Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза у больных Санкт-Петербурга. Корреляция генотип-фенотип

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза у больных Санкт-Петербурга. Корреляция генотип-фенотип"

На правах рукопясж

БАКАЙ Марина Анатольевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕ ТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНА ТРАНСМЕМБРАННОГО РЕГУЛЯТОРНОГО БЕЛКА МУКОВИСЦИДОЗА У БОЛЬНЫХ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА. КОРРЕЛЯЦИЯ ГЕНОТИП-ФЕНОТИП.

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в Лаборатории пренатальной диагностик] наследственных заболеваний Научно-исследовательского институт; акушерства и гинекологии РАМН им.Д.О.Отта

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.С.Баранов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Л.В.Пучкова

доктор биологических наук В.Н.Горбунова

Ведущее учреждение:

Медико-генетический научный центр Академии медицинских наз России, Москва.

Защита диссертации состоится «....»..........1998г. в ... часов I

заседании Диссертационного совета К.001.23.01 по защи: диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Научнс исследовательском Институте экспериментальной медицины РАМН I адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад.Павлова,12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ РАМН

Автореферат разослан «...»...........1998г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

О.Г,Куликов;

ВВЕДЕНИЕ

туальность тамы. Муковисцидоз (MB) - кистозный фиброз поджелудочной езы - наиболее распространенное, тяжелое моногенное заболевание, ледуемое по аутосомно-рецессивному типу. Частота заболевания в разных уляциях, нациях и этнических группах существенно варьирует, составляя реднем 1:2-2500 новорожденных у представителей белой расы, олекулярно-генетическими методами ген MB картирован на длинном плече мосомы 7 (7q31.1) в 1985 году. В конце 1989 года идентифицирован сам MB и выявлена наиболее частая мутация - delF508, приводящая к этому олеванию, охарактеризован белковый продукт этого гена, получивший вание трансмембранный регуляторный белок муковисцидоза (ТРЕМ)(Riordan al.,1989, Rommens et al.,1989, Kerem et al.,1989). Помимо мутации F508 в гене ТРЕМ обнаружены и другие мутации, число которых быстро растает. В отличие от delF508 подавляющее большинство таких мутаций цставлено спорадическими случаями, т.е. встречается достаточно редко, аогие исследователи делали попытки установить корреляцию между астыо течения заболевания, его формой и конкретными мутациями гена i. Серьезным препятствием для проведения подобных исследований залась сравнительно низкая частота таких мутаций, а также то, что в авляющем большинстве случаев больные были носителями двух разных аций, причем одной из них чаще всего является delF508, тогда как для знения более четкой зависимости необходимо изучение проявления 1ции в гомозиготном состоянии.

Настоящая диссертационная работа представляет собой продолжение золимого лабораторией пренатальной диагностики ИАГ РАМН цикла 1едований по выяснению популяционных особенностей тонкой структуры 1 ТРЕМ, его внутригенных полиморфизмов, идентификации молекулярной юды его мутаций. Учитывая важную медицинскую и социальную значимость >лемы муковисцидоза, молекулярные исследования этого гена безусловно 'альны как для медицинской генетики, так и для генетики человека. !ыявление мажорных мутаций гена ТРЕМ для конкретного региона и гение корреляции между генотипом и фенотипом заболевания позволяют >ать верную стратегию лечения.

(ь исследования: молекулярно-генетический анализ внутригенных морфизмов и мутаций гена ТРЕМ у больных MB и в семьях высокого .а С.Петербурга; изучение особенностей клинического течения

муковисцидоза в зависимости от мутаций гена ТРЕМ и других генетичес факторов.

Основные задачи:

1. Продолжить исследования по идентификации мутаций гена ТРБ больных муковисцидозом с целью выявления новых мажорных мутаций, име) диагностическое значение.

2. Проанализировать особенности внутригенных полиморфизмов ми] сателлитной ДНК интронов 6В и 8 гена ТРЕМ в популяции Северо-запад! региона России и у больных муковисцидозом С.Петербурга.

3. Проанализировать наличие корреляции между тяжестью теч> заболевания, его формой и конкретными мутациями гена ТРЕМ.

4. Изучить особенности клинического проявления мутаций гена ТРБ зависимости от мутаций генов глютатион-Э-трансферазы и микросомал: эпоксид гидролазы, аллелей Главного локуса гистосовместимости (Н полиморфизма интрона 8 гена мышечной протеинкиназы (DMPK), аллелей п< последовательности интрона 8 гена ТРЕМ и полиморфизма M470V в экзон< гена ТРЕМ.

Научная новизна и практическая значимость■

В настоящем исследовании были разработаны собственные вари (модификации) тестирования мутаций 2143delT, 2184insA (экзон 13 W1282X (экзон 20) , имеющих диагностическое значение. Для удобно простой идентификации мутаций 2143delT и 2184insA, а также мино; мутаций 2113delA, 2118del4, 2141insA, delE672, 2176insC, 2183AÎ 2183delAA, 2184delA разработана новая система праймеров, позволя надежно проводить их одновременное тестирование мет гетеродуплексного анализа. Предложена новая система праймеров выявления мутации W1282X: в одном из праймеров был создан искусстве сайт для эндонуклеазы АссВ71, который исчезает при наличии мутации.

Впервые для больных MB Европейской части России и ее Северо-запад региона была оценена частота мажорной для Северной Европы мут 394delTT (экзон 3) , которая составила 2% (Европейский регион Росси] 0.5% (С.Петербург).

Впервые в России проанализированы частоты двух мутаций с части пенетрантностыо: аллелей политимидинового тракта интрона 8 гена ТР] мутации M470V (экзон 10).

редпринят направленный поиск новь« мутаций гена ТРЕМ, в результате зрого впервые обнаружены и охарактеризованы две не описанные ранее ации гена ТРЕМ: 5521пзА(экзон 4) и 136бс}е15 (интрон 8) . Впервые оценены частоты мажорных для Западной Европы и Северной рики мутаций гена ТРБМ для Сольных С. Петербурга и установлен ктр диагностически значимых мутаций гена ТРБМ для больных МВ атербурга: де1Г-508 (45%), И1282Х (2.1%) , 3732с1е1А(1. 6%),

7сЗе1ТА(1.б%), Ш.303К(1.б%), 2143с1е1Т (1.0%) . Сделан вывод о есообразности идентификации мутаций И1282Х, 1677ёе1ТА, 2143с1е1Т, 2бе1А, ЬЛЗОЗК при генетическом обследовании больных МВ и в семьях экого риска, с целью повышения информативности семьи для аатальной диагностики.

роведен анализ корреляции тяжести течения МВ в зависимости от типа аций гена ТРБМ.

настоящем исследовании впервые для популяции Северо-Западного лона России и у больных МВ из С. Петербурга проведена оценка частот альных вариантов гена О0А1 Главного локуса гистосовместимости методом лмеразной цепной реакции. Обнаружена предпочтительная ассоциация елей 201/601 гена Б0А1 Главного локуса гистосовместимости с легочной жэй муковисцидоза и аллелей 401/501 этого же гена со смешанной формой вредней тяжести.

первые была предпринята попытка изучить особенности клинического явления мутаций гена ТРБМ в зависимости от аллельных вариантов других эв, отвечающих за синтез ферментов, участвующих в системе эксикации, таких как ген глютатион-З-трансферазы (СЭТМи и росомальной эпоксид гидролазы (тЕРНХ). Установлено, что снижение явности ферментов, принимающих участие в детоксикации ксенобиотиков, эт вести к преимущественному поражению легких у больных МВ.

Практическая значимость: Разработаны новые методы детекции таких зрных мутаций как Ю1282Х,2143йе1Т, позволяющие просто и надежно атифицировать эти изменения у больных МВ. Выяснены точные данные о готах мутаций гена ТРБМ для Северо-западного региона России, что воляет повысить эффективность пренатальной диагностики в семьях экого риска. Выявленные ассоциации течения МВ с определенными элями Главного локуса гистосовместимости, а также с мутациями генов, гтвующих в системе детоксикации ксенобиотиков, позволяют

прогнозировать характер течения МВ и более эффективно осуществ лечение и профилактические мероприятия.

Положения, выносимые на защиту:

1. Спектр и частота диагностически значимых мутаций для больны* С.Петербурга отличаются от таковых в Западной Европе и Северной Амер а также по России в целом. К диагностически значимым мутац приводящим к МВ в С.Петербурге, можно отнести мутации с!е1Г508(4 И1282Х (2.1%), 3732с1е1А (1. 6%) , 1677с1е1ТА(1. 6%) , Ш303К(1. 2143(3е1т (1.0%) .

2. Установлена низкая (менее 1%) встречаемость мутаций Я334&$, 65 Б1553Х, 21841пзА, 394ае1ТТ, 5521пбА, 3849+ЮкЬ, 136бс1е15 и отсутс мутаций 11541пбТС, И347Р, 05510, йе11-507 в исследованной выборке бол МВ С.Петербурга.

3. Выявляемость мутаций для больных МВ С. Петербурга не превышает что делает нецелесообразным скрининг гетерозиготного носитель мутантного гена ТРЕМ для популяции С.Петербурга; и поиск новых мажо мутаций по-прежнему остается актуальным.

4. Впервые обнаружены и охарактеризованы две не описанные р спорадические мутации гена ТРЕМ: 5521пэА (экзон 4) и 13ббс3е15(интрон

5. Пациенты с одинаковым генотипом могут иметь разную тяжесть теч заболевания, которая зависит от других генов или дополнительных мут в гене ТРЕМ.

6. Установлена определенная корреляция между аллелями 201/601 гена Главного локуса гистосовместимости и легочной формой муковисцид аллелей 401/501 - со средней тяжестью течения смешанной формы МВ.

7. Определенные аллельные варианты генов, белковые продукты кот принимают участие в системе детоксикации ксенобиотиков (глготатио трансферазы и микросомальной эпоксид гидролазы), могут коррелировав преимущественным поражением легких у больных МВ.

Апробация работы. Представленные в диссертации резуль докладывались на Всероссийских и Международных симпозиумах конференциях: на XXIII Научной сессии НИИАГ им.Д.О.Отта (1994 г.), Первом (Третьем) Российском съезде медицинских генетиков (1994,Моек на 2-м Съезде медицинских генетиков Украины (1995, Львов), на 8-ой : ой Северо-Американских конференциях по муковисцидозу (1994,Орла

г Даллас,США), на XXI и XXII Европейских конференциях по зисцидозу (1995,Амстердам; 199б,Иерусалим), на 2-й Европейской гренции по пренатальной диагностике (1997,Будапешт).

акации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

стура и объем диссертации. Работа изложена на 153 страницах полисного текста. Иллюстративный материал представлен 19 таблицами и рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, эиалов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных гдований, заключения, выводов. Список цитируемой литературы содержит источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3 качестве материала использовали образцы ДНК, выделенной из зцитов периферической крови, и пятна крови, нанесенные на гровальную бумагу. В работе использованы образцы ДНК больных MB, эящих на учете в Государственном Центре Диагностики и Лечения MB при Пульмонологии или в отделении пульмонологии Детской городской ■шцы Святой Ольги (г. С.Петербург). Выделение ДНК из лейкоцитов ^ерической крови, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), рестрикцию лентов ДНК специфическими эндонуклеазами, электрофорез в акриламидном геле (ПДАГ) , SSCP-анализ, секвенирование фрагментов ДНК гствляли согласно общепринятым методам (Kunkel et al.,1977; Sanger al.,1977; Orita et al.,1990). Олигонуклеотидные праймеры гзированы в НПО «Сибэнзим», (г.Новосибирск), термостабильная ДНК-■гераза - в НПО «Биотекс», использовались специфические эндонуклеазы «Сибэнзим» и «Promega».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ частоты мутации dalF508 у больных с разной

тяжестью течения MB.

т проанализировано 96 больных MB из С.Петербурга, в том числе L%) - с легочной формой MB и 76(79%)- со смешанной формой MB. В гимости от тяжести течения заболевания больные, имеющие смешанную

форму MB, были разделены на три основных группы: с легким течением человек (12%), среднетяжелым - 33 человека (43%), тяжелым - 34 челог (45%) .

Частота мутации delF508 среди всех больных MB С.Петербурга состав; 45%.

У больных с разными формами MB частота данной мутации достове отличается: 15% - при легочной форме MB, 52.6% - при смешанной форме (Х=10.01,р<0.01). При анализе частоты delF508 у больных со cuemai формой MB (с учетом тяжести течения заболевания) обнаружено, что легком течении MB частота мутации delF508 составляет 50%; среднетяжелом течении MB - 41%; при тяжелом течении MB - 65%. Ка следовало ожидать, частота делеции наиболее высока в группе больны тяжелым течением MB, т.к. мутация delF508 относится к классу «тяже1 мутаций. Однако мы обнаружили достаточно высокий процент встречаемс мутации delF508 в группе с легким течением MB, причем процент гомозъ по делеции одинаков как в этой группе, так и в группе с тяжелым тече1 (33%). По-видимому, это можно объяснить влиянием других генетичес факторов, либо дополнительными мутациями (полиморфизмами) в ТРЕМ ге уже несущем мутацию delF508.

2. Анализ частот некоторых наиболее распространенных в Западной Европе и Северной Америке мутаций гена ТРЕМ у больных MB

С.Петербурга.

С целью определения спектра мутаций гена ТРЕМ, характерных больных MB С.Петербурга, помимо delF508 у MB пациентов исследованы 24 мутации гена ТРЕМ: 394delTT, 552insA, H54insTC, R334W, R347P, G5î G542X, R553X, delI-507, 1677delTA, 1366del5, 2113delA, 2118de 2141insA, 2143delT, E672del, 2176insC, 2183AA-»G, 2183delAA, 2184ir 2184delA, W1282X, N1303K, 3732delA. В анализируемой выборке больных помимо delF508, идентифицировано 12 мутаций : 394delTT, 552insA, R33 G542X, R553X, 1677delTA, 1366del5, 2143delT, 2184insA, W1282X, N13C 3732delA.Мутации 1154insTC, R347P, G551D, delI-507, 2113delA, 2118di 2141insA, E672del, 2176insC, 2183AA-»G, 2183delAA, 2184delA обнаружены. Частоты выявленных мутаций у больных MB приведены в Ta6j 1.

Таблица 1

:тота и ассоциация мутаций гена ТРБМ с полиморфным повтором интрона 6В плели 6ТТП,7ТТП), аллелями политикидинового тракта интрона 8(7Т,9Т) и аллелями локуса М470У (экэон 10).

Название частота аллели ал лели ал лели

мутации мут. хромосом 6ТТП 7ТТП 9Т 7Т Met Val

delF508 86/192 (45%) 86 0 83 3 82 4

2143delT 2/192 (1.0%) 2 0 2 0 2 0

G542X 1/192 (0.5%) 1 0 0 1 1 0

394delTT 1/192 (0.5%) 1 0 1 0 1 0

1366del5 1/192 (0.5%) 1 0 1 0

R553X 1/192 (0.5%) 1 0 0 1 1 0

N1303K 3/192 (1.6%) 2 1 2 1 3 0

W1282X 4/192 (2.1%) 0 4 0 4 4 0

1677delTA 3/192 (1.6%) 0 3 0 3 0 3

3732delA 3/192 (1.6%) 0 3 0 3 1 2

R334W 1/192 (0.5%) 0 1 0 1 1 0

552insA 1/192 (0.5%) 0 1 0 1 0 1

2184¡n$A 1/192 (0.5%) 0 1 0 1 1 0

5щая выявляемость мутаций у больных МВ С.Петербурга составила 56.5%: F/-508 - 45%, другие идентифицированные мутации - 11.5%. Из зеленного анализа спектра МВ мутаций у больных С.Петербурга следует, второй по частоте является мутация W1282X-2.1%. Мутации 1677delTA, 2delA, N1303K встречаются с одинаковой частотой 1.6%,а частота ации 2143delT составила 1.0%. Мутации G542X, 394delTT, 1366del5, ЗХ, R334W, 552insA, 2184insA идентифицированы в единичных случаях и гота каждой из них равна 0.5%.

ля исследования мутаций гена ТРБМ были использованы как известные панты ПЦР анализа, так и разработанные нами тесты, позволяющие ественно сократить затраты времени и средств. Предложенная нами пара ймеров (CF13F ATGGGATGTGATTCTTTCGA, CF13R TCGTATAGAGTTGATTGGAT) воляет амплифицировать фрагмент в 195 п.о.(с 2065 по 2260 нуклеотид) она 13 и надежно, выявлять методом гетеродуплексного анализа 10 естных мутаций, локализованных в этом участке гена. Две из них -4insA и 2143delT относительно часто встречаются у больных МВ России, утацию 2143delT можно отнести к диагностически значимым для больных етербурга.

Для тестирования мажорной мутации W1282X также разработана не система праймеров, позволяющая вместо дорогостоящей эндонуклеазы Mnl которая не производится в России, использовать фермент АссВ71. Для эг. в одном из праймеров был создан искусственный сайт для эндонукле АссВ71:

CCANNNNÍNTGG

ggtnTnnnnacc

В последовательность праймера было введено 3 точечных заме нормальная последовательность: TGG GAT ТСА ATA ACT TTG CAA CAG модифицир. последовательность: TGG GAT ТСА ATA ACT ТСС AAA CAG

При наличии мутации W1282X сайт рестрикции в исследуемом амплифи* исчезает.

Поскольку к настоящему времени в России доступны идентификации оь 65-70% всех мутантных хромосом у больных MB, выявление новых мажор мутаций этого гена продолжает оставаться актуальной проблеь Проведенный в ходе данного исследования направленный поиск мутаций i ТРЕМ позволил обнаружить две новые мутации 552insA (экзон 4) и 1366с (интрон 8). Однако они найдены в единичных случаях, т.е. являк редкими для отечественной популяции, а потому не имеют диагностическ значения.

3. Анализ аллелей тетрамерных нуклеотидных повторов (ТТП) интрона

гена ТРЕМ у больных MB.

В работе проанализировано распределение аллелей тетрамер нуклеотидных повторов (ТТП) интрона 6В в популяции Северо-западн региона России и у больных MB. Частоты аллелей тетрамерных нуклеотид повторов интрона 6В и генотипов представлены в таблице 2.

Как следует из полученных данных, соотношение аллелей у больных смещено в сторону преобладания аллеля 6ТТП, который встречается в раза чаще (Х=21.3, р<0.001), чем аллель 7ТТП, т.е. соотношение аллеле больных оказывается обратным по сравнению с популяционными данными.

Частоты различных генотипов у больных MB и в популяции Северо-западн региона России достоверно отличаются: генотип 7ТТП/7ТТП в отечествен популяции присутствует у 65% здоровых доноров (Х=19.9, р<0.001), генотип 6ТТП/6ТТП - только у 3% (Х=9.2, pcO.Ol). В то же время, больных MB частота гомозигот 6ТТП/6ТТП составляет 37%.

Таблица 2

Распределение генотипов 7ТТП/7ТТП,7ТТП/6ТТП,6ТТП/6ТТП и частоты гслелей 7ТТП и 6ТТП интрона 6В гена ТРЕМ у разных групп больных МВ и в

популяции.

обследованные генотипы аллели

7/7. 7/6. 6/6. 7ТТП 6ТТП

N частота N частота N частота N частота N частота

контроль 20 0.65 10 0.32 1 0.03 98 0.80 26 0.20

MB 15 0.16 45 0.47 35 0.37 75 0.39 115 0.61

MB лег.ф. 6 0.31 11 0.59 2 0.10 23 0.61 15 0.39

MB см.ф. 9 0.12 34 0.45 33 0.43 52 0.34 100 0.66

MB см.ф.л.т. 3 0.33 2 0.22 4 0.44 8 0.44 10 0.56

MB см.ф.с.т. 5 0.15 18 0.55 10 0.30 28 0.42 38 0.58

MB см.ф.т.т. 1 0.03 14 0.41 19 0.56 16 0.24 52 0.76

Наше исследование подтверждает абсолютное сцепление аллеля 6ТТП с ацией delF-508. Мутации G542X, 394delTT, 1366del5, 2143delT, R553X а ТРБМ были обнаружены на хромосомах, несущих аллель 6ТТП, тогда как 7delTA, W1282X, 3732delA, R334W, 552insA сцеплены с аллелем 7ТТП бл.1). Эти наблюдения свидетельствуют в пользу предположения, что ьшинство мутаций гена ТРБМ возникло однократно на определенном нетическом фоне».

4. Анализ полудоминантных мутаций с частичной пвнетрантностыо.

зучение полудоминантных мутации гена ТМРБ с частичной етрантностыо, которые до недавнего времени считались вариантами мы, в последнее время привлекает к себе внимание исследователей. Этот ерес связан с трудно объяснимым широким спектром проявляемой иической патологии при MB. Возможно, изучение этого класса мутаций эт способствовать лучшему пониманию разнообразия форм и течения MB.

4.1. Анализ политимидинового тракта интрона 8.

оказано, что в популяции существуют три аллельных варианта политими-эвого тракта интрона 8 гена ТРБМ, содержащих 5, 7 и 9 тимидиновых атков (аллели 5Т, 7Т, ЭТ).

ак следует из полученных данных (таб.3), в популяции Северо-западного лона России преимущественно встречается 7Т аллель (85%), тогда как

другие два аллеля (5Т и ЭТ) достаточно редки (6% и 9%, соответствен] У больных МВ соотношение аллелей смещено в сторону преобладания ал. 9Т, частота которого достигает 53%, что почти в б раз выше, че популяции. Отличия частот аллелей политимидинового тракта для больны) и здоровых доноров статистически достоверны (5Т - Х=4.2, р<0.05; " Х=18.2; 9Т - Х=33.8 (р<0.001)).

Таблица 3

Частота аллелей политимидинового тракта интрона 8 гена ТРБМ у болью

муковисцидозом и в популяции.

обследованные аллели полиТ локуса

5Т аллель 7Т аллель 9Т аллель

N частота N частота N частота

контроль 6 0.06 85 0.85 9 0.09

МВ 3 0.02 86 0.45 102 0.53

МВ лег.ф. 0 0 28 0.70 12 0.30

МВ см.ф. 3 0.02 58 0.38 90 0.59

МВ см.ф.л.т. 0 0 8 0.44 10 0.56

МВ см.ф.с.т. 1 0.02 31 0.47 34 0.51

МВ см.ф.т.т. 2 0.03 19 0.28 46 0.68

Анализ сцепления МВ мутаций с аллелями полиТ тракта интрон; показал, что мутация с1е1Г508 в 97% случаев сцеплена с 9Т аллелем. изучении сцепления аллелей политимидиного тракта с другими мутащ (Табл.1) обнаружено, что мутации 394с1е1ТТ, 2143с1е1Г гена ТРБМ сцеплен 9Т аллелем, тогда как 1677йе1ТА, С542Х, В.553Х, И1282Х, 3732с1е1А, ЯЗ: 552д.пзА, 3849+ЮкЪ идентифицированы на хромосомах, несущих 7Т алле Эти наблюдения еще раз подтверждают, что большинство мутаций гена 1 возникло однократно на определенном «генетическом фоне».

4.2. Анализ М470У полиморфизма.

Высказано предположение, что полиморфизм М470У (экзон 10), лс лизованный в консервативном районе гена ТРБМ, может влиять на урое транскрипции, а следовательно и на функциональную активность гена 1 (СиррепБ,1995; Кегет et а1.,1995).

Нами проанализирован М47 0У локус у 96 больных МВ и у 42 здорс доноров Северо-западного региона России. Из результатов, представлен

таблице 4, следует, что оба аллеля локуса М470У в популяции стически встречаются с одинаковой частотой, тогда как у больных МБ гношение аллелей смещено в сторону преобладания аллеля М470, который зечается в 3.3 раза чаще, чем аллель У470. При этом частота аллеля Э у больных МВ в 1.6 раза выше, чем в популяции Северо-западного юна России (Х=7.22, р<0.01).

Таблица 4

тота аллелей М470У (эгсзон 10) у больных муковисцидозом и в популяции.

обследованные АЛЛЕЛИ

Ме} Уа!

N частота N частота

контроль 40 0.48 44 0.52

МВ 147 0.77 45 0.23

МВ лег.ф. 30 0.75 10 0.25

МВ см.ф. 117 0.77 35 0.23

МВ см.ф.л.т. 15 0.83 3 0.17

МВ см.ф.с.т. 47 0.71 19 0.29

МВ см.ф.т.т. 55 0.81 13 0.19

оказано, что частота аллеля М470 на хромосомах, несущих мутацию Г508, составляет 95%. Эти данные указывают на тесное сцепление аллеля О с мутацией с!е1Р508. Неравновесие по сцеплению аллеля М470У с ацией с!е1Е508 и рядом других мутаций, (локализованных в 1-м и 2-м леотидсвязывающих доменах гена ТРЕМ) отмечено ранее для больных МВ ьгии (Сиррепэ, 1995}. Следует отметить, что большинство нтифицированных нами мутаций гена ТРЕМ (2143ае1Т, С542Х, 394с1е1ТТ, бсЗе15, И553Х, ШЗОЗК, И1282Х, R334W, 21841пзА) сцеплены с аллелем О, и лишь две из них (1677с1е1ТА, 552л.пзА ) - с аллелем У470 (табл.1). нтересно, что три пациента с одинаковым генотипом йе1Г508/3732с1е1А со шанной формой МВ, отличались по тяжести течения заболевания: два .иента имели тяжелое течение МВ (у них был представлен аллель У470, пленный с мутацией 3732с1е1А) и один пациент - со смешанной формой МВ дней тяжести имел аллель М470, сцепленный с мутацией 3732с1е1А. кольку известно, что пре-мРНК, несущие У470 аллель, приводят к личению числа транскриптов с потерей экзона 9 (Сиррепэ,1995), можно

предполагать, что Оелок ТРЕМ, кодируемый геном с мутацией 3732с1е1 У470 аллелем, оказывается более «ущербным» и определяет более тяж1 клиническое течение МВ. Это наблюдение свидетельствует о важн< мутаций с частичной пенетрантностью для понимания разнообразия < клинического проявления МВ.

5. Генетические факторы, влияющие на клиническую картину МВ.

В последние годы в литературе встречается все больше данн свидетельствующих о гетерогенности течения МВ у пациентов, имею одинаковые мутации в гене ТРЕМ (Воа*:, 1994) . По-видимому, пом огромного разнообразия мутаций самого гена ТРЕМ, на их проявле оказывают существенное влияние и другие гены. Эти сложные биохимичес взаимодействия только начинают изучаться.

5.1. Исследование аллелей гена Б0А1 Н1А локуса.

Большой интерес к изучению аллельного разнообразия генов НЬА лок; определяется их участием в иммунных реакциях организма. Ана. аллельного полиморфизма системы ЕЪА позволил выявить ряд ассоциа! между определенными аллелями генов НЬА и различными заболеваниями.

Используя молекулярно-генетические методы, мы исследовали част« аллелей гена О0А1 у больных МВ и в популяции Северо-западного реги< России (таблица 5) .

Таблиц;

Распределение аллелей локуса О0А1 при различных формах МВ и в популяц

Северо-западного региона России.

аллели Контрольная группа (п-156) СР(п=192) СР,легочная форма (п=40) СГ,смешан. форма (п-152)

0101/0102 61(39%) 70(37%) 14(35%) 56(37%)

,0103 17(11%) 18(9%) 2(5%) 16(10.5%)

0201/0601 16(10%) 28(15%) 9(22.5%) 19(12.5%)

,0301 21(14%) 24(12%) 6(15%) 18(12%)

0401/0501 41(26%) 52(27%) 9(22.5%) 43(28%)

Обнаружено повышение доли аллелей 201/601 у больных с легочной форь МВ по сравнению с контрольной группой: 22.5% и 10%, соответствен (различия достоверны с вероятностью 93%: Х2=3.74).

ри исследовании распределения аллелей гена О0А1 у больных МВ со шанной формой в зависимости от тяжести течения заболевания (табл.6) влены достоверные различия (Х2=4.1б, р<0.05) в частоте аллелей 401/501 больных с тяжелым и среднетяжелым течением МВ (19% и 38%, тветственно).

Таблица б

определение аллелей локуса О0А1 у больных с разной тяжестью смешанной

формы МВ.

CF см,ф., легкое течение(п=18) CF см.ф., среднее течение(п=66) CF см.ф., тяжелое течение(п-68)

6(33%) 21(32%) 29(43%)

3(17%) 8(12%) 5(7%)

3(17%) 6(9%) 10(15%)

1(6%) 6(9%) 11(16%)

5(27%) 25(38%) 13(19%)

эзможно, в дальнейшем анализ HLA локуса у больных МВ позволит 1гнозировать развитие определенного клинического варианта МВ и >актер его течения.

5.2. Анализ генов системы детоксикации.

Практически все формы МВ сопровождаются серьезным поражением легких. :ледние, однако, могут зачастую нарушаться и при действии ¡нообразных внешних воздействий, как инфекционной так и неинфекционной ¡роды, в том числе под влиянием неблагоприятных факторов внешней ;ды. Естественно, что на фоне МВ, повреждающий эффект экзогенных сторов на функции легких может быть резко выражен. Все это дало ювание предполагать наличие возможной связи между тяжестью течения 1 очных форм МВ и состоянием системы детоксикации ксенобиотиков в 'анизме.

1ами изучена корреляция тяжести клинических форм МВ с особенностями ¡ельного полиморфизма генов GSTM1 (глютатион-Б-трансферазы М1) и тЕРНХ 1кросомальная эпоксид гидролаза).

5.2.1. ввТЮ. (Глютатион-Б-трансфераэа).

Один из аллельных вариантов гена 63ТМ1, так называемый нулевой алж в гомозиготном состоянии, на уровне фенотипа проявляется в отсутс^ фермента. Поскольку данный белок является важным компонентом сис. детоксикации, гомозиготность по нулевому аллелю может коррелироват повышенной восприимчивостью организма к вредным воздействиям и, следствие, с увеличением риска возникновения некоторых заболевг таких как рак легкого, эндометриоз, хронический бронхит (ВгосктоНег а1.,1993).

Результаты исследования частот гомозигот по 0-аллелю в попул; Северо-Запада региона России и в разных группах больных МВ представ; в Таблице 7.

Таблш.

Частота гомозигот СЗТМ1*0/0 в контрольной группе и в группах пациенто; разными формами и тяжестью МВ.

обследованные выборка N вЭТКИ-О % С8ТМ1-0

контрольная группа 99 42 42.4

МВ:

легочная форма 20 11 55

смешанная форма: 76 37 49

легкое течэние 9 5 55

среднее течение 33 19 57

тяжелое течение 34 13 38

Выявлена тенденция к увеличению количества гомозигот по 0-аллелю группе больных с легочной формой МВ (55% по сравнению с 42% в контроле

5.2.2. тЕРНХ (микросомальная эпоксид гидролаза).

Ген тЕРНХ кодирует микросомальную эпоксид гидролазу - ферм» участвующий в I фазе утилизации ксенобиотиков. Идентифицировано ; аберрантных аллеля, обеспечивающих синтез медленной и быстрой форм этс фермента. Мутация в экзоне 3 гена тЕРНХ приводит к 50% сниже

'явности фермента (медленная форма), тогда как мутация в экзоне 4 гена 'НХ - к увеличению активности фермента на 25% (быстрая форма) (Smith, rison,1997).

Методом ПЦР проведено генотипирование пациентов с MB. Распределение НХ генотипов представлено в Таблице 8.

Таблица 8

Распределение шЕРНХ генотипов в контроле и разных группах больных

муковисцидоэом.

количество человек(%) в группе частота

обследованные ГЕНОТИПЫ мутант.

N/N N/M М/М аллеля

) экзон (медленная)

нтроль (п=203) 91(45%) 99(49%) 13(6%) 0.31

3 в целом (п=96) 41(43%) 33(34%) 22(23%) 0.40

MB лег.ф. (п=20) 5(25%) 9(45%) 6(30%) 0.53

МВсм.ф. (п=76) 36(47%) 24(32%) 16(21%) 0.37

В см.ф.л.т. (п=9) 0 5(56%) 4(44%) 0.72

Всм.ф.с.т. (п=33) 20(60%) 9(27%) 4(12%) 0.26

В см.ф.т.т. (п=34) 16(47%) 10(29%) 8(24%) 0.38

4 экзон (быстрая)

нтроль (п=203) 147(72%) 53(26%) 3(2%) 0.15

В в целом (п=96) 55(72%) 38(40%) 3(3%) 0.23

MB лег.ф (п=20) 13(65%) 5(25%) 2(10%) 0.23

МВсм.ф. (п=76) 42(55%) 33(44%) 1(1%) 0.23

3 см.ф.л.т. (п=9) 4(44.5%) 4(44.5%) 1(11%) 0.33

3 см.ф.с.т. (п=33) 16(48%) 17(51%) 0 0.25

3 см.ф.т.т. (п=34) 22(65%) 12(35%) 0 0.17

Частота гомозигот по медленной форме фермента (М/М) оказалось товерно выше во всех рассмотренных группах больных MB.

Частота мутантного аллеля экзона 3 у больных MB в целом и у больных смешанной формой несущественно отличается от контрольной группы (40%, и 31%, соответственно), тогда как у больных легочной формой MB его тота достигает 53% (Х=5.24; р<0.05). Следовательно, можно предпола-

гать, что снижение активности микросомальной эпоксид гидрол; коррелирует с преимущественным поражением легких. Частота гомозигот «быстрой» мутации (экзон 4) у больных с легочной формой МВ достове! выше чем в контрольной группе (Х=5.89; р<0.02).

Таким образом, повышение частоты нулевого аллеля гена СБТМ1 и дс гомозигот по мутациям гена тЕРНХ у больных с легочной формой позволяет предполагать, что изменение активности ферментов, участвуют в системе детоксикации, может усугублять поражение легких у болы муковисцидозом.

ВЫВОДЫ

1. Спектр идентифицируемых мутаций гена ТРЕМ у больных муковисцидо; С.Петербурга имеет свои особенности, и отличается от такового Западной Европе и от спектра мутаций других регионов России.

2. Диагностически значимыми мутациями гена ТРЕМ у больных С.Петербурга являются: <1е1Е508 (45%), И1282Х (2.1%), 3732с1е1А(1. 6? 1677с1е1ТА(1. 6%), Ы1303К(1.6%), 2143ае1Т(1.0%), тестирование котог позволяет выявлять до 53% мутантных хромосом.

3. Разработаны собственные варианты детекции трех мажорных мута! (И1282Х, 2143с1е1Т, 21841пзА) , позволяющие эффективно проводить идентификацию.

4. Обнаружены и охарактеризованы две новые мутации гена ТРЕМ: 5521г (экзон 4) и 136бс1е15 (интрон 8) .

5.Частоты полиморфных аллелей гена ТРЕМ (тетрамерные нуклеотид* повторы интрона 6В, аллели политимидинового тракта интрона 8 и лок> М470У в экзоне 10) достоверно отличаются у больных МВ и в популяции.

6. Обнаружена неслучайная ассоциация аллелей 201/601 гена Б0А1 Главно локуса гистосовместимости с легочной формой муковисцидоза и аллет 401/501 гена Б0А1 со смешанной формой МВ средней тяжести.

7. Выявлено достоверное повышение частоты гомозигот по мутации экзона (медленная форма) в гене тЕРНХ (микросомальной эпоксид гидролазы) больных МВ по сравнению с контрольной группы, и достоверное повышеь гомозигот по мутации экзона 4 (быстрая форма) в гене тЕРНХ у больных легочной формой МВ.

Гомозиготность по нулевому аллелю гена GSTM1 и по аллелям, несущим гацию экзона 3 (медленная форма) и экзона 4 (быстрая форма) гена РНХ, может усугублять поражение легких у больных муковисцидозом.

Неслучайная ассоциация клинических форм MB с мутациями гена ТРЕМ, с ределенными аллелями Главного локуса гистосовместимости (аллели 1/601; 401/501 гена DQA1), с аллелями генов, участвующих в системе гоксикации ксенобиотиков (нулевой аллель гена GSTM1, аллели, несущие тации экзона 3 и экзона 4 гена шЕРНХ) позволяет более обоснованно огнозировать характер течения MB и эффективно осуществлять лечение.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

аранов B.C., Иващенко Т.Э., Асеев М.В., Кузнецова Т.В., Кащеева Т.К., ай М.А., Оптимизация молекулярно-генетических подходов ранней гностики и профилактики некоторых социально-значимых наследственных олеваний// 4 конф. «Геном человека-94», 1994, Черноголовка.- с.8-9 акай М., Иващенко Т.Э., Баранов B.C. Новые диагностически значимые ации гена CFTR у больных муковисцидозом России.// Мат.2 Съезда мед етиков Украины. 18-20 окт. 1995, Львов,- с.12

акай М.А., Осиновская Н.С., Орлов A.B., Романенко О.П., Иващенко Т.Э. бенности частоты и спектра мутаций гена CFTR у больных :овисцидозом в Санкт-Петербурге//1-ой Росс. конф. "Мед.-ген. :сультирование в профилактике инвалидизирующих наследственных :езней". М.-12-13 ноября 1997.

Баранов B.C., Иващенко Т.Э., Кащеева Т.К., Бакай М.А., Глазков П.Б., :айлова Е.Г., Баранов А.Н. Пренатальная диагностика и состояние :ледований по генной терапии муковисцидоза в России// IV Всерос. :гресс «Человек и лекарство», 1998, Москва, е.- 92.

laranov V., Ivaschenko Т., Kascheeva Т., Bakay М., Lebedev v., :harlovsky V. Basic results and major trends in prenatal diagnosis >) cystic fibrosis in Russia// Eighth Annual North American CF iference, Orlando, Florida, 20-23 October 1994, Pediatric monology,Suppl.12 p.205.

Baranov V.S., Ivaschenko Т., Bakay M. Early elimination of CF-baby :ients homozygous for glutathione-S-transferase Ml gene deletion // ith Annual North American CF Conference, Dallas,Texas 12-15 October 15, Pediatric Pulmonology,1995 Suppl.12 p.205.

7. Ivaschenko T,, Bakay M., Baranov V. Novel Frameshift Mutation in ! 4 of CFTR Gene // Human Mutation 1995, vol. 5, 184-185.

8. Baranov V.S., Ivaschenko T., Bakay M., Guembitskaya T. Associal of gluthatione-S-transferase Ml gene deletion with cystic fibre severity //European CF Conference, Amsterdam, Belgium. Abstract 1995, 201.

9. Ivaschenko T., Bakay M., Gimbovskaya S., Baranov V. Search for nc CFTR mutations in Russian CF patients.// Ibid.p.186.

10.Baranov V.,, Ivaschenko T., Bakay M. et al. Proportion of GSTM1 genotype in some Slavic populations and its correlation with cys fibrosis and some multifactorial diseases.// Human Genet. 1996, vol. 516-520.

11. Ivaschenko T., Bakay M., Osinovskaya N., Orlov A., Baranov V Analysis of some semidominant mutation with partial penentration in and normal chromosomes of North-West Russia.// Abstr. XII Int. Congress, June 16-21, 1996, Jerusalem, Israel. Isr. J. Med. Genet. 19 vol.32 (Suppl.), S.229.

12. Bakay M., Ivaschenko T., Osinovskaya N., Baranov V. Search novel CFTR mutations in Russia //21-st Eur.Cystic Fibrosis Conf. Da (Switzerland), June 1-6, 1997. P43.

13. Ivaschenko T., Aseev M., Malysheva 0., Bakay M,, Osinovskaya : Baranov V. Prenatal diagnosis of some common monogenic disordres St.Petersburg // 2nd PECO-EUCROMIC Conference on Prenatal Diagnosis Budapest, June 1997,ibid.P24

14. Estevill X.... Ivaschenko T.E., Bakay M., Baranov V. Geograp] distribution and regional origin of 272 Cystic Fibrosis mutations European populations.// Human Mutations 1997,10,135-154.