Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение некоторых особенностей эксперсии гена CFTR и разработка экспериментальных подходов к генотерапии муковисцидоза

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение некоторых особенностей эксперсии гена CFTR и разработка экспериментальных подходов к генотерапии муковисцидоза"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК 575:599,577:213.1

РГЗ од

2 9 ДЗГ Ш

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА СРТИ И РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПОДХОДОВ К ГЕНОТЕРАПИИ МУКОВИСЦИДОЗА

специальность: 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 2000

Работа выполнена в лаборатории пренатальной диагностики

наследственных болезней человека Института акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта РАМН.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

профессор,

доктор медицинских наук В.С.Баранов

профессор,

доктор биологических наук

A.ГШеревозчиков

доктор биологических наук

B.Н.Горбунова

Институт цитологии РАН

Защита диссертации состоится "б> 2000 г. в 77 часов на

заседании Диссертационного совета Д.063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

ЕМ3.1. о

Л. А. Мамон

р 0 М V *

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Муковисцидоз - МВ (кистозиый фиброз поджелудочной железы) одно из наиболее распространенных, моногенных, наследственных болезней человека, наследуемое по аутосомпо-рецессивному типу. Причиной МВ являются нарушения транспорта ионов в эпителиальных клетках всех экзокринных желез. При МВ поражены в основном две системы - бронхолегочная и пищеварительная. Причиной этих нарушений являются мутации гена МВ, которых на сегодняшний день в мире идентифицировано свыше 900.

Ген картирован на длинном плече хромосомы 7, идентифицирован и охарактеризован его белковый продукт, получивший название трансмембранного регуля горного белка муковисцидоза (СЕГЯ).

Частота заболевания в разных популяциях, нациях и этнических группах существенно варьирует, составляя в среднем 1 : 2-2500 новорожденных у представителей белой расы. По оценкам Всемирной Организации Здравоохранения в мире ежегодно рождается 45-50,000 детей с МВ. Каждый 25-й представитель европейской расы является носителем мутации в гене МВ. Считается, что ежегодно в России рождается около 750 детей больных этим заболеванием.

Несмотря на значительные успехи медикаментозного лечения МВ генная терапия является одним из перспективных и многообещающих способов лечения этого тяжелого смертельного заболевания. В настоящее время исследования по генной терапии МВ проводятся во многих научных центрах, в 10-ти из которых они уже находятся на стадии клинических испытаний. Доставка экспрессирующих конструкций с кДНК гена СРШ осуществляется с помощью различных вирусных или невирусных носителей, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Поэтому поиск новых носителей, обеспечивающих эффективную и безопасную доставку кДНК гена СБТЯ в клетки дыхательного эпителия остается весьма актуальным.

Для оценки эффективности клинических испытаниях по генной терапии, а также с целью разработки новых лабораторных тестов для диагностики МВ в последнее время с успехом применяют иммуноцитохимические и электрофизилогические методы. В настоящее время основным лабораторным методом диагностики МВ в лечебно-диагностических учреждениях России остается измерение хлоридов потовой жидкости. Нередко, однако, содержание хлоридов пота находится в пределах нормы при выраженных клинических проявлениях МВ. Кроме того, встречаются случаи повышенных значений хлоридов пота у некоторых больных с неспецифическими хроническими заболеваниями легких. Примерно у трети отечественных пациентов не удается

идентифицировать мутаций в гене CFTR, а показатели потового теста у них неоднозначны. Поэтому, использование новых лабораторных тестов для диагностики МВ и разработки экспериментальных подходов к генной терапии этого заболевания представляются весьма актуальными.

Цели и задачи исследования. Цель - определить возможность использования иммуногистохимических и электрофизиологических тестов для анализа экспрессии гена CFTR и синтетического полимера VSST-25 в качестве невирусного носителя при разработке экспериментальных подходов к генотерапии МВ.

Для достижения данной цели были определены следующие задачи:

1. Методом иммуногистохимии изучить локализацию белкового продукта гена CFTR в клетках назального эпителия у здоровых индивидуумов и больных МВ с различными мутациями этого гена.

2. Сравнить значения разности назальных потенциалов у больных МВ и у больных с хроническими неспецифическими заболеваниями легких (контрольная группа).

3. Подобрать оптимальные условия для упаковки плазмидной ДНК при помощи синтетического полимера VSST-25 и проанализировать внутриклеточную локализацию комплексов $HK/VSST-25.b экспериментах in vitro.

4. Изучить возможность доставки маркерного гена LacZ в различные органы и ткани лабораторных мышей с помощью полимерного носителя -VSST-25 в экспериментах in vivo.

Научная новизна. Впервые в России у больных МВ с различными мутациями гена CFTR методом иммуногистохимии изучена локализация CFTR в клетках назального эпителия; установлено, что локализация этого белка у больных МВ отличается от таковой в контрольной группе; отмечена определенная корреляции концентрации и распределения белка в цитоплазме эпителиальных клеток в зависимости от типа мутационных повреждений гена CFTR.

Впервые проведены измерения назальных потенциалов у больных МВ России; показано, что значения разности назальных потенциалов у больных МВ достоверно отличаются от таковых у больных, страдающих хроническими неспецифическими заболеваниями легких.

Впервые в работах по генной терапии муковисцидоза изучена способность полимерного носителя VSST-25 служить средством доставки маркерного гена LacZ в клетки дыхательного эпителия легких мышей в условиях внутриназального введения; впервые продемонстрирована доставка маркерного гена LacZ и кДНК гена CFTR в легкие и другие органы

плодов мышей в условиях внутрибрюшинного введения беременным самкам и внутриамниатического введения зародышам.

Практическая значимость работы: Согласно нашим данным гистохимический анализ белкового продукта гена СЕТИ в биоптатах назального эпителия, равно как и измерение разности назальных потенциалов могут служить дополнительными и высоко информативными лабораторными тестами для дифференциальной диагностики МВ, особенно в тех случаях, когда клиническое обследование, стандартные лабораторные тесты (значения хлоридов пота) и ДНК-анализ гена СРТЯ не дают однозначных результатов. Учитывая сравнительно низкую частоту выявляемости мутаций в гене СПИ у больных МВ в России (около 70-75%), методы измерения РНП и анализ СПИ в биоптатах назального эпителия могут быть рекомендованы для уточнения диагноза МВ в спорных случаях.

Полученные в работе дшпвде о направленной доставке в эпителиальные клетки бронхов и бронхиол мышей и продолжительной экспрессии (до двух месяцев) маркерных генов LacZ в составе синтетического полимера после однократного внутриназального введения свидетельствуют о перспективности использования оригинального носителя У88Т-25 для доставки генетических конструкций с целью лечения муковисцидоза.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены на Международной конференции аспирантов и студентов «Ломоносов-98» (МГУ, 1998), XXII Европейской конференции по муковисцидозу (Берлин, 1998), Международной конференции молодых ученых (Люблин (Польша), 1998), VIII итоговой конференции «Геном человека-98» (Черноголовка, 1998), VI совещании Европейской рабочей группы по изучению генной терапии человека (Иерусалим, 1998), II Американском ежегодном совещании по генной терапии (Вашингтон, 1999), IX итоговой конференции «Геном человека-99» (Черноголовка, 1999), IX Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1999), П съезд Всероссийского общества генетиков и селекционеров (С-Петербург, 2000).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах, содержит 5 таблиц и 26 рисунка. Работа состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследовано тринадцать больных муковисцидозом в возрасте от 5 до 23 лет (средний возраст 17 лет), в т.ч. 9 мужчин (мальчиков) и 4 женщины (девочки), состоящих на учете в Центре диагностики и лечения муковисцидоза Института пульмонологии при Санкт-Петербургской

б

государственной медицинской академии им. И.П.Павлова РАМН и в отделении пульмонологии Детской городской больницы № 4 им.Святой Ольги (г.Санкт-Петербург). Дифференциальную диагностику MB и оценку тяжести его течения проводили специалисты вышеуказанных центров.

Идентификация мутаций гена CFTR проведена методом полимеразной цепной реакции. Исследованные больные MB имели следующие генотипы: 9-delF508/delF508; l-delF508/W1282X; l-delF508/1366del, 1-N1303K/2143deIT, 1- delF508/3732delA.

Контрольная группа состояла из 15 человек не имеющих диагноз MB (больные с хроническими неспецифическими заболеваниями легких (хроническим бронхитом, бронхоэктатической болезнью, бронхиальной астмой, облитерирующим бронхиолитом)). В контрольную группу вошли индивидуумы в возрасте от 7 до 34 лет (средний возраст 25 лет) из них 6 мужчин (мальчиков) и 9 женщин (девочек)

Измерение разницы назальных потенциалов (РЫТ) проводили по методу M.Knowels с соавторами (Knowels, et al., 1981). Показания измерений в милливольтах (mV) определяли с помощью вольтметра. Регистрировали стабильное максимальное значение РНП. Больные на момент измерения РНП не имели признаков острых респираторных заболеваний и травм носовой полости.

Для анализа локализации белкового продукта гена CFTR в клетках назального эпителия человека использованы моноклональные антитела MATG 1061 (Transgene, Франция), специфичные к последовательности NBF1 домена CFTR белка (503-515 а/к) (Dupuit, et al., 1995). Материал для исследования получали из средней части носовой полости методом полипэктомии ("выщипывания").

При разработке экспериментальных подходов к генотерагии муковисцидоза использованы: плазмида, содержащая кДНК гена CFTR (pTG5985), две плазмиды с маркерным геном LacZ с цитоплазматической (pCMV-LacZ) и ядерной (pCMV-nlsLacZ) локализацией продукта экспрессии (р-галактозидазы). В качестве контроля использовали ллазмиду pCMV-luc содержащую кДНК гена люциферазы. Все плазмиды любезно предоставлены д-ром B.Scholte (Erazmus University, Rotterdam, The Netherlands).

Для доставки плазмид был использован оригинальный полимерный носитель VSST-25, любезно предоставленный компанией "Биосистема XXI" (Санкт-Петербург). Упаковку ДНК проводили методом комплексной коацервации с последующей сушкой.

Эксперименты in vitro выполнены на культуре клеток мышиных миобластов линии L69 (любезно предоставлены д-ром B.Scholte (Erazmus University, Rotterdam, The Nethelands)). В условиях in vivo работа выполнена на 4-6 недельных весом 20-25 гр мышах гибридной линии CBA/C57BL, полученных из питомника "Рапполово" (Ленинградская область).

Генетические конструкции животным доставляли следующими способами: внутриназально, внутрибрюшино и внутриамниатически беременным самкам. Внутриназальное введение осуществляли с помощью тонкой пластмассовой пипетки. Опытных животных (VSST-25/pCMV-LacZ или VSST-25/pCMV-nlsLacZ) и контрольных (VSST-25/pCMV-luc, "несвязанная" плазмида, интакгные) забивали одновременно на разных сроках после введения (от 24 часов до 60 дней). На каждую экспозицию использовано по 3 животных. Экспрессию гена LacZ в разных тканях оценивали количественно по наличию ß -галахтозидазы на разных сроках после введения. Визуально локализацию экспрессии гена LacZ изучали как на тотальных органах, так и на гистологических препаратах.

Количественную оценку активности ß-галахтозидазы в условиях in vivo проводили по методу, описанному Kaplan с соавторами (Kaplan et al.1997). Выявление ß-галактозидазы на тотальных препаратах и замороженных гистологических срезах проводили по стандартной методике (Bout, et al., 1993).

Проведена специальная серия опытов по изучению возможностей доставки и экспрессии кДНК гена CFTR и маркерного гена LacZ в составе полимерного комплекса в ткани плода беременных мышей. Генетические комплексы на основе синтетических микросфер, содержащие обе плазмиды (pTG5985 и pCMV-LacZ), вводили на 17 день беременности. Ткани и органы анализировали у новорожденных мышей. Особенности трансфекции тканей плода изучены в условиях внутрибрюшинного и внутриамниотического введения генетических конструкций.

Анализ внутриклеточной локализации генетических конструкции VSST-25/ДНК in vivo проводили методом гибридизации in situ, где в качестве ДНК-зонда использована биотинилированная конструкция плазмидной ДНК (pCMV-LacZ). Гибридизационпые сигналы идентифицировали с помощью копъюгата авидин-FITC (флуоресцеинизотиоцианатом).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Измерение разности назальных потенциалов. На рисунке 1 представлены значения измерений назальных потенциалов в норме и у . больных MB. Были обнаружены статистически достоверные отлнчля РНП в контрольной группе и у больных MB (р<0,001). Так, значения РНП у больных MB составили в среднем -44,7±2,2 mV (пределы от -32,5 mV до -68,9 mV), в контрольной группе -17,2±1,8 mV (пределы от-6,8 mV до -30,2 mV). Не было зарегистрировано разницы величин РНП в зависимости от пола в обеих группах. В то же время у 3-х человек контрольной группы было отмечено повышение хлоридов пота (66-74 ммоль-л *'), однако, РНП у них была в норме (-6,8 mV, -16,2 mV, -22,0 mV). Это еще раз подтвердило надежность использования РНП в диагностике MB.

Как известно, в настоящее время измерение хлоридов потовой жидкости остается практически единственно доступным методом диагностики MB в

ряде лечебно-диагностических учреждений России. Принимая во внимание случаи нормальных или пограничных значений хлоридов потовой

Рис.1. Распределение измерений разности назальных потенциалов в корме и у больных МВ с различными генотипами.

жидкости у больных МВ, повышение значений хлоридов пота у некоторых больных, страдающих хроническими неспецифическими заболеваниями легких, возникает необходимость дополнительных, более чувствительных диагностических тестов.

РНП отражает основной функциональный дефект при МВ и, по нашим данным, является дополнительным, информативным и доступным методом диагностики МВ. Благодаря этому методу, уже сейчас на базе Института пульмонологии при Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.П.Павлова удается решать спорные вопросы при диагностике МВ в тех случаях, когда клиническое обследование, стандартные лабораторные тесты (хлориды пота) и ДНК-анализ гена СРТЯ не дают однозначных результатов. Учитывая сравнительно низкую частоту выявления мутаций при МВ в России (около 70-75%), метод анализа РНП может быть рекомендован для уточнения диагноза МВ в спорных случаях.

Анализ локализации белкового продукта гена СРТЛ в назальном эпителии. Результаты нммуногистохимического анализа биоптатов назального эпителия в контроле и у больных МВ приведены на рисунке 2. В норме СПИ белок четко локализован в апикальной мембране реснитчатых клеток назального эпителия (рис 2 а). Локализации СРШ у больных МВ заметно отличается от таковой в контрольной 1руппе. Во всех образцах назального эпителия пациентов с МВ белок СРТИ. присутствовал только в цитоплазме эпителиальных клеток, но не определялся в апикальной мембране (рис. 2 б, в). При этом у больных МВ с генотипом <1е1Р508/Уе1Р508 и ёе1Г508ЛУ1282Х отмечалось заметное снижение экспрессии гена СРТ11. У больных МВ с генотипами (1е1Р508/1366с1е1,

М1303К/2143<1е1Т, delF508/3732delA по интенсивности специфичного ярко-зеленого РТТС свечения можно судить о высокой концентрации СПИ белка в цитоплазме. Полученные результаты подтверждают данные о наличии четких морфологических отличий в локализации белкового продукта гена СПИ в назальном эпителии у больных МВ и у здоровых. Более того, концентрация и распределение этого белка в цитоплазме эпителиальных клеток коррелирует с типом мутационного повреждения гена СРТК.

Следовательно, согласно нашим данным гистохимический анализ белкового продукта гена СЕГО в биоптатах назального эпителия, равно как и измерение разности назальных потенциалов могут служить дополнительными и высокоинформативными лабораторными тестами для дифференциальной диагностики МВ.

Рис.2. Михрофоттарафии яртостагных срезов биоптатов назального эпителия в норме и у больных МВ с различными генотипами: а-иорма (стрелками показана локализация СПИ в апикальной мембране реснитчатых клеток назального эпителия), {н1е1Р508/<1с1Р508; в- йе1Р508/13б&1е15 после иммуногистохамической окраски. Увеличение х 1000.

Оптимизация упаковки плазмидной ДНК в полимер У55Т-25. Эффективность сборки оценивали по уменьшению электрофоретнческой

а.

«

подвижности плазмидной ДНК в 0.8% агарозном геле. Показано, что образование комплекса ДНК/полимер увеличивалось в зависимости от количества полимерного носителя. Связывание плазмидной ДНК носителем близкое к 100% отмечается в пропорции 1:2000 количества полимера по отношению к плазмидной ДНК. В дальнейших исследованиях мы использовали именно это соотношение ДНК/полимер. Методом электронной микроскопии показано, что при этом соотношении ДНК/полимер, полученные комплексы имеют сферическую форму, и их размер составляет около 2.0 мкм.

Анализ внутриклеточной локализации комплексов HHK/VSST-25 в опытах in vitro. Плазмидную ДНК (pCMV-luc), меченную FITC, в составе полимерного комплекса, вводили в культуру клеток линии L69 (мышиные миобласты) и инкубировали в течение 6 и 24 часов. Методом флуоресцентной микроскопии показано, что уже через б часов после добавления полимерных комплексов в культуру клеток конструкция VSST-25/pCMV-luc/FITC проникает в цитоплазму и ядра примерно в 810% клеток, а через 24 часа в 75-80% клеток. Полученные результаты продемонстрировали ядерную доставку генетической конструкции VSST-25/pCMV-luc/FITC в экспериментах in vitro.

Для доказательства феномена ядерной доставки генетических конструкций в экспериментах in vitro был использован метод конфокальной микроскопии. С помощью этого метода на серийных конфокальных изображениях выявлено специфическое ярко-зеленое свечению FITC в ядрах клеток, что позволяет с уверенностью говорить о ядерной локализации полимерных комплексов.

Какой механизм обеспечивает столь высокое сродство использованных нами конструкций к ядрам клеток остается неизвестным. Нет сомнений, однако, что полученные нами данные о направленной ядерной доставке генетических конструкций flHK/VSST-25 в экспериментах in vitro указывают на перспективность использования оригинального синтетического полимера VSST-25 в качестве невирусного носителя ДНК в генотерапевтических исследованиях.

Доставка маркерного гена LacZ в легкие мыши при помощи полимера VSST-25. Принимая во внимание высокую трансфецирующую способность комплексов ДНК/полимер в экспериментах in vitro, была изучена возможность использования данного носителя в качестве средства доставки генетических конструкций в клетки дыхательного эпителия легких мышей.

Методом гибридизации in situ было показано, что через 7 дней после внухриназального введения комплексы flHK/VSST-25 локализуются преимущественно в клеточных ядрах. Четкий положительный сигнал выявлен примерно у 45-50% ядер клеток легкого. Эти данные,

подтверждают результаты, полученные в экспериментах in vitro, и свидетельствуют о большой тропности исследуемого полимера к ядру.

На рис.3 представлены количественные показатели уровня экспрессии маркерного гена LacZ на 1, 7, 14, 21 и 60-й дни после внутрииазального введения "несвязанной" плазмиды pCMV-LacZ или комплекса VSST-25/pCMVLacZ. На рисунке приведены результаты интактного контроля. Как следует из приведенных данных, во всех изученных тканях (эпителий носа, трахея, легкие) Р-галактозидазная активность через 24 часа после введения комплекса VSST-25/pCMVLacZ оставалась на уровне фона, т.е. соответствовала таковой у интактных мышей. Существенно, что наиболее высокие показатели Р-галактозидазной активности зарегистрированы в обеих легких подопытных мышей на 14-й и 21-й день после введения комплекса VSST-25/pCMVLacZ, достоверно (р<0.05) отличаясь от контроля (г :у.:дение "несвязанной" плазмиды pCMV-LacZ) и с высокой

Рис.3. Количественная зависимость экспрессии маркерного гена pCMV-LacZ в различных органах (A-нос; Б-трахея; В-левая доля легкого; Г-правая доля легкого) через различные периоды времени после однократного внутриназзльного введения. Примечание: . VSST-25/pCMVLacZ; - «голая» pCMVLacZ;

—- интактный контроль.

достоверностью (р<0.01) отличаясь от интактного контроля. В дальнейшем экспрессия LacZ во всех проанализированных тканях снижается, однако даже на 60-й день она остается примерно в 1.5 раза выше контрольной. Столь продолжительная экспрессия маркерного гена пока не достигнута в экспериментах in vivo ни с одним из изученных ранее невирусных

носителей (Wheeler, et al., 1996; Griesenbach, et al., 1998; Raczka, et al., 1998; Yew, et al., 1999).

Динамика экспрессии LacZ в экспериментах с "несвязанной" плазмидой отличается от таковой при введении комплекса. Уже через 24 часа уровень ß-галактозидазы выше таковой у интакгаых мышей и мышей, получивших плазмиду в комплексе с VSST-25. В дальнейшем во всех проанализированы« тканях она быстро снижается, приближаясь к уровню интакгного контроля уже к 3-й неделе после введения.

Столь обнадеживающие количественные результаты стимулировали проведение экспериментов по выяснению более точной тканевой локализации клеток, экспрессирующих ß-галактозидазу. Основываясь на результатах количественной оценки уровня экспрессии гена LacZ, анализ проводили через 14 дней после введения конструкции. Как видно на Рис.4 яркая окраска, свидетельствующая о высокой концентрации маркерного белка ß-галактозидазы, в цитоплазме эпителиальных клеток бронхиол и альвеол обнаруживается только на криостатных срезах легких после внутриназального введения VSST-25/pCMVLacZ (Рис.4а). Она не выявляется на срезах легких после введения комплекса VSST-25/pCMV-luc (контроль) (Рис.4б).

Рис.4. Гистохимический анализ р-галакгозидазы на криостатных срезах легкого через 14 дней после внутриназального введения комплексов У58Т-25/рСМУ- Ьас2 (А) и У88Т-25/рСМУ-1ис (Б) (контроль). Локализация позитивного 0-галакгозидазного сигнала в эпителиальных клетках бронхиол и альвеол показана стрелками. Увеличение

На тотальных препаратах просветленной ткани легкого на 14-день после интраназального введения комплекса У88Т-25/рСМУ-Ьасг характерной синей окраской определялся рисунок бронхиального дерева (Рис.5а). В контроле после введения конструкции УБ8Т-25/рСМ\Чис специфический сигаал выявлен не был (Рис.5б).

х200.

Рис.5. Гистохимический анализ р-галакгозидазы на тотальных препаратах легкого мышей через 14 дней после вяутриназального введения комплексов VSST-25/pCMV-LacZ (а) и VSST-25/pCMV-luc (б) (контроль). Четко виден рисунок бронхиального дерева легких в клетках которого экспрессируется р-галактозидаза. Увеличение х 60.

Еще более четкие результаты гистохимического анализа получены в экспериментах с плазмидой pCMV-nlsLacZ, характеризующейся специфической внутриядерной локализацией р-галактозидазы. На 14-й день после введения комплекса VSST-25/pCMVnIsLacZ были выявлены отдельные ядра альвеолярных клеток, активно экспрсссирующих ген LacZ. В контроле специфический сигнал не выявляли.

Результаты подсчета числа альвеол, содержащих положительные по окраске на р-галактозидазу ядра, приведены в Табл.1. Из данных таблицы видно, что в среднем на срез число альвеол, экспрессирующих р-галактозидазу составляет около 3%, что почти в 3-6 раз больше, чем в экспериментах по трансфекции легкого мышей геном LacZ с использованием катионных липосом GAP-DLRIE/DOPE (Wheeler, et al., 1996).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что маркерный ген LacZ в составе различных экспрессирующихся конструкций, доставленный интраназально с помощью полимера VSST-25 в дыхательные пути лабораторных мышей, способен к трансфекции эпителиальных клеток носа, трахеи, бронхов и даже бронхиол. При этом динамика экспрессии гена LacZ в комплексе с полимером VSST-25 обнаруживала весьма характерные особенности: она достаточно медленно нарастала во всех изученных тканях, достигала макисмума к 7-14 дням и затем постепенно снижалась, оставаясь, однако, вполне реальной даже спустя 2 месяца. При введении "несвязанной" плазмиды pCMV-LacZ, как отмечено в наших экспериментах и в работах других авторов максимумы экспрессии гена LacZ приходятся уже на первые сутки после введения, после чего ее

Таблица 1. Относительное количество травсфяцврованных LacZ клеток в легких мышей.

Генетическая конструкция Число проаналюи-po ванных срезов Среднее количество альвеол на срез Среднее количество LacZ+ альвеол на срез Средний процент LacZ+ альвеол на срез

VSST25/pCMV-nlsUcZ 75 3069 70.07 ±19.97 2.28 ±0.65

VSST25/pCMV-nlsLacZ 88 3124 84.36 ±24.55 2.70 ±0.79

VSST25/pCMV-nlsLacZ «7 2782 94.36 ±26.94 3.39 ±0.96

VSST25/pCMV-kc 72 3250 0 0

VSST25/pCMV-luc 59 2375 0 0

интенсивность быстро падает. Подобный "пролонгированный" вариант экспрессии генной конструкции, доставленной полимером VSST-25, ранее нами зарегистрирован в опытах in vivo после введения кДНК гена дистрофика в мышцы и, по-видимому, определяется необходимостью, по крайней мере, частичного внутриядерного растворения полимера прежде чем, содержащиеся в них конструкции становятся доступными для транскрипции (Baranov, et al., 1999).

Данный феномен заслуживает специального изучения. Отметим только, что при использовании других невирусных носителей (катионные липосомы), а также аденовирусных конструкций с геном CFTR, уже проходящих клинические испытания продолжительность экспрессии чужеродных генов обычно не превышала одного месяца (Porteous, et al., 1997; Alton, et al., 1999).

Доставка плазмид pCMV-LacZ и pTG5985 беременным самкам мышей при помощи полимера VSST-25. Проведена специальная серия опытов по изучению возможностей доставки и экспрессии кДНК гена CFTR и маркерного гена LacZ в составе VSST-25 в ткани плода беременных мышей. Генетические комплексы, содержащие обе плазмиды (рГС5985 и pCMV-LacZ), вводили на 17 день беременности. Особенности трансфекции тканей плода изучены в условиях внутрибрюшинного и внутриамниотического введения генетических конструкций. Методом ПЦР, проанализировано наличие плазмиды pTG5985 в различных органах и тканях у новорожденных мышей. Кроме того, гистохимически была изучена экспрессия маркерного гена LacZ на криостатных срезах разных тканей новорожденных животных.

Методом гибридизации in situ утановлено, что при обоих способах введения конструкции VSST-25/pCMV-LacZ/pTG5985 достигают легкого новорожденного. В этом эксперименте показано, что генетические конструкции имеют преимущественно ядерную локализацию и способны преодолевать плацентарный барьер.

Внутриамниотическое введение генетической конструкции VSST-2S/pCMV-LacZ/pTG5985. Метод ПЦР позволил доказать присутствие генетической конструкции pTG5985 во всех проанализированных тканях и органах новорожденных, а именно; в легком, сердце, кишечнике, печени, селезенки, почках, щитовидной железе, мозге, в мочевом пузыре, яичнике, в мышцах передней и задней ног. На рис.6 приведена электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента кДНК гена CFTR в составе плазмиды pTG5985.

Рис.б. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента кДНК гена СПИ в составе плазмиды рТС5985 после ПЦР. Специфический дня плазмиды фрагмент (94 п.н.) отмечен стрелкой. Дорожки: 1- легкое, 2- сердце, 3-кишечник, 4-печень, 5-селезепка, 6-почка, 7-щитовидиая железа, 8-мозг, 9-мышца передней лапы, 10-мьшща задней лапы, 1)-мочевой пузырь, 12-яичник, 13-амплнфпкация ~ с 5 копий плазмиды, 14-амплификация ~ с 500 копий плазмиды.

Согласно полученным данным, после внутриамниотической инъекции генетическая конструкция, содержащая кДНК гена СБТИ, присутствовала во всех исследованных тканях. Методом полуколичественной ПЦР удалось оценить примерное число копий плазмиды рТС5985, доставленной с помощью У58Т-25 в каждую из этих тканей. На рисунке число копий приведено относительно 1 мкг суммарной геномной ДНК. Для установления числа копий плазмиды рТв5985 в исследуемых тканях приведены результаты амплификации примерно 5 и 500 копий этой

1 2 3 ! 5 6 ? S 9 ¡0 I! 12 И

дорожки

плазмиды. Как видно из рисунка, число копий плазмидной ДНК во всех проанализированных тканях новорожденных мышей варьировало от 10 до 100 копий.

Методом гистохимического анализа ¡З-галактозидазной активности выявлена экспрессия гена Ьас2 в кишечнике и легком новорожденных животных. Особенно высокий уровень экспрессии маркерного гена обнаружен в кишечнике. Это по-видимому, можно объяснить тем, что плод заглатывает амниотическую жидкость с генетическими конструкциями, и трансген поступает в кишечник, где частично всасывается, и распространяются по организму плода.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что после однократного внутриамниотического введения генетической конструкции У88Т-25/рСМУ-Ьасг/рТС5985 плазмидная ДНК не только достигает различные органы плода, но даже экспрессируется (на примере маркерного гена 1>а&) в таких пораженных при муковисцидозе органах, как кишечник и легкие.

Внутрибрюшинное введение генетической конструкции У88Т-25/рСМУ-Ьас2/рТ05985. Методом ПЦР показано, что введенная генетическая конструкция, содержащая кДНК гена СПИ, присутствовала в тканях легкого, сердца, почках, мозга, тимуса, мышц передней и задней лап новорожденных. Выявлено, что кДНК гена СРТП доставляется не во все ткани. На рис. '7 приведена электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента к ДНК гена СПЯ в составе плазмиды рТС5985.

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 И 12

дорожки

Рис.7. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента кДНК гена СГТЯ в составе плазмиды рТй5985 после ПЦР. Специфический для плазмиды фрагмент (94 п.в.) отмечен стрелкой. Дорожки: 1- легкое, 2-сердце, 3-кишечник, 4-печенъ, 5-селезенка, 6-почка, 7-мозг, 8-мышца передней лапы, 9-ыышца задней лалы, 10-тимус, 11-амплифихация я с 500 копий плазмиды, 12-амплифнкация « с 5 копий плазмиды.

Используя метод полуколичественной оценки продуктов амплификации, удалось приблизительно оценить число копий введенной плазмиды в 1 мкг суммарной геномной ДНК в каждой из исследованной ткани. Выявлено, что в выше перечисленных органах на 1 мкг суммарной геномной ДНК присутствуют лишь единичные копии плазмиды рТС5985. Однако наличие положительного сигнала после проведения ПЦР позволяет однозначно говорить о том, что синтетические полимерные комплексы, содержащие генетические конструкции, при внутрибрюшинном введении беременным мышам эффективно преодолевают плацентарный барьер и достигают тканей плода.

Во всех исследованных органах новорожденных животных была изучена экспрессии маркерного гена Ьасг. Однако ни на одном из криостатных срезов не было выявлено специфической синей окраски, свидетельствующей об экспрессии маркерного гена. Это можно объяснить сильным разбавлением пробы после внутрибрюшинного введения беременным мышам.

Таким образом, результаты экспериментов как при внутриамниотическом, так и при внутрибрюшинном введении доказывают перспективность использования синтетических микросфер для доставки генетических конструкций в ткани плода. Нет сомнений, что уже сейчас данный носитель заслуживает самого пристального внимания.

ВЫВОДЫ

1. Концентрация и распределение белка CFTR в цитоплазме клеток назального эпителия больных MB отличаются от нормы и обнаруживают определенную корреляцию с типами мутационных повреждений гена CFTR.

2. Иммуногистохимический анализ белкового продукта гена CFTR в биоптатах назального эпителия и измерение разности назальных потенциалов могут служить дополнительными высоко информативными тестами для дифференциальной диагностики MB.

3. Результаты опытов in vitro и in vivo по исследованию внутриклеточной локализации комплексов плазмидной ДНК в составе микросфер (МФ), полученных на основе синтетического полимера VSST-25, доказывают их высокую тропность к ядру.

4. Трансфекция клеток легкого и других органов у плодов лабораторных мышей может быть достигнута как при внутрибрюшинном введении генетических комплексов беременным самкам, так и в условиях их внутриамниотического введения.

5. Локализация и продолжительность экспрессии маркерных генов LacZ в составе полимерного носителя VSST-25 в экспериментах in vivo свидетельствуют о перспективности использования МФ для доставки генетических конструкций с целью лечения муковисцидоза и, возможно, других хронических заболеваний легких.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. AJBaranov, P.Glazkov, A.Kiselev, O.Ostapenko, V.Mikhailov, T.Ivaschenko, V.Sabetsky, V.Baranov Local and distant transfection of mdx muscle fibers with dystrophin and LacZ genes delivered in vivo by synthetic microspheres // Gene Therapy. 1999. V. 6. P. 1406-1414.

2. Глазков П.Б., Миткина E.H, Гембицкая Т.Е., Иващенко Т.Э., Орлов А.В., Баранов B.C. Взаимоотношения генотип-фенотип у больных муковисцидозом и разработка экспериментальных основ генотерапии этого заболевания // Пульмонология. 2000. № 1. С. 14-23.

3. Е.Н. Миткина, Т.Е. Гембицкая, АЛ. Фокина, ЕЛ Куприна, А.В. Орлов,П,Б. Глазков Измерение разности назальных потенциалов - новый, информативный тест для диагностики муковисцидоза//Пульмонология. 1999. №3. С. 50-54.

4. П.Б.Глазков, Т.Э.Иващенко, В.А.Сабетский, Боб Схольте, В.С.Баранов Экспрессия in vivo маркерных генов, доставленных в легкие мышей при помощи' синтетических микросфер // Генетика. 2000. Т.Зб. №4. С.444-450.

5. П.Б. Глазков, Т.Э. Иващенко, ЕЛ. Миткина, Т.Е. Гембицкая, А.В. Орлов, АГ. Черменский, В.С.Баранов. Корреляция результатов иммуноцигохимических, электрофизиологических и молекулярных исследований у больных муковисцидозом // Генетика. 2000. Т.Зб. №7.

6. Ivaschenko Т., Glazkov P., Baranov A. ,Sabetsky V., Baranov V. Comparative analysis of gene delivery to the lung cells of laboratory mice with different vehicles and by different administration routs // American Society of Gene Therapy. Is* Annual Meeting May 28-31,1998. P. 148a, Seattle, Washington.

7. Sabetsky V., Baranov V., Glazkov P., Kiselev A., Baranov V. New particulate gene delivery system for in vivo applications // American Society of Gene Therapy. Iй Annual Meeting May 28-31, 1998.P. 162a, Seattle, Washington.

8. Глазков П.Б. Особенности локализации трансмембранного белка муковисцидоза в назальном эпителии // Материалы международной конференции аспирантов и студентов, Москва, МГУ, 1998, С. 23.

9. Glazkov P., Ivaschenko Т. Immunohistochemical localization of the CFTR protein in cystic fibrosis nasal epithelium // International Medical Conference for Students and Young Doctors, Lublin, Poland, April 24-26, 1998, P. 38.

10. Glazkov P.B., Ivaschenko Т.Е., Orlov A.V., Gembitskay Т.Е., Baranov V.S. Different localization the CFTR protein in normal and CF airway epithelium derived from polyps of non-CF & CF subjects // 22 nd European Cystic Fibrosi Conference, June 13-19 1998, Berlin, Germany. P.82.

11. Ivaschenko T, Glazkov P., Baranov A., Baranov V. Transfection efficiency of CFTR, LacZ, GFP genes delivered to the lungs of laboratory mice with different vehicles // The Journal of Gene medicine. Abstracs Presented at Sixth Meeting of the European Working Group on Human Gene Transfer and Therapy (EWGT). Jerusalem, Israel 21-24 November 1998. P.65.

12. IvaschenkoT., Glazkov P., Baranov A., Baranov V. Transfection efficiency of reporter genes with artificial polymer microspheres (MF-2) delivered into the lungs of laboratoiy mice // American society of gene therapy, 2 nd Annual Meeting, June 9-13, 1999, Washington. P.118a.

13. Иващенко Т.Э., Глазков П.Б., Баранов A.H., Сабетский В.А., Киселев А.В., Баранов B.C. Трансфекция клеток легкого мышей геном CFTR человека и геном LacZ при различных носителях и способах доставки // Тезисы девятой итоговой конференции «Геном человека-99», 2-5 февраля, 1999, г.Черноголовка, С.122.

14. Иващенко Т.Э., Глазков П.Б., Баранов А.Н., Баранов B.C. Разработка экспериментальных основ генотерапии муковисцидоза // Тезисы отчетов по работе программы «Геном человека», Москва, 2000, C.147-I48.

Подписано к печати 27.04.2000. Бумага офсетная. Формат 60x90 1/16. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Зак. № 1337. ЛР № 040815 от22.05.07. Отпечатано в Отделе оперативной полиграфии НИИ химии СПбГУ

с оригинал-макета заказчика 198904, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр., 2.