Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ структуры и экспрессии района локализации гена flamenco Y Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ структуры и экспрессии района локализации гена flamenco Y Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

ПОТАПОВА МАРИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ЭКСПРЕССИИ РАЙОНА ЛОКАЛИЗАЦИИ ГЕНА flamenco У Drosophila melanogaster

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 CZ3 2011

Москва 2011

4854650

Работа выполнена на кафедре имени М. В. Ломоносова

генетики биологического факультета МГУ

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

КИМ Александр Иннокентьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

КУЗИН Борис Александрович

доктор биологических наук КАЛМЫКОВА Алла Ивановна

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Защита диссертации состоится « 02 » марта 2011 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. Сайт: http://idbras.corncor.ru/: e-mail: idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан «01 » февраля 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^ /Абрамова Е. Б./

ele0806@vandex.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Drosophia melanogaster - излюбленный модельный объект для исследования структурной и функциональной организации эукариотического генома, и, в том числе, его мобильного компонента. В последние годы особое внимание уделяется изучению мобильного генетического элемента (МГЭ) gypsy (МДГ4). Элемент gypsy относится к ретротранспозонам, перемещающимся с помощью РНК-интермедиата, и имеет три открытые рамки считывания (ОРС), гомологичные ОРС ретровирусов позвоночных. Наличие функциональной третьей ОРС, кодирующей белок оболочки вирусных частиц, способности к инфицированию клеток in vivo и горизонтальному переносу позволило отнести gypsy к настоящим ретровирусам беспозвоночных (Kim et al., 1994), а D. melanogaster использовать в качестве модели для их исследования. Актуальность изучения ретровирусов дрозофилы, и, следовательно, ретротранспозонов обусловлена тем, что к классу ретровирусов относится и вирус иммунодефицита человека. Его структура принципиально не отличается от структуры ретровирусов насекомых. Не исключено, что схожи и механизмы передачи, контроля развития инфекции и защиты организма от нее.

Спонтанные транспозиции МГЭ чрезвычайно редки, но в некоторых случаях перемещения происходят с повышенной частотой, что может стать причиной генных мутаций и приводить к хромосомным перестройкам. Особенно опасна активность МГЭ в клетках полового пути, поскольку вызываемые ими мутации будут аккумулироваться в следующих поколениях (Brennecke et al, 2007). Для изучения транспозиции МГЭ у D. melanogaster была получена нестабильная мутаторная линия (mutator strain - MS), которая ведет свое происхождение от стабильной лабораторной линии (stable strain - SS) и характеризуется увеличенной до 10"3-10"4 частотой спонтанного мутирования и активной транспозицией gypsy при неизменной локализации других элементов (Ким и др., 1989). Поскольку в норме частота транспозиции снижена, следовательно, у D. melanogaster существует ген (гены), который участвует в контроле транспозиции gypsy. Таким геном оказался недавно обнаруженный ген flamenco (Prud'homme et al, 1995), который пока клонировать не удалось. С помощью молекулярной конструкции на основе Р-элемента и гена yellow (P[yellow]) был получен инсерционный мутант D. melanogaster с фенотипом flamenco (Robert et al., 2001), который характеризуется повышенной частотой транспозиции МГЭ. В области инсерции, локализованной в районе 20АЗ-А5 X-хромосомы, находится кластер из 8 ОРС, которые транскрибируются в одном направлении. На расстоянии 1,5 т.п.н. от инсерции расположен ген DIP], за ним следуют две ОРС (CG32500 и CG32819), последовательно повторенных три раза, а завершает кластер ОРС CG14476. Любая из этих 8 ОРС могла бы претендовать на роль гена flamenco.

С другой стороны от точки инсерции находится область размером около 200 т.п.н., богатая дефектными копиями МГЭ, преимущественно

транскрибируемых в одном направлении. Известно, что в контроле транспозиций МГЭ важную роль играют процессы РНК-интерференции. Короткие молекулы РНК — piPHK (Piwi interacting РНК) связываются комплементарно с мРНК МГЭ, которые в дальнейшем деградируют. Большое количество последовательностей piPHK обнаружено на антисмысловой цепи гена DIPI в районе локализации гена flamenco. Таким образом, можно предполагать, что продуктом гена flamenco может быть молекула РНК-предшественника, после процессинга которого образуется множество piPHK.

Формирование фенотипа flamenco может быть обусловлено изменениями в структуре ДНК или уровне транскрипции РНК любой из 8 обнаруженных ОРС или влиянием на экспрессию области, богатой дефектными копиями МГЭ. Отсюда возникает необходимость исследования структурной организации этого района Х-хромосомы и анализа его экспрессии в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по гену flamenco.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - исследование молекулярной природы района гена flamenco, осуществляющего контроль транспозиции ретротранспозона-ретровируса gypsy у Drosophila melanogaster.

В работе предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать структурную организацию генов, входящих в район локуса flamenco в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по гену flamenco.

2. Провести анализ структуры и экспрессии гена DIP1 у видов Drosophila, родственных D. melanogaster.

3. Провести сравнительный анализ экспрессии генов, входящих в район локуса flamenco, на уровне транскрипции на разных стадиях развития в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по локусу flamenco методом ОТ-ПЦР.

4. Провести сравнительный анализ экспрессии на уровне транскрипции прицентромерного района X хромосомы в области локализации локуса flamenco (ОТ-ПЦР, ПЦР в режиме реального времени).

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые проведено комплексное исследование структуры и экспрессии района локализации гена flamenco. Исследована структура и экспрессия кластера генов DIPI, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в район локализации гена flamenco. Показано, что гены CG32500, CG328I9 и CG14476 в линиях flamenco и flamenco+ не участвуют в формировании фенотипа flamenco, в отличие от гена D1P1.

Впервые установлена специфичность транскрипции изучаемых генов на разных стадиях индивидуального развития D. melanogaster: эмбриональной, личинки 3 возраста и имаго.

Различия в структуре и экспрессии установлены только для ближайшего к точке инсерции гена DIP1 в линиях с фенотипами flamenco и flamenco+.

Впервые показано, что в транскрипции РНК-предшественника молекул piPHK принимает участие промотор дефектного мобильного элемента НВ, а формирование фенотипа flamenco обусловлено нарушениями в процессах РНК-

интерференции. Эти нарушения связаны со структурными изменениями в линиях с фенотипом flamenco, что ведет к изменению целостности молекулы РНК-предшественника piPHK.

Полученные данные могут быть использованы в дальнейшем для исследования механизмов контроля транспозиции у эукариот, процесса биогенеза piPHK в клетке в целом, и для изучения формирования мутантного фенотипа flamenco у D. melanogaster, который характеризуется повышенной частотой транспозиции МГЭ, в частности.

Личное участие автора. Вся работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи решены с применением современных биоинформатических и молекулярно-генетических методов. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию ИОГен им. Н. И. Вавилова РАН (Москва, 2006), Международной научной конференции «Current Evolutionary thinking in Biology, Medicine and Sociology», посвященная 90-летию со дня рождения академика Д. К. Беляева. (Новосибирск, 2007), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007, 2008, 2009), на 1-й Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Харьков, 2008), на IV съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), на Всероссийской конференции посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы (Уфа, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 9.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 103 страницах, содержит 25 рисунков, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 129 цитируемых источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Лабораторные линии D. melanogaster (SS, MS, Oregon R (+Y+3), P[yellow] - с фенотипом flamenco, линия flamenco+). Виды Drosophila из коллекции кафедры генетики МГУ: Drosophila sechellia, Drosophila mauritiana, Drosophila simulans, Drosophila erecta, Drosophila yakuba.

Штаммы Escherichia coli C600, JM109 из коллекции кафедры.

Условия культивирования лабораторных линий, получение личинок 3 возраста и эмбрионов 0-24 ч. Линии мух поддерживались в стандартных условиях: при температуре 25°С на питательной агаризованной среде.

Самцов и самок исследуемых линий flamenco+, SS, MS, Oregon R (+Y+3)

помещали на чашки Петри при температуре 25°С на ночь. Эмбрионы собирали и помещали в пробирки объемом 1,5 мл для последующего выделения РНК.

Для получения личинок 3-го возраста самцов и самок по 10 штук помещали в пробирки. Через 3 сут отбирали личинок в пробирки объемом 1,5 мл для последующего выделения РНК. В линии flamenco* отбирали только самцов.

Сбор семенников и яичников проводили у взрослых половозрелых особей (около 100 штук самцов или самок).

Клетки Е. coli культивировали на агаризованной или в жидкой среде LB (Luria-Bertani) с карбенициллином (50 мкг/мл).

Приготовление компетентных клеток и трансформация Е. coli. осуществлялись с помощью стандартных методик (Maniatis et al., 2001).

Выделение хромосомной ДНК и плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора для выделения хромосомной ДНК «Fermentas» по протоколу.

Обработка ДНК ферментами проводилась рестрикционными эндонуклезами по протоколам фирмы производителя «Fermentas». Лигирование с вектором для клонирования согласно протоколу «Promega».

Тотальную РНК из эмбрионов, личинок, имаго, яичников и семенников выделяли с помощью набора «Promega» согласно протоколу. Перед постановкой обратной транскрипции пробы (по 3 мкг тотальной РНК) обрабатывали ДНКазой I («Fermentas») для разрушения ДНК.

Обратная транскрипция (ОТ) проводилась с помощью набора для синтеза кДНК «Fermentas». В качестве матрицы использовали тотальную РНК, выделенную из яичников (семенников) изучаемых линий.

Полимеразная цепная реакции. Приготовление смеси для реакции выполняли по протоколу фирмы «Fermentas». Реакцию проводили в амплификаторе Amply4 («Biokom»). В качестве матрицы использовали хромосомную ДНК и кДНК, выделенную из: D. sechellia, D. manritiana, D. simulans, D. erecta, D. yakuba, D. melanogaster (линии flamenco"1", SS, MS и Oregon R (+Y+3)). Проводили амплификацию фрагментов ДНК и кДНК генов DIP], CG32500, CG32819, CG14476, кДНК района локализации гена flamenco. В качестве контроля использовали фрагменты гена гр49.

ПЦР в реальном времени. Приготовления смеси с использованием набора реагентов фирмы «Fermentas» («Master Mix (SYBR)») проводили по протоколу фирмы производителя. Реакция проводилась в амплификаторе MiniOpticon Real-Time PCR System производства Bio-Rad Laboratories. Одновременно ставили отрицательные контроли для каждого образца: пробы, обработанные ДНКазой I и не прошедшие ОТ.

Секвенирование. Клонированные фрагменты ДНК были секвенированы в Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.

Биоинформатические методы. Использованные программы: GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide) и база данных последовательностей генома D. melanogaster FlyBase

(http://flybase.bio.indiana.edu/) для поиска нуклеотидных последовательностей; BLAST (http://flybase.org/blast/) для поиска гомологии генов; Vector NT1 для

работы с известными нуклеотидными последовательностями; ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Toois/ciustalw/) для множественного выравнивания последовательностей; SoftBerry (linuxl.softberry.com) для выявления экзон-интронного строения; Promoter Prediction (http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl) для поиска промоторной области; для обработки данных ПЦР в режиме реального времени использовали программное обеспечение фирмы «Bio-Rad» - CFX Manager.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование структуры гена DIP1 у D. melanogaster

По данным FlyBase в исследуемой области 20А1-5 размером более 300 т.п.н. обнаружено только 8 ОРС, организованных в кластер: ген DIP], точка начала трансляции которого находится на расстоянии 1,5 т.п.н. от инсерции P[yellow], две ОРС (CG32500 и CG32819), последовательно повторенных три раза (Robert et al., 2001), и завершает кластер ОРС CGI4476 (Рис. 1). Функции гена DIP1 и остальных 7 генов кластера неизвестны.

Нами было сделано предположение, что инсерция в линии P[yellow] может влиять на транскрипцию гена DIP! или другого гена кластера. Если изменение экспрессии гена DIP1 приводит к фенотипу flamenco, то в линиях SS и MS функция гена DIP] также должна быть нарушена вследствие изменений его структуры и/или экспрессии.

Проведенный рестрикционный анализ показал, что амплифицированный с праймерами DIPd4 и DIPr2 фрагмент в линиях SS и MS, в отличие от линий flamenco+ и P[yellow], не содержит сайта рестрикции Dra\ в положении 1765 (Рис. 1). Эта мутация определяется мононуклеотидной заменой сайта узнавания ТТТААА на TTTAAG и является трансляционно незначащей.

214801с 21490k 21500k 21510k

CG14476 __CG32SOO DIPL Р|Дои|

Рис. 1. Схема области 20А5 локализации гена flamenco по данным FlyBasc. Показано направление транскрипции 8 ОРС и дефектных МГЭ. Треугольником показана инсерция P[yellow], Обозначены: сайты рестрикции Dral и их координаты; сайты локализации праймеров; ATG - предполагаемые сайты инициации трансляции, черным прямоугольником показан альтернативный экзон, стрелкой показано направление и локализация последовательности НВ.

Кроме того, ген DIPI в линиях MS, SS Oregon R (+Y+3), в отличие от линий flamenco+ и Pfyellow], содержит вставку, заключенную между двумя другими сайтами Dra\ (2297 и 2888) и обозначенную нами IdSS, размером 182 п.н. во втором интроне (Рис. 1). Выявленная вставка была утрачена в линиях P[yellow] и flamenco+. Согласно Genbank комплементарная цепь последовательности второго интрона гена DIP1 содержит дефектную копию МГЭ HB размером -1300 п.н. Выделенная вставка позволяет продлить область гомологии ОРС HB с генами Tel-подобных транспозаз на величину последовательности IdSS.

Более того, нами обнаружены структурные отличия линии Oregon R (+Y+3) от линий MS, SS и flamenco+: вставка размером 173 п.н. в промоторной области гена DIPI, которая может влиять на уровень экспрессии гена D1P1, либо соседнего района. Эта вставка не обнаружена в промоторной области гена DIP] у других линий D. melanogaster, но она присутствует в гомологичных областях у более молодых видов D. sechellia и D. simulans. Следовательно, в линиях D. melanogaster (flamenco+, MS, SS) произошла делеция этой последовательности.

Предположительно, МГЭ передвигались по геному, поэтому в результате делеций, сопровождавших этот процесс (линии Pfyellow] и flamenco+), их фрагменты обнаруживаются во втором интроне и начале гена DIPL Таким образом, по нашим данным, из четырех исследуемых генотипов D. melanogaster генотип линии SS эволюционно самый древний, Oregon R (+Y+3) более молодой, Pfyellow] и flamenco+ самые молодые. Не исключено, что подобные изменения в нуклеотидной структуре исследуемого района способствовали появлению механизмов защиты от действия МГЭ и могут влиять на экспрессию TtmDIPl.

Анализ экспрессии гена DIP1 у D. melanogaster

Ген DIP1 состоит из четырех экзонов, первый из которых может быть альтернативным. DIP1 кодирует несколько продуктов, образующихся в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК (DeSausa et al., 2003). В базе данных FlyBase приведены два названия одного и того же гена: DIPI и Klett. Известны три варианта CDS (coding sequence), включающих сайт трансляции ATG1: DIPl-c, она же Klett-c (AF175711), DIPl-b, она же Klett-d (AF182154) и DIPl-d (AY217028), и два варианта CDS с альтернативным первым экзоном (с ATG2): Klett-a (AJ2500866) и Klett-b (AJ2500867). С ATG3, локализованного во втором экзоне, читается форма DIPl-a (AF175713) (Рис. 1).

Анализ продуктов альтерантивного сплайсинга гена DIPI, включающих сайт ATG1/ATG2 методом ОТ-ПЦР с парами праймеров DIP d4-DIP r2, DIP d3-DIP r2 (Рис. 1) подтвердил наличие следующих форм: DIPl-c (1109 п.н.), DIPl-b (1063 п.н.), DIPl-d (713 п.н.), Klett-a (1113 п.н.) и Klett-b (1068 п.н.) (Рис. 2).

Нами исследована экспрессия гена DIPI на 3-х стадиях индивидуального развития: у эмбрионов, личинок 3 возраста и имаго D. melanogaster. Во всех линиях на стадии имаго и у эмбрионов выявляются формы DIP-c, Dip-b и Dip-d, Klett-a и Klett-b (Рис. 2). Формы DIP-c и Klett-a транскрибируются преимущественно.

Мы установили, что экспрессия гена DIP1 D. melanogaster не является конститутивной, а зависит от возраста особей. В линиях flamenco+, SS, MS на стадии личинок транскрипции гена не выявлено. Однако в линии Oregon R (+Y+3) его транскрипция практически не снижена, что связано с наличием дополнительного промотора в области начала гена D1PI.

Эмбрионы Лпчннкп Имаго

1234L1234L1234L

DIP 1-е. DIPl-b DIP ГЗ1

KietNa KlettT

В

rp-49

Рис. 2. Экспрессия гена DIP1 на разных стадиях развития мух линий flamenco+ (1), SS (2), MS (3), Oregon R (+Y+3) (4). Использованы пары праймеров: A. DIP d4-DIP r2 для оценки кДНК с ATG1; Б. DIP d3-DIP r2 для оценки кДНК с ATG2. В. Контрольная амплификация кДНК гена гр49. Стрелками показаны ПЦР-фрагменты. Маркер размера фрагментов ДНК (п.н.) (дорожка L) - GeneRuler DNA Ladder Mix («Fermentas»).

Обнаруженные нами многочисленные траскрипты свидетельствуют о многофункциональности гена. Но исследование его функции с помощью инактивации невозможно в связи с тем, что ген является жизненно важным (De Felice et ai, 2004). Поэтому нами решено было провести сравнительный анализ структуры и экспрессии гена DIP1 у других видах Drosophila, близкородственных D. melanogaster.

Структурная организация и анализ экспрессии гомологов гена DIP1 в геномах /). sechellia, D. mauritiana, D. simulans, D. erecta и D. yakuba

В настоящее время в базе данных FlyBase представлены секвенированные последовательности геномов двенадцати различных видов рода Drosophila. Наиболее близкими по структуре к гену DIP1 D. melanogaster являются гомологи, обнаруженные у представителей подгруппы melanogaster: D. sechellia, D. mauritiana, D. simulans, D. erecta и D. yakuba (Рис. ЗА).

ПЦР-анализ хромосомной ДНК видов подгруппы melanogaster на наличие копий ИВ показал, что копии этого МГЭ присутствуют в геномах всех видов подгруппы, но ни в одной из нуклеотидных последовательностей гомологов гена DIP1 копий НВ нет. Геном D. mauritiana в настоящее время не секвенирован, в отличие от геномов D. sechellia, D. simulans, D. erecta и D. yakuba, поэтому амплифицированные фрагменты были нами клонированы и

секвенированы.

Анализ секвенированных последовательностей показал, что гомолог DIPI у D. mauritiana, также как и гомологи гена у D. sechellia, D. simulans, D. erecta и D. yakuba, действительно не содержит НВ. Этот мобильный элемент ранее перемещался по геному и попал в ген DIP1 после отделения D. melanogaster от общего эволюционного древа подгруппы melanogaster (Рис. ЗА).

yakuba

melanogaster simulans

sechellia mauritiana

inel

erecta

sec sim mau

mel sec sim mau yak ere L

E niF1^-

I r 1 РЧ 53

1'iic. 3 А. Эволюционное дерево представителен подгруппы melanogaster, стрелкой показано внедрение HB в геном D. melanogaster. Б-Е. Амплифнцнрованныс фрагменты ДНК н кДНК гена DI PI и его гомологов видов D. melanogaster (mel), D. sechellia (sec), D. simulans (sim), D. mauritiana (mau), D. yakuba (yak), IX erecta (ere). Использованы пары праймеров: Б. ДНК, амплифицированная с праймерами DIPdl-DIPrl, +НВ и -HB обозначено наличие/отсутствие HB внутри гена DIP1 и его гомологов; В. кДНК, амплифицированная с праймерами DIPdl-DIPrl. Г; ДНК, амплифицированная с праймерами DIPd2-DIPrl; Д. кДНК, амплифицированная с праймерами DIPd2-DlPrl; Е. Контрольная амплификация кДНК гена гр49. Маркер размера фрагментов (в п.н.) ДНК (дорожка L)

В области, соответствующей альтернативному первому экзону, у D. sechellia, D. simulans и D. mauritiana обнаружены делеции, которые могут привести к изменению экспрессии гомологов гена DIPL У D. erecta и D. yakuba организация района совпадает с таковой у D. melanogaster.

Анализ экспрессии форм, образующихся с альтернативного первого

экзона, однозначно свидетельствует об экспрессии форм Klett-a/Klett-b у D. erecta (Рис. ЗБ-Е). У D. secheüia, D. simiilans и D. mauritiana экспрессии с альтернативного первого экзона нет.

Таким образом, альтернативные формы транскриптов гена DIP! (Klett-a/Klett-b) отсутствуют у более молодых, чем D. melanogaster, видов дрозофилы, и есть у более древних. По-видимому, альтернативные формы, не являясь основными у D. melanogaster, не поддерживались в процессе эволюции отбором, что привело к их утрате более молодыми видами. Отличия, связанные с изменением экспрессии гена DIP1, могут стать причиной формирования фенотипа flamenco и быть следствием инсерции в область локализации гена flamenco. Инсерция в свою очередь может влиять на экспрессию и соседних с DIP1 генов.

Анализ экспрессии генов кластера CG32500, CG32819 и CG14476 у D. melanogaster

По данным FlyBase ОРС CG32500, CG32819 и CG14476 содержат в кодируемой ими последовательности высоко консервативные домены. Размеры амплифицированных фрагментов хромосомной ДНК с парами праймеров совпадали с теоретически ожидаемым.

Мы установили, что экспрессия гена CG32500 на уровне транскрипции происходит на всех стадиях развития D. melanogaster, различия можно выявить лишь в количестве амплифицированного продукта: у личинок в отличие от эмбрионов и имаго уровень экспрессии гена снижен. В результате ПЦР-амплификации получен продукт размером ~800 п.н. (Рис. 4А), что соответствует продукту сплайсинга пре-мРНК согласно базе данных (FlyBase). Мы не обнаружили различий в экспрессии гена в линиях flamenco и flamenco+.

Рис. 4. Амплифицироваиные фрагменты на стадиях развития: эмбриональной, личинки 3 возраста, имаго. Линии flamenco4" (flam+), SS, MS, Oregon R (+Y+3) (OreR). Использованы пары праймеров: А. фрагменты гена CG32500\ Б. фрагменты гена CG32819; В. фрагменты гена CG14476. Стрелками показаны ПЦР-фрагменты (в п.н.). Маркер размера фрагментов (в п.н.) ДНК (дорожка L)

Анализ данных по экспрессии гена CG32819 (рис. 4Б), свидетельствует о том, что он транскрибируется только у эмбрионов, а размеры производимой РНК соответствуют данным FlyBase (1803 п.н. и 1560 п.н.). Форма 1560 п.н. образуется в результате альтернативного сплайсинга (Рис. 4Б). На стадии имаго обнаружен единственный продукт размером 800 п.н. Он является артефактом, поскольку секвенированная последовательность не проявляет сходства с геном CG32819. На стадии личинок продуктов амплификации не выявлено. Таким образом, мы установили, что функция гена CG32819 важна только на ранних этапах развития дрозофилы во всех линиях.

Выявить различия в экспрессии гена CG14476 в линиях с фенотипами flamenco+ и flamenco не удалось (Рис. 4В). Продукт ОТ-ПЦР обнаружен на стадии имаго и у эмбрионов, у личинок экспрессия этого гена значительно снижена (Рис. 4В). Таким образом, экспрессия гена идет на всех стадиях развития особи. Размер полученного фрагмента (-2900 т.п.н.) соответствует размеру, представленного в базе данных.

Полученные нами данные по экспрессии генов кластера у D. melanogaster, свидетельствуют о том, что гены CG32500, CG32819 и CG14476 не участвуют в формировании фенотипа flamenco.

Эволюционный анализ кластера генов DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476 у разных видов Drosophila

Подобная структурная организация 8 ОРС: трипликация генов CG32500, CG32819 и однонаправленность транскрипции может быть связана с перемещением мобильных генетических элементов. Транспозиции, приведшие к образованию кластера D. melanogaster, можно проследить при сравнительном анализе генов, гомологичных генам DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476, у разных видов Drosophila. Исследования проводились с помощью биоинформатического анализа секвенированных геномов видов дрозофилы, находящихся в разной степени филогенетического родства. Последовательности геномов разных видов Drosophila секвенированы в конце 2007 года и размещены в базе данных FlyBase, но они еще не аннотированы.

Гомологи исследуемых генов кластера обнаружены в геномах всех исследованных видов.

На основании проведенного биоинформатического анализа построена схема эволюции кластера генов района flamenco (Рис. 5). Таким образом, гомологи генов кластера района гена flamenco присутствуют в геномах всех анализируемых видов, но ни в одном из них, структурная организация района не повторяет строение кластера у D. melanogaster.

Ген DIP1 консервативен у всех видов, причем у D. sechellia и D. simulans он существует в нескольких структурных вариантах. Таким образом, функция гена DIP1 является консервативной в разных видах дрозофилы.

D.grimshawi

Ш"1шТ' < иззш

cgj:.ii9 со

IX vir ¡lis

m.Ujtt

D.pseuiloobscura mum

mvi ct;j2sim¡ a;i2xiv а;ш7я D.anmmssae

о 4iri сайт D.yakuba

4416 сг,з:я11> сазам mri

Г

1 D.sil

simulans

cg14476 \qg32k14 cg32sm)/ dll'l c<132s19 cc32sd0 ш1ч du'l

D.secheilia 1

Din саз:я19 счззтп ¡шч от да

' cc32s19

Рис. 5. Эволюция кластера генов района гена flamenco. Показаны гомологи генов DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476. Вертикальными стрелками - возможные этапы сборки генов в кластер. В круг обведены гены, которые повторены 3 раза у D. melanogaster.

Поиск РНК-предшественника piPHK в области локализации гена flamenco

В области гена flamenco считывается значительное количество piPHK, участвующих в подавлении транспозиций МГЭ. Была выдвинута гипотеза, что в этой области транскрибируется длинная молекула-предшественник с антисмысловой цепи гена DIPÍ, дающая начало piPHK (Brennecke et al., 2007). Область локализации ближайшей к гену DIPI piPHK картирована на расстоянии -2500 п.н. от начала гена (Рис. 6).

Если предположить, что в линиях с фенотипом flamenco+ образуется единый однонитевой РНК-предшественник piPHK, который в результате процессинга дает начало множеству piPHK, то, очевидно, в линиях с фенотипом flamenco механизм образования коротких молекул РНК нарушен.

Причин нарушения может быть как минимум две: цельный транскрипт или не образуется в результате нарушения инициации транскрипции, или образуется, но не подвергается дальнейшему процессингу. Поиск единого РНК-предшественника piPHK был проведен методом ОТ-ПЦР с подобранными специфическими праймерами на РНК, выделенной из яичников линий flamenco"1", MS, SS, Oregon R (+Y+3). Область исследования, праймеры и размер продуктов указаны на рис. 6.

Анализ ПЦР-продуктов на матрице кДНК подтвердил гипотезу о существовании в исследуемой области продуктов транскрипции. Продукты обнаруживаются как в районе между началом гена D1PI и первой piPHK, так и внутри гена DIP1. Уровень экспрессии в линиях с фенотипом flamenco снижен по сравнению с уровнем flamenco+ линии (данные не приведены).

область гена flamenco

1102 п.и.

РНК-прсдшестесшшк

Рис. 6. Схема расположения праймеров в области гена flamenco. Фигурными скобками показаны амплифицированные фрагментов кДНК, указаны их размеры. Обозначен НВ внутри второго интрона гена DIP1 и его предполагаемый промотор (Потапова и др., 2009). Обозначена предполагаемая молекула-предшественник. Треугольником обозначена инсерция (~1,5 т.п.н. от начала гена D1P1), приводящая к фенотипу flamenco. Пунктиром показано положение центромеры относительно района гена flamenco. Вертикальными пронумерованными линиями обозначены точки для анализа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Таким образом, общий уровень экспрессии области flamenco в линиях SS и Oregon R (+Y+3) ниже, чем в flamenco4, что может быть связано со структурными особенностями линий: наличие вставки во втором интроне гена DIP1 в линиях SS и Oregon R (+Y+3) и увеличение области начала гена DIP! в линии Oregon R (+Y+3) на 173 п.н.

Мы предположили, что молекула РНК-предшественника piPHK может транскрибироваться с промотора МГЭ HB, локализованного в составе гена DIPL Этому способствует направление транскрипции МГЭ HB противоположное транскрипции гена DIP1 (Рис. 6). Биоинформатическим методом определена область предполагаемого промотора в элементе HB (Рис. 7Б), кроме промотора на комплементарной цепи гена DIP1 выявлены и другие промоторы (Рис. 7Б).

б pipi

RT1 revi 4 RT1 forlf] экзон I 2 интрон |2 экфн

I И " '.о

RT1 rcv3c) EjRTlrcvX

х:

первая piPHK I

Рис. 7. Поиск области предполагаемого промотора в последовательности HB. А. Схема локализации праймеров в гене DIPL Отмечена предполагаемая область промотора, показан размер HB элемента. Штрих-линией обозначены продолжения гена DIP1. Б. Диаграмма с обнаруженными биоинформатически промоторами. По оси Y отложена вероятность нахождения промотора, по оси X протяжённость DIP1 и прилегающей области в п.н. В круг обведены наиболее вероятные промоторные последовательности.

Для установления предполагаемой области начала транскрипции были подобраны несколько праймеров до и после предполагаемой точки начала

транскрипции (Рис. 7А). В качестве матрицы для постановки ОТ со специфическим праймером RT1 fori использовали РНК линий flamenco+, MS и Oregon R (+Y+3), выделенную из яичников.

Среди продуктов амплификации выявлены фрагменты нужной длины (соответствуют длине фрагментов, представленных в базе данных) с парами праймеров RT1 forl-RTl revi и RT1 forl-RTl rev2 (Рис. 7А). ПЦР-продукт с парой праймеров RT1 forl-RTl rev3 обнаружен не был, что свидетельствует об отсутствии РНК-матрицы в конце второго интрона гена DIP1, левее предполагаемого промотора.

В то же время при наличии амплифицированного фрагмента с праймерами RT1 forl-RTl rev2 можно утверждать о сдвиге области предполагаемого промотора. Тем более биоинформатический анализ показал возможность такого сдвига в район З'-конца гена D1P1 (Рис. 7Б).

Таким образом, мы обнаружили, что молекула РНК-предшественника образуется как в линии flamenco, так и flamenco+, но обнаруженные ранее в линиях MS, SS и Oregon R (+Y+3) структурные изменения могут влиять на количество анализируемой матрицы.

Исследование области flamenco методом ПЦР в реальном времени

Нами были подобраны пары праймеров в области flamenco (на рис. 6 вертикальными пронумерованными линиями показаны анализируемые точки). Для постановки ОТ в качестве затравок использовали 6 пар праймеров, которые отжигались одновременно на одной и той же матрице РНК, выделенной из яичников или семенников. Это позволяло оценить уровень транскрипции РНК исследуемых линий с фенотипом flamenco+ и flamenco по шести точкам. После серии аналогичных экспериментов данные были объедены и обработаны программой Bio-Rad CFX Manager (Рис. 8). Представлены диаграмма и график, соответственно, экспрессии в яичниках по семи анализируемым точкам в линиях flamenco"1", MS и Oregon R (+Y+3). Линию SS в данных экспериментах не использовали.

Из диаграммы на (Рис. 8) видно, что в линии с фенотипом flamenco+ экспрессия в районе локализации гена flamenco в целом выше, чем в линии MS и Oregon R (+Y+3), особенно, в точках между началом гена DIP1 и началом скопления МГЭ. Скорее всего, это связано со структурными отличиями линий с фенотипом flamenco: наличие вставки в районе HB (линии MS, SS и Oregon R (+Y+3)), вставка в область начала гена DIP! (линия Oregon R (+Y+3)). Область между геном DIP] и первой обнаруженной piPHK, видимо, является регуляторной, поэтому в линии flamenco+, где не нарушена регуляции транспозиции МГЭ, она экспрессируется с большей эффективность и далее происходит снижение экспрессии за счет процессинга однонитевого транскрипта. Причем процессинг начинается только в районе скопления МГЭ, а в районе возможной регуляции остается на высоком уровне.

123456 123456 123456

flanieiico+ MS Oregoii R (+Y'3)

линпп D. melanogaster

Phc. 8. Диаграмма экспрессии 6 анализируемых точек в районе локализации гена flamenco в линиях flamenco , MS и Oregon R (+Y+3) на РНК, выделенной из яичников.

Суммарные данные 7 независимых экспериментов нормализованы относительно референсного гена гр49. Показан доверительный интервал значений. Последовательность столбцов соответствует последовательности точек в области локализации гена flamenco.

В линии MS снижена экспрессия исследованного района (Рис. 8, 9). Резкое уменьшение количества РНК-предшественника выявляется во втором интроне гена DIP, что связано с наличием вставки в НВ. Далее РНК обнаруживается во всех исследуемых точках, в том числе в области скопления дефектных копий МГЭ. Стабильное количество РНК в точках 4-6 (Рис. 9) свидетельствует о нарушении функции процессинга РНК-предшественника. Таким образом, вставка IdSS влияет на уровень экспрессии, но не на процесс образования piPHK. Процессинг может быть нарушен в следствие мутаций в генах, кодирующих белки, которые участвуют в биогенезе коротких молекул РНК (Pélisson et al., 2007).

Как и в линии MS, в линии Oregon R (+Y+J) наблюдается стабильный сниженный уровень экспрессии РНК. Снижение экспрессии выявлено только в области НВ. Не исключено, что вставка внутри гена DIP/ влияет только на количество образованного транскрипта. Следующая же вставка (в начале гена DIP/) компенсирует эффект снижения и приводит к восстановлению уровня активного транскрипта. В результате, полноценная молекула РНК-предшественника подвергается процессингу. В данном случае фенотип flamenco не является следствием структурных изменений и обусловлен наличием другого, отличного от линии MS, аллеля flamenco. По-видимому, фенотип flamenco в линии Oregon R (+Y+3) обусловлен сниженным количеством piPHK, связанным с уменьшенным количеством РНК-

предшественникаАналогичным образом по 5 точкам был исследован район локализации гена flamenco на РНК, выделенной из семенников. Анализируя данные, можно сделать вывод, что экспрессия в данном районе не проявляет никаких закономерностей.

1.6......................-...................................—.....—.........—.....-.........—

1.4 -™-

Рис. 9. РНК-прсдшсствспнпк в яичниках линии flamenco*, MS н Oregon R (+Y+3). Порядок и название точек соответствует порядку на рис. 7 и 8.

0.2---------■-

О -1-1-т--1--1--,

1 2 3 4 5 6

По-видимому, РНК района локализации гена flamenco не принимает участие в сперматогенезе, в отличие от самок, для которых было доказано участие данного локуса в гаметогенезе (Brennecke et al., 2007),

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Процессы посттранскрипционного подавления экспрессии, генов выполняют в организме функцию, направленную на репрессию чужеродных последовательностей ДНК- и РНК-содержащих вирусов и мобильных элементов. Эти механизмы являются очень эффективными в распознавании новых элементов, поскольку не зависят от конкретной структуры, особенностей размножения или кодируемых белков чужеродных последовательностей. Они обеспечивают подобие иммунной системы на уровне последовательностей нуклеиновых кислот, а не белков, при этом, в отличие от иммунной системы, образование фактора, специфически противостоящего заражению конкретным элементом, происходит в момент инфекции и не требует предварительных стадий.

Производимые в районе локализации гена flamenco piPHK участвуют в контроле транспозиции в половых клетках яичников у D. melanogaster. Причем, в каких именно, терминальных или фолликулярных, соматического происхождении, остается неизвестным. Важно отметить, что piPHK данного района взаимодействуют с белком Piwi. И путь образования piPHK с участием Piwi относят к механизму образования первичного класса piPHK. Первичные piPHK инициирует образование вторичных piPHK, амплификация которых выступает как мгновенный и эффективный путь защиты от действия атакующих постоянно геном МГЭ. Процесс амплификации особенно важен при гаметогенезе у самок. Ведь при активной транспозиции МГЭ необходимо обеспечить потомству подобие «иммунной» системы.

Полученные в работе данные однозначно свидетельствуют о наличии молекулы РНК-предшественника piPHK в линиях с фенотипами flamenco и

flamenco+ MS

Oregon R (+Y+3}.

flamenco*, что позволяет выдвинуть следующую гипотезу. С каждого промотора независимо синтезируются РНК различного (небольшого) размера, соответственно их концы могут также являться затравками для транскрипции, и происходит накопление транскрипта в линии flamenco+ (то есть в норме). Напротив, в линии MS, где наблюдается генетическая нестабильность, экспрессия снижена по сравнению с диким типом и вставка IdSS, изменяя последовательность, затормаживает цепную реакцию образования РНК. В линии Oregon R (+Y+3) наблюдается снижение эффективности транскрипции, как и в MS, при этом процессинг РНК-предшественника происходит. Следовательно, в этом случае включаются неизвестные механизмы восстановления синтеза РНК с последующим нарезанием на piPHK.

ВЫВОДЫ

1. Во втором интроне гена DIP! у D. melanogaster обнаружен дефектный мобильный генетический элемент HB. В линиях с фенотипом flamenco внутри HB выявлена инсерция (IdSS) размером 182 п.н. Изучение экспрессии гена DIP1 в линиях D. melanogaster с разным статусом flamenco показало, что эта инсерция не только влияет на экспрессию гена D1P1, но и участвует в формировании фенотипа flamenco.

2. В линии дрозофилы Oregon R (+Y+3) с фенотипом flamenco в промоторной области гена DIP1 обнаружена вставка размером 173 п.н. Анализ экспрессии гена D1P1 в линиях D. melanogaster, отличающихся по статусу flamenco, на разных стадиях развития показал, что в линии Oregon R (+Y+3) транскрипция этого гена происходит конститутивно, в отличие от всех других исследованных линий.

3. Показано, что ген DIP1 состоит из четырех экзонов, первый из них может быть представлен двумя альтернативными вариантами. Анализ структуры и экспрессии гена D1P1 и его гомологов показал, что у D. simulans, D. sechellia, D. mauritiana первый альтернативный экзон представлен только одним структурным вариантом. По-видимому, функционально значимым является лишь один из альтернативных вариантов первого экзона гена DIP1.

4. Показано, что гены CG32500, CG328I9 и CG14476, локализованные рядом с геном DIPI и образующие с ним единый кластер, в линиях flamenco и flamenco+ не участвуют в формировании фенотипа flamenco.

5. В линиях flamenco MS не формируются короткие РНК из протяженного транскрипта, синтезируемого в районе мастер-локуса flamenco. Показано, что транскрипция длинного РНК-предшественника молекул piPHK начинается с многочисленных промоторов, один из которых локализован во втором интроне гена DIP1.

6. Показано, что в генетически нестабильной линии MS и Oregon R (+Y+3) район локализации локуса flamenco экспрессируется менее интенсивно, чем в линии flamenco+. В линии MS кроме нарушения процесса образования piPHK имеются нарушения в процессах элонгации образования функционального транскрипта-предшественника piPHK.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 08-04-00693 и частичной

поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной

России» (2009-2011 г.г.).

Список работ опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах соответствующих Перечню ВАК:

1. Потапова М.В, Нефедова Л.Н., Ким А.И. Анализ структуры и экспрессии кластера генов Drosophila DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в область гена flamenco И Генетика. 2009. Т. 45. №10. С. 1339-1346.

2. Нефедова Л.Н., Коростин Д.О., Потапова М.В., Ким А.И. Молекулярно-генетический анализ регуляторного гена DIP1 у разных видов Drosophila // Экологическая генетика. 2009. Т. 7. №4. С. 8-13.

3. Нефедова Л.Н., Потапова М.В., Романова Н.И., Ким А.И. Анализ структуры и экспрессии гена DIP1 в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по гену flamenco // Генетика. 2009. Т. 45. №2. С. 203-208.

Тезисы конференций:

1. Ким А.И., Потапова М.В., Нефедова Л.Н. Структурная организация гена DIP1 в генетически нестабильных линиях D. melanogaster. Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященная 40-летию ИОГен им.Н.И.Вавилова РАН. 28 июня-2 июля 2006 г. Москва. С. 87.

2. Потапова М.В. Молекулярно-генетическое исследование гена DIP1 и его связи с геном flamenco у Drosophila melanogaster. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», 11-14 апреля 2007 г. Секция «Биология». Москва: Макс-Пресс. С. 59.

3. Потапова М.В. Молекулярно-генетическое исследование района гена flamenco у Drosophila melanogaster. Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. 8-11 апреля 2008. Секция «Биология». М.: Макс-Пресс. С. 76-77.

4. Потапова М.В., Нефедова Л.Н., Романова Н.И., Ким А.И. Структура и экспрессия генов D. melanogaster DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в локус flamenco. Тезисы доклада Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009». Секция «Биология». 13-18 апреля 2009 г. С. 100.

5. Потапова М.В., Нефедова Л.Н., Романова Н.И., Ким А.И. Структура и экспрессия генов D. melanogaster DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в локус flamenco. Тезисы доклада V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 21-28 июня 2009. Часть 2. С. 81.

Заказ № 127-а-2/01/2011 Подписано в печать 28.01.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 0,8

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Потапова, Мария Валерьевна

Список сокращений и условных обозначений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Мобильные генетические элементы дрозофилы и их классификация 1 о

2.2. Структурная организация ретротранспозона gypsy

2.3. Gypsy и генетическая нестабильность

2.4. Роль Еокуса flamenco в генетической нестабильности

2.5. Ген DIP1 — один из кандидатов на роль локусаßamenco

2.6. Регуляция экспрессии ретротранспозонов

2.7. Регуляция экспрессии ретротранспозонов РНК-интерференцией

2.7.1. РНК-интерференция у D. melanogaster

2.7.2. Характеристика малых РНК

2.7.3. Кластеры piPHK

3. Материалы и методы

3.1. Лабораторные линии Drosophila, использованные в 38 работе

3.2. Штаммы Escherichia coli

3.3. Векторы, использованные для клонирования фрагментов ДНК

3.4. Условия культивирования лабораторных линий

3.5. Культивирование линий D.melcmogaster для получения личинок 3 возраста и эмбрионов 0-24 ч

3.6. Сбор семенников и яичников

3.7. Культивирование клеток Е.coli

3.8. Приготовление компетентных клеток и трансформация

E.coli

3.9. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного 40 лизиса

3.10. Выделение геномной ДНК из взрослых особей

3.11. Обработка ДНК ферментами

3.12. Электрофорез в агарозном геле

3.13. Проведение полимеразной цепной реакции

3.14. Выделение тотальной РНК из эмбрионов, личинок, имаго, яичников и семенников

3.15. 5'-RACE (rapid amplification ofcDNA ends) анализ

3.16. Обратная транскрипция и ПНР

3.17. Обратная транскрипция и ПЦР в «реальном времени»

3.18. Секвенирование

3.19. Методы компьютерного анализа

Результаты

4.1. Молекулярно-генетическое исследование гена DIP

4.2. Анализ экспрессии гена DIP

4.3. Структурная организация гомологов гена DIP1 и анализ их экспрессии в геномах D. sechellia,

D. mauritiana, D. simúlame, D. erecta и D. yakuba

4.4. Анализ экспрессии генов кластера CG32500, CG

4.5. Эволюционный анализ кластера генов DIP1, CG32500, CG32819 и CG

4.6. Молекула РНК-предшественник в районе локализации локуса flamenco

4.7. Исследование предполагаемой области начала транскрипции РНК-предшественника

4.8. Исследование области flamenco методом ПЦР в реальном времени

5. Обсуждение

6. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ структуры и экспрессии района локализации гена flamenco Y Drosophila melanogaster"

Мобильные генетические элементы (МГЭ) или их фрагменты присутствуют в геномах многих ныне живущих организмов. Неконтролируемые транспозиции МГЭ могут быть причиной генных мутаций и приводить к хромосомным перестройкам. Особенно опасна активность МГЭ в клетках полового пути, поскольку вызываемые ими мутации будут аккумулироваться в следующих поколениях (Brennecke et al, 2007). Потенциально отрицательный эффект воздействия МГЭ на геном хозяина неизбежно влечет за собой развитие механизмов контроля транспозиций. Несмотря на то, что хозяйский геном может контролировать численность МГЭ, мобильным элементам свойственно большое разнообразие ретротранспозонов (Kazazian, 2004), которые могут выступать в качестве движущего фактора эволюции генома. Их перемещение является важным фактором индивидуальной изменчивости. Взаимодействие между мобильной ДНК и хозяйским геномом может иметь различные последствия: от изменения экспрессии единичных генов до перестройки архитектуры целого генома. Поэтому в эволюционном аспекте МГЭ в геноме могут рассматриваться как естественный молекулярный фактор, влияющий на структуру и функцию генома в целом (Miller, Сару, 2004).

В последние годы наибольшее внимание уделялось исследованию ретротранспозонов D.melanogaster, относящихся к группе gypsy. Элемент gypsy (МДГ4) дрозофилы является типичным ДКП-ретротранспозоном, содержащим три ОРС (Marlor et al, 1986). Наличие функционально активной ОРСЗ, а также способность gypsy к горизонтальному переносу, позволяют отнести его к ретровирусам (Kim et al, 1994). Gypsy является первым ретровирусом, обнаруженным у беспозвоночных.

Локус, регулирующий транспозиции gypsy, был обнаружен и назван flamenco (Prud'homme et al, 1995). Локус flamenco клонировать не удалось. Однако с помощью инсерционного мутагенеза получена мутантная линия

D.melanogaster с фентипом flamenco (Robert et al., 2001). В исследуемой области инсерции, размером более 300 т.п.н., обнаружено только 8 ОРС, предположительно кодирующих гены, функции которых не установлены. На расстоянии 1,5 т.п.н. от инсерции P[yellow] расположен ближайший к ней ген DIP1. Продукт этого гена взаимодействует с некоторыми белками, которые участвует в контроле индивидуального развития особи и в регуляции транскрипции: Ubx (Нох-ген) (Bondos et al., 2004), Disco (DeSousa et al., 2003), Su(var)3-9 (Delattre et al., 2000). Кроме того, известно, что форма гена DIPl-c может связывать предшественник miPHK (miR-iab-4-5p), который вовлечен в регуляцию экспрессии гена Ubx (Catanese, Matthews, 2010). Сразу за ним следуют две ОРС (CG32500 и CG32819), последовательно повторенных три раза. Завершает кластер ОРС CGI447б. Примечательно, что все 8 ОРС транскрибируются в одном и том же направлении от инсерции. Справа от точки инсерции - протяженная область размером около 200 т.п.н. богатая дефектными мобильными генетическими элементами, большая часть которых отличается однонаправленностью транскрипции.

Недавно показано, что в контроле транспозиций МГЭ принимает участие РНК-интерференция, а именно малые молекулы РНК, называемые piPHK, которые образуются из однонитевой молекулы-предшественника РНК. Молекулы piPHK гомологичны определенным последовательностям генома Drosophila melanogaster, т.е. организованны в кластеры. Одним из таких кластеров является район локализации локуса flamenco.

Так как локус flamenco участвует в контроле транспозиции gypsy, и активным его продуктом может быть единая молекула РНК, которая впоследствии процессируется до piPHK, была поставлена цель: исследовать структуру и экспрессию района локализации локуса flamenco у Drosophila melanogaster. В связи с этим в работе были поставлены конкретные задачи: 1. Исследовать структурную организацию генов, входящих в район локуса flamenco в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

2. Исследовать структуру и экспрессию гена DIP1, в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

3. Провести анализ структуры и экспрессии гена DIP1 у видов Drosophila, родственных D. melanogaster.

4. Провести сравнительный анализ экспрессии генов, входящих в район локуса flamenco, на уровне транскрипции на разных стадиях развития в линиях D. melanogaster, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

5. Провести сравнительный анализ экспрессии на уровне транскрипции прицентромерного района X хромосомы в области локализации локуса flamenco в линиях, мутантных и нормальных по локусу flamenco.

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Потапова, Мария Валерьевна

6. выводы

1. В исследованных линиях Drosophila melanogaster, мутантных по локусу flamenco, внутри дефектного мобильного генетического элемента HB, расположенного во втором интроне гена DIP1, выявлена инсерция (IdSS) размером 182 п.н., которая принимает участие в экспрессии локуса flamenco.

2. Анализ экспрессии гена DIP1 в линиях D. melanogaster, отличающихся по статусу локуса flamenco, на разных стадиях развития показал, что в линии Oregon R (+Y ), мутантной по локусу flamenco, транскрипция этого гена происходит на всех стадиях развития (эмбрионы, личинки, имаго), тогда как в других линиях этот ген на стадии личинок не транскрибируется. По

ЬЗ видимому, в линии

Oregon R (+Y ) экспрессия гена DIP1 видоизменяется под влиянием нуклеотидной вставки размером 173 п.н., расположенной в промоторной области гена.

3. Анализ структуры и экспрессии гена DIP1 и его гомологов показал, что у D. simulans, D. sechellia, D. mauritiana первый альтернативный экзон представлен только одним структурным вариантом. По-видимому, функционально значимым является лишь один из альтернативных вариантов первого экзона гена DIP1.

4. Исследована экспрессия генов CG32500, CG32819 и CG14476, образующие с геном DIP1 единый кластер, на уровне транскрипции. Обнаружено, что транскрипция CG32819 и CG14476 происходит стадиеспецифично. Показано, что гены CG32500, CG32819 и CG14476 в линиях flamenco и flamenco+ по экспрессии не отличаются. Вероятно, эти гены не принимают участие в регуляции транспозиций мобильных генетических элементов.

5. Показано, что в линии MS, мутантной по локусу flamenco, транскрипция этого локуса не снижается в отличие от других линий. По-видимому, в линии MS транскрипт, образующийся в области этого локуса, не подвергается процессингу, что коррелирует с транспозициями мобильного элемента gypsy.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Потапова, Мария Валерьевна, Москва

1. Ким А.И., Беляева Е.С., Ларкина З.Г., Асланян М.М. Генетическая нестабильность и транспозиции мобильного элемента МДГ4 в мутаторной линии Drosophila melanogaster II Генетика. 1989. Т. 25. № 10. С. 1747-1756.

2. Медведев Н.Н. Практическая генетика. М. Наука. 1968. С. 294.

3. Нефедова Л.Н., Коростин Д. О., Потапова М.В., Романова Н.И., Ким А.И. Молекулярно-генетический анализ регуляторного гена DIP1 у разных видов Drosophila II Генетика. 2009. Т. 9. № 4. С. 8-13.

4. Нефедова Л.Н., Романова Н.И., Ким А.И. Особенности структурной организации гена DIP1 в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по гену flamenco II иГенетика. 2007. Т. 43. № 1. С. 70-77.

5. Потапова М.В., Нефедова Л.Н., Романова Н.И., Ким А.И. Структура и экспрессия генов D.melanogaster DIP1, CG32500, CG32819 и CG14476, входящих в локус flamenco И Генетика. Т. 45. №. 10. С. 1324-1331.

6. Ambros V. The functions of animal microRNAs I I Nature. 2004. V. 431. P. 350-355.

7. Aravin A.A., Lagos-Quintana M., Yalcin A., Zavolan M., Marks D., Snyder В., Gaasterland Т., Meyer J., Tuschl T. The small RNA profile during Drosophilamelanogaster development // Dev. Cell. 2003. V. 5. P. 337-350.

8. Aravin A.A., Naumova N.M., Tulin A.V., Vagin V.V., Rozovsky Y.M., Gvozdev V.A. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline // Curr Biol. 2001. V. 11. P. 1017-1027.

9. Aravin A.A., Sachidanandam R., Girard A., Fejes-Toth K., Hannon G.J. Developmentally Regulated piRNA Clusters Implicate MILI in Transposon Control II Science. 2007. V. 316. № 5825. P. 744-747.

10. Arkhipova I.R., Ilyin Y. V. Properties of promoter regions of mdgl Drosophila retrotransposon indicate that it belongs to a specific class of promoters // EMBO J. 1991. Vol. 10. P. 1169-1177.

11. Arkhipova I.R., Lyubomirskaya N.V, Ilyin Y.V. Drosophila retrotransposons // Mol. Biol. Intel. Unit. R. G. Landes Company, USA. 1995. P. 130.

12. Arkhipova I.R., Mazo A.M., Cherkasova V.A., Gorelova T.V., Schuppe N.G., Ilyin Y. V. The steps of reverse transcription of Drosophila mobile dispersed genetic elements and U3-R-U5 structure of their LTRs // Cell. 1986. Vol. 44. №4. P. 555-563.

13. Becker J., Micard D., Becker J.L., Fourcade-Peronnet F., Dastugue B., Best-Belpomme M. Ecdysterone decreases the transcription level of the retrotransposons 1731 and 412 in a Drosophila cell line // Cell Mol. Biol. 1991. V.37. P. 41-49.

14. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., and Hannon G.J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference // Nature. 2001. V. 409. P. 363-366.

15. Birchler J.A., Hiebert J.C., Rabinow L. Interaction of the mottle of white withtransposable element alleles at the white locus in Drosophila melanogaster // Genes Dev. 1989. V. 3. P. 73-84. удалить

16. Bregliano J.C., Picard G., Bucheton A., Pelisson A., Lavige J.M., and L Heritier P. Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster И Science. 1980. V. 207. №4413. P. 606-611.

17. Brennecke J., Aravin A.A., Stark A., Dus M, Kellis M., Sachidanandam R., Hannon G.J. Discrete small RNA-generating loci as Master Regulators of transposone activity in Drosophila // Cell. 2007. Vol. 128. № 6. P. 1089-1103.

18. Bucheton A. The relationship between the flamenco gene and gypsy in Drosophila: how to tame a retrovirus // Trends Genet. 1995. Vol. 11. P. 349353.

19. Bustin M. Regulation of DNA-Dependent Activities by the Functional Motifs of the High-Mobility Group Chromosomal Proteins // Molecular and Cellular Biology. 1999. V. 19. P. 5237-5246.

20. Capelson M., Corces KG. SUMO conjugation attenuates the activity of the gypsy chromatin insulator // EMBO J. 2006. V. 25. P. 1906-1914.

21. Capelson M., Corces V.G. The ubiquitin ligase dTopors directs the nuclear organization of a chromatin insulator // Mol Cell. 2005. V. 20. P. 105-116.

22. Caspi A, Pachter L. Identification of transposable elements using multiple alignments of related genomes // Genome Res. 2006. V. 16. P. 260-270.

23. Catanese D., Matthews K. High affinity, dsRNA binding by disconnected interacting protein 1 // Biochem Biophys Res Commun. 2010. V. 399. P. 186191.

24. Cavarec L. and Heidmann T. The Drosophila copia retrotransposon contains binding sites for transcriptional regulation by homeoproteins // Nucl. Acids

25. Res. 1993. V. 21 №. 22. P. 5041-5049.

26. Chendrimada T.P., Gregory R.I., Kumaraswamy E., Norman J., Cooch N., Nishikura K., Shiekhattar R. TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing // Nature. 2005. V. 436. P. 740-744.

27. Czech B., Malone C.D., Zhou R., Stark A., Schlingeheyde C., Dus M., Perrimon N., Kellis M., Wohlschlegel J.A., Sachidanandam R, Hannon G.J., Brennecke J. An endogenous small interfering RNA pathway in Drosophila // Nature. 2008. V. 453. P. 798-802.

28. Cox D.N., Chao A., Baker J., Chang L., Qiao D., Lin H. A novel class of evolutionarily conserved genes defined by piwi are essential for stem cell self-renewal // Genes Dev. 1998. V. 12. P. 3715-3727.

29. Csink A.K., Linsk R. and Birchler J.A. Mosaic suppressor, a Gene in Drosophila That Modifies Retrotransposon Expression and Interacts With zeste //Genetics. 1994. V. 136. P. 573-583.

30. De Felice B., Ciarmiello L.F., Wilson R.R. Identification of a cDNA clone encoding DIP 1-binding protein in Drosophila melanogaster // Mol Biol Rep. 2004. V. 31. P. 165-169.

31. Chemistry. 2003. V. 278. P. 38040-38050.

32. Desset S., Buchon N., Meignin C., Coiffet M., Vaury C. In Drosophila melanogaster COM locus directs the somatic silencing of two retrotransposons through both piwi-dependent and -independent pathways // PLoS One. 2008. V. 3.№2.el526.

33. Dohmen R.J. SUMO protein modification // Biochim Biophys Acta. 2004. V. 1695. P. 113-131.

34. Dushay M.S., Rosbash M., Hall J.S. The disconnected visual system mutations in Drosophila melanogaster drastically disrupt circadian rhythms // J Biol Rhythms. 1989. V. 4. P. 1-27.

35. Engels W.R. Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster rules of inheritance of female sterility // Genet. Res. 1979. Vol. 33. P. 219-236.

36. Evgen'ev M., Corces V. and Lankenau D. Ulysses transposable element of Drosophila shows high structural similarities to functional domains of retroviruses // J Mol Biol. 1992. V. 225. P. 917-924.

37. Farazi T.A., Juranek S.A. and Tuschl T. The growing catalog of small RNAs and their association with distinct Argonaute/Piwi family members // 2008. Development. V. 135. P. 1201-1014.

38. Finnegan D.J., Rubin G.M., Hogness D.S. Repeated gene in Drosophila melanogaster II Cold Spring Harbor Symp Quant Biol. 1978. V. 42. P. 10531063.

39. Finnegan E.J., Matzke M.A. The small RNA world // J Cell Sci. 2003. V. 1. № 116. P. 4689-4693.

40. Gdula D.A., Corces. KG. Characterization of functional domains of the Su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations II Genetics. 1997. V. 145. P. 153-161.

41. Gdula D.A., Gerasimova T.I., Corces KG. Genetic and molecular analysis of the gypsy chromatin insulator of Drosophila // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93. P. 9378-9383.

42. Georgiev P.G., Gerasimova T.I. Novel genes influencing the expression of the yellow locus and mdg4 (gypsy) in Drosophila melanogaster // Mol Gen Genet. 1989. V. 220. P. 121-126.

43. Georgieva S.G., Nabirochkina E.N., Ladygina N.G., Georgiev P.G., Soldatov A.V. Nuclear protein e(y)2 from Drosophila melanogaster participates in transcription control // Genetika. 2001. V. 37. P. 24-28.

44. Green S.R. and Mathews M.B. Two RNA-binding motifs in the double-stranded RNA-activated protein kinase, DAI // Genes Dev. 1992. V. 6, 24782490.

45. Grimson A., Srivastava M., Fahey BWoodcroft B.J., Chiang H.R., King N., Degnan B.M., Rokhsar D.S., Barte D.P. Early origins and evolution of microRNAs and Piwi-interacting RNAs in animals // Nature. 2008. V. 455. P. 1193-1197.

46. Han J., Lee Y, Yeom K.H., Nam J. W., Heo I., Rhee J.K., Sohn S.Y., Cho Y., Zhang B.T., Kim V.N. Molecular basis for the recognition of primary microRNAs by the Drosha-DGCR8 complex // Cell. 2006. V. 125. P.887-901.

47. Han, J., Lee Y., Yeom K.H., Nam J. W., Heo I., Rhee J.K., Sohn S.Y., Cho Y., Zhang B.T. and Kim V.N. Molecular basis for the recognition of primary microRNAs by the Drosha-DGCR8 complex // Cell. 2006. V. 125. P. 887-901.

48. Harris L.J., Baillie D.L., Rose A.M. Sequence identity between an inverted repeat family of transposable elements in Drosophila and Caenorhabditis // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 5991-5998.

49. Hay R.T. SUMO: a history of modification // Mol Cell. 2005. V. 18. P. 1-12.

50. Heilig J.S., Freeman M., Laverty 71, Lee K.J., Campos A.R., Rubin G.M. and Steller H. Isolation and characterization of the disconnected gene of Drosophila melanogaster//EMBO J. 1991. V. 10. P. 809-815.

51. Ilyin Y. V., Tcurikov N.A., Ananiev E. V. Studies on the DNA fragments of mammals and Drosophila containing structural genes adjacent sequences // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1978. V. 42. P. 959-969.

52. Ishimaru S., Saigo K. The Drosophila forked gene encodes two major RNAs, which, in gypsy or springer insertion mutants, are partially or completely truncated within the 5'-LTR of the inserted retrotransposon // Mol Gen Genet. 1993. V. 241. P. 647-656.

53. Jeffs P.S., Holmes E.C. and Ashburner M. The molecular evolution of the alcohol dehydrogenase and alcohol dehydrogenase-related genes in the Drosophila melanogaster species subgroup // Mol Biol Evol. V. 11. P. 287304.

54. Johnston St. D., Brown N.H., Gall J.G., Jantsch M. A conserved double-stranded RNA-binding domain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 10979-10983.

55. Kalmykova A.I., Klenov M.S., Gvozdev V.A. Argonaute protein PIWI controls mobilization of retrotransposons in the Drosophila male germline // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 2052-2059.

56. Kazazian H.H Jr. Mobile elements: drivers of genome evolution // Science. 2004. V. 303. P. 1626-1632.

57. Ketting R.F., Haverkamp T.H., van Luenen H.G and Plasterk R.H. Mut-7 of C.elegans, required for transposon silencing and RNA interference, is a homolog of Werner syndrome helicase and RNaseD // Cell. 1999. V. 99. P. 133-141.

58. Kidwell M.G., Kidwell J.F. and Sved J.A. Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster a syndrome of aberrant traits including mutation, sterility, and mail recombination//Genetics. 1977. V. 86. P. 813-833.

59. Kim A., Terzian C., Santamaría P., Pélisson A., Prud'homm N., Bucheton A. Retroviruses in vertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 1285-1289.

60. Kim V.N., Han J., Siomi M.C. Biogenesis of small RNAs in animals // Nature. 2009. V.10.P. 126-137.

61. Lacoste J., Codani-Simonart S., Best-Belpomme M. F Peronnet. Characterization and cloning of pi 1, a transrepressor of Drosophila melanogaster retrotransposon 1731 //Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 50735079.

62. Langland J O; Kao P N, Jacobs B L. Nuclear factor-90 of activated T-cells: A double-stranded RNA-binding protein and substrate for the double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 63616368.

63. Lasko P J. The Drosophila melanogaster genome: translation factors and RNA binding proteins // Cell Biol. 2000. V. 150. P. 51-56.

64. Lecher P., Bucheton A., Pelisson A. Expression of the Drosophila retrovirus gypsy as ultrastructurally detectable particles in the ovaries of flies carrying a permissive flamenco allele // J Gen Virol. 1997. V. 78. P. 2379-2388.

65. Lee K.J., Mukhopadhyay M., Pelka P., Campos A.R., Steller H.S. Autoregulation of the Drosophila disconnected gene in the developing visual system // Dev. Biol. 1999. V. 214. P. 385-398.

66. Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 // Cell. 1993. V. 75. P. 843-854.

67. Lee Y., Ahn C., Han J., Choi H., Kim J., Yim J., Lee J., Provost P., Rädmark O., Kim S., Kim V.N. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNAs processing//Nature. 2003. V. 425. P. 415-419.

68. Lee Y., Hur I., Park S.Y., Kim Y.K., Suh M.R., Kim V.N. The role of PACT in the RNA silencing pathway // EMBO J. 2006. V. 25. P. 522-532.

69. Lee Y.S., Nakahara K, Pham J. W., Kim K, He Z, Sontheimer E.J., Carthew R.W. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways // Cell. 2004. V. 117. P. 69-81.

70. Lei E.P., Corces V.G. RNA interference machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator // Nat Genet. 2006. V. 38. P. 936-941.

71. Lund E., Giittinger S., Calado A., Dahlberg J.E. and Kutay U. Nuclear export of microRNA precursors // Science. 2004. V. 303. P. 95-98.

72. Lyubomirskaya N. V, Arkhipova I.R., Ilyin Y. V, Kim A.I. Molecular analysis ofthe gypsy (mdg4) retrotransposon in two Drosophila melanogaster strains differing by genetic instability II Mol. Gen. Genet. 1990. V. 223. P. 305-309.

73. Lyubomirskaya N. V., Smirnova Y.B., Avedisov S.N., Surkov S.A., Ilyin Y. V. Comparative analysis of structure and retrotrasposition activity in two Drosophila mobile element mdg4(gypsy) II Molecular Biology. 1998. V. 32. P. 689-694.

74. Malone C.D., Brennecke J., Dus M., Stark A., McCombie W.R., Sachidanandam R., Hannon G.J. Specialized piRNA pathways act in germline and somatic tissues of the Drosophila ovary // Cell. 2009. V. 137. P. 522-535.

75. Margaret G. Kidwell and Damon Lisch Transposable elements as sources of variation in animals and plants I I Proc Natl Acad Sci USA. 1997. V. 94. P. 7704-7711.

76. Marlor R.L., Parkhurst S.M., Corces V.G. The Drosophila melanogaster gypsy transposable element encodes putative gene products homologous to retroviral proteins //Mol. Cell. Biol. 1986. Vol. 6. P. 1129-1134.

77. Mazo A., Misrohi L., Karavanov A., Sedkov. Y., Krichevskaja A.A., Ilyin Y. V. Suppression in Drosophila : su(Hw) and su(f) gene products interact with a region of gypsy regulating its transcriptional activity // EMBO J. 1989. V. 8. P. 903-911.

78. Measter G., Tuschl M. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA //Nature. 2004. V. 431. P. 343-349.

79. Mevel-Ninio M., Pelisson A., Kinder J., Campos A.R., Bucheton A. The flamenco locus controls the gypsy and ZAM retroviruses and is required for Drosophila oogenesis // Genetics. 2007. V. 175. № 4. P. 1615-1624.

80. Miklos G.L. and Cotsell J.N. Chromosome structure at interfaces between major chromatin types: alpha- and beta-heterochromatin // Bioessays. 1990. V. 12. P. 1-6.

81. Miller W.J., Capy P. Mobile genetic elements as natural tools for genome evolution // Methods Mol Biol. 2004. V. 260 P. 1-20.

82. Molodell J., Bender W., Meselson M.M. Drosophila melanogaster mutations suppressible by the suppressor of Hairy-wing are insertions of a 7.3-kilobase mobile element//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 1678-1682.

83. Moshkovich N., Lei E.P. HP1 recruitment in the absence of argonaute proteins in Drosophila // PLoS Genet. 2010. 6(3):el000880.

84. Murray M. V., Turnage M.A., Williamson K.J., Steinhauer W.R., Searles L.L. The Drosophila suppressor of sable protein binds to RNA and associates with a subset of polytene chromosome bands // Mol Cell Biol. 1997. V. 17. P. 2291300.

85. Nakayama J., Rice J.D., Strahl B.D., Allis C.D. and Grewal S.S. Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly//Science. 2001. V. 292. P. 110-113.

86. Pai C. V., Lei E.P., Ghosh D., Cor ces V.G. The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator // Mol Ceil. 2004. V. 16. P. 737748.

87. Palladino M.J., Keegan L.P., O'Connel M.A., Reenan R.A. dADAR, a Drosophila double-stranded RNA-specific adenosine deaminase is highly developmentally regulated and is itself a target for RNA editing // RNA. 2000. V. 6. P. 1004-1018.

88. Parkhurst S.M., Cor ces V.G. Mutations at the suppressor of forked locus increase the accumulation of gy/zsy-encoded transcript in Drosophilamelanogaster II Mol Cell Biol. 1986b. V. 6. P. 2271-2274.

89. Peng X. and Mount S.M. Characterization of Enhancer-of-White-Apricot in Drosophila Melanogaster//Genetics. 1990. V. 126. P. 1061-1069. eymajiHTL

90. Piron M., Vende P., Cohen J. and Poncet D. Rotavirus RNA-binding protein NSP3 interacts with eIF4GI and evicts the poly(A) binding protein from eIF4F //EMBO J. 1998. V. 17. P. 5811-5821.

91. Prud'homme N., Gans M, Terzian C., Bucheton A. Flamenco, a gene controlling the gypsy retrovirus of Drosophila melanogaster II Genetics. 1995. Vol. 139. P. 697-711.

92. Rea S., Eisenhaber F., O'Carroll D., Strahl B.D., Sun Z.W., Schmid M„ Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P., Allis C.D., Jenawein T. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases // Nature, 2000. V. 406. P. 593-599.

93. Reiss D., T. Josse T., D. Anxolabehere D. and Ronsseray S. aubergine mutations in Drosophila melanogaster impair P cytotype determination by telomeric P elements inserted in heterochromatin // Mol. Genet. Genomics. 2004. V. 272. № 3. P. 336-343.

94. Reuter G., Spierer P. Position effect variegation and chromatin proteins // Bioessays. 1992. V. 14. P. 605-612.

95. Robert V., Prud'homme N. Kim A., Bucheton A., Pelisson A. Characterization of the flamenco Region of the Drosophila melanogaster Genome // Genetics.2001. V. 158. P. 701-713.

96. Ronshaugen M., Biemar F, Piel J., Levine M., Lai E.C. The Drosophila microRNA iab-4 causes a dominant homeotic transformation of halteres to wings // Genes Dev. 2005. V. 19. P. 2947-2952.

97. Rotondo G. and Frendewey D. Purification and characterization of the Pacl ribonuclease of Schizosaccharomyces pombe // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 2377-2386.

98. Sarot E., Payen-Groschene G., Bucheton A., Pelisson A. Evidence for a piwi-dependent RNA silencing of the gypsy endogenous retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco gene // Genetics. 2004. V. 166. P. 13131321.

99. Saunders L.R., Barber G.N. The dsRNA binding protein family: critical roles, diverse cellular functions // FASEB J. 2003. V. 17. P. 961-983.

100. Savitsky M., Kwon D., Georgiev P., Kalmykova A., Gvozdev V. Telomere elongation is under the control of the RNAi-based mechanism in the Drosophila germline // Genes Dev. 2006. V. 20. P. 345-354.

101. Schmidt T. LINEs, SINEs and repetitive DNA: non-LTR retrotransposons in plant genomes // Plant Mol Biol. 1999. V. 40, P. 903-910.

102. Schotta G., Ebert A., Krauss K, Fischer A., Hoffmann J., Rea S., Jenuwein T., Dorn R., Renter G. Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing // EMBO J. 2002. V. 21. P. 1121-1131.

103. Simmons M.J., Ryzek D.F., Lamour C., Goodman J.W., Kummer N.E., Merriman P.J. Cytotype regulation by telomeric P elements in D.melanogaster evidence for involvement of an RNA interference gene // Genetics. 2007. V. 176. №4. P. 1945-1955.

104. SmitA.F. Interspersed repeats and other mementos of transposable elements in mammalian genomes. // Curr. Opin. Genet. Dev., 1999, Vol. 9, 657-663.

105. Smith P.A., Corces KG. The suppressor of Hairy-wing protein regulates thetissue-specific expression of the Drosophila gypsy retrotransposon // Genetics. 1995. V. 139. P. 215-228.

106. Sneddon A. and Flavell A. The transcriptional control region of the copia retrotransposon//Nucleic acids Res. 1989. V. 17. P. 4025-4035.

107. Song J.J., Smith S.K., Hannon G.J., Joshua-Tor L. Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. // Science, 2004, Vol. 305, 1434-1437.

108. Song S.U., Gerasimova T, Kurkulos M, Boeke J.D., Corces V.G. An env-like protein encoded by a Drosophila retroelement: evidence that gypsy is an infectious retrovirus // Genes Dev. 1994. V. 8. P. 2046-2057.

109. Spana C., Harrison D.A., Corces V.G. The Drosophila melanogaster suppressor of Hairy-wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon // Genes Dev. 1988. V. 2. P. 1414-1423.

110. Szweykowska-Kulinska Z., Jarmolowski A., Figlerowicz M. RNA interference and its role in the regulation of eucaryotic gene expression // Acta Biochim Pol. 2003. V. 50. № 1. P. 217-229. Review.

111. Tabar H., Sakissian M., Kelly W.G., Fleenor J., Grishok A., Timmons L., Fire A. and Mello C.C. The rde-1 gene, RNA-interference, and transposon silencing in C.elegans // Cell. 1999. V. 99. P. 123-132.

112. Vaury C., Bucheton A. and Pelisson A. The beta-heterochromatic sequences flanking the I elements are themselves defective transposable elements // Chromosoma. 1989. V. 98. P. 215-224.

113. Wang G., Ma A., Chow C.-M., Horsley D., Brown N.R., Cowell I.G. and Singh

114. P.B. Conservation of heterochromatin protein 1 function // Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P. 6970-6983.

115. Wilson S., Matyunina L. V. and McDonald J.F. An enhancer region within the copia untranslated leader contains binding sites for Drosophila regulatory proteins // Gene. 1998. V. 209. № 1-2. P. 239-246.

116. Yun Y. and Davis R. Copia RNA levels are elevated in dunce mutants and modulated by cAMP //Nucleic acids Res. 1989. V. 17. P. 8313-8326.

117. Ziarzyk P., Best-Belpomme M. A short 5' region of the long terminal repeat is required for regulaton by hormone and heat shock of Drosophila retrotransposon//Nucleic acids Res. 1991. V. 1731. P. 5689-5693.8. Благодарности

118. Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н., профессору А.И.Киму за помощь на всех этапах выполнения работы, к.б.н. Л.Н.Нефедовой за неоценимую помощь и внимательное отношение.

119. Огромную благодарность автор выражает коллективу лаборатории и кафедры.