Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль локуса flamenco и генов hp1 в регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy y Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль локуса flamenco и генов hp1 в регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy y Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

JIABPEHOB Антон Русланович

Роль локуса flamenco и генов ЪрХ в регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy у Drosophila melanogaster.

03.02.07.- генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2014

1 9 ФЕВ 2015

005559148

005559148

Работа выполнена в лаборатории генетических основ морфогенеза Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук и на кафедре генетики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

КИМ Александр Иннокентьевич (профессор кафедры генетики биологического факультета, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ПАСЮКОВА Елена Генриховна (заведующая лабораторией геномной изменчивости, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук)

кандидат биологических наук ГРИШАЕВА Татьяна Михайловна (старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н,И. Вавилова Российской академии наук)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Защита состоится «В» Оике-ЛЯ 20 {£~ г. в У/ часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН: http://idbras.ru/.

Автореферат разослан « 6 » '< 20 / 5года.

Ученый секретарь диссертационного совета, г>

кандидат биологических наук /ту/'"^ о.В. Бойко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Мобильные генетические элементы (МГЭ) имеют широкое распространение в геномах про- и эукариот и составляют значительную часть геномной ДНК многих изученных организмов. У эукариот выделяют 4 основных класса мобильных элементов: ДНК-трансиозоны, LINE (длинные рассеянные ядерные элементы) и SINE (короткие рассеянные ядерные элементы), а также ДКП-ретротранспозоны (ретротранспозоны с длинными концевыми повторами) и эндогенные ретровирусы. МГЭ могут существенно влиять на генетический материал хозяина. Перемещаясь внутри генома, они могут вызывать различные мутации [McClintock, 1953]. Таким образом, МГЭ играют важную роль в формировании генетической изменчивости.

Особый интерес для исследования представляют ДКП-ретротранспозоны с тремя открытыми рамками считывания (ОРС). По своей структуре они схожи с ретровирусами. Кодирующая часть ДКП-ретротранспозонов содержит ОРС, гомологичные ретровирусным генам gag, pol и env, поэтому их принято считать группой эндогенных ретровирусов. У Drosophila melanogaster данная группа представлена группой g}>psy.

Высокая транспозиционная активность МГЭ опасна для организма, так как повышает частоту возникновения мутаций. По этой причине в геноме существуют механизмы, подавляющие транспозиции МГЭ.

Подавление экспрессии МГЭ у D. melanogaster может осуществляться как путем РНК-интерференции, так и путем непосредственной компактизации участков хромосом, содержащих МГЭ при активном участии белков семейства НР1 (beterochromatin protein i). Известно, что эти два пути тесно связаны между собой: РНК-интерференция играет важную роль в формировании гетерохроматина и, по-видимому, направляет его формирование [Lippman, Martienssen, 2004]. Мутации в генах, задействованных в механизме РНК-интерференции, приводят к снижению уровня гистона НЗ, метилированного по лизину в 9-м положении (НЗК9), и к неправильной локализации гетерохроматиновых белков семейства НР1 на хромосомах [Moshkovich, Lei, 2010]. ß свою очередь, белки семейства НР1 принимают активное участие в регуляции экспрессии кластеров малых РНК, необходимых для процесса РНК-интерференции [Klattenhoff, 2009; Basquin, 2014].

Линия SS [Ким и др., 1986; 1989] имеет мутантный фенотип flamenco, который характеризуется повышенной частой транспозиции МГЭ группы gypsy. Фенотип flamenco может быть обусловлен разными причинами. В генотипе линии SS может- присутствовать мутация в локусе flamenco. Установлено, что flamenco контролирует транспозицию элемента gypsy . Локус flamenco локализован в перицентромерном районе Х-хромосомы и

представляет собой кластер-матрицу для считывания предшественника малых РНК, ассоциированных с белком PIWI (piPHK). Не исключено, что в генотипе линии SS имеются мутации в генах, задействованных в процессинге первичных транскриптов подобных кластеров. Также возможны нарушения со стороны генов семейства hpl.

Цели и задачи исследования

Целью работы было исследование механизмов регуляции транспозиции ретротранспозонов группы gypsy у Drosophila melanogaster. Были поставлены следующие задачи:

1) Провести анализ экспрессии на уровне транскрипции локуса flamenco, контролирующего транспозиции мобильных генетических элементов группы gypsy, в линии SS, мутантной по данному локусу.

2) Провести анализ экспрессии на уровне транскрипции генов системы РНК-интерференции piwi, agoí, zuc, aub в линии SS, мутантной по локусу flamenco .

3) Проанализировать экспрессию на уровне транскрипции генов hpla, hp Ib, hplc, lipid, hple, кодирующих гетерохроматиновые белки семейства Hpl, в линии SS D. melanogaster, мутантной по локусу flamenco.

4) Получить рекомбинантный белок НР1а и проанализировать взаимодействие данного белка с регуияторными областями элс,\;ентов группы gypsy.

Научная новизна и практическая значимость работы

В работе проведен комплексный анализ экспрессии генов, участвующих в регуляции транспозиционной активности ретротранспозонов группы gypsy на линиях D. melanogaster с фенотипом flamenco-.

Проведен сравнительный анализ связывания белка HP 1а с нетранслируемыми областями ретротранспозонов группы gypsy.

Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для исследования вопросов, связанных с механизмами контроля ретроэлементов и ретровирусов в геноме эукариот.

Апробации результатов.

Работа прошла апробацию на VII, VIII и IX конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2011, 2012, 2013), XX и XXI международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» и «Ломоносов-2014» (Москва) и семинарах лаборатории генетики животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Личное участие автора.

Основная часть работы выполнена непосредственно автором. Эксперименты по измерению уровней экспрессии локуса flamenco и генов семейства hpI выполнялись совместно с аспирантом Потаповой М.В. и студентом магистратуры Шмельковой А.О. соответственно. Поставленные задачи решены с применением современных методов генетики. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 102 страницах, содержит 23 рисунка, 2 таблицы, 1 приложение и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 128 цитируемых источника.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 7.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы

Линии D. melanogaster и их характеристики

В работе использованы линии D. melanogaster: SS (мутантная по гену flamenco, w') и линия D32 с фенотипом flamenco+ из коллекции кафедры генетики МГУ. Линии культивировали в стандартных условиях, на общепринятой агаризованной питательной среде при температуре 25°С.

Штаммы Escherichia coli

В работе использованы следующие штаммы: JM109 (endAl glnV44 thi-1 relAl gyrA96 recAl mcrB' A(lac-proAB) el4- [F traD36 pro AB* lacf lacZAM15] hsdR17(r¿mK')) для клонирования ПЦР фрагментов, BL21 (Е. coli В F- dem отрТ hsdS{rü- mB-) gal [malB+]K-i2(^S)) для экспрессии белка HP la.

Методы

Приготовление компетентных клеток и трансформацию Е. coli осуществляли по стандартным методикам (Sambrook, Rüssel, 2001).

Выделение хромосомной и плазмидион ДНК осуществляли с использованием наборов «Genomic DNA Purification Kit» (Fermentas) для

5

выделения хромосомной ДНК и «GeneJET Plasmid Miniprep Kit» (Fermentas) для выделения плазмид по протоколам фирмы-производителя.

Сбор тканей для последующего выделения РНК

Мух анестезировали диэтиловым эфиром и вскрывали под бинокулярным микроскопом с помощью препаровальных игл. Органы (яичники, семенники и корпуса) (по 20-30 мг) собирали в отдельные пробирки объемом 1,5 мл с заранее добавленным реагентом для выделения суммарной РНК «ExtractRNA» (Евроген).

Выделение тотальной РНК осуществляли с помощью реактива «ExtractRNA» (Евроген) в соответствии с протоколом фирмы производителя. Количество выделенной РНК измеряли спектрофотометрически на приборе Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). 400 нг РНК обрабатывали 1U ДНКазы I (Fermentas) в течение 1 часа. Реакцию останавливали добавлением EDTA (конечная концентрация 2,5 тМ), для инактивации ДНКазы пробу прогревали в течение 10 мин при 65°С.

Синтез кДНК осуществляли с помощью набора «MMLV RT kit» (Евроген) по протоколу производителя. В качестве затравок для обратной транскрипции РНК использовали случайный праймер. В реакции использовали 200 нг обработанной ДНКазой I РНК.

Полимеразная цепная реакция.

Приготовление реакционной смеси выполняли по стандартному протоколу (Fermentas). Реакцию проводили в амплификаторе Amply4 (Biokom). В качестве матрицы использовали хромосомную ДНК и кДНК, полученную на матрице РНК D. melanogaster.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

Амплификацию проводили в объеме 25 мкл в течение 40 циклов в амплификаторе MiniOpticon Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories). Использовали реакционная смесь M-428 (Синтол), содержащую флуоресцентный краситель SYBR Green I. Концентрация MgCl2 - 2.5 мМ, каждого праймера - 0.4 мкМ на реакцию. Параметры цикла: денатурация -95°С, 30 сек; отжиг праймеров - 55°С, 30 сек; элонгация - 72°С, 1 мин.

Клонирование в плазмидах и получение векторных конструкций, содержащих регуляторные области ретротранспозонов

Клонирование ПЦР-фрагментов осуществляли в векторе pAL-TA по протоколу фирмы производителя (Евроген). Копии гена hpla переклонировали в плазмиду рЕТЗОа по сайтам рестрикции Not I и Nde I.

Амплификаты регуляторных областей ретротранспозонов лигировали с

плазмидой pAL-TA по протоколу фирмы производителя (Евроген) . Затем фрагмент вырезали по заданным сайтам рестрикции Xho MUincñW и EcoR I и переклонировали его в векторную плазмиду pEGFP-nl, таким образом, чтобы регуляторные области элемента лежали в одной рамке считывания с репортерным геном GFP. Конечным этапом было переклонирование фрагмента с ДКП и нетранслируемой областью, слитого с репортерным геном по сайтам рестрикции Xho VHincñU и Л'о/1 в плазмиду pCaSpeR-hs. Рестрикцию проводили по протоколам фирмы-производителя (Fermentas).

Секвенирование.

Клонированные фрагменты ДНК секвенировали в фирме Евроген.

Получение рекомбинантных белков.

Для получения рекомбинантного белка штамм E.coli BL21 трансформировали плазмидой рЕТЗО, содержащей полноразмерную копию гена hpla. В колбу с 200 мл бактериальной культуры, находящейся в логарифмической фазе роста, добавляли IPTG до конечной концентрации 1мМ и инкубировали при комнатной температуре в течение 16 ч. Полученную культуру осаждали центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин, осадок ресуспендировали в 10 мл буфера для нанесения на колонку (0,5М NaCl, 5мМ имидазол, ЮмМ фосфатный буфер рН 7,4 1мМ PMSF), затем разрушали клетки ультразвуковым гомогенизатором УЗГ-0,1/22 (УЗТ). Полученный лизат центрифугировали 30 мин при 16000 g, белок выделяли из супернатанта с помощью колонки HisTrap FF (GE Healthcare). В протокол, рекомендованный производителем, был добавлен этап промывки белка растворами, содержащими 50 и 150 мМ имидазола. Качество полученного препарата оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии MOPS.

Электрофорез проводили в камере для вертикального электрофореза VE-10 (Хеликон) в 10%-ном ПААГ. К 3,3 мл 30%-ного акриламида (29 г акриламида к 1 г бисакриламида) добавляли 4 мл 1М раствора Tris-HCl рН 6,8 и доводили водой H2Omq до объема 10 мл. Для инициации радикальной полимеризации добавляли 100 мкл 10%-ного APS. В качестве катализатора использовали 30 мкл ТЕМЕД. Состав верхнего буфера: 50mM MOPS, 50 тМ Tris-HCl рН 6,5, 0,1% SDS. Нижний буфер - 50 тМ Tris-HCl рН 6,8. Форез проводили в течение 2-3 час при напряжении 150 В.

Диализ растворов белков проводили в диализных трубках SERVAPOR (Serva). 1 мл раствора белка в буфере для элюции с колонки HisTrap FF диализовали против 200 мл раствора PBS при 4°С в трех сменах буфера.

Измерение концентрации белка проводили с помощью набора реактивов «Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination» (Sigma) по протоколу фирмы.

Анализ ДКН-связывающей активности рекомбинантного белка НР1а

Связывание белка проводили в пробирке объемом 0,5 мл в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, 0,5 М КС1 рН 7,4 в течение 30-60 мин при 0°С. Очищенные фрагменты смешивали с 8 мкг белка. Связывание анализировали в 8% ПААГ: к 2,65 мл 30%-ной смеси акриламид/бисакриламид (29:1) добавляли 0,5 мл ЮхТВЕ. Затем к смеси добавляли 1 мл 80%-ного глицерина и доводили ее до объема 10 мл H2Omq. Для инициации радикальной полимеризации добавляли 100 мкл 10% APS. В качестве катализатора использовали 30 мкл ТЕМЕД.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ транскрипции локуса flamenco

Локус flamenco представляет собой место скопления дефектных копий МГЭ. Предполагается, что транскрипт flamenco участвует в процессе РНК-интерференции МГЭ, выступая в роли молекулы-предшественника, дающей начало малым РНК, ассоциированных с белком PIWI (piPHK). У инсерционных мутантов по локусу flamenco малые РЖ, взаимодействующие с белком PIWI, не образуются (Brennecke et al., 2007). Мы предположили, что в линии SS с фенотипом flamenco", нарушен механизм образования малых РНК. Одной из причин нарушения может быть отсутствие транскрипта-предшественника из-за нарушения инициации транскрипции. Другой причиной может быть нарушение его дальнейшего процессинга: сплайсинга или расщепление до малых РНК. Нами был проведен анализ транскрипции РНК в линиях SS (мутант) и D32 (дикий тип) в четырех точках локуса flamenco (рис. 1).

Исследуя уровни транскрипции во взятых точках на РНК семенников линий дикого типа и мутанта, мы не обнаружили принципиальных отличий в уровнях транскрипции. В яичниках общий уровень транскрипции в анализируемых точках 1 и 2 локуса flamenco примерно в 2 раза ниже в линии SS, чем в линии D32, что может быть связано со структурными особенностями района инициации транскрипции предшественника в этих линиях (Нефедова и др., 2007). При этом в точках 3 и 4 в линии D32 наблюдается снижение уровня транскрипции в 30 и в 3 раза соответственно. У линии SS такого снижения не наблюдалось.

По-видимому, в линии D32 происходит процессинг РНК-предшественника, считываемого в этом районе, результат которого мы наблюдаем на графике. Отсутствие различий уровней транскрипции во всех точках в линии SS можно объяснить нарушением процессинга первичного транскрипта.

Рис. 1. Диаграмма транскрипции РНК в локусе /himeneo. А) Количественный ОТ-ПЦР анализ транскрипции в 4-х анализируемых точках района flamenco в яичниках мух линий flamenco* (D32) и SS. Б) Количественный ОТ-ПЦР анализ транскрипции в 4-х анализируемых точках района flamenco в семенниках мух линий flamenco* (D32) и SS.

Молекулярно-генетический анализ сплайсинга локуса flamenco

РНК локуса flamenco подвергается альтернативному сплайсингу (Goriaux et al., 2014). Мы предположили, что в нашей линии SS он может быть нарушен. Для проверки нашей гипотезы мы провели ОТ-ПЦР-анализ 5'-областиflamenco размером 10 т.п.н., в которой были картированы различные альтернативно сплайсированные формы РНК (Goriaux et al., 2014).

Мы подобрали праймеры к экзонам, которые имеются в большей части альтернативно сплайсированных форм локуса flamenco (области в которых отсутствовали копии МГ'Э и картировались как экзоны) таким образом, чтобы в случае нарушения сплайсинга, мы смогли бы это установить, анализируя длину получаемых ПЦР-фрагментов.

Качественный анализ методом ОТ-НЦР показал, что все альтернативно сплайсированные формы присутствуют как в линии D32, так и в линии SS (рис. 2 В).

Количественный анализ показал, что в линии дикого типа сплайсированных форм значительно меньше, чем у линии с фенотипом flamenco. Это можно объяснить накоплением сплайсированного транскрипта в линии SS. Вероятно, один из факторов, отвечающих за дальнейший процессинг транскрипта утратил свою функцию.

!ш ns iuj sn ss

gimió«-__,>«н10<ж МО - . лдаймер * .в-мРНК

Рис. 2. Альтернативный сплайсинг РНК локуса flamenco. А - Схема вариантов альтернативного сплайсинга РНК, считываемой в локусе flamenco. Буквами А, В, С обозначены сплайсировашше формы, полученные с одной пары праймеров: exonl f-exon2r, exonlf-ехонЗг, exonlf-exon4r соответственно. Прозрачными прямоугольником обозначен вариант альтернативной формы сплайсинга РНК, которая не была описана ранее. Б-количественный анализ сплайсированных РНК (А, В, С) локуса flamenco в яичниках мух линий flamenco+ (D32) и SS. В - электрофоре1рамма ПЦР-продуктов кДНК, полученных па основе РНК, выделенной из яичников, с праймеров ехоп 1 f-exon2r, exonl f-exon3r и exonlf-схоп4г.

Анализ экспрессии генов системы РНК-интерференции

Как мы установили, причиной фенотипа flamenco может быть нарушение процессинга РНК локуса flamenco. Предполагается, что flamenco является

кластером piPHK. Как было описано в параграфе 1.3.1.2., в процессе piPHK-интерференции задействованы белки семейства PIWI. Мы сравнили уровни экспрессии генов, кодирующих данные белки системы РНК-интерференции (aub, piwi и ago3), в линиях SS и D32. Для гена piwi ранее нами было показано комплементарное взаимодействие с локусом flamenco [Урусов и др., 2013j. Также мы измерили уровень экспрессии гена zuc. Некоторые литературные данные указывают на то, что данный ген кодирует эндонуклеазу, вовлеченную в первичный процессинг предшественника piPHK [Handler etjal., 2013, Ipsaro et al., 2012; Nishimasu et ai., 2012; Saito et al., 2010]. Существенных отличий no транскрипции данных генов обнаружено не было (рис. 3).

ддс(г)

адо-З aub zuc pj»i адо-3 aub zuc pint

Рис. 3. Уровень экспрессии на уровне транскрипции генов системы РНК-ннтерференции ago-3, aub, zuc и piwi в яичниках в линиях D32 (дикий тин) и SS (flamenco).

Полученные данные указывают на отсутствие нарушений в работе данных генов в линии SS.

Анализ экспрессии генов семейства hpl

Мы провели анализ экспрессии генов, кодирующих белки семейства HP! в линии SS с фенотипом flamenco [Лавренов и др., 2014].

Предположительно, нарушения экспрессии генов hpl могли повлиять на активность ретротранспозонов группы gypsy. Основные паралоги гена hpl (hpla, hplb, hplc) экспрессируются во всех тканях, поэтому анализ их экспрессии проводили на препаратах тотальной РНК. Гены hpld и hple экспрессируются исключительно в терминальных тканях D. melanogaster [Vermaak, Malik, 2009]. поэтому кДНК синтезировали на основе РНК, выделенной из яичников и семенников соответственно.

По полученным данным уровень экспрессии генов hpla, hplb и hplc в линии SS не отличается от уровня экспрессии дикого типа (рис. 4А). Это

11

свидетельствует о том, что фенотип flamenco в линии SS не вызван нарушением экспрессии данных генов. Этого следовало ожидать, так как известно, что обычно мутации в этих генах детальны или вызывают грубые дефекты в развитии мух (Kellum and Alberts, 1995 ).

Л ЛСД A AAC(t) Б ДДсМ В

hpla hplb hplc hpla hplb hplc hpld hpie

D32 SS 032 SS D32 SS

Рис. 4. Уровень экспрессии на уровне транскрипции генов, кодирующих белки семейства НР1 в линиях D32 (дикий тпп) и SS (flamenco). Á) Экспрессия генов hpla, hplb и hplc в целых мухах. Б) Экспрессия гена hpld в яичниках. В) Экспрессия гена hp Je в семенниках.

Мутации в генах hpld и hp le не детальны, но могут вызывать стерильность у самок. Уровень экспрессии гена hpld в линии SS оказался примерно в 2 раза ниже по сравнению с диким типом (рис. 4Б). Полученные данные позволяют предполагать, что низкая экспрессия hpld может вносить вклад в формирование фенотипа flamenco". Ген hple в линии SS экспрессируется, в основном, на уровне D32 (рис. 4В), и, таким образом, не участвует в формировании фенотипа flamenco.

Стоит отметить, что для гена hpld(rhino) уже демонстрировалось участие в инициации транскрипции двуцепочечных кластеров piPHK (Klattenhoff, 2009). Хотя flamenco считается одноцепочечным кластером, мы все же заметили некую корреляцию в снижении экспрессии hpld и flamenco в яичниках линии SS. Справедливо будет предположить, что эти снижения взаимосвязаны и гены каким-то образом взаимодействуют друг с другом.

Связывание белка HPla с нетранслируемыми областями ретротранспозонов группы gypsy

Нами был получен рекомбинантный белок HP 1а. По литературным данным известно, что белки семейства НР1 способны связываться с нетранслируемыми областями некоторых транспозонов, таким образом подавляя их транспозицию [Minervini et al., 2007]. Поскольку элементы группы

12

gypsy делятся на три подгруппы по специфичности интеграции [Нефедова, 2007], мы решили выяснить, различаются ли подгруппы по способности связываться с белком HP 1а.

Для этого нами были поставлены эксперименты по связыванию HP 1а с ДНК элементов in vitro.

В качестве матрицы для связывания мы использовали амплификаты, содержащие 5'UTR области элементов ZAM, tirant, 17,6, rover, gypsy и Springer, полученные на матрице полученных нами конструкций pCasper:LTR-UTR-EGFP, во избежание связывания неспецифики.

Мы начали с постановки эксперимента по связыванию с элементами подгруппы ZAM. Помимо целевых фрагментов в общую смесь для связывания добавлялся «холодный конкурент» - ПЦР фрагмент, с которым не должны образовываться ДНК-белковые комплексы. «Холодный конкурент» выступает дополнительным контролем, подтверждающим, что наш белок связывается специфически, игнорируя «холодного конкурента» в качестве матрицы для связывания.

В случае элементов ZAM и tirant белок HP 1а в различных разведениях предпочтительнее связывался с копиями элементов, содержащих наибольшее количество повторов (рис. 5).

ZAM tirant

Рис. 5. Связывание белка НР1а с элементами ZAM и tirant Красным» стрелками обозначены ДНК-белковые комплексы. В качестве контрольного ПЦР-фрагмента («холодного конкурента») использовался амплификаг гена Grp. Цифрами обозначено количество белка взятого на пробу в мкг. Красными стрелками обозначены ДНК-белковые комплексы.

Это подтверждается и другими экспериментами. При связывании малого количества белка HP 1а с амплифицированными областями 5'UTR элемента tirant, ДНК-белковые комплексы образовывались с нетранслируемыми областями, содержащими 6 повторов (рис.6, а). Если мы убирали из общей смеси фрагмент, содержащий 6 повторов, связывание и образование ДНК-белковых комплексов происходило с амплификатами имеющими 4 или 5 повторов (рис. 6, б). Похожая картина наблюдалась при удалении из смеси фрагмента с 5-ю повторами (рис.6, в). Интересно, что при тех же концентрациях НР1а и отсутствии амплификатов с 4, 5 и 6 повторами, связывания с оставшимися амплификатами (1-3 повторами) не происходило (рис.6, г).

tirant

праймер

Рис. 6. Связывание белка HPla с различными полиморфными формами 5'UTR элемента tirant а - 6 полиморфных вариантов, б - 5 полиморфных вариантов, в — 4 полиморфных варианта, г — 3 полиморфных варианта. Цифрами обозначено число повторов в амплификатах 5'UTR.Черными стрелками обозначены несвязавшиеся с HP 1а амплификаты. Красными стрелками обозначены ДНК-белковые комплексы.

Подобная картина наблюдалась и с элементом ТАМ. Мы делали разные комбинации с амплификатами, содержащими от 1 до 3 повторов в нетранслируемой области ХАМ. Во всех трех экспериментах НР1а связывался полностью с фрагментами, имеющими 2 и 3 повтора (рис.7, а, б, в).

Амплификаты с одним повтором связывались слабее, что мы и наблюдали на электрофореграмме - небольшое смещение ПЦР-продукта (рис. 7, а, б).

ZAM

праймер праймер

тандемные повторы

Z.4M

HPla - +

ZAM

HPla - +

В) ZAM HPla

Рис. 7. Связывание белка HPla с различными полиморфными формами 5'UTR элемента ZAM. Связывание с полиморфными формами нетранслируемой области ZAM (а -с двумя вариантами нетранслируемой области ZAM, содержащими 3 повтора и 1 повтор, б -с двумя вариантами нетранслируемой области ZAM, содержащими 2 повтора и 1 повтор, в -с двумя вариантами нетранслируемой области ZAM, содержащими 3 повтора и 2 повтора). Цифрами обозначено число повторов в амплификатах 5'UTR элементов. Черными стрелками обозначены не связавшиеся с HPla амплификаты. Красными стрелками обозначены ДНК-белковые комплексы (цифрой 1 обозначено число повторов в смещенном амплификате) В качестве контрольного ПЦР-фрагмента («холодного конкурента») использовали амплификагг гена Grp.

Далее мы провели гель-шифт анализ связывания белка HPla с элементами gypsy, Springer, rover и 17,6. В результате показано, что белок HPla способен связываться со всеми классами элементов группы gypsy. Однако предпочтительнее HPla связывается с нетранслируемыми областями элементов, содержащих тандемные повторы в 5'UTR, богатые АТ-последовательностями (рис. 8). По этой причине хуже всего связывание белка прошло с элементами Springer и gypsy. По биоинформатическим данным у элемента Springer тандемные повторы отсутствуют, а элемент gypsy содержит наименьшее число повторов среди представленных элементов и наименьшую протяженность в нетранслируемой области. Стоит также отметить, что в некоторых копиях gypsy тандемные повторы отсутствуют [Minervini et al.,

15

2007].

gV/WV

г

Плд

"1 -с

5'ITR

Springer rover

котраль - Ш1

1'ис. 8. Связывание белка HPla с элементами gypsy, Springer, rover и 17,6. Красными стрелками обозначены ДНК-белковые комплексы. В качестве контрольного ПЦР фрагмента («холодного конкурента») использовался амплификат гена Grp.

Таким образом, можно предполагать, что белок HPla принимает участие в регуляции элементов группы gypsy, инициируя компактизацию участка, содержащего копию элемента. При этом сайтом связывания выступают тандемные повторы, имеющиеся в нетранслируемых областях элементов. Связывание осуществляется благодаря содержащимся в повторах АТ-богатым последовательностям.

Заключение

В данной работе мы провели комплексный анализ линии SS с целью выяснения причин фенотипа flamenco, характеризуемого повышенной частотой транспозиции МГЭ gypsy.

Основными механизмами регуляции транспозиции МГЭ у D.melanogaster являются РНК-интерференция и механизмы компактизации участков с копиями МГЭ, задействующие белки семейства НР1. Нами было установлено, что в линии SS имеется нарушение в системе процессирования малых РНК, необходимых для сайленсинга ретроэлементов. Точную причину нарушения установить трудно. Накопление транскриптов локуса flamenco можно объяснить мутацией самого локуса или нарушением работы генов системы РНК-интерференции. Скорее всего, первичный транскрипт локуса flamenco после сплайсинга не связывается с факторами, инициирующими его дальнейшее процессирование на малые РНК. Нам удалось исключить мутации в основных генах, задействованных в piPHK-пути регуляции ретротранспозонов. В дальнейшем будет необходимо провести анализ и других

генов, ассоциированных с процессом биогенеза piPHK на стадии обработки первичного транскрипта.

Корреляция в снижении уровня транскрипции hpld и flamenco, которую мы наблюдали в яичниках линии SS, можно объяснить взаимодействием этих генов. Возможно, как и в другом описанном случае, hpld(rhino) инициирует транскрипцию кластера piPHK, в данном случае — flamenco. С другой стороны, наблюдаемая корреляции могла быть случайна. Тогда можно предположить, что в линии SS фенотип flamenco формируется комплексно, то есть в результате нарушения работы обоих генов.

Мы также установили, что белок HP la способен связываться с нетранслируемыми областями элементов группы gypsy. В дальнейшем необходимо сравнить связывающую способность других белков семейства НР1.

Полезным инструментом в изучении механизмов транспозиции могут стать генетические конструкции, содержащие ДКГ1 и нетранслируемые области ретротранспозонов, слитые с репортерными генами. Такие конструкции помогут отследить транспозиционную активность элементов in vivo.

ВЫВОДЫ

1. Уровни экспрессии генов, участвующих в системах РНК-интерференции, аиЪ, ago-3, zuc, piwi не отличаются в линиях SS и дикого типа. Это свидетельствует о том, что в линии SS эти гены не несут мутаций и, следовательно, не участвуют в формировании фенотипа flamenco.

2. Показано, что в линии SS, несущей мутацию в локусе flamenco, сплайсинг РНК, считываемой с этого локуса, не нарушен. Однако содержание сплайсированных транскриптов flamenco а линии SS выше, чем в линии дикого типа, что свидетельствует о нарушениях дальнейших этапов их процессинга.

3. Анализ экспрессии генов kpla, hplb, hplc, hpld и hple, кодирующих белки семейства HP i, показал, что hpld экспрессируется на низком уровне в линии SS. Это указывает на то, что ген hpld может участвовать в регуляции транспозиции элементов группы gypsy, внося вклад в формирование фенотипа flamenco.

4. Выявлено, что белок HP 1а, кодируемый геном hp la, связывается с нетранслируемыми областями ретротранспозонов группы gypsy, содержащими тандемные повторы. Таким образом, белок НР1а принимает участие в регуляции транспозиции элементов группы gypsy.

Список работ опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК:

1. Лавренов А.Р. , Нефедова Л.Н., Романова Н. И., Ким А.И. Экспрессия генов семейства hpl и их возможная роль в формировании фенотипа flamenco у D. melanogaster II Биохимия (Biochemistry (Moscow)). — 2014, —Т. 79,№ 11.-С. 1554-1560.

2. Урусов Ф.А., Нефедова Л.Н., Лавренов А.Р., Романова Н.И., Ким А.И. Генетический и молекулярный анализ комплементации локусов flamenco и piwi у Drosophila melanogaster // Вавиловский журнал генетики и селекции — 2013 - Т. 17, № 3. - С. 381-89.

Материалы и тезисы конференций:

1. Лавренов. А.Р. Исследование взаимодействия генов, контролирующих транспозиции мобильных элементов i-руппы gypsy у Drosophila melanogaster // VII Конференция молодых ученых ИБР РАН, Тез. докл// Онтогенез. - 2013. - Т. 43, No4. - С. 235-249.

2. Лавренов А.Р., Урусов Ф.А. Анализ экспрессии ретротранспозона gypsy в гибридах, полученных от скрещивания линий, несущих мутации в генах контролирующих данный элемент у Drosophila melanogaster // VIII Конференция молодых ученых ИБР РАН, Тез. докл// Онтогенез. - 2013. -T.44,No4.-C. 230-231.

3. Лавренов А.Р., Шмелькова А.О. Анализ экспрессии генов семейства hpl в пиниях Drosophila melanogaster, мутантных по локусу flamenco // IX Конференция молодых ученых ИБР РАН, тезисы докладов. 2013. С. 3738.

4. Лавренов А.Р. Конструирование векторов для исследования транспозиционной активности ретротранспозонов группы gypsy in vivo у Drosophila melanogaster // XX международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов, секция «биология», тезисы докладов. 2013. С.87

5. Nefedova L., Lavrenov A., Kuzmin I., Kim A. Different way evolution of the regulatory regions of closely related mobile elements of drosohila melanogaster provides different way transposition // Proceedings of the 17th Evolutionary Biology Meeting. —Marseilles, 2013. — P. 86-87.

6. Nefedova L., Shmelkova A., Lavrenov A. et al. Integration specificity of the mobile element tirant in the drosophila melanogaster genome// Proceedings of the International Moscow Conference on computational molecular biology. — M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, 2013. - P. 130-131.

7. Лавренов А.Р. Анализ экспрессии генов семейства hpl в линии SS Drosophila melanogaster, мутантной по локусу flamenco // XXI международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2014», секция «биология», тезисы докладов. С.91-92

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: globus9393338@yandex.ru тел.: 8 (495) 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 16.01.2015 г.