Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Цис- и транс-эффекты положения гена у Drosophila melanogaster: влияние хромосомных перестроек на репликацию и экспрессию генов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Цис- и транс-эффекты положения гена у Drosophila melanogaster: влияние хромосомных перестроек на репликацию и экспрессию генов"
I
О На правах рукописи
Абрамов Юрий Александрович
Цис- и транс- эффекты положения гена у ОгожрШа те1апо%а51ег влияние хромосомных перестроек на репликацию и экспрессию генов
(03 00 03- молекулярная биология)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических
0031В8989
МОСКВА-2008
003168989
Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики клетки Института молекулярной генетики РАН
Научный руководитель
кандидат биологических наук Г Л Коган
Научный консультант
доктор биологических наук, профессор, академик РАН В А Гвоздев
Официальные оппоненты
доктор биологических наук, профессор М Б Евгеньев доктор биологических наук Д В Муха
Ведущая организация Институт биологии гена РАН
Защита состоится « № » ИЮК 2008 г в Л
СО
_часов иа заседании
Диссертационного совета Д 002 235 01 при Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, г Москва, ул Вавилова, 32
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН
Автореферат разослан
.2008 г
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук
М Крицын
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Исследование эффектов поюжения гена, начатые в 30-х годах XX века (Muller 1930), сохраняют актуальность и в настоящее время, поскольку затрагивают вопрос о роли геномного окружения в регуляции экспрессии генов Специальный интерес представляет изучение роли гетерохроматина в инактивации генов, перемешенных в гетерохроматин или оказавшихся вблизи гетерохроматина В этом случае наблюдается эпигенетическая, клонально наследуемая, инактивация генов Характер процесса инактивации зависит от природы близлежащего гетерохроматина, вызывающего цис-инактивацию близлежащих эухроматиновых генов При исследовании цис-инактивации, вызванной гетерохроматином, обычно вне поля зрения остается вопрос о том, как при эу-гетерохроматиновых перестройках меняются свойства и функциональные характеристики гетерохроматина В настоящей работе исследуется изменение характера репликации гетерохроматина при разрыве гетерохроматинового блока, в результате которого один участок гетерохроматина перемещается в эухроматин, а другой оказывается в непосредственном соседстве с эухроматином
Особый интерес представляет явление транс-инактивации, обусловленное внедрением гетерохроматина в эухроматин и сопровождающееся транс-инактивацией гена в гомологичном районе оппозитной хромосомы Такой случай трансинактивации, обусловленный эу-гетерохроматиновой перестройкой, детально изучен только на примере так называемого доминантного эффекта положения в гене bw (bwD) Природа транс-инактивации на примере гена bw описывалась как результат «затягивания» близлежащих к гетерохроматину эухроматиновых генов и конъюгирующих с ними участков гомологичной хромосомы в гетерохроматиновый компартмент ядра (Hemkoff and Dreesen 1989) В данной работе подробно изучен случай транс-инактивации, вызванной эу-гетерохроматиновой инверсией
Цели и задами работы
Целью настоящей работы являлось исследование цис- и транс-эффектов положения с использованием генетических моделей, полученных в лаборатории биохимической генетики животных Отдела молекулярной генетики клетки ИМГ РАН Были поставлены следующие задачи 1 Исследовать возможность репликации гетерохроматина в политенных хромосомах в случае эу-гетерохроматиновых
перестроек 2 Изучить транс-действие гетерохроматииа на репликацию гетерохроматиновых повторов Stellate, перенесённых в эухроматин 3 Описать систему транс-инактивации генов, вызванную инверсией, в которой участок эухроматина ограничен гетерохроматиновыми блоками и транс-инактивирован 4 Исследовать роль известных гетерохроматиновых белков в процессе трансинактивации эухроматина в оппозитной хромосоме
Научная новизна
Показана репликация гетерохроматиновых блоков, в норме отсутствующих в политенных хромосомах, в эу-гетерохроматиновых перестройках Обнаружено, чго цис-эффект близлежащего эухроматина распространяется от эу-гетерохроматиновой границы внутрь гетерохроматинового блока Показано в политенных хромосомах транс-действие гетерохроматииа других хромосом на репликацию блоков гетерохроматииа, перенесенных в эухроматин Удаление большей части гетерохроматииа Х-хромосомы восстанавливало свойственную гетерохроматину, нормальную недорепликацию фрагмента гетерохроматииа, перенесённого в эухроматин, тогда как введение Y-хромосомы снова приводило к репликации фрагмента гетерохроматииа в перестройках
Описана инактивация эухроматиновых генов хромосомы 2, оказавшихся в результате эу-гетеоохроматиновой инверсии в участке эухроматина, ограниченного блоками гетерохроматииа Показано, что инверсия вызывает транс-инактивацию области эухроматиновых генов (~800 тип) оппозитной хромосомы Обнаружена прерывистость в распространении транс-инактивации генов гомологичной хромосомы Показано, что ключевой белок гетерохроматииа, гистонметилтрансфераза, кодируемый геном Su(var)3-9, не влияет на процесс трансинактивации, что говорит об особом типе гетерохроматинового сайленсинга при транс-инактивации В то же время другие известные модификаторы эффекта положения - Su(var)3-7 (ДНК-связывающий белок, содержащий цинковые пальцы), Su(var)5-6 (каталитическая субъединица протеинфосфатазы 1, регулирующая конденсацию хроматина в интерфазе), Su(var)3-1 (регулирует экспансию гетерохроматииа), Su(var)2-5 (НР1), e(y)3ul (активатор транскрипции эухроматиновых генов, репрессирует транскрипцию трансгенов в гетерохроматине и супрессируют транс-инактивацию трансгенов)
Апробация работы
Работа апробирована на лабораторном семинаре в отделе молекулярной генетики клетки (ОМГК) ИМГ РАН, на ученом совете ИМГ РАН и в Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардга РАН Данные, представленные в работе, докладывались на конференциях молодых учёных «Будущее молекулярной генетики» (ИМГ, 2004, 2006), на седьмой конференции по изучению гетерохроматнна (Италия, 2003) и на третьем съезде ВОГиС (6-12 июня 2004 Москва)
Структура и объем диссертации
Материал диссертации изложен на страницах, содержит J6 рисунков и 2 таблицы Список цитированной литературы включает 158 ссылок Диссертация включает в себя следующие разделы «Общая характеристика работы», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы», «Благодарности»
СОДЕРЖАНИЕРАБОТЫ 1 Эу-гетерохроматиновые перестройки препятствуют недорепликации близлежащего гетерохроматнна в политенных хромосомах
Ранее исследованная эу-гетерохроматиновая перестройка In(lLR)pn2a и ее производные Перицентрическая перестройка In(lLR)pn2a была получена облучением дикой лини Batumi (Ilyna, Sorokin et al 1980) Структуры изначальной перестройки In(lLR)pn2a и ей производные (mlOO, т141, г4, г16, и г9) описаны ранее (Tolchkov, Kramerova et al 1997, Tolchkov, Rasheva et al 2000) и суммированы на Рис 1, сюда же включены полученные в данной работе результаты, касающиеся локализации фрагментов Stellate, структура перестройки т141 быча скорректирована вопреки тому, что было опубликована ранее, в ходе работы было показано, что большая часть фрагментов кластера Stellate ( все, кроме фрагмента А) ассоциирована с перицентрическим блоком Xh гетерохроматнна Перестройки были сбалансированы на FM7, у'ы scs и1" vof В g4 Эффекты различных перестроек на репликацию гетерохроматиновых фрагментов в политенных хромосомах были проверены на самках Batumi/R , где R обозначает перестройку X хромосомы Самки Batumi/R получены скрещиванием самок R/FM7 с самцами Batumi Чтобы отличить личинок Batumi/R от их сестер Batumi/F\17, была использована FM7i балансерная хромосома, несущая GFP трансген (FM7i, P{w+mC=ActGFP}JMR/C(l)DX) Самки, несущие
дополнительную Y хромосому, были получены и результате скрещивания самок recR/FM7 с самцами у2 su(w°)YsYly'' , где recR ообозначает реко.мбинантную хромосому. Все использованные балансеры и маркеры описаны (Lindsley and Zimm 1992).
Детальное исследование влияния эухроматина на политенизацию фрагментов кластера Stellate при эу-гетерохроматиновых перестройках можно было выполнить только после картирования в кластере полиморфных fcoRI фрагментов Stellate. Для этих целей, прежде всего, необходимо было получить X-хромосому, лишенную этого кластера, чтобы у самок на ее фоне можно было бы детектировать фрагменты кластера. Для установления структур фрагментов Stellate, отколовшихся от прицентромерного гетерохроматинового блока, необходимо было получить рекомбинантные Х-хромосомы, содержащие только отколовшиеся фрагменты и лишенные основного центромерного блока кластера Stellate.
XR XL
SCLR hSte
ml 00
Рис.1.— Схема гетерохроматиновых частей вторичных перестроек, полученных облучением Iti(lLR) рп2а (рп2а). Эта хромосома является инверсией с точками разрыва в XR (секция h34) и эухроматике, несущая целостный интактный гетерохроматин XL (Toichkov, Kramerova et al. 1997; Toichkov, Rasheva et al. 2000). Полная структура сложных перестроек представлена ранее (Toichkov, Rasheva et а!. 2000); здесь, для простоты, опущены транслоцированные центромерные сегменты перестроек тЮО, г!6, и r4. D, С, Е, и А показывают локализацию соответствующих полиморфных ЕсоШ фрагментов Stellate (см. рис.4), что представляет один из результатов настоящей работы по локализации фрагментов гетерохроматинового кластера Stellate. Тёмные сегменты указывают на районы гетерохроматинового кластера Stellate, которые реплицируются в политенных хромосомах. Повторы Stellate обозначены в гетерохроматине (SCLR и hSte) и эухроматине (euSte) Х-хромосомы. Эухроматин изображен линией. Отдельные сегменты Х-гетерохроматина (Xh) изображены и пронумерованы согласно Gatti et al. (1994). Сегмент 29 содержит ядрышковый организатор (NO); С, центромера; Ste, кластер повторов Stellate; SCLR, проксимально локализованные повреждённые повторы Stellate, прерванные инсерциями мобильных элементов (Nurmmsky et al. 1994; Tulin et al. 1997).
Получение хромосом Df(l)hSte и Df(l)12.
Хромосома Df(I)hSte у ас se u< , содержащая нехватку всех hSte копий и SCLRs, была получена в результате рекомбинации у самцов хромосомы Dp r9/Y и У хромосомы по ядрышковому организатору в секции Ь29 (Рис.2). Dp г9 является производной от хромосомы r9 (Tolchkov, Rasheva et al. 2000) и содержит дупликацию эухроматинового района 1А-2Е, несущего гены у ас* and se*. В результате рекомбинации Dp г9 потеряла h26 сегмент, который содержит повторы генов Stellate (Palumbo et al. 1994; Tulin et al. 1997) и приобрела короткое плечо Y-хромосомы (У6) (Рис.2) Самцы и гомозиготные самки, несущие эту хромосому - жизнеспособны и фертильны. Отсутствие материала генов Stellate у самок в хромосоме Df(l)hSte было показано саузерн-анализом геномной ДНК с использованием ¿Ve/tee-спсцифи ческой пробы.
Dp г0
Яг SCUt NO
Рис.2.— Схема получения хромосомы DJ(l)hSte, лишенной гетерохроматиновых повторов Stellate. Эта хромосома была получена путем рекомбинации между производной хромосомы г9, несущей дупликацию района 1А-2Е {Dp г9), и коротким плечом У хромосомы. Vs и У,1' соответственно, обозначают короткое и длинное плечо У хромосомы. Другие обозначения, такие же, как на рис. 1.
Хромосома Df(I)I2 (Рис.1) несла частичную делецию дистального Xh и отобрана в потомстве облучённых (4 krad) самцов In(lLR)pn2a, »>, скрещенных с самками w" / suff). Самки Df(l)12IFM7, несущие предполагаемую делецию su(f) и дистального Xh, были проверены на присутствие ядрышкового организатора с помощью скрещивания с самцами ln(l)sc4L scsr/BsY, несущими нехватку ядрышкового организатора. Полученные в результате скрещивания самки Df(l)12/ln(l)sc4L scSR были жизнеспособны, что указывает на присутствие, по крайней мере части ядрышкового организатора в хромосоме Df(l)12 (Рис.1) (Попкова и др.).
С помощью саузерн-анализа в настоящей работе показано, что хромосома Df(l)l2 несла частичную нехватку (фрагменты А и Е) гетерохроматинового кластера Stellate (рис.4а).
Создание рекомбинантных хромосом - производных перестроек тЮО и ml41, лишенных значительной части Xh блока.
Для исследования репликации отколовшихся от прицентромерного блока фрагментов гетерохроматина в перестройках тЮО и т141 получали их производные (R) с нехваткой большей части прицентромерного гетерохроматина Xh (Рис.ЗА). Для этого самок R/FM7 скрещивали с самцами с перицентрической инверсией In(l)scs> и отбирали рекомбинантные хромосомы v f в потомстве самок R/scsl. Рекомбинантная хромосома v f , утрачивающая у* асх sc' и примыкающий Xh, однако сохранявшая блок центромерного Xh хромосомы scsi, была отобрана в потомстве самок R/sc5', скрещенных с самцами Df(l)hSte, у ас sc w/Y.
а
ln(l)sc vf
» Sir Г
-t.......Т'1. 1
2? 28 ,
-nsi—t-
Ц!
Рис.3.—(а) Схема получения рекомбинатной хромосомы, утрачивающей дистальный гетерохроматин Xh. Гетерохроматиновые блоки изображены как на рис.1. Расположение генов показано согласно цитологической карте. Ste, локализация эухроматиновых повторов Stellate. Ste* и Ste полиморфные эухроматиновые кластеры в перестройках Л'хромосомы scsi ирп2а. соответственно. (Ь) Саузерн анализ повторов Stellate в рекомбинантных хромосомах после рестрикции геномных ДНК Cfo\.
Число копий повторов Stellate в эухроматине хромосом In(l)scsi значительно больше числа копий эухроматиновых генов Stellate в Batumi (фрагмент 0.95-kb Cjo\). В
рекочбинатных хромосомах v f, как и ожидалось, в результате рекомбинации в районе между эухроматиновым кластером Stellate 12Е и геном / обнаруживали эухроматиновые повторы Stellate хромосомы scsl (РисЗЬ) Для исследования организации блока гетерохроматиновых повторов Stellate и их репликации использовали саузерн-анализ геномной ДНК самок rec/Df(l)hSte с фенотипом у ас sc
где гес обозначение рекомбинантов-производных тЮО и т!41, лишенных проксимального сегмента Xh
Картирование рестриктных фрагментов кластера гетерохроматиновых повторов Stellate
Гетерохроматиновые повторы Stellate, как известно, недореплицированы в политенных хромосомах, (Shevelyov 1992, Tulin, Kogan et al 1997) в пробах ДНК из имаго обнаруживаются все имеющиеся в геноме копии эу- и гетерохроматиновых повторов Stellate, однако в норме только эухроматиновые копии генов Stellate представлены в ДНК слюнных желез Сравнительный саузерн-анализ ДНК самок линии Batumi, послужившей источником всех использованных в работе Х-хромосом с перестройками в дистальном блоке прицентромерного гетерохроматина, выявил образование нескотьких £со R1 рестриктов, содержащих материал гетерохроматиновых повторов Stellate, различающихся по величине А(>23 т п н), В/С, D, Е (<3 т п н) (Рис 4) Дублет В/С показан на Рис 1 как фрагмент С Фрагменты 13 и 0 8 т п н происходят из тандемных повторов SCLR, содержащих поврежденные фрагменты копий Stellate, прерванные имсерциями мобильных элементов (Nurminsky et al 1994) Все перечисленные фрагменты отсутствуют в ДНК слюнных желез (Рис 4а) Недорепликация фрагментов в слюнных железах указывает на их принадлежность к конститутивному гетерохроматину Фрагмент А образован регулярным тандемным повтором генов Stellate, не содержащим сайтов £coRl При его рестрикции с помощью С/о1 образуются единицы повтора размером 1 15 тин (Рис ЗЬ) В ДНК слюнных желез самок линии Batumi и гомозиготных самок Df(l)hSte обнаруживаются только фрагменты величиной — 10,5 и -3,5 тпн , соответствующие эухроматиновым повторам Stellate, локализованным в районе 12D Х-хромосомы Таким образом, у гомозиготных самок Df(l)hSte, жизнеспособных и фертильных, лишенных большей части блока h26, полностью отсутствуют гетерохроматиновые повторы Stellate (Рис 4а) Саузерн-анализ ДНК самок Df(l)12/Df(l)hSte, гетерозиготных по делениям проксимального гетерохроматина Х-хромосомы не обнаруживал фрагментов А и Е, в то время как выявлялись фрагменты В/С, D, и
проксимально локализованные SCLR повторы (Tulin, Kogan et al 1997), (Рис 4a) Таким образом, в линии Df(l)12 в результате делеции удалены самые дистапьные районы кластера Stellate (Рис 1), которые на основании проведенного саузерн-анализа содержат регулярные тандемные повторы (Tulin, Kogan et al 1997) А и E фрагментов Цитологический анализ показал, что в перестройках т 100 и т141, район h26, содержащий кластер гетерохроматиновых генов Stellate, расколот и часть его в случае перестройки тЮО перемещена в серединный эухроматин Х-хромосомы и в случае перестройки т141 в XL теломеру (Tolchkov, Rasheva et al 2000) Чтобы идентифицировать в этих перестройках перемещённые EcoRl фрагменты Stellate, мы получили рекомбинатные хромосомы (rec ml 00 и гес т141), несущие перемещённый (отколовшийся) h26 район, на фоне нехватки большей части проксимального Xh (районы h27-h30, рисЗ) Саузерн анализ тотальной ДНК из самок линий Df(l)hSte/recl00 и Df(l)hSte/recl41, показал присутствие А и Е фрагментов Stellate в h26 сегменте, перемещённом в эухроматин хромосомы reel 00 , в то время как только А фрагмент, содержащийся внутри h26 сегмента, оказывается перемещенным к теломере в хромосоме гес141 (Рис4Ь) Эти результаты подтверждают, что внутри большого блока гетерохроматинового кластера Stellate фрагменты А и Е - самые дистальные, в то время как фрагменты В/С и D расположены проксимальнее в сегменте Ь2б (Рис 1)
Гетерохроматиновые фрагменты Stellate реплицируются в политенных хромосомах отдельных перестроек
In(lLR)pn2a содержит целостный Х-гетерохроматиновый блок Stellate (Рис 1), но гетерохроматиновые Stellate фрагменты не обнаруживаются в ДНК политенных хромосом самок In(LR)pn2a/Batumi, обработанной ЕсоШ (Рис 4с) Однако, мы обнаружили, что гетерохроматиновые Stellate повторы представлены в ДНК слюнных желез из мух, несущих вторичные перестройки В самках mlOO/Batumi фрагменты А, Е, и В/С, перемещенные к эухроматину, представлены в ДНК слюнных желез, в то время как фрагмент D, который остаётся внутри гетерохроматина, не детектируется (Рис 4с) Саузерн-анализ ДНК из политенных хромосом cavoK Batumi/ml41, демонстрирует значительную репликацию фрагмента Е, тогда как фрагмент А практически не детектируются (Рис 4с) Интересно, цитогенетический анализ тЫ1 показывает присутствие дополнительного гетерохроматинового материала в теломерном районе этой хромосомы (Tolchkov, Rasheva et al 2000) Таким образом, возможно причиной репликации фрагмента Е является близость к эухроматину, тогда как более дистальный фрагмент А (рис 1) остаётся недопредставленным вследствие
j) sclr sie
NO »BiCEA
..................————— Dfrl/HSle
ЛЕ
...........................iggg—rtcmlOO
recml41
Рис. 4.— Саузерн-блот анализ геномных повторов Stellate после рестрикции EcoRI . (а) Недопредставленность £coRI фрагментов (А, В/С, D, и Е), содержащих гетерохроматиновые повторы Stellate и SCLR в случае делеций гетерохроматина. ей, эухроматиновые фрагменты. Показан размер фрагментов Stellate (в т.н.п.), включая повторы SCLR. (b) Пробы ДНК выделены из самок. Рекомбинантные хромосомы несут перемещённые гетерохроматиновые повторы Stellate, (с) Обнаружение гетерохроматиновых фрагментов Stellate в DNA из слюнных желез мух, несущих различные перестройки, (d) Схема X хромосомной структуры перестроек, использованных в Саузерн-анализе. Пунктирной линией показаны делетированные сегменты, другие обозначения такие же, как на рис. 1.
его попадания в теломерный гетерохроматин. В ДНК из слюнных желез самок перестройки rl6/Batumi детектируется только след фрагмента А (Рис.4, с и d). Отсутствие политенизации гетерохроматиновых Stellate было отмечено для перестроек г4 и г9 (900 ядер, 60 личинок). Перестройка г4 содержит неповрежденный дистальный район Xh, содержащий секции h26-h29 и интактную эу-
Рис.5.— Детекция повторов Stellate в политенных хромосомах с помощью гибридизации in situ. Обозначения структуры перестроек такие же, как на рис. 2. С соответствует полосе В/С (см. текст). Показан неспаренный 1А-2Е эухроматиновый район хромосомы Batumi. Район 2Е наблюдается либо возле хромоцентра (Ь и с), либо отделённым от него, (а) самки pn2a/Baiumi. Показана детекция эухроматинового кластера Stellate 12Е (стрелка) и отсутвие окрашивания повторов Stellate в хромоцентре; толстой стрелкой показан 2F теломерный район (Т) рп2а и неспаренный район 1A-2F хромосомы Batumi, (b) Детекция повторов Stellate в хромоцентре и 12Е районе самок ml41/Batumi (не показан внутренний X хромосомный фрагмент дистальнее района 12Е). (с) паттерн окрашивания в самках rl6/Batumi. (d) Stellate гибридизация на политенных хромосомах самцов mlOO/Y. Отмечена поломка X хромосомы в месте ново- сформированной "слабой точки" в 5D; в хромоцентре чётко выявляется сигнал Stellate ,как и в 12Е и районе 5D.
гетерохроматиновую границу (Рис.1 и 4d). Перестройка г9 характеризуется перемещением внутренних сегментов Xh блока (Рис.2 и Tolchkov, Rasheva et al. 2000), но при этом не изменяется эу-гетерохроматиновая граница.
Дополнительная очевидность сверхпредставленности гетерохроматиновых повторов Stellate была получена с помощью гибридизации in situ последовательностей Stellate и политенных хромосом. Не обнаружена гибридизация Stellate с хромоцентром самок pn2a/Batumi (Рис.5а) (800 ядер, 50 личинок посчитано), в то
время как сильный сигнал был отмечен в районе 12Е, где локализуются эухроматиновые варианты Stellate (Palumbo, Bonaccorsi et al 1994) Напротив, высокая воспроизводимость и сильное окрашивание хромоцентра было отмечено на политенных хромосомах самок ml41/Batumi и rl6/Batumi (Рис 5, b и с) Это соответствует результатам, полученным с помощью саузерн-анализа этих генотипов Анализ представленности гетерохроматиновых последовательностей Stellate с помощью гибридизации in situ был выполнен на самцах mlOO/Y Перемещённые фрагменты А и Е четко детектировались в эухроматиновом районе 5D в виде появляющегося района «слабой точки» (здесь часто обнаруживается разрыв хромосом), соответствующей перемещенному гетерохроматиновому блоку (Рис 5d) В девяноста процентах ядер (900 ядер, 50 личнок) из слюнных желез самцов mlOO/Y в хромоцентре обнаруживался сигнал Stellate Этот результат соответствует наблюдаемой сверхрепликации фрагмента £coRI С, который в ml 00 остается в основном блоке Xh, но примыкает к новой эу-гетерохроматиновой границе (Рис 2 и 4, с и d) Сигнал гибридизации в хромоцентре, наблюдаемый в самцах mlOO/Y, не является следствием гибридизации Y хромосомных повторов Supressors of Stellate (Livak 1990), гомологичных повторам Stellate, так как Y хромосома полностью недореплицируется в слюнных железах Дополнительным экспериментальным подтверждением отсутствия гибридизации Y хромосомных повторов Supressors of Stellate является отсутствие сигнала Stellate в хромоцентре самцов In(LR) pn2a/Y (500 ядер, 30 личинок)
Гетерохроматнн гомологичной Х-хромосомы, также как и У хромосома, вызывают trans эффекты, способствующие репликации гетерохроматиновых повторов SteUate в эу-гетерохроматиновых перестройках.
Показано, что сигнал Stellate , наблюдаемый в районе 5D политенных хромосом мух ml00, исчезает (500 ядер, 35 личинок) в самках rec ml00/Df(l)hSte , содержащих нехватку большей части гетерохроматина Х-хромосомы, присутствующего в исходной хромосоме тЮО (Рис 6а) Недорепликация этого района в политенных хромосомах сохранялась в последующих поколениях самок rec ml00/Df(l)hSte (400 ядер, 30 личинок) Саузерн-анализом ДНК из слюнных желез самок rec ml00/Df(l)hSte также не удалось детектировать фрагменты Stellate А и Е, в то же время фрагменты А и Е обнаруживаются в препаратах ДНК самок тех же самых мух (Рис 4Ь) Аналогичные результаты были получены с самками rec ml41/Df(l)hSte Е фрагмент, который четко детектируется в ДНК из слюнных желез мух m!41/Df(l)hSte
rec ml 00
IB
Sle
'Г&ШШШ
rec m 100/Df(1)hSte
rec mIOO/XY
IB у rec ml00 j"
Рис. 6.—Делеция X гетерохроматина вызывает недорепликаиию перемещённых гетерохроматиновых фрагментов Stellate, в то время как добавочная Y хромосома восстанавливает репликацию, (а) Отсутствие сигнала Stellate в районе 5D в личинках rec mlOO/Df(l)hSte. (Ь) Восстановление репликации перемещённых гетерохроматиновых фрагментов Stellate в личинках rec тЮО/ . (с) Схема политенных хромосом
rec mlOO/Df(l)hSte. Хромосома rec тЮО несёт терминальную дупликацию 2F-5D района, отмеченную толстой пунктирной линией, которая спарена с Df(l)hSte (тонкая линия); вся остальная часть rec тЮО хромосомы (пунктирная линия), представлена спаренным и неспаренным районом. Эктопическое спаривание наблюдается между 5D и 20F районами, (d) Изображение X хромосомы, унаследованной от X Y самцов (сплошная линия), спаренной с rec тЮО (тонкая пунктирная линия) и 2F-5D фрагментом этой хромосомы (толстая пунктирная линия).
(Рис.4с), полностью исчезает в политенных хромосомах самок rec m!41/Df(l)hSte, несущих делецию большей части гетерохроматина Х-хромосомы, присутствующего в исходной хромосоме т141 (Рис.4Ь). Однако гибридизацией in situ показано восстановление репликации фрагмента АЕ в самках rec тЮО/ XY, несущих добавочную У хромосому (Рис.бЬ) (40% ядер, 600 ядер, 50 личинок). Эти результаты показывают, что добавление или делеция гетерохроматина в политенных хромосомах могут супрессировать или усиливать недорепликацию гетерохроматиновых повторов Stellate, приближенных к эухроматину.
2. Транс-эффекты положения, вызванные эу-гетерохроматиновой инверсией 1п(2)А4.
Одним из свойств прицентромерного гетерохроматина является склонность к транс-взаимодействиям, то есть к ассоциации блоков гетерохроматина на гомологичных хромосомах В хромосомных перестройках в результате трансвзаимодействия перемещенных блоков гетерохроматина с прицентромерным районом в ряде случаев возникает транс-инактивация конъюгированных с этим районом эухроматиновых генов, расположенных на интактной оплозитной хромосоме (Talbert, LeCiel et al 1994, Weiler and Wakimoto 1995, Csink and Hemkoff 1996) В литературе известна всего лишь одна хорошо щученная система, описывающая трансинактивацию эухроматиновых генов в результате инсерции большого блока гетерохроматинового сателлита AAGAG в кодирующую последовательность гена brown (Hemkoff and Dreesen 1989) Предполагается, что в этом случае инактивация неповрежденного гена brown оппозитной хромосомы происходит в результате "затягивания" района локализации гена brown нормального гомолога в гетерохроматиновый компартмент вследствие конъюгации гомологичных эухроматиновых районов (Hemkoff and Dreesen 1989, Sage and Csmk 2003) В данной работе исследовали инактивацию трансгенов, локализованных в нормальном гомологе, вызванную хромосомой, в которой инвертированный фрагмент эухроматина хромосомы 2 находится в гетерохроматиновом окружении
Структура инверсии Iit(2)A4
С помощью облучения (4krad) у мух D melanogaster из исходной линии у\/'7с2\ несущей трансген Р[mini-white, 6Ste], который содержал репортёрный ген mini-white с прилежащими шестью тандемными гетерохроматиновыми повторами Stellate, была получена инверсия 1п(2)А4 с разрывами в эухроматине и гетерохроматине (Рис 7) У особей yw67c2s In(2)A4/Cy трансген mmi-white, перенесённый в результате инверсии к гетерохроматину, практически не экспрессируется за исключением отдельных, редких, слабо окрашенных участков глаза, демонстрируя мозаичный эффект положения Цитологический анализ политенных хромосом показал перемещение трансгена 39С в гетерохроматин хромосомы 2 (Рис 7 и 8) С помощью ПЦР и in situ гибридизации с различными зондами для генов этого района была установлена приблизительно точка разрыва инверсии в эухроматине, локализованная дистальнее гена Ret С помощью транспозазы была получена хромосома [1п(2)А4]* без Р-элемента в результате эксцизии инсерции P[mim-white, 6Ste\ из инверсии 1п(2)А4 (рис 7)
/1п(2)А41 */Р[тЫ- ккИе]
Р[тт>л\'Кие]
Рис.7. Происхождение и индуцируемые эффекты инверсии 1п(2)А4. Синими стрелками показаны точки разрыва в инверсии 1п(2)А4. Зелёной линией обозначена нормальная хромосома, фиолетовой - хромосома с инверсией 1п(2)Л4, красной -хромосома [1п(2)А4\*. Треугольниками показаны инсерции репортёрного гена т/ш-\vhite.
39В
А АС АС: проба
(Г>: сат*^1лнг)
Нормальная хромосома
егерохромятчновып обогащение белком НР1
комиартмснт
— района 39В;
гетерохроматиновый,
а / ядерный компяртмент, \ НР1 окрашивание | (желтый)
IV
Средняя дистанция 6 мкм 12
Средняя дистанция 3.3 мкм ± 0.5
Инверсия А4
ААСАС здв
Рис.8. Характеристика инверсии с помощью ЗБ конфокальных изображений.
Показано изменение внутриядерной локализации эухроматинового фрагмента 39В в гомозиготе с инверсией 1п(2)А4 и перемещение этого района в область, обогащенную белком НР1, в район хромоцентра.
(а). Уменьшение расстояния между гетерохроматиновым сателлитом ААСАС и уникальным районом 39В в 3D конфокальных изображениях ядер из слюнных желез гомозиготных самок с инверсией 1п(2)А4 по сравнению с самками дикого типа (Canton-S). Биотинилированные олигонуклсотиды ААСАС и DIG-меченый зонд уникального фрагмента из района 39В( вблизи оухроматиновой точки разрыва в 1п(2)А4 ) использованы как пробы для иммуно-FISH. (Ь). Обогащение белком НР1 района 39В в инверсии 1п(2)А4.
Хромосома 1п(2)Л4 способна индуцировать транс-инактивацию трансгенов mini-white, располагающихся в район- 39А-Е хромосомы 2.
Исследовали влияние хромосом [1п(2)А4\* и/или 1п(2)А4 на экспрессию mini-white трансгена в инсерциях, располагающихся в районе 39-40 хромосомы 2 (Рис.9). В подавляющем большинстве случаев наблюдалась мозаичная окраска глаза по типу "соль и перец". Для некоторых инсерций наблюдали полное подавление экспрессии mini-white, что выражалось вотсутсгвии окраски глаза.
нет инактивации
гетерохроматиновая точка разрыва
инактивация
инакшвируются инсерции, находящиеся вне инверсии, перед точкой разрыва
не инаетивируются инсерции, находящиеся в пределах инверсии
Nhe
t39B
эухроматщовая точка разрыва
гетерохроматиновый компартмент
с трансгенами mini-white
Рис.9. Looping-модепь, и транс-инактивация инсерций, содержащих репортерный ген mini-white, хромосомой [1п(2)А4\*. Красной линией обозначена хромосома [1п(2)А4]*, зелёной - хромосома несущая инсерцию с трансгеном mini-white. Красным треугольником обозначены инсерции, которые подвергаются транс-инакгиващи, синим - которые не подвергаются. Показаны гены Nhe, Ret, Hr39, Mio, tsh и локус шстоновых генов (Hist).
Было использовано (в основном из коллекции Bloomington(BL) около 80 линий с инсерциями трансгена с репортерпым геном mini-white Для большинства инсерций известно точное местоположение в геноме Скрещивали самок [1п(2)А4]*/Су или 1п(2)А4/Су с самцами BL и сравнивали окраску глаз у самцов и самок In(2)A4/BL с самцами и самками BL/Cy
Оказалось, что хромосомы [1п(2)Л4\* и 1п(2)А4 вызывают транс-инактивацию инсерций в районе 39А-Е и не оказывает влияния на инсерции, расположенные дистальнее района 39А и проксимальнее района 39Е6 левого плеча хромосомы 2 Транс-инактивация проявляется в снижении пигментации или, как правило, появтении мозаичности по типу "соль и перец" в транс-гетерозиготных мухах In(2)A4/BL (самцы и самки) с двумя дозами трансгена по сравнению с мухами BL/Cy с одной дозой трансгена
Весь район, на который распространяется транс-инактивация, составляет примерно 800 т п н Начинается район с инсерции 19582 в гене Dapl60, цитологически находящемся в районе 39А4, а заканчивается инсерцией 19883 в гене сг//-Д39Е6) Инсерции, расположенные дистальнее или проксимальнее этого района, не транс-инактивируются хромосомами [1п(2)А4]* и 1п(2)А4 Механизм трансинактивации в нашем случае представляется следующим образом (рис 9) Спаренные гомологичные участки района 39А-40, нормальной и перестроенной хромосомы 1п(2)А4, образуют петлю размером более 600 т п н В перестроенной хромосоме эухроматиновый район 39-40 предполагаемой петли ограничен гетерохроматином В результате петля "затягивается" в гетерохроматиновый компартмент за счет взаимодействия отколовшегося блока гетерохроматина в перестроенной хромосоме с основным блоком гетерохроматина хромосомы 2 Отколовшийся блок гетерохроматина "затягивает" петлю 39-40 в гетерохроматиновый компартмент Таким образом, в основе наблюдаемой мозаичной транс-инактивации лежит механизм гетерохроматинового затягивания Перемещение инактивируемых инсерций трансгена mim-white, расположенных на нормальном гомологе, из эухроматинового компартмента в гетерохроматиновый, показано на итерфазных ядрах политенных хромосом с помощью гибридизации in situ с зондом репортёрного гена white
Трансгены, находящиеся на оппозитной хромосоме, по генетической карте дистальнее точки разрыва до 100 т н п, также сильно инактивируются хромосомами [1п(2)А4\* и 1п(2)А4 Таким образом, затягиваются и инактивируются инсерции, находящиеся не только в пределах инверсионной петли, но и инсерции, располагающиеся вне петли на расстоянии до 100 т п н
Тем не менее обнаружены единичные случаи отсутствия эффектов трансинактивации для некоторых инсерций в пределах района 39А-39Е. (рис. 10). Так, например, наблюдается мозаичная экспрессия трансгена 41К в гене Mio, тогда как для инсерции 20102, отстоящей от инсерции 41К всего на 800 н.п. и находящейся в межгенном промежутке, транс-инактивация не наблюдалась. В то же время для инсерцни 12400, отстоящей от инсерции 20102 всего на 500 н.п. и находящейся уже в 5' области гена сгс, мы снова наблюдали транс-инактивацию. Интересна ситуация и с двумя инсерциями в гене сгс. Ген сгс кодирует ДНК связывающий белок, регулирующий транскрипционную активность. Инсерция 12400, находящаяся в 5' области гена сгс, как было сказано выше - транс-инактивируетя. В то же время инсерция 21396, которая находится в том же гене, но в 3' области - не транс-ин активируется.
Рис.10 . Неравномерность транс-инактивации в пределах одного гена. Темным треугольником обозначены инсерции, которые подвергаются транс-инактивации, светлым - которые не подвергаются.
Аналогичный случай и для двух инсерций в гене Нг39, когда инсерции, находящиеся в начале (5') и конце (3') одного и того же гена, проявляли разную чувствительность к транс-инактивации причины которой, остаются невыясненными.
Наблюдаемая прерывистость способности к транс-инактивации на относительно небольших расстояниях в настоящее время не имеет разумного объяснения, однако в этом процессе могут играть роль как цис-действующие последовательности, усиливающие или ослабляющие транс-инактивацию, так и специфическая структура хроматина, меняющаяся в процессе транскрипции гена. Не исключено, что наблюдаемая в наших опытах прерывистость транс-инактивации трансгенов, возможно, связана с уровнем экспрессии генов, в которых находится
i
инсерции подвергающиеся транс-инактивашш
Mio
инсерции не подвергающиеся транс-инактивации
инсерция Инсерции, содержащие репортйрный ген mini-white и энхансер для гена white - не подвергались транс-инактивации По-видимому, сила промотора (экспрессии) и характер модификаций нуклеосом в области промотора определяют в значительной степени способность трансгена к транс-инактивации
Гены-модификаторы эффекта положения и транс-инактивация гена mtnt-white, хромосомами [ln(2)A4\* н 1п(2)А4
Мутантные аллели ряда известных генов-супрессоров эффекта положения (см табл 1) супрессируют транс-инактивацию репортбрных генов, однако мутация в гене Su(var)3-9, кодирующем гистонметилтрансферазу и ответственного за метилирование лизина 9 в гистоне НЗ, не оказывала заметного влияния (Табл 1), несмотря на то, что гистонметилтрансфераза входит в состав НР1 сайленсирующего комплекса Вероятно, в этом случае мы имеем дело с особым типом гетерохроматина и гетерохроматинового сайленсинга, отличного от классического ЭПМ
Табл.1 Влияние генов-модификаторов классического ЭПМ на трансинактивацию гена mini-white хромосомами \1п(2)А4]* и 1п(2)А4 _
Ген- модификатор Функция продукта гена аллель Степень супрессии транс-инактивации
Su(varJ3-l кодирует эухроматановую НЗ-БЮ киназу, регулирует гетерохроматиновую Экспансию Su(var)3'lul Средне
Su(\ar)2-5 НРI, структурный белок гх Появляется в районах эухроматина, конденсированного вследствие ЭПМ Su(varj2'5'i' -ноль мутация Очень сильно
Su(var)3-9 Структурный бе ток гх, гистонметилтрансфераза К9НЗте ■ ночь мутацкя Не влияет
Su(var)3-6 Каталитическая субъединищ протеинфосфзтазы 1(РР1) РР1 регулирует конденсацию хроматина в интерфазе Su(var)3-6" Сильно
Su(var)3-7 Кодирует ДНК связывающий белок, Содержит домен Цинковые пальцы Sufvar) 3-lDf Su(var) 3-7pI2 Sufvar) 3-7p43 Очень сильно
# Активатор транскрипции эухроматиновых генов репрессирует экспрессию трансгенов в гетерохроматине e(y)3"~ ноль мутация Очень сильно
Подобная ситуация была описана в работе (Haynes, Gracheva et al 2007), где на системе трансгенных инсерций, распочагаюшихся на хромосоме 4, отмечали отсутствие супрессирующего влияния Su(var)3-9
Среди существующего многообразия уровней регуляции экспрессии гена одним из самых значитечьных, является уровень, обеспечивающий пространственное позиционирование хромосом в ядре (Wakimoto and Hearn 1990, Weiler and Wakimoto 1995, Talbcrt and Hemkoff 2006) Мы показали, что эу-гетерохроматиновые перестройки могут глобально менять экспрессию целых блоков хромосомы не только в цис- но и в транс-положении, изменяя локализацию в ядре не только инвертированного, но и нормального гомолога Подобные исследования моделируют взаимосвязь между пространственной внутриядерной локализацией хромосом и экспрессией генов в эухариотической клетке
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Как известно, эу-гетерохроматиновые перестройки вызывают недопредставленность эухроматиновых последовательностей, перемещенных к гетерохроматиьу Распространение компактизации хроматина и недопредставленности от эу-гетерохроматиновой границы в эухроматин широко документировано на политенных хромосомах (Ananiev and Gvozdev 1974, Spradlmg 1993, Lavrov et al 1998, Zhimulev 1999) Мы увидели "эухроматинизацию" гетерохроматина, которая, возможно, является следствием распространения эухроматиновой репликации на примыкающий гетерохрочатин в политенных хромосомах, несущих эу-гетерохроматиновые перестройки Это явление можно считать особым типом эффекта положения, приводящим к нарушению нормального процесса недопредставченности гетерохроматина в политенных хромосомах Мы определили относительное расположение вдоль дистального района гетерохроматина Х-хромосомы (район h26) фрагментов EcoRI гетерохроматинового кластера повторов Stellate Индуцировали серии перестроек, включающих секцию h26, цитологически и молекулярно определили их точки разрыва в гетерохроматине Это позволило нам продемонстрировать распространяющийся цис-эффект, идущий от эухроматина, на репликацию гетерохроматиновых последовательностей, которые в результате хромосомных перестроек приобретают новую эу-гетерохроматиновую границу Было показано, что район кластера Stellate, который вследствие перестроек приближается к эухроматину, начинает сверхреплицироваться в политенных хромосомах, в то время
как участок кластера Stellate, расположенный более дистально к эухроматину, сохраняет нормальную недорепликацию Согласно нашим представлениям, этот результат демонстрирует, что распространяющийся эффект на репликацию гетерохроматина может исходить из участков приближенного эухроматина В таком случае распространяющийся цис-эффект может быть объяснен либо вовлечением эухроматиновых ориджинов репликации в репликацию гетерохроматиновых повторов Stellate, либо активацией криптических ориджинов репликации гетерохроматина, приближенных к новой эу-гетерохроматиновой границе Предположение, что распространяющийся цис-эффект стартует из прилежащего эухроматина, позволяет нам предположить, что естественная эу-гетерохроматиновая граница в норме выполняет функцию барьера между недореплицированным гетерохроматином и политенизированым эухроматином
Репликация гетерохроматиновых последовательностей Stellate, наблюдаемая в слюнных железах мух, несущих эу-гетерохроматиновые перестройки, стабильно супрессируется делецией гетерохроматина, в то время как добавочная Y-хромосома восстанавливает политенизацию гетерохроматиновых повторов Stellate в мухах, лишенных значительной части гетерохроматина Х-хромосомы Транс-эффект любого блока гетерохроматина на репликацию гетерохроматиновых районов, приближенных к эухроматину, предполагает, что сверхрепликацию гетерохроматина в политенных хромосомах можно представить как эпигенетическое явление, похожее на классический ЭПМ эухроматиновых генов Мы показали, что гетерохроматиновые блоки могут оказывать транс-эффект на репликацию фрагментов кластера Stellate, перемещённых в эухроматин нехватка блока гетерохроматина Х-хромосмы стабильно предотвращает политенизацию гетерохроматинового фрагмента повторов Stellate, находящихся в эухроматиновом окружении, в то время как добавочная Y-хромосома супрессирует этот эффект Эти наблюдения убеждают в том, что специфические гетерохроматиновые белки могут быть вовлечены в контроль и обеспечение процесса недорепликации
Если результаты первой части работы касались процессов цис-действия эухроматина на гетерохроматин, то во второй части диссертации наряду с процессом цис-инакгивации эухроматина гетерохроматином, исследовали способность гетерохроматинизированного участка эухроматина хромосомы 2 (1п(2)А4), ограниченного блоками гетерохроматина, вызывать транс-инактивацию трансгенов в эухроматине гомологичной хромосомы Показано, что транс-инактивация в основном ограничена участками, гомологичными району, заключенному между
гетерохроматиновыми блоками в перестроенной хромосоме 2 - индукторе инактивации С помощью конфокальной микроскопии показано изменение локализации в ядре и перемещение в хромоцентр эухроматинового фрагмента хромосомы 2, оказавшегося в результате эу-гетерохроматиновой инверсии ограниченным блоками гетерохроматина, а также затягивание в хромоцентр и нормального гомолога, конъюгирующего с этим районом эухроматина Показано, что инверсия вызывает транс-инактивацию большинства, но не всех трансгенов, локализованных в участке эухроматина нормальной оппозитной хромосомы, конъюгирущим с инверсией Обнаружение прерывистости в распространении трансинактивации трансгенов в нормальном гомологе, перемещающемся в гетерохроматиновый компартмент, указывает на возможность сохранения локальных активных нуклеосомных структур при гетерохроматинизации На особый тип гетерохроматинизации и инактивации эухроматиновых генов хромосомы 2, оказавшихся в результате инверсии, ограниченными блоками гетерохроматина, транс-сайленсинга в этом спучае трансгенов в нормальном гомологе, указывает обнаружение того, что гистонметилтрансфераза, кодируемая геном Su(var)3-9, не оказывала влияния на процесс цис- и транс-инактивации, в то время как другие известные модификаторы эффекта положения - Su(var)3-7, Su(var)3-6, Su(var)3-1, Su(var)2-5, e(y)3ul супрессировали инактивацию
ВЫВОДЫ
1 Картированы фрагменты кластера повторов Stellate, расположенного в дистальном гетерохроматине Х-хромосомы и подвергающегося характерной для гетерохроматина недорепликации при политенизации хромосом слюнных желез
2 Обнаружено, что в случае эу-гетерохроматиновых перестроек, разрывающих кластер гетерохроматиновых повторов Stella'e, его фрагменты, оказавшиеся в эухроматиновом окружении или вблизи новой эу-гетерохроматиновой границы, начинают реплицироваться (политенизироваться) Цис-действие эухроматина на репликацию фрагментов Stellate наблюдается только на близлежащие к эухроматину фрагменты кластера, и не распространяется на фрагменты, более удалённые от новой эу-гетерохроматиновой границы
3 Внутренние перестройки дистального гетерохроматина Х-хромосомы не влияют на политенизацию повторов Stellate
4 Показано транс-действие гетерохроматина на репликацию фрагментов кластера повторов Stellate, перенесенных в эухроматин Крупный блок
гетерохроматина Х-хромосомы и Y-хромосома поддерживают репликацию фрагментов Stellate, перенесённых к эухроматину Полученные данные, обнаруживающие роль эу-гетерохроматинового баланса в недорепликации, могут указывать на участие в этом процессе белков гетерохроматина
5 Обнаружена способность гетерохроматинизированного участка эухроматина хромосомы 2 (1п(2)А4), ограниченного блоками гетерохроматина, вызывать трансинактивацию трансгенов в гомологичной хромосоме Транс-инактивация в основном ограничена участками, гомологичными району, заключенному между гетерохроматиновыми блоками в перестроенной хромосоме 2 - индукторе инактивации
6 Обнаружена неравномерность распределения районов транс-инактивации генов репортеров mtnt-whrte, располагающихся на протяжении 800 тнп по длине эухроматиновой области хромосомы 2, гомологичной гетерохроматинизированному участку в 1п(2)А4
7 Ряд известных генов-супрессоров эффекта положения Su(var)3-7 (ДНК-связывающий белок, содержащий цинковые пальцы), Su(var)3-6 (каталитическая субъединица протеинфосфатазы 1, регулирующая конденсацию хроматина в интерфазе), Su(var)3-1 (регулирует экспансию гетерохроматина), Su(var)2-5 (НР1), e(y)3ul (активатор транскрипции эухроматиновых генов и репрессор транскрипции трансгенов в гетерохроматине) супрессируют транс-инактивацию трансгенов, однако мутация в гене Su(var)3-9, кодирующем гистонметилтрансферазу, не оказывала вчияния
Список работ, оп>бликованных по теме диссертации
Статьи
1 Gvozdev VA, Aravm АЛ. Abramov YA. Klenov MS, Kogan GL, Lavrov SA, Naumova NM, Olenkina OM, Tulm AV, Vagin VV Stellate repeats targets of silencing and modules of repeat induced cis-inactivation and trans-activation Genetica, 2003,117 239-245
2. Abramov YA, Kogan GL, Tolchkov EV, Rasheva VI, Lavrov SA, Bonaccorsi S, Kramerova IA, Gvozdev VA Eu-heterochromatic rearrangements induce replication of heterochromatic sequences normally underreplicated m polylene chromosomes of Drosophila melanogaster Genetics 2005,171 1673-1681
3 В А Гвоздев, Ю А Абрамов. Г J1 Коган, С А Лавров Нарушения репликации гетерохроматина в политенпых хромосомах Drosophila melanogaster, вызванные эу- гетерохроматиновыми перестройками Генетика, 2007, Т 43, №1,18-26
Тезисы конференций
Kibanov MV, Lavrov SA, Abramov YA. Gvozdev VA Studies of Long-range interactions in the case of trans-acting position effect in Drosophdlla melanogaster //Embo Conf Series on "Nuclear Structure and Dynamics" 2007, 1-5 September, Montpellier, France
Подписано в печать 24 04 2008 г Печать трафаретная
Заказ № 333 Тираж 120 экз
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Абрамов, Юрий Александрович
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
1.1. Актуальность проблемы.
1.2. Задачи исследования.
1.3. Научная новизна результатов исследования.
1.4. Практическая ценность.
1.5. Апробация работы.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Особенности репликации и «недорепликации» гетерохроматина в слюнных железах D. melanogaster.
2.1.1. Недопредставленностъ гетерохроматиновых последовательностей в политенных хромосомах.
2.1.2. Клеточный цикл и недорепликация гетерохроматина.
2.1.2.1. Ориджины репликации эукариот.
2.1.2.2. ORC и пререпликативный комплекс.
2.1.2.3. Репликация, транскршщия и ORC.
2.1.2.4. ORC, роль в инициации репликации, цитокинезе и сайленсинге.
2.1.2.5. ORC и гетерохроматин.
2.1.2.6. ORC и политенные хромосомы.
2.1.3. Нарушения политенизации эухроматинового района, вызванные эу-гетерохроматиновыми перестройками. Изменение свойств эухроматина при эффекте положения мозаичного типа.
2.1.4. Повторы Stellate, особенности регуляции экспрессии, недорепликация гетерохроматиновых повторов.
2.2. Транс-эффекты положения, вызванные эу-гетерохроматиновыми перестройками.
2.2.1. Модели инактивации при эффекте положения.
2.2.2. "Затягивание " эухроматинового гена в гетерохроматиновый компартмент ядра.
2.2.3. Хромосома bwD вызывает инактивацию инсерций репортёрного гена mini-white, находящихся на оппозитной нормальной хромосоме.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Линии Drosophila и генетические скрещивания.
3.1.1. Линии с хромосомными перестройками - ml41, ml00, г 16, г4, г20, г24 — производными эу-гетерохроматиновой инверсии ln(lLR)pn2a.
3.1.2. Линии и скрещивания для исследования влияния хромосомы 1п(2)А4 и [1п(2)А4]* на транс-инактивацию трансгенов.
3.1.3. Линии и скрещивания для исследования влияния модификаторов эффекта положения на транс-инактивацию трансгенов.
3.1.4. Получение хромосомы [1п(2)А4]*.
3.2. Молекулярные методы.
3.2.1. Использованные праймеры.
3.2.2. Гибридизация ДНК-ДНК in situ.
3.2.2.1. Приготовление биотинилированных зондов для гибридизации in situ.
3.2.1.2. Приготовление давленых препаратов политенных хромосом слюнных желез.
3.2.1.3. Проведение гибридизации in situ.
3.2.2. Определение цитологических сайтов гибридизации.
3.2.3. Флуоресцентная in situ ДНК-ДНК гибридизация (FISH) с ядрами политенных хромосом.
3.2.4. Выделение плазмидной ДНК.
3.2.5. Выделение геномной ДНК Drosophila.
3.2.6. Выделение ДНК из слюнных желез D. melanogaster.
3.2.7. Рестрикция ДНК.
3.2.8. Гель-электрофорез ДНК.
3.2.9. Выделение ДНК из легкоплавких агарозных гелей.
3.2.10. Southern-блот гибридизация.
3.2.10.1. Перенос ДНК из агарозных гелей на нитроцеллюлозный фильтр.
3.2.10.2. Мечение ДНК методом рассеянной затравки.
3.2.10.3. Гибридизация с меченым зондом.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. Эу-гетерохроматиновые перестройки препятствуют недорепликации близлежащего гетерохроматина в политенных хромосомах.
4.1.1. Эу-гетерохроматиновая перестройка In(lLR)pn2a и ее производные.
4.1.2. Получение хромосом Df(l)hSte и Df(l)12.
4.1.3. Создание рекомбинантных хромосом, производных перестроек ml 00 и ml41, лишенных значительной части гетерохроматинового блока X-хромосомы.
4.1.4. Картирование рестриктных фрагментов кластера гетерохроматиновых повторов Stellate.
4.1.5. Гетерохроматиновые фрагменты Stellate реплицируются в политенных хромосомах отдельных перестроек.
4.1.6. Гетерохроматин гомологичной Х-хромосомы, таю/се как и Y-хромосома, вызывают транс-эффекты, способствующие репликации гетерохроматиновых повторов Stellate в эу-гетерохроматиновых перестройках.
4.1.7. Обсуждение результатов.
4.2. Транс-эффекты положения, вызванные эу-гетерохроматиновой инверсией In(2)A4.
4.2.1. Получение хромосомы с инверсией 1п(2)А4.
4.2.2. Фенотип особей, несущих хромосому с инверсией 1п(2)А4.
4.2.3. Картирование и структура инверсии 1п(2)А4.
4.2.4. Хромосома 1п(2)А4 способна индуцировать транс-инактивацию трансгенов mini-white, располагающихся в районе 39А-Е хромосомы 2.
4.2.5. Транс-инактивация трансгенов mini-white, располагающихся в районе 39А-Е хромосомы 2 является прерывистой.
4.2.6. Транс-инактивация инсерций сопровождается их попаданием ("затягиваниел4") в гетерохроматиновый компартмент.
4.2.7. Гены-модификаторы эффекта положения и транс-инактивация гена mini-white, хромосомами [1п(2)А4]* и 1п(2)А4.
4.2.8. Обсуждение результатов.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Цис- и транс-эффекты положения гена у Drosophila melanogaster: влияние хромосомных перестроек на репликацию и экспрессию генов"
Общая характеристика работы 1.1. Актуальность проблемы Исследование эффектов положения гена, начатые в 30-х годах XX века Мёллером, сохраняют актуальность и в настоящее время, поскольку затрагивают вопрос о роли геномного окружения в регуляции экспрессии генов. Специальный интерес представляет изучение роли гетерохроматина в инактивации генов, перемещённых в гетерохроматин или оказавшихся вблизи гетерохроматина. В этом случае наблюдается эпигенетическая, клонально наследуемая, инактивация генов. Характер процесса инактивации зависит от природы близлежащего гетерохроматина, вызывающего с/-инактивацию близлежащих эухроматиновых генов. При исследовании с/я-инактивации, вызванной гетерохроматином, обычно вне поля зрения остается вопрос о том, как при перестройках меняются В свойства и эу-гетерохроматиновых характеристики характера функциональные исследуется гетерохроматина. настоящей работе изменение репликации гетерохроматина при разрыве гетерохроматинового блока, в результате которого один участок гетерохроматина перемещается в эухроматин, а другой оказывается в непосредственном соседстве с эухроматином. Особый интерес внедрением представляет явление транс-инактивации, обусловленное в эухроматин и сопровождающееся trans- гетерохроматина инактивацией гена в гомологичном районе оппозитной хромосомы. Такой случай транс-инактивации, обусловленный эу-гетерохроматиновой перестройкой, детально изучен только на примере так называемого доминантного эффекта положения в гене описывалась bw (bwD). Природа транс-инактивации на примере гена bw «затягивания» близлежащих к гетерохроматину гомологичной как результат генов эухроматиновых и конъюгирующих с ними участков хромосомы в гетерохроматиновый компартмент ядра (Henikoff and Dreesen 1989). В данной работе подробно изучен второй случай транс-инактивации, вызванной эугетерохроматиновой инверсией. 1.2. Задачи исследования Целью настоящей работы являлось исследование цис- и транс-эффектов положения с использованием генетических моделей, полученных в лаборатории биохимической генетики животных Отдела молекулярной генетики клетки ИМГ РАН. Были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать возможность репликации гетерохроматина в политенных хромосомах в случае перестроек. 2. Изучить транс-действие эу-гетерохроматиновых на репликацию гетерохроматина гетерохроматиновых повторов Stellate, перенесённых в эухроматин. 3. Описать систему транс-инактивации генов, вызванную инверсией, в которой участок эухроматина ограничен гетерохроматиновыми блоками. 4. Исследовать роль известных гетерохроматиновых белков в процессе транс-инактивации эухроматина в оппозитной хромосоме. 1.3. Научная новизна результатов исследования В этой работе на молекулярном уровне показана репликация гетерохроматиновых блоков, в норме отсутствующих в политенных хромосомах, в эу-гетерохроматиновых перестройках. Обнаружено, что цис-эффект близлежащего эухроматина распространяется блока. от эу-гетерохроматиновой транс-действие границы внутрь на гетерохроматинового Показано гетерохроматина репликацию блоков гетерохроматина, перенесенных в эухроматин политенных хромосома: удаление большей части гетерохроматина Х-хромосомы восстанавливало свойственную гетерохроматину, нормальную недорепликацию фрагмента гетерохроматина, перенесённого в эухроматин, тогда как введение Yхромосомы снова приводило к репликации фрагмента гетерохроматина в перестройках. Описана инактивация эухроматиновых генов хромосомы 2, оказавшихся в результате эу-гетерохроматиновой инверсии в участке эухроматина, ограниченного блоками гетерохроматина. Показано, что инверсия вызывает транс-инактивацию области эухроматиновых генов (-600 т.н.п.) оппозитной хромосомы. Обнаружена прерывистость хромосомы. в распространении что транс-инактивации ключевой белок генов гомологичной Показано, гетерохроматина, гистонметилтрансфераза, кодируемый геном Su(var)3-9, не влияет на процесс транс-инактивации, сайленсинга что говорит об особом то же типе время гетерохроматинового другие известные при транс-инактивации. В модификаторы эффекта положения Sn(var)3-7 содержащий цинковые пальцы), 1, регулирующая Su(var)3-6 (ДНК-связывающий белок, субъединица (каталитическая протеинфосфатазы конденсацию хроматина в интерфазе), 5и(уаг)5-/(эухроматиновая H3-S10 киназа), Su(var)2-5 (НР1), e(y)3ul (активатор транскрипции эухроматиновых генов, репрессирует транскрипцию трансгенов в гетерохроматине) супрессируют транс-инактивацию трансгенов. 1.4. Практическая ценность Полученные данные могут быть использованы в биомедицинских исследованиях, в том числе и в изучении природы заболеваний человека, включая канцерогенез, когда причиной патологии являются хромосомные перестройки, сопровождающиеся сайленсингом генов. 1.5. Апробация работы Работа апробирована на лабораторном семинаре в отделе молекулярной генетики клетки (ОМГК) ИМГ РАН, на учёном совете ИМГ РАН и в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Данные, представленные в работе, докладывались на конференциях молодых учёных «Будущее молекулярной генетики» Москва). Объем диссертации Материал диссертации изложен на 102 страницах 158 работ. машинописного текста, (ИМГ, 2004, 2006), на седьмой конференции по изучению гетерохроматина (Италия, 2003) и на третьем съезде ВОГиС (6-12 июня. 2004. содержит 16 рисунков и 2 таблицы. СПИСОК_ЛИТЕРАТУРЫ состоит из Обзор литературы 2.1. Особенности репликации и «недорепликации» гетерохроматина в слюнных железах D. melanogaster Известно, что при политенизации хромосом в клетках слюнных желез дрозофилы результате происходит «недорепликация» гетерохроматиновых районов. В прицентромерные районы хромосом и области так называемого интеркалярного гетерохроматина «недопредставлены» в политенных хромосомах; (Zhimulev 1998; Zhimulev, Belyaeva et al. 2003). Изучение особенностей репликации ДНК в политенных хромосомах представляет значительный интерес не только как повод для исследования явления «недорепликации» гетерохроматина в этих специализированных структурах, но и как методический подход для геномного анализа процессов эпигеномного сайленсинга и выявления взаимодействий между эухроматиновым и гетерохроматиновым компартментами генома эукариот. Было показано, что инактивация генов при эффекте положения, вызванных близлежащим гетерохроматином, наблюдаемая в диплоидных соматических клетках, тесно коррелирует как с запаздыванием репликации близлежащих эухроматиновых районов (Ananiev and Gvozdev 1974; Gvozdev, Ananev et al. 1980) так и с их недорепликацией в политенных хромосомах (Karpen and Spradling 1990; Lavrov, Tolchkov et al. 1998). Таким образом, между эпигеномным сайленсингом эухроматиновых генов в соматических клетках и нарушениями репликации наблюдалась тесная корреляция. Более того, анализ районов недорепликации в политенных хромосомах по всему геному D.melanogaster, проведенный в лаборатории И.Ф. Жимулева, обнаружил тесную связь между участками поздней репликации и недорепликации и областями тканеспецифичной транскрипции (Zhimulev, Belyaeva et al. 2003). Оказалось, что «педореплицированные» в политенных хромосомах районы являются поздно реплицирующимися в культивируемых клетках дрозофилы. Кроме того, авторы обнаружили, что заметная часть этих районов соответствует транскрипционным территориям, экспрессирующимся в семенниках, но не в яичниках или эмбрионах. Таким образом, анализ репликации политенных хромосом обнаруживает корреляции между особенностями репликации специализированных участков хромосом и тканеспецифичной экспрессией этих районов в других тканях. Этот вывод касается районов интеркалярного гетерохроматина, рассеянных по длине хромосом 8 (Schubeler, Scalzo et al. 2002; Belyakin, Christophides et al. 2005). Однако вопрос о «недорепликации» гетерохроматина прежде всего касается прицентромерного гетерохроматина, обогащенного сателлитными ДНК, мобильными элементами и другими повторами. Причины и механизмы недорепликации этих районов остаются загадочными. Можно предполагать, что эти участки, необходимые для процессов сегрегации хромосом, также, утрачиваются что эти районы как бесполезные за при эндорепликации. Известно отвечают явление мейотического драйва преимущественной передачи одной из гомологичных хромосом (Peacock, Miklos et al. 1975; МсКее 1998). В то же время известны «гетерохроматиновые гены», как например, ген light, локализованный в гетерохроматине D. melanogaster, кодирующий цинк зависимую убиквитин-лигазу, активируемую митогенными факторами (Devlin, Bingham et al. 1990; Yasuhara and Wakimoto 2008). Интересно, что соответствующий фрагмент генома защищен от недорепликации в политенных хромосомах и легко детектируется методом гибридизации in situ (Yasuhara and Wakimoto 2008). Этот пример еще раз иллюстрирует разнокачественность молекулярной природы ДНК конститутивного гетерохроматина дрозофилы, которая может коррелировать с избирательностью процесса недорепликации. Области недорепликации границами, могут регулироваться были бы существующими гипотетическими которые должны находиться в зонах перехода центромерный гетерохроматин эухроматин. Вопрос о том, как изменяется недорепликация гетерохроматина при нарушении гипотетической границы или, проще, при эу гетерохроматиновых перестройках, практически не был изучен. Учитывая вышеприведенные ссылки на роль и мейотическом драйве, обратим типа исследований. Что касается гетерохроматина в сегрегации хромосом внимание на актуальность подобного исследования гетерохроматина Х-хромосомы, то в его дистальной части находится локус АВО, определяющий правильность первых делений ядер после оплодотворения, однако механизмы этого воздействия остаются загадочными (Pimpinelli, Sullivan et al. 1985; Tomkiel, Fanti et al. 1995; Popkova, Tolchkov et al. 2004). Нельзя исключить, что специфическая структура хроматина этого локуса, характер его репликации и экспрессии могут изменяться при эу— гетерохроматиновых перестройках, нарушающих природную границу эухроматина и гетерохроматина. Учитывая вышеизложенное, в литературном обзоре будут рассмотрены вопросы, касающиеся особенностей репликации и недорепликации гетерохроматина в слюнных железах..1.1. Недопредставленность гетерохроматиновых последовательностей в политенных хромосомах При образовании политенных хромосом в слюнных железах происходит 10 циклов эндорепликации генома без деления клетки. Амшшфицируются главным образом эухроматиновые последовательности, тогда как количество некоторых гетерохроматиновых последовательностей, в частности сателлитной ДНК, практически не увеличивается. Это явление было описано как «недорепликация» (underreplication) или «недопредставленность» Glaser, Leach et al. также 1997; Zhimulev 1999). так гетерохроматина (Rudkin 1969; В политенных хромосомах точки обнаруживаются многочисленные, называемые, слабые интеркалярного хроматина, для которых показана недорепликация хроматина (Laird and Lamb 1988). Недорепликация основной части гетерохроматина в слюнных железах дрозофилы обсуждается как остановка/обрыв репликации гетерохроматиновой ДНК в конце S-фазы дупликации ДНК (Leach, Chotkowski et al. 2000). Факт недопредставленности гетерохроматина в политенных хромосомах ряда тканей Drosophila melanogaster был установлен в ходе исследований, в которых определялась кратность количества ДНК в последовательных циклах репликации. Было установлено, что количество ДНК с каждым циклом репликации увеличивается не в два раза, а на некую меньшую величину (Rudkin 1969). Это можно объяснить, предположив, что в ходе S-фазы 20-30 процентов генома не реплицируется. Как цитологические наблюдения, так и эксперименты с применением цитофотометрии и молекулярных методов свидетельствуют о том, что недополитенизируются последовательности, входящие в состав гетерохроматина. Гетерохроматин дрозофилы состоит из протяженных блоков простых повторов, перемежающихся островками более сложной ДНК умеренными повторами разных типов и уникальными последовательностями (Le, Duricka et al. 1995; Dimitri, Corradini el al. 2005). В состав гетерохроматина входят также несколько типов тандемных повторов, имеющих специализированные функции. К числу таких повторов относятся кластер рибосомных генов в Х-хромосоме, локус Stellate(X)/Su(Ste)(Y), влияющий на фертилыюсть самцов, элемент Responder (гетерохроматин второй хромосомы), компонент системы SD-Responder, а также факторы фертильности самцов из Y-хромосомы, некоторые из которых представлены блоками коротких тандемных повторов (Pimpinelli, Sullivan et al. 1985; Sullivan and Pimpinelli 1986). Наконец, в состав гетерохроматина входят 10 уникальные последовательности, в частности ряд генов (light, rolled, cubitus interruptus и др.) (Gatti and Pimpinelli 1992; Williams and Robbins 1992; Weiler and Wakimoto 1995; Dimitri, Corradini et al. 2005; Rossi, Moschetti et al. 2007). Различные компоненты гетерохроматина представлены в политенных хромосомах в разной степени. Уже достаточно давно существует представление о двух типах гетерохроматина а и р. При этом считается, что а гетерохроматин представлен в основном сателлитами, гетерохроматин политенизирован и сильно недополитенизирован, а р и образует видимую массу нормально хромоцентра на препаратах политенных хромосом. р-Гетерохроматин считается состоящим преимущественно последовательности из ухмеренных повторов. Предполагалось, что буферную зону между р гетерохроматина образуют эухроматином и истинным а гетерохроматином (Zhimulev 1998). Исследования на молекулярном уровне показали, что сателлитные ДНК действительно сильно недопредставлены в составе гетерохроматина. С помощью метода гибридизации in situ удалось показать, что сателлит AAGAG в политенных хромосомах слюнных желез недопредставлен примерно в 60 раз (Hammond and Laird 1985). Недопредставленность сателлитов описана для разных типов политенных тканей, а также у разных видов двукрылых (обзор см.) (Gatti and Pimpinelli 1992; Zhimulev 1998; Grewal and Elgin 2002). Сателлитами обогащен проксимальный район гетерохроматина, содержащий некоторые специфические, характерные только для этого района белки, например, AT-hook protein Dl, специфически взаимодействующий с АТ-сателлитами в прицентромерном гетерохроматине (Aulner, Monod et al. 2002). Тандемные повторы других типов также обычно недополитенизируются. Количество генов рДНК (18S+28S) в политенных хромосомах слюнных желез по отношению к эухроматину примерно в 5 раз меньше, чем в диплоидной ткани. Таким образом, гены рДНК в политенных хромосомах недопредставлены, хотя и в меньшей степени, чем сателлиты. При этом в клетках имеется система контроля, обеспечивающая определенное содержание генов рДНК. Особенностью рибосомной РНК является репликацию наличие разных механизма, единиц генов обеспечивающего генов. Так, дифференциальную кластера транскрипционно-активные (не нарушенные инсерциями) копии реплицируются в большей степени по сравнению с инактивированными. Кроме того, часто повторы одного кластера реплицируются значительно сильнее, чем повторы гомологичного кластера с соседней хромосомы (X или Y), в ряде случаев подитенизируется только 11 один ядрышковый организатор (Endow and Glover 1979; Endow 1982; de Cicco and Glover 1983). Нарушения диметилирования H3K9 или механизма РНК- интерференции приводили к появлению экстрахромосомных кольцевых копий рДНК и увеличению числа ядрышковых организаторов в клетках слюнных желез (Peng and Karpen 2007). Относительно уровня представленности повторов Responder данных нет, гены же из гетерохроматинового кластера Stellate сильно недопредставлены в политенных хромосомах слюнных желез по сравнению с генами из второго имеющегося в геноме дрозофилы кластера, распложенного в эухроматине Xхромосомы. Гены Sn(Ste) из Y-хромосомы также недопредставлены. Помимо тандемных повторов, гетерохроматин представлен т. н. сложной ДНК. (Le, Duricka et al. 1995). Это обычно умеренные повторы разных типов, не образующие встроившихся кластеров, друг в но друга часто образующие протяженные а также участки из мобильных элементов, уникальные последовательности, например функциональные гены. Элементы этой группы политенизируются в составе гетерохроматина по-разному. Ряд мобильных элементов недопредставлен в случае локализации в гетерохроматине (Nurminskii and Shevelev 1992; Nurminsky, Shevelyov et al. уникальных 1994). С другой стороны, генов могут быть последовательности гетерохроматиновых представлены практически полностью (Rossi, Moschetti et al. 2007). Например, полностью политенизируются в составе прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 D.melanogaster последовательности гена light (Devlin, Bingham et al. 1990) и rolled (Berghella and Dimitri 1996). Особый интерес представляет сопоставление свойств гомологичных генов, находящихся в разных геномных компартментах эухроматине и перемещении в гетерохроматине. Эухроматиновые гены при как правило, недореплицируются и гетерохроматин, репрессируются (Belyaeva, Demakova et al. 1993; Weiler and Wakimoto 1995; Elgin 1996; Zhimulev 1998; генов и Ebert, в Schotta et al. не 2004). всегда DeCrease Однако перемещения их В эухроматиновых инактивацией гетерохроматин сопровождаются et al. 2005). недорепликацией (Yasuhara, гетерохроматине эукариот обнаруживается большое количество жизненноважных генов (Rossi, Moschetti et al. 2007). Яркий пример эволюция жизненноважного гена It: в геномах всех дрозофил ид, кроме D.melanogaster, ген It локализован в эухроматине и только в геноме D.melanogaster в гетерохроматине. Предполагается, что переход из эу- в гетерохроматин произошел около 20 млн лет тому назад в 12 составе большого хромосомного сегмента (около 600 т.н.п.), включающего одиннадцать белок-кодирующих генов. Для семи из них, включая ген It, в эухроматине D. psendoobscura обнаружены ортологи в составе одной непрерывной последовательности величиной более 200 кв. Существование эуи гетерохроматиновых ортологов гена позволило выявить различия в генах, находящихся в разных хроматиновых компартментах. В блоке, перемещенном в гетерохроматин, не произошла амплификация последовательностей, кодирующих специфические белки. Показано, что область промотора оу- и гетерохроматиновых ортологов гена It наиболее консервативна, однако в случае гетерохроматиновой локализации гена It в геноме D.melanogaster произошло насыщение района, прилегающего к промотору, повторами и мобильными элементами. Предполагается, что увеличение этой области привело к изменению регуляторной зоны, увеличению расстояния между энхансером и промотором, формированию новой, отличающейся от эухроматинового ортолога и специфичной для гетерохроматина, регуляции экспрессии. Предложена модель позитивного участия гетерохроматиновых гетерохроматиновых эпигенетическая повторов белков в и мобильных элементов, а также формировании активного экспрессии генов, гетерохроматина, находящихся в модель активации гетерохроматине (Yasuhara, DeCrease et al. 2005). Предполагается, что именно гетерохроматиновые белки способствуют активации гена в геноме D. melanogaster, сближая энхансерные районы и промотор (Yasuhara, DeCrease et al. 2005). Парадоксальное участие гетерохроматиновых белков НР1 и Su(var) в активации гетерохроматиновых генов показано и в других случаях (Dimitri, Corradini et al. 2005). Исследование распределения модифицированных гистонов в экспрессируемых гетерохроматиновых эмбрионах с помощью хроматиновой содержание НЗК9те2 генах It и concertina в нормальных иммунопреципитации, показало, что незначительно в области 5-концов транскрибируемых гетерохроматиновых генов и увеличивается к 3-концу. В то же время, содержание маркеров активного хроматина НЗК4те2 и ацетилированных форм гистона НЗ (H3K9/14acet) в области 5-концов транскрибируемых гетерохроматиновых генов и concertina увеличено и снижалось к 3-концу. Профиль распределения НЗК9те2 в экспрессируемых гетерохроматиновых генах нормальных эмбрионов отличался от распределения НЗК9те2 в эухроматиновых генах, в которых содержание НЗК9те2 оставалось незначительным по всей длине генов, в то время как содержание маркеров активного хроматина, ацетилированных форм гистона НЗ 13 (H3K9/14acet), обнаруживалось высоким в области 5-концов транскрибируемых генов независимо от локализации в эухроматине или гетерохроматине (Yasuhara and Wakimoto 2008). Гены rolled и light экспрессируются в гетерохроматине и имеют нуклеосомную структуру, характерную для эухроматиновых генов, менее регулярную, чем типичные области прицентромерного гетерохроматина (Yasuhara, DeCrease et al. 2005). Возможно, именно с особенностью нуклеосомной структуры генов rolled и light связана репликация и представленность этой области в хромоцентре слюнных желез. В двух работах (Zhang and Spradling 1995; Wallrath, Guntur et al. 1996) исследовалась степень представленности ДНК в местах интеграции Р-элементов в гетерохроматиновые районы. В работе (Zhang and Spradling 1995) приводятся данные по 9 инсерциям в Y-хромосому и по 8 инсерциям в разные сайты аутосомного гетерохроматина. Результаты исследований последовательностей в сайтах интеграции показали, что большинство инсерции повторы разных типов либо в неидентифицированные попало в умеренные последовательности сложной природы. Инсерции непосредственно в сателлитную ДНК обнаружено не было, но некоторые инсерции находились далеко от р гетерохроматина и достаточно близко к известным блокам сателлита. Тем не менее, только инсерции в Y-хромосому были сильно (более чем в 20 раз) недопредставлены, тогда как в случае инсерции в аутосомный гетерохроматин заметной недопредставленности обнаружено не было. В работе (Wallrath, Guntur et al. 1996) в аналогичной системе из пяти инсерции в прицентромерный гетерохроматин в двух инсерциях недопредставленность ДНК незначительна, в трех ДНК недополитенизирована от 4 до 33 раз (Wallrath, Guntur et al. 1996). Можно было бы предположить, что степень недопредставленности гетерохроматиновых последовательностей зависит от их типа тандемные повторы недопредставлены, тогда как сложная ДНК реплицируется в большей степени. Однако представляется, что это не совсем так. Хотя сателлиты действительно сильно недопредставлены, степень амплификации сложной ДНК гетерохроматина сильно варьирует. Если ген rolled и некоторые инсерции в работах Цанга и Валлраф представлены в той же степени, что и эухроматин, то ряд сложных последовательностей из дистального Х-гетерохроматина сильно недопредставлены (Nurminskii and Shevelev 1992; Shevelyov 1992; Tulin, Kogan et al. 1997). До недавнего времени существовало представление, согласно которому гетерохроматин недореплицирован целиком, за исключением Р-гетерохроматина, 14 который формирует переходную зону между эухроматином и а-гетерохроматином. Однако данные по репликации гетерохроматиновых генов типа light и rolled и инсерций Р-элемента в гетерохроматин позволяют предположить, что разные участки гетерохроматина реплицируются в разной степени, при этом островки сложной ДНК могут полностью политенизироваться, даже будучи локализованы глубоко в гетерохроматине. По мнению Цанга и Спрадлинга (Zhang and Spradling 1995), подобные политенизированные уникальные и умеренно повторенные последовательности выпетливаются, формируя р-гетерохроматин. Таким образом, р-гетерохроматин не обязательно образует переходную зону между эухроматином и а-гетерохроматином. Не исключено, что элементы р-гетерохроматина образуют островки, рассеянные по прицентромерному гетерохроматину. Механизм иедорепликации при политенизации остается невыясненным. Неясно, что собою представляют барьеры для репликации, какова природа точек, в которых происходит остановка репликации и определяется ли прекращение репликации определенными последовательностями ДНК или структурами более высокого порядка. Вопрос о механизме и регуляции иедорепликации остается невыясненным. Определенным прорывом в этой области исследований является обнаружение в лаборатории И.Ф.Жимулева гена SuUR (suppressor of underreplication) (Belyaeva, Zhimulev et al. 1998), мутации в котором приводят к частичному подавлению иедорепликации интеркалярного и некоторых районов прицентромерного гетерохроматина (Belyaeva, Zhimulev et al. 1998; Zhimulev, Makunin et al. 2000; Makunin, Volkova et al. 2002; Zhimulev and Belyaeva 2003; Zhimulev, Belyaeva et al. 2003). Локус Su(UR)ES (suppresser of underreplication) картирован в районе 68A3-B4. Мутация Su(UR) в гетерозиготе приводила к частичному подавлению иедорепликации прицентромерного и интеркалярного гетерохроматина, блоков способствовала возникновению в политенных эухроматинизации хромосомах районов. интеркалярного гетерохроматина, этих (Belyaeva, Zhimulev et al. 1998; Makunin, Volkova et al. 2002). Гомозиготы демонстрируют увеличение содержания рДНК в политенных хромосомах слюнных желез, а также ряд морфологических изменений структуры политенных хромосом. В частности, на месте прицентромерного гетерохроматина хромосомы 3 появляется район с обычной эухроматиновой организацией. Наблюдается 1.688 увеличение сколь-нибудь содержания а-гетерохроматина, но содержание сателлита заметно не увеличено. Напротив, увеличение дозы Su(UR) в трансгенных линиях мух усиливало недорепликацию и сопровождалось увеличением районов 15 недорепликации в политенных хромосомах (Zhimulev, Belyaeva el al. 2003). Показана локализация хромосомного белка, супрессора недорепликации Su(UR), на политенных хромосомах слюнных желез в районах поздней репликации, прицентромерном хроматине и большом количестве точек интеркалярного гетерохроматина (Belyaeva, Zhimulev et al. 1998; Makunin, Volkova et al. 2002; Zhimulev, Belyaeva et al. 2003; Tchurikov, Kretova et al. 2004). Очевидно, что ген Sn(UR) контролирует репликацию интеркалярного PI прицентромерного гетерохроматина в слюнных железах (Kolesnikova, Makunin et al. 2005). Возможно, хромосомный белок Sn(UR) специфически останавливает репликацию прицентромерного и интеркалярного гетерохроматина в слюнных железах. Ген Su(UR) был клонирован, кодируемый им белок содержит в N-концевой части АТФаза/хеликазный SNF2/SW12 Kolesnikova, домен, обнаруживаемый в активаторах транскрипции (Makunin, Volkova et al. 2002; Zhimulev, Belyaeva et al. 2003; Makunin et al. 2005), и последовательность, гомологичную бромодомену (Tchurikov, Kretova et al. 2004). Локализация белка совпадает с поздно реплицирующимися районами интеркалярного гетерохроматина (Belyaeva, Zhimulev et al. 1998; Makunin, Volkova et al. 2002; Zhimulev, Belyaeva et al. 2003; Tchurikov, Kretova et al. 2004). Ген Su(UR) является пока единственным примером хромосомного белка, специфически предотвращающего репликацию в районах поздней репликации в слюнных железах дрозофилы, но механизм его действия остается невыясненным. Показано, что в случае разрывов в дистальном гетерохроматине Х-хромосомы на фоне двойных мутаций Su(UR) Su(var)3-9 в отсутствие SU(VAR)3-9 из хромоцентра почти исчезает НР1 и происходит сильная локальная декомпактизация гетерохроматина секций h26 h28 с образованием псевдопуффов (Demakova, Pokholkova et al. 2007). Пуффированный район характеризовался не только уникальной морфологией. В нем не обнаруживались белковые компоненты, характерные для активного хроматина, поэтому он назван псевопуффом, однако обнаруживались белки, специфичные для гетерохроматина, такие как SU(VAR)3-7 и SU(UR), пониженное содержание НР1и НР2. и, в Псевдопуффы реплицировались до следовательно, недорепликация начала репликации гетерохроматина, ДНК, входящих последовательностей псевдопуфф, супрессировалась мутацией Su(var)3-9 нарушающей метилирование гистона НЗК9 и компактизацию гетерохроматина. Разрывы в проксимальном гетерохроматине Х-хромосомы в тех же условиях на фоне мутаций Su(UR) Su(var)3-906 не приводили к образованию псевдопуффов, что указывает на то, что, 16 белковые компоненты дистального и проксимального гетерохроматина отличаются и
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Абрамов, Юрий Александрович, Москва
1. Alatortsev, V. E., 1. A. Kramerova, et al. (1997). "Vinculin gene is non-essential in Drosophila melanogaster." FEBS Lett 413(2): 197-
2. Altaian, A. L. and E. Fanning (2004). "Defined sequence modules and an architectural element cooperate to promote initiation at an ectopic mammalian chromosomal replication origin." Mol Cell Biol 24(10): 4138-
3. Ananiev, E. V. and V. A. Gvozdev (1974). "Changed pattern of transcription and replication in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster resulting from euheterochromatin rearrangement." Chromosoma 45(2): 173-
4. Araki, M., R. P. Wharton, et al. (2003). "Degradation of origin recognition complex large subunit by the anaphase-promoting complex in Drosophila." Embo J 22(22): 611
5. Aravin, A. A., N. M. Naumova, et al. (2001). "Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline." CurrBiol 11(13): 1017-
6. Asano, M. and R. P. Wharton (1999). "E2F mediates developmental and cell cycle regulation of ORC1 in Drosophila." Embo J 18(9): 2435-
7. Ashburner, M. (1989). Drosophila. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Aulner, N., С Monod, et al. (2002). "The AT-hook protein Dl is essential for Drosophila melanogaster development and is implicated in position-effect variegation." Mol Cell Biol 22Г4): 1218-
8. Badugu, R., M. M. Shareef, et al. (2003). "Novel Drosophila heterochromatin protein 1 (HPl)/origin recognition complex-associated protein (HOAP) repeat motif in HP1/HOAP interactions and chromocenter associations." J Biol Chem 278(36): 34491-
9. Balakireva, M. D., Y. Shevelyov, et al. (1992). "Structural organization and diversification of Y-linked sequences comprising Su(Ste) genes in Drosophila melanogaster." Nucleic Acids Res 20(14): 3731-6. 90
10. Bell, S. P. (1995). "Eukaryotic replicators and associated protein complexes." Curr Qpin Genet Dev 5(2): 162-
11. Bell, S. P. and A. Dutta (2002). "DNA replication in eukaryotic cells." Annu Rev Biochem 71: 333-
12. Bell, S. P., R. Kobayashi, et al. (1993). "Yeast origin recognition complex functions in transcription silencing and DNA replication." Science 262(5141): 1844-
13. Bell, S. P., J. Mitchell, et al. (1995). "The multidomain structure of Orclp reveals similarity to regulators of DNA replication and transcriptional silencing." Cell 83(4): 563-
14. Belotserkovskaya, R. and D. Reinberg (2004). "Facts about FACT and transcript elongation through chromatin." Curr Qpin Genet Dev 14(2): 139-
15. Belyaeva, E. S., O. V. Demakova, et al. (1993). "Cytogenetic and molecular aspects of position-effect variegation in Drosophila melanogaster. V. Fleterochromatin-associated protein HPl appears in euchromatic chromosomal regions that are inactivated as a result of position-effect variegation." Chromosoma 102(8): 583-
16. Belyaeva, E. S., I. F. Zhimulev, et al. (1998). "Su(UR)ES: a gene suppressing DNA underreplication in intercalary and pericentric heterochromatin of Drosophila melanogaster polytene chromosomes." Proc Natl Acad Sci U S A 95(13): 7532-
17. Belyakin, S. N., G. K. Christophides, et al. (2005). "Genomic analysis of Drosophila chromosome underreplication reveals a link between replication control and transcriptional territories." Proc Natl Acad Sci U S A 102(23): 8269-
18. Berghella, L. and P. Dimitri (1996). "The heterochromatic rolled gene of Drosophila melanogaster is extensively polytenized and transcriptionally active in the salivary gland chromocenter." Genetics 144(1): 117-
19. Bozzetti, M. P., S. Massari, et al. (1995). "The Ste locus, a component of the parasitic cry-Ste system of Drosophila melanogaster, encodes a protein that forms crystals in primary spermatocytes and mimics properties of the beta subunit of casein kinase 2." Proc Natl Acad Sci U S A 92(13): 6067-
20. Burke, T. W., J. G. Cook, et al. (2001). "Replication factors MCM2 and ORC1 interact with the histone acetyltransferase HBOl." J Biol Chem 276(18): 15397-408. 91
21. Chesnokov, I. N., O. N. Chesnokova, et al. (2003). "A cytokinetic function of Drosophila ORC6 protein resides in a domain distinct from its replication activity." Proc Natl Acad Sci U S A 100(16): 9150-
22. Cockell, M. and S. M. Gasser (1999). "Nuclear compartments and gene regulation." Curr Qpin Genet Dev 9(2): 199-
23. Csink, A. K., A. Bounoutas, et al. (2002). "Differential gene silencing by transheterochromatin in Drosophila melanogaster." Genetics 160(1): 257-
24. Csink, A. K. and S. Henikoff (1996). "Genetic modification of heterochromatic association and nuclear organization in Drosophila." Nature 381(6582): 529-
25. Cuvier, O., M. Lutzmann, et al. (2006). "ORC is necessary at the interphase-tomitosis transition to recruit cdc2 kinase and disassemble RPA foci." Curr Biol 16(5): 516-23. de Cicco, D. V. and D. M. Glover (1983). "Amplification of rDNA and.type I sequences in Drosophila males deficient in rDNA." Cell 32(4): 1217-
26. Demakova, O. V., G. V. Pokholkova, et al. (2007). "The SU(VAR)3-9/HPl complex differentially regulates the compaction state and degree of underreplication of X chromosome pericentric heterochromatin in Drosophila melanogaster." Genetics 175(2): 609-20. DePamphilis, M. L. (2005). "Cell cycle dependent regulation of the origin recognition complex." Cell Cycle 4(1): 70-
27. Devlin, R. H., B. Bingham, et al. (1990). "The organization and expression of the light gene, a heterochromatic gene of Drosophila melanogaster." Genetics 125(1): 12
28. Dillin, A. and J. Rine (1997). "Separable functions of ORC5 in replication initiation and silencing in Saccharomyces cerevisiae." Genetics 147(3): 1053-
29. Dimitri, P., N. Corradini, ct al. (2005). "The paradox of functional heterochromatin." Bioessavs 27(1): 29-
30. Ebert, A., S. Lein, et al. (2006). "Histone modification and the control of heterochromatic gene silencing in Drosophila." Chromosome Res 14(4): 377-
31. Ebert, A., G. Schotta, et al. (2004). "Su(var) genes regulate the balance between euchromatin and heterochromatin in Drosophila." Genes Dev 18(23): 2973-83. 92
32. Elgin, S. C. (1996). "Heterochromatin and gene regulation in Drosophila." Curr Opin Genet Dev 6(2): 193-
33. Endow, S. A. (1982). "Polytenization of the ribosomal genes on the X and Y chromosomes of Drosophila melanogaster." Genetics 100(3): 375-
34. Endow, S. A. and D. M. Glover (1979). "Differential replication of ribosomal gene repeats inpolytene nuclei of Drosophila." Cell 17(3): 597-
35. Feinberg, A. P. and B. Vogelstein (1983). "A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity." Anal Biochem 132(1): 6-
36. Foss, M., F. J. McNally, et al. (1993). "Origin recognition complex (ORC) in transcriptional silencing and DNA replication in S. cerevisiae." Science 262(5141): 183
37. Gasser, S. M. (2002). "Visualizing chromatin dynamics in interphase nuclei." Science 296(5572): 1412-
38. Gatti, M. and B. S. Baker (1989). "Genes controlling essential cell-cycle functions in Drosophila melanogaster." Genes Dev 3(4): 438-
39. Gatti, M. and S. Pimpinelli (1992). "Functional elements in Drosophila melanogaster heterochromatin." Annu Rev Genet 26: 239-
40. Gemkow, M. J., P. Buchenau, et al. (1996). "FISH in whole-mount Drosophila embryos. RNA: activation of a transcriptional lokus, DNA: gene architecture and expression." Bioimaging 4: 107-
41. Glaser, R. L., T. J. Leach, et al. (1997). "The structure of heterochromatic DNA is altered in polyploid cells of Drosophila melanogaster." Mol Cell Biol 17(3): 1254-
42. Goldman, M. A., G. P. Holmquist, et al. (1984). "Replication timing of genes and middle repetitive sequences." Science 224(4650): 686-
43. Gregoire, D., K. Brodolin, et al. (2006). "HoxB domain induction silences DNA replication origins in the locus and specifies a single origin at its boundary." EMBO Rep 7(8): 812-
44. Grewal, S. I. and S. С Elgin (2002). "Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure." Curr Opin Genet Dev 12(2): 178-
45. Gvozdev, V. A., E. V. Ananev, et al. (1980). "[Transcription of portions of chromosomes corresponding to regions of intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster cell cultures]." Genetika 16(10): 1729-40. 93
46. Hardy, R. W., D. L. Lindsley, et al. (1984). "Cytogenetic analysis of a segment of the Y chromosome of Drosophila melanogaster." Genetics 107(4): 591-
47. Haynes, K. A., E. Gracheva, et al. (2007). "A Distinct type of heterochromatin within Drosophila melanogaster chromosome 4." Genetics 175(3): 1539-
48. Henikoff, S. (1990). "Position-effect variegation after 60 years." Trends Genet 6(12): 422-
49. Henikoff, S. (1995). "Gene silencing in Drosophila." Curr Top Microbiol Immunol 197: 193-
50. Henikoff, S. and T. D. Dreesen (1989). "Trans-inactivation of the Drosophila brown gene: evidence for transcriptional repression and somatic pairing dependence." Proc Natl AcadSciUS A 86(17): 6704-
51. Henikoff, S., J. Jackson, et al. (1995). "Distance and pairing effects on, the brownDominant heterochromatic element in Drosophila." Genetics 140(3): 1007-
52. Huang, D. W., L. Fanti, et al. (1998). "Distinct cytoplasmic and nuclear fractions of Drosophila heterochromatin protein 1: their phosphorylation levels and associations with origin recognition complex proteins." J Cell Biol 142(2): 307-
53. Ilyna, O. V., A. V. Sorokin, et al. (1980). "New mutants." Drosophila Inform. Serv. 55:
54. Kalmykova, A. I., A. A. Dobritsa, et al. (1997). "The Su(Ste) repeat in the Y chromosome and betaCK2tes gene encode predicted isoforms of regulatory beta-subunit of protein kinase CK2 in Drosophila melanogaster." FEBS Lett 416(2): 164-
55. Kalmykova, A. I., A. A. Dobritsa, et al. (1998). "Su(Ste) diverged tandem repeats in a Y chromosome of Drosophila melanogaster are transcribed and variously processed." Genetics 148(1): 243-
56. Karpen, G. H. and A. С Spradling (1990). "Reduced DNA polytenization of a minichromosome region undergoing position-effect variegation in Drosophila." Cell 63(1): 97-
57. Khesin, R. B. and B. A. Leibovitch (1978). "Influence of deficiency of the histone gene-containing 38B-40 region on X-chromosome template activity and the white gene position effect variegation in Drosophila melanogaster." Mol Gen Genet 162(3): 323-
58. Kolesnikova, T. D., I. V. Makunin, et al. (2005). "Functional dissection of the Suppressor of UnderRepIication protein of Drosophila melanogaster: identification of 94
59. Laird, C. D. and M. M. Lamb (1988). "Intercalary heterochromatin of Drosophila as a potential model for human fragile sites." Am J Med Genet 30(1-2): 689-
60. Lamb, M. M. and С D. Laird (1987). "Three euchromatic DNA sequences underreplicated in polytene chromosomes of Drosophila are localized in constrictions and ectopic fibers." Chromosoma 95(4): 227-
61. Landis, G., R. Kelley, et al. (1997). "The k43 gene, required for chorion gene amplification and diploid cell chromosome replication, encodes the Drosophila homolog of yeast origin recognition complex subunit 2." Proc Natl Acad Sci U S A 94(8): 388
62. Lavrov, S. A., E. V. Tolchkov, et al. (1998). "[Disruption of polytenization of DNA from the euchromatin region of the Drosophila melanogaster X-chromosome, caused by euheterochromatin restructuring]." Mol Biol (Mosk) 32(6): 992-7. Le, M. H., D. Duricka, et al. (1995). "Islands of complex DNA are widespread in Drosophila centric heterochrornatin." Genetics 141(1): 283-
63. Leach, T. J., H. L. Chotkowski, et al. (2000). "Replication of heterochromatin and structure of polytene chromosomes." Mol Cell Biol 20(17): 6308-
64. Leatherwood, J. and A. Vas (2003). "Connecting ORC and heterochromatin: why?" Cell Cycle 2(6): 573-
65. Lidonnici, M. R., R. Rossi, et al. (2004). "Subnuclear distribution of the largest subunit of the human origin recognition complex during the cell cycle." J Cell Sci 117(Pt 22): 5221-
66. Lilly, M. A. and A. С Spradling (1996). "The Drosophila endocycle is controlled by Cyclin E and lacks a checkpoint ensuring S-phase completion." Genes Dev 10(19): 2514-
67. Lindsley, D. L. and G. G. Zimm (1992). The genome of Drosophila melanogaster. San Diego, Academic Press. Liu, G., M. Malott, et al. (2003). "Multiple functional elements comprise a Mammalian chromosomal replicator." Mol Cell Biol 23(5): 1832-
68. Livak, K. J. (1990). "Detailed structure of the Drosophila melanogaster stellate genes and their transcripts." Genetics 124(2): 303-
69. Loupart, M. L., S. A. Krause, et al. (2000). "Aberrant replication timing induces defective chromosome condensation in Drosophila ORC2 mutants." Curr Biol 10(24): 1547-56. 95
70. Machida, Y. J. and A. Dutta (2005). "Cellular checkpoint mechanisms monitoring proper initiation of DNA replication." J Biol Chem 280(8): 6253-
71. Machida, Y. J., J. L. Hamlin, et al. (2005). "Right place, right time, and only once: replication initiation in metazoans." Cell 123(1): 13-
72. Makunin, I. V., E. I. Volkova, et al. (2002). "The Drosophila suppressor of undcrreplication protein binds to late-replicating regions of polytene chromosomes." Genetics 160(3): 1023-
73. Malceva, N. I. and I. F. Zhimulev (1993). "Extent of polytene in the pericentric heterochromatin of polytene chromosomes of pseudonurse cells of otu (ovarian tumor) mutants of Drosophila melanogaster." Mol Gen Genet 240(2): 273-6. McKee, B. D. (1998). "Pairing sites and the role of chromosome pairing in meiosis and spermatogenesis in male Drosophila." Curr Top Dev Biol 37: 77-
74. Misteli, T. (2001). "Where the nucleus comes from." Trends Cell Biol 11(4):
75. Muller, H. J. (1930). Types of visible variations induced by X-rays in Drosophila." J. Genet. 22:
76. Nikolenko Iu, V., V. Shidlovskii Iu, et al. (2005). "[Transcriptional coactivator SAYP can suppress transcription in heterochromatin]." Genetika 41(8): 1033-
77. Nurminskii, D. I. and I. Shevelev (1992). "[MDGlhet and aurora—non-mobile retrotransposons of Drosophila melanogaster]." Genetika 28(8): 36-
78. Nurminsky, D. I., Y. Shevelyov, et al. (1994). "Structure, molecular evolution and maintenance of copy number of extended repeated structures in the X-heterochromatin of Drosophila melanogaster." Chromosoma 103(4): 277-
79. Paixao, S., I. N. Colaluca, et al. (2004). "Modular structure of the human lamin B2 replicator." Mol Cell Biol 24(7): 2958-
80. Рак, D. Т., M. Pflumm, et al. (1997). "Association of the origin recognition complex with heterochromatin and HP1 in higher eukaryotes." Cell 91(3): 311-
81. Palumbo, G., M. Berloco, et al. (1994). "Interaction systems between heterochromatin and euchromatin in Drosophila melanogaster." Genetica 94(2-3): 26
82. Palumbo, G., S. Bonaccorsi, et al. (1994). "Genetic analysis of Stellate elements of Drosophila melanogaster." Genetics 138(4): 1181-
83. Parada, L. and T. Misteli (2002). "Chromosome positioning in the interphase nucleus." Trends Cell Biol 12(9): 425-32. 96
84. Peng, J. С and G. H. Karpen (2007). "H3K9 methylation and RNA interference regulate nucleolar organization and repeated DNA stability." Nat Cell Biol 9(1): 25-
85. Pflumm, M. F. and M. R. Botchan (2001). "Ore mutants arrest in metaphase with abnormally condensed chromosomes." Development 128(9): 1697-
86. Pimpinelli, S., W. Sullivan, et al. (1985). "On biological functions mapping to the heterochromatin of Drosophila melanogaster." Genetics 109(4): 701-
87. Popkova, A. M., E. V. Tolchkov, et al. (2004). "[Heterochromatic ABO locus of the Drosophila melanogaster X chromosome overlaps with the region of localization of repeats, including mobile elements and Stellate genes]." Genetika 40(2): 167-
88. Prasanth, S. G., K. V. Prasanth, et al. (2004). "Human Orc2 localizes to centrosomes, centromeres and heterochromatin during chromosome inheritance." Embo J 23(13): 2651-
89. Prasanth, S. G., K. V. Prasanth, et al. (2002). "Orc6 involved in DNA replication, chromosome segregation, and cytokinesis." Science 297(5583): 1026-
90. Raghuraman, M. К., E. A. Winzeler, et al. (2001). "Replication dynamics.of the yeast genome." Science 294(5540): 115-
91. Remus, D., E. L. Beall, et al. (2004). "DNA topology, not DNA sequence, is- a critical determinant for Drosophila ORC-DNA binding." Embo J 23(4): 897-
92. Reuter, G. and P. Spierer (1992). "Position effect variegation and chromatin proteins." Bioessays 14(9): 605-
93. Roseman, R. R., E. A. Johnson, et al. (1995). "A P element containing suppressor of hairy-wing binding regions has novel properties for mutagenesis in Drosophila melanogaster." Genetics 141(3): 1061-
94. Rossi, F., R. Moschetti, et al. (2007). "Cytogenetic and molecular characterization of heterochromatin gene models in Drosophila melanogaster." Genetics 175(2): 595-
95. Royzman, I., R. J. Austin, et al. (1999). "ORC localization in Drosophila follicle cells and the effects of mutations in dE2F and dDP." Genes Dev 13(7): 827-
96. Royzman, I. and T. L. Orr-Weaver (1998). "S phase and differential DNA replication during Drosophila oogenesis." Genes Cells 3(12): 767-
97. Rudkin, G. T. (1969). "Non replicating DNA in Drosophila." Genetics 61(1): Suppl:227-38. 97
98. Sage, В. Т., J. L. Jones, et al. (2005). "Sequence elements in cis influence heterochromatic silencing in trans." Mol Cell Biol 25(1): 377-
99. Sage, В. Т., M. D. Wu, et al. (2008). "Interplay of developmentally regulated gene expression and heterochromatic silencing in trans in Drosophila." Genetics 178(2): 74
100. Sambrook, J., E. Fritsch, et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory. Sass, G. L. and S. Henikoff (1998). "Comparative analysis of position-effect variegation mutations in Drosophila melanogaster delineates the targets of modifiers." Genetics 148(2): 733-
101. Sauer, K., J. A. Knoblich, et al. (1995). "Distinct modes of cyclin E/cdc2c kinase regulation and S-phase control in mitotic and endoreduplication cycles of Drosophila embryogenesis." Genes Dev 9(11): 1327-
102. Schubeler, D., D. Scalzo, et al. (2002). "Genome-wide DNA replication profile for Drosophila melanogaster: a link between transcription and replication timing." Nat Genet 32(3): 438-
103. Shareef, M. M., C. King, et al. (2001). "Drosophila heterochromatin protein 1 (HPl)/origin recognition complex (ORC) protein is associated with HPl and ORC and functions in heterochromatin-induced silencing." Mol Biol Cell 12(6): 1671-
104. Shevelyov, Y. Y. (1992). "Copies of a Stellate gene variant are located in the X heterochromatin of Drosophila melanogaster and are probably expressed." Genetics 132(4): 1033-
105. Shidlovskii, Y. V., A. N. Krasnov, et al. (2005). "A novel multidomain transcription coactivator SAYP can also repress transcription in heterochromatin." Embo J 24(1): 97
106. Smith, A. V. and T. L. Orr-Weaver (1991). "The regulation of the cell cycle during Drosophila embryogenesis: the transition to polyteny." Development 112(4): 997-1
107. Spofford, J. (1976). Position-effect variegation in Drosophila. Genetics and Biology of Drosophila. M. Ashburner and E. Novitski. London, Academic Press: 955-1
108. Spradling, A. С (1993). "Position effect variegation and genomic instability." Cold Spring Harb Svmp Quant Biol 58: 585-96. 98
109. Talbert, P. B. and S. Henikoff (2006). "Spreading of silent chromatin: inaction at a distance." Nat Rev Genet 7(10): 793-
110. Talbert, P. В., D. LeCiel, et al. (1994). "Modification of the Drosophila heterochromatic mutation brownDominant by linkage alterations." Genetics 136(2): 55
111. Tchurikov, N. A., O. V. Kretova, et al. (2004). "SuUR protein binds to the boundary regions separating forum domains in Drosophila melanogaster." J Biol Chem 279(12): 11705-
112. Tolchkov, E. V., I. A. Kramerova, et al. (1997). "Position-effect variegation in Drosophila melanogaster X chromosome inversion with a breakpoint in a satellite block and its suppression in a secondary rearrangement." Chromosoma 106(8): 520-
113. Tolchkov, E. V., V. I. Rasheva, et al. (2000). "The size and internal structure of a heterochromatic block determine its ability to induce position effect variegation in Drosophila melanogaster." Genetics 154(4): 1611-
114. Tomkiel, J., L. Fanti, et al. (1995). "Developmental genetical analysis and molecular cloning of the abnormal oocyte gene of Drosophila melanogaster." Genetics 140(2): 615-
115. Triolo, T. and R. Sternglanz (1996). "Role of interactions between the origin recognition complex and SIR1 in transcriptional silencing." Nature 381(6579): 251 1
116. Tulin, A. V., G. L. Kogan, et al. (1997). "Heterochromatic Stellate gene cluster in Drosophila melanogaster: structure and molecular evolution." Genetics 146(1): 253-
117. Tulin, A. V., N. M. Naumova, et al. (1998). "Repeated, protein-encoding heterochromatic genes cause inactivation of a juxtaposed euchromatic gene." FEBS Lett 425(3): 513-
118. Umbetova, G. H., E. S. Belyaeva, et al. (1991). "Cytogenetic and molecular aspects of position effect variegation in Drosophila melanogaster. IV. Underreplication of chromosomal material as a result of gene inactivation." Chromosoma 101(1): 55-
119. Usakin, L. A., G. L. Kogan, et al. (2005). "An alien promoter capture as a primary step of the evolution of testes-expressed repeats in the Drosophila melanogaster genome." Mol Biol Evol 22(7): 1555-
120. Vagin, V. V., A. Sigova, et al. (2006). "A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline." Science 313(5785): 320-4. 99
121. Wakimoto, B. T. and M. G. Hearn (1990). "The effects of chromosome rearrangements on the expression of heterochromatic genes in chromosome 2L of Drosophila melanogaster." Genetics 125(1): 141-
122. Wallrath, L. L. and S. C. Elgin (1995). "Position effect variegation in Drosophila is associated with an altered chromatin structure." Genes Dev 9(10): 1263-
123. Wallrath, L. L., V. P. Guntur, et al. (1996). "DNA representation of variegating heterochromatic P-element inserts in diploid and polytene tissues of Drosophila melanogaster." Chromosoma 104(7): 519-
124. Wang, L., M. Lin, et al. (2004). "The human beta-globin replication initiation region consists of two modular independent replicators." Mol Cell Biol 24(8): 3373-
125. Weiler, K. S. and В. T. Wakimoto (1995). "Heterochromafin and gene expression in Drosophila." Annu Rev Genet 29: 577-
126. Weiler, K. S. and В. T. Wakimoto (1998). "Chromosome rearrangements, induce both variegated and reduced, uniform expression of heterochromatic genes in a development-specific manner." Genetics 149(3): 1451-
127. Williams, S. M. and L. G. Robbins (1992). "Molecular genetic analysis of Drosophila rDNA arrays." Trends Genet 8(10): 335-
128. Yasuhara, J. С H. DeCrease, et al. (2005). "Evolution of heterochromatic genes of Drosophila." Proc Natl Acad Sci U S A 102(31): 10958-
129. Yasuhara, J. С and В. T. Wakimoto (2008). "Molecular landscape of modified histones in Drosophila heterochromatic genes and euchromatin-heterochromatin transition zones." PLoS Genet 4(1): el
130. Zhang, P. and A. С Spradling (1995). "The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin." Genetics 139(2): 659-
131. Zhimulev, I. F. (1998). "Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation." Adv Genet 37: 1-
132. Zhimulev, I. F. (1999). "Genetic organization of polytene chromosomes." AdvGenet 39: 1-
133. Zhimulev, I. F. and E. S. Belyaeva (2003). "Intercalary heterochromatin and genetic silencing." Bioessays 25(11): 1040-
134. Zhimulev, I. F., E. S. Belyaeva, et al. (1989). "Position-effect variegation and intercalary heterochromatin: a comparative study." Chromosoma 98(5): 378-87. 100
135. Zhimulev, I. F., E. S. Belyaeva, et al. (2003). "Influence of the SuUR gene on intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster Chromosoma 111(6): 377-
136. Zhimulev, I. F., I. V. Makunin, et al. (2000). "[Effect of four doses of the Su(UR)ES gene on intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster]." Genetika 36(8): 1061-
137. Zhou, J., N. Ashouian, et al. (2002). "The origin of a developmentally regulated Igh replicon is located near the border of regulatory domains for Igh replication and expression." Proc Natl Acad Sci U S A 99(21): 13693-
138. Жимулев, И. Ф. (1993). Новосибирск, Наука. Прокофьева-Бельговская, хромосом. Москва, Наука. Толчков, Е. В., М. Д. Балакирева, et al. (1984). "Инактивация района Xхромосомы Drosophila melanogaster с известной тонкой генетической структурой в результате эффекта положения." Генетика 20(11): 1846. А. А. (1986). Гетерохроматические районы Гетерохроматин и эффект положения гена. polytene chromosomes." 101
-
Абрамов, Юрий Александрович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.03
- Гетерохроматин и модификаторы экспрессии генов Drosophila melanogaster
- Влияние различных хромосомных перестроек на экспрессию гена Pgd, кодирующего 6-фосфоглюконатдегидрогеназу у Drosophila melanogaster
- Влияние белка SUUR на структуру политенных хромосом Drosophila melanogaster
- Эффект положения мозаичного типа, возникающий вследствие перемещения транспозона в геноме Drosophila melanogaster
- Закономерности организации гетерохроматиновых районов политенных хромосом Drosophila melanogaster: цитогенетические аспекты
