 (для Sie или Su(Ste)) 5'-

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACTCTGTGAACGAGTGAACTGGC T7-DSS2 (для Sie или Su(Ste))

5-TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACTTACCGTGGGTTGTCCAGG T7-DSG1 (для lacZ)

5'-TAATACGACTCACTATAGGGATTCCACGTGGTTATGCCGATCGCGT T7-DSG2 (для lacZ)

5-TAATACGACTCACTATAGGGATTCCACATATCGGTGGCCGT'GGTGT T7-GFP1 5'-

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACGGCGAGGAGCTGTTCACC

T7-GFP3 5'-

TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCCGAGGTGAAGTTCGAGG

Праймеры, использованные при анализе экспрессии трансгенных конструкций Ste-lacZ в семенниках

DSG1 (для Ste-lacZ) 5'-GTGGTTATGCCGATCGCGT DSG2 (дляSte-lacZ) 5-ATATCGGTGGCCGTGGTGT rp49d 5'-CAGGCCCAAGATCGTGAAG

ф49г 5 '-TG AG AACGC AGGCGACC

Праймеры, использованные при анализе экспрессии репортёрных конструкций hsp70-Ste-lacZ, hsp70-lacZ и hsp70-GFP в культуре клеток DSG1 (см. выше)

lacZ-rev 5ACCGCC AAGACTGTTACCCAT

T7-GFP1 (см. выше)

5-TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACTGCTCAGGTAGTGGTTGTCG

3.3. Выделение РНК из семенников или из ядерной и цитоплазматической фракций

3.4. Обратная транскрипция

проводились в объёме 30 мкл. Пробы +RT и -RT амплифицировали параллельно. Во всех реакциях ОТ-ПЦР, приведенных в работе, не выявлялось продуктов амплификации в -RT при тех же условиях.

3.5. Количественная ПЦР в реальном времени

Количественную ПЦР использовали для оценки представленности кДНК эу-или гетерохроматиновых копий Stellate в семенниках или в ядерной и цитоплазматической фракциях, выделенных из семенников. Количественная ПЦР в реальном времени основана на том, что количество ПЦР-продукта в реакционной смеси определяется после каждого цикла амплификации по флуорисценции красителя SYBR green, появляющейся при его встраивании в образующиеся молекулы двухцепочечной ДНК. В каждую реакцию брали 3 мкл кДНК, по 2 мкл. каждого праймера в концентрации 3.3 пМ, 3 мкл. 10х буфера (0.67 M Tris-HCl рН 8.8, 166 мМ (NH4)2S04, 0.1% Twcen-20), 6 мкл. 25 мМ MgCb. 6 мкл. смеси четырёх дНТФ с концентрацией 1 мМ каждого дНТФ, SYBR green (1/10000 из стока стандартной концентрации, Синтол), ROX (1/3000 из стока с концентрацией 100 pmole/мкл., Синтол) и 0,6 мкл. Hot Start Taq ДНК полимеразы (5и/мкл., СибЭнзим). ПЦР проводили в приборе Chromo4 (BioRad). В каждом эксперименте параллельно строили калибровочную кривую, показывающую зависимость порогового цикла амплификации от количества ДНК, добавленной в реакцию.

3.6. Выделение геномной ДНК Drosophila

Буфер ТЕТ: 0.1 М Tris pH 9.1, 50 mM EDTA, 0.2% Triton Х-100.

3.7. Стандартные молекулярно-биологические методы

Стандартные методы полимеразной цепной реакции, рестрикции,

электрофореза и т. д. выполняли в соответствии с руководством (Sambrook J., 2001). Использовали ферменты и реактивы фирм MBI Fermentas, Ambion, Promega, Boehringer и др.

3.8. Выделение ядерной и цитоплазматической фракций из семенников

Семенники извлекали из самцов, помещали в раствор С39 на льду, осаждали,

Буфер для лизиса: 350 мМ сахарозы, 15 мМ HEPES (pH 7.6), 10 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0.1 мМ ЭДТА, 0.5 мМ ЭГТА, 1 мМ DTT, protease inhibitor cocktail (Roche), 0.5 u RNasin Plus (Promega).

Ресуспензионный буфер: 290 мМ сахарозы, 5 мМ Tris-HCl (pH 7.4), 1.5 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, Triton Х-100 0.04%, protease inhibitor cocktail (Roche), 0.5 u RNasin Plus (Promega).

3.9. Нозерн анализ

Буфер для нанесения: 95% формамид, 0,025% бромфеноловый синий, 0,025% ксилен цианол, 0,025% SDS, 18mM EDTA.

IxTBE: 89тМ Tris base, 89тМ борная кислота, 2mM EDTA (pH 8), pH 8.3.

Буфер Church: 0.5 M фосфатный буфер pH 7.5, 1 тМ ЭДТА, 7% SDS.

Предгибридизационный буфер: 50 тМ фосфатный буфер pH 7.5, 0.5 M NaCl, 0.1% Фикол400, 0.1% поливинилпиролидон, 0.1% пирофосфат, 50 мкг/мл гепарин, 25 мМ ЭДТА, 1% саркозил, 150 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося.

Буфер для кинирования: 0.7 M Tris-IiCl, 0.1 M MgCl2, 50 мМ DTT. pH 7.6.

20xSSC: 3 M NaCl, 0.3 M Na3C6H507.

Используемые олигонуклеотидные зонды:

mt tRNA M 5'-GGGTATGAACCCAGTAGCTTAA-3',

tRNA К 5 '-AG ATTAAGAGTCTC ATGCTCTA-3

piRNA Su(Ste)-4 5'- TCGGGCTTGTTCTACGACGATG-3'.

3.10. Сравнение количества белка по методу Бредфорда

10 мкл. Z-буфера с гомогенизированными в нём семенниками или 1мкл ядерной или цитоплазматической фракций смешивали с 200 мкл. 5Х Bio-Rad Protein Assay буфера, после чего добавляли 800 мкл. воды и инкубировали 30 мин. при комнатной температуре. В образцах измеряли поглощение при длинне волны 595 нм. В каждом опыте брали двойное количество субстрата, чтобы проверить линейную зависимость между количеством белка и интенсивностью сигнала.

3.11. Вестерн анализ

Количество белка, используемого для Вестерн анализа, было выровнено с использованием метода Бредфорда. Для оценки чистоты разделения ядерной и цитоплазматической фракций проводили Вестерн анализ с мышиными моноклональными антителами к ламину В (DmO ADL67.10, Developmental Studies Hybridoma Bank), кроличьими моноклональными антителами к у-тубулину (Sigma)

Буфер для нанесения: 2% SDS, 100 мМ DTT, 60 мМ Tris-HCl рН 6.8, 0.01% бромфеноловый синий, 10% глицерин.

Буфер для электрофореза: 48 мМ Tris-HCl рН 9.2, 48 мМ глицин, 0.15% SDS.

Буфер для электропереноса: на 1 литр 3 г. Tris, 14.4 г. глицин, 77 мл. 96% этанола (готовить перед употреблением).

Буфер для забивки: 90% (по объёму) 0.5% молока, 0.1% Tween-20, IxPBS (1.7 мМ КН2Р04, 5.2 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCl).

Буфер для промывки: IxPBS, 0.1% Tween-20.

Щелочной буфер: 100 мМ Tris рН 9.2, 100 мМ NaCl.

3.12. Иммуноокрашивание семенников и ядер

Ядерную фракцию наносили на предметное стекло (SuperFrost Plus Gold, Menzel-Glaser) и инкубировали 15 мин., чтобы ядра осели. Ядра фиксировали в течении 15 мин. в растворе 1.8% параформальдегида в lxPBS при комнатной температуре, промывали три раза в растворе РВТ по 5 мин. и инкубировали при комнатной температуре в течении 1-2 часов в растворе РВТ, содержащем 3% козьей антисыворотки и 0.1% Tween-20. Обработка антителами проводилась так же, как при иммуноокрашивании семенников.

Раствор PBTD: lxPBS, 0.1% Tween-20, 0.3% Triton Х-100, 0.3% дезоксихолат натрия.

Раствор РВТ: lxPBS, 0.1% Tween 20.

3.13. Гистохимическая окраска органов на активность ß-галактозидазы

Механически выделенные из имаго семенники помещали в раствор 0,15 M

Раствор С39: 3,2 mM NaH2P04, 4,2 mM NaHC03, 21 mM KCl, 69 mM NaCI.

Галактозидазный буфер: 0,15 М NaCI, 10 mM NaH2P04, pH 7,5, 1 шМ MgCl2, 3,1 mM K3[Fen(CN)ö], 3,1 mM К4[Реш(СЫ)б|. Готовый раствор хранили в темноте, не более месяца.

3.14. Количественное определение активности ß-галактозидазы

Z-буфер: 60 mM Na2HP04, 40 mM NaH2P04, 10 mM KCl, 1 mM MgS04, 0,35% меркаптоэтанол.

3.15. Полуколичественная ПЦР

3.16. Электрофорез ПЦР-продуктов в акриламидном геле

Препараты радиоактивно меченых продуктов ПЦР смешивали с буфером для

нанесения в соотношении 3:2, наносили 2/5 ПЦР смеси на 1 форез. Для электрофореза использовался 5% полиакриламидный гель.' Электрофорез проводили при 25V/cm, в 1ХТВЕ до выхода бромфенолового синего. Гель после фореза переносили на лист ЗММ бумаги, сушили до полного исчезновения следов влаги и экспонировали на экран фосфоимиджера. Интенсивность полученных сигналов рассчитывали с использованием программы Image Quant.

Состав буфера для нанесения: 50% глицерин, 0,025% бромфеноловый синий, 0,025% ксилен цианол.

Состав акриламидного геля: 5% раствор акриламид/бисакриламид (в соотношении 19/1) на бидистилированной воде, 1ХТВЕ (89 мМ Tris, 89 мМ борная кислота, 2мМ ЭДТА, рН8,3).

3.17. Выделение плазмидной ДНК

Выделение плазмидной ДНК для трансфекции в культуру клеток S2 Drosophila осуществляли из 25 или 100 мл культуры E.coli с помощью колонок Quagen Midi или Maxi в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

3.18. Получение дцРНК

Для получения двухцепочечных РНК использовали ПЦР-продукты, ограниченные двумя противоположено ориентированными Т7 промоторами для синтеза смысловой и антисмысловой цепей РНК. ПЦР-продукты для синтеза

дцРНК Su(Sie), Ste, GFP или lacZ получали с помощью ПЦР с праймерами, содержащими на 5' концах последовательности Т7 промотора, с плазмид, несущих последовательности Su(Ste), Ste, GFP или lacZ, соответственно.

3.19. РНКи в культуре клеток Drosophila melanogaster

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. piRNA Su(Ste) вызывают деградацию мРНК Stellate

В геноме D.melanogaster на Х-хромосоме находятся тандемно повторяющиеся гены Stellate, а на Y-хромосоме гомологичные генам Stellate повторы Suppressor of Stellate (Su(Ste)). Гены Stellate и повторы Su(Ste) экспрессируются в семенниках. Белок Stellate гомологичен регуляторной р-субъединице протеинкиназы CKII и связывает каталитическую а-субъединицу CKII в ядрах, что может влиять на фосфорилирование ядерных белков (Bozzetti et al., 1995; Egorova et al., 2009; Livak, 1984; Livak, 1990). Повторы Su(Ste) в отличие от генов Stellate содержат поврежденные открытые рамки считывания и, по-видимому, не могут кодировать функционального белка (Balakireva et al., 1992; Kalmykova et al., 1998). При делеции повторов Su(Ste) происходит значительное увеличение количества мРНК Stellate, что вызывает накопление белка Stellate в виде кристаллов преимущественно в цитоплазме, а также в растворимой форме в ядрах сперматоцитов (Bozzetti et al., 1995; Egorova et al., 2009). Это приводит к различным мейотическим нарушениям в ходе сперматогенеза в линиях с меньшим числом генов Stellate и к стерильности самцов в линиях с большим числом генов Stellate (Livak, 1984; Livak, 1990; Palumbo et al., 1994). Показано, что транскрипция повторов Su(Ste) происходит в двух направлениях (Aravin et al., 2001). Антисмысловые транскрипты Su(Ste) нарезаются с помощью мало охарактеризованного механизма «первичного процессинга» (см. обзор литературы), что приводит к образованию piRNA Su(Ste) длиной 25-27 нуклеотидов. piRNA Su(Ste) связываются белком Aub (Nishida et al., 2007). Мутация в гене Aub приводит к исчезновению piRNA Su(Ste) и дерепрессии генов Stellate. Подавление экспрессии генов с помощью коротких РНК (в том числе piRNA) может происходить как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях (см. обзор литературы). Одна из задач настоящей работы состояла в оценке вклада транскрипционного и посттранскрипционного механизмов в Su(Ste) piRNA-зависимую репрессию генов Stellate.

Методом количественного ОТ-ПЦР в реальном времени (кОТ-ПЦР) оценивали эффект делеции повторов Su(Ste) или мутации aubstms' на количество

сплайсированиых и несплайсированных (новообразованные в результате транскрипции пре-мРНК, не успевшие ¡юдвергнуться процессу сплайсинга) транскриптов Stellate в семенниках. Увеличение количества несплайсированной мРНК Stellate при нарушении сайленсинга указывало бы на транскрипционную репрессию. Увеличение количества только сплайсированной мРНК Stellate укажет на то, что piRNA Su(Ste) вызывают деградацию мРМК Stellate. Такой подход основывается на том, что короткие РНК могут влиять на процессы транскрипции или деградации мРНК. а не на эффективность сплайсинга транскриптов-мишеней Действительно, у растений, дрожжей, дрозофилы и млекопитающих показано, что разные типы коротких РНК подавляют трансляцию, транскрипцию или вызывают деградацию мРНК-мишеней (см, обзор литературы), В тоже время, среди данных литературы отсутствуют указания на влияние коротких РНК на эффективность сплайсинга.

ciajH трямскрнпинн

эухроматиноная khindi Stellate

пол и А

пол м Л

Рис. 8. Схема эу- и гетерохроматиновых КОПИЙ генов Stellate и положение праймеров, использованных для ПЦР. Подобранные праймеры обозначены цифрами ¡-6, Пары нраймеров 1/3 и 2/3 использованы для амплификации эухроматиновых КОПИЙ Stellate, поскольку праймер 3 комплементарен последовательности, которая отсутствует к гетерохроматиновых копиях. Праймеры 1/3 (эу спл) амплифинируют преимущественно сплайсированиые транскрипты, поскольку для эухроматиновых копий Stellate их количество значительно больше, чем несплайсированных. Праймеры 2/3 (эу нести) амплифицнруют только несплайсированные транскрипты. Пары праймеров 1/4 (гет сум) или 5/6 (гет неепп) позволяют амплифицировать сумму или несплайсированные транскрипты гетерохроматиновых копий Stellate, соответственно, поскольку 3' концевые нуклеотиды праймеров 4 и 6 комплементарны единичным нуклеотидным заменам, различающим оба типа Stellate (показаны большими буквами). При вычитании количества несплайсированных транскриптов из суммы получали количество сплайсированиых транскриптов гетерохроматиновых копий Stellate.

гетерохроматиновая копим Stellate

Геном Drosophila melanogaster содержит два кластера генов Stellate, расположенные в эухроматиновом регионе 12Е (aySte) или дистальном гетерохроматине X хромосомы (reTSte) (Livak, 1990; Palumbo et al., 1994; Shevelyov, 1992; Tulin et al., 1997). Благодаря единичным нуклеотидным заменам, различающим эти кластеры, были подобраны праймеры, которые раздельно детектируют два типа транскриптов Stellate (рис. 8). ПЦР анализ с использованием в качестве матриц плазмид, содержащих эу- или гетерохроматиновые копии Stellate или повтор Su(Ste), подтвердил специфичность праймеров (рис. 9А). Чтобы подтвердить локализацию детектируемых копий Stellate в эу- или гетерохроматине, был использован подход, основанный на явлении недорепликации гетерохроматиновой ДНК в ядрах клеток слюнных желёз личинок (Abramov et al., 2005). В этих ядрах ДНК эухроматина подвергается множественной политенизации, в то время как ДНК гетерохроматина не реплицируется. Проведён количественный ПЦР в реальном времени с использованием ДНК, выделенной из слюнных желёз или из целых мух, и с праймерами к эу- или гетерохроматиновым копиям Stellate или к гену Adh, который находится в эухроматине (маркёр ДНК, подвергающейся политенизации). Для каждой пары праймеров к Stellate рассчитывали соотношение Ste/Adh, а затем делили полученное отношение Ste/Adh в ДНК из слюнных желёз на отношение Ste/Adh в ДНК из целых мух и выражали отношение в процентах (рис. 9Б). Полученное отношение позволяет оценить относительную степень политенизации ДНК, которая амплифицируется данной парой праймеров. Если отношение близко к 100%, то праймеры амплифицируют копии Stellate, которые в слюнных железах подвергаются политенизации в той же степени, как и эухроматиновый ген Adh и, следовательно, лежат в эухроматине. Если отношение значительно ниже 100%, значит копии Stellate недореплицируются и, следовательно, лежат в гетерохроматине. Полученные результаты подтвердили, что праймеры для суммарных и несплайсированных транскриптов гетерохроматиновых Stellate (гет сум и гет неспл, соответственно) детектируют копии, расположенные в гетерохроматине, а праймеры для сплайсированных и несплайсированных транскриптов эухроматиновых Stellate (эу cm и эу неспл, соответственно) детектируют копии, расположенные в эухроматине.

пары принтеров

гет сум гет неспл ЭУ СПЯ »>' неспл

п лат II л я с эуSte + + - - + +

|11Я!>|1||Я 1' 11'l'St' + + - - + +

плазм ил ¡1 с SufSte) + + + - - +

продукт — — —

X 2 х х S ц, о

л с 3 =г п S

а о а> s

120 100 80 60 40 20

пет эу эу гет гет эу эу неспл сум неспл спл неспп сум неспл спл без инсерции S rerSte

Ste в эухроматине

Рис. 9. Проверка специфичности пар праймеров, детектирующих эу- или гетерохроматиновые копии генов Stellate. А. ПЦР анализ плазм ид, несущих эу- или гетерохроматиновые копии генов Stellate или повтор Su(Ste), подтверждает специфичность праймеров для нес планированной (эу неспл, гет неспл) или сплайсированмой/суммарной (эу спл, гет сум) мРНК Stellate. Б. Проверка локализации детектируемых копий Stellate в эу- или гетерохроматине. Приведены расчётные значения, полученные в результате деления отношения Stellate/Adh в слюнных железах на это отношение в целых мухах. Этот тест под тверждает, что пары праймеров гет неспл и гет сум или эу неспл и эу спл детектируют копии генов Stellate, расположенные в гетера- или эухро матине, соответственно. При использовании линии мух, несущих трансген с шестью повторами гетерохроматиновых генов Stellate в эухроматине хромосомы 3, происходит увеличение расчётных значений для праймеров специфичных к гетерохроматиновым копиям Stellate, что подтверждает обоснованность использования данного теста.

Обнаружено, что как деления повторов Su(Ste), так и мутация auh5"" приводят к незначительному увеличению количества несплайсированных гран скриптов, в то время как количество с планированных транскриптов сильно возрастает (в 10-50 раз) для обоих типов Stellate (рис. 10).Таким образом.

пос [транскрипционная деградация мРНК является основным механизмом подавления экспрессии генов Stellate. Сходство результатов, полученных для эу- и гетерохроматиновых копий Stellate, указывает на то, что положение копий в геноме не влияет на механизм их репрессии, что хорошо согласуется с иосп'ранскрипционным механизмом сайленсинга генов Stellate.

s эу гетеро эу гетеро эу гетеро

ш эндогенные 6 гетеро Ste эндогенные

Sie в эухроматине Sfe

делеция Su(Ste) мутация аиЬ

Рис. 10. Делеция повторов Su(Ste) или мутация в гене aub вызывает преимущественное увеличение количества сплайсированной, но не несплайсированной мР1 (К Stellate в семенниках дрозофилы. Показано, во сколько раз увеличивается количество сплайсированной (тёмные столбцы) или несплайсированной (светлые столбцы) эухроматиновой (эу) или гетерохроматиновой (гетеро) мРИК Stellate при делеции повторов Su(Ste) (по сравнению с мухами дикого типа) или при мутации в гене auh (мутация - sling-I, сравнивали гомозигот по мутации с гетерозиготами) по данным кОТ-ПЦР.

4.2. piRNA Su(Ste)-зависимая деградация мРНК Stellate может происходить как в цитоплазме, так и в ядрах

Белки Ago, являющиеся ключевыми компонентами эффекторного комплекса RISC, осуществляющего деградацию мРНК-мишени, обнаруживаются как в цитоплазме, так и в ядрах клеток у различных организмов (Aravin et al., 2008; Brennecke et al., 2007; Guang et al., 2008; Liu et al., 2005b; Ohrt et al, 2008; Robb et al., 2005; Weinmann et al., 2009). В культуре клеток млекопитающих белок Ago2 транспортируется в ядро, для чего необходим рецептор импорта импортин 8 (Weinmann et al., 2009). При этом, Ago2 является единственным белком подсемейства Ago у млекопитающих, обладающим слайсерной активностью (Liu et al., 2004; Meister et al., 2004). В соответствии с этим в культуре клеток млекопитающих siRNA могут вызывать деградацию РНК-мишеней как в цитоплазме, так и в ядрах (Robb et al., 2005; Zeng and Cullen, 2002). Представляло интерес выяснить, могут ли piRNA Su(Ste) вызывать деградацию мРНК Stellate в ядрах? Для этой цели было решено определить, происходит ли увеличение уровня мРНК Stellate в ядрах сперматоцитов при делеции повторов Su(Ste).

Из лизатов семенников мух с делецией повторов Su(Ste) и мух дикого типа были получены ядерная и цитоплазматическая фракции. Чистота разделения фракций была проверена с помощью Вестерн анализа с антителами против ламина и у-тубулина, которые локализуются в ядре и цитоплазме, соответственно (рис. IIA). Согласно методике фракционирования ядерная фракция не должна содержать ядерных мембран. Чтобы это оценить, был проведён Вестерн анализ с антителами против калнексина, который является трансмембранным белком эндоплазматического ретикулума (рис. ПА). В целом, Вестерн анализ показал, что ядерная фракция практически не загрязнена белками цитоплазмы. Чистота разделения фракций была также проверена с помощью Нозерн анализа с использованием РНК, выделенной из обеих фракций (рис. ПА). Был использован зонд, комплементарный цитоплазматической лизиновой тРНК или митохондриальной метиониновой тРНК. Применимость Нозерн анализа для количественного сравнения уровней тРНК была подтверждена с помощью калибровочного эксперимента, в котором обнаружена линейная корреляция между количеством РНК, взятой для анализа, и интенсивностью сигнала после гибридизации (рис. 11Б). Согласно данным Нозерн анализа степень загрязнения ядерной фракции цитоплазматической РНК не превышала 10%.

Методом кОТ-ПЦР в каждой фракции определяли, во сколько раз увеличивается уровень мРНК Stellate при делеции повторов Su(Ste). Обнаружено, что количество сплайсированных гетерохроматиновых транскриптов Stellate возрастает в цитоплазматической и ядерной фракциях в 37 и 13 раз, соответственно (рис. 11В). Для эухроматиновых Stellate степень дерепрессии в цитоплазматической и ядерной фракциях составляет 36 и 17 раз, соответственно (рис. ИВ). Значительная дерепрессия Stellate в ядерной фракции не может быть объяснена цитоплазматическим загрязнением, поскольку по данным Нозерн анализа загрязнение ядерной фракции цитоплазмой не превышает 10%. Это позволяет заключить, что деградация мРНК Stellate происходит как в цитоплазме, так и в ядрах.

количество тотальной РНК ((jg) 0,4 1 4 8

дик ни тип

делецни Su(Ste)

ядра цит ядра цит

о. s 3 (О 40

к X а о

о а. >. е о о 30

(С о. X X 20

ш аз ц

0) 5 ф ч 10

□ несплайсиронанные транскрипты

■ еппайсированные транскрипты

ядро цит

ядро цит aySte

0 2 4 6 8 10 количество тотальной РНК, взятой для Нозерн анализа (рд)

Рис. 11, Деградация мРНК Stellate, вызванная piRNA Su(Ste), происходит как в цитоплазме, так и в ядрах. А. Оценка чистоты ядерной и цитоплазматической фракций. Вверху: Нозерн анализ с зондами, комплементарными митохондриальной метионнновой тРНК (mt tRNA М) и цитоплазм этической лизиновой тРНК (tRNA К). Внизу: Вестерн анализ с антителами против лам и на (ядерный белок), у-тубулина (цитоплазматический белок) и кал не кс и на (траисмембранный белок эндоплазм этического ретикулума). Б. Калибровочный Нозерн анализ (зонд к митохондриальной метиониновой тРНК) демонстрирует, что сигнал, полученный после гибридизации, коррелирует с количеством РНК, взятым для анализа. Этот эксперимент показывает, что Нозерн анализ может быть использован для количественного сравнения уровней тРНК и piRNA Su(Ste) в ядерной и цитоплазматической фракциях. В. Делеция повторов Su(Ste) приводит к возрастанию количества сплайсированных эухроматиновых (эу) и гетерохроматиновых (гетеро) транскриптов Stellate как в ядерной, так и в цитоплазматической фракциях, выделенных из семенников дрозофилы.

4.3. Белок Aub и piRNA Su(Ste) присутствуют как в ядрах, так и в цитоплазме сперматоцитов

Деградацию мРНК Stellate осуществляет эффекторный комплекс, содержащий piRNA Su(Ste) и белок Aub. Учитывая, что деградация траискриптов Stellate происходит как в цитоплазме, так и ядрах ожидалось обнаружить Su(Ste) piRNA и белок Aub в обоих компартментах. В соответствии с этим предположением piRNA Su(Ste) были детектированы с помощью Нозерн анализа как в ядерной, так и в цитоплазматичсской фракциях (рис. 12А). В качестве зондов использовали рибопробу, детектирующую сумму Su(Ste) piRNA, или олигонуклеотидный зонд комплементарный Su(Ste)-4 piRNA, которая является наиболее представленной среди piRNA, иммунопреципитирующихся с белком Aub (Nishida et al., 2007). В ядре Su(Ste) piRNA только в 2 раза менее представлены, чем в цитоплазме (рис. 12Б), что исключает возможность объяснить присутствие piRNA в ядрах цитоплазматической контаминацией, которая не превышает 10%. Результаты Вестерн анализа указывают на присутствие белка Aub в ядерной и цитоплазматической фракциях, причём примерно в равных концентрациях (рис. 12А). Поскольку общее количество белка, выделенное из ядер сперматоцитов, было примерно в 10 раз меньше, чем количество белка, выделенное из цитоплазмы, можно заключить, что примерно 1/10 часть от общего количества белка Aub находится в ядрах сперматоцитов, а 9/10 в цитоплазме.

ли км и тип

деления Su(Ste)

ядра ииг tupa циг

сумма piRNAs SufSte)

Su(Síe)-4 piRNA

34 нг 25 ht

14 ht.14 ht

1 % ? -fr W >5

6- g 70 « g

g i 5S 50 К ¡3 ffi n> q 40 с

О =r в о

ai га а. о

□ mttRNA M ■ Su(Ste) píRNA

дикий делоция тип Su(Ste)

Рис. 12. piRNA Su(Ste) и белок Aub обнаруживаются как в ядерной, так и в цитоплазматической фракциях. А. Распределение белка Aub и piRNA SufSte) между ядерной и цитоплазмати чес кой фракциями. Вверху: Нозерн анализ с РНК зондом, комплементарным сумме piRNA SufSte). В середине: Нозерн анализ с ДНК олигонуклеотидом, комплементарным уникальной SufSte)-4 piRNA. Внизу: Вестерн анализ с антителами против белка Aub. Б. Содержание митохондриальной меч ион я новой тРНК и SufSte) piRNA (количественный расчёт сигналов из рис. ПА и 12А) в ядерной фракции в сравнении с цитоплазматической фракцией.

С помощью иммуноокрашивания была изучена локализация белка Aub в семенниках (рис. 13А). Основной сигнал от Aub (показан красным) обнаруживается в районе ядерной оболочки и напоминает так называемый nuage, являющийся распространённой перинуклеарной структурой, обнаруживаемой вокруг ядер терминальных клеток многих организмов {Eddy, 1975). При более подробном рассмотрении видно, что «кольцеобразный» сигнал состоит из диффузного н гранулярного компонентов. Отсутствие сигнала в семенниках мутантных по Aub мух подтверждает специфичность иммуноокрашивания (рис. 13А). В качестве маркёра границы ядра использовали ламин В (показан зелёным), который является ядерным белком, связанным с внутренней ядерной мембраной. Обнаружена колокализация Aub и ламина В (рис. 13А). Это указывает на локализацию части белка Aub в ядрах, что согласуется с данными фракционирования.

Для дополнительного изучения локализации Aub было проведено иммуноокрашивание препаратов выделенных ядер сперматоцитов (рис. 13Ь). Aub

детектировали преимущественно в виде гранул, которые колокализуются с ламином В. Интенсивность сигнала от Aub была значительно слабее, чем в семенниках, что согласуется с оценками результатов фракционирования, согласно которым количество белка Aub в ядрах сперматоцитов может быть примерно на порядок меньше, чем в цитоплазме. Результаты фракционирования, кОТ-ГТЦР и иммуноокрашивания указывают на то, что небольшая часть комплексов piRNA-Aub находится в ядрах сперматоцитов вблизи внутренней мембраны, где может вызывать деградацию мРНК Stellate.

л анти-Aub анти-ламин В наложение

дикий тип

анти-Aub анти-ламин В наложение

Рис. 13. Иммуноокрашивание семенников и выделенных ядер с антителами к АиЬ. А. Локализация белка АиЬ в семенниках. Проведено иммуноокрашивание семенников с антителами против АиЬ (показано красным) и ламина (показано зелёным), который является ядерным белком. Колокализация АиЬ и ламина В даёт жёлтый сигнал, возникающий при наложении красного и зелёного сигналов. Специфический сигнал от белка АиЬ был выявлен путём сравнения иммуноокрашиваний семенников мух дикого типа с семенниками мух с мутацией в гене ииЪ (использованы трансгетерозиготы аиЬИЬ!/аиЬ&'43, обозначенные -/-). Шкала - 10 (ил. Б. Локализация АиЬ в выделенных ядрах. Ядерная фракция была окрашена с антителами против АиЬ и ламина. Сигналы от АиЬ (в виде точек) колокализуются с ламином.

4.4. Изучение регуляции экспрессии репортёрной конструкции Ste-lacZ

Помимо piRNA, к основным классам коротких РНК животных относят siRNA и miRNA (см. обзор литературы). Механизмы регуляции экспрессии мишеней с помощью siRNA и miRNA изучены гораздо лучше, чем механизмы регуляции экспрессии с помощью piRNA. Представлялось интересным сравнить механизмы репрессии одной и той же мишени с помощью piRNA и siRNA. В качестве мишени были выбраны репортёрные конструкции Ste-lacZ, несущие часть гена Stellate слитую с репортёрным геном lacZ, кодирующим р-галактозидазу.

4.4.1 piRNA Su(Ste) вызывают непропорционально низкое изменение уровня мРНК Ste-lacZ по сравнению с уровнем р-галактозидазы

С помощью полуколичественного ОТ-ПЦР и метода количественной оценки активности Р-галактозидазы в семенниках изучали регуляцию экспрессии трансгенных репортёров Ste703-lacZ (предоставлена А. Тулиным) и Stel34-lacZ (Aravin et al., 2001) (рис. 14). Для проверки линейной корреляции между количеством материала, взятого-для анализа, и интенсивностью сигнала в пОТ-ПЦР и в определении активности Р-галактозидазы, брали 2-х кратные количества кДНК или лизата семенников, соответственно. Обнаружено, что при делеции повторов Su(Ste) количество мРНК Ste-lacZ увеличивается в 1,5 раза, а уровень Р-галактозидазы в 4-7 раз (рис. 15А,Б). Незначительное увеличение уровня мРНК Ste-lacZ по сравнению с изменением уровня Р-галактозидазы указывает на то, что подавление транскрипции не играет важной роли в репрессии конструкций, что согласуется с данными, полученными для эндогенных Stellate (рис. 10). Кроме того, для эндогенных генов Stellate также обнаружено, что делеция повторов Su(Ste) приводит к непропорциональному увеличению количества белка по сравнению с уровнем мРНК (возрастание количества белка Stellate более чем в 200 раз (Kotelnikov et al., 2009), что заметно превышает увеличение уровня мРНК Stellate (30-50 раз, рис. 10)). Обнаружение сходных эффектов piRNA Su(Ste) на экспрессию трансгенных конструкций Ste-lacZ и эндогенных Stellate позволяет экстраполировать результаты, полученные при изучении конструкций, на эндогенные гены. Более слабая степень дерепрессии конструкций Ste-lacZ по сравнению с эндогенными Stellate может быть объяснена тем, что репортёрные конструкции не содержат большей части последовательности Stellate и

Ст 11 |)T

i pa iiCKpiuiuHii

Рспортёрные конструкции в геноме D.melanogaster

Ste 703-lacZ Stel34-lacZ

Репортёрные конструкции, которые в составе плазм ид трансфецвровались в культуру клеток S2 D.melanogaster

hsp70-Ste-lacZ [

hsp 70-lacZ

niiPHK-Slft' или Su(StL') диРНК lucZ

hsp 70 Г* lacZ

1 ---И йшМ L

дцРН К lacZ

дцРНК GFP

Рис. 14. Репортёрные конструкции Ste-lacZ. Репортёрные конструкции Ste703-lacZ и Steli4-lacZ содержат интактный промотор Stellate или 101 нуклеотид промотора Stellate и 141 или 33 нуклеотида транскрибируемой последовательности Stellate, соответственно, слитые с репортёрным геном lacZ. Ген lacZ показан не и масштабе (его длина составляет 3308 нт.). Конструкция hsp70-Ste-lacZ содержит после hsp70 промотора первые 585 нт. транскрибируемой последовательности Stellate. Конструкции hsplO-lacZ и hsp70-GFP содержат промотор hsp70 и гены lacZ и GFP. соответственно. Двойной линией обозначены гомологичные двухцепочечные РНК, используемые для когрансфеции вместе с репортёрными конструкциями в культуру клеток S2 D.melanogaster.

Ste703-lacZ

Stel34-lacZ

дикий делеция тип Su(Ste)

□ мРНК Ste-lacZ

■ активность ß-галактозидазы

Рис. 15. Экспрессия траисгенной репортёрной конструкции Ste-lacZ в семенниках при делеции повторов Би(51е). А. Окрашивание на активность Р-галактоз ид азы семенников мух, несущих трансгенные ренортёрные конструкции Ste703-lacZ или Лс 134-1ас2. Б. Возрастание уровня мРНК $1е-1ас2 (светлые столбцы) и активиосги Р-галактозидазы (тёмные столбцы) в семенниках мух при делеции повторов 8и($1е).

комплементарные этой последовательности 8и(3(е) не участвуют в

репрессии Ste-lacZ.

4.4.2 siRNA вызывают непропорционально низкое изменение уровня мРНК Ste-lacZ по сравнению с уровнем ß-галактозидазы в культуре клеток Drosophila

Для изучения механизма репрессии конструкции Ste-lacZ с помощью siRNA культуру клеток S2 дрозофилы трансфецировали плазмидой, несущей конструкцию hsp70-Ste-lacZ, и дцРНК, которая в результате процессинга нарезается с образованием siRNA. КотрансфекЦйЯ гомологичной дцРНК (Su(Ste), Sie или lacZ) вела к 7-10 кратному уменьшению активности ß-галакгозидазы (по сравнению с котралсфекцией, в которой использовалась негомологичная дцРНК GFP), но лишь к 1,5-2 кратному уменьшению количества мРНК Ste-lacZ (рис. 16А). Таким образом, siRNA в культуре клеток, также как и piRNA в семенниках.

вызывают непропорционально низкое изменение уровня мРНК Ste-lacZ, Репрессия конструкции Ste-lacZ была одинакова при использовании полностью гомологичных дцРНК Sie и lacZ или гомологичной на 90% дцРНК Su(Ste), что указывает на то, что отсутствие гомологии на 10% между короткой РНК и мишенью не является причиной непропорционально низкого изменения уровня мРНК.

Согласно литературным данным, siRNA вызывают более сильную деградацию гомологичной мРНК, чем была обнаружена в случае мРНК Ste-lacZ (1,5-2 раза) (Ghildiyal and Zamore, 2009). Чтобы оценить эффективность siRNA-инициированной деградации в используемых экспериментальных условиях, провели нокдаун экспрессии плазмиды hsp70-GFP с помощью дцРНК GFP vi обнаружили уменьшение уровня мРНК GFP в 10 раз (рис. 16Б). Таким образом, 90% мРНК GFP деградирует в ответ на дцРНК GFP, тогда как в случае мРНК Ste-lacZ лишь 20-40% транскриптов подвергаются деградации. Было предположено, что 60-80% транскриптов Ste-lacZ защищены от деградации с помощью неизвестного механизма. Чтобы оценить, ответственна ли за защиту мРНК Ste-lacZ от деградации последовательность Stellate, был проведён нокдаун плазмиды hsp70-lacZ, не содержащей последовательности Stellate, с помощью дцРНК lacZ. Обнаружено уменьшение уровня мРНК lacZ в 5 раз (рис. 16В), что значительно сильнее эффекта дцРНК lacZ на количество мРНК Ste-lacZ (уменьшение в среднем в 1,3 раза). Таким образом, последовательность Stellate снижает эффективность siRNA-зависимой деградации мРНК Ste-lacZ.

о о а >.

□ мРНК 51е-1асг ■ активность [1-галактозидазы

вРР Эи^е) Ste

Л X Ф ш о

0=Р Би^е) дцРНК

X н л: го

□ мРНК 1асг

■ активность р-галактозидазы 100

ьс X О. £

£ 40 ¡й го С

Рис. 16. 51Я]^А-зависимая репрессия репортёриой конструкции $,1е-1ас2 в кульгуре клеток 52. А. Уровень мРНК 51е-1ас2. измеренной с помощью пОТ-ПЦР, (светлые столбцы) и активность р-галактоз ид азы (тёмные столбцы) при котрансфекции плазмнды }щ)70-8(е-1ас2 и одной из дцРМК: СРР (нет гомологии с мРНК Б1е-1ас2. используется как отрицательный контроль, принят за 100%), Бифе), Я/е или 1ас2. При нарезании дцРНК образуются которые, как видно ИЗ Ь и В, вызывают эффективную деградацию

комплементарной мРНК. Б. Уровень мРНК ОГР при котрансфекции плазмиды ИзрУО-ОРР и дцРНК ОГР или Зи(8(е). В. Уровень мРНК ¡ас2 (светлые столбцы) н активность р-галактозидазы (тёмные столбцы) при котраисфскции плазмиды Ь$р70-1ас2 и дцРНК СРР или дцРНК 1ас2.

Можно предположить, что неизвестный «маскирующий» белковый комплекс связывает определённый мотив в последовательности Sie в транскриптах Ste-lacZ и тем самым защищает их от деградации, вызванной siRNA. и подавляет их трансляцию. В то же время, некоторое количество молекул мРНК Ste-lacZ транслируется и может подвергаться siRNA-зависимой деградации (рис. 17). Таким образом, согласно данной модели причина непропорциональности в изменениях количеств транскриптов и белка заключается в том, что siRNA взаимодействуют лишь с транслирующимися транскриптами.

Схожесть результатов, полученных при исследовании piRNA- и siRNA-зависимой репрессий конструкции Ste-lacZ, позволяет предположить, что и в семенниках только немаскированная фракция тотальной цитоплазматической мРНК Ste-lacZ и Stellate подвергается piRNA-зависимой деградации и трансляции.

деградация

немаеккрованнан мРНК Ste-lacZ

маскированная мРНК Ste-lacZ

трансляция

Рис, 17. Гипотеза, объясняющая, почему в ответ на ptRNA и siRNA уровень мРНК Ste-lacZ изменяется непропорционально низко по сравнению с уровнем ß-галактозидазы. Эффекторный комплекс RISC направлен на деградацию транслирующихся транскриптов Ste-lacZ. Другие транскрипты Ste-lacZ связаны неизвестным репрессорным белком(ами), который ингибирует трансляцию этих транскриптов и защищает от RISC-зависимой деградации.

Существуют альтернат«вные гипотезы, которые могли бы объяснить полученные результаты, однако они хуже согласуются с данными экспериментов. Во-первых, можно было бы предположить, что piRNA и siRNA подавляют

трансляцию мРНК Ste-lacZ. Доводы о малой вероятности такой альтернативы приведены в разделе обсуждение результатов. Во-вторых, часть транскриптов Ste-lacZ могла бы избегать деградации из-за того, что находится в ядре. Однако, эта гипотеза плохо согласуется с данными о piRNA-зависимой деградации эндогенных транскрилтов Stellate в ядрах (см. раздел 4.2.). Кроме того, если эта гипотеза верна, то в цитоплазме должна обнаруживаться дерепрессия мРНК Ste-lacZ пропорциональная дерепрессии уровня р-галактоз идазы. Напротив, в выделенной из семенников ц и то плазматической фракции делеция повторов Su(Ste) вызывает такое же непропорционально низкое увеличение уровня мРНК Ste-lacZ, как и при анализе с использованием целых семенников (рис, 18), что делает данную гипотезу маловероятной.

□ мРНК Ste-lacZ

■ активность Д-галактозидазы

N " Л

" л о 4

Ste703-lacZ

Рис. 18. Увеличение количества мРНК регюртёрной конструкции 3!е703-1ас2 и р-галактозидазы в цитоплазматической фракции семенников при делении повторов 5и($1е).

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. Посттранскрипционная репрессия генов Stellate

Методом количественного ОТ-ПЦР показано, что делеция повторов Su(Ste) или мутация в гене aub, кодирующем piRNA £ы(57е,)-связывающий белок Aub, приводят к значительному увеличению количества сплайсированной, но не несплайсированной мРНК Stellate. Это указывает на то, что piRNA Su(Ste) преимущественно вызывают деградацию сплайсированной мРНК Stellate, а не репрессию транскрипции. Данный эффект обнаружен для генов Stellate, расположенных как в эу-, так и в гегерохроматине, что указывает на отсутствие влияния структуры хроматина на механизм репрессии и согласуется с представлениями о посттранскрипционной регуляции.

Система Ste/Su(Ste) уникальна для D.melanogaster, поскольку у других видов рода Drosophila соответствующих генов нет (Usakin et al., 2005). Амплификация повторяющихся генов Stellate и гомологичных повторов Su(Ste) в ходе эволюции вида melanogaster приводила к увеличению количества белка Stellate в сперматоцитах, что, по-видимому, нарушало процессы гаметогенеза. Вероятно, система РНКи, участвующая в репрессии повторяющихся мобильных элементов в семенниках (Kalmykova et al., 2005), была в ходе эволюции адаптирована для репрессии генов Stellate. Повторы Su(Ste) приняли на себя функцию по кодированию антисмысловых piRNA. Для репрессии были использованы белки Aub и Ago3, которые экспрессируются в сперматоцитах (Gunawardane et al., 2007; Li et al., 2009; Nishida et al., 2007). Наиболее простое объяснение посттранскрипционного механизма репрессии генов Stellate может заключаться в том, что это единственный способ сайленсинга, который могут осуществлять белки Aub и Ago3.

Альтернативной причиной выбора механизма посттранскрипционной репрессии может быть необходимость высокого уровня репрессии генов Stellate. Возможно, подавление транскрипции не могло бы обеспечить необходимый уровень репрессии генов Stellate, поскольку, при этом механизме, эффекторный комплекс обнаруживает локус-мишень за счёт связывания с РНК, которая транскрибируется этим локусом (Moazed, 2009). Вследствие этого, такая репрессия требует частичной транскрипции подавляемого локуса и, вероятно, множественность повторов Stellate приводит к тому, что такая транскрипция

давала бы слишком высокий уровень мРНК Stellate. Посттранскрипдионная деградация мРНК Stellate обеспечивает очень сильную репрессию белка Stellate (согласно Вестерн анализу, проведённому JI.B. Олениной в нашей лаборатории, при делеции повторов Su(Ste) уровень белка Stellate возрастает более чем в 200 раз (Kotelnikov et al., 2009)), что может быть необходимо для нормального функционирования терминальных тканей самцов.

5.2. Деградация транскриптов Stellate в ядрах

Показано, что при делеции повторов Su(Ste) количество сплайсированных транскриптов Stellate возрастает как в цитоплазматической, так и в ядерной фракциях, выделенных из семенников. В ядерной фракции уровень транскриптов гетеро- и эухроматиновых генов Stellate в среднем увеличивается в 15 раз, что лишь в 2-2,5 раза меньше, чем в цитоплазме. Такая заметная дерепрессия в ядерной фракции не может возникать в результате загрязнения цитоплазмой, поскольку с помощью Вестерн анализа с антителами к у-тубулину (белок цитоплазмы) и калнексину (трансмембранный белок ЭПР) а также Нозерн анализа с зондом к митохондриальной метиониновой тРНК показано, что ядерная фракция практически не содержит цитоплазматических белков и РНК (степень загрязнения по РНК не превышает 10%). Следовательно, деградация мРНК Stellate с помощью piRNA Su(Ste) происходит в ядрах сперматоцитов. Большая степень дерепрессии Stellate в цитоплазматической фракции указывает на то, что там также происходят процессы деградации мРНК Stellate. Таким образом, в данной работе впервые была показана способность piRNA вызывать деградацию мишеней в ядерном компаргменте клетки.

К настоящему моменту, локализация процесса РНКи-зависимой деградации РНК-мишени изучена недостаточно. Считается, что основная часть инициированного siRNA или miRNA посгтранскрипционного сайленсинга происходит в цитоплазме (Carthew and Sontheimer, 2009). Этот вывод основывается на нескольких наблюдениях. Во-первых, по данным иммуноокрашивания большая часть белков подсемейства Ago в клетках дрозофилы и млекопитающих локализуется в цитоплазме (Parker and Sheth, 2007). Во-вторых, в составе siRISC находят белки, взаимодействующие с рибосомой (Ishizuka et al., 2002). В-третьих, miRNA-зависимая репрессия трансляции направлена на транслирующиеся мРНК цитоплазмы (Carthew and Sontheimer,

2009). Однако, белки подсемейства Ago находят и в ядрах (Ohrt et al., 2008; Robb et al., 2005). Показано, что в культуре клеток человека импортин 8 необходим для транспорта белка Ago2 в ядра (Weinmann et al., 2009). Тот факт, что клетка использует специальный аппарат для транспорта Ago2 в ядра указывает на важную роль этого белка в ядерном компартменте. Эта роль может заключаться как в подавлении транскрипции (Janowski et al., 2006), так и в деградации мРНК-мишеней в ядре (Robb et al., 2005). Обнаруженная в данной работе деградация мРНК Stellate в ядрах и цитоплазме сперматоцитов указывает на сходство механизмов piRNA- и siRNA-зависимой репрессии, осуществляющих деградацию мРНК-мишеней как в цитоплазматическом, так и в ядерном компартментах.

5.3. Локализация белка Aub в сперматоцитах

Белок Aub, связывающий piRNA Su(Ste), а также сами piRNA Su(Ste) обнаружены как в ядерной, так и в цитоплазматической фракциях лизатов семенников. Иммуноокрашивание с антителами к Aub показало его наличие в выделенных ядрах, а также в цитоплазме сперматоцитов вблизи ядерной мембраны. Границу ядра выявляли с помощью иммуноокрашивания с антителами к ламину В, который является ядерным белком, ассоциированным с внутренней ядерной мембраной. Сигналы от Aub и ламина В частично перекрываются, указывая на присутствие Aub в ядрах вблизи внутренней ядерной мембраны. Каких-либо других локусов внутриядерной локализации Aub не детектировано. Таким образом, обнаружение белка Aub в ядрах сперматоцитов согласуется с данными о деградации мРНК Stellate в ядрах.

Локализация Aub в семенниках, обнаруженная в данной работе, напоминает опубликованную ранее (Snee and Macdonald, 2004). Однако в работе Snee с соавторами не использовался маркёр, показывающий границу ядерной мембраны, что не позволило установить наличие Aub в ядрах.

В яичниках дрозофилы значительная часть белка Aub локализуется в перинуклеарной структуре nuage (см. обзор литературы). Nuage представляет собой электронноплотную структуру, видимую в световой или электронный микроскопы вокруг ядер терминальных клеток многих животных. По мере изучения РНКи, процессы piRNA-зависимого сайленсинга стали связывать с nuage, поскольку с этой структурой колокализуется ряд белков, необходимых для функционирования piRNA. Белок Vasa, являющийся компонентом nua^e,

обнаруживается в ядрах питающих клеток яйцевой камеры (Findley et al., 2003). Другой компонент nuage в яичниках, белок Maelstrom, функционирует как шатл, перемещающийся между nuage и ядром питающей клетки (Findley et al., 2003). Таким образом, присутствие в ядрах характерно, по крайней мере, для некоторых компонентов nuage, и обнаруженная локализация белка Aub в ядрах сперматоцитов не является уникальной. Возможно, использование маркёров, показывающих расположение ядерной мембраны, позволит обнаружить и другие компоненты nuage на внутренней поверхности ядер.

Вероятная причина локализации в ядрах сперматоцитов белка Aub и связанных с ним piRNA Su(Ste) заключается в недостаточной эффективности деградации мРНК Stellate в цитоплазме и, следовательно, необходимости дополнительной деградации этой мРНК в ядрах. Однако, молено предположить и альтернативное объяснение. Возможно, причиной локализации белка Aub в ядрах является то, что только в этом компартменте может происходить образование piRNA Su(Ste) (что сопровождается одновременной загрузкой этих коротких РНК в белок Aub). Это приводит к появлению в ядрах репрессорного комплекса Aub/piRNA Su(Ste), который вызывает деградацию ядерной мРНК Stellate. То есть, деградация мРНК Stellate в ядрах может быть сопутствующим процессом, который не вносит существенного вклада в общую репрессию Stellate'. Действительно, антисмысловые транскрипты Su(Ste), являющиеся предшественниками piRNA, обнаруживаются только в ядрах сперматоцитов (Aravin et al. 2004). Антисмысловые транскрипты Su(Ste) нё подвергаются сплайсингу и полиаденилированию, т.е. процессам, которые увеличивают эффективность экспорта транскриптов из ядра. Поэтому транспорт антисмысловых транскриптов Su(Ste) из ядер может быть затруднён. Исходя из этого можно предположить, что нарезание антисмысловой РНК SufStej происходит непосредственно в ядрах сперматоцитов. В дальнейших исследованиях необходимо определить локализацию процесса биогенеза piRNA Su(Ste).

5.4. Избирательность деградации, направляемой piRNA Su(Ste)

Количество мРНК репортёрной конструкции Ste-lacZ в ответ на гомологичные piRNA или siRNA уменьшается значительно слабее,.чем количество кодируемой этой конструкцией р-галактозидазы. В культуре клеток,

где показана эффективная деградация мРНК lacZ в ответ на siRNA, не происходит столь же эффективной деградации мРНК Ste-lacZ, что указывает на то, что последовательность Stellate защищает мРНК от деградации. Схожесть результатов, полученных при изучении репрессии репортёрных конструкций Ste-lacZ с помощью piRNA и siRNA, позволяет предположить, что оба типа коротких РНК подавляют экспрессию конструкций по единому механизму. Предполагается, что деградация направлена лишь на транслирующиеся транскрипты Ste-lacZ и существует пул защищенных от деградации, нетранслирующихся транскриптов Ste-lacZ («маскированные транскрипты»), что объясняет причину непропорционально низкого изменения уровня мРНК по сравнению с белком (рис. 19).

Существуют две дополнительные интерпретации полученных данных. Можно было бы предположить, что отсутствие значительного изменения уровня мРНК Ste-lacZ, объясняется тем, что piRNA и siRNA могут подавлять трансляцию этой мРНК. Однако, «трансляционная» гипотеза хуже согласуется с данными литературы. Во-первых, способность piRNA подавлять трансляцию к настоящему моменту не была показана, но многие эксперименты свидетельствуют о том, что белки подсемейства Piwi, связывающие piRNA, могут вызывать деградацию мРНК-мишени (Gunawardane et al., 2007; Nishida et al., 2007; Saito et al., 2006). Во-вторых, в культуре клеток эксперимент был проведён таким образом, чтобы siRNA вызывали только деградацию мРНК-мишени, поскольку для репрессии была использована дцРНК, полностью (100%) комплементарная мРНК Ste-lacZ (дцРНК Ste и lacZ) (Forstemann et al., 2007; Tomari et al., 2007).

Вторая альтернативная гипотеза заключается в том, что часть транскриптов Ste-lacZ задерживается в ядре и таким способом избегает деградации с помощью piRNA или siRNA. Однако, нами показано, что в ядрах сперматоцитов piRNA Su(Ste) могут вызывать деградацию мРНК Stellate. Кроме того, эта гипотеза предполагает, что в цитоплазме сперматоцитов при делеции повторов Su(Ste) уровень дерепрессии мРНК Ste-lacZ будет пропорционален степени дерепрессии Р-галактозидазы. Однако, в выделенной из семенников цитоплазме обнаружена такая же непропорционально низкая дерепрессия мРНК Ste-lacZ, как и при использовании целых семенников. В целом, приведённые выше данные указывают на предпочтительность для объяснения результатов гипотезы о маскировании, хотя детали этого процесса и, в частности, белок(ки), участвующие в маскировании мРНК Ste-lacZ, ещё предстоит выявить.

Обнаруженные особенности механизма регуляции репортёрных конструкций Ste-lacZ показаны и для эндогенных Stellate. При делеции повторов Su(Ste) количество мРНК Stellate возрастает в 30-50 раз (рис. 10), а количество белка Stellate более, чем в 200 раз (Kotelnikov et al., 2009). Более слабый эффект делеции повторов Su(Ste) на экспрессию конструкций Ste-lacZ по сравнению с эндогенными Stellate может быть объяснён меньшей длиной последовательности Stellate в мРНК Ste-lacZ. Это сужает спектр эффекторных комплексов Aub/piRNA Sn(Ste), участвующих в репрессии. Таким образом, гипотеза о маскировании может быть распространена и на эндогенные Stellate. Согласно этой гипотезе, экспрессия эндогенных Stellate и репортёрных конструкций Ste-lacZ подавляется не только с помощью piRNA Su (Ste) -з ави с и м о й деградации мРНК в ядре и цитоплазме, но и с помощью неизвестного белка(ов), ингибирующего трансляцию (рис. 19).

По-видимому, среди смысловых транскриптов Sa(Ste) доля транслирующихся мРНК меньше, чем среди мРНК Stellate. Это может быть объяснено тем, что нуклеотидные замены в мРНК Sn(Ste), отличающие эту мРНК от Stellate, приводят к возникновению сайтов альтернативного сплайсинга и преждевременным стоп кодонам (Balakireva et al., 1992). В соответствии с этим, количество смысловых транскриптов Su(Ste) при мутации в гене аиЪ увеличивается в 5 раз слабее, чем количество мРНК Stellate, несмотря на то, что piRNA Su(Ste) имеют более высокую степень комплементарности с мРНК Su(Ste) (Vagin et al., 2006). Вероятно, piRNA Sn(Ste) преимущественно вызывают деградацию более активно транслирующейся мРНК Stellate.

Предполагаемые свойства piRNA-зависимого сайлеисинга генов Stellate могут быть распространены и на репрессию мобильных элементов. Показано, что в семеиниках дрозофилы мутация в гене piwi приводит к существенному увеличению скорости транспозиций ретротраиспозона mdgl при незначительном увеличении количества мРНК mdgl (Kalmykova et al., 2005). Вероятно, piRNA вызывают преимущественную деградацию трансляционно активной мРНК транспозонов.

п о с ле до ва т е л ь-ность

гомологичная Stellate

транспозон hoppel

повторы St/fSfe)

антисмысловои транскрипт Su(Ste)

цитоплазма

гены Stellate

мРНК Stellate

Рис. 19. Предполагаемый механизм посггранскрипционпой репрессии генов Stellate с помощью повторов Su(Ste). Транскрипция повторов Su(Ste), иниииируемая промотором транспозона hoppel, приводит к образованию антисмысловых транскриптов Su (St е), которые нарезаются в ядре или в цитоплазме (в данный момент это неизвестно) с образованием piRNA Su(Ste). Белок Aub связывает piRNA Su(Ste) и вызывает деградацию мРНК Stellate в ядре (1) или в цитоплазме (2), Предполагается, что неизвестный репрессорный белок(ки) связывает остальные транскрипты Stellate, подавляя их трансляцию и защищая от деградации, вызываемой комплексом Aub/piRNA Su(Ste) (3).

Зависимость Su(Ste) piRNA-инициированной деградации мРНК Ste-lacZ и Stellate от регуляторных (в данном случае маскирующих) белков, связанных с этими мРНК, хорошо согласуется с существующими представлениями о механизмах репрессии с помощью siRNA и miRNA. В яичниках дрозофилы трансляционно неактивные маскированные мРНК не подвергаются siRNA-зависимой деградации, а после снятия трансляционного блока начинают деградировать (Kennerdell et al., 2002). В терминальных тканях D.reriu белок Dndl связывается с мРНК гена nanosJ вблизи сайтов отжига miR-430, что не позволяет этой miRNA осуществить репрессию (Kedde et al., 2007; Mishima et al. 2006). По-видимому, процессы сайленсинга с помощью коротких РНК, как и другие основные пути регуляции экспрессии, сами подвергаются активной регуляции и, таким образом, встраиваются в состав единой регуляторной сети, определяющей жизнедеятельность клетки.

5.5. Оценка вкладов Su(Ste) piRNA-зависимой деградации и трансляционной репрессии в подавление экспрессии генов Stellate

Для создания цельной картины репрессии генов Stellate важно сравнить вклады Su(Ste) piRNA-зависимой деградации и трансляционной репрессии в общий сайленсинг. Обозначим количество транслируемой мРНК Stellate в семенниках мух дикого типа за X, а количество нетранслируемой РНК за Y. При делеции повторов Su(Ste) количество белка Stellate увеличилось более чем в 200 раз (Kotelnikov et al., 2009) и, если считать, что эффективность трансляции не изменилась, то количество транслируемой мРНК Stellate будет 200Х. Примем также допущение, что количество нетранслируемой мРНК Stellate не изменилось и осталось Y. Общее количество мРНК Stellate при делеции повторов Su(Ste) увеличилось в 42 раза (в среднем для эу- и гетерохроматиновых копий). В результате получаем уравнение:

(X+Y)*42=200X+Y

42X+42Y=200X+Y

Получается, что в семенниках дикого типа нетранслируемой мРНК Stellate в 3,9 раза больше, чем транслируемой. При отсутствии Su(Ste) piRNA-зависимой репрессии количество нетранслируемой мРНК меньше, чем транслируемой в 51 раз (200/3,9). Таким образом, репрессия трансляции не может компенсировать Su(Ste) piRNA-зависимую репрессию. Если нарушить трансляционную репрессию, то, согласно расчётам, значительного увеличения количества белка Stellate не произойдёт. Таким образом, Su(Ste) piRNA вносят гораздо больший вклад в репрессию генов Stellate, чем предполагаемый механизм трансляционной репрессии.

Подобный расчёт был проведён и для репортёрных конструкций Ste-lacZ (использованы средние значения дерепрессии по мРНК и ß-галактозидазе для конструкций Ste703-lacZ и Stel34-lacZ)\

(X+Y)*1,24=5,57X+Y 1,24X+1,24 Y=5,57X+Y 0,24Y=4,33X Y=18X

Вклад трансляционной репрессии в сайленсинг репортёрных конструкций Ste-lacZ больше, чем вклад Su(Ste) piRNA-зависимой репрессии, что, по-видимому, объясняется меньшей длиной последовательности Stellate в конструкции.

Приведённые расчёты могут быть использованы лишь для грубой оценки, поскольку основываются на ряде допущений, однако они позволяют предположить этапы возникновения системы репрессии генов Stellate в эволюции D.melanogaster. Вероятно, на первом этапе усиливающаяся в ходе эволюции экспрессия генов Stellate подавлялась за счёт репрессии трансляции. Был использован повсеместно экспрессирующийся репрессорный белок(ки), поскольку трансляционная репрессия конструкции Ste-lacZ происходит и в культуре клеток S2, полученной на основе эмбриональных стволовых клеток дрозофилы. На. втором этапе, когда экспрессия генов Stellate возросла так сильно, что не могла быть подавлена за счёт трансляционной репрессии, для сайленсинга была приспособлена семенникспецифичная система РНКи, которая изначально * использовалась для репрессии мобильных элементов. Ключевым событием стала появившаяся способность антисмысловой РНК повторов Su(Ste) нарезаться в результате первичного процессинга с образованием piRNA. Вероятно, этому способствовало то, что транскрипция антисмысловой РНК Su(Ste) инициируется с промотора транспозона hoppel, который репрессируется с помощью piRNA в семенниках (Aravin et al., 2003). Таким образом, репрессия трансляции не играет существенной роли в сайленсинге генов Stellate, однако она могла вносить важный вклад в сайленсинг Stellate на более ранних этапах эволюции D. melanogaster.

6. выводы

Изучены особенности механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью piRNA Su(Ste) у Drosophila melanogaster.

1) Делеция повторов Su(Ste) или мутация в гене аыЬ приводят к значительному накоплению сплайсированных, но не несплайсированных транскриптов эу- и гетерохроматиновых копий генов Stellate в семенниках. Полученные данные показывают, что piRNA Su(Ste) преимущественно вызывают деградацию мРНК Stellate.

3) Подавление экспрессии репортёриой конструкции Ste-lacZ как с помощью piRNA в семенниках, так и с помощью siRNA в культуре клеток сопровождается непропорционально сильным снижением активности (3-галактозидазы но сравнению со снижением уровня мРНК Ste-lacZ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Котельников, Роман Николаевич, Москва

1. Aravin, A. A., Hannon, G. J., and Brennecke, J. (2007a). The Piwi-piRNA pathway provides an adaptive defense in the transposon arms race. Science 318, 761-764.

2. Aravin, A. A., Klenov, M. S., Vagin, V. V., Bantignies, F., Cavalli, G., and Gvozdev, V. A. (2004). Dissection of a natural RNA silencing process in the Drosophila melanogaster germ line. Mol Cell Biol 24, 6742-6750.

3. Aravin, A. A., Lagos-Quintana, M., Yalcin, A., Zavolan, M., Marks, D., Snyder, B., Gaasterland, T., Meyer, J., and Tuschl, T. (2003). The small RNA profile during Drosophila melanogaster development. Dev Cell 5, 337-350.

4. Aravin, A. A., Naumova, N. M., Tulin, A. V., Vagin, V. V., Rozovsky, Y. M., and Gvozdev, V. A. (2001). Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr Biol 11, 1017-1027.

5. Aravin, A. A., Sachidanandam, R., Bourc'his, D., Schaefer, C., Pezic, D., Toth, K. F., Bestor, T., and Hannon, G. J. (2008). A piRNA pathway primed by individual transposons is linked to de novo DNA methylation in mice. Mol Cell 31, 785799.

6. Aravin, A. A., Sachidanandam, R., Girard, A., Fejes-Toth, K., and Hannon, G. J. (2007b). Developmentally regulated piRNA clusters implicate MILI in transposon control. Science 316, 744-747.

7. Baek, D., Villen, J., Shin, C., Camargo, F. D., Gygi, S. P., and Bartel, D. P. (2008). The impact of microRNAs on protein output. Nature 455, 64-71.

8. Balakireva, M. D., Shevelyov, Y., Nurminsky, D. I., Livak, K. J., and Gvozdev, V. A. (1992). Structural organization and diversification of Y-linked sequences comprising Su(Ste) genes in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res 20, 3731-3736.

9. Bartel, D. P. (2004). MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116, 281-297.

10. Bartel, D. P. (2009). MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-233.

11. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Doerks, T., Stark, A., Bork, P., and Izaurralde, E. (2006). mRNA degradation by miRNAs and GW182 requires both CCR4:NOT deadenylasc and DCP1:DCP2 decapping complexes. Genes Dev 20, 1885-1898.

12. Bernard, P., Maure, J. F., Partridge, J. F., Genier, S., Javerzat, J. P., and Allshire, R.

13. C. (2001). Requirement of heterochromatin for cohesion at centromeres. Science 294, 2539-2542.

14. Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., and Sander, C. (2008). The microRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Res 36, D149-153.

15. Bhattacharyya, S. N., Habermacher, R., Martine, U., Closs, E. I., and Filipowicz, W. (2006). Relief of microRNA-mcdiated translational repression in human cells subjected to stress. Cell J25, 1111-1124.

16. Brennecke, J., Aravin, A. A., Stark, A., Dus, M., Kellis, M., Sachidanandam, R. and Hannon, G. J. (2007). Discrete small RNA-generating loei as master regulatois of transposon activity in Drosophila. Cell 128, 1089-1103.

17. Brennecke, J., Malone, C. D., Aravin, A. A., Sachidanandam, R., Stark, A., and Hannon, G. J. (2008). An epigenetic role for maternally inherited pillNAs in transposon silencing. Science 322, 1387-1392.

18. Brennecke, J., Stark, A., Russell, R. B„ and Cohen, S. M. (2005). Principles of microRNA-target recognition. PLoS Biol 3, e85.

19. Bucheton, A., Paro, R., Sang, H. M., Pelisson, A., and Finnegan, D. J. (1984). The molecular basis of I-R hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster: identification, cloning, and properties of the I factor. Cell 38, 153-163.

20. Buhler, M., and Moazed, D. (2007). Transcription and RNAi in heterochromatic gene silencing. Nat Struct Mol Biol 14, 1041-1048.

21. Buhler, M., Verdel, A., and Moazed, D. (2006). Tethering RITS to a nascent transcript initiates RNAi- and heterochromatin-dependent gene silencing. Cell 125, 873-886.

22. Cai, X., Hagedorn, C. H., and Cullen, B. R. (2004). Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. Rna 10, 1957-1966.

23. Carmell, M. A., Girard, A., van de Kant, H. J., Bourc'his, D., Bestor, T. H., de Rooij,

24. D. G., and Hannon, G. J. (2007). MIWI2 is essential for spermatogenesis and repression of transposons in the mouse male germline. Dev Cell 12, 503-514.

25. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., and Hannon, G. J. (2002). The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev 16, 2733-2742.

26. Carthew, R. W., and Sontheimer, E. J. (2009). Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-655.

27. Castro, J. P., and Carareto, C. M. (2004). Drosophila melanogaster P transposable elements: mechanisms of transposition and regulation. Genetica 121, 107-118.

28. Caudy, A. A., Myers, M., Hannon, G. J., and Hammond, S. M. (2002). Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interference machinery. Genes Dev 16, 2491-2496.

29. Ceci, M., Gaviraghi, C., Gorrini, C., Sala, L. A., Offenhauser, N., Marchisio, P. C., and Biffo, S. (2003). Release of eIF6 (p27BBP) from the 60S subunit allows 80S ribosome assembly. Nature 426, 579-584.

30. Chambeyron, S., and Bucheton, A. (2005). I elements in Drosophila: in vivo retrotransposition and regulation. Cytogenet Genome Res 110, 215-222.

31. Chen, Y., Pane, A., and Schupbach, T. (2007). Cutoff and aubergine mutations result in retrotransposon upregulation and checkpoint activation in Drosophila. Curr Biol 17, 637-642.

32. Chendrimada, T. P., Finn, K. J., Ji, X., Baillat, D., Gregory, R. I., Liebhaber, S. A., Pasquinelli, A. E., and Shiekhattar, R. (2007). MicroRNA silencing through RISC recruitment of eIF6. Nature 447, 823-828.

33. Chendrimada, T. P., Gregory, R. I., Kumaraswamy, E., Norman, J., Cooch, N., Nishikura, K., and Shiekhattar, R. (2005). TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing. Nature 436, 740-744.

34. Chu, C. Y., and Rana, T. M. (2006). Translation repression in human cells by microRNA-induced gene silencing requires RCK/p54. PLoS Biol 4, e210.

35. Cook, H. A., Koppetsch, B. S., Wu, J., and Theurkauf, W. E. (2004). The Drosophila SDE3 homolog armitage is required for oskar mRNA silencing and embryonic axis specification. Cell 116, 817-829.

36. Cox, D. N., Chao, A., Baker, J., Chang, L., Qiao, D., and Lin, H. (1998). A novel class of evolutionarily conserved genes defined by piwi are essential for stem cell self-renewal. Genes Dev 12, 3715-3727.

37. Cox, D. N., Chao, A., and Lin, H. (2000). piwi encodes a nucleoplasmic factor whose activity modulates the number and division rate of germline stem cells. Development 127, 503-514.

38. Cummings, M. R., Brown, N. M., and King, R. C. (1971). The cytology of the vitellogenic stages of oogenesis in Drosophila melanogaster. 3. Formation of the vitelline membrane. Z Zellforsch Mikrosk Anat 118, 482-492.

39. Deng, W., and Lin, H. (2002). miwi, a murine homolog of piwi, encodes a cytoplasmic protein essential for spermatogenesis. Dev Cell 2, 819-830.

40. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., and Hannon, G. J. (2004). Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 432, 231-235.

41. Deshpande, G., Calhoun, G., and Schedl, P. (2005). Drosophila argonaute-2 is required early in embryogenesis for the assembly of centric/centromeric heterochromatin, nuclear division, nuclear migration, and germ-cell formation. Genes Dev 19, 1680-1685.

42. Desset, S., Buchon, N., Meignin, C., Coiffet, M., and Vaury, C. (2008). In Drosophila melanogaster the COM locus directs the somatic silencing of two retrotransposons through both Piwi-dependent and -independent pathways. PLoS One 3, el526.

43. Desset, S., Meignin, C., Dastugue, B., and Vaury, C. (2003). COM, a heterochromatic locus governing the control of independent endogenous retroviruses from Drosophila melanogaster. Genetics 164, 501-509.

44. Ding, S. W., and Voinnet, O. (2007). Antiviral immunity directed by small RNAs. Cell 750,413-426.

45. Djikeng, A., Shi, H., Tschudi, C., Shen, S., and Ullu, E. (2003). An siRNA ribonucleoprotein is found associated with polyribosomes in Trypanosoma brucei. Rna 9, 802-808.

46. Doench, J. G., Petersen, C. P., and Sharp, P. A. (2003). siRNAs can function as miRNAs. Genes Dev 17, 438-442.

47. Easow, G., Teleman, A. A., and Cohen, S. M. (2007). Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. Rna 13, 1198-1204.

48. Eddy, E. M. (1975). Germ plasm and the differentiation of the germ cell line. Int Rev Cytol 43, 229-280.

49. Eulalio, A., Behm-Ansmant, I., Schweizer, D., and Izaurralde, E. (2007a). P-body formation is a consequence, not the cause, of RNA-mediated gene silencing. Mol Cell Biol 27, 3970-3981.

50. Eulalio, A., Helms, S., Fritzsch, C., Fauser, M., and Izaurralde, E. (2009a). A C-terminal silencing domain in GW182 is essential for miRNA function. Rna 15, 1067-1077.

51. Eulalio, A., Huntzinger, E., and Izaurralde, E. (2008a). Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing. Cell 132, 9-14.

52. Eulalio, A., Huntzinger, E., and Izaurralde, E. (2008b). GW182 interaction with Argonaute is essential for miRNA-mediated translational repression and mRNA dccay. Nat Struct Mol Biol 15, 346-353.

53. Eulalio, A., Huntzinger, E., Nishihara, T., Rehwinkel, J., Fauser, M., and Izaurralde, E. (2009b). Deadenylation is a widespread effect of miRNA regulation. Rna 15, 21-32.

54. Farh, K. K., Grimson, A., Jan, C., Lewis, B. P., Johnston, W. K., Lim, L. P., Burge, C. B., and Bartel, D. P. (2005). The widespread impact of mammalian MicroRNAs on mRNA repression and evolution. Science 310, 1817-1821.

55. Filbin, M. E., and Kieft, J. S. (2009). Toward a structural understanding of IRES RNA function. Curr Opin Struct Biol 19, 261-216.

56. Findley, S. D., Tamanaha, M., Clegg, N. J., and Ruohola-Baker, H. (2003). Maelstrom, a Drosophila spindle-class gene, encodes a protein that colocalizes with Vasa and RDEl/AGOl homolog, Aubergine, in nuage. Development 130, 859-871.

57. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.

58. Forstemann, K., Horwich, M. D., Wee, L., Tomari, Y., and Zamore, P. D. (2007). Drosophila microRNAs are sorted into functionally distinct argonaute complexes after production by dicer-1. Cell J30, 287-297.

59. Friedman, R. C., Farh, K. K., Bürge, C. B., and Bartel, D. P. (2009). Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res 19, 92105.

60. Gaidatzis, D., van Nimwegen, E., Hausser, J., and Zavolan, M. (2007). Inference of miRNA targets using evolutionary conservation and pathway analysis. BMC Bioinformatics 8, 69.

61. Ghildiyal, M., and Zamore, P. D. (2009). Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet 10, 94-108.

62. Gingras, A. C., Raught, B., and Sonenberg, N. (1999). eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem 68, 913-963.

63. Giraldez, A. J., Mishima, Y., Rihel, J., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Inoue, K., Enright, A.T., and Schier, A. F. (2006). Zebrafish MiR-430 promotes deadenylation and clcarance of maternal mRNAs. Science 312, 75-79.

64. Girard, A., Sachidanandam, R., Hannon, G. J., and Carmell,, M. A. (2006). A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins. Nature 442, 199-202.

65. Golden, D. E., Gerbasi, V. R., and Sontheimer, E. J. (2008). An inside job for siRNAs. Mol Cell 31, 309-312.

66. Gregory, R. I., Chendrimada, T. P., Cooch, N., and Shiekhattar, R. (2005). Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing. Cell 123,631-640.

67. Grewal, S. I. (2000). Transcriptional silencing in fission yeast. J Cell Physiol 184, 311-318.

68. Grewal, S. I., and Elgin, S. C. (2007). Transcription and RNA interference in the formation of heterochromatin. Nature 447, 399-406.

69. Griffiths-Jones, S., Saini, FI. K., van Dongcn, S., and Enright, A. J. (2008). miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res 36, D154-158.

70. Grimson, A., Farh, K. K., Johnston, W. K., Garrett-Engele, P., Lim, L. P., and Bartel, D. P. (2007). MicroRNA targeting specificity in mammals: determinants beyond seed pairing. Mol Cell 27, 91-105.

71. Gu, S., and Rossi, J. J. (2005). Uncoupling of RNAi from active translation in mammalian cells. Rna 11, 38-44.

72. Guang, S., Bochner, A. F., Pavelec, D. M., Burkhart, K. B., Harding, S., Lachowiec, J., and Kennedy, S. (2008). An Argonaute transports siRNAs from the cytoplasm to the nucleus. Science 321, 537-541.

73. Gunawardane, L. S., Saito, K., Nishida, K. M., Miyoshi, K., Kawamura, Y., Nagami, T., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2007). A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5' end formation in Drosophila. Science 315, 15871590.

74. Haley, B., and Zamore, P. D. (2004). Kinetic analysis' of the RNAi enzyme complex. Nat Struct Mol Biol 11, 599-606.

75. Hall, I. M., Noma, K., and Grewal, S. I. (2003). RNA interference machinery regulates chromosome dynamics during mitosis and meiosis in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 193-198.

76. Hamilton, A., Voinnet, O., Chappell, L., and Baulcombe, D. (2002). Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. Embo J 21, A61X-A619.

77. Hammell, M., Long, D., Zhang, L., Lee, A., Carmack, C. S., Han, M., Ding, Y., and Ambros, V. (2008). mirWIP: microRNA target prediction based on microRNA-containing ribonucleoprotein-enriched transcripts. Nat Methods 5, 813-819.

78. Han, J., Lee, Y., Yeom, K. II., Kim, Y. K., Jin, H., and Kim, V. N. (2004). The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes Dev 18', 3016-3027.

79. Han, J., Lee, Y., Yeom, K. H., Nam, J. W., Heo, I., Rhee, J. K., Sohn, S. Y., Cho, Y., Zhang, B. T., and Kim, V. N. (2006). Molecular basis for the recognition of primary microRNAs by the Drosha-DGCR8 complex. Cell 125, 887-901.

80. Harris, A. N., and Macdonald, P. M. (2001). Aubergine encodes a Drosophila polar granule component required for pole cell formation and related to eIF2C. Development 128, 2823-2832.

81. Hartig, J. V., Tomari, Y., and Forstemann, K. (2007). piRNAs—the ancient hunters of genome invaders. Genes Dev 21, 1707-1713.

82. Haynes, K. A., Caudy, A. A., Collins, L., and Elgin, S. C. (2006). Element 1360 and RNAi components contribute to HP 1-dependent silencing of a pericentric reporter. Curr Biol 16, 2222-2227.

83. Horwich, M. D., Li, C., Matranga, C., Vagin, V., Farley, G., Wang, P., and Zamore, P. D. (2007). The Drosophila RNA methyltransferase, DmHenl, modifies germline piRNAs and single-stranded siRNAs in RISC. Curr Biol 17, 12651272.

84. Humphreys, D. T., Westman, B. J., Martin, D. I., and Preiss, T. (2005). MicroRNAs control translation initiation by inhibiting eukaryotic initiation factor 4E/cap and poly(A) tail function. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 16961-16966.

85. Hutvagner, G. (2005). Small RNA asymmetry in RNAi: function in RISC assembly and gene regulation. FEBS Lett 579, 5850-5857.

86. Hutvagner, G., and Simard, M. J. (2008). Argonaute proteins: key players in RNA silencing. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 22-32.

87. Jakymiw, A., Lian, S., Eystathioy, T., Li, S., Satoh, M., Ilamel, J. C., Fritzler, M. J., and Chan, E. K. (2005). Disruption of GW bodies impairs mammalian RNA interference. Nat Cell Biol 7, 1267-1274.

88. Janowski, B. A., Huffman, K. E., Schwartz, J. C., Ram, R., Nordsell, R., Shames, D. S., Minna, J. D., and Corey, D. R. (2006). Involvement of AGO 1 and AG02 in mammalian transcriptional silencing. Nat Struct Mol Biol 13, 787-792.

89. Jing, Q., Huang, S., Guth, S., Zarubin, T., Motoyama, A., Chen, J., Di Padova, F., Lin, S. C., Gram, H., and Han, J. (2005). Involvement of microRNA in AU-rich element-mediated mRNA instability. Cell 120, 623-634.

90. Kalmykova, A. I., Dobritsa, A. A., and Gvozdev, V. A. (1998). Su(Ste) diverged tandem repeats in a Y chromosome of Drosophila melanogaster are transcribed and variously processed. Genetics 148, 243-249.

91. Kalmykova, A. I., Klenov, M. S., and Gvozdev, V. A. (2005). Argonaute protein PIWI controls mobilization of retrotransposons in the Drosophila male germline. Nucleic Acids Res 33, 2052-2059.

92. Kedde, M., Strasser, M. J., Boldajipour, B., Oude Viielink, J. A., Slanchev, K., 1c Sage, C., Nagel, R., Voorhoeve, P. M., van Duijse, J., Orom, U. A., et al (2007). RNA-binding protein Dndl inhibits microRNA access to target mRNA. Cell 131, 1273-1286.

93. Kennerdell, J. R., Yamaguchi, S., and Carthew, R. W. (2002). RNAi is activated during Drosophila oocyte maturation in a manner dependent on aubergine and spindle-E. Genes Dev 16, 1884-1889.

94. Kertesz, M., Iovino, N., Unnerstall, U., Gaul, U., and Segal, E. (2007). The role of site accessibility in microRNA target recognition. Nat Genet 39, 1278-1284.

95. Khvorova, A., Reynolds, A., and Jayasena, S. D. (2003). Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115, 209-216.

96. Kidwell, M. G. (1983). Evolution of hybrid dysgenesis determinants in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A 80, 1655-1659.

97. Kidwell, M. G., Kidwell, J. F., and Sved, J. A. (1977). Hybrid Dysgenesis in DROSOPHILA MELANOGASTER: A Syndrome of Aberrant Traits Including Mutation, Sterility and Male Recombination. Genetics 86, 813-833.

98. Kim, D. H., Saetrom, P., Snove, O., Jr., and Rossi, J. J. (2008). MicroRNA-directed transcriptional gene silencing in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 16230-16235.

99. Kim, D. H., Villeneuve, L. M., Morris, K. V., and Rossi, J. J. (2006). Argonaute-1 directs siRNA-mediated transcriptional gene silencing in human cells. Nat Struct Mol Biol 13, 793-797.

100. Kiriakidou, M., Tan, G. S., Lamprinaki, S., De Planell-Saguer, M., Nelson, P. T., and Mourelatos, Z. (2007). An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell 129, 1141-1151.

101. Klattenhoff, C., and Theurkauf, W. (2008). Biogenesis and germline functions of piRNAs. Development 135, 3-9.

102. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., and Plasterk, R. H. (2004). Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic Acids Res 32, 6284-6291.

103. Kuramochi-Miyagawa, S., Kimura, T., Ijiri, T. W., Isobe, T., Asada, N., Fujita, Y., Ikawa, M., Iwai, N., Okabe, M., Deng, W., et al. (2004). Mili, a mammalian member of piwi family gene, is essential for spermatogenesis. Development 131, 839-849.

104. Kuramochi-Miyagawa, S., Kimura, T., Yomogida, K., Kuroiwa, A., Tadokoro, Y. Fujita, Y., Sato, M., Matsuda, Y., and Nakano, T. (2001). Two mouse piwi-related genes: miwi and mili. Mech Dev 108, 121-133.

105. Ma, J. B., Ye, K., and Patel, D. J. (2004). Structural basis for overhang-specific small interfering RNA recognition by the PAZ domain. Nature 429, 318-322.

106. Macrae, I. J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A. N., Cande, W. Z., Adams, P. D., and Doudna, J. A. (2006). Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311, 195-198.

107. Malone, C. D., Brennecke, J., Dus, M., Stark, A., McCombie, W. R., Sachidanandam. R., and Hannon, G. J. (2009). Specialized piRNA pathways act in gennline and somatic tissues of the Drosophila ovary. Cell 137, 522-535.

108. Maniataki, E., and Mourelatos, Z. (2005). A human, ATP-indcpendent, RISC assembly machine fueled by pre-miRNA. Genes Dev 19, 2979-2990.

109. Maroney, P. A., Yu,- Y., Fisher, J., and Nilsen, T. W. (2006). Evidence that microRNAs are associated with translating messenger RNAs in human cells. Nat Struct Mol Biol 13, 1102-1107.

110. Martinez, J., and Tuschl, T. (2004). RISC is a 5' phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev 18, 975-980.

111. Matranga, C., Tomari, Y., Shin, C., Bartel, D. P., and Zamore, P. D. (2005). Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes. Cell 123, 607-620.

112. Meister, G., Landthaler, M., Patkaniowska, A., Dorsett, Y., Teng, G., and Tuschl, T.(2004). Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol Cell 15, 185-197.

113. Meister, G., Landthaler, M„ Peters, L., Chen, P. Y., Urlaub, H., Luhrmann, R., and Tuschl, T. (2005). Identification of novel argonauie-associated proteins. Ciirr Biol/5, 2149-2155.

114. Mette, M. F., Aufsatz, W., van der Winden, J., Matzke, M.A., ?nd Matzke, A. J. (2000). Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA. Embo J 19, 5194-5201.

115. Mevel-Ninio, M., Pelisson, A., Kinder, J., Campos, A. R., and Bucheton, A. (2007). The flamenco locus controls the gypsy and ZAM retroviruses and is required for Drosophila oogenesis. Genetics 175, 1615-1624.

116. Mishima, Y., Giraldez, A. J., Takeda, Y., Fujiwara, T., Sakamoto, H., Schier, A. F., and Inoue, K. (2006). Differential regulation of germline mRNAs in soma and germ cells by zebrafish miR-430. Curr Biol 16, 2135-2142.

117. Miyoshi, K., Tsukumo, H., Nagami, T., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2005). Slicer function of Drosophila Argonautes and its involvement in RISC formation. Genes Dev 19, 2837-2848.

118. Moazed, D. (2009). Small RNAs in transcriptional gene silencing and genome defence. Nature 457, 413-420.

119. Mochizuki, K., Fine, N. A., Fujisawa, T., and Gorovsky, M. A. (2002). Analysis of a piwi-related gene implicates small RNAs in genome rearrangement in tetrahymena. Cell 110, 689-699.

120. Morris, K. V., Chan, S. W., Jacobsen, S. E., and Looney, D. J. (2004). Small interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in human cells. Science 305, 1289-1292.

121. Motamedi, M. R., Verdel, A., Colmenares, S. U., Gerber, S. A., Gygi, S. P., and Moazed, D. (2004). Two RNAi complexes, RITS and RDRC, physically interact and localize to noncoding centromeric RNAs. Cell 119, 789-802.

122. Nishida, K. M., Saito, K., Mori, T., Kawamura, Y., Nagami-Okada, T., Inagaki, S., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2007). Gene silencing mechanisms mediated by Aubergine piRNA complexes in Drosophila male gonad. Rna 13, 1911-1922.

123. Nottrott, S., Simard, M. J., and Richter, J. D. (2006). Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nat Struct Mol Biol 13, 1108-1114.

124. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2004). Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev 18, 1655-1666.

125. Olsen, P. H., and Ambros, V. (1999). The lin-4 regulatory RNA controls developmental timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis after the initiation of translation. Dev Biol 216, 671-680.

126. Orban, T. I., and Izaurralde, E. (2005). Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome. Rna 11, 459-469.

127. Pal-Bhadra, M., Leibovitch, B. A., Gandhi, S. G., Rao, M., Bhadra, U., Birchler, J. A., and Elgin, S. C. (2004). Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303, 669-672.

128. Palumbo, G., Bonaccorsi, S., Robbins, L. G., and Pimpinelli, S. (1994). Genetic analysis of Stellate elements of Drosophila melanogaster. Genetics 138, 11811197.

129. Pane, A., Wehr, K., and Schupbach, T. (2007). zucchini and squash encode two putative nucleases required for rasiRNA production in the Drosophila germline. Dev Cell 12, 851-862.

130. Parker, J. S., Roe, S. M., and Barford, D. (2004). Crystal structure of a PIWI protein suggests mechanisms for siRNA recognition and slicer activity. Embo J 23, 4727-4737.

131. Parker, J. S., Roe, S. M., and Barford, D. (2005). Structural insights into mRNA recognition from a PIWI domain-siRNA guide complex. Nature 434, 663-666.

132. Parker, R., and Sheth, U. (2007). P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Mol Cell 25, 635-646.

133. Parker, R., and Song, H. (2004). The enzymes and control of eukaryotic mRNA turnover. Nat Struct Mol Biol 11, 121-127.

134. Pauley, К. M., Eystathioy, Т., Jakymiw, A., Hamel, J. C., Fritzler, M. J., and Chan, E. K. (2006). Formation of GW bodies is a consequence of microRNA genesis. EMBO Rep 7, 904-910.

135. Pelisson, A. (1981). The I—R system of hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster: are I factor insertions responsible for the mutator effect of the I— R interaction? Mol Gen Genet 183, 123-129.

136. Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., and Sharp, P. A. (2006). Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Mol Cell 21, 533-542.

137. Picard, G. (1976). Non-mendelian female sterility in Drosophila melanogaster: hereditary transmission of I factor. Genetics 83, 107-123.

138. Pillai, R. S., Bhattacharyya, S. N., Artus, C. G., Zoller, Т., Cougot, N„ Basyuk, E., Bertrand, E., and Filipowicz, W. (2005). Inhibition of translational initiation by Let-7 MicroRNA in human cells. Science 309, 1573-1576.

139. Prud'homme, N., Gans, M., Masson, M., Terzian, C., and Bucheton, A. (1995). Flamenco, a gene controlling the gypsy retrovirus of Drosophila melanogaster. Genetics 139, 697-711.

140. Rana, Т. M. (2007). Illuminating the silence: understanding the structure and function of small RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 23-36.

141. Rand, T. A., Petersen, S., Du, F., and Wang, X. (2005). Argonaute2 cleaves the antiguide strand of siRNA during RISC activation. Cell 123, 621-629.

142. Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., and Sanchez Alvarado, A. (2005). SMEDWI-2 is a PlWI-like protein that regulates planarian stem cells. Science 310, 1327-1330.

143. Rehwinkel, J., Natalin, P., Stark, A., Brennecke, J., Cohen, S. M., and Izaurralde, E. (2006). Genome-wide analysis of mRNAs regulated by Drosha and Argonaute proteins in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol 26, 2965-2975.

144. Reinhart, B. J., Slack, F. J., Basson, M., Pasquinelli, A. E., Bettinger, J. C., Rougvie, A. E., Horvitz, H. R., and Ruvkun, G. (2000). The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 403, 901-906.

145. Reuter, M., Chuma, S., Tanaka, T., Franz, T., Stark, A., and Pillai, R. S. (2009). Loss of the Mili-interacting Tudor domain-containing protein-1 activates transposons and alters the Mili-associated small RNA profile. Nat Struct Mol Biol 16, 639646.

146. Ringrose, L., and Paro, R. (2004). Epigenetic regulation of cellular memory by the Polycomb and Trithorax group proteins. Annu Rev Genet 38, 413-443.

147. Rivas, F. V., Tolia, N. H., Song, J. J., Aragon, J. P., Liu, J., Hannon, G. J., and Joshua-Tor, L. (2005). Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. Nat Struct Mol Biol 12, 340-349.

148. Robb, G. B., Brown, K. M., Khurana, J., and Rana, T. M, (2005). Specific and potent RNAi in the nucleus of human cells. Nat Struct Mol Biol 12, 133-137.

149. Rubin, G. M., Kidwell, M. G., and Bingham, P. M. (1982). The molecular basis of P-M hybrid dysgenesis: the nature of induced mutations. Cell 29, 987-994.

150. Ruby, J. G., Jan, C. H., and Bartel, D. P. (2007a). Intronic microRNA precursors that bypass Drosha processing. Nature 448, 83-86.

151. Ruby, J. G., Stark, A., Johnston, W. K., Kellis, M„ Bartel, D. P., and Lai, E. C. (2007b). Evolution, biogenesis, expression, and target predictions of a substantially expanded set of Drosophila microRNAs. Genome Res 17, 18501864.

152. Saetrom, P., Heale, B. S., Snove, O., Jr., Aagaard, L., Alluin, J., and Rossi, J. J. (2007). Distance constraints between microRNA target sites dictate efficacy and cooperativity. Nucleic Acids Res 35, 2333-2342.

153. Saito, K., Ishizuka, A., Siomi, H., and Siomi, M. C. (2005). Processing of pre-microRNAs by the Dicer-1-Loquacious complex in Drosophila cells. PLoS Biol 3, e235.

154. Sambrook J., R. D. W. (2001). Molecular cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

155. Sandberg, R., Neilson, J. R., Sarma, A., Sharp, P. A., and Bürge, C. B. (2008). Proliferating cells express mRNAs with shortened 3' untranslated regions and fewer microRNA target sites. Science 320, 1643-1647.

156. Sarot, E., Payen-Groschene, G., Bucheton, A., and Pelisson, A. (2004). Evidence for a piwi-dependent RNA silencing of the gypsy endogenous retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco gene. Genetics 166, 1313-1321.

157. Saxena, S., Jonsson, Z. O., and Dutta, A. (2003). Small RNAs with imperfect match to endogenous mRNA repress translation. Implications for off-target activity of small inhibitory RNA in mammalian cells. J Biol Chem 278, 44312-44319.

158. Schupbach, T., and Wieschaus, E. (1991). Female sterile mutations on the second chromosome of Drosophila melanogaster. II. Mutations blocking oogenesis or altering egg morphology. Genetics 129, 1119-1136.

159. Schwarz, D. S., Hutvagner, G., Du, T., Xu, Z., Aronin, N., and Zamore, P. D. (2003). Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115, 199-208.

160. Seggerson, K., Tang, L., and Moss, E. G. (2002). Two genetic circuits repress the Caenorhabditis elegans heterochronic gene lin-28 after translation initiation. DevBiol 243, 215-225.

161. Shevelyov, Y. Y. (1992). Copies of a Stellate gene variant are located in the X heterochromatin of Drosophila melanogaster and are probably expressed. Genetics 132, 1033-1037.

162. Siomi, H., and Siomi, M. C. (2009). On the road to reading the RNA-interference code. Nature 457, 396-404.

163. Snee, M. J., and Macdonald, P. M. (2004). Live imaging of nuage and polar granules: evidence against a precursor-product relationship and a novel role for Oskar in stabilization of polar granule components. J Cell Sci 117, 2109-2120.

164. Song, J. J., Smith, S. K., Hannon, G. J., and Joshua-Tor, L. (2004). Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC sheer activity. Science 305, 14341437.

165. Spirin A., S. (2000). Ribosomes: Springer Us ).

166. Stark, A., Brennecke, J., Bushati, N., Russell, R. B., and Cohen. S. M. (2005). Animal MicroRNAs confcr robustness to gene expression and have a significant impact on 3'UTR evolution. Cell 123, 1133-1146.

167. Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., and Wang, X. (2009). Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes Dcv 23, 304-317.

168. Teixeira, D., Sheth, U., Valencia-Sanchez, M. A., Brengues, M., and Parker,.R. (2005). Processing bodies require RNA for assembly and contain nontranslating mRNAs.Rna 11, 371-382.

169. Tomari, Y., Du, T., Haley, B., Schwarz, D. S., Bennett, R., Cook, H. A., Koppetsch, B. S., Theurkauf, W. E., and Zamore, P. D. (2004a). RISC assembly defects in the Drosophila RNAi mutant armitage. Cell 116, 831-841.

170. Tomari, Y., Du, T., and Zamore, P. D. (2007). Sorting of Drosophila small silencing RNAs. Cell 130, 299-308.

171. Tomari, Y., Matranga, C., Haley, B., Martinez, N., and Zamore, P. D. (2004b). A protein sensor for siRNA asymmetry. Science 306, 1377-1380.

172. Tulin, A. V., Kogan, G. L., Filipp, D., Balakireva, M. D., and Gvozdev, V. A. (1997). Heterochromatic Stellate gene cluster in Drosophila melanogaster: structure and molecular evolution. Genetics 146, 253-262.

173. Usakin, L. A., Kogan, G. L., Kalmykova, A. I., and Gvozdev, V. A. (2005). An alien promoter capture as a primary step of the evolution of testes-expressed repeats in the Drosophila melanogaster genome. Mol Biol Evol 22, 1555-1560.

174. Vagin, V. V., Sigova, A., Li, C., Seitz, H., Gvozdev, V., and Zamore, P. D. (2006). A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science 313, 320-324.

175. Valencia-Sanchez, M. A., Liu, J. Hannon, G. J., and Parker. R. (2006). Control of translation and mRNA degradation by miRNAs and siRNAs. Genes Dev 20, 515-524.

176. Vasudevan, S., and Steitz, J. A. (2007). AU-rich-element-mediated upregulation of translation by FXR1 and Argonaute 2. Cell 128, 1105-1118.

177. Vasudevan, S., Tong, Y., and Steitz, J. A. (2007). Switching from repression to activation: microRNAs can up-regulate translation. Science 318, 1931-1934.

178. Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y„ Reinert, K., and Slack, F. J. (2004). The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes Dev 18, 132-137.

179. Verdel, A., Jia, S., Gerber, S., Sugiyama, T., Gygi, S., Grewal, S. I., and Moazed, D. (2004). RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RJTS complex. Science 303, 672-676.

180. Volpe, T., Schramke, V., Hamilton, G. L., White, S. A., Teng, G., Marticnssen, R. A., and Allshire, R. C. (2003). RNA interference is required for normal centromere function in fission yeast. Chromosome Res 11, 137-146.

181. Wakiyama, M., Imataka, II., and Sonenberg, N. (2000). Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus oocyte maturation. Curr Biol 10. 1147-1150.

182. Wakiyama, M., Takimoto, K., Ohara, O. and Yokoyama, S. (2007). Let-7 microRNA-mediated mRNA deadenylation and translational repression in a mammalian cell-free system. Genes Dev 21, 1857-1862.

183. Wang, B., Love, T. M. Call, M. E., Doench, J. G., and Novina, C. D. (2006). Recapitulation of short RNA-directed translational gene silencing in vitro. Mol Cell 22, 553-560.

184. Wang, J., Saxe, J. P., Tanaka, T., Chuma, S., and Lin, H. (2009). Mili interacts with tudor domain-containing protein 1 in regulating spermatogenesis. Curr Biol 19, 640-644.

185. Weinmann, L., Hock, J., Ivacevic, T., Ohrt, T., Mutze, J., Schwille, P., Kremmer, E., Benes, V., Urlaub, H., and Meister, G. (2009). Importin 8 is a gene silencing factor that targets argonaute proteins to distinct mRNAs: Cell 136, 496-507.

186. Wu, L., and Belasco, J. G. (2005). Micro-RNA regulation of the mammalian lin-28 gene during neuronal differentiation of embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol 25, 9198-9208.

187. Wu, L., Fan, J., and Belasco, J. G. (2006). MicroRNAs direct rapid deadenylation of mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 4034-4039.

188. Xie, Z., Johansen, L. K., Gustafson, A. M., Kasschau, K. D., Lellis, A. D., Zilberman, D., Jacobsen, S. E., and Carrington, J. C. (2004). Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol 2, El 04.

189. Yekta, S., Shih, I. H., and Bartel, D. P. (2004). MicroRNA-directed cleavage of HOXB8 mRNA. Science 304, 594-596.

190. Yi, R., Qin, Y., Macara, I. G., and Cullen, B. R. (2003). Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes Dev 17, 3011-3016.

191. Zamore, P. D., Tuschl, T., Sharp, P. A., and Bartel, D. P. (2000). RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 tp 23 nucleotide intervals. Cell 101, 25-33.

192. Zeng, Y., and Cullen, B. R. (2002). RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm. Rna 8, 855-860.

193. Zilberman, D., Cao, X., and Jacobsen, S. E. (2003). ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation. Science 299, 716-719.

Информация о работе

Котельников, Роман Николаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Особенности механизма подавления экспрессии генов Stellate с помощью РНК-интерференции у Drosophila melanogaster - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы