Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ ряда генов как возможных генов-модификаторов клинической картины муковисцидоза у больных из России

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ ряда генов как возможных генов-модификаторов клинической картины муковисцидоза у больных из России"

На правах рукописи

Тимковская Елизавета Ефимовна

АНАЛИЗ РЯДА ГЕНОВ КАК ВОЗМОЖНЫХ ГЕНОВ-МОДИФИКАТОРОВ КЛИНИЧЕСКОЙ КАРТИНЫ МУКОВИСЦИДОЗА У БОЛЬНЫХ ИЗ РОССИИ

03 00 15 - генетика 14.0009 -педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003 161025

ЪФ

Москва, 2007

Работа выполнена в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Научные руководители:

кандидат биологических наук, Н.В. Петрова доктор медицинских наук, Н.Ю Каширская

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор A.B. Поляков доктор медицинских наук, профессор И.К. Волков

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования Российская медицинская академия последипломного образования Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Защита диссертации состоится «_ 6 » ASaitt^UP 2007 г B«i4j> часов на заседании Диссертационного совета Д 001 016 01 в ГУ Медико-генетический научный центр РАМН по адресу 115478, Москва, ул Москворечье, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ Медико-генетический научный центр РАМН по адресу 115478, Москва, ул Москворечье, д 1

Автореферат разослан

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Л. Ф. Курило

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Муковисцидоз (MB)- частое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное мутацией гена CFTR, характеризующееся клиническим полиморфизмом

Частота MB в Европе, в среднем, составляет 1.3000 - 1 3500 новорожденных, в России, по разным оценкам, от 1 4900 до 1 12000 [Капранов НИ и др, 2004, РадионовичАМ идр,2005]

Продолжительность жизни, спектр и тяжесть клинических проявлений значительно варьируют среди больных MB

Значительное количество симптомов MB и осложнений могут отсутствовать у одних больных на протяжении всей жизни, тогда как у других имеется почти полный их спектр уже в раннем возрасте К таким проявлениям, например, относятся мекониалышй илеус и синдром дистальной икггестинальной обструкции, недостаточность поджелудочной железы, цирроз печени, сахарный диабет, остеопороз, а также колонизация легких Pseudomonas aeruginosa, существенно ухудшающая течение и прогноз заболевания

Вариабельность клинического течения лишь отчасти обусловлена CFTR генотипом [CFG-PC, 1993, Ferrari М, Cremonesi L, 1996, Parad RB et al, 1999, McKone E F et al, 2006]

Различное течение MB наблюдается у больных, проживающих в равных социальных условиях, наблюдаемых в одних медицинских центрах и имеющих одинаковые мутации в гене CFTR, в частности, у сибсов Причем конкордантность по тяжести заболевания у монозиготных близнецов, достоверно выше, чем у дизиготных [Mekus N et al, 2000, Vanscoy L L et al, 2007] Это позволяет предполагать влияние на клиническую картину MB других генетических факторов, отличных от гена CFTR

В связи с широкой вариабельностью клинической картины идентификация генов, вовлеченных в патогенез отдельных синдромов MB, является важной медико-генетической задачей во всем мире Изучается ряд генов, белковые продукты которых могут быть вовлечены в патогенетические механизмы MB [Drumm М L et al, 2005, Salvatore F et al, 2002, Witt H, 2003]

В нашей стране молекулярно-генетические работы, посвященные изучению генов, модифицирующих клинические проявления MB, немногочисленны и проведены на выборках больных MB небольшого размера без учета CFTR генотипа [Иващенко Т Э, Баранов В С, 2002, Корытина Г Ф и др, 2004, Келемберт H А и др , 2005]

Возможность прогнозировать дальнейшее течение заболевания и возникновение определенных осложнений позволит оптимизировать доведение профилактических и лечебных мероприятий и может способствовать созданию новых этиопатогенетических подходов к терапии заболевания, что будет способствовать дальнейшему увеличению продолжительности и повышению качества жизни больных

Цель исследования: изучение возможного модифицирующего влияния генов eNOS, TNFA, LTA, GSTM1, MBL2, HFE на клинические проявления MB у российских больных.

Задачи исследования;

1 Составить регистр обследованных больных муковисцидозом с указанием их генотипа и особенностей течения заболевания

2 Проанализировать частоты полиморфизмов в генах eNOS, TNFA, LTA, GSTM1, MBL2, HFE среди больных муковисцидозом и здоровых индивидов

3 Изучить ассоциации полиморфизмов в указанных генах с течением бронхолегочного процесса у больных муковисцидозом

4 Изучить взаимосвязь данных полиморфизмов с характером поражения системы пищеварения у больных муковисцидозом

Научная новизна и практическая значимость. Впервые получена оценка частот аллелей и генотипов полиморфных локусов генов eNOS, TNFA, LTA, GSTM1, MBL2, HFE в выборке больных MB, гомозиготных по мутации F508del, проживающих на территории Российской Федерации

Впервые определены частоты мутаций в первом экзоне, а также аллелей и генотипов промоторного полиморфизма в гене MBL2 у здоровых индивидов, проживающих на территории Европейской части России

Проведен анализ связей данных полиморфных локусов с клиническими проявлениями муковисцидоза и выявлены ассоциации с тяжестью бронхолегочной патологии и рядом осложнений MB Впервые у больных MB, носителей аллеля А VNTR eNOS4, установлено более тяжелое течение бронхолегочного процесса и меньшая частота цирроза печени по сравнению с больными MB, гомозиготными по аллелю дикого типа eNOS У пациентов, являющихся носителями мутации H63D в гене HFE, выявлено более тяжелое поражение желудочно-кишечного тракта и более благоприятное течение бронхолегочного процесса, чем у обладателей Н/Н генотипа Впервые в России показана ассоциация тяжести бронхолегочного процесса и кишечного синдрома у больных MB с мутантными аллелями гена MBL2

Результаты работы вносят вклад в общее представление о генах-модификаторах клинической картины MB Полученные в работе данные имеют существенное значение для проведения ДНК-диагностики с целью выявления факторов риска развития ряда осложнений MB Положения, выносимые на защиту:

1 Определены особенности клинической картины MB у больных, гомозиготных по мутации F508del, из России для них в большей мере характерна смешанная форма заболевания, а также быстрое прогрессирование бронхолегочного процесса и поражения гепатобилиарной системы

2 Частоты изученных мутаций и полиморфизмов в генах TNFA, LTA, GSTM1, MBL2, HFE в выборках здоровых индивидов и больных MB, гомозиготных по мутации F508del, не различаются Выявлено достоверное различие частот аллелей полиморфизма VNTR eNOS4 между выборками больных MB и здоровых индивидов

3 Установлена ассоциация тяжести бронхолегочного процесса при MB с полиморфизмом VNTR 27 пн в 4 интроне гена eNOS, мутациями R52C, G54D, G57E и полиморфизмом -221 G-C гена MBL2, мутацией H63D гена HFE У больных MB, гомозиготных по мутации F508del, отмечены более тяжелые проявления со стороны легких среди пациентов, имеющих

мутантные аллели MBL2 и eNOS, а также у индивидов, гомозиготных по аллелю Н63 гена HFE

4 Выявлена ассоциация проявлений со стороны пищеварительной системы у больных MB, гомозиготных по мутации F508del, с мутациями и полиморфизмами генов eNOS, GSTM1, MBL2 и HFE Обнаружено снижение частоты цирроза печени у больных MB, имеющих аллель eNOS4*A Выявлено увеличение частоты фиброза печени среди пациентов, гомозиготных по делеционному полиморфизму GSTM1 Отмечена более ранняя манифестация кишечного синдрома среди больных MB, носителей мутации H63D гена HFE. Обнаружено увеличение частоты мекониального илеуса и синдрома дистальной интестинальной обструкции среди пациентов с мутантными аллелями генов HFE и MBL2

5 Отмечена ассоциация более позднего возраста постановки диагноза среди больных, гомозиготных по мутации F508del, с наличием аллеля А полиморфизма -308 G-A гена TNFA

Апробация работы. Материалы работы были представлены на VII Национальном Конгрессе по муковисцидозу, 5-6 апреля 2005 года, г Воронеж, V съезде Российского общества медицинских генетиков, май 2005 года, г Уфа, VIII Национальном конгрессе по муковисцидозу, июнь 2007 года, г Ярославль, лабораторных и межлабораторном семинарах ГУ МГНЦ РАМН, июнь 2007 Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ Объем и структура работы. Работа изложена на 153 страницах, состоит из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы», «результаты и обсуждение», заключения, выводов, практических рекомендаций, приложений и списка литературы (185 источника, из них 149 зарубежных) Работа проиллюстрирована 46 таблицами и 23 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Нами было проанализировано 460 историй болезни детей, больных муковисцидозом, проживающих в РФ, находившихся на постоянном амбулаторном учете и обследованных в научно-клиническом отделе муковисцидоза (Российский

центр муковисидоза) (руководитель - д.мн проф НИ Капранов) с 1991 по 2006 год Анализируемые параметры включали CFTR генотип, пол, возраст, место проживания, проводимую терапию, время манифестации кишечного и респираторного синдрома, возраст постановки диагноза, форму заболевания, тяжесть течения, показатели ФВД (ФЖЕЛ и ОФВ^, результаты посева мокроты (наличие высева, его периодичность, существование мукоидной или гладкой формы Р aeruginosa, наличие высева S aureus, MRSA, Al xylosoxidans, В cepacia, St maltophiha), массо-ростовой индекс (МРИ), поражение гепатобилиарной системы, наличие в анамнезе мекониального илеуса (МИ) и синдрома дистальной интестинальной обструкции (СДИО)

Анализ полиморфизмов генов-модификаторов проводили в выборке больных MB, гомозиготных по мутации F508del, составившей 148 пациентов, и контрольной выборке здоровых индивидов Выборка здоровых индивидов (289 человек) по полу, возрасту, этнической принадлежности и месту проживания соответствовала выборке анализируемых больных Выделение геномной ДНК проводили из лейкоцитов венозной крови набором реактивов «Wizard Genomic DNA Purification Kit» фирмы «Promega» (USA) в соответствии с рекомендациями производителя

Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом полимеразной цепной реакции на программируемом термоциклере МС2 производства фирмы "ДНК-технология" (Россия) с использованием ДНК-полимеразы Biotaq ("БиоМастер") и олигонуклеотидных праймеров, которые синтезировались в НПО «Литех» (Россия)

Исследование полиморфизмов изучаемых генов проводили методом ПДРФ-анализа [Monti L D et al ,2003; Zhang D.L., 2003, Пай Г В и др, 2003, Madsen et al, 1998, Beutler E et al, 1996] Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы Vilber Lourmat (Франция) в УФ-свете В работе использовались эндонуклеазы производства Fermentas (Литва), «Сибэнзим» (Россия)

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием параметрической и непараметрической статистики в зависимости

от шкал и характера распределения переменных Для анализа ассоциаций между полиморфными вариантами изучаемых генов и количественными характеристиками течения заболевания использовали непараметрический критерий Манна-Уитни Расчет данного критерия осуществляли с использованием пакета «Statistica 6 0» Анализ качественных признаков проводили на основе сравнения частот их проявления в исследуемых группах, с последующей попарной проверкой статистической достоверности различий значений частот с использованием критериев согласия уД двустороннего теста Фишера, модифицированного [Животовский, 1991] Расчет осуществляли с использованием пакета программ, имеющегося в лаборатории, составленного сотрудниками д б н Ельчиновой Г И, дбн НурбаевымСД

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Активный поиск кандидатных генов, оказывающих влияние на характер течения MB, ведется в настоящее время многими группами исследователей Особое внимание уделяется генам, вовлеченным в процессы иммунной защиты и воспаления [Drumm M L et al, 2005, Salvatore F et al, 2002, Witt H, 2003]

Изучение модулирующего влияния кандидатных генов-модификаторов следует проводить в группе больных с одинаковым CFTR генотипом для исключения возможного специфического влияния разных мутаций гена CFTR на фенотип [CFGPC, 1993, Каширская НЮ, 2001, de Gracia J et al, 2005, Loubieres M D et al, 2002; McKone E F. et al, 2003, Salvatore F, 2002]

Наиболее многочисленную группу в исследованной нами выборке больных составили 148 пациентов, гомозиготных по мутации F508del (32% от общего числа больных MB, доступных для исследования) Для этой группы характерно преобладание смешанной формы заболевания (98%), а также быстрое прогрессирование заболевания (ранняя манифестация кишечного синдрома - 0,27 ± 0,08 года (0,00 - 6 лет) и ранняя манифестация легочного синдрома - 0,66 ±0,11 года (0,00 - 10 лет)) Возраст больных со снижением ФЖЕЛ (менее 80% от д ) в среднем составил 11,12 ±0,64 (от 5,16 до 18) лет. Высев Р aeruginosa отмечен у 77% больных, из них хроническая синегнойная инфекция - у 57,6% Высев S aureus присутствовал в анамнезе у 73% пациентов Мекониальным илеусом

заболевание дебютировало у 7,5% больных Синдром дистальной ингестинальной обструкции отмечен у 7,6% Патология печени выявлена у 31% больных, в том числе цирроз у 17,6%, фиброз у 11,5%, холестатический гепатит у 1,4%, вирусное поражение печени у 2% пациентов Средний возраст больных с поражением печени составил 9,26 ±0,61 лет

В настоящей работе исследовано влияние генов еЫОБ (эндотелиальной синтазы оксида азота), ШРА (фактора некроза опухоли а), ЬТА (лимфотоксина а), СБТМ1 (глутатион-8-трансферазы М1), МВЬ2 (манозо-связывающего лектина), НЕЕ (гемохроматоза типа I), как наиболее вероятно вовлеченных в патогенез клинических проявлений МВ В исследованных генах были проанализированы полиморфизмы, ассоциированные с функцией генов и имеющие относительно высокую дапуляционную частоту (не менее 10%)

Анализ ассоциации полиморфизма УОТИ 27 п.н. в 4 интроне гена еМОЭ с клиническими проявлениями муковисцидоза.

Принимая во внимание то, что оксид азота, синтезируемый еКОБ (эндотелиальной синтазой оксида азота), стимулирует бронходилятацию, задействован в иммунной защите и участвует в регуляции сосудистого тонуса, отчасти компенсируя индуцированную гипоксией вазоконстрикцию в легких больных МВ, нами проведен анализ полиморфизма УШИ 27 п н в 4 интроне гена еИОБ у больных МВ и в контрольной группе

Частота аллеля А еЫОБ4 составила в выборке больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации Р508с1е1, 0,208, а в контрольной выборке 0,111, различие частот достоверно %12=10,13, р<0,01

Группы обследуемых больных МВ с различными генотипами по \TNTR е№054 не отличались по полу, получаемой терапии, месту проживания Различий по тяжести течения и форме заболевания между группами не наблюдалось

В груше больных с генотипами А/А и А/В выявлены достоверно более низкие показатели ФЖЕЛ (69,37±4,09% от должного) по сравнению с группой больных с генотипом В/В (80,57±3,31% от д) (2=2,14, р=0,03) Показатели ОФВ, у больных, имеющих аллель А, также ниже (64,48±5,50% от д), чем у больных с генотипом В/В (77,62±4,14% от д) (г=1,85, р=0,06) (рис 1)

Подавляющее большинство литературных источников свидетельствует о снижении синтеза N0 у обладателей аллеля А [Пай Г.В. и др., 2006; Tsukada Т. et al,, 1998; Hoffmann LSI et al., 2005; Song J. et aL, 2003]. Полученные нами результаты согласуются с этими данными, т.к. недостаточная выработка NO должна неблагоприятно отражаться на ФВД, вызывая бр онхокон стрик ци ю и ухудшая муконишиарный транспорт.

Достоверных различий в высеве P. aeruginosa, S. aureus, MRS A, Al.

xylosoxidans, В. cepacia, St. maltophilia между группами не наблюдалось.

%

Is

60 so

Рисунок 1. Ассоциация полиморфизма VNTR eNOS4 с показателями ФВД (ФЖЕЛ и ОФВ|) у больных MB.

Суммарные частоты поражений печени в группах статистически не различались. Однако цирроз у больших с генотипами А/А и А/В выявлялся достоверно реже, чем у больных с генотипом В/В (6,6% против 22,06%) (XiZ=4,06. р<0,05) (рис. 2). Различий по среднему возрасту больных с заболеванием печени, а также по наличию вирусного поражения печени у больных с разными VNTR

eNOS4 генотипами не выявлено,

%

3S 30 15 26 IS 10 S

о

Рисунок 2. Ассоциация полиморфизма VNTR eNOS4 с поражением печени у больных MB.

от д.

ФЖО (tr=W№) ОФВ1 <(кО,1)

ЧАСТОТ! ElHpfKTia (|г:0.11е.> 0 б nut я частота п.печени (££>0,05)

Для подтверждения диагноза билиарного цирроза, развивающегося при MB, необходимо гистологическое заключение, однако больным MB пункционная биопсия печени не показана и у этого контингента больных диагноз ставится косвенно, по совокупности клинических, лабораторных показателей и данных УЗИ Определяющим в постановке диагноза цирроза является наличие у больного портальной гипертензии (ПГ), в развитии которой вовлечена eNOS, увеличивающая синтез NO у больных с циррозами печени, что рассматривается как адаптация эндотелиальных клеток к стойкому повышению давления в системе портальной вены [Goh В J et al, 2006] Повышенная продукция N0 этим ферментом способствует дилятации портальной вены и ее притоков, реваскуляризации сосудистых коллатералей и развитию, т о, ПГ [Mohammed N А et al, 2003] Низкая регистрация цирроза печени среди больных, несущих аллель А, соответствует данным о низкой активности eNOS у больных с генотипами А/А и А/В

Итак, у больных MB аллель eNOS4*A ассоциирован со снижением показателей ФВД и более редким диагнозом цирроза печени

Анализ ассоциации полиморфизмов -308G>A гена TNFA и +252 A>G гена LTA с клиническими проявлениями муковисцидоза.

TNFA (фактор некроза опухоли а) является мощным провоспалительным цитокином и хемоатрактантом для нейтрофилов Учитывая его значительную роль в развитии лейкоцитарного повреждения легких, нами был проведен анализ полиморфизмов -308 G-A в гене TNFA и +252 A-G в гене LTA, ассоциированных с изменением уровня TNFA в плазме, у больных муковисцидозом и у здоровых индивидов

Различий частот аллелей и генотипов полиморфизмов -308G-A гена TNFA и +252 A-G гена LTA, а также комбинаций генотипов по данным полиморфизмам между выборками здоровых и больных муковисцидозом не выявлено

Группы обследуемых больных с различными генотипами по полиморфизмам -308G-A в гене TNFA и +252 A-G гена LTA не отличались по полу, получаемой терапии, месту проживания

В группе больных с генотипами А1—А2 и А2—А2 выявлена более поздняя постановка диагноза по сравнению с группой больных с генотипом Л1 -А 1 по гену ТЫРА (3,21*0,6 года против 1,89*0,25 года; 2=-2,23; р=0,025). Более поздняя постановка диагноза наблюдалась также в группе пациентов, гетерозиготных по обоим полиморфизмам генов и ¿ТА (А1—А2; В1—В2), по сравнению с

группой больных, гомозиготных по более частым аллелям изучаемых полиморфизмов (Л 1 —А 1; В2—В2) (3,31±(Ш года против 1,69±0,29 года; 2—2,12; р=0,034) (рис. 3). Достоверных различий в возрасте начала заболевания и времени появления симптомов, как при совместном рассмотрении полиморфизмов, так и при анализе каждого из них в отдельности не выявлено.

Возраст

(годы)

3,31

---, г г -Н

■ВИН Ша ШН

генотип Л1/А1

генотип Л1:-\1 ;Л2.Л2 комбинация I йсотнпов , !Г.мн;:.и■<

А1/А.1-В2/В2 ПЮТМ1ЮВЛ1/А1-В1/В2

Рисунок 3. Ассоциация полиморфизмов -308 в-А гена ТОТА и +252 А-0 гена ЬТА с возрастом постановки диагноза.

Различий по другим изучаемым параметрам между группами больных с разными генотипами по исследуемым полиморфизмам в генах ТЫРА и ¿ТА не выявлено.

Анализ ассоциации делецнонного полиморфизма (75ТЛ/1 с клиническими проявлениями МВ.

05ТМ1 (глутатион-8-трансфераза М1) участвует в детоксикации ксенобиотиков и нейтрализации продуктов перекисного окисления липидов, снижая степень оке и дативного стресса, выраженного при МВ. Учитывая вышесказанное, а также данные литературы о наличии экспрессии гена С8ТМ1 и в тканях легких и в печени [Сат1ау АМ. « а!., 1994; Непггоп-Саис1е А. « а!., 2002],

нами проведен анализ делеционного полиморфизма GSTM1 у больных муковисцидозом, а также у здоровых индивидов.

Частота гомозигот по нулевому аллелю GSTM1 достоверно не различалась в выборке больных ГИВ и в контрольной выборке.

Группы больных с различными генотипами GSTM! не отличались по полу, получаемой терапии, месту проживания.

Параметры, характеризующие тяжесть течения бронхолеточного процесса, в группах с различными генотипами по делеционному полиморфизму гена GSTM1 у обследованных больных значимо не различались.

Общая частота заболеваний печени в этих группах больных различалась недостоверно (33,33% против 25,0% соответственно, Xi1=0,95, р>0,05). Различия в частоте цирроза, холестатического гепатита и вирусных поражений печени между группами больных с разными генотипами GSTM1 не отмечены. Было выявлено достоверное увеличение частоты фиброза печени у гомозигот по нулевому аллелю GSTMJ (14,04%) по сравнению с больными, имеющими функциональные аллели (1,19%) (Xi.io62=6,34, р<0,05) (рис. 4), Т.к. GSTM1 имеет антиоксидантные и детоксикационные свойства, возможно, постоянное использование лекарств и воздействие системного оксидатнвного стресса обладают более сильным повреждающим действием на печень среди больных МВ, гомозиготных по нулевому аллелю GSTM1, чем у носителей функциональных аллелей, В литературе имеются сведения об увеличении риска гепатопатяй среди индивидов, гомозиготных по нулевому аллелю [Engracia V. el ai., 2003; Мohammadzadeh Ghobadloo S. et al, 2006].

Все Фиброз Цирроз Гепатит

заболевания (р<0,05) печени

Рисунок 4. Ассоциация делеционного генотипа GSTM1 с фиброзом печени.

Таким образом, выявлена ассоциация генотипа 0/0 GSTM1 с увеличением частоты фиброза печени у больных MB Однако, учитывая отсутствие достоверных различий между группами в частоте других заболеваний печени, имеющих сходный патогенез, полученные результаты требуют подтверждения.

Анализ ассоциации аллелей гена MBL2 с клиническими проявлениями

MB.

MBL (маннозо-связывающий лекгин) является важным компонентом системы врожденного иммунитета, действующим как опсонин и активатор комплемента, и его уровень может оказывать влияние на течение MB Нами был проведен анализ промоторного полиморфизма -221G-C и трех мутаций первого экзона гена MBL2 (R52C, G54D и G57E) в выборках здоровых индивидов и больных MB Достоверных различий частот мутантных аллелей в выборках больных MB и контроля не выявлено В дальнейшем все мутантные аллели были объединены и обозначены как О, поскольку каждая из мутаций приводит к практически полному отсутствию белка MBL в сыворотке, аллель дикого типа обозначен как А

Различия в частотах генотипов и аллелей полиморфизма -221G-C гена MBL2 между группами здоровых индивидов и больных MB не достоверны В дальнейшем аллель G обозначен как Y, а аллель С - как X

Существует отчетливая связь между уровнем MBL в сыворотке и генотипом по гену MBL2 [Steffensen R et al, 2000, Lee S G et al, 2005] У индивидов с генотипом YA/YA уровень сывороточного MBL максимален, тогда как индивиды, имеющие аллель X полиморфизма -221G>C на одной хромосоме и аллель О на другой (генотип ХАЮ) или гомозиготные по аллелю О, имеют низкий уровень MBL в сыворотке В соответствии с этим обследуемые больные MB были разделены на три группы 1) 39 человек - с генотипом YA/YA, 2) 57 пациентов, имеющих средние уровни MBL и следующие генотипы YA/XA, YA/O или XA/XA и 3) 8 больных - с генотипом ХА/О или О/О

Изучаемые группы больных MB с разными генотипами по гену MBL2 достоверно не различались по возрасту на момент последнего обследования Различия в возрасте постановки диагноза также не достоверны

ОФВг, % от л.

Ш YA/XA, VA/O, XA/XA, XA/O или 0/0 □ YA/YA

(1*9,051

Возраст

члалпый ■ iikn.iк mviü гглрвшй школьный

школьный [ JT

Рисунок 5, Ассоциация генотипов MBL2 с показателями ОФВ. в различных возрастных фуппах. Примечание. Дошкольный возраст 4-блет, младший школьный возраст 7-1 ¡лет, средний школьный возраст I 12-14 лет, старший школьный воЗрастИ 15-17 лет.

В нашем исследовании при рассмотрении общей выборки без учета возраста различия В показателях ФВД у пациентов с разными генотипами MBL2 не выявлены. При разделении больных на возрастные группы оказывается, что у детей младшей возрастной группы (4-6 лет), имевших мутантные аллели по гену MBL2, показатели ФВД ниже (ФЖЕЛ -72,66*5,38% от д., ОФВ, - 68,48*7,03% от Д.), чем у пациентов с генотипом YA/YA (ФЖЕЛ - 83,74*5,27% от Д., ОФВ, - 89,91*6,57% от д.) (для показателя ОФВ, это различие достоверно: 2=2,08, р=0,038). У детей средних возрастных групп (6-11 лет и 11-14 лет) различия показателей ФВД между пациентами с разными генотипами по гену K4BL2 не достоверны. А в старшей возрастной группе (15-17 лет) наблюдалась обратная тенденция, т.е. у больных с генотипом YA'YA показатели ФВД снижены сильнее (ФЖЕЛ- 69,81*10,87% от д., ОФВ,- 59,88*13,72% от д.), чем у больных с мутантными аллелями гена MBL2 (ФЖЕЛ 92,36*9,45% от д., ОФВ, 83,74*5,27% от д.) (хотя различия и не достигли уровня значимости: для ФЖЕЛ - Z=-l,29, р=0,11; для ОФВ] Z=-í,21, р=0,22) (рис. 5). Это можно объяснить тем, что функция иммуномодудятора, которую выполняет MBL, наиболее важна в раннем детском возрасте, когда система специфического иммунитета сформирована неполно. В более взрослом возрасте высокий уровень MBL может уже не иметь протективного значения и, напротив, усугублять

развитие заболевания, что соответствует наблюдениям H.V.Olesen с соавторами [2006].

Значимых различий в частоте высева P. aeruginosa между группами с различными генотипами MBL2 не выявлено. Однако обнаружено достоверное различие возраста первого высева P. aeruginosa в исследуемых группах больных MB. Более раннее начало поражения бронхолегочной системы P. aeruginosa отмечено у больных второй и третьей групп по сравнению с пациентами, имеющими генотипы YA/YA по гену MBL2 (Z=2,39; р=0,017) (рис. 6).

AL xylosoxidans <p<í!,(li) St. mniiopftiiia (p<0,0í>

йозраст 1-го высепя P. apruginosa (p<0,05)

Рисунок 6. Ассоциация генотипов MBL2 с возрастом первого высева Р. aeruginosa.

Возраст, годы

□ YA/YA

И Y А.ад, YA/O iuui XA/XA XA/О или О'О

Рисунок 7. Ассоциация мутации G54D гена MBL2 с высевом Ai. xylosoxidans и St maltophiJia.

Была также изучена частота поражения бронхолегочной системы другими видами инфекции. AL xylosoxidans выявлен у 5,2%, a St. maltophilia - у 15,5% пациентов. Различий в частоте поражения этими видами инфекции в группах больных с генотипом YA/YA и другими генотипами по гену MBL2 не выявлено. Но при рассмотрении каждого аллельного варианта гена MBL2 отдельно оказалось, что среди гомо- и гетерозигот по аллелю В (мутация G54D) частота поражения Al. xylosoxidans и St. maltophilia достоверно выше, чем у больных, не имеющих

такового (14,0% против 3,0%, = 4,20; р=0,037 и 30% против 12,5%, x2i,oie = 3,90, р=0,049, соответственно) (рис 7)

МИ и СДИО чаще наблюдали у больных, имевших генотипы, ассоциированные с пониженным уровнем MBL2 (18,4%), чем у больных с генотипом YA/YA (8,1%) (р=0,058)

Рядом исследователей было показано, что у больных MB, имеющих генотипы, обусловливающие сниженный уровень MBL2, частота и тяжесть поражения печени циррозом выше, чем у больных с нормальным уровнем MBL2 [Gabold М et al, 2001] Thio С L с сотрудниками [2005] показал, что аллель С промоторного полиморфизма -221G-C чаще встречается у индивидов с вирусной персистенцией (HBV). У индивидов, имеющих гомозиготные генотипы, ассоциированные с низкой продукцией MBL2, вирусная персистенция также отмечается чаще В исследуемой нами выборке больных MB частоты поражения печени циррозом и фиброзом в группах с разным генотипом по MBL2 не различались Холестатический гепатит отмечен только среди больных, имеющих генотипы со сниженной продукцией MBL2 (7,8%) (р=0,09) Инфицирование вирусами HBV и HCV выявлено у трех больных, имеющих генотипы с мутантными аллелями гена MBL2

Таким образом, была обнаружена ассоциация генотипов MBL2, обуславливающих снижение уровня MBL, с более ранней колонизацией легких Р aeruginosa, со снижением ОФВ| у детей дошкольного возраста, с тенденцией к более частому развитию холестатического гепатита (р<0,1), мекониального илеуса и синдрома дистальной интестинальной обструкции (р<0,1). Выявлена ассоциация мутации G54D (аллель В) с более частым высевом Al xylosoxidans и St maltophiha

Анализ ассоциации мутации H63D гена HFE с клиническими проявлениями муковисцидоза.

Принимая во внимание данные литературы о связи мутаций гена гемохроматоза (HFE) с развитием мекониального илеуса и поражения печени у больных MB [Rohlfs ЕМ et al, 1998, Devaney J., et al, 2003, Salvatore F et al, 2002], а также учитывая локализацию HFE в непосредственной близости к локусам

МНС и схожесть проявлений со стороны пищеварительной системы при наследственном гемохроматозе (НГ) и MB, нами был проведен анализ мутаций H63D и C282Y в гене HFE у больных муковисцидозом и у здорового контроля

В выборке больных MB, гомозиготных по мутации F508del, частоты аллелей D и Y мутаций H63D и C282Y в гене HFE составили 0,15 и 0,010, соответственно Различия частот аллелей и генотипов по проанализированным мутациям между выборками здоровых индивидов и больных муковисцидозом недостоверны Ввиду низкой частоты мутации C282Y (1%), анализ ассоциации с клиническими проявлениями MB проводили только для мутации H63D

Группы обследуемых больных с генотипами Н/Н и D/H не отличались по полу В группе больных с генотипом Н/Н доля москвичей, обследуемых более часто и имеющих более широкий спектр доступных лекарственных средств, оказалась достоверно выше (%2i=5,38,p<0,05) Также среди больных с генотипом Н/Н большее число получало Пульмозим (Дорназа-альфа, Хоффманн ля Рош, Швейцария) (х2]=3,44, р<0,1), препарат, достоверно улучшающий показатели ФВД, увеличивающий массо-ростовой индекс, снижающий обсемененность мокроты S aureus и Р aeruginosa [Капранов Н И и др, 2001].

У больных MB, имеющих мутацию H63D в гене HFE, первые проявления со стороны ЖКТ наступали достоверно раньше (0,19±0,14 года), чем у больных с генотипом Н/Н (0,43±0,14 года) (Z=-2,04, р=0,04) (рис 8) Достоверные различия также отмечены в суммарной частоте МИ и СДИО, наблюдавшихся чаще у больных с генотипом H/D (24,24%), чем у больных с генотипом Н/Н (9,09%)

(Х1,о4з2=4,65,р<0,05)(рис 9)

Таким образом, выявлена четкая связь мутации H63D с желудочно-кишечными проявлениями при MB, обусловленными нарушением внешнесекреторной функции поджелудочной железы, причем D аллель ассоциирован с более выраженными изменениями в ЖКТ Е М Rohlfs с сотрудниками [1998] и J Devaney с сотрудниками [2003] выявили тенденцию к увеличению частоты МИ у больных, несущих мутацию C282Y, однако для мутации H63D таких закономерностей выявлено не было [Rohlfs EM et al, 1998; Devaney J et al, 2003] В нашем исследовании среди трех больных, носителей мутации C282Y, МИ и СДИО в анамнезе не отмечались

■ IV Л

□ ШН

Возраст, годы

зебнтг ►.пи.с -м;'|, ".Г;

Рисунок 8. Ассоциация мутации НбЗО гена НЕЕ с возрастом манифестации

кишечного синдрома,

%

30 25 2(1 15 10 5 0

МИ и СЯИО (р<€.03) мя СЛИО |р<1,1)

Рисунок 9, Ассоциация мутации Н630 гена НЕЕ с ме ¡гениальным илеусом (МИ) и синдромом дистальний интестинальной обструкции.

Различия частоты поражений печени в группах больных MB с разными генотипами по мутации H63D не значимы,

В группе больных с генотипом D/H выявлены более высокие средние показатели ФЖЕЛ (85,78±4,85% от д.) по сравнению с группой больных с генотипом Н/Н (74,8Р±2,90% от д.) (Z=l,85, р=0,06). У носителей мутации H63D наблюдались более высокие значения ФЖЕЛ, несмотря на то, что условия лечения и получаемая терапия этой группой больных были достоверно менее благоприятные, чем для больных с генотипом Н/Н. В доступной нам литературе данные о связи мутации H63D с заболеваниями легких отсутствуют. Ген НЕЕ располагается в одном регионе с генами МНС, и можно предполагать, что аллель D ассоциирован с определенными гаплотшами МНС, способствующими более благоприятному течению бронхолеточного процесса. Например, мутация H63D находится в неравновесии по сцеплению с гаплотипом HLA А-29, который ассоциирован с увеличением числа Т-кштлеров (CDS) [Cardoso C.S. et al., 2002].

Частота высева St maltophilia у больных с генотипом D/H составила 3,03%, у больных с генотипом Н/Н - 15% (Р=0,06) Т е более благоприятные результаты микробиологического исследования, как и другие показатели течения бронхолегочного процесса, отмечены у носителей мутации H63D

Таким образом, выявлена ассоциация мутации H63D HFE с более ранней манифестацией кишечного синдрома и достоверно более высокой частотой МИ и СДИО У обладателей мутации H63D в гене HFE также отмечена тенденция к более высоким показателям ФЖЕЛ (р<0,1) и более редкому высеву St maltophilia (р<0,1), несмотря на менее благоприятные условия для лечения бронхолегочной патологии в этой группе больных (р<0,05)

По нашему мнению, гены eNOS, MBL2, HFE можно рассматривать как модификаторы клинических проявлений MB и анализ изученных полиморфизмов в этих генах может оказаться полезным при прогнозе возможных осложнений у конкретных больных MB

ВЫВОДЫ

1 Среди выборки больных MB наиболее многочисленной генетически однородной группой явилась группа пациентов, гомозиготных по мутации F508del (148 человек - 32%) На основе созданного регистра определены особенности клинической картины у больных данной группы, для которых в большей мере характерна смешанная форма заболевания, а также быстрое прогрессирование бронхолегочного процесса и поражения гепатобилиарной системы

2 Частоты изученных мутаций и полиморфизмов в генах TNF A, LT A, GSTM1, MBL2, HFE в выборках здоровых индивидов и больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del, не различаются Выявлено достоверное увеличение частоты аллеля А полиморфизма VNTR eNOS4 у больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del (20,8%), по сравнению с выборкой здоровых индивидов (11,1%) (р<0,01)

3. У больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del гена CFTR, носителей аллеля A VNTR eNOS4, установлены более тяжелое течение

бронхолегочного процесса (р<0,05), проявляющееся снижением показателей ФЖЕЛ (69,4% от должного против 80,6% от должного) и ОФВ, (64,5% от должного против 77,6% от должного) и менее выраженное поражение печени, заключается в меньшей частоте цирроза (6,1 % против 22,1%), по сравнению с гомозиготными носителями аллеля В (р<0,05)

4 Выявлен более поздний возраст постановки диагноза у больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del гена CFTR, имеющих аллель А полиморфизма -308 G-A гена TNFA (3,21 года), а также среди пациентов, гетерозиготных по обоим полиморфизмам -308 G-A гена TNFA и +252 A-G гена LTA (3,31 года) по сравнению с обладателями нормальных генотипов по данным полиморфизмам (1,89 года и 1,69 года, соответственно, р<0,05)

5 Обнаружено значимое увеличение частоты фиброза печени в группе больных муковисцидозом, с генотипом F508del/F508del по гену CFTR, гомозиготных по делеционному полиморфизму гена GSTM1 (14%), по сравнению с больными, имеющими аллель дикого типа GSTM1 (1,8%) (р<0,05), в то время как частота цирроза в группах достоверно не отличалась (14,04% и 23,21% соответственно, р>0,05)

6 У больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del гена CFTR, носителей мутантных аллелей гена MBL2 установлено более тяжелое течение бронхолегочного процесса, чем у больных с YA/YA генотипом MBL2 (р<0,05), проявляющееся снижением показателей ОФВ! у детей дошкольного возраста (68,5% от д против 89,9% от д), более ранним инфицированием Р aeruginosa (4,9 года против 6,9 лет) и более частым обнаружением Al xylosoxidans и St maltophiha (14,3% против 3% и 30% против 12,5%, соответственно) У носителей мутантных аллелей гена MBL2 наблюдается более тяжелые проявления со стороны пищеварительной системы, заключающиеся в более частом развитием мекониального илеуса, синдрома дистальной интестинальной обструкции (22,6% против 8,1%) и холестатического гепатита (7,8% против 0) (р<0,1) в сравнении с гомозиготами по аллелям дикого типа гена MBL2

7 У больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del гена CFTR, являющихся носителями мутации H63D в гене HFE, выявлено более тяжелое, чем у обладателей Н/Н генотипа, поражение желудочно-кишечного тракта (р<0,05), проявляющееся ранней манифестацией кишечного синдрома (0,19 года против 0,43 года), более частым развитием мекониального илеуса и синдрома дистальной интесгинальной обструкции (24,2% против 9,1%) У носителей мутации H63D также прослеживается более благоприятное течение бронхолегочного процесса, по сравнению с гомозиготами по нормальному аллелю, выражающиеся лучшими показателями ФЖЕЛ (85,8% от д против 74,8% от д) и редким высевом St maltophiha (3% против 15%)

0X0,1)

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Учитывая достаточно четкую корреляцию тяжести легочной патологии с А аллелем полиморфизма УТчГГЯ гена еМОД мутациями 0540, 057Е, И52С и полиморфизмом -22Ш-С гена МВЬ2 представляется вполне оправданным рекомендовать генотипирование больных МВ на наличие неблагоприятных аллелей с целью объективного прогноза течения заболевания и выработки более рациональной тактики лечения

Список сокращений:

% от д - % от должного

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

МВ - муковисцидоз

ОФВ, - объем форсированного выдоха в одну секунду

ПГ - портальная гипертензия

ФВД - функция внешнего дыхания

ФЖЕЛ - форсированная жизненная емкость легких

еМОБ - эндотелиальная синтаза оксида азота

ОБТШ - глутатион-8-трансфераза М1

НЕЕ - гемохроматоз

ЬТА - лимфотоксин а

МВЬ2 - манозо-связывающий лектин

МЯБА - метициллин-резистентный золотистый стафилококк N0 - оксид азота

Т№А - фактор некроза опухоли а

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ:

1 Petrova N V, Timkovskaya Е.Е., Gmter Е.К Analysis of common mutations and mtragenic marker haplotypes m CF and normal samples from Russia // 7й International Symposium for Cystic Fibrosis, Slovalaa, 2003, no 23, p 12

2 Петрова H В, Тимковская E.E Анализ частых мутаций и галлотипов внутригенных маркеров у больных муковисцидозом и в норме (Тезисы) // 5-й Славяно-Балтийский научный форум «Санкт-Петербург - Гастро-2003», 10-12 сентября 2003г, стр 80

3 Петрова H В , Тимковская Е.Е. Анализ гаплотипов внутригенных маркеров у больных муковисцидозом и в норме (Тезисы) // Научно-практическая конференция «Современные достижения клинической генетики», Москва, 25-27 ноября 2003 - Медицинская генетика, 2003, т 2, №10, стр 436

4 Петрова H В, Тимковская Е.Е., Зинченко Р А Анализ частоты встречаемости некоторых мутаций в гене CFTR в популяциях европейской части России (Тезисы) // Всероссийская научно-практическая конференция «Современные достижения клинической генетики», Москва, 25-27 ноября 2003 - Медицинская генетика, 2003, т 2, №10, стр 436

5 Петрова H В , Тимковская Е.Е., Каширская H Ю., Зинченко Р А Анализ частот мутаций в гене CFTR в норме и у больных муковисцидозом в российских популяциях // Третий съезд генетиков и селекционеров России "Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития", Москва, 6-12 июня 2004, стр 100

6. Тимковская Е.Е., Петрова H В , Каширская H Ю, Зинченко Р А Частоты мутаций C282Y и H63D в гене HFE1 в выборках больных муковисцидозом и здоровых доноров в России // Третий съезд генетиков и селекционеров России "Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития", Москва, 6-12 июня 2004, стр 100

7 Петрова H В , Тимковская Е.Е., Зинченко Р А Анализ частот мутаций в гене CFTR российских популяциях // Третьи антропологические чтения к 75-летию со дня рождения академика В П.Алексеева «Экология и демография человека в прошлом и настоящем», тезисы 2004, стр 287-288

8. Тимковская Е.Е., Петрова НВ, Зинченко РА Анализ частот мутаций C282Y и H63D в гене HFE1 в некоторых популяциях России // Третьи антропологические чтения к 75-летию со дня рождения академика В П Алексеева «Экология и демография человека в прошлом и настоящем», Тезисы 2004, стр 273-274

9 Тимковская Е.Е., Петрова Н В , Зинченко Р А Анализ некоторых мутаций генов частых наследственных болезней в популяциях России // V Съезд Медицинских генетиков, Уфа, май 2005 - Медицинская генетика, 2005, Т 4, №6, стр 275

10Петрова НВ, Тимковская Е.Е., Каширская НЮ Анализ полиморфизма генов TNFA, LTA, MBL2 И HFE1 у больных муковисцидозом // VII национальный кошресс по муковисцидозу - Сборник статей и тезисов, М, 2005, стр 78-79

11 Петрова Н В, Тимковская Е.Е., Каширская Н Ю Полиморфизм генов TNFA, LTA, MBL2 И HFE1 у больных муковисцидозом // Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков - Медицинская генетика, 2005, №6, стр 250

12 Петрова Н В , Тимковская Е.Е., Зинченко Р А, Гингер Е К. Анализ частоты некоторых мутаций в гене CFTR в разных популяциях России // Медицинская генетика, 2006, №2, стр 32-39

13 Тимковская Е.Е., Каширская НЮ , Петрова НВ Анализ полиморфизма генов TNFA, LTA, eNOS, GSTM1 у больных муковисцидозом // VIII национальный конгресс по муковисцидозу - Сборник статей и тезисов, М 2007, стр 151-152

14Тимковская Е.Е., Петрова НВ, Каширская НЮ, Тереховская ИГ, Шаронова Е И., Воронкова А Ю, Радионович А М., Капранов Н И, Передерко JIВ , Семыкин С Ю, Зинченко Р А Полиморфизм генов TNFA и LTA у больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del // Медицинская генетика, 2007, т 6,Х»3,стр 27-32.

Заказ № 619. Объем 1 п.л Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Пет роруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тимковская, Елизавета Ефимовна

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цель и задачи исследования.

1.3. Научная новизна и практическая значимость.

1.4. Положения, выносимые на защиту.:.

1.5. Апробация работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Патогенез и клиническая картина муковисцидоза.

2.1.1. Респираторный тракт.

2.1.1.1. Колонизация P. aeruginosa.

2.1.1.2. Воспалительный процесс.

2.1.1.3. Оксидативный стресс.

2.1.2. Пищеварительная система.

2.1.2.1. Поджелудочная железа.

2.1.2.2. Кишечник.

2.1.2.3. Печень.

2.2. CFTR.

2.2.1. Ген и его продукт.

2.2.2. Мутации гена CFTR, их классификация в зависимости от первичного повреждающего дефекта.

2.2.3. Корреляция мутаций гена CFTR с клиническими проявлениями MB.

2.3. Возможные гены модификаторы течения муковисцидоза.

2.3.1. Ген эндотелиальной синтазы оксида азота.

2.3.2. Гены фактора некроза опухоли а и лимфотоксина а.

2.3.3. Ген глутатион-Б-трансферазы Ml.

2.3.4. Ген маннозо-связывающего лектина.

2.3.5. Ген гемохроматоза.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материалы исследования.

3.1.1. Общая характеристика больных.

3.1.2. Характеристика контрольной группы.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Общеклинические методы.

3.2.2. Молекулярно-генетические методы.

3.2.2.1. Выделение геномной ДНК.

3.2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК.

3.2.2.3. Рестрикционный анализ.

3.2.2.4. Метод электрофореза в полиакриламидном геле.

3.2.3. Статистическая обработка результатов исследований.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Характеристика выборки больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del.

4.2.Анализ ассоциации полиморфизма VNTR 27 п.н. в 4 интроне гена eNOS с клиническими проявлениями муковисцидоза.

4.3. Анализ ассоциации полиморфизмов -308G>A гена TNFA и +252 A>G гена LTA с клиническими проявлениями муковисцидоза.

4.4. Анализ ассоциации делеционного полиморфизма GSTM1 с клиническими проявлениями MB.

4.5. Анализ ассоциации вариантных аллелей MBL2 с клиническими проявлениями MB.

4.6. Анализ ассоциации мутации H63D гена HFE с клиническими проявлениями муковисцидоза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ ряда генов как возможных генов-модификаторов клинической картины муковисцидоза у больных из России"

1.1. Актуальность проблемы.

Муковисцидоз (MB) — частое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное мутацией гена CFTR, характеризующееся клиническим полиморфизмом. Сгущение секрета экзокринных желез приводит к развитию мультисистемного заболевания, имеющего обычно тяжелое течение и прогноз. Качество и продолжительность жизни больных в первую очередь определяются степенью и характером поражения бронхолегочной системы [Капранов Н.И. и др., 2004; Радионович A.M. и др., 2005].

Частота MB в Европе, в среднем, составляет 1:3000 - 1:3500 новорожденных, в России, по разным оценкам, от 1:4900 до 1:12000. В Российской Федерации зарегистрировано более 1700 больных MB, но ориентировочные расчеты показывают, что число больных MB в России должно быть около 8000 [Капранов Н.И. и др., 2004; Радионович A.M. и др., 2005].

Значительный прогресс в области ранней диагностики и терапии MB способствует трансформации MB из безусловно фатального заболевания детского возраста в хроническую патологию взрослых. В развитых странах отмечается рост числа больных MB подросткового, юношеского возраста и взрослых [Амелина Е.Л. и др., 2001; Allen E.D., 1999; CFG-PC, 1993].

Однако продолжительность жизни, спектр и тяжесть клинических проявлений значительно варьируют среди больных MB. Так, несмотря на проводимую терапию, ряд больных умирают от тяжелых осложнений уже на первом году жизни, тогда как у других первые проявления заболевания возникают лишь в подростковом возрасте. Значительное количество симптомов MB и осложнений могут отсутствовать у одних на протяжении всей жизни, тогда как у других имеется почти полный их спектр уже в раннем возрасте. К таким проявлениям, например, относятся: мекониальный илеус и синдром дистальной интестинальной обструкции, недостаточность поджелудочной железы, цирроз печени, сахарный диабет, остеопороз, а также колонизация легких Pseudomonas aeruginosa, существенно ухудшающая течение и прогноз заболевания.

Взаимосвязь между вариабельностью клинического течения и CFTR генотипом неоднозначна. Установлена четкая зависимость между недостаточностью внешнесекреторной функции поджелудочной железы и мутациями в гене CFTR. Выделена группа мутаций, ассоциирующих обычно с сохранностью функции поджелудочной железы, и эти, так называемые, «мягкие» мутации обладают доминантным эффектом, т.к. остаточная экзокринная функция поджелудочной железы отмечается даже у пациентов, несущих «тяжелую» мутацию во втором CFTR аллеле. Однако связь между другими проявлениями MB и CFTR генотипом спорна. В частности, течение бронхолегочного процесса, определяющее качество и продолжительность жизни больных MB, впрямую не зависит от CFTR генотипа [CFG-PC, 1993; Ferrari М., Cremonesi L., 1996; Parad R.B. et al., 1999; McKone E.F. et al., 2006].

Различное течение MB наблюдается у больных, проживающих в равных социальных условиях, наблюдаемых в одних медицинских центрах и имеющих одинаковые мутации в гене CFTR, в частности, у сибсов, причем конкордантность по тяжести заболевания у монозиготных близнецов, достоверно выше, чем у дизиготных [Mekus N. et al., 2000; Vanscoy L.L. et al., 2007]. Это позволяет предполагать влияние на клиническую картину MB других генетических факторов, отличных от гена CFTR.

В настоящее время во всем мире ведется активный поиск генов, оказывающих влияние на клинические проявления MB. Изучается ряд генов, белковые продукты которых могут быть вовлечены в патогенетические механизмы MB. Особое внимание уделяется генам, продукты которых вовлечены в иммунную защиту организма [Drumm M.L. et al., 2005; Salvatore F. et al., 2002; Witt H., 2003].

В нашей стране молекулярно-генетические работы, посвященные изучению генов, модифицирующих клинические проявления MB, немногочисленны и проведены на выборках больных MB небольшого размера без учета CFTR генотипа. Эти исследования затрагивают, в большинстве случаев, изучение полиморфизма генов детоксикации ксенобиотиков, нейрональной и эндотелиальной синтаз оксида азота [Иващенко Т.Э., Баранов B.C., 2002; Корытина Г.Ф. и др., 2004; Келемберт Н.А. и др., 2005].

В связи с широкой вариабельностью клинической картины идентификация генов, вовлеченных в патогенез отдельных синдромов MB, является важной медико-генетической задачей во всем мире, решение которой позволит не только выявить генетические факторы риска определенных осложнений, но оптимизировать лечение этого тяжелого заболевания. Возможность прогнозировать дальнейшее течение заболевания и возникновение определенных осложнений позволит обеспечить своевременное проведение целенаправленных профилактических мероприятий, повысить эффективность проводимого лечения и может способствовать созданию новых этиопатогенетических подходов к терапии заболевания, что будет способствовать дальнейшему увеличению продолжительности и повышению качества жизни больных.

На основании вышесказанного были определены цели и задачи настоящего исследования.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Тимковская, Елизавета Ефимовна

5. ВЫВОДЫ.

1. Среди выборки больных MB наиболее многочисленной генетически однородной группой явилась группа пациентов, гомозиготных по мутации F508del (148 человек - 32%). На основе созданного регистра определены особенности клинической картины у больных данной группы, для которых в большей мере характерна смешанная форма заболевания, а также быстрое прогрессирование бронхолегочного процесса и поражения гепатобилиарной системы.

2. Частоты изученных мутаций и полиморфизмов в генах TNFA, LTA, GSTM1, MBL2, HFE в выборках здоровых индивидов и больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del, не различаются. Выявлено достоверное увеличение частоты аллеля А полиморфизма VNTR eNOS4 у больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del (20,8%), по сравнению с выборкой здоровых индивидов (11,1%)(р<0,01).

3. У больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del гена CFTR, носителей аллеля A VNTR eNOS4, установлены более тяжелое течение бронхолегочного процесса (р<0,05), проявляющееся снижением показателей ФЖЕЛ (69,4% от должного против 80,6% от должного) и ОФВ] (64,5% от должного против 11,6% от должного) и менее выраженное поражение печени, заключается в меньшей частоте цирроза (6,1 % против 22,1%), по сравнению с гомозиготными носителями аллеля В (р<0,05).

4. Выявлен более поздний возраст постановки диагноза у больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del гена CFTR, имеющих аллель А полиморфизма -308 G-A гена TNFA (3,21 года), а также среди пациентов, гетерозиготных по обоим полиморфизмам -308 G-A гена TNFA и +252 A-G гена LTA (3,31 года) по сравнению с обладателями нормальных генотипов по данным полиморфизмам (1,89 года и 1,69 года, соответственно; р<0,05).

5. Обнаружено значимое увеличение частоты фиброза печени в группе больных муковисдидозом, с генотипом F508del/F508del по гену CFTR, гомозиготных по делеционному полиморфизму гена GSTM1 (14%), по сравнению с больными, имеющими аллель дикого типа GSTM1 (1,8%) (р<0,05), в то время как частота цирроза в группах достоверно не отличалась (14,04% и 23,21% соответственно, р>0,05).

6. У больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del гена CFTR, носителей мутантных аллелей гена MBL2 установлено более тяжелое течение бронхолегочного процесса, чем у больных с YA/YA генотипом MBL2 (р<0,05), проявляющееся снижением показателей ОФВ] у детей дошкольного возраста (68,5% от д. против 89,9% от д.), более ранним инфицированием P. aeruginosa (4,9 года против 6,9 лет) и более частым обнаружением Al. xylosoxidans и St. maltophilia (14,3% против 3% и 30% против 12,5%, соответственно). У носителей мутантных аллелей гена MBL2 наблюдается более тяжелые проявления со стороны пищеварительной системы, заключающиеся в более частом развитием мекониального илеуса, синдрома дистальной интестинальной обструкции (22,6% против 8,1%) и холестатического гепатита (7,8% против 0) (р<0,1) в сравнении с гомозиготами по аллелям дикого типа гена MBL2.

7. У больных муковисцидозом, гомозиготных по мутации F508del гена CFTR, являющихся носителями мутации H63D в гене HFE, выявлено более тяжелое, чем у обладателей Н/Н генотипа, поражение желудочно-кишечного тракта (р<0,05), проявляющееся ранней манифестацией кишечного синдрома (0,19* года против 0,43 года), более частым развитием мекониального илеуса и синдрома дистальной интестинальной обструкции (24,2% против 9,1%). У носителей мутации H63D также прослеживается более благоприятное течение бронхолегочного процесса, по сравнению с гомозиготами по нормальному аллелю, выражающиеся лучшими показателями ФЖЕЛ

85,8% от д. против 74,8% от д.) и редким высевом St. maltophilia (3% против 15%) (р<0,1).

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Учитывая достаточно четкую корреляцию тяжести легочной патологии с аллелем А полиморфизма VNTR eNOS4 и вариантными аллелями мутаций G54D, G57E, R52C и полиморфизма -221G-C MBL2 представляется вполне оправданным рекомендовать генотипирование больных MB на наличие неблагоприятных аллелей этих генов с целью объективного прогноза течения заболевания и выработки более рациональной тактики лечения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тимковская, Елизавета Ефимовна, Москва

1. Амелина Е.Л, Черняк А.В, Черняев А.Л. Муковисцидоз: определение продолжительности жизни // Пульмонология, 2001, №3, стр.61-64.

2. Ванин А.Ф. Оксид азота регулятор клеточного метаболизма // Соросовский образовательный журнал, 2001, №11, стр. 7-12.

3. Вознесенский Н.А., Чучалин А.Г., Антонов Н.С. Окись азота и легкие. // Пульмонология, 1998, Vol.8, № 2,стр. 6-10.

4. Жеребцова А.Л. Изучение полиморфных маркеров ДНК в кандидатных генах болезни двигательного нейрона. // Дисс. канд. мед. наук., Москва, 2006, 165стр.

5. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. // М.: Наука, 1991, 271стр.

6. Зубков М.Н., Самойленко В.А., Гугуцидзе Е.Н., Чучалин А.Г. Микробиологические аспекты этиологии и антимикробной терапии бронхолегочной инфекции при муковисцидозе у взрослых // Пульмонология, 2001, №3, стр. 38-41.

7. Иващенко Т.Э., Баранов B.C. Биохимические и молекулярно-генетические основы патогенеза мковисцидоза. «Интермедика», Санкт-Петербург, 2002 256 стр.

8. Капранов Н.И., Делягин В.М. Муковисцидоз с точки зрения врача общей практики. // Лечещий врач, 1998, №4 http://old.osp.ru/doctore/1998/04/24print.htm

9. Капранов Н.И., Каширская Н.Ю., Петрова Н.В. Муковисцидоз. Достижения и проблемы на современном этапе. // Мед. генетика, 2004, №9, стр. 398-412.

10. Ю.Капранов Н.И., Каширская Н.Ю. Воронкова А.Ю., Шабалова Л.А., Васильева Ю.И., Капустина Т.Ю., Радионович A.M., Толстова В.Д. Муковисцидоз (Современные достижения и актуальные проблемы). Методические рекомендации. Москва, 2005г, 110стр.

11. П.Капранов Н.И., Рачинский С.В. Муковисцидоз. Москва, 1995, 188 стр.

12. Капранов Н.И., Шабалова J1.A. Рациональная антибиотикотерапия и роль ципрофлоксацина в лечении бронхолегочной инфекции у детей с муковисцидозом. // Применение ципрофлоксацина у детей при лечении тяжелых инфекций. Москва, 1999, стр. 36- 62.

13. З.Капранов Н.И., Шабалова Л.А., Каширская Н.Ю. Муковисцидоз (Современные достижения и проблемы). Методические рекомендации. Москва, 2001, 76 стр.

14. И.Каширская Н.Ю. Состояние желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы и гепатобилиарной системы у больных муковисцидозом // Автореф. дисс. . докт. мед. наук, Москва, 2001, 45стр.

15. Корытина Г.Ф., Янбаева Д.Г., Викторова Т.В. Полимофизм генов глутатион-8-трансфераз' Ml и Р1 у больных с муковисцидозом и хроничсескими заболеваниями дыхательной системы. // Генетика, 2004, том 40,№3, стр. 401- 408.

16. Кулинский В.И. Обезвреживание ксенобиотиков. // Соросовский Образовательный журнал 1999.№1, стр. 8-12.

17. Насонов E.JI. Фактор некроза опухоли новая мишень для противовоспалительной терапии ревматоидного артрита. // Клиническая фармакология и терапия, 2001, №1, стр. 64-70. http://www.cardioline.ru/show/?rid=268

18. Петрова Н.В. Определение относительных частот некоторых мутаций гена CFTR и анализ гаплотипов сцепленных с ними ДНК- маркерных локусов в Популяции России. // Автореф. дисс. . канд. биол. наук, Москва, 1996, 24 стр.

19. Петрова Н.В., Тимковская Е.Е. Анализ частых мутаций и гаплотипов внутригенных маркеров у больных муковисцидозом и в норме. (Тезисы) // 5-й Славяно-Балтийский научный форум «Санкт-Петербург Гастро-2003а», 10-12 сентября 2003г., стр.80.

20. Петрова Н.В., Тимковская Е.Е., Зинченко Р.А., Гинтер Е.К. Анализ частоты некоторых мутаций в гене CFTR в разных популяциях России. // Медицинсая генетика, 2006, №2, стр.32-39.

21. Радионович A.M., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. Клиническое значение субингибирующих доз кларитромицина при лечении хронического бронхолегочного процесса у детей, больных муковисцидозом.// Детская больница, 2006, №1(23), стр.21-29.

22. Тимковская Е.Е., Петрова Н.В., Ельчинова Г.И., Нурбаев С.Д., Амелина С.С., Зинченко Р.А., Гинтер Е.К. Анализ частот мутаций C282Y и H63D в гене HFE1 в некоторых популяциях европейской части России. Медицинская генетика,2006,№5(47), стр. 32-38.

23. Тимковская Е.Е., Петрова Н.В., Зинченко Р.А. Анализ некоторых мутаций генов частых наследственных болезней в популяциях России. / V Съезд Медицинских генетиков, Уфа, май 2005 // Медицинская генетика, 2005, Т.4, №6, стр. 275.

24. Хусаинова Р.И., Федорова С.А., Хуснутдинова Э.К. Скрининг Cys282Tyr и His63Asp в гене гемохроматоза у народов Волго-Уральского региона и Республики Саха (Якутия). // Медицинская генетика. 2003. - Т.2, №5. -стр.207-211.

25. Aggarwal ВВ, Eessalu ТЕ, Hass РЕ. Characterization of receptors for human tumour necrosis factor and their regulation by gamma-interferon. // Nature, 1985 Dec. 19-1986 Jan. 1,318(6047), p. 665-7.

26. Akar N., Akar E., CinS. Endothelial nitric oxide synthase intron 4, 27-bp repeat polymorphism in Turkish patients with deep vein thrombosis and cerebrovascular accidents // Thrombosis Res., 1999,V. 94, p. 63-64.

27. Allen E.D. Cystic fibrosis: a decade of progress. Drugs Today (Bare)., 1999, Nov, 35(11), p. 835-48.

28. Armstrong D.S., Grimwood K., Cardin J.B. Lower airway inflammation in infants and young children with cystic fibrosis // Am J Respir Crit Care Med., 1997, V.156. p. 1197-1204.

29. Baranov V.S., Ivashenko Т., Bakay В. Proportion of the GSTM1 0/0 genotype in some Slavic populations and its correlation with cystic fibrosis and other multifactorial dis-eases. //Hum Genet 1996; 97, p. 517-20.

30. Bemig Т., Breunis W., Brouwer N. An analysis variation across the MBL2 locus in Dutch Caucasians indicates that 3' haplotypes could modify circulating levels of mannose-binding lectin. //Hum.Genet., 2005, V.l 18(3-4), p.404-415.

31. Bemig Т., Taylor J.G., Foster C.B. Sequence analysis of the mannose-binding lectin (MBL2) gene reveals a high degree of heterozygosity with evidence of selection. // Genes Immun., 2004, V.5(6), p.461-476.

32. Beutler E, Gelbart T, West C, Lee P, Adams M, Blackstone Pockros R.P. Mutation Analysis in Hereditary Hemochromatosis. // Blood Cells, Molecules, and Diseases, 1996, Aug, 22(16) 31, p. 187-194.

33. Boldt A.B., Culpi L., Tsuneto L.T. Diversity of the MBL2 gene in various Brasilian populations and the case of selection at the mannose-binding lectin locus. // Hum.Immunol., 2006, V.67(9), p.722-734.

34. Bittencourt P.L., Palacios S.A., Cancado E.L. Susceptibility to primary sclerosing cholangitis in Brazil is associated with HLA-DRB1*13 but not with tumour necrosis factor alpha -308 promoter polymorphism. // Gut, 2002, V.51(4), p. 609-10.

35. Bonfield T.L., Panuska J.R., Konstan M.W. Inflammatory cytokines in cystic fibrosis lungs. // Am.J.Respir.Crit.Care Med., 1995, V. 152(6 Pt 1), p. 2111-8.

36. Borgo G, Mastella G, Gasparini P, Zorzanello A, Doro R, Pignatti PF. Pancreatic function and gene deletion F508 in cystic fibrosis. J Med Genet., 1990 Nov, V. 27(11), p. 665-9.

37. Borowiz D, Bacer RD, Stallings V. Consensus report on nutrition for pediatric patients with cystic fibrosis. // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 2002, V.35, p.246-59.

38. Brissot P., Troadec M.B., Lore'al O. Intestinal absorption of iron in HFE-1 hemochromatosis: local or systemic process? Review. // Journal of Hepatology, 2004,4, p. 702-709.

39. Brown RK, Wyatt H, Price JF, Kelly FJ. Pulmonary dysfunction in cystic fibrosis is associated with oxidative stress. // Eur. Respir. J., 1996, V. 9, p. 334339.

40. Buranawuti K., Boyle M.P., Cheng S. Variants in mannose-binding lectin and tumor necrosis factor {alpha} affect survival in cystic fibrosis. // J.Med.Genet., 2006, Dec.l 1 Epub ahead of print.

41. Burt M.J., George P.M., Upton J.D. The significance of haemochromatosis gene mutations in the general population: implications for screening // Gut, 1998, V. 43(6), p.830-836.

42. Cantlay AM, Smith CA, Wallace WA, Yap PL, Lamb D, Harrison DJ. Heterogeneous expression and polymorphic genotype of glutathione S-transferases in human lung. // Thorax, 1994 Oct, V. 49(10), p. 1010-4.

43. Carlsson M., Sjoholm A.G., Eriksson L. Deficiency of the mannan-binding lectin pathway of complement and poor outcome in cystic fibrosis: bacterial colonization may be decisive for a relationship. // Clin.Exp.Immumol., 2005, V. 139(2), p.306-13.

44. Chagani Т., Pare P.D., Zhu S. Prevalence of tumor necrosis factor-alpha and angiotensin converting enzyme polymorphisms in mild/moderate and fatal/near-fatal asthma. // Am.J.Respir.Crit.Care Med., 1999, V. 160(1), p. 27882.

45. Cystic fibrosis foundation patient registry 1997 annual data report. Bethesda, MD, USA. Cystic Fibrosis Foundation 1998.

46. Cystic fibrosis genotype-phenotype consortium. Correlation between genotype and phenotype in patients with cystic fibrosis // N. Engl. J. Med., 1993, V.329, p.1308.

47. Cystic fibrosis mutation database, Mar.,2007 http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/StatisticsPage.html

48. Darling K.E., Dewar A., Evans T.J. Role of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in internalization of Pseudomonas aeruginosa by polarized respiratory epithelial cells. // Cell Microbiol., 2004, Jun, V. 6(6), p. 521-33.

49. Davies J, Alton E, Griesenbach U. Cystic fibrosis modifier genes. Review.// J. R. Soc. Med., 2005, V. 98 (45), p. 47-54.

50. Davies J., Neth O., Alton E. Differetial binding of mannose-binding lectin to respiratoiy pathogens in cystic fibrosis. // Lancet, 2000, V. 355(9218), p. 18856.

51. Davies J.,Turner M.W., Klein N. Impaired pulmonary status in cystic fibrosis adults with two mutated MBL-2 alleles. // Eur.Respir.J., 2004, V.24, p.798-804.

52. Dean Т., Dai Y., Shute K., Church MK, Warner JO. Interleukin-8 concentrations are elevated in bronchoalveolar lavage, sputum, and sera of children with cystic fibrosis. // Pediatric Research, 1993, V. 34, p. 159-161.

53. Demko CA, Stern RC, Doershuk CF. Stenotrophomonas maltophilia in cystic fibrosis: incidence and prevalence. Pediatr Pulmonol. 1998 May, V. 25(5), p. 304-8.

54. Devaney J., Maher M., Smith Т., Houghton J.A., and M. Glennon. HFE Alleles in an Irish Cystic Fibrosis Population. // Geneting testing, 2003 V. 7, № 2, p. 155-158.

55. D6rk Т., M.Macek Jr., F.Mekus. Characterization of a novel 21-kb deletion, CFTRdele2,3(21kb), in the CFTR gene: a cystic fibrosis mutation of Slavic origin common in Central and East Europe. // Hum.Genet., 2000, V. 106, p. 259-268.

56. Dotsch J., Demirakca S., Terbrack H.G., Huls G, Rascher W., Kuhl P.G. Airway nitric oxide in asthmatic children and patients with cystic fibrosis. // Eur. Respir. J., 1996 Dec, V. 9(12), p. 2537-40.

57. Drumm M.L., Konstan M.W., Schluchter M.D. Genetic modifiers of lung disease in cystic fibrosis. //N. Engl.J.Med., 2005, V.6, 353(14), p. 1443-53.

58. Engracia V., Leite M.M.B.S., Pagotto R.C., Zucoloto S., Barbosa C.A.A, Mestriner, M.A. Expression of Class m Glutathione-S-Transferase in human liver and its association with hepatopathies. // Am. J. of Med. Gen., 2003, V. 123A, p. 257-260.

59. Ferrari M., Cremonesi L. Genotype-phenotype correlation in cystic fibrosis patients // Ann. Biol. Clin. (Paris), 1996, V. 54, №6, p.235-41.

60. Fodinger M, Sunder-Plassmann G. Low clinical penetrance of homozygosity for HFE C282Y: implications for genetic testing? // Eur. J. Clin. Invest., 2003 Sep, V. 33(9), p. 737-9.

61. Gabold M., Guilloud-Bataille M., Feingold J. Association of variant alleles of mannose binding lectin with severity of pulmonary disease in cystic fibrosis: cohort study.//B.M.J., 1999, V.319, p. 1166-1167.

62. Gabold M., Hubert D., Guilloud-Bataille M. The mannose binding lectin gene influences the severity of chronic liver disease in cystic fibrosis. // J. Med. Genet., 2001, V.38, p.310-311.

63. Garred P., Larsen F., Madsen H.O., Koch C. Mannose-binding lectin deficiency-revisited. // Mol. Immunol., 2003, V.40, p.73-84.

64. Garred P., Pressler Т., Lanng S. Mannose-binding lectin (MBL) therapy in an MBL-deficient patient with severe cystic fibrosis lung disease. // Pediatr.Pulmonol., 2002, V.33(3), p.201-7.

65. Ghio AJ, Turi JL, Yang F, Garrick LM, Garrick MD. Iron homeostasis in the lung. //Biol Res., 2006, V. 39(1), p. 67-77.

66. Ghobadloo SM, Yaghmaei B, Bakayev V, Goudarzi H, Noorinayer B, Rad FH, Samiy S, Aghabozorghi S, Zali MR. GSTP1, GSTM1, and GSTT1 genetic polymorphisms in patients with cryptogenic liver cirrhosis. // J Gastrointest Surg. 2004 May-Jun;8(4):423-7.

67. Goh В J, Tan ВТ, Hon WM, Lee KH, Khoo HE. Nitric oxide synthase and heme oxygenase expressions in human liver cirrhosis. // World J. Gastroenterol., 2006, Jan 28, V. 12(4), p.588-94.

68. Gong M.N., Zhou W., Williams P.L. -308GA and TNFB polymorphisms in acute respiratory distress syndrome. // Eur. Respir. J., 2005, V.26, p. 382-389.

69. Grasemann H., Gravesande K.S., Bu'scher R., Knauer N., Silverman E S, Palmer L.J., Drazen J. M., Ratjen F. Endothelial Nitric Oxide Synthase Variants in Cystic Fibrosis Lung Disease. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 2003, V. 167, p. 390-394.

70. Greally P., Hussein M.J., Cook A.J. Sputum tumour necrosis factor-alpha and leukotriene concentrations in cystic fibrosis. //Arch.Dis.Child., 1993, V. 68, p. 389-92.

71. Hanson E., Imperatore G., Burke W. HFE gene and hereditary hemochromatosis: a Huge review. Human Genome Epidemiology // Am. J. Epidemiol., 2001, V.154, №3, p.193-206.

72. Hardin D.S., Leblanc A., Marshall G., Seilheimer D.K. Mechanisms of insulin resistance in cystic fibrosis. // AmJ.Physiol.Endocrinol.Metab., 2001, V.281(5), p. 1022-8.

73. Henrion-Caude A., Flamant C., Roussey M., Housset C., Flahault A.,. Fryer A. A, Chadelat K., Strange R. C., Clement 1 A. Liver Disease in Pediatric Patients

74. With Cystic Fibrosis Is Associated With Glutathione S-Transferase PI Polymorphism.// Hepatology, 2002, V. 36, №. 4, p.913-17.

75. Hodson M.E., Duncan M.G. Cystic Fibrosis. Arnold, a member of the Hodder Headline Group, London, UK., 2000, 477p.

76. Hooper W.C., Lally C., Austin H. The relationship between polymorphism in the endothelial nitric oxide synthase gene and platelet GPIIIa gen with myocardian infarction and venous thromboembolism in African Americans// Chest, 1999,V. 116(4), p. 880-886.

77. Huang S.L., Su C.H., Chang S.C. Tumor necrosis factor-alpha gene polymorphism in chronic bronchitis. // Am.J.Respir.Crit.Care Med., 1997, V.156, p. 1436-1439.

78. Hull J., Thomson A. Contribution of genetic factors other than CFTR to disease severity in cystic fibrosis. // Thorax, 1998, V.53, p. 018-1021.

79. Imundo L, Barasch J, Prince A, al-Awqati Q. Cystic fibrosis epithelial cells have a receptor for pathogenic bacteria on their apical surface. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, V. 92, p. 3019-3023.

80. Kallianpur AR, Hall LD, Yadav M, Christman BW, Dittus RS, Haines JL, Pari FF, Summar ML. Increased prevalence of the HFE C282Y hemochromatosis allele in women with breast cancer. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2004 Feb, V. 13(2), p. 205-12.

81. Kerem E., Corey M., Kerem B.S. The relation between genotype and phenotype in cystic fibrosis analysis of the most common mutation (delta F508). //N.Engl.J.Med., 1990, V.323, p.1517-1522.

82. Kerem В., Kerem E. The molecular basis for disease variability in cystic fibrosis // Eur J Hum Genet., 1996, V. 4, p.65-73.

83. Kim, Y. J.; Lee, H.-S.; Yoon, J.-H. Association of TNF-alpha promoter polymorphisms with the clearance of hepatitis В virus infection. // Hum.Molec.Genet., 2003, V.12, p. 2541-2546.

84. Lee S.G., Yum J.S., Moon H.M. Analysis of mannose-lectin 2 (MBL2) genotype and the serum protein levels in the Korean population. // Mol.Immunol., 2005, V.42(8), p. 969-977.

85. Lee, Y. H.; Harley, J. В.; Nath, S. K. Meta-analysis of TNF-alpha promoter -308A/G polymorphism and SLE susceptibility. // Europ.J.Hum.Genet., 2006, V.14, p. 364-371.

86. Loubieres Y, Grenet D, Simon-Bouy B, Medioni J, Landais P, Ferec C, Stern M. Association between genetically determined pancreatic status and lung disease in adult cystic fibrosis patients. // Chest, 2002 Jan, V. 121(1), p. 73-80.

87. Madsen H.O., Satz M.L., Hogh B. Different molecular events result in low protein levels of mannan-binding lectin on populations from Southeast Africa and South America. //J.Immunol., 1998, V.161, p. 3169-3175.

88. Martin A.M., Athanasiadis G., Greshok J.D. Population frequencies of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in immuno-modulatory genes. // Hum.Hered., 2003, V. 55(4), p. 171-8.

89. Martin PM, Gnana-Prakasam JP, Roon P, Smith RG, Smith SB, Ganapathy V. Expression and polarized localization of the hemochromatosis gene product HFE in retinal pigment epithelium. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2006, V. 47(10), p. 4238-44.

90. Maselli J.H., Sontag M.K., Norris J.M. Risk factors for initial acquisition of Pseudomonas aeruginosa in children with cystic fibrosis identified by newborn screening. // Pediatr. Pulmonol., 2003, V.35, p. 257-262.

91. McKone E.F., Emerson S.S., Edwards K.L., Aitken M.L. Effect of genotype on phenotype and mortality in cystic fibrosis: a retrospective cohort study. // Lancet, 2003, V.361(9370), p. 1671-1676.

92. McKone EF, Goss CH, Aitken ML. CFTR genotype as a predictor of prognosis in cystic fibrosis. // Chest, 2006 Nov, 130(5), p. 1441-7.

93. Mekus N, Ballmann M, Bronsveld I, Bijman J, Veeze H, Tummler B. Categories of deltaF508 homozygous cystic fibrosis twin and sibling pairs with distinct phenotypic characteristics. // Twin Res., 2000, V. 3, p. 277-293.

94. Mekus F, Tummler B. Cystic fibrosis and NOS3. // Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2004 Jan 15, V. 169(2), p. 319-20.

95. Mira, J.-P., Cariou, A., Grail, F. Association of TNF2, a TNF-alpha promoter polymorphism, with septic shock susceptibility and mortality: a multicenter study. // J.A.M.A., 1999, V.282, p. 561-568.

96. Mishra A., Greaves R., Massie J. The relevance of sweat testing for the diagnosis of cystic fibrosis in the genomic era. // Clin. Biochem.Rev., 2005, V.26, p. 135-153.

97. Miyahara K, Kawamoto T, Sase K, Yui Y, Toda K, Yang LX, Hattori R, Aoyama Т., Yamamoto Y., Doi Y. Cloning and structural characterization of the human endothelial nitric-oxide-synthase gene. // Eur. J. Biochem., 1994 Augl,V. 223(3), p. 719-26.

98. Moffatt MF, Cookson WO. Related Articles. Tumour necrosis factor haplotypes and asthma. // Hum.Mol.Genet., 1997, V.6(4), p. 551-4.

99. Mohammed NA, Abd El-Aleem S, Appleton I, Maklouf MM, Said M, McMahon RF.Expression of nitric oxide synthase isoforms in human liver cirrhosis. // J. Pathol., 2003 Aug, V. 200(5), p. 647-55.

100. Moller-Kristensen M., Eddie Ip W.K., Shi L. Deficiency of mannan-binding lectin greatly increases susceptibility to postburn infection with Pseudomonas aeruginosa. // J.Immunol., V. 176, p.l 769-1775.

101. Morrissey BM, Schilling K, Weil JV, Silkoff PE, Rodman DM. Nitric oxide and protein nitration in the cystic fibrosis airway. // Arch. Biochem. Biophys., 2002 Oct 1, V. 406(1), p.33-9.

102. Mukhopadhyay S., Hoidal J.R., Mukherjee Т.К. Role of TNFalpha in pulmonary pathophysiology. // Respir.Res., 2006., V.l 1 (7), p. 125.

103. Nedwin, G. E., Naylor, S. L., Sakaguchi, A. Y. Human lymphotoxin and tumor necrosis factor genes: structure, homology and chromosomal localization.//Nuc.Ac.Res., 1985, V. 13, p.6361-6373.

104. Neuman M., Angulo P., Malkiewicz I. Tumor necrosis factor-alpha and transforming growth factor-beta reflect severity of liver damage in primary biliary cirrhosis. // J.Gastroenterol.Hepatol., 2002, V. 17(2), p. 196-202.

105. Nguyen Т., Louie S.G., Beringer PM, Gill M.A. Potential role of macrolide antibiotics in the management of CF lung desease // Curr. Opin. Pulm. Med. 2002. - Vol.8, №6. - P.521-528.

106. Nicolae D., Cox N.J., Lester L.A., Schneider D., Tan Z., Billstrand C. Fine mapping and positional candidate studies identify HLA-G as an asthma susceptibility gene on chromosome 6p21. Am. J. Hum. Genet., 2005 Feb, V. 76(2), p. 349-57.

107. Niwa Y., Ito H., Matsuo K. Lymphotoxin-a polymorphisms and the risk of endometrial cancer in Japanese subjects. // Gynecol.Oncol., 2006., Oct 10 Epub ahead of print.

108. Norek A, Romanowska-Pietrasiak B, Bal J. Genetic markers in the pathogenesis of osteopenia and osteoporosis in cystic fibrosis. // Med. Wieku Rozwoj. 2006 Jan-Mar, V. 10(1 Pt 2), p. 275-87.

109. Ozaki, K., Ohnishi, Y., Iida, A. Functional SNPs in the lymphotoxin-alpha gene that are associated with susceptibility to myocardial infarction. // Nature Genet., 2002, V.32., p. 650-654.

110. Park K.S., Kim M.Y., Мок J.W. Ncol restriction fragment length polymorphism at -308 of the tumor, necrosis factor alpha (TNFA) promoter region in Korean. // Jpn.J.Hum.Genet., 1997, V.42(l), p. 241-7.

111. Patuzzo С., Gile L. S., Zorzetto M. Tumor Necrosis Factor Gene Complex in COPD and Disseminated Bronchiectasis. // Chest, 2000, V.5, 117, p. 13531358.

112. Peterlin B, Globocnik Petrovic M, Makuc J, Hawlina M, Petrovic D. A hemochromatosis-causing mutation C282Y is a risk factor for proliferative diabetic retinopathy in Caucasians with type 2 diabetes. // J Hum Genet., 2003, V. 48(12), p. 646-9.

113. N.V. Petrova, E.E. Timkovskaya, E.K. Ginter. Analysis of common mutations and intragenic marker haplotypes in CF and normal samples from Russia. // 7th International Symposium for Cystic Fibrosis, Slovakia, 2003, no.23, p. 12.

114. Pirzada O, Taylor C. Modifier genes and cystic fibrosis liver disease.Hepatology, 2003 Mar, V. 37(3), p. 714.

115. Quinton PM. Physiological basis of cystic fibrosis: a historical perspective. // Physiol Rev., 1999 Jan, V. 79(1 Suppl), S3-S22.

116. Rohlfs E.M., Shaheen N.J., Silverman L.M. Is the hemochromatosis gene a modifier locus for cystic fibrosis? // Genet. Test., 1998, V. 2(1), p. 85-8.

117. Rosenstein B.J, Zeitlin P.L.Cystic fibrosis. // Lancet, 1998, V. 351, p. 27782.

118. Rowntree RK, Harris A. The phenotypic consequences of CFTR mutations. Review. // Ann. Hum. Genet. 2003 Sep, V. 67(Pt 5), p. 471-85.

119. Saiman L, Siegel J. Infection control in cystic fibrosis. Review. // Clin. Microbiol. Rev., 2004 Jan, V. 17(1), p. 57-71.

120. Salvatore F., Scudiero O., Castaldo G. Genotype-phenotype correlation in cystic fibrosis: The role of modifier genes. // Am J.Med. Genet., 2002, V. Ill, p. 88-95.

121. Sampietro M., Piperno A., Lupica L. High prevalence of the His63Asp HFE mutation in Italian patients with porphyria cutanea tarda // Hepatology, 1998, V. 27, № l,p. 181-184.

122. Sanchez M., Villa M., Ingelmo M., Sanz C., Bruguera M., Ascaso C., Oliva R. Population screening for hemochromatosis: a study in 5370 Spanish blood donors// J Hepatol., 2003, V.38 (6), p. 745-750.

123. Scheid P, Kempster L, Griesenbach U, Davies JC, Dewar A, Weber PP, Colledge WH, Evans MJ, Geddes DM, Alton EW. Inflammation in cystic fibrosis airways: relationship to increased bacterial adherence. // Eur. Respir. J., 2001 Jan, V. 17(1), p. 27-35.

124. Schmitt-Grohe S., Stuber F., Book M. TNF-alpha promoter polymorphism in relation to TNF-alpha production and clinical status in cystic fibrosis. // Lung, 2006, V. 184(2), p. 99-104.

125. Sekut L., Connolly K. AntiTNF-alpha agents in the treatment of inflammation. //Expert.Opin.Investig.Drugs, 1998, V.7(l 1), p.l825-39.

126. Shin, H.D., Park, B.L., Kim, L.H. Association of tumor necrosis factor polymorphisms with asthma and serum total IgE. // Hum. Molec.Genet., 2004, V.13, p. 397-403.

127. Song J., Yoon Y., Park K. U., Park J., Hong Y. J., Hong S. H., and Kim J. Q. Genotype-specific Influence on Nitric Oxide Synthase Gene Expression,

128. Protein Concentrations, and Enzyme Activity in Cultured Human Endothelial Cells. // Clinical Chemistry, 2003, V. 49 (6), p. 847-852.

129. Steffensen R., Thiel S., Varming K. Detection of structural gene mutations and promoter polymorphisms in the mannan-binding lectin (MBL) gene by polymerase chain reaction with sequence specific primers. // J.Immunol.Methods., 2000, V.241, p.33-42.

130. Tanus-Santos JE, Desai M, Flockhart DA. Effects of ethnicity on the distribution of clinically relevant endothelial nitric oxide variants. // Pharmacogenetics, 2001 Nov, V. 11(8), p. 719-25.

131. Thio C.L., Mosbruger Т., Astemborski J. Mannose binding lectin genotypes influence recovery from hepatitis В virus infection. // J.Virol., 2005,V.79, №14, p.9192-9196.

132. Tsui L.C. The spectrum of cystic fibrosis mutation // Trends Genet., 1992, V.8., p. 392-8.

133. Turner M.W. Mannose-binding lectin (MBL) in health and disease. // Immunobiology, 1998, V.199, p. 327-339.

134. Verdu P., Barreiro L.B., Patin E. Evolutionary insights into the high worldwide prevalence of MBL2 deficiency alleles. // Hum.Mol.Genet., 2006, V. 15(17), p. 2650-2658.

135. Welsh M.J., Smith A.E. Molecular mechanisms of CFTR chloride channel dysfunction in cystic fibrosis // Cell, 1993, V.73, p. 1252-4.

136. Wilson A.G., Symons J.A., McDowell T.L. Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional activation. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1997, V.l;94(7), p. 3195-9.

137. Wiertsema S.P., Helpers B.L. Veenhoven R.H. Functional polymorphisms in the mamman-binding lectin 2 gene: effect on MBL levels and otitis media. // J.Allergy Clin.Immunol., 2006, V.l 17(6), p. 1344-1350.

138. Witt H. Chronic pancreatitis and cystic fibrosis. // Gut, 2003, V.52, Suppl 2, p. 1131-41.

139. Witte J.S., Palmer, L.J., O'Connor, R.D. Relation between tumour necrosis factor polymorphism TNF-alpha-308 and risk of asthma. // Europ.J.Hum.Genet., 2002, V.10, p. 82-85.

140. Yarden J., Radojkovic D., De Boeck K. Polymorphism in the mannose binding lectin gene affects the cystic fibrosis pulmonary phenotype. // J.Med.Genet., 2004, V.41, p.629-633.

141. Yarden J., Radojkovic D., De Boeck K. Association of tumour necrosis factor alpha variants with the CF pulmonary phenotype. // Thorax, 2005, V.60(4), p. 320-5.

142. Zhana X., Lia D., and Johnsa R. A. Expression of Endothelial Nitric Oxide Synthase in Ciliated Epithelia of Rats Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 2003 Jan., Vol. 51, p. 81-87.

143. Zhang D.L., Li J. S., Jiang Z.W. Association of two polymorphisms of tumor necrosis factor gene with biliary pancreatitis. // World J.Gastroenterol., 2003, V.4, p. 824-828.

144. Zhang Z., Lay H. Comparison of the use of body mass index percentiles and percentage of ideal body weight to screen for malnutrition in children with cystic fibrosis. // Am.J.Clin.Nutr., 2004, V.80, p. 982-91.

145. Zhao Q, Su SY, Chen SF, Li B, Gu DF. Association study of the endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms with essential hypertension in northern Han Chinese. // Chin. Med. J. (Engl), 2006 Jul 5, V. 119(13), p. 106571.