Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ транскрипции ретротранспозонов группы gypsy в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по локусу flamenco

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ транскрипции ретротранспозонов группы gypsy в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по локусу flamenco"

На праваурукописи

УРУСОВ Феликс Анатольевич

АНАЛИЗ ТРАНСКРИПЦИИ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ ГРУППЫ gypsy В ЛИНИЯХ Drosophila melanogaster, МУТАНТНЫХ ПО Л О КУСУ flamenco

03.02.07 — генетика

005570522

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2015

005570522

Работа выполнена на кафедре генетики биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

КИМ Александр Иннокентьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент РАН ЗАХАРОВ-ГЕЗЕХУС Илья Артемьевич (советник РАН, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук)

доктор биологических наук АЛЕКСАНДРОВ Игорь Донатович (главный научный сотрудник, Объединенный институт ядерных исследований)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Защита состоится 2015 г. в /^^"часов на заседании

диссертационного совета Д 002.238.01 в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН: http://idbras.ru/.

Автореферат разослан 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

О.В. Бойко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Мобильные генетические элементы (МГЭ) - обязательная составляющая генома всех эукариотических организмов. Перемещения МГЭ вызывают повышенный уровень инсерционного мутагенеза, что приводит к геномной нестабильности, которую можно рассматривать как движущий фактор эволюционного процесса. С другой стороны, геномная нестабильность часто приводит к негативным последствиям для организма. Именно поэтому возникли механизмы, ограничивающие транспозиционную активность МГЭ. Так, например, уже достаточно давно у Drosophila. melanogaster известен локус flamenco, контролирующий транспозиции МГЭ gypsy [Prud'homme et al., 1995]. В последнее время этому локусу уделяется повышенное внимание [Zanni et al., 2013; Goriaux et al., 2014b]. Удалось установить, что локус flamenco состоит из дефектных копий МГЭ и является источником коротких антисмысловых РНК особого класса - piPHK, которые участвуют в сайленсенге МГЭ [Brennecke et al., 2007]. Таким образом, flamenco осуществляет контроль транспозиции по механизму РНК-интерференции. В настоящее время интенсивно исследуются механизмы функционирования piPHK-системы [Czech et al., 2013; Muerdter et al., 2013]. По-видимому, роль данного класса коротких РНК у разных организмов может быть значительно шире и не ограничиваться контролем МГЭ [Landry et al, 2013; Ross et al., 2014].

Известны линии D. melanogaster, мутантные по локусу flamenco. В нашей лаборатории такими линиями являются MS и SS, изогенные по происхождению [Kim et al., 1994а]. Несмотря на то, что эти две линии были описаны уже достаточно давно, молекулярные причины наблюдаемого мутантного фенотипа не известны вплоть до настоящего времени. Мы предпожили, что мутантный фенотип может быть обусловлен нарушениями не только в локусе flamenco, но и в других генах. В работе обсуждается возможная роль гена piwi в формировании мутантного фенотипа flamenco в линиях MS и SS.

В геноме дрозофилы, кроме уже упомянутого gypsy, обнаружены родственные ему ретротранспозоны, которые объединены в одноименную систематическую группу [Nefedova, Kim, 2009]. Данные ретротранспозоны сходны по структуре с ретровирусами, а для gypsy инфекционные свойства были показаны экспериментально [Kim et al., 1994b], Поэтому изучение механизмов ограничения активности таких элементов генома является актуальным. Хорошей модельной системой для изучения вышеуказанных процессов могут являться линии MS и SS. На данный момент актуальны два вопроса: 1) Приводит ли мутантный фенотип в линиях MS и SS к нарушению регуляции других МГЭ или является специфичным только для gypsy? Иными словами, пригодны или нет эти линии для изучения контроля родственных gypsy элементов? 2) Какова молекулярная природа нарушений в этих линиях, и связаны ли нарушения с функционированием системы piPHK? Ответить на эти

вопросы позволит анализ экспрессии ретротранспозонов группы gypsy в линиях MS и SS.

Цель данной работы — анализ транскрипции ретротранспозонов группы gypsy для исследования причин генетической нестабильности в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по локусу flamenco.

Были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать экспрессию на уровне транскрипции ретротранспозонов группы gypsy в линиях MS и SS, мутантных по локусу flamenco.

2. Провести анализ экспрессии ретротранспозона Tirant в линии MS, различных отводках линии SS и у гибридов, полученных от скрещивания отводок 7Kwl и 7К(1) между собой.

3. Методом вычитающей гибридизации определить, способны ли перемещаться копии элемента Tirant, присутствующие в геноме изучаемых линий.

4. Провести структурный анализ 5'-нетранслируемой области Tirant.

5. Осуществить скрещивания линий MS и SS с линией piwi3, гетерозиготной по мутации в гене piwi. Проанализировать уровень экспрессии gypsy в яичниках и семенниках гибридов и исходных родительских линий методом ПЦР в реальном времени. Проанализировать уровень экспрессии элемента Ideflx в семенниках гибридов и исходных родительских линий.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые было показано, что ретротранспозоны rover, 17,6, 297, Ideflx, Quasimodo, Transpac, Tirant, gypsy, springer, opus, принадлежащие одной систематической группе - gypsy, экспрессируются на уровне РНК в линиях MS и SS, следовательно, данные линии пригодны для дальнейших исследований механизмов контроля вышеуказанных МГЭ. Впервые показано, что транскрипция ретротранспозонов rover, 17,6, 297, Ideflx, Quasimodo, Transpac, Tirant, gypsy, springer, opus контролируется локусом flamenco. Для МГЭ Tirant впервые показан гетерогенный характер транскрипции в изогенных отводках линии SS. Впервые в изогенных отводках линии SS обнаружены структурные различия нетранслируемой области Tirant. Впервые обнаружена способность Tirant к транспозиции в линиях MS и SS.

Впервые показано, что генетические дефекты в линиях D. melanogaster MS и SS не связаны с нарушением функции белка Piwi, однако связь с функционированием piPHK системы интерференции имеется. Впервые предложен новый способ детекции фенотипа flamenco, основанный на анализе экспрессии gypsy в семенниках. В дальнейших исследованиях линий MS и SS можно успешно применять вышеуказанный способ. Впервые в результате анализа литературных данных выявлены новые гены-кандидаты, мутации в которых потенциально могут обуславливать мутантный фенотип в SS и MS.

Апробация работы

Работа прошла апробацию на конференции «Спорт: медицина, генетика, физиология, биохимия, педагогика, психология» (Уфа, 2011), на

Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» (Москва), семинарах лаборатории генетики животных и заседаниях кафедры генетики биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Лнчное участие автора

Работа выполнена лично автором. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 116 страницах, содержит 27 рисунков, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 128 цитируемых источника.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Линии D. melanogaster и условия их культивирования

В работе применялись изогенные линии, мутантные по локусу flamenco, w': SS, 7К(1), 7KSS, 7Kw', MS [Kim et al., 1994а]. В качестве контрольной использовали линию дикого типа Д32 с фенотипом flamenco+. Линия P{PZ}piwi06843 cn'/СуО; гу506 (в тексте обозначена символом piwi3) характеризуется наличием инсерции Р-элемента в первом экзоне гена piwi [Lin, Spradling, 1997]. Линия piwi3 была любезно предоставлена А.И. Калмыковой (ИМГ РАН). Все линии мух культивировали на общепринятой агаризованной среде при температуре 25°С.

Выделение тотальной РНК

Выделение РНК осуществляли с помощью комплекта реагентов «РИБО-золь-А» по протоколу производителя («AmpliSens», Россия). Качество выделенной РНК оценивали путем электрофореза, количество — спектрофотометрически (Nanodrop 1000, «Thermo Fisher Scientific»). Затем 1 мкг РНК инкубировали с 1U ДНКазы I («Fermentas») при 37°С в течение 60 мин. Реакцию останавливали добавлением EDTA до конечной концентрации 2,5 мМ, ДНКазу инактивировали прогреванием при 65°С в течение 10 мин.

Синтез кДНК

Синтез кДНК осуществляли с помощью набора «First Strand cDNA Synthesis Kit» («Fermentas») по протоколу производителя, в качестве затравки для синтеза использовали случайные праймеры. Количество матрицы РНК составляло 500 нг на реакцию.

Полимеразная цепная реакция

Амплификацию в режиме реального времени проводили в объеме 25 мкл в течение 40 циклов в амплификаторе MiniOpticon Real-Time PCR System («Bio-Rad Laboratories»). Использовали реакционную смесь M-428 с красителем

5

SYBR Green I («Синтол»). Концентрация MgCl2 — 2.5 мМ, каждого праймера -0.4 мкМ на реакцию. Параметры цикла ПЦР: денатурация - 95°С, 15 сек, отжиг праймеров - 55°С, 45 сек, элонгация - 62°С, 60 сек. Для амплификации использовали праймеры gypsy f 5'-gtctgcacccaagcaaagta-3', gypsy г 5'-cacgtcaggaatagcttcct-3', rp49 f 5'-gtatcgacaacagagtgcgt-3', rp49 r 5'-gttctgcatgagcaggacct-3', Idefix f 5'-gacatgggaaaaccgcaaga-3', Idefix r 5'-cggtcttgtggaatctttcta-3'. Анализ результатов ПЦР проводили с помощью пакета программ Bio-Rad CFX Manager (версия 1.6.541.1028). Вычисление относительной экспрессии производилось AAC(t) методом. В качестве референсного гена был использован гр49.

Амплификацию кДНК проводили в объеме 25 мкл в течение 30 циклов в амплификаторе Amply-24 ("Biokom"), используя Тад-полимеразу (2.5U на реакцию). Концентрация MgCl2 - 2.5 мМ, каждого праймера - 0,4 мкМ на реакцию. Параметры цикла: денатурация - 95°С, 30 сек, отжиг праймеров -54°С, 30 сек, элонгация - 72°С, 1 мин. Нуклеотидный состав праймеров: ZAM f 5'-aacggcatcaattgcatcaa-3', ZAM r 5'-tgttggttctactctgcttg-3', 17.6 f 5'-cctgcgtagcacgattttgt-3', 17.6 r 5'-ctatgtccgccacaccagtt-3' 297 f 5'-cgttggttcatacgccgaat-3 ', 297 r 5'-ttcgacgtctgctactccgt-3', Transpac f 5'-taacaagcgatccgatagtc-3', Transpac r 5'-ctgagtccgcactgtgaata-3', Tirant f 5'-ggaattgcattaacgtagtt-3', Tirant r 5'-gggtctgttcgggtttcatt-3', springer f 5'-gacgtagttcgacagtttcc-3', springer r 5'-gccactattgtctgcgattt-3', rover f 5'-gcgacttaatagggttgtcc-3', rover r 5'-ttccgtgttacggtgttctg-3', Quasimodo f 5'-ggaagcacatttgcaacgct-3', Quasimodo r 5'-ttcgggagttgagctggaat-3', Opus f 5'-ggaagcacatttgcaacgct-3', Opus r 5'-ttgagcactgtggggcataa-3', Idefix f 5'-gacatgggaaaaccgcaaga-3', Idefix r 5'-acgatcttcctgccacgatt-3', gypsy f 5'-gtgaacgctattcactgcga-3', gypsy r 5'-gaggtgacagtttctgagtt-3', rp49-f 5'-cgatctcgccgcagtaaac-3', rp49-r 5'-accatccgcccagcataca-3'.

Вычитающая гибридизация

Вычитающую гибридизацию выполняли по методу, изложенному в работе [Mamedov et al., 2005]. Данный метод основан на инвертированной ПЦР и позволяет сравнивать один и более геномов (трэйсеров) относительно другого генома (драйвера). В частности, с его помощью можно выявлять новые инсерции МГЭ. После гибридизации между собой трэйсерной и драйверной ДНК можно амплифицировать геномное окружение такой инсерции мобильного элемента, которая есть в трэйсерном геноме, но отсутствует в геноме драйвера. Геномное окружение инсерции МГЭ, которая присутствует в обоих геномах, не амплифицируется.

Биоинформатический анализ

В качестве источника нуклеотидных последовательностей использовали GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide) и базу данных Flybase (http://flybase.org/). Номера последовательностей ДКП-ретротранспозонов D. melanogaster в GenBank: gypsy (AF033821), ZAM {AJ000387), Idefix (AJ009737), Tirant (AY928610), opus (AY180918), Springer (AF364549), Quasimodo

(AF364550), 17,6 (Х01472), 297 (Х03431), rover (AF492764), Transpac (AF222049). Для анализа нуклеотидных последовательностей и дизайна праймеров использовали программу Vector NTI Suite 9 («Invitrogen»), РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование экспрессии на уровне транскрипции МГЭ группы gypsy в линиях MS и SS

Генетические дефекты в линиях SS и MS теоретически могут вызывать дерепрессию не только gypsy, но и родственных ему элементов. В связи с этим, мы охарактеризовали наши линии на наличие или отсутствие транскриптов на стадии имаго 11 элементов группы gypsy: rover, 17,6, 297, Idefix, Quasimodo, Transpac, Tirant, ZAM, gypsy, springer, opus (рис. 1). Обнаружено, что большинство элементов группы gypsy являются транскрипционно активными. Транскрипция собственно элемента gypsy хорошо выявляется только в линии MS, поскольку в SS имеются лишь вырожденные его копии, не способные обеспечить уверенно регистрируемого уровня экспрессии. РНК элемента ZAM не удалось обнаружить ни в одной из линий. Подавленная транскрипция может быть обусловлена тем, что характерной чертой ZAM является его преимущественная локализация в гетерохроматиновых районах [Baldrich et al., 1997]. Существенных различий в экспрессии изучаемых МГЭ между самками и самцами не обнаружено, за исключением отсутствия у самцов SS экспрессии Tirant. Что касается экспрессии элементов в контрольной линии Д32, то здесь, по всей видимости, для большинства из них она снижена по сравнению с линиями SS и MS, кроме элементов 297, Quasimodo, Transpac.

Рис.1. Электрофореграммы, демонстрирующие результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии элементов группы gypsy у имаго линий SS, MS и Д32 (линия дикого типа). В качестве контроля амплифицировали фрагмент гена rp49. M - маркер молекулярного веса. Приведены результаты типичного эксперимента (одного из трех).

МГЭ проявляют свою активность в соматических и терминальных тканях гонад. Наиболее изученные МГЭ группы gypsy - ZAM, gypsy, Idefix имеют ярко выраженную тенденцию к активности в соматических тканях яичников [Desset et al., 2003; Mevel-Ninio et al., 2007; Pelisson et al., 2007]. Мы

7

О S Щ Ф Й И ¡S ^ <° t ï s =; M О J> -S SS" ce _ ~ -s о fcs ï ~ te J é? N ci & o> Ш1

SS — 500 п.н.

¿SS «m mm ta» шт mm SOOn.H.

MS штш щт rrt mm «*• ■ 500 п.н.

— - — 500 п.н.

Д32 «I 500 n.H.

ЙД32 500 п.н.

проанализировали экспрессию изучаемых МГЭ в гонадах линий SS и MS (рис. 2). Для большинства остальных элементов можно заключить, что их РНК обнаруживается во всех исследованных органах. За исключением rover, Tirant, springer. Их экспрессия уверенно выявляется только в яичниках. Если сравнивать между собой мужские половые ткани, то в семенниках практически для всех элементов различий между линиями SS и MS не обнаружено.

Рис. 2. Электрофореграммы, демонстрирующие результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии элементов группы gypsy в семенниках (testis) и яичниках (ovary) линий SS и MS. В качестве контроля амплифицировали фрагмент гена rp49. M - маркер молекулярного веса. Приведены результаты типичного эксперимента

Таким образом, по результатам качественного анализа экспрессии МГЭ группы gypsy у взрослых мух и в гонадах можно заключить, что большинство из них экспрессируются в нашей модельной системе изогенных линий SS и MS, следовательно, эти линии пригодны для изучения механизмов, ограничивающих активность элементов этой группы.

Исследование транскрипции МГЭ Tirant

В повторных экспериментах по исследованию экспрессии элементов группы gypsy на других изогенных отводках линии SS, для всех МГЭ, как в предыдущих оптытах на SS и MS, была вновь обнаружена их экспрессия (результаты не представлены). Исключением стал Tirant. Мы констатировали факт отсутствия транскриптов Tirant в двух отводках линии SS - 7К и 7К(1) (рис. 3).

p|m^|mé!m|1m¡;|mí;|m Рис. 3. Экспрессия на уровне

Я транскрипции МГЭ Tirant в изогенных линиях flamenco.

7К(1) 7к Ms ss 7Kw' сз Анализ проводили у взрослых самок, в качестве контроля амплифицировали фрагмент гена гр49. РНК для данного эксперимента была экстрагирована из целых мух.

Отсутствие транскрипции Tirant в линиях 7К и 7К(1) может свидетельствовать о том, что их геномы не содержат полноценных копий элемента. Также возникает вопрос о наличии в этих линиях регуляторных

0 1 « 1 £ $ 1 » í Í ? S j s s. t t N S 5 e fe g¡ .. S 5 S ■»■• ffis ® M .g 5 5. s. g. 3. Ci NI g й g S

SS ov.iry 500 п.н.

MS ) ovary jti ' i,i •» 500 п.н.

¿SS testis 500 п.н.

tJMS testis • 500 п.н.

(одного из трех).

механизмов, подавляющих транскрипцию Tirant. Гетерогенная экспрессия Tirant, обнаруженная нами, представляет интерес, поскольку это явление мы наблюдаем не у независимых по происхождению линий, а у изогенных отводок.

Анализ 5'-нетранслируемой области Tirant

5'-нетранслируемая область Tirant устроена особым образом. В ней имеются тандемные повторы длиной 102 п.н., число которых может варьировать у разных копий элемента от 2 до 6 [Fablet et al., 2006]. Предполагается, что повторы выполняют регуляторную функцию. С использованием праймеров, фланкирующих данные повторы, мы выполнили амплификацию на геномной ДНК изучаемых линий. В каждой линии было выявлено по 6 ПЦР продуктов, различающихся по длине примерно на 100 п.н. (рис. 4). Это значит, что каждая исследуемая отводка содержит все возможные полиморфные варианты Tirant, и неоднородная экспрессия Tirant в изогенных линиях не связана с полиморфизмом 5'-нетранслирумой области. С другой стороны, стоит отметить, что среди всех ПЦР продуктов лучше всего амплифицируется фрагмент, соответствующий копии с 5 повторами (рис. 4). Это, по-видимому, связано с преобладанием данной копии Tirant в геномах почти всех изогенных отводок. Для двух отводок - 7К(1) и 7К (нет экспрессии Tirant), обнаружились структурные различия, отличающие их от других отводок. В 7К(1) выявилось большое количество копий с 6 повторами, чего нет в геномах остальных отводок. В 7К отличительной чертой стало преобладание копий с 4 повторами.

Дифференциальная экспрессия и обнаруженные структурные различия свидетельствуют о том, что элемент транспозиционно активен в наших отводках. В связи с этим мы провели непосредственный анализ транспозиционной активности Tirant в наших линиях.

д ^ Рис. 4. Полиморфные варианты Tirant в

«f g ^ g í, ^ ^ геномах изогенных линий (ПЦР на

—> "" !■■■■■ геномной днк) Г Pi

***** , , , ¿L-250 п.и.-> " • — ' - - -

Исследование транспозиционной активности Tirant

Транспозиционная активность Tirant была исследована с помощью вычитающей гибридизации. В качестве трэйсера была использована ДНК линии MS (есть экспрессия Tirant), в качестве драйвера - геном отводки линии SS - 7К (экспрессии Tirant нет). Исходя из того, что линии изогенные, по различной локализации Tirant в геномах этих линий, мы делали вывод о произошедшей транспозиции. Мы обнаружили три инсерции МГЭ Tirant, которые есть в линии MS, но отсутствуют в линии 7К. Нам удалось установить положение двух инсерций. Одна из них произошла в интрон гена cactus, другая - в интрон гена aralarl. В итоге можно заключить, что в геномах исследуемых линий присутствуют активные копии МГЭ Tirant. Не исключено, что наблюдаемые транспозиции обусловлены нарушенным контролем.

1000 п.н.-

Скрещивание линий 7KwJ и 7К(1), анализ экспрессии Tirant у потомства

Учитывая современные представления о пластичности регуляторных механизмов МГЭ, не исключено, что в линии 7К(1) в отношении данного элемента они возникли уже после того, как отводка была выделена в самостоятельную линию. С целью подтвердить наличие регуляции в отношении элемента Tirant в 7К(1), мы осуществили её скрещивание с другой линией - 7K.w1 (рис. 5). Скрещивания осуществлялись в обоих направлениях Ç$7Kw' х <?<?7К(1) и $97К(1) х ^Kw1.

Рис. 5. Схема массовых скрещиваний линий 7Kw' и 7К(1): А - прямое, Б - обратное. Tirant + / Tirant '— наличие или отсутствие экспрессии Tirant.

А Р: ÇÇ7Kw1 [Tirant*) X ddvK1 (Tirant )

I

ÇÇ (Tirant*) dd (Tirant')

Б p: çÇ7K1(7ïraf?0 x ddTKw (Tirant')

I

ÇÇ (Tirant*) dd(Tirant')

-к1 -к«1fi a ris Рис. 6. Результаты анализа экспрессии Tirant у

=500 П.Н.—►Tirant 7Kw и 7K( 1 ) и у их гибридов F1 :

FIA - гибриды прямого скрещивания, F1B -=зоо ii.ii—> Гр49 обратного. Анализ производился на целых

9d'?d'$d'$d' мухах, отдельно у самцов и самок. В качестве контроля амплифицировалась кДНК гена гр49. Экспрессия Tirant у самцов исходной линии 7Kw' выявляется крайне слабо (дорожка 4), в связи с чем мы приняли данный результат за отсутствие экспрессии (т.е. Tirant' согласно обозначениям на рис. 5)

Далее у полученных гибридов проводили анализ транскрипции Tirant. Ожидалось, что если в линии 7К(1) функционируют механизмы неизвестной природы, ограничивающие уровень транскриптов Tirant, то и у гибридов мы увидим их проявление. Среди гибридов F1 от прямого скрещивания Ç$7Kw' х с?с?7К(1) только у самок обнаруживалась РНК Tirant (рис. 6). У гибридных самцов, как и самцов родительской линии 7К(1), экспрессии не было. Скорее всего, это связано с тканеспецифичной активностью Tirant в 7Kw'. Регуляторных механизмов, наличие которых мы предполагали в 7К(1), нет. Причиной отсутствия экспрессии Tirant в 7К(1), по всей видимости, является неравномерное распределение транскрипционно активных копий МГЭ при разделении отводок.

9 с? ?cf?cJÇd

Анализ экспрессии ретротранспозона gypsy в яичниках гибридов первого поколения, полученных от скрещивания линий SS и MS с линией piwi3

Мы предпожили, что мутантный фенотип flamenco в линиях SS и MS обусловлен снижением или отсутствием транскрипции данного локуса. Однако нами было показано, что вместо снижения, в линиях SS и MS наблюдался повышенный уровень транскрипции той области локуса flamenco, из которой впоследствии и образуются короткие piRNA [Lavrenov et al., 2014]. Столь неожиданные результаты позволили предположить, что причинами мутантного фенотипа могут быть не только нарушения в самом локусе flamenco, но и мутации в других генах системы РНК-интерференции, продукты которых участвуют в процессинге РНК-предшественника. Если процессинг нарушен, то следствием этого может быть накопление непроцессированного РНК-предшественника, в результате чего мы и регистрируем высокий уровень его экспрессии.

Рис. 7. Схема скрещиваний линий SS и MS с линией piwi3. Фенотипические классы: N — мухи с прямыми крыльями, Су - мухи с загнутыми крыльями.

N : су

Один из главных компонентов piPHK пути - белок Piwi. Мутации в гене piwi приводят к стерильности и вызывают повышенную частоту транспозиции МГЭ gypsy [Sarot et al., 2004]. Piwi - крайне полифункциональный белок, и среди множества его функций была отмечена способность к рибонуклеазной активности [Saito et al., 2006]. Возможно, что Piwi является непосредственным участником процессирования предшественника piPHK. Учитывая это, возникла необходимость протестировать линии SS и MS на функциональность гена, кодирующего белок Piwi. Главная задача - ответить на вопрос, являются ли наблюдаемые особенности процессинга РНК-предшественника в SS и MS следствием нарушения нормального функционирования данного белка. Мы провели функциональный тест на комплементацию. Его суть заключается в скрещивании линии, мутантной по гену piwi, с линиями SS и MS с последующим анализом экспрессии gypsy у потомства. Использовали линию piwi3, гетерозиготную по рецессивной мутации в гене piwi [Lin, Spradling, 1997]. Скрещивания осуществляли в обоих направлениях (прямое - Ç QMS х rjo'piwi3, обратное - 9$piwi3 х cJc?MS, прямое - Ç9SS х c^piwi3, обратное - ÇÇpiwi3 х <5c?SS). Схема скрещиваний представлена на рис. 7. Балансерная хромосома СуО линии piwi3 маркирована доминантной мутацией Су (загнутые крылья). В результате скрещивания появляются потомки двух фенотипических классов: с

? 3

~ л .. .. Piwi ♦ . ^ . - ^ ^ 1 piwi *

Р: ?Ç(do')MS/SS---Xod(99)piwi3-

piwi ♦ * Су

. I .

рМ ♦ plwl ♦ г 1 : -

piwi3 * * Су

загнутыми (Су) и нормальными (N) крыльями. Из них только особи N наследуют от линии piwi3 ту хромосому, в которой ген piwi в мутантном состоянии. Другую хромосому особи N наследуют от линии MS или SS; при этом аллельное состояние гена piwi в этой хромосоме нам неизвестно (знак вопроса на схеме). Далее у потомства F1 анализировали уровень транскриптов ретротранспозона gypsy в яичниках и семенниках.

Рис. 8. Уровень транскрипции gypsy в яичниках линий MS, piwi3 и их гибридов от прямого (Nnp.. Супр.) и обратного (No6P„ Су0бР.) скрещиваний. Аналогичные результаты получены для скрещивания линий SS и piwi3.

При положительном результате теста мы ожидали, что особи N продемонстрируют высокий уровень экспрессии gypsy, значительно превышающий экспрессию в тканях родительских линий. При отрицательном результате у особей N уровень экспрессии gypsy должен быть низким, либо таким же, как и у родительских линий. В результате анализа было обнаружено, что в яичниках гибридов фенотипического класса N, полученных как от прямого скрещивания 9$ MS х ¿Wpiwi3, так и от скрещивания обратного $$piwi3 х cJcjMS (рис. 8), наблюдается примерно 17-кратное снижение экспрессии по сравнению с яичниками линии MS и 12-кратное снижение относительно яичников другой родительской линии - piwi3. Та же самая картина наблюдалась и в другой паре скрещиваний - $SS х c?piwi3, $piwiJ х cJSS. Полученные данные позволяют сделать вывод, что результат теста отрицательный. Мутация в гене piwi, приводящая к нарушению его функции, в изогенных линиях MS и SS отсутствует. Гибриды другого фенотипического класса - Су, наследуют хромосому с нормальным аллелем piwi от линии piwi3, в связи с чем это потомство является не вполне информативным. Однако в случае отрицательного результата теста данный класс мух можно было использовать в качестве дополнительного контроля, ожидая сходный характер транскрипции gypsy у гибридов N и Су. Неожиданно было обнаружено, что уровень транскрипции gypsy у мух фенотипического класса Су оказался значительно выше, чем у особей N (Су > N). При этом он не превысил значений, по крайней мере, одной из родительских линий - piwi3, и, таким образом, обнаруженный факт не противоречит выводу об отсутствии мутации в гене piwi в SS и MS. Закономерность Су > N была выявлена во всех исследованных нами тканях -яичниках и семенниках. Четкая связь с фенотипом Су позволяет предположить,

12

что это может быть связано с балансерной хромосомой СуО (вторая хромосома). Известно, что вторая хромосома содержит два крупных кластера piRNA [Brennecke et al., 2007]. Теоретически инверсии балансерной хромосомы могут серьезно нарушать функционирование кластеров piRNA и других генов. Учитывая непростой характер повышенной экспрессии gypsy в потомстве Су, установить ее истинную причину пока не удалось.

Экспрессия gypsy в семенниках гибридов первого поколения Далее молекулярный анализ точно так же, как и в яичниках, был проделан в семенниках. Вновь учитывали экспрессию gypsy у родительских линий, вступающих в скрещивание, и у гибридов N и Су.

Рис. 9. Уровень транскрипции gypsy в семенниках линий MS, piwi3 и их гибридов от прямого (Nnp„ Супр.) и обратного (No6p.,Cyo6p.) скрещиваний. Аналогичные результаты получены для скрещивания линий SS и piwi3.

В семенниках No6p. количество РНК gypsy относительно родительских линий было снижено (рис. 9). Наблюдалась та же самая картина, что и в яичниках. В семенниках Nnp. уровень экспрессии gypsy оказался выше, чем в семенниках родительской линии piwi3, линиях SS, MS и гибридах No6p. (рис. 9). Различное проявление признака (экспрессия gypsy, Nnp. > No6p.) у гибридов прямого и обратного скрещиваний означает, что локус, контролирующий данный признак, сцеплен с Х-хромосомой. Действительно, только самцы F1 от прямого скрещивания наследуют свою единственную Х-хромосому, с которой ассоциирован мутантный фенотип flamenco, от линии SS или MS (рис. 10). Самцы F1, полученные от обратного скрещивания, наследуют Х-хромосому от линии piwi3 и повышенной экспрессии gypsy не демонстрируют.

Анализ экспрессии Idefix в семенниках гибридов первого поколения

После того как нами была обнаружена зависимость Nnp. > No6p. по отношению к элементу gypsy, возник следующий вопрос: распространяется ли обнаруженный эффект на другие мобильные элементы. Мы проанализировали экспрессию Idefix в семенниках гибридов, где в результате снова был обнаружен эффект Nnp. > No6p (данные не представлены). Это означает, что flamenco (или другой Х-сцепленный фактор), который нарушен в линиях MS и SS, принимает участие в контроле не только gypsy, но и элемента Idefix.

с. с

ш

"пр. N обр, с»пр. Су

обр. MS piwi

р- Î9MS/SS flamenco — piwi7 + X 6S piwi3 1 flamenco + piwi3 ♦ A

flamenco— piwi7 * -^ Cy

FI flamenco- piwi7 + 1 flamenco- piwi7 +

9S N Sí Cy

flamenco + flamenco- piwi3 * piwi7 * flamenco + flamenco-~ Cy piwi7 *

. .3 . piwi * У + Cy

S9 piwi3 „.meneo* . .3 . prwi + flamenco- L ? , piwi + Б

flamenco + + Cy 1 piwi7 +

F! SS N $¿ flamenco + piwi3 * 1 flamenco + ♦ Cy

flamenco- flamenco + . .? piwi * ■ -3 _ pnvi ♦ Cy flamenco- piwi7 * * Cy

. .? piwi + . 7 piwi ♦

Рис. 10. Схема скрещиваний линий SS и MS с линией piwi3 с учетом гена flamenco. А — прямое, Б - обратное скрещивание

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе проанализирована экспрессия одиннадцати элементов принадлежащих группе gypsy: rover, 17,6, 297, Idefix, Quasimodo, Transpac, Tirant, ZAM, gypsy, springer, opus. Показано, что большинство из них транскрипционно активны в MS и SS, значит, линии можно использовать для дальнейших исследований. Для Tirant продемонстрирован неоднородный характер экспрессии в изогенных отводках и способность перемещаться. Не исключено, что обнаруженная активность МГЭ связана с ослабленным контролем на фоне мутации в локусе flamenco.

Природа нестабильности в линиях MS и SS на сегодняшний день точно не установлена. Мутантный локус был картирован в области локализации flamenco. Именно на этом основании линии считаются мутантами по этому локусу. Мы предполагаем, что мутантный фенотип линий может быть обусловлен дефектами и в других генах. По результатам анализа гибридов от скрещиваний MS и SS с piwi3, был сделан вывод, что мутации в гене piwi, продукт которого принимает непосредственное участие в регуляции ретротранспозонов, в тестируемых линиях нет. Тем не менее, нарушенные механизмы контроля МГЭ в линиях MS и SS, связаны с системой РНК-интерференции и являются Piwi-зависимыми, чему до сих пор не было строгих доказательств. Вывод сделан на основании обнаруженного эффекта Nnp. >N06P в семенниках гибридов, где мы наблюдали комплементарное взаимодействие локуса flamenco (или другого Х-сцепленного гена) и piwi.

Из эффекта NIlp > No6p следует, что мутантный ген локализован на X-хромосоме. В случае если это не flamenco, то это может быть другой ген задействованный в функционировании piPHK системы. На основании представленных в литературе данных [Czech et al., 2013; Handler et al., 2013; Muerdter et al., 2013] мы составили список генов-кандидатов. Учитывали два критерия - локализация на Х-хромосоме и транскрипция в семенниках, поскольку эффект Nnp. >N06P проявляется именно в этих тканях. Полный список

приведен в тексте диссертации. Наибольший интерес вызывают те гены, продукты которых непосредственно задействованы в метаболизме РНК (растап, Integrator 2), или гены локализованые в одном районе с flamenco (напрмер, FBgn0052820). Данная стратегия позволяет значительно сузить список «подозреваемых» и может служить отправной точкой для дальнейших исследований.

Скрещивая MS и SS с линией piwi3 и анализируя экспрессию gypsy в семенниках гибридов, можно выявлять фенотип flamenco. Ранее это осуществлялось с помощью оуо°-теста, предполагающего анализ инсерций в «горячую точку» транспозиций gypsy - в ген ovoD [Prud'homme et al., 1995]. Однако он трудоемок, и его не всегда можно применять в полном объеме. Вот почему новый подход, базирующийся на анализе экспрессии gypsy в семенниках гибридов, может быть успешно применен для решения вопроса о том, какие же на самом деле механизмы контроля gypsy нарушены в линиях MS и SS.

В настоящее время РНК-интерференция и процессы, ею регулируемые, интенсивно изучаются. Идентифицируются новые гены, отвечающие за контроль МГЭ с помощью piPHK [Handler et al., 2013; Muerdter et al., 2013]. Расширяются представления о роли piRNA-пути в регуляции не только активности транспозонов, но и структуры хроматина, фундаментальных процессов, обеспечивающих целостность генома [Mani, Juliano, 2013; Ross et al., 2014]. По этой причине наши линии можно эффективно использовать для дальнейших исследований генетических механизмов контроля не только ретротранспозона gypsy и родственных ему МГЭ.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что большинство элементов группы gypsy {rover, 17,6, 297, Idefix, Quasimodo, Transpac, Tirant, gypsy, springer, opus) из одиннадцати изученных активно транскрибируются в линиях MS и SS, несущих мутацию в локусе flamenco, в отличие от линии дикого типа. Очевидно, транскрипция этих элементов контролируется локусом flamenco.

2. Показано, что ретроэлемент Tirant, присутствующий в геномах линий MS и SS, характеризуется транспозиционной активностью, что обусловлено его активной экспрессией на уровне транскрипции. Транспозиционная активность элемента Tirant свидетельствует о том, что в геноме исследованных линий содержатся функционально активные (полноценные) копии элемента.

3. Обнаружено, что в изогенных отводках мутантной по flamenco линии SS, изолированных друг от друга на протяжении длительного времени, уровень транскрипции элемента Tirant не одинаков. Показано, что такая гетерогенность экспрессии Tirant обусловлена его транспозиционной активностью, по-видимому, приводящей к неравномерному распределению копий элемента по отводкам исследованной линии.

4. Анализ 5'-нетранслируемой регуляторной области ретроэлемента Tirant показал, что его структура гетерогенна в разных изолированных отводках

линий, мутантных по flamenco. Описаны отличия в количестве повторяющихся последовательностей ДНК. Это, по-видимому, обуславливает различия в транскрипционной и транспозиционной активности Tirant.

5. По результатам функционального теста на аллелизм мутаций в гене piwi и локусе flamenco в исследованных линиях, учитывающего транскрипционную активность ретротранспозонов gypsy и Idefïx, установлено, что мутации piwi и flamenco комплементируют друг с другом. Это свидетельствует о том, что исследованные линии MS и SS не содержат мутаций в гене piwi.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК:

1. Урусов Ф.А., Нефедова Л.Н., Ким А.И. Анализ ткане- и стадиеспецифичности транскрипции ретротранспозонов группы gypsy у Drosophila melanogaster // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011. 15(2). 283-288.

2. Нефедова JI.H., Урусов Ф.А., Романова Н.И., Шмелькова А.О., Ким А.И. Исследование транскрипционной и транспозиционной активности ретротранспозона Tirant в линиях Drosophila melanogaster SS, мутантных по гену flamenco II Генетика. 2012. Т. 48. № 11. С. 1271-1279.

3. Урусов Ф.А., Нефедова Л.Н., Лавренов А.Р., Романова Н.И., Ким А.И. Генетический и молекулярный анализ комплементации локусов flamenco и piwi у Drosophila melanogaster // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. Т. 17. №3. С. 381-89.

Материалы и тезисы конференций:

1. Урусов Ф.А. Анализ экспрессии мобильных элементов группы gypsy у Drosophila melanogaster // Материалы международного молодежного научного форума «Ломоносов - 2010», секция «биология». С. 93-94.

2. Урусов Ф.А., Букреева Д.С., Лавренов А.Р., Нефедова Л.Н., Ким А.И. Исследование экспрессии на уровне транскрипции ретротранспозонов группы gypsy в линии Drosophila melanogaster SS мутантной по гену flamenco II Спорт: медицина, генетика, физиология, биохимия, педагогика, психология. Материалы I международной школы-конференции молодых учёных. С. 148154. Уфа. 2011.

3. Урусов Ф.А., Шмелькова А.О. Исследование экспрессии и транспозиции ретроэлемента Tirant в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по гену flamenco // XIX международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2012», секция «биология», подсекция «генетика», тезисы докладов. С. 82-83.

Заказ № 20-Р/04/2015 Подписано в печать 06.04.15 Тираж 50 экз. Усл. п.л. 0,8

ООО "Цифровичок", Москва, Большой Чудов пер., д.5 тел. (495)649-83-30 I, )) www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru