Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ структуры и экспрессии района локализации гена flamenco y Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Анализ структуры и экспрессии района локализации гена flamenco y Drosophila melanogaster"

п-2 ;

1052 -

j ; , ,• На правах рукописи

M//ct

ПОТАПОВА МАРИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ЭКСПРЕССИИ РАЙОНА ЛОКАЛИЗАЦИИ ГЕНА flamenco У Drosophila melanogaster

03.03.05 - биология развития, эмбриология 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1

Работа выполнена на кафедре генетики биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор КИМ Александр Иннокентьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор КУЗИН Борис Александрович, Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН

доктор биологических наук

МЕЛЕХОВА Ольга Петровна, МГУ имени

М.В.Ломоносова

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им.В.А.Энгельгардта РАН. Защита диссертации состоится а/9»¿ь^или^ 2011 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, Ауд. М-1.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ и на сайте Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «/д » 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук /Е.Н.Калистратова/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Drosophia melanogaster -модельный объект для исследования как генетики развития, так и структурной и функциональной организации эукариотического генома, в том числе, его мобильного компонента. Мобильные генетические элементы играют важную роль в эмбриональном развитии, их функциональная активность может приводить к гибели особей на ранних стадиях или вести к многочисленным патологиям на поздних стадиях эмбриогенеза. В последние годы особое внимание уделяется изучению мобильного генетического элемента (МГЭ) gypsy (МДГ4). Элемент gypsy относится к ретротранспозонам, перемещающимся с помощью РНК-интермедиата, и имеет три открытые рамки считывания (ОРС), гомологичные ОРС ретровирусов позвоночных. Наличие функциональной третьей ОРС, кодирующей белок оболочки вирусных частиц, способности к инфицированию клеток in vivo и горизонтальному переносу позволило отнести gypsy к настоящим ретровирусам беспозвоночных (Kim et al., 1994), a D. melanogaster использовать в качестве модели для их исследования. Актуальность изучения ретровирусов дрозофилы, и, следовательно, ретротранспозонов обусловлена тем, что к классу ретровирусов относится и вирус иммунодефицита человека. Его структура принципиально не отличается от структуры ретровирусов насекомых. Не исключено, что похожи и механизмы передачи, контроля развития инфекции и защиты организма от нее.

Спонтанные транспозиции МГЭ чрезвычайно редки, но в некоторых случаях перемещения происходят с повышенной частотой, что может стать причиной генных мутаций и приводить к хромосомным перестройкам. Особенно опасна активность МГЭ в клетках полового пути, поскольку вызываемые ими мутации будут аккумулироваться в следующих поколениях (Brennecke et al., 2007). Частота транспозиций МГЭ gypsy у D. melanogaster повышена в нестабильной мутаторной линии (mutator strain - MS), которая ведет свое происхождение из стабильной лабораторной линии (stable strain - SS) и характеризуется увеличенной частотой спонтанного мутирования (Ким и др., 1989). Оказалось, что в ней содержится мутация в локусе flamenco, который регулирует транспозиции (Prud'homme et al., 1995). С помощью молекулярной конструкции на основе Р-элемента и гена yellow (P[yellow]) был получен инсерционный мутант D. melanogaster flamenco (Robert et al., 2001), который

характеризуется повышенной частотой транспозиции МГЭ. В области инсерции, локализованной в районе 20АЗ-А5 Х-хромосомы, находится кластер из 8 ОРС с неизвестными функциями, которые транскрибируются в одном направлении. На расстоянии 1,5 т.п.н. от инсерции расположен ген DIP1, за ним следуют две ОРС (CG32500 и CG32819), последовательно повторенных три раза, а завершает кластер ОРС CG 14476. Примечательно, что в кластер входит ген D/PI, принимающий участие в начальных стадиях эмбриогенеза у дрозофилы. Продукт гена D1P1 взаимодействует с белком Ubx, который относится к Нох-белкам, и принимает участие в генетическом контроле сегментации и развитии нервной системы (Bondos et al., 2004). Известно, что форма гена DIPl-c может связывать предшественник miPHK (m¡R-iab-4-5p), который вовлечен в регуляцию экспрессии гена Ubx, контролирующего сегментацию у D.melanogaster (Catanese, Matthews, 2010). Кроме того, одним из его белков-партнеров выступает белок Disco, который участвует в контроле развития нервной системы D.melanogaster (DeSousa et al., 2003). Также продукт гена Dl PI взаимодействует с белком Su(var)3-9 (Delattre et al., 2000), принимающим участие в регуляции транскрипции генов через модификацию структуры гетерохроматина. Перечисленные свойства свидетельствуют о том, что DIP1 является многофункциональным регуляторным белком, который принимает участие в формировании сложных белковых комплексов, контролирующих транскрипцию жизненно важных генов D. melanogaster. Не исключено, что в его функцию может входить регуляция транспозиции ретротранспозонов.

С другой стороны от точки инсерции находится область размером около 200 т.п.н., богатая дефектными копиями МГЭ, преимущественно транскрибируемых в одном направлении. Поскольку антисмысловая цепь гена DIP1 кодирует множество piPHK (Brennecke el al., 2007), которые регулируют процессы транспозиции МГЭ, можно предполагать, что продуктом локуса flamenco может быть молекула РНК-предшественника, из которой в результате образуются piPHK.

В локус flamenco могли бы входить любая из 8 обнаруженных в этом районе ОРС или все вместе. Отсюда возникает необходимость исследования структурной организации этого района Х-хромосомы и анализа его экспрессии в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - исследование структуры и экспрессии локуса flamenco, осуществляющего контроль транспозиции ретротранспозона-ретровируса gypsy у Drosophila melanogaster.

В работе представлены следующие задачи:

1. Исследовать структурную организацию генов, входящих в район локуса flamenco в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

2. Исследовать структуру и экспрессию гена DIPI, в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

3. Провести анализ структуры и экспрессии гена DIPI у видов Drosophila, родственных D. melanogaster.

4. Провести сравнительный анализ экспрессии генов, входящих в район локуса flamenco, на уровне транскрипции на разных стадиях развития в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

5. Провести сравнительный анализ экспрессии на уровне транскрипции прицентромерного района X хромосомы в области локализации локуса flamenco в линиях, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые проведено комплексное исследование структуры и экспрессии района локализации локуса flamenco. Исследована структура и экспрессия кластера генов DIPI, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в район локализации локуса flamenco. Показано, что экспрессия генов CG32500, CG32819 и CG14476 не различается в линиях с генотипами flamenco и flamencoв отличие от гена DIP1.

Впервые установлена специфичность транскрипции изучаемых генов на разных стадиях индивидуального развития D. melanogaster: эмбриональной, личинок третьего возраста и имаго.

Различия в структуре и экспрессии установлены только для гена DIPI, расположенного ближе всего к точке инсерции P[yellow], в линиях мутантных и нормальных по локусу flamenco.

Показано, что в области локуса flamenco образуется РНК, считывающаяся с промотора дефектного МГЭ HB, который расположен во втором интроне гена DIP1. Вероятно, эта РНК может служить предшественником образования коротких РНК, принимающих участие в процессах РНК-интерференции.

Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для исследования механизмов контроля транспозиции и сопряженности процессов транспозиций МГЭ и индивидуального развития, и для изучения формирования мутаитного генотипа flamenco у D. melanogaster, который характеризуется повышенной частотой транспозиции МГЭ, в частности.

Личное участие автора. Вся работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи решены с применением современных биоинформатических и молекулярно-генетических методов. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию ИОГен им. Н. И. Вавилова РАН (Москва, 2006), Международной научной конференции «Current Evolutionary thinking in Biology, Medicine and Sociology», посвященная 90-летию со дня рождения академика Д. К. Беляева. (Новосибирск, 2007), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007, 2008, 2009), на 1-й Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Харьков, 2008), на IV съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), на Всероссийской конференции посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы (Уфа, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 9.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 103 страницах, содержит 26 рисунков, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 134 цитируемых источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Лабораторные линии D. melanogaster: мутантные по локусу flamenco - SS, MS (Любомирская и др., 1994), Oregon R (+Y+3), P[yellow] (Robert et al., 2001), и нормальная по локусу flamenco - c(l)Dx, у f/y v f mal su(f)/Y. Виды Drosophila из коллекции кафедры генетики МГУ: Drosophila sechellia, Drosophila mauritiana, Drosophila simalans, Drosophila erecta, Drosophila yakiiba.

Штаммы Escherichia coli C600, JM109.

Условия культивирования лабораторных линий, получение личинок третьего возраста и эмбрионов 0-24 ч. Линии мух поддерживались при стандартных условиях: при температуре 25°С на питательной агаризованной среде.

Самцов и самок исследуемых линий flamenco+, SS, MS, Oregon R (+Ye) помещали на чашки Петри при температуре 25°С на ночь. Эмбрионы собирали и помещали в пробирки объемом 1,5 мл для последующего выделения РНК.

Для получения личинок третьего возраста самцов и самок по 10 штук помещали в пробирки. Через 3 сут отбирали личинок в пробирки объемом 1,5 мл для последующего выделения РНК. В линии flamenco + отбирали только самцов.

Сбор семенников и яичников проводили у взрослых половозрелых особей (около 100 штук самцов или самок).

Клетки Е. coli культивировали на агаризованной или в жидкой среде LB (Luria-Bertani) с карбенициллином (50 мкг/мл).

Приготовление компетентных клеток и трансформация Е. coli. осуществлялись с помощью стандартных методик (Maniatis et al., 2001).

Выделение хромосомной ДНК и плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора для выделения хромосомной ДНК «Fermentas» по протоколу фирмы.

Обработка ДНК ферментами проводилась рестрикционными эндонуклезами по протоколам фирмы производителя «Fermentas». Лигирование с вектором для клонирования - согласно протоколу «Promega».

Тотальную РНК из эмбрионов, личинок, имаго, яичников и семенников выделяли с помощью набора «Promega» согласно протоколу. Перед постановкой обратной транскрипции пробы (по 3 мкг тотальной РНК)

обрабатывали ДНКазой I («Fermentas») для разрушения ДНК.

Обратная транскрипция (ОТ) проводилась с помощью набора для синтеза кДНК «Fermentas». В качестве матрицы использовали тотальную РНК, выделенную из яичников (семенников) изучаемых линий.

Полимеразная цепная реакции. Приготовление смеси для реакции выполняли по протоколу фирмы «Fermentas». Реакцию проводили в амплификаторе Amply4 («Biokom»). В качестве матрицы использовали хромосомную ДНК и кДНК, выделенную из: D. sechellia, D. mauritiana, D. simulans, D. erecta, D. yakuba, D. melanogasier (линии flamencoSS, MS и Oregon R (+Y+3)). Проводили амплификацию фрагментов ДНК и кДНК генов DIPI, CG32500, CG32819, CG14476, кДНК района локализации локуса flamenco. В качестве контроля амплифицировали фрагменты гена гр49.

ПЦР в реальном времени. Приготовления смеси с использованием набора реагентов фирмы «Fermentas» («Master Mix (SYBR)») проводили по протоколу фирмы производителя. Реакция проводилась в амплификаторе MiniOpticon Real-Time PCR System производства Bio-Rad Laboratories. Одновременно ставили отрицательные контроли для каждого образца: пробы, обработанные ДНКазой I и не прошедшие ОТ.

Секвенирование. Клонированные фрагменты ДНК были секвенированы в Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН и в фирме «Евроген».

Биоинформатические методы. Использованные программы: GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi7dbHsiucleotide) и база данных последовательностей генома D. melanogasier FlyBase

(http://flybase.bio.indiana.edu/) для поиска нуклеотидных последовательностей; BLAST (http://flybase.org/blast/) для поиска гомологии генов; Vector NTI для работы с известными нуклеотидными последовательностями; ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/) для множественного выравнивания последовательностей; SoftBerry (linuxl.softberry.com) для выявления экзон-интронного строения; Neural Network Promoter Prediction (http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl) для поиска промоторной области; для обработки данных ПЦР в режиме реального времени использовали программное обеспечение фирмы «Bio-Rad» - CFX Manager.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование структуры гена DIP1 у D. melanogaster

По данным FlyBase в исследуемой области 20А1-5 размером более 300 т.п.н. обнаружено только 8 ОРС, организованных в кластер: ген DIP1, точка начала трансляции которого находится на расстоянии 1,5 т.п.н. от инсерции P[yellow], две ОРС (CG32500 и CG32819), последовательно повторенных три раза (Robert et al., 2001), и завершает кластер ОРС CG14476 (Рис. 1). Функции гена DIP1 и остальных 7 генов кластера неизвестны.

Нами было сделано предположение, что инсерция в линии P[yellow] может влиять на транскрипцию гена DIP1 или другого гена кластера. Если изменение экспрессии гена DIP1 приводит к генотипу flamenco, то в линиях SS и MS функция гена DIP1 также должна быть нарушена вследствие изменений его структуры и/или экспрессии.

Проведенный рестрикционный анализ показал, что амплифицированный с праймерами DIPd4 и DIPr2 фрагмент в линиях SS и MS, в отличие от линий flamencoh и P[yellow], не содержит сайта рестрикции Dral в положении 1765 (Рис. 1). Эта мутация определяется мононуклеотидной заменой сайта узнавания ТТТААА на TTTAAG и является трансляционно незначащей.

21480k 21490k 21500k 21510k

Рис. 1. Схема области 20А5 локализации локуса/Хатепсо по данным Р1уВазе. Показано направление транскрипции 8 ОРС и дефектных МГЭ. Треугольником показана инсерция Р[уе11о\у]. Обозначены: сайты рестрикции Вга\ и их координаты; сайты локализации праймеров; АТв - предполагаемые сайты инициации трансляции, черным прямоугольником показан альтернативный экзон, стрелкой показано направление и локализация последовательности НВ.

Кроме того, ген DIP! в линиях MS, SS Oregon R (+Y+3), в отличие от линий flamenco" и P[yellow], содержит вставку, заключенную между двумя другими сайтами Dral (2297 и 2888) и обозначенную нами IdSS, размером 182 п.н. во втором интроне (Рис. 1). Выявленная вставка была утрачена в линиях P[yelIow] и flamencoСогласно Genbank комплементарная цепь последовательности второго интрона гена DJP1 содержит дефектную копию МГЭ НВ размером -1300 п.н. Выделенная вставка позволяет продлить область гомологии ОРС НВ с генами Тс 1 -подобных транспозаз на величину последовательности IdSS.

Более того, нами обнаружены структурные отличия линии Oregon R (+Y+3) от линий MS, SS и flamenco*-, вставка размером 173 п.н. в промоторной области гена DIPI, которая может влиять на уровень экспрессии гена DIPI, либо соседнего района. Биоинформатический анализ вставки 173 п.н. выявил наличие в ней дополнительной промоторной последовательности.

Эта вставка не обнаружена в промоторной области гена DIP1 у других линий D. melanogasíer, но она присутствует в гомологичных областях у более молодых видов D. sechellia и D. simulans. Следовательно, в линиях D. melanogasíer {flamencoMS, SS) произошла делеция этой последовательности.

Анализ экспрессии гена DIPI у D. melanogasíer

Ген DIPI состоит из четырех экзонов, первый из которых может быть альтернативным (по сведениям из базы данных Flybase). DIPI кодирует несколько продуктов, образующихся в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК (DeSausa et ai, 2003). В базе данных FIyBase приведены два названия одного и того же гена: DIPI и Klett. Известны три варианта CDS (coding sequence), включающих сайт инициации трансляции ATG1: DIPl-c, она же Klett-c (AF175711), DIPl-b, она же Klett-d (AF182154) и DIPl-d (AY217028), и два варианта CDS с альтернативным первым экзоном (с ATG2): Klett-a (AJ2500866) и Klett-b (AJ2500867). С ATG3, локализованного во втором экзоне, образуется форма DIPl-a (AF175713) (Рис. 1).

Анализ продуктов альтернативного сплайсинга гена DIPI, включающих сайт ATG1/ATG2, методом ОТ-ПЦР с парами праймеров DIP d4-DIP r2, DIP d2-DIP r2 (Рис. 1) подтвердил наличие следующих форм: DIPl-c (1109 п.н.), DIPl-b (1063 п.н.), DIPl-d (713 п.н.), Klett-a (1113 п.н.) и Klett-b (1068 п.н.) (Рис. 2).

Нами исследована экспрессия гена DIPI на 3-х стадиях индивидуального

развития: у эмбрионов, личинок третьего возраста и имаго D. melanogaster. Во всех линиях на стадии имаго и у эмбрионов выявляются формы DIP-c, Dip-b и Dip-d, Klett-a и Klett-b (Рис. 2), уровень экспрессии форм DIP-c и Klett-a повышен. В линиях flamencoSS, MS на стадии личинок транскрипции гена не выявлено. Однако в линии Oregon R (+Y+3) уровень транскрипции гена DIP1 увеличен, что, по-видимому, связано с наличием дополнительного промотора в области начала гена DIP1.

Эмбрионы Личннкп Имаго

flam*SS MS OreR L ßam+SS MS OreR L Лат* SS MS OreR L

Рис. 2. Экспрессия гена DIP1 на разных стадиях развития мух линий flamenco* (1), SS (2), MS (3), Oregon R Í+Y*'3) (4). Использованы пары праймеров: A. DIP d4-DIP г2 для оценки кДНК с ATG1; Б. DIP d2-DIP г2 для оценки кДНК с ATG2. В. Контрольная амплификация кДНК гена гр49. Стрелками показаны ПЦР-фрагменты. Маркер размера фрагментов ДНК (п.н.) (дорожка L) - GeneRuler DNA Ladder Mix («Fermentas»),

Обнаруженные нами многочисленные траскрипты свидетельствуют о многофункциональности гена. Но исследование его функции с помощью инактивации невозможно в связи с тем, что ген является жизненно важным (De Felice et ai, 2004). Поэтому нами решено было провести сравнительный анализ структуры и экспрессии гена DIP1 у других видов Drosophila, близкородственных D. melanogaster.

Структурная организация и анализ экспрессии гомологов гена DIP1 в геномах D. sec/iellia, D. mauritiana, D. simulans, D. erecta и D. yakuba

В настоящее время в базе данных FlyBase представлены секвенированные последовательности геномов двенадцати различных видов рода Drosophila.

Наиболее близкими по структуре к гену DIP1 D. melanogaster являются гомологи, обнаруженные у представителей подгруппы melanogaster: D. sechellia, D. mauritiana, D. simulans, D. erecta и D. yakuba (Рис. ЗА).

ПЦР-анализ хромосомной ДНК видов подгруппы melanogaster на наличие копий НВ показал, что копии этого МГЭ присутствуют в геномах всех видов подгруппы, но ни в одной из нуклеотидных последовательностей гомологов гена D1P1 копий IIB нет. Геном D. mauritiana в настоящее время не секвенирован, в отличие от геномов D. sechellia, D. simulans, D. erecta и D. yakuba, поэтому амплифицированные фрагменты были нами клонированы и секвенированы.

А г— melanogaster — __simulans

| г— sechellia 1 mauritiana i— yakuba — erecta

niel sec sini mau vak ere L

Piic. 3 А. Эволюционное древо представителен подгруппы melanogaster, стрелкой показано внедрение HB в геном D. melanogaster. Б-Е. Амплифицированные фрагменты ДНК и кДНК гена DIP1 и его гомологов видов D. melanogaster (niel), D. sechellia (sec), D. simulans (sim), D. mauritiana (niau), D. yakuba (yak), D. erecta (ere). Использованы пары пранмеров: Б. ДНК, амплифицированная с праймерами DIPdl-DIPrl, +НВ и -HB обозначено наличие/отсутствие HB внутри гена DIP1 и его гомологов; В. кДНК, амплифицированная с праймерами DIPdl-DIPrl. Г. ДНК, амплифицированная с праймерами DIPd2-DIPrl; Д. кДНК, амплифицированная с праймерами DlPd2-DlPrl; Е. Контрольная амплификация кДНК гена гр-19. Маркер молекулярного веса размера фрагментов (в п.н.) ДНК (дорожка L)

L

niel sec sim mau vak ere

г

Анализ секвенированных последовательностей показал, что гомолог DIPI у D. mauritiana, также как и гомологи гена у D. sechellia, D. simiilans, D. erecta и D. yakuba, действительно не содержит НВ. Этот мобильный элемент ранее перемещался по геному и попал в ген DIPI после отделения D. melanogaster от общего эволюционного древа подгруппы melanogaster (Рис. ЗА).

В области, соответствующей альтернативному первому экзону, у D. sechellia, D. simiilans и D. mauritiana обнаружены делеции, которые приводят к изменению экспрессии гомологов гена DIPI. У D. erecta и D. yakuba организация района совпадает с таковой у D. melanogaster.

Анализ экспрессии форм, образующихся с альтернативного первого экзона, однозначно свидетельствует об экспрессии форм Klett-a/KIett-b у D. erecta (Рис. ЗБ-Е). У D. sechellia, D. simiilans и D. mauritiana экспрессии с альтернативного первого экзона не обнаружено.

Таким образом, альтернативные формы транскриптов гена DIPI (Klett-a/Klett-b) отсутствуют у более молодых, чем D. melanogaster, видов дрозофилы, и есть у более древних. По-видимому, альтернативные формы, не являясь основными у D. melanogaster, не поддерживались в процессе эволюции отбором, что привело к их утрате более молодыми видами. Отличия, связанные с изменением экспрессии гена DIPI, могут стать причиной формирования генотипа flamenco и быть следствием инсерции в область локализации локуса flamenco. Инсерция в свою очередь может влиять на экспрессию и соседних с DIP1 генов.

Анализ экспрессии кластера генов CG32500, CG32819 и CG14476 у D. melanogaster

По данным FlyBase ОРС CG32500, CG32819 и CGN476 содержат в кодируемой ими последовательности высоко консервативные домены. Размеры амплифицированных фрагментов хромосомной ДНК с парами праймеров совпадали с теоретически ожидаемым.

Мы установили, что экспрессия гена CG32500 на уровне транскрипции происходит на всех стадиях развития D. melanogaster. В результате ПЦР-амплификации получен продукт размером -800 п.н. (Рис. 4А), что соответствует продукту сплайсинга пре-мРНК согласно базе данных (FlyBase). Мы не обнаружили различий в экспрессии гена CG32500 в линиях flamenco и flamenco

Анализ данных по экспрессии гена СС32819 (рис. 4Б), свидетельствует о том, что он транскрибируется только у эмбрионов, а размеры синтезируемой РНК соответствуют данным Р1уВазе (1803 п.н. и 1560 п.н.). Форма 1560 п.н. образуется в результате альтернативного сплайсинга (Рис. 4Б). На стадии личинок и имаго продуктов амплификации не выявлено. Таким образом, мы установили, что функция гена СС32819 важна только на ранних этапах развития дрозофилы во всех линиях. Различий в транскрипции между линиями /1атепсо и f1атепсо+ не выявлено.

Эмбрионы Личинки Имаго

flam* SS MS OreR L flam* SS MS OreR L flam* SS MS OreR L

r.

Ф49Ц j..i»■!......щи шВЯВЕВШ ISSBE^B300

Piic. 4. Амплнфицированные фрагменты на стадиях развития: эмбриональной, личинки 3 возраста, имаго. Линии flamenco ' (flam+), SS, MS, Oregon R (+Y+3) (OreR). Использованы пары праймеров: А. фрагменты гена CG32500\ Б. фрагменты гена CG32819\ В. фрагменты гена CG14476. Стрелками показаны ПЦР-фрагменты (в п.н.). Г. фрагменты гена гр49. Маркер молекулярного веса размера фрагментов (в п.н.) ДНК (дорожка L)

Выявить различия в экспрессии гена CG14476 в линиях с генотипами flamenco+ и flamenco также не удалось (Рис. 4В). Продукт ОТ-ПЦР обнаружен на стадии имаго и у эмбрионов, у личинок экспрессия этого гена детектируется слабо (Рис. 4В). Размер полученного фрагмента (-2800 т.п.н.) соответствует размеру, представленному в базе данных.

Полученные нами данные по экспрессии генов кластера у D. melanogasíer,

свидетельствуют о том, что гены СС32500, СС32819 и СС14476 не участвуют в формировании генотипа /1атепсо.

Эволюционный анализ кластера генов й!Р1, СС32500, СС32819 и СС14476 у разных видов ОгоъорНИа

Подобная структурная организация 8 ОРС - трипликация генов СС32500, СС32819 и однонаправленность их транскрипции - может быть следствием геномных перестроек, в которых могли принимать участия МГЭ. Транспозиции, приведшие к образованию кластера О. те\сто%а81ег, можно проследить при сравнительном анализе генов, гомологичных генам 01Р1, СС32500, СО32819 и СС14476, у разных видов йгоБоркИа.

О^птькат

П1Р1 Саз2500

О. уШИБ

СС32500 1)114

саз 2 а 19 са N476

В.рьеиАооЬъсига саш7б

--ШР1 СС32500

О.ашак^ае

€032819 СО14476

СОЗ2819 С032500 ШР1 СО14476

В. уакиЬа

О. текто§(Шег

СО14476 СОЗ 2819 СОЗ2500 1)114

СО ¡4476

О.ьчпш/апя

П1Р1

П1Р1 СОЗ 2819 €032500 П1Р1

Р.весЬеШа

1111'1 саз 2819 саз2500 П1Р1 1Ш>1 1)114

СО14476 СО14476 С032819

Рис. 5. Эволюция кластера генов района локуса/1атепсо. Показаны гомологи генов О/Р/, СС32500, СО 32819 и СС14476. Вертикальными стрелками - возможные этапы сборки генов в кластер. В круг обведены гены, которые повторены 3 раза у О. те1апо%а$1ег.

Исследования проводились с помощью биоинформатического анализа секвенированных геномов видов дрозофилы, находящихся в разной степени филогенетического родства. Последовательности геномов разных видов Вго$орЫ\а секвенированы в конце 2007 года и размещены в базе данных

FlyBase, но они еще не аннотированы.

Гомологи исследуемых генов кластера обнаружены в геномах всех исследованных видов.

На основании проведенного биоинформатического анализа построена схема эволюции кластера генов района flamenco (Рис. 5).

Таким образом, гомологи генов кластера района локуса flamenco присутствуют в геномах всех анализируемых видов, но ни в одном из них структурная организация района не повторяет строение кластера у D. melanogaster.

Ген DIPJ консервативен у всех видов, причем у D. sechellia и D. simulans он существует в нескольких структурных вариантах. Таким образом, функция гена DIPI является консервативной в разных видах дрозофилы.

Поиск РНК-предшественника piPHK в области локализации локуса flamenco

В области локуса flamenco обнаружено значительное количество piPHK, участвующих в подавлении транспозиций МГЭ (Brennecke et al., 2007). Была выдвинута гипотеза, что в этой области транскрибируется длинная молекула-предшественник с антисмысловой цепи гена DIP!, дающая начало piPHK (Brennecke et al., 2007). Область локализации ближайшей к гену DIP1 piPHK картирована на расстоянии -2500 п.н. от начала гена (Рис. 6).

Если предположить, что в линиях с генотипом flamenco+ образуется единый однонитевой РНК-предшественник piPHK, который в результате процессинга дает начало множеству piPHK, то, очевидно, в линиях с генотипом flamenco механизм образования коротких молекул РНК нарушен.

Причин нарушения может быть как минимум две: цельный транскрипт или не образуется в результате нарушения инициации транскрипции, или образуется, но не подвергается дальнейшему процессингу. Поиск единого РНК-предшественника piPHK был проведен методом ОТ-ПЦР с подобранными специфическими праймерами на РНК, выделенной из яичников линий flamenco , MS, SS, Oregon R (+Y+3). Область исследования, праймеры и размер продуктов указаны на Рис. 6.

Анализ ПЦР-продуктов на матрице кДНК подтвердил гипотезу о существовании в исследуемой области продуктов транскрипции. Продукты обнаруживаются как в районе между началом гена DIP1 и первой piPHK, так и

внутри гена DIPL Уровень экспрессии в линиях с генотипом flamenco снижен по сравнению с уровнем в линии flamenco' (данные не приведены).

Таким образом, общий уровень экспрессии области с генотипом flamenco в линиях SS и Oregon R (+Y+3) ниже, чем в линиях с генотипом flamenco , что может быть связано со структурными особенностями линий: наличие вставки во втором интроне гена DIP! в линиях SS и Oregon R (+Y+3) и увеличение области начала гена DIPI в линии Oregon R (+Y+3) на 173 п.н.

Мы предположили, что молекула РНК-предшественника piPHK может транскрибироваться с промотора МГЭ HB, локализованного в составе гена DIPL Этому способствует направление транскрипции МГЭ HB противоположное транскрипции гена DIPI (Рис. 6). Биоинформатическим методом определена область предполагаемого промотора в элементе LIB (Рис. 7Б), кроме промотора на комплементарной цепи гена DIPI выявлены и другие промоторы (Рис. 7Б).

1102 п.н.

_А_

Й ¥

область гена flamenco 707 п.н. 806 п.н.

943 п.н. ¡

* ¥ ¥ ¥

К

1 т

4 ¥ V I5 Iе i

1 1 1

IIB 1297 п.н.

скопление дефектны; МГ'Э

РНК-предшестоеиник

Рис. 6. Схема расположения пранмеров в области локуса flamenco. Фигурными скобками показаны амплифицированные фрагментов кДНК, указаны их размеры. Обозначен ИВ внутри второго интрона гена DIP1 и его предполагаемый промотор (Потапова и др., 2009). Обозначена предполагаемая молекула-предшественник. Треугольником обозначена инсерция (-1,5 т.п.н. от начала гена DIPI), приводящая к генотипу flamenco. Пунктиром показано положение центромеры относительно района локуса flamenco. Вертикальными пронумерованными линиями обозначены точки для анализа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Для установления предполагаемой области начала транскрипции были подобраны несколько праймеров до и после предполагаемой точки начала транскрипции (Рис. 7А). В качестве матрицы для постановки ОТ со специфическим праймером RT1 fori использовали РНК линий flamenco \ MS и Oregon R (+Y+3), выделенную из яичников.

„„.. ' У _. _„ первая »iPHKl

Dl 14 , , гдааяртад! hw»S>g| ИЗ ' 1 -L-

RT1 revllj RT1 fori (i káóii l 2 пнтрон

RT1 rev3 ^ ^RTl rcv2

Б

; (O.W),

Рис. 7. Поиск области предполагаемого промотора в последовательности HB. А. Схема локализации праймеров в гене DIPL Отмечена предполагаемая область промотора, показан размер HB элемента. Штрих-линией обозначены продолжения гена DIPL Б. Диаграмма с обнаруженными биоинформатически промоторами. По оси Y отложена вероятность нахождения промотора, по оси X протяжённость DIPI и прилегающей области в п.н. В круг обведена наиболее вероятная промоторная последовательность (вес (score) > 0.8), в скобках указаны некоторые значения веса.

Среди продуктов амплификации выявлены фрагменты нужной длины (соответствуют длине фрагментов, представленных в базе данных) с парами праймеров RT1 forl-RTl revi и RT1 forl-RTl rev2 (Рис. 7А). ПЦР-продукт с парой праймеров RT1 forl-RTl rev3 обнаружен не был, что свидетельствует об отсутствии РНК-матрицы в конце второго интрона гена DIP1, левее предполагаемого промотора.

В то же время при наличии амплифицированного фрагмента с праймерами RT1 forl-RTl rev2 можно утверждать о сдвиге области предполагаемого промотора. Тем более биоинформатический анализ показал возможность такого сдвига в район З'-конца гена DIP1 (Рис. 7Б).

Таким образом, мы обнаружили, что молекула РНК-предшественника образуется как в линии flamenco, так и flamenco+, но обнаруженные ранее в линиях MS, SS и Oregon R (+Y+3) структурные изменения могут влиять на количество анализируемой матрицы.

Исследование области локуса flamenco методом ПЦР в реальном времени

Нами были подобраны пары праймеров в области flamenco (на Рис. 6 вертикальными пронумерованными линиями показаны анализируемые точки). Для постановки ОТ в качестве затравок использовали 6 пар праймеров, которые отжигались одновременно на одной и той же матрице РНК, выделенной из яичников или семенников. Это позволяло оценить уровень транскрипции РНК исследуемых линий с генотипами flamenco+ и flamenco по шести точкам. На

рисунке 8 представлен график, соответственно, экспрессии в яичниках по шести анализируемым точкам в линиях flamencoMS и Oregon R (+Y+3). Линию SS в данных экспериментах не использовали.

Из графика на Рис. 8 видно, что в линии с генотипом flamenco' экспрессия в районе локализации гена flamenco в целом выше, чем в линии MS и Oregon R (+Y+3), особенно, в точках между началом гена DIP1 и началом скопления МГЭ. Скорее всего, это связано со структурными отличиями линий с генотипом flamenco: наличие вставки в районе НВ (линии MS, SS и Oregon R (+Y+3)), вставка в область начала гена D1P1 (линия Oregon R (+Y+3)). Область между геном DIP] и первой обнаруженной piPHK, видимо, является регуляторной, поэтому в линии flamenco+, где не нарушена регуляции транспозиции МГЭ, она экспрессируется с большей эффективность и далее происходит снижение экспрессии за счет процессинга однонитевого транскрипта. Причем процессинг начинается только в районе скопления МГЭ, а в районе возможной регуляции остается на высоком уровне.

Рис. 8. РНК-предшественник в яичниках линии flamenco , MS и Oregon R (+Y+3). Суммарные данные 7 независимых экспериментов нормализованы относительно референсного гена гр49.

В линии MS снижена экспрессия исследуемого района (Рис. 8). Уменьшение количества РНК-предшественника выявляется во втором интроне гена DIP], что связано с наличием вставки в НВ. Далее РНК обнаруживается во всех исследуемых точках, в том числе в области скопления дефектных копий МГЭ. Одинаковый уровень РНК в точках 3-5 (Рис. 8) свидетельствует о нарушении функции процессинга РНК-предшественника. Таким образом, можно предполагать, что вставка IdSS влияет на уровень экспрессии РНК-предшественника. Его процессинг может быть нарушен вследствие мутаций в генах, кодирующих белки, которые участвуют в биогенезе коротких молекул РНК (Pélisson el al, 2007).

Как и в линии MS, в линии Oregon R (+Y+3) наблюдается стабильный сниженный уровень экспрессии РНК. Снижение экспрессии выявлено только в области НВ. Не исключено, что вставка внутри гена DIP1 влияет только на количество образованного транскрипта. В результате, полноценная молекула РНК-предшественника подвергается процессингу. В данном случае генотип flamenco не является следствием структурных изменений и обусловлен наличием другого, отличного от линии MS, аллеля flamenco. По-видимому, генотип flamenco в линии Oregon R (+Y+3) обусловлен снижением количества РНК, получающихся в результате процессинга.

Аналогичным образом по 5 точкам был исследован район локализации локуса flamenco на РНК, выделенной из семенников. Экспрессия в данном районе в линиях с генотипом flamenco не проявляет никаких закономерностей. По-видимому, локус flamenco не принимает участие в сперматогенезе, в отличие от самок, для которых было доказано, что данный локус функционирует во время гаметогенеза. (Brennecke el ai, 2007).

ВЫВОДЫ

1. В исследованных линиях Drosophila melanogasíer, мутантных по локусу flamenco, внутри дефектного мобильного генетического элемента НВ, расположенного во втором интроне гена DIP1, выявлена инсерция (IdSS) размером 182 п.н., которая принимает участие в экспрессии локуса flamenco.

2. Анализ экспрессии гена DIP1 в линиях D. melanogasíer, отличающихся по статусу локуса flamenco, на разных стадиях развития показал, что в линии

Oregon R (+Y+3), мутантной по локусу flamenco, транскрипция этого гена происходит на всех стадиях развития (эмбрионы, личинки, имаго), тогда как в других линиях этот ген на стадии личинок не транскрибируется. По-видимому, в линии Oregon R (+Y+3) экспрессия гена DIP1 видоизменяется под влиянием нуклеотидной вставки размером 173 п.н., расположенной в промоторной области гена.

3. Анализ структуры и экспрессии гена DIP1 и его гомологов показал, что у D. simulans, D. sechellia, D. mauritiana первый альтернативный экзон представлен только одним структурным вариантом. По-видимому, функционально значимым является лишь один из альтернативных вариантов первого экзона гена DIPI.

4. Исследована экспрессия генов CG32500, CG328I9 и CG 14476, образующие с геном DIP1 единый кластер, на уровне транскрипции. Обнаружено, что транскрипция CG32819 и CG14476 происходит стадиеспецифично. Показано, что гены CG32500, CG32819 и CG14476 в линиях flamenco и flamencoh по экспрессии не отличаются. Вероятно, эти гены не принимают участие в регуляции транспозиций мобильных генетических элементов.

5. Показано, что в линии MS, мутантной по локусу flamenco, транскрипция этого локуса не снижается в отличие от других линий. По-видимому, в линии MS транскрипт, образующийся в области этого локуса, не подвергается процессингу, что коррелирует с транспозициями мобильного элемента gypsy.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 08-04-00693 и частичной

поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной

России» (2009-2011 г.г.).

Список работ опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах соответствующих Перечню ВАК:

1. Нефедова Л.Н., Потапова М.В., Романова Н.И., Ким А.И. Анализ структуры и экспрессии гена DIPI в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по гену flamenco И Генетика. 2009. Т. 45. №2. С. 203-208.

2. Нефедова Л.Н., Коростин Д.О., Потапова М.В., Ким А.И. Молекулярно-генетический анализ регуляторного гена DIP1 у разных видов Drosophila Н Экологическая генетика. 2009. Т. 7. №4. С. 8-13.

3. Потапова M.B, Нефедова JI.H., Ким А.И. Анализ структуры и экспрессии кластера генов Drosophila D1PI, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в область гена flamenco // Генетика. 2009. Т. 45. №10. С. 1339-1346.

Тезисы конференций:

1. Ким А.И., Потапова М.В., Нефедова JLH. Структурная организация гена DIPI в генетически нестабильных линиях D. melanogasier. Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию ИОГен им.Н.И.Вавилова РАН. 28 июня-2 июля 2006 г. Москва. С. 87.

2. Потапова М.В. Молекулярно-генетическое исследование гена DIP1 и его связи с геном flamenco у Drosophila melanogasier. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», 11-14 апреля 2007 г. Секция «Биология». Москва: Макс-Пресс. С. 59.

3. Потапова М.В. Молекулярно-генетическое исследование района гена flamenco у Drosophila melanogasier. Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. 8-11 апреля 2008. Секция «Биология». М.: Макс-Пресс. С. 76-77.

4. Потапова М.В., Нефедова JI.H., Романова Н.И., Ким А.И. Структура и экспрессия генов D. melanogasier DIPI, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в локус flamenco. Тезисы доклада Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009». Секция «Биология». 13-18 апреля 2009 г. С. 100.

5. Потапова М.В., Нефедова Л.Н., Романова Н.И., Ким А.И. Структура и экспрессия генов D. melanogasier DIPI, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в локус flamenco. Тезисы доклада V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 21-28 июня 2009. Часть 2. С. 81.

Заказ № 205-1/03/2011 Подписано в печать 17.03.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

#-53/7

2010198712

2010198712