Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Инактивация репортерных генов клонированными гетерохроматиновыми повторами в геноме D. melanogaster

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Наумова, Наталия Михайловна

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Задачи исследования.

1.3. Научная новизна результатов исследования.

1.4. Практическая ценность.

1.5. Апробация работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ ГЕТЕРОХРОМАТИНА У ДРОЗОФИЛЫ

2.1 Введение.

2.2 Общий механизм образования репрессионного хроматина у эукариот

2.2.1. Переход между активным и репрессированным состоянием регулируется модификациями гистонов.

2.2.2. Механизм образования гетерохроматина.

2.3 Метилирование ДНК у дрозофилы.

2.4 Модификации гистонов в гетерохроматине дрозофилы.

2.4.1 Su(Var)3-9 и метилирование К9-НЗ.

2.4.2 Связь между метилированием и ацеттированием К9-НЗ.

2.4.3 Другие модификации гистонов: МеК20Н4.

2.4.4. Ацетилирование гистонов в гетерохроматине.

2.5 Распознавание эпигенетического сигнала МеК9НЗ структурным белком гетерохроматина нр1.

2.6 Белки НР1, Su(Var)3-9 и Su(Var)3-7 действуют в комплексе, образуя прицентромерный гетерохроматин.

2.7 Участие НР1, НО АР и Su(Var)3-9 в образовании гетерохроматина теломер.

2.8 Структурные белки гетерохроматина участвуют в репрессии эухроматиновых генов.

2.9 Закладка гетерохроматина в эмбриогенезе дрозофилы.

2.9.1 НР1 доставляется к сайтам инициации сборки гетерохроматина в составе ORC/HOAP/HP1 комплекса.

2.9.2 PARP необходим для закладки гетерохроматина.

2.10 Эволюционная консервативность HP 1/Su(Yar)3-9 системы в формировании гетерохроматина у эукариот и участие РНК в этом процессе.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Биологические материалы.

3.2. Использованные праймеры.

3.3. Линии Drosophila и генетические скрещивания.

3.4. Трансформация эмбрионов Drosophila.

3.4.1. Подготовка линии мух.

3.4.2. Сбор эмбрионов и инъекции.

3.4.3. Сбор эмбрионов после инъекций.

3.5. Гибридизация ДНК-ДНК in situ.

3.5.1. Приготовление биотинилированных зондов для гибридизации in situ

3.5.2. Приготовление давленных препаратов политенных хромосом слюнных желез.

3.5.3. Проведение гибридизации in situ.

3.5.4. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH).

3.5.5 Определение цитологических сайтов гибридизации.

3.6.йммунолокализация НР1 на политенных хромосомах слюнных желез.

3.6.1. Получение препаратов.

3.6.2. Иммунолокализация НР1.

3.6.3. Цитологический анализ иммунноокрашенных препаратов.

3.6.4. Обработка изображения в Adobe Photoshop.

3.7. Гистохимическая окраска органов на активность галактозидазы

3.8. Количественное определение активности галактозидазы.

3.9. Стандартные молекулярно-биологическиеметоды.

3.10. Создание конструкций для трансформации дрозофилы.

3.11. лигирование ДНК и трансформация клеток e.coli.

3.12. Выделение плазмидной ДНК.

3.13. Выделение ДНК из легкоплавких агарозных гелей.

3.14. Выделение геномной ДНК Drosophila.

3.15. Southern-блот гибридизация.

3.15.2. Перенос ДНК из агарозных гелей на нитроцеллюлозный фильтр.

3.15.2. Мечение ДНК методом рассеянной затравки.

3.15.3. Гибридизация с меченым зондом.

3.16. Локализация инсерций в геноме трансформантов методом обратной ПЦР (Inverse PCR).

3.17. Анализ доступности хроматина для Dam-метилтрансферазы Е. сои

3.18. Выделение ядер из целых мух.

3.19. Выделение ядер из семенников Drosophila.

3.20. Переваривание ядер ДНКазоМ.

3.21. Переваривание ядер микрококковой нуклеазой.

3.22. Выделение ДНК из ядер после инкубации с нуклеазами.

3.23. Анализ ДНК, выделенной из ядер после нуклеазного переваривания

3.24. Денситометрирование радиоавтографов и анализ данных.

4.РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1 Инактивация репортерных генов клонированными гетерохроматиновыми повторами Stellate и Su(Ste) в соматических тканях D. melanogaster.

4.2 Изучение влияния генов-модификаторов классического эффекта положения мозаичного типа, а также делеции эндогенных локусов Stellate и Su(Ste) на инактивацию репортерных генов клонированными повторами в соматических тканях Drosophila melanogaster.

4.3 Исследование состояния хроматина в районе репортерных генов, прилежащих к тандему 6Ste.

4.3.1. Анализ доступности нуклеазам репортерных генов, инактивированных прилежащим тандемом 6Ste, in vitro.

4.3.2. Анализ доступности репортерного гена mini-white, прилежащего к тандему 6Ste, Darn-метгттрансферазе E.coli in vivo.

4.4. Инактивация репортерных генов клонированными повторами Stellate в терминальных тканях самцов.

4.5. Исследование влияния тандемной организации генов Stellate на их экспрессию и регуляцию повторами Su(Ste) в семенниках.

4.6. Влияние активации экспрессии генов Stellate на фоне делеции повторов Su(Ste) на структуру хроматина в области промотора Stellate в семенниках.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Особенности инактивации репортерных генов гетерохроматиновыми повторами в соматических тканях дрозофилы.

5.1.1. Стабильное наследование клонированных гетерохроматиновых повторов в эктопических сайтах в геноме дрозофилы.

5.1.2. Ткане-зависимая репрессия репортерных генов повторами Stellate

5.1.3. Репрессия, обусловленная повторами Stellate, может быть преодолена активацией промотора.ПО

5.2. Особенности хроматина, образующегося на клонированных повторах Stellate и Su(Ste) в эктопических сайтах в соматических тканях.

5.2.1. Изменение структуры хроматина в районе клонированных повторов Stellate.Ill

5.2.2. Механизм репрессии гетерологичных генов повторами Stellate и Su(Ste) отличен от классического ЭПМ.

5.2.3. Хроматин на повторах Stellate и Su(Ste) не образует гомологичных транс-взаимодействий.

5.2.4. Повторы Stellate и транс-активация репортерного гена mini-white

5.3. Повторы и образование гетерохроматина у дрозофилы.

5.4. Особенности регуляции генов Stellate в семенниках дрозофилы

5.4.1. Организация повторов Stellate не влияет на их экспрессию.

5.4.2. Репрессия генов Stellate повторами Su(Ste) по механизму РНКи включает стадию регуляции структуры хроматина.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Инактивация репортерных генов клонированными гетерохроматиновыми повторами в геноме D. melanogaster"

1.1. Актуальность проблемы

Гетрохроматин - это компартмент генома высших эукариот, который представлен в основном повторяющимися последовательностями (сатгелитами и мобильными элементами) и расположен в прицентромерных и теломерных областях хромосом. Хотя гетерохроматин может составлять значительную часть генома (до 50% у млекопитающих), его роль в функционировании генома еще далеко не выяснена. Показаны структурные функции гетерохроматина, такие как образование и поддержание центромеры, управление сегрегацией хромосом в ходе клеточных делений, в том числе при сперматогенезе, установление правильной пространственной организации ядра. Открыт также ряд жизненно важных генов, активно экспрессирующихся в гетерохроматине, например гены рРНК и факторы фертильности самцов дрозофилы. По всей видимости, ключевым моментом, определяющим функционирование гетерохроматина как целого, а также экспрессию отдельных его генов, является особая компактная структура хроматина, для образования которой в равной степени важны специфические структурные белки хроматина и повторяющаяся природа последовательностей ДНК.

Понять механизм образования гетерохроматина помогает изучение феномена эффекта положения мозаичного типа (ЭПМ) - явления репрессии эухромати-новых генов, оказавшихся в результате хромосомных перестроек вблизи блока гетерохроматина (рис.1). Репрессия связана с компактизацией хроматина в районе инактивируемых генов (Sun et al., 2001), возникающей за счет распространения белков гетерохроматина от точки разрыва, и носит мозаичный характер, так как происходит с разной эффективностью в разных клетках. Изучение мутаций, модулирующих ЭПМ (так называемых модификаторов ЭПМ), позволило охарактеризовать значительное количество белков, участвующих в образовании гетерохроматина. Однако, исследуя ЭПМ на хромосомных перестройках, когда инактивация осуществляется блоками естественного гетерохроматина, невозможно сказать, какой именно участок блока отвечает за репрессию, то есть за распространение структуры гетерохроматина в область эухроматина, поскольку каждый блок состоит из множества различных последовательностей. Поиск последовательностей - инициаторов сборки гетерохроматина может быть

Current Opinion in Genetics & Development

Рис.1. Эффект положения мозаичного типа по гену white, отвечающему за окраску глаз у дрозофилы, а. Локус white в норме расположен в дистальном эухроматине на X хромосоме и экспрессируется равномерно. Ь. Инверсия, возникшая вследствие индуцированной облучением поломки хромосомы, переносит ген white в непосредственную близость к прицентромерному гетерохроматину. В глазах возникает три типа фасеток: красные, с полностью активным геном white, белые с неактивным геном, и оранжевые, где white частично репрессирован. Предложен следующий механизм: структурные белки гетерохрома-тина (обозначены геометрическими фигурами) связываются с некоторыми инициаторными сайтами Т в гетерохроматине и распространяются по хромосоме благодаря кооперативным взаимодействиям, пока не достигнут барьерных эелементов 'В' (boundary). При хромосомных поломках барьер пропадает, и компактная белковая структура распространяется в эу-хроматин, репрессируя эухроматиновые гены, в данном случае white. Разные типы фасеток возникают по причине разной эффективности распространения гетерохроматина от точек разрыва. Схема предусматривает линейное распространение гетерохроматина и не объясняет тех случаев ЭПМ, когда гены, расположенные дальше от точки разрыва, репрессированы Сильнее, чем близлежащие гены. Рисунок из обзора Grewal&Elgin, 2002, CurrOpinGenetDev 12 осуществлен с использованием подхода, основанного на введении в геном трансгенных конструкций, содержащих небольшие фрагменты нативного гетерохроматина, с прилежащими к ним репортерными генами.

В настоящей работе мы исследовали влияние тандемных повторов гетерохроматиновых локусов Stellate и Suppressor-of-Stellate D.melanogaster, на экспрессию репортерных генов в различных тканях дрозофилы. Локусы Stellate и SufSte) представлены гомологичными тандемными повторами в гетерохроматине X и Y хромосомы соответственно. Х-хромосомные гены Stellate, представляющие собой редкий случай кодирующих белок последовательностей, расположенных в гетерохроматине, обладают открытой рамкой считывания с гомологией с регуляторной субъединицей протеинкиназы CKII (Livak, 1990; Livak, 1984). Повторы Suppressor of Stellate (SufSte)), расположенные на Y-хромосоме, обладают большой степенью гомологии с генами Stellate (около 90% идентичных нуклеотидных остатков), однако, в отличие от них, открытая рамка считывания во всех известных на сегодняшний день копиях повреждена (Balakireva et al., 1992; Kalmykova et al., 1998). Кроме области гомологии с генами Stellate, каждый повтор Su(Ste) несет также инсерцию мобильного элемента hoppel (Balakireva et al., 1992). По-видимому, оба типа повторов возникли благодаря амплификации на половых хромосомах уникального аутосомного гена bCKIItes, кодирующего семенник-специфическую регуляторную субъединицу протеинкиназы CKII, который в свою очередь, видимо возник из гена повсеместно экспрессирующеся субъединицы путем ретропозиции (Kalmykova et al., 1997с). На фоне полной или частичной делеции повторов Su(Ste) возникает гиперэкспрессия генов Stellate, которая приводит к многочисленным нарушениям мейоза и стерильности самцов (Bozzetti et al., 1995; Hurst, 1992; Hurst, 1996; Kalmykova et al., 1998; Livak, 1984).

В отличие от многих последовательностей гетерохроматина, для повторов Stellate и Su(Ste) известна функция: некодирующие повторы Su(Ste) подавляют в норме экспрессию белок-кодирующих генов Stellate по механизму сходному с искусственной РНК-интерференцией (Bosher and Labouesse, 2000; Sharp, 1999; Yang et al., 2000; Zamore et al., 2000), при которой репрессия генов осуществляется гомологичной двуцепочечной РНК (далее дцРНК) (Aravin et al., 2001) (рис.2). В результате транскрипции обеих цепей повторов Su(Ste) образуются смысловые и антисмысловые транскрипты, по крайней мере часть из которых формирует дцРНК. Местом формирования, а также возможно и дальнейшего процессинга дцРНК на 25-27 нт. РНК является, по-видимому, ядро. В то время как смысловые транскрипты Stellate и Su(Ste), а также дцРНК (или же короткие РНК) могут выходить из ядра в цитоплазму, антисмысловые транскрипты Su(Ste) остаются в ядре и избегают деградации. В цитоплазме короткие РНК узнают и направляют деградацию гомологичных мРНК Stellate и смысловых транскриптов Su(Ste). Полученные А.Аравиным данные не отвергают механизм, согласно которому короткие РНК могут направлять изменение структуры хроматина и последующее транскрипционное подавление гомологичных последовательностей в ядре.

Рис.2 Предполагаемый механизм регуляции экспрессии генов Stellate.

Повторы Stellate транскрибируются

Показаны две возможные ветви регуляции: пост-транскрипционная деградация смысловых транскриптов Su(Ste) и Stellate в цитоплазме и направляемая антисмысловой РНК или же короткими РНК модификация структуры хроматина локуса Stellate в ядре.

По всей видимости, гены Stellate являются активными сайтами сборки гете-рохроматина, поскольку, как было показано ранее (Tulin et al., 1998), при помощи трансгенных конструкций, тандем из шести копий Stellate подавляет экспрессию репортерного гена mini-white, отвечающего за пигментацию глаз. В настоящей работе исследования в этом направлении были продолжены. Показано, что оба типа повторов - Stellate и Su(Ste), вызывают инактивацию прилежащих репортерных генов, что, однако, происходит без привлечения наиболее известных структурных белков гетерохроматина.

Использование трансгенных конструкций также позволило показать, что организация генов Stellate в виде тандема несущественна для подавления их экспрессии повторами Su(Ste). Отдельный интерес представляло сравнение структуры хроматина молчащих и активных генов Stellate на фоне делеции повторов Su(Ste), поскольку таким образом можно судить о том, на каком уровне - транскрипционном или пост-транскрипционном, - происходит регуляции экспрессии генов Stellate с помощью гомологичной дцРНК Su(Ste).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Наумова, Наталия Михайловна

6. Выводы

1. Исследована способность клонированных из гетерохроматина D.melanogaster повторов вызывать инактивацию прилежащих генов-репортеров. Фрагмент ДНК гетерохроматина длиной 8 т.п.н., содержащий шесть тандемно повторенных семенник-специфичных генов Stellate, вызывает инактивацию репортерных генов в различных соматических тканях взрослых мух и личинок. Характер инактивации ткане-специфичен: в одних тканях наблюдается мозаичная инактивация (глаза, имагинальные диски и слюнные железы личинок), а в других - одинаковое снижение экспрессии во всех клетках ткани (мозг, половые железы самцов). Тандем некодирующих повторов Su(Ste), гомологичных генам Stellate, длиной 9 т.п.н., содержащий 3 повтора, также вызывал мозаичную инактивацию репортерного гена mini-white.

2. Инактивация репортерного гена mini-white шестью повторами Stellate сопровождается локальной компактизацией хроматина, о чем свидетельствует снижение доступности последовательности гена mini-white для Dam-метилтрансферазы E.coli. Однако изменений в характере нуклеосомной укладки в районе репортерного гена не обнаружено.

3. Гены-модификаторы классического эффекта положения мозаичного типа (НР1, SuVar3-9, SuVar3-6, SuVar2-l) и гены группы Polycomb (E(z), Pel, Su(z)2) не влияют на степень инактивации гена mini-white клонированными повторами Stellate. Структурный белок гетерохроматина НР1 не обнаружен в районе эндогенного локуса Stellate.

4. Тандем из шести копий семенник-специфичных генов Stellate вызывает инактивацию прилежащих репортерных генов, находящихся под контролем чужеродных промоторов генов теплового шока, на всех стадиях сперматогенеза.

5. Уровень экспрессии репортерного гена Ste-lacZ в терминальных тканях самцов одинаков, когда ген находится на краю тандема 6Ste или в виде одиночных копий в эухроматине. Собственный промотор Stellate нечувствителен к репрессионной структуре, возникающей в области тандема 6Ste в семенниках и подавляющей экспрессию генов с чужеродными промоторами. Активность одиночной копии Ste-lacZ и копии, прилегающей к тандему, на фоне делеции повторов Su(Ste), являющихся репрессорами повторов Stellate, возрастает одинаково. Следовательно, активность промотора Stellate и его регуляция повторами Su(Ste) не связана с тандемной организацией генов Stellate.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Наумова, Наталия Михайловна, Москва

1. Adams, M. D., Celniker, S. E., Holt, R. A., Evans, C. A., Gocayne, J. D., Amanatides, P. G., Scherer, S. E., Li, P. W., Hoskins, R. A., Galle, R. F., et al. (2000). The genome sequence of Drosophila melanogaster, Science 287, 2185-95.

2. Aravin, A. A., Naumova, N. M., Tulin, A. V., Vagin, V. V., Rozovsky, Y. M., and Gvozdev, V. A. (2001). Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline, Curr Biol 11, 1017-27.

3. Ashburner, M. (1989). Drosophila. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

4. Austin, R. J., Orr-Weaver, T. L., and Bell, S. P. (1999). Drosophila ORC specifically binds to ACE3, an origin of DNA replication control element, Genes Dev 13, 263949.

5. Bachman, К. E., Rountree, M. R., and Baylin, S. B. (2001). Dnmt3a and Dnmt3b are transcriptional repressors that exhibit unique localization properties to heterochromatin, J Biol Chem 276, 32282-7.

6. Ballestar, E., and Wolffe, A. P. (2001). Methyl-CpG-binding proteins. Targeting specific gene repression, Eur J Biochem 268, 1-6.

7. Bannister, A. J., Zegerman, P., Partridge, J. F., Miska, E. A., Thomas, J. O., Allshire, R. C., and Kouzarides, T. (2001). Selective recognition of methylated lysine 9 on his-tone H3 by the HP1 chromo domain, Nature 410, 120-4.

8. Bingham, P. M. (1997). Cosuppression comes to the animals comment., Cell 90, 3857.

9. Birchler, J. A., Bhadra, M. P., and Bhadra, U. (2000). Making noise about silence: repression of repeated genes in animals, Curr Opin Genet Dev 10, 211-6. Bird, A. P. (1986). CpG-rich islands and the function of DNA methylation, Nature 321, 209-13.

10. Bone, J. R., Lavender, J., Richman, R., Palmer, M. J., Turner, В. M., and Kuroda, M. I. (1994). Acetylated histone H4 on the male X chromosome is associated with dosage compensation in Drosophila, Genes Dev 8, 96-104.

11. Bonner, J. J., Parks, C., Parker-Thornburg, J., Mortin, M. A., and Pelham, H. R. (1984). The use of promoter fusions in Drosophila genetics: isolation of mutations affecting the heat shock response, Cell 37, 979-91.

12. Bosher, J. M., and Labouesse, M. (2000). RNA interference: genetic wand and genetic watchdog, Nat Cell Biol 2, E31-6.

13. Brown, К. E., Guest, S. S., Smale, S. Т., Hahm, K., Merkenschlager, M., and Fisher, A. G. (1997). Association of transcriptionally silent genes with Ikaros complexes at centromeric heterochromatin, Cell 91, 845-54.

14. Cheutin, Т., McNairn, A. J., Jenuwein, Т., Gilbert, D. M., Singh, P. В., and Misteli, T. (2003). Maintenance of stable heterochromatin domains by dynamic HP1 binding, Science 299, 721-5.

15. Chien, С. Т., Buck, S., Sternglanz, R., and Shore, D. (1993). Targeting of SIR1 protein establishes transcriptional silencing at HM loci and telomeres in yeast, Cell 75, 531-41.

16. Cleard, F., Delattre, M., and Spierer, P. (1997). SU(VAR)3-7, a Drosophila heterochromatin-associated protein and companion of HP1 in the genomic silencing of position-effect variegation., EMBO J 16, 5280-8.

17. Csink, A., and Henikoff, S. (1996). Genetic modification of heterochromatic association and nuclear organization in Drosophila., Nature 381, 529-31.

18. Czermin, В., and Imhof, A. (2003). The sounds of silence—histone deacetylation meets histone methylation, Genetica 117, 159-64.

19. Davie, J. R. (1998). Covalent modifications of histones: expression from chromatin templates, Curr Opin Genet Dev 8, 173-8.

20. Dernburg, A., Broman, K., Fung, J., Marshall, W., Philips, J., Agard, D., and Sedat, J. (1996). Perturbation of nuclear architecture by long-distance chromosome interactions., Cell 85, 745-59.

21. Dernburg, A., and Sedat, J. (1998). Mapping three-dimensional chromosome architecture in situ., Methods Cell Biol 53, 187-233.

22. Dernburg, A. F., and Karpen, G. H. (2002). A chromosome RNAissance, Cell 111, 159-62.

23. Dernburg, A. F., Zalevsky, J., Colaiacovo, M. P., and Villeneuve, A. M. (2000). Transgene-mediated cosuppression in the C. elegans germ line, Genes Dev 14, 157883.

24. Devlin, R., Bingham, В., and Wakimoto, B. (1990). The organization and expression of the light gene, a heterochromatic gene of Drosophila melanogaster., Genetics 125, 129-40.

25. Dobie, K., Mehtali, M., McClenaghan, M., and Lathe, R. (1997). Variegated gene expression in mice., Trends Genet 13,127-30.

26. Dutta, A., and Bell, S. P. (1997). Initiation of DNA replication in eukaryotic cells, Annu Rev Cell Dev Biol 13, 293-332.

27. Eberl, D., Duyf, В., and Hilliker, A. (1993). The role of heterochromatin in the expression of a heterochromatic gene, the rolled locus of Drosophila melanogaster., 134, 277-92.

28. Ehrenhofer-Murray, A. E., Rivier, D. H., and Rine, J. (1997). The role of Sas2, an ace-tyltransferase homologue of Saccharomyces cerevisiae, in silencing and ORC function, Genetics 145, 923-34.

29. Eissenberg, J. C. (2001). Decisive factors: a transcription activator can overcome heterochromatin silencing, Bioessays 23, 767-71.

30. Eissenberg, J. C., and Elgin, S. C. (2000). The HP1 protein family: getting a grip on chromatin, Curr Opin Genet Dev 10, 204-10.

31. Elgin, S. (1990). Chromatin structure and gene activity., Curr Opin Cell Biol 2, 43745.

32. Elgin, S., Granok, H., Lu, Q., and Wallrath, L. (1993). Role of chromatin structure in regulating gene expression: the hsp26 gene of Drosophila melanogaster., Cold Spring Harb Symp Quant Biol 58, 83-96.

33. Fanti, L., Berloco, M., Piacentini, L., and Pimpinelli, S. (2003). Chromosomal distribution of heterochromatin protein 1 (HP1) in Drosophila: a cytological map of eu-chromatic HP1 binding sites, Genetica 117, 135-47.

34. Foe, V. E., and Alberts, В. M. (1983). Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis, J Cell Sci 61, 31-70.

35. Fung, J., Marshall, W., Dernburg, A., Agard, D., and Sedat, J. (1998). Homologous chromosome pairing in Drosophila melanogaster proceeds through multiple independent initiations., J Cell Biol 141, 5-20.

36. Grewal, S. I., and Elgin, S. C. (2002). Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure, Curr Opin Genet Dev 12, 178-87.

37. Hall, I. M., Shankaranarayana, G. D., Noma, K., Ayoub, N., Cohen, A., and Grewal, S. I. (2002). Establishment and maintenance of a heterochromatin domain, Science 297, 2232-7.

38. Hayashi, S., Ruddell, A., Sinclair, D., and Grigliatti, T. (1990). Chromosomal structure is altered by mutations that suppress or enhance position effect variegation, Chromosoma 99, 391-400.

39. Heard, E., Rougeulle, C., Arnaud, D., Avner, P., Allis, C. D., and Spector, D. L. (2001). Methylation of histone H3 at Lys-9 is an early mark on the X chromosome during X inactivation, Cell 107, 727-38.

40. Hearn, M., Hedrick, A., Grigliatti, Т., and Wakimoto, B. (1991). The effect of modifiers of position-effect variegation on the variegation of heterochromatic genes of Drosophila melanogaster., Genetics 128, 785-97.

41. Henikoff, S. (1994). A reconsideration of the mechanism of position effect., Genetics 138,1-5.

42. Henikoff, S., and Comai, L. (1998). Trans-sensing effects: the ups and downs of being together, Cell 93, 329-32.

43. Horner, A & C. Tummel, 1997. Mutations in the DHR orphan receptor gene have no effect on viability. Dros. Inf. Service 80: 35-70

44. Howe, M., Dimitri, P., Berloco, M., and Wakimoto, B. (1995). Cis-effects of heterochromatin on heterochromatic and euchromatic gene activity in Drosophila melanogaster., Genetics 140, 1033-45.

45. Hung, M. S., Karthikeyan, N., Huang, В., Koo, H. C., Kiger, J., and Shen, C. J.1999). Drosophila proteins related to vertebrate DNA (5-cytosine) methyltrans-ferases, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 11940-5.

46. Hurst, L. (1992). Is Stellate a relict meiotic driver?, Genetics 130, 229-30.

47. Hurst, L. D. (1996). Further evidence consistent with Stellate's involvement in meioticdrive, Genetics 142, 641-3.

48. Jacobs, S. A., and Khorasanizadeh, S. (2002). Structure of HP1 chromodomain bound to a lysine 9-methylated histone H3 tail, Science 295, 2080-3.

49. Jacobs, S. A., Taverna, S. D., Zhang, Y., Briggs, S. D., Li, J., Eissenberg, J. C., Allis, C. D., and Khorasanizadeh, S. (2001). Specificity of the HP1 chromo domain for the methylated N-terminus of histone H3, Embo J 20, 5232-41.

50. Jaenisch, R. (1997). DNA methylation and imprinting: why bother? see comments., Trends Genet 13, 323-9.

51. Jenuwein, Т., and Allis, C. D. (2001). Translating the histone code, Science 293, 1074-80.

52. Joanis, V., and Lloyd, V. K. (2002). Genomic imprinting in Drosophila is maintained by the products of Suppressor of variegation and trithorax group, but not Polycomb group, genes, Mol Genet Genomics 268, 103-12.

53. Johnson, L., Cao, X., and Jacobsen, S. (2002). Interplay between two epigenetic marks. DNA methylation and histone H3 lysine 9 methylation, Curr Biol 12, 1360-7.

54. Jones, L., Ratcliff, F., and Baulcombe, D. C. (2001). RNA-directed transcriptional gene silencing in plants can be inherited independently of the RNA trigger and requires Metl for maintenance, Curr Biol 11,1Л1-51.

55. Keohane, A. M., O'Neill L, P., Belyaev, N. D., Lavender, J. S., and Turner, В. M. (1996). X-Inactivation and histone H4 acetylation in embryonic stem cells, Dev Biol 750,618-30.

56. Kouzarides, T. (2002). Histone methylation in transcriptional control, Curr Opin Genet Dev 12, 198-209.

57. Kutach, A. K., and Kadonaga, J. T. (2000). The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters, Mol Cell Biol 20, 4754-64.

58. Mahowald, A. P., and Hardy, P. A. (1985). Genetics of Drosophila embryogenesis, Annu Rev Genet 19, 149-77.

59. Mette, M. F., Aufsatz, W., van Der Winden, J., Matzke, M. A., and Matzke, A. J. (2000). Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA, Embo J 19, 5194-5201.

60. Mette, M. F., Matzke, A. J., and Matzke, M. A. (2001). Resistance of RNA-mediated TGS to НС-Pro, a viral suppressor of PTGS, suggests alternative pathways for dsRNA processing, Curr Biol 11, 1119-23.

61. Michiels, F., Gasch, A., Kaltschmidt, В., and Renkawitz-Pohl, R. (1989). A 14 bp promoter element directs the testis specificity of the Drosophila beta 2 tubulin gene., EMBO J 8, 1559-65.

62. Mine, E., Courvalin, J. C., and Buendia, B. (2000). HP1 gamma associates with eu-chromatin and heterochromatin in mammalian nuclei and chromosomes, Cytogenet Cell Genet 90, 279-84.

63. Nakayama, J., Rice, J. C., Strahl, B. D., Allis, C. D., and Grewal, S. I. (2001). Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly, Science 292, 110-3.

64. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., and Li, E. (1999). DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development, Cell 99, 247-57.

65. Okano, M., Xie, S., and Li, E. (1998). Dnmt2 is not required for de novo and maintenance methylation of viral DNA in embryonic stem cells, Nucleic Acids Res 26, 2536-40.

66. Osgood, С. J., and Seward, S. M. (1989). 5-Azacytidine induces sex chromosome loss and interchange in immature germ cells of Drosophila mei-9 males, Environ Mol Mutagen 14, 135-45.

67. Рак, D., Pflumm, M., Chesnokov, I., Huang, D., Kellum, R., Mair, J., Romanowski, P., and Botchan, M. (1997a). Association of the origin recognition complex with het-erochromatin and HP1 in higher eukaryotes., Cell 91, 311-23.

68. Pal-Bhadra, M., Bhadra, U., and Birchler, J. A. (1999). Cosuppression of nonhomologous transgenes in Drosophila involves mutually related endogenous sequences, Cell 99, 35-46.

69. Pal-Bhadra, M., Bhadra, U., and Birchler, J. A. (2002). RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila, Mol Cell 9, 315-27.

70. Peters, A. H., Mermoud, J. E., O'Carroll, D., Pagani, M., Schweizer, D., Brockdorff, N., and Jenuwein, T. (2002). Histone H3 lysine 9 methylation is an epigenetic imprint of facultative heterochromatin, Nat Genet 30, 77-80.

71. Peters, M. E., and Ostrander, E. A. (2001). Prostate cancer: simplicity to complexity, Nat Genet 27, 134-5.

72. Plasterk, R. H., and Ketting, R. F. (2000). The silence of the genes, Curr Opin Genet Dev 10, 562-7.

73. Platero, J., Hartnett, Т., and Eissenberg, J. (1995). Functional analysis of the chromo domain of HP1., EMBO J 14, 3977-86.

74. Quivy, J. P., and Becker, P. B. (1997). Genomic footprinting of Drosophila embryo nuclei by linker tag selection LM-PCR, Methods 11, 171-9.

75. Raff, J., Kellum, R., and Alberts, B. (1994). The Drosophila GAGA transcription factor is associated with specific regions of heterochromatin throughout the cell cycle., EMBO J/3, 5977-83.

76. Reuter, G., Dorn, R., and Hoffmann, H. J. (1982a). Butyrate sensitive suppressor of position-effect variegation mutations in Drosophila melanogaster, Mol Gen Genet 188, 480-5.

77. Reuter, G., and Spierer, P. (1992). Position effect variegation and chromatin proteins., Bioessays 14, 605-12.

78. Reuter, G., and Szidonya, J. (1983). Cytogenetic analysis of variegation suppressors and a dominant temperature-sensitive lethal in region 23-26 of chromosome 2L in Drosophila melanogaster, Chromosoma 88, 277-85.

79. Reuter, G., Werner, W., and Hoffmann, H. J. (1982b). Mutants affecting position-effect heterochromatinization in Drosophila melanogaster, Chromosoma 85, 539-51.

80. Robertson, H., Preston, С., Phillis, R., Johnson-Schlitz, D., Benz, W., and Engels, W. (1988). A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster., Genetics 118, 461-70.

81. Roder, K., Hung, M. S., Lee, T. L., Lin, T. Y., Xiao, H., Isobe, К. I., Juang, J. L., and Shen, C. J. (2000). Transcriptional repression by Drosophila methyl-CpG-binding proteins, Mol Cell Biol 20, 7401-9.

82. Sabl, J., and Henikoff, S. (1996). Copy number and orientation determine the susceptibility of a gene to silencing by nearby heterochromatin in Drosophila., Genetics 142, 447-58.

83. Samson, M. L., and Wegnez, M. (1989). An approach to study the evolution of the Drosophila 5S ribosomal genes using P-element transformation, J Mol Evol 28, 51723.

84. Smith, M. M. (2002). Histone variants and nucleosome deposition pathways, Mol Cell 9, 1158-60.

85. Smothers, J. F., and Henikoff, S. (2000). The HP1 chromo shadow domain binds a consensus peptide pentamer, Curr Biol 10, 27-30.

86. Spofford, J. (1976). Position-effect variegation in Drosophila. In Genetics and Biology of Drosophila, M. Ashburner, and E. Novitski, eds. (London, Academic Press), pp. 955-1019.

87. Strahl, B. D., and Allis, C. D. (2000). The language of covalent histone modifications, Nature 403,41-5.

88. Strahl, B. D., Ohba, R., Cook, R. G., and Allis, C. D. (1999). Methylation of histone H3 at lysine 4 is highly conserved and correlates with transcriptionally active nuclei in Tetrahymena, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 14967-72.

89. Sun, F. L., Cuaycong, M. H., Craig, C. A., Wallrath, L. L., Locke, J., and Elgin, S. C. (2000). The fourth chromosome of Drosophila melanogaster: interspersed euchro-matic and heterochromatic domains, Proc Natl Acad Sci U S A 97, 5340-5.

90. Sun, F. L., Cuaycong, M. H., and Elgin, S. C. (2001). Long-range nucleosome ordering is associated with gene silencing in Drosophila melanogaster pericentric hetero-chromatin, Mol Cell Biol 21, 2867-79.

91. Thomas, G., and Elgin, S. (1988). Protein/DNA architecture of the DNase I hypersensitive region of the Drosophila hsp26 promoter published erratum appears in EMBO J 1988 0ct;7(10):3300., EMBO J 7, 2191-201.

92. Tulin, A., and Spradling, A. (2003). Chromatin loosening by poly(ADP)-ribose polymerase (PARP) at Drosophila puff loci, Science 299, 560-2.

93. Tulin, A., Stewart, D., and Spradling, A. C. (2002). The Drosophila heterochromatic gene encoding poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) is required to modulate chromatin structure during development, Genes Dev 16, 2108-19.

94. Tulin, A. V., Naumova, N. M., Aravin, A. A., and Gvozdev, V. A. (1998). Repeated, protein-encoding heterochromatic genes cause inactivation of a juxtaposed euchro-matic gene, FEBS Lett 425, 513-6.

95. Turner, В. M. (2000). Histone acetylation and an epigenetic code, Bioessays 22, 83645.

96. Turner, В. M., Birley, A. J., and Lavender, J. (1992). Histone H4 isoforms acetylated at specific lysine residues define individual chromosomes and chromatin domains in Drosophila polytene nuclei, Cell 69, 375-84.

97. Tweedie, S., Ng, H. H., Barlow, A. L., Turner, В. M., Hendrich, В., and Bird, A. (1999). Vestiges of a DNA methylation system in Drosophila melanogaster?, Nat Genet 23, 389-90.

98. Vaute, O., Nicolas, E., Vandel, L., and Trouche, D. (2002). Functional and physical interaction between the histone methyl transferase Suv39Hl and histone deacetylases, Nucleic Acids Res 30, 475-81.

99. Vlassova, I. E., Graphodatsky, A. S., Belyaeva, E. S., and Zhimulev, I. F. (1991). Constitutive heterochromatin in early embryogenesis of Drosophila melanogaster, Mol Gen Genet 229, 316-8.

100. Volpe, T. A., Kidner, C., Hall, I. M., Teng, G., Grewal, S. I., and Martienssen, R. A. (2002). Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation byRNAi, Science 297, 1833-7.

101. Wakimoto, В., and Hearn, M. (1990). The effects of chromosome rearrangements on the expression of heterochromatic genes in chromosome 2L of Drosophila melanogaster., Genetics 125, 141-54.

102. Waterborg, J. H. (1993). Dynamic methylation of alfalfa histone H3, J Biol Chem 268, 4918-21.

103. Weiler, K. S., and Wakimoto, В. T. (1998). Chromosome rearrangements induce both variegated and reduced, uniform expression of heterochromatic genes in a development-specific manner, Genetics 149, 1451-64.

104. Westphal, Т., and Reuter, G. (2002). Recombinogenic effects of suppressors of position-effect variegation in Drosophila, Genetics 160, 609-21.

105. Wines, D. R., Talbert, P. В., Clark, D. V., and Henikoff, S. (1996). Introduction of a DNA methyltransferase into Drosophila to probe chromatin structure in vivo, Chro-mosoma 104, 332-40.

106. Yang, D., Lu, H., and Erickson, J. W. (2000). Evidence that processed small dsRNAs may mediate sequence-specific mRNA degradation during RNAi in drosophila embryos, Curr Biol 10, 1191-200.

107. Zamore, P. D., Tuschl, Т., Sharp, P. A., and Bartel, D. P. (2000). RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals, Cell 101, 25-33.

108. Zhang, Y., and Reinberg, D. (2001). Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails, Genes Dev 15, 2343-60.

109. Zhao, Т., and Eissenberg, J. C. (1999). Phosphorylation of heterochromatin protein 1 by casein kinase II is required for efficient heterochromatin binding in Drosophila, J Biol Chem 274, 15095-100.

110. Zhao, Т., Heyduk, Т., and Eissenberg, J. C. (2001). Phosphorylation site mutations in heterochromatin protein 1 (HP1) reduce or eliminate silencing activity, J Biol Chem 276, 9512-8.

111. VUphxjbUx OlCLHa ^oJcTh/ / а Та* х-е плл^сГлл ha /Ра уу •Псылак , с^лГ-е 4 'fi■

112. OwJiUthO KO-l^ tvcSAcu^D^fuu'il G^jtrea t /!п?к 4 t

113. O/tecutcj О/ииши-у ut iba-cu/bct* И-С^СССЦb £

114. Л ыеЦлъм ccSjiyfH^f^aus ИМГр/jHгу /ол1.ycuSlцомсицЬ к&шеамм* ^af^fh к flu^f^t/* fbuuier/l^j<z J^O^M^^

115. Ж*^ • <JL iTUtUi Je^lz, д /^Sa/i/Ш <-fjJjJic^ / Сл/Я 5^a fyrvy*^