Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза у больных из Башкортостана и в популяциях Волго-Уральского региона

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Корытина, Гульназ Фаритовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика гена СПЯ и его продуктов.

1.1.1. Картирование и клонирование гена СРТЯ.

1.1.2. Структура гена СЕТЯ и матричной РНК.

1.1.3. Структура и функции белкового продукта.

1.1.4. Мутации гена СРТЯ.

1.1.5. Внутригенные полиморфные маркеры гена СРТЯ ^ ^

1 .2. Разнообразие клинических проявлений нарушений в гене

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1. Объект исследования. ^

2.2. Методы исследования.

РЕЗУЛЬ ТА ТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ВНЕГЕННЫХ И ВНУТРИГЕННЫХ МАРКЕРОВ ГЕНА CFTR В ПОПУЛЯЦИЯХ ВОЛГО-УРАЛЬСКОГО РЕГИОНА

3.1. Анализ полиморфизма диаллельных маркеров Met Н и Cs. у народов Волго-Уральскогорегиона. 5g

3.2. Анализ полиморфизма внутригенного микросателлитного маркера (IVS6aGATT) гена CFTR в популяциях Волго-Уральского региона.

1.3. Диагностика муковисцидоза

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ СПЕКТРА МУТАЦИЙ ГЕНА СЕТИ У БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ ИЗ БАШКОРТОСТАНА. 41. Анализ частоты наиболее распространенных в России мутаций гена С ГТК у больных МВ из

Башкортостана.

4.2. Поиск новых мутаций в гене СРТЯ.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ВНЕГЕННЫХ И ВНУТРИГЕННЫХ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНА СЕТИ НА МУТАНТНЫХ И НОРМАЛЬНЫХ ХРОМОСОМАХ

5.1. Анализ распределения частот аллелей и генотипов в неге иных (МеШ, Ся.7) и внутригенных (М470У, Т11В20, ШбаСАТТ, Ш8СА, Ш17СА) маркеров гена СПЯ на мутантных и нормальных хромосомах.

5.2. Анализ гаплотипов по внегенным и внутригенным полиморфным маркеров гена СГТЯ на мутантных и нормальных хромосомах.

ГЛАВА 6. АНАЛИЗ ИНФОРМАТИВНОСТИ И ОПТИМИЗАЦИЯ АЛГОРИТМА ДНК-ДИАГНОСТИКИ МВ

В БАШКОРТОСТАНЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза у больных из Башкортостана и в популяциях Волго-Уральского региона"

Актуальность проблемы.

Муковисцидоз (MB) (кистозный фиброз поджелудочной железы) одно из самых распространенных наследственных, аутосомно-рецессивных летальных заболеваний, характеризующееся системным поражением экзокринных желез. Ген трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) - CFTR был идентифицирован и клонирован в 1989 году (Kerem et al.,1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al, 1989). Ген CFTR находится на длинном плече 7 хромосомы (7q31.2), состоит из 27 экзонов, содержит 230 тпн. Транскрипция гена CFTR приводит к появлению первичного продукта - мРНК, состоящего из 6129 нуклеотидов (Riordan et al., 1989). Белковый продукт включает 1480 аминокислотных остатков. Белок CFTR, функционируя как цАМФ-регулируемый хлорный канал (Riordan et al., 1989), обладает рядом очень важных дополнительных функций - регулирует работу других хлорных и натриевых каналов, участвует в проведении воды и АТФ, является сенсором внутриклеточного уровня АТФ и медиатором транспорта эндоплазматических пузырьков (Jetten et al., 1989; Gibson et al., 1991; Higgins, Stephen, 1991; Anderson, Welsh, 1991; Barasch et al., 1991; Canwen et al., 1993; Grubb et al., 1994; Stutts et al, 1995; Reddy et al., 1996). В связи с этим любые изменения в его структуре, вызванные мутациями, могут приводить к нарушению в регуляции транспорта электролитов в эпителиальных клетках.

По данным Консорциума по муковисцидозу, к 2002 году в гене CFTR идентифицировано около 1000 мутаций (The CF mutation database http.//www.genet.sickkids.on.cax/cftr). Мутации в гене CFTR отвечают за широкий спектр клинической патологии: муковисцидоз, обструктивная б азоспермия, дессиминированные бронхоэктазы, легочный аспергиллез, хронический панкреатит, хронический рино-синусит (Bombieri at al., 2000; Noone et al., 2001; Tzetis et al., 2001). Снижение экспрессии гена CFTR более чем на 95% приводит к тяжелому заболеванию - муковисцидозу (MB), поражающего в среднем 1:2500 новорожденных в популяциях европеоидов (The CF mutation database http.//www.genet.sickkids.on.cax/cftr). Частота MB в России, по данным разных авторов, варьирует от 1:5465 до 1:12300 новорожденных (Чучалин, 1994; Петрова, 1996; Желенина, 1998; Миткина, 1999). Патогенез MB связан с выделением экзокринными железами секрета повышенной вязкости, приводящего к поражению жизненно важных органов и систем (Капранов, 2001).

MB является классическим примером моногенного наследственного заболевания, при котором установлена мажорная мутация для большинства популяций мира (делеция фенилаланина в 508 положении белка CFTR (delF508)), и поэтому возможно выявить источник ее происхождения, путем анализа ассоциации с определенными маркерными гаплотипами (Morral et al., 1994). Установлено, что в Европе мутация delF508 получила распространение вследствие эффекта основателя. Ее частота обнаруживает определенный градиент распространения с севера на юг и с запада на восток: достигая 85% в Дании, она уменьшается до 50% в Италии и до 20-30% - в Турции (The CF mutation database 2002 http.//www.genet.sickkids.on.cax/cftr; Bayleran et al., 1996; Estivill., 1997; Casals et al., 1997; Onay et al., 1998). В Европейской части России мутация delF508 присутствует примерно на 50% всех мутантных хромосом (Иващенко, 2000, Петрова, Гинтер, 2001).

Спектр и частоты различных мутаций и полиморфизмов гена CFTR обладают выраженной популяционной специфичностью (The CF mutation database http.//www.genet.sickkids.on.cax/cftr). Экологическая адаптация, тяжелые инфекции, селективное преимущество гетерозигот, эффект основателя, дрейф генов - вот основные популяционные факторы и механизмы, определяющие естественные колебания частоты полиморфизмов и мутаций в различных популяциях и регионах мира (Рычков с соавт., 1996). Несомненно, выявление особенностей распространения МВ в Башкортостане, анализ частоты и спектра мутаций, приводящих к данному заболеванию, представляет актуальную научную задачу и имеет важное значение для здравоохранения. Анализ внегенных и внутригенных полиморфных маркеров гена СБТЯ открывает новые возможности для исследования генетической структуры популяций и выявления основных механизмов возникновения и распространения мажорных мутаций гена СБТЯ.

Целью данного исследования является изучение спектра мутаций и полиморфных маркеров гена СБТЯ у больных МВ из Башкортостана и в популяциях Волго-Уральского региона. Разработка на основе этого оптимальной стратегии ДНК-диагностики МВ у жителей Башкортостана.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать частоты аллелей и генотипов внегенных диаллельных (МеШ и Су. 7) и внутригенного микросателлитного {¡УБбаСАТТ) маркеров гена СБТЯ в этнических группах Волго-Уральского региона.

2. Проанализировать спектр и частоту мутаций гена СБТИ. у больных МВ из Башкортостана.

3. Провести сравнительный анализ распределения частот аллелей и гаплотипов внегенных и внутригенных диаллельных {МеШ, СБ. 7, М470У, Т11В20) и внутригенных микросаттелитных (.1У86аСАТТ,, 1У58СА, 1УБ17СА) маркеров гена СБТ11 на нормальных и мутантных хромосомах.

4. Дать оценку ассоциации мутаций гена СБТЯ с определенными гаплотипами по внегенным и внутригенным маркерам гена СРТК.

5. Оптимизировать алгоритмы молекулярной диагностики МВ для жителей Башкортостана.

Научная новизна. Впервые получены данные об аллельном и генотипическом разнообразии внегенных диаллельных (МеШ и С8.7) и внутригенного микросателлитного (¡УБбаСАТТ) маркеров гена СПЯ у народов Волго-Уральского региона. Выявлена существенная гетерогенность между большинством исследованных популяций по распределению частот аллелей микросателлитного маркера 1У8баОАТТ.

Впервые дана характеристика спектра и частоты мутаций гена СБТЯ при МВ в Башкортостане. Впервые у больных МВ из Башкортостана выявлены пять новых мутаций: 1488М (10 экзон), 1811+12А—>С (11 интрон), ТббЗБ (13 экзон), 1122613. (19 экзон), 4005+9А^С (20 интрон) и нейтральные полиморфизмы: 2097А^С) А655А (13 экзон), (39960^С) У1288У (20 экзон).

Впервые дана оценка времени накопления наблюдаемой дисперсии гаплотипов на хромосомах, несущих мажорную мутацию (с!е1Р508) гена СБТЯ. Показано, что появление и распространение мутации с!е1Р508 в Башкортостане, по-видимому, обусловлено эффектом основателя вследствие миграции славянского населения из Восточной Европы.

Выявлен мажорный гаплотип, который достоверно чаще встречается на хромосомах с неидентифицированными мутациями гена СБТЯ.

Практическая значимость. Оптимальные алгоритмы выявления гетерозиготных носителей мутаций гена СПЯ, пресимптоматической и пренатальной диагностики МВ необходимы для осуществления целенаправленной профилактики этого наследственного заболевания в Республике Башкортостан. Материалы работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах, а также на курсах постдипломного образования врачей общей практики.

Положения выносимые на защиту:

1. Анализ частот аллелей и генотипов внегенных (МеШ и Сл. 7) и внутригенного (1¥8баСАТТ) маркеров гена СБТЫ свидетельствуют о наличии межпопуляционных различий для большинства изученных этносов Волго-Уральского региона по данным полиморфным системам.

2. В результате молекулярно-генетического анализа гена СРТК было выявлено 15 мутаций, что позволило идентифицировать 51% всех мутантных аллелей. Спектр мутаций гена СБТЯ у больных МВ из Башкортостана имеет свои особенности и отличается от такового в других регионах России.

3. Обнаружены и охарактеризованы пять новых мутаций гена СБТЯ и два нейтральных полиморфизма.

4. Большинство выявленных мутаций гена СБТЯ ассоциированы с определенными гаплотипами маркерных локусов Ме///-Су. 7-М470 V-ТиВ20-тбаОАТТ-№8СЛ-т17СА.

5. Появление мутации с1е1Б508 в генофонде народов Волго-Уральского региона, вероятно, обусловлено миграциями славянского населения из Восточной Европы, а ее широкое распространение связано с эффектом основателя.

6. Выявлен мажорный гаплотип, который достоверно чаще встречается на хромосомах с неидентифицированными мутациями гена СБТИ.

7. Оптимальные алгоритмы ДНК-диагностики МВ, основанные на молекулярно-генетическом анализе мутаций и полиморфных маркеров гена СБТ11, позволяют осуществлять пренатальнуто диагностику МВ и выявлять гетерозиготных носителей мутаций гена ОТЯ в семьях высокого риска МВ из Башкортостана

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Корытина, Гульназ Фаритовна

ВЫВОДЫ

1. Проведено изучение характера распределения частот аллелей и генотипов внегенных (МеШ и С?. 7) и внутригенного (¡УБбаСАТТ) маркеров гена СБТ11 в популяциях Волго-Уральского региона. Выявлена существенная гетерогенность между большинством исследованных этносов по распределению частот аллелей микросателлитного маркера ¡УБбаСАТТ.

2. Анализ мутаций гена СРТЯ у больных МВ из Башкортостана позволил идентифицировать 51% всех мутантных аллелей. К диагностически значимым мутациям, приводящим к МВ в Башкортостане, относятся: с!еШ508 (33,8%) 394с1еПТ (3,52%), СБТКс1е1е2,3(21 кЬ) (1,41%), Я334\У (1,41%), 3849+ЮкЬС^Т (1,41%), ШЗОЗК (1,41%). Мутации 0542Х, 2184тзА, 81196Х, \V1282X встречаются с частотой менее 1%.

3. Впервые обнаружены пять новых мутаций гена СБТЯ: 1488М (10 экзон), 1811+12А^С (11 интрон), ТббЗБ (13 экзон), 1122611 (19 экзон), 4005+9А->С (20 интрон) и два нейтральных полиморфизма (2097А^С) А655А (13 экзон), (39960^С) У1288У (20 экзон).

4. Установлены различия в характере распределения полиморфных аллелей и генотипов внегенных (МеШ и С?. 7) и внутригенных (М470У, ТиВ20, ШбаСАТТ, 1ШСА, 1Ш7СА) маркеров гена СБТЯ на нормальных и мутантных хромосомах.

145

5. Показано, что появление мажорной мутации ёеШ508 в генофонде народов Волго-Уральского региона, вероятно, обусловлено миграциями славянского населения из Восточной Европы, а ее широкое распространение связано с эффектом основателя.

6. Выявлен мажорный внутригенный гаплотип по локусам (М470У-7 7 !В2 0-1УШСА 7 Т-ШНСА-IУ$17 С, Л) (22777), достоверно чаще встречающийся на хромосомах с неидентифицированными мутациями.

7. Доля полностью информативных семей при анализе гена СБТЯ по всем изученным мутациям и маркерным полиморфным локусам составила 94,4%, что позволяет осуществлять пренатальную диагностику МВ и выявлять гетерозиготных носителей мутаций гена СРТЯ практически во всех семьях высокого риска МВ из Башкортостана.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С целью молекулярно-генетического изучения гена СРТЯ и сцепленных с ним локусов области 7q.31 проведен анализ частоты и спектра мутаций гена СБТЯ и характера распределения частот аллелей, генотипов и гаплотипов внегенных и внутригенных полиморфных маркеров гена СБТЯ у больных МВ из Башкортостана и в некоторых популяциях Волго-Уральского региона.

В результате изучения полиморфизма двух внегенных диаллельных (МеШ и О». 7) и внутригенного микросателлитного (¡УЯбаСАТТ) маркеров гена СБТ11 в популяциях Волго-Уральского региона получены данные о распределении частот аллелей и генотипов, проведен анализ наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности и сравнительный анализ частот аллелей между изученными этносами и другими популяциями России и Европы. Установлено, что аллельные формы локусов МеШ и 7 встречаются во всех изученных популяциях с высокой частотой, близкой к 0,5. Для внегенного маркера МеШ показатели фактической гетерозиготности варьировали от 0,286 у коми-зырян до 0,548 у чувашей. Наиболее высокие значения ожидаемой гетерозиготности установлены для двух выборок башкир, наиболее низкие - для мордвы. Показатели наблюдаемой гетерозиготности по локусу Ся. 7 варьировали в широких пределах: от 0,262 у мордвы до 0,653 у западных башкир. Полученные нами данные подтверждают популяционную неоднородность внегенных (МеШ и С$\7) полиморфных маркеров гена СБТЯ и свидетельствуют о наличии генетической подразделенности популяций Волго-Уральского региона, обусловленной различием в характере распределения частот полиморфных генотипов. Показано отсутствие статистически достоверных различий в распределении частот аллелей между большинством изученных этносов, а также между популяциями Волго-Уральского региона и популяциями Европы и России.

При анализе внутригенного микросателлитного маркера IVSóaGATT установлено, что частота аллеля 7 варьирует от 0,636 у чувашей до 0,805 у мордвы. На втором месте по распространенности оказался аллель 6, максимальная частота которого составила 0,333, у чувашей, а минимальная -0,188, у мордвы. Аллель 8, который относительно часто встречается у удмуртов и марийцев (около 8%), в единичных случаях был выявлен в популяциях башкир, татар, мордвы, коми-пермяков и не встречался у русских. Показатель генотипического разнообразия оказался самым низким у мордвы (0,496) и у татар (0,505), что отражает, сравнительно низкую гетерогенность маркера IVSóaGATT в данных выборках. Наиболее высокие значения фактической гетерозиготности были характерны для удмуртов (0,532) и коми-пермяков (0,560), самые низкие - для мордвы (0,297). Анализ распределения частот генотипов и аллелей внутригенного маркера (IVSóaGATT) гена CFTR у народов Волго-Уральского региона свидетельствует об их генетической гетерогенности по данной полиморфной системе и о наличие, в большинстве случаев, существенных межпопуляционных различий. Для популяционно-генетических исследований определение частот генотипов и аллелей внутригенного микросателлитного (IVSóaGATT) маркера гена CFTR является новой информацией и вносит вклад в дальнейшее изучение генофонда и генетической структуры популяций Волго-Уральского региона.

С целью изучения спектра и частоты мутаций гена CFTR у больных MB из Башкортостана нами проведен молекулярно-генетический анализ 18 наиболее частых в России мутаций гена CFTR (delF508, 1677delTA (10 экзон), CFTRdele2,3(21kb) (2, 3 экзон), 394delTT(3 экзон), 1154msTC, R347P, R334W (7 экзон), G542X, G551D, R553X, S549N (11 экзон), 2184msA, 2143delT (13 экзон), S1196X, 3737delA (19 экзон), 3849+lOkbC^T (19 интрон), W1282X (20 экзон), N1303K (21 экзон)) и поиск мутаций в семи функционально значимых экзонах гена CFTR (3, 7, 10,11, 13, 19, 20) методом

ББСР-анализа, с последующим секвеиированием образцов с измененной подвижностью.

Установлено, что частота мажорной мутации ёеШ508 гена СБТЫ у больных МВ из Башкортостана составила 33,80%. По сравнению с жителями европейской части России, где частота мутации ёе1Б508 по данным нескольких независимых исследований в среднем составляет 50% (Капранов, 1997; Петрова, 1996; Иващенко, 2000), частота мутации ёе1Б508 в Башкортостане оказалась ниже. Поскольку выборка больных МВ из Башкортостана является неоднородной по этническому составу, было важно проанализировать частоту мутации ёеШ508 с учетом этнической принадлежности обследованных. У русских частота мутации с1еШ508 составляет 48,39%, у татар и башкир - 24,32%. К диагностически значимым мутациям, приводящим к МВ в Башкортостане помимо с1е1Б508 можно отнести мутации 394с1еПТ (3,52%), СБТКс1е1е2,3(21кЬ) (1,41%), Я334\¥ (1,41%), 3849+ЮкЬС^Т (1,41%), Ш303К (1,41%). Мутации 0542Х, 2184тзА, Б1196Х, \V1282X являются редкими, так как их частота не превышает 1%. Мутации 1677с1е1ТА, 1154]1шТС, Я347Р, 055Ш, Я553Х, 2143с1е1Т, 3737с1е1А в выборке больных МВ из Башкортостана не обнаружены. В результате ЗБСР-анализа семи экзонов гена СБТЯ и последующего секвенирования образцов с конформационными изменениями удалось выявить 5 новых мутаций и 2 нейтральных полиморфизма в пяти экзонах и пограничных интронах: 1488М (10 экзон), 1811+12А^С (11 интрон), Т6638, А655А (13 экзон), 11226К (19 экзон), 4005+9А-^С (20 интрон), VI288V (20 экзон).

В целом в результате анализа спектра мутационных повреждений гена СРТК. у больных МВ из Башкортостана было выявлено 15 мутаций, что позволило идентифицировать 51 % всех МВ аллелей. Мутация ёе№508 обнаружена на 48 хромосомах. На 24 хромосомах выявлены мутации отличные от с!е1Р508, что составило 16% от всех мутантных хромосом. Доля идентифицированных в нашей выборке не-с1е1Р508 мутаций практически не отличается от аналогичных данных, полученных для других регионов России: в Центральном регионе (12,1%) (Петрова, 1996), в Московской области (16,4% (Сазонова, 1998). Обращает на себя внимание высокая доля неидентифицированных мутаций в гене СРТЯ: в Башкортостане - 49%, в Московском регионе - 37% (Сазонова, 1998), в Центральном регионе - 32% (Петрова, 1996), Северо-Западном - 29% (Иващенко, 2000), в Западной Европе - 17% (Оеяиекег & а1., 2000), в Турции - 40% (Опау й а1., 1998). По-видимому, они могут представлять собой, либо протяженные делеции, которые невозможно выявить использованными методами, либо они сосредоточены в интронах и промоторном участке гена СРТИ. Кроме того, возможно, мутации, приводящие к МВ, могут располагаться в другом гене (Месиэ е! а1., 1998).

В связи с тем, что у больных МВ из Башкортостана, доля неидентифицированных мутаций остается достаточно высокой, актуальным является изучение внегенных и внутригенных полиморфных маркеров и выявления информативных систем для проведения молекулярной диагностики заболевания. Установлены различия в характере распределения полиморфных аллелей внегенных (МеШ и Сл\ 7) и внутригенных (К4470У, ТиВ20) диаллельных и внутригенных микросаттелитных (ГУЗбаСА 77', 1УБ8СА, 1У817СА) маркеров гена СБТЯ на нормальных и мутантных хромосомах с с1е1Р508 и сходство в распределении частот аллелей большинства маркерных локусов на нормальных хромосомах и мутантных хромосомах без с!е1Р508. Выявлено, что определенные аллели полиморфных маркеров находятся в значительном неравновесии по сцеплению с мутацией ёеШ508. По л о кусу МеШ распределение частот аллелей в группах мутантных и нормальных хромосом практически не отличается, однако на МВ-хромосомах с ёеШ508 достоверно чаще (85%) встречается аллель 1 0,221). При изучении полиморфизма локуса 0.7 установлено, что различия в распределении частот аллелей между мутантными и нормальными хромосомами статистически не достоверны. На МВ-хромосомах с delF508 обнаружено выраженное неравновесие по сцеплению с аллелем 2, характеризующимся наличием сайта рестрикции (ASt =-0,398). Вместе с тем, частота данного аллеля на МВ-хромосомах без delF508 и нормальных хромосомах составила 48% и 41%, соответственно, против 80% на МВ-хромосомах с delF508. Анализ внутригенного полиморфного локуса M470V выявил несущественное увеличение частоты аллеля 1 на мутантных хромосомах (^2=3,04; 0,1>р>0,05), но наличия неравновесия по сцеплению мутации delF508 с аллелем 1 (ASt=-0,500). Распределение частот аллелей локуса М470V на МВ-хромосомах без delF508 практически не отличается от такового на нормальных хромосомах. Аллель 2 локуса TUB20 является самым частым как на мутантных, так и на нормальных хромосомах, но на мутантных хромосомах его частота достоверно выше (z2 =8,737; р<0,01). Для МВ-хромосом с delF508 выявлено неравновесие по сцеплению с аллелем 2 (A St=-0,35).

При анализе встречаемости аллелей локуса IVSóaGATT гена CFTR обнаружено абсолютное сцепление аллеля 6 с мутацией delF508 (ASt=-0,766), что хорошо согласуется с данными других авторов (Петрова, 1996; Иващенко, 2000; Chebab et al., 1991; Morral et al., 1994; Claustres et al., 1996). Показано достоверное отличие распределения частот аллелей локуса IVSóaGATT на мутантных и нормальных хромосомах (х2=11,233; р=0,004). рис. 4.). Большинство МВ-хромосом без delF508 чаще встречалось в сочетании с аллелем 7, но достоверных различий по сравнению с контролем не выявлено. При исследовании динуклеотидных повторов локуса IVS8CA гена CFTR обнаружены достоверные различия в распределении частот аллелей на мутантных и нормальных хромосомах (^2=26,338; р=0,0001), связанные с увеличением частоты аллеля 2 и очень низкой частотой аллеля

8 на мутантных хромосомах. При дальнейшем анализе установлено, что МВ-хромосомы с delF508 ассоциируют с аллелями 2 (44%) и 6 (52%) локуса 1VS8CA. Анализ распределения частот аллелей на МВ-хромосомах без delF508 показал, что большинство мутаций ассоциировано с аллелями 7, 6 и 2. Характер распределения СА-повторов локуса IVSI7CA и на мутантных, и на нормальных хромосомах оказался сходным: во всех случаях преобладающим по частоте оказался аллель 7, хотя аллели 2 и 6 были обнаружены только на мутантных хромосомах, а аллели 4 и 5 только на нормальных хромосомах. Обнаружено абсолютное сцепление аллеля 7 с мутацией delF508 (ASt=-0,35).

На основе полученных данных по распределению частот аллелей и генотипов вышеописанных маркерных локусов гена CFTR был проведен сравнительный анализ распределения частот гаплотипов на нормальных и мутантных хромосомах. Наиболее информативным оказалось изучение гаплотипов M470V-TUB20-IVS6aGATT-IVS8CA-IVSl 7СА.

Для 26 МВ-хромосом с delF508 обнаружено 6 различных гаплотипов. Два из них являются наиболее частыми - это гаплотипы (12667)- 50%, (12627)- 35%. Наличие мажорных гаплотипов и низкое значение гаплотипического разнообразия на МВ-хромосомах с delF508 (0,6492) является следствием возникновения мажорной мутации в результате одного мутационного события и распространения в различных популяциях благодаря эффекту основателя. Анализ только внутригенного SNP-гаплотипа M470V-TUB20 позволяет выделить предковую гаплооснову, на которой возникла мутация delF508, так как 83,3% хромосом с мажорной мутацией имеют гаплотип (12). Этот внутригенный SNP-гаплотип является редким на нормальных хромосомах и МВ-хромосомах без delF508, что подтверждает гипотезу однократного возникновения мутации delF508 и согласуется с данными, полученными для стран Европы (Morral et al., 1994, Claustres et al., 1996).

Вопрос о предковом M470V-TUB20-IVS6aGATT-IVS8CA-IVSl 7СА гаплотипе можно решить, анализируя дисперсию двух основных гаплотипов (12667) и (12627). В результате анализа было установлено, что, несмотря на то, что гаплотип (12627) встречается реже, чем гаплотип (12667), он действительно может быть предковым гаплотипом, на котором возникла мутация delF508, произошедшая затем мутация в локусе IVS8CA, привела к возникновению аллеля 6 (17 повторов) и распространению гаплотипа (12667).

Анализируя распределение частот гаплотипов, полученных только с помощью STR маркеров IVS6aGATT-IVS8CA-IVS17CA, можно приблизительно рассчитать эволюционный возраст хромосом с мутацией delF508, распространенных в генофонде населения современного Башкортостана. Для MB-хромосом с delF508 обнаружено только 3 STR-гаплотипа, два из них (667) и (627) встречаются примерно с одинаковыми частотами, 53,85% и 42,31%, соответственно. Гаплотип (657) возник в результате мутационного события в локусе 1VS8CA. По литературным данным известно, что мутация delF508 возникла в период Палеолита (52 тыс. лет назад) (Morral et al., 1994), но разделение европейских популяций произошло в более поздний период, в период Неолита (Angelicheva et al., 1997), когда происходили массовые переселения племен. Возможно, в это время уже существовали мутантные хромосомы с гаплотипами (667) и (627). Тогда оба гаплотипа можно отнести к предковым и их распространение шло независимо. Поэтому в одних регионах преобладает гаплотип (667) - Россия, Северная и Центральная Европа; в странах Средиземноморья частым является гаплотип (627). Исходя из предположения, что скорость накопления мутаций в аутосомных STR локусах ц= 1,5 10~4 (Weber, Wong, 1993), мутация delF508 на хромосомах с гаплотипами (667) и (627) была внесены в генофонд народов Волго-Уральского региона около 5 тыс. лет назад. Можно предположить, что ее появление обусловлено миграциями славянских народов из Восточной Европы, а ее широкое распространение связано с эффектом основателя.

При анализе внутригенных гаплотипов по маркерам М470У-Т11В20-¡УЗбаОА ТТ-1У88СА-1У817СА на 169 нормальных хромосомах были обнаружены 52 гаплотипа. Распределение гаплотипов на нормальных хромосомах характеризуется высокой степенью дисперсии, это подтверждается большим значением гаплотипического разнообразия (11=0,9608). Частота самого распространенного гаплотипа (22777) не превышает 11%. По литературным данным для европеоидов наиболее частым на нормальных хромосомах также является гаплотип (22777).

При анализе частот гаплотипов М4 70 У-ТиВ20-1У8баОА ТГ-1У58СА -1У817СА на МВ-хромосомах без с1еШ508 с большой частотой обнаружен тот же гаплотип (22777), но его частота достигает 22%, различия при сравнении с нормальными хромосомами являются статистически достоверными (/=4,99; 0,05>р>0,025). Вполне возможно, что у больных МВ из Башкортостана, где большинство случаев заболевания приходится на тюркские семьи, имеется специфическое мутационное повреждение гена СРТЛ, ассоциированное с данным гаплотипом. На МВ-хромосомах без ёе1Р508, но с идентифицированными мутациями, гаплотип (22777) был ассоциирован с мутацией СРТЯс1е1е2,3(21кЬ) - 1 хромосома и мутацией 1811+12А^С - 1 хромосома. На 72 МВ-хромосомах без ёеШ508 обнаружено 37 различных гаплотипов, 38% из них не встречались на нормальных хромосомах. Выявленные специфичные гаплотипы, характерные только для МВ-хромосом без с!е1Р508, предполагают наличие широкого спектра неидентифицированных мутационных изменений у больных МВ из Башкортостана.

При анализе спектра мутаций гена СРТЯ с достаточно высокой относительной частотой у больных тюркского происхождения была обнаружена мутация 394ёе1ТТ- 6,76%. По литературным данным, считается, что мутация возникла на севере Европы (Schwartz et al, 1994). Она широко распространена в Щвеции, Норвегии, Финляндии, Эстонии, Дании и встречается исключительно на хромосомах с гаплотипом M470V-TUB20-IVS6aGATT-IVS8CA-IVSl7СА (12627) (Schwartz et al, 1994; Claustres et al., 1996). Все выявленные нами хромосомы с мутацией 394delTT имели тот же гаплотип (12627). Таким образом, учитывая ассоциацию мутации 394delTT с одним и тем же гаплотипом мы вправе сделать предположение о едином источнике происхождения мутации 394delTT в Башкортостане и в странах Северной Европы. Более детальный анализ распространенности данной мутации у финно-угорских и тюркских народов Волго-Уральского региона и привлечение антропологических и этнографических данных, предполагает возможность иного взгляда на пути возникновения и распространения мутации 394delTT.

Важным практическим итогом работы является высокая диагностическая значимость исследованных полиморфных маркеров и мутаций гена CFTR для семейного анализа и пренатальной диагностики. Полученные в ходе настоящего исследования данные позволили существенно увеличить число семей, для которых возможно проведение пренатальной диагностики MB. Так, из общей выборки обследованных 94,4% семей оказалось полностью информативными. Кроме того, молекулярный скрининг всех близких родственников пробандов с идентифицированными мутациями гена CFTR повысит эффективность активного выявления гетерозиготных носителей с последующим их медико-генетическим консультированием, что является эффективным способом профилактики MB. На основании данных, полученных в ходе исследования спектра и частоты мутаций гена CFTR у больных MB из Башкортостана, и исследования полиморфных аллелей и гаплотипов, нами оптимизирован алгоритм молекулярной диагностики MB в Башкортостане.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Корытина, Гульназ Фаритовна, Уфа

1. Абгангла К., Осиновская Н. С., Иващенко Т. Э., Баранов В. С. Молекулярно-генетический анализ тандемных повторов в интроне 6В гена ТРБМ в некоторых популяциях и у больных муковисцидозом // Генетика. 1992. Т. 28. № 11. С. 145-149.

2. Амелина ЕЛ., Самсонова М. В., Черняев АЛ. Поражения легких при муковисцидозе // В кн.: Хронические обструктивные болезни легких / Ред. А.Г. Чучалина. М.: "Бином", 1998. 256 с.

3. Амосенко Ф. А., Сазонова М. А., Капранов Н. П., Трубникова И. С., Калинин В. Н. Анализ некоторых полиморфных маркеров гена ТРБМ у больных муковисцидозом и у здоровых доноров московского региона // Генетика. 1995. Т. 31. № 4. С. 532-535.

4. Бакай М.А. Молекулярно-генетический анализ гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза у больных Санкт-Петербурга. Корреляция фенотип-генотип // Автореферат дис. канд. биол. наук. СПб.,1998. 19 с.

5. Баранов B.C., Гинтер Е.К. Генетические аспекты муковисцидоза // Капранов Н.И., Рачинский C.B. Муковисцидоз,- М.: Медицина, 1995. С. 8-24.

6. Баранов B.C., Горбунова В.Н., Вахарловский В.Г., Иващенко Т.Э. Кузнецова Т.В. Наследственные болезни // В кн.: Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы). Т. 3. Ред. А. И. Карпищенко. СПб., "Интермедика". 1997. С. 180-202.

7. Баранов B.C., Горбунова В.Н., Иващенко Т. Э. Пренатальная диагностика, медико-генетическое консультирование и профилактика муковисцидоза (кистозного фиброза): Методические рекомендации. М.,1991. 30. с.

8. Баранов B.C., Иващенко Т.Э., Горбунова и др. Аллельный полиморфизм ДНК-локусов MET, D7S8, D7S23, сцепленных с геном муковисцидоза в некоторых популяциях СССР, в семьях высокого риска и у больных муковисцидозом //Генетика. 1991. Т. 27. №1. С. 113-121.

9. Гембицкая Т.Е., Баранов B.C. Информация о работе IV Североамериканской конференции по муковисцидозу // Пульмонология. 1991. №2. С. 59-62.

10. Гимбовская С. Д., Калинин В.Н., Иващенко Т.Э., Баранов B.C. Полиморфные маркеры, сцепленные с геном муковисцидоза в республике Молдова. Характеристика гаплотипов и их сцепления с различными мутациями //Генетика. 1994. Т. 30. №12. С. 1616-1620.

11. Глазков П.Б., Миткина Е.Н, Гембицкая Т.Е., Иващенко Т.Э., Орлов A.B., Баранов B.C. Взаимоотношения генотип-фенотип у больных муковисцидозом и разработка экспериментальных основ генотерапии этого заболевания // Пульмонология. 2000. № 1. С. 14-23.

12. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб.: Специальная литература, 1997. 286 с.

13. Евграфов О.В. Генетическая археология: новый подход к исследованию генетической структуры популяций// ДАН. 1994. Т. 338. №6. С. 822-826.

14. Желенина Л. А. Муковисцидоз у детей (клинико-генетические особенности, инфекционный процесс в легких, лечение) // Автореф. дисс. д-ра мед. наук. Спб., 1998. 47 с.

15. Желенина Л.А. Муковисцидоз: диагностика и принципы лечения больных // В кн.: Болезни органов дыхания. Клиника и лечение. Избранные лекции / Ред. А. Н. Кокосова. СПб.: "Лань", 1999. 256с.

16. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. М.: Наука. 1991. 272 с.

17. Забаровский Е.Р. Новые стратегии клонирования идентичных и различающихся фрагментов ДНК из сложных геномов // Мол. Бил. 2000. Т. 34. №4. С.612-625.

18. Иващенко Т.Э. Идентификация мутаций и ПДРФ анализ ДНК-локусов, сцепленных с геном муковисцидоза, в некоторых популяциях, семьях высокого риска и у больных // Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1992. 26 с.

19. Иващенко Т.Э. Муковисцидоз: молекулярно-генетический анализ гена, разработка новых подходов диагностики и генотерапии // Автореф. дисс. д-ра мед. М., 2000. 46 с.

20. Иващенко Т.Э, Бакай М.А., Михайлова Е.Г., Баранов B.C., Гембицская Т.Е., Желенина Л.А. Молекулярный анализ спектра и частот мутаций гена CFTR у больных муковисцидозом С.Петербурга // 2-ой съезд ВОГИС. С.Петербург. 2000. С. 269.

21. Иващенко Т.Э, Асеев М.В., Малышева О.В., Бакай М.А., Осиновская Н.С. и др. ДНК-методы в пренатальной диагностике генных болезней // Вестн. Рос. Ассоц. Акушерства-Гинекологии. 1997. № 3. С. 46-49.

22. Капранов Н.И., Рачинский C.B. Муковисцидоз. М.Медицина. 1995. С. 8

23. Капранов Н. И., Каширская Н.Ю. Актуальные проблемы муковисцидоза // Педиатрия. 1998. №1. С. 61-66.

24. Капранов Н.И., Успехи и современные проблемы в диагностике и лечении муковисцидоза в России //Пульмонология. 2001. Т. 11. № 3. С. 9-16.

25. Кузеев Р.Г. Волго-Уральский регион этнокультурного взаимодействия финно-угорских и тюркских этносов // В сб.: Антропология и популяционная генетика башкир. Уфа, 1987. С. 6-17.

26. Кузеев Р.Г. Народы среднего Поволжья и Южного Урала. М.: Наука, 1992. 345 с.

27. Миткина. E.H., Гембицкая Т.Е., Фокина A.A., Куприна Е.А, Орлов A.B., Глазков П.Б. Измерение разности назальных потенциалов новый, информативный тест для диагностики муковисцидоза // Пульмонология. 1999. № 3. С. 50-54.

28. Новик A.A., Камилова Т.А., Цыган В.Н. Генетика в клинической медицине (руководство для врачей). Спб.: ВмедА, 2001. 219 с.

29. Петрова Н.В. Определение относительных частот некоторых мутаций гена CFRT и анализ гаплотипов сцепленных с ним ДНК-маркерных локусов в популяциях России //Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1996. 24 с.

30. Петрова Н.В., Капранов Н.И., Гинтер Е.К. Определение частых мутаций гена CFTR у больных муковисцидозом из Центральной России // Генетика. 1997. Т. 33. С. 106-109.

31. Петрова Н.В., Гинтер Е.К. Десятилетний опыт молекулярно-генетической диагностики муковисцидоза в МГНЦ РАМН // Пульмонология. 2001. Т. 11. № 3. С. 17-20.

32. Потапова О. Ю. Молекулярно-генетический анализ кистозного фиброза в России//Автореф. дисс. канд. биол. наук. СПб, 1994. 21с.

33. Рынков Ю.Г., Балановская Е.В., Жукова О.В., Нурбаев С.Д., Шнейдер Ю.В. Генофонд, теногеотрафия и заболеваемость населения // Успехи соврем, генетики. М.: Наука, 1996, 205 с.

34. Сазонова М.А., Амосенко Ф.А., Капранов Н.И., Калинин В.Н. Молекулярно-генетический анализ внутригенных полиморфизмов TUB 18 и TUB20 и некоторых мутаций гена ТРБМ в московской регионе // Генетика. 1997. Т. 33. №9. С. 1303-1307.

35. Чучалин А.Г., Воронина JI.M., Кронина JT.A., Самсонова М.В. Муковисцидоз у взрослых: этиология, патогенез, перспективы лечения // Пульмонология. 1994. №3. С. 17 -23.

36. Хуснутдинова Э.К. Молекулярная этногенетика народов Волго-Уральского региона. Уфа. .Тилем, 1999. 238 с.

37. Янковский Н.К. Геномика в 2000 году. Заметки с конференции Human Genome Meeting 2000 // Мол. Биол. 2000. Т34. №4. С. 708-714.

38. Abeliovich D., Lavon I. P., Lerer I., et al. Screening for five mutations detects 97% of cystic fibrosis (CF) chromosomes and predicts a carrier frequency of 1:29 in the Jewish Ashkenazi population//Am. J. Hum. Genet. 1992. V.51. P. 951-956.

39. Al-Jader J. N., Meredith А.Г., Ryley H.C. et al. Severity of chest disease in cystic fibrosis patients in relation to their genotype // Med. Genet. 1992. V. 29. № 12. P. 883-887.

40. Alton E.W. Currie D., Eogan-Sinclair R. et al Nasal potential difference: a clinical diagnostic test for cystic fibrosis // Eur. Respir. J. 1990. V. 8. № 3. P. 922928.

41. Ameen N., Alexis J., Salas P. Cellular localization of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in mouse intestinal tract // Histochem. Cell. Biol. 2000a. V. 114. P. 69-75.

42. Ameen N., van Donselaar., Posthuma G. et al., Subcellular distribution of CFTR in rat intestine supports a physiologic role for CFTR regulation by vesicle traffic //Histochem. Cell. Biol. 2000b. V.114. P. 219-228.

43. Anderson M. P., Gregory R.J., Thompson S. et al. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 6003-6007.

44. Anderson M. P., Welsh M. J. Calcium and camp activate different chloride channels in the apical membrane of normal and cystic fibrosis epitelia // Science. 1991. V. 253. P. 202-205.

45. Anderson W.F. Human gene therapy // Nature. 1998. V. 392. P. 25-30.

46. Angelicheva D., Boteva K., Jordanova A., Savov A., Kufardjieva A., Tolun A., Dean M., Ivaschenko T., Baranov V., Kalaydjieva L. Cystic fibrosis patients from the black sea region: the 1677delTA Mutation // Human Mutat. 1994. P. 353-357.

47. Angelicheva D., Calafell F., Savov A. et al. Cystic fibrosis mutations and associated haplotypes in Bulgaria a comparative population genetic study // Human Genet. 1997. V. 99. P. 513-520.

48. Anguiano A., Oates R.D., Amon J.A. et al. Congenital bilateral absence of the vas deference: a primarily genital form of cystic fibrosis // JAMA. 1992. V.267. P. 1794-1797.

49. Bandelt H. J. Phylogenetic network // Verh. Naturwiss. Ver. Hamburg. 1994. V. 34. P. 51-71.

50. Baranov A., Glazkov P., Kiselev A. et al. Local and distant transfection of mdx muscle fibers with dystrophin and LacZ genes delivered in vivo by synthetic microspheres // Gene Therapy. 1999. V. 6. P. 1406-1414.

51. Barash J., Kiss B., Prince A. et al. Defective acidification of intracellular organells in cystic fibrosis //Nature. 1991. V. 352. P.70-73.

52. Bayleran J.K., Yan H., Hopper C. A. et al. Frequencies of cystic fibrosis mutations in the Maine population of unknown alleles in individuals of French-Canadian ancestry // Hum. Genet. 1996. V. 98. P. 207-209.

53. Beaudet A., Bowcock A., Buchwald M., et al. Linkage of cystic fibrosis to two tightly linked DNA markers: joint report from a collaborative study // Am. J. Hum. Genet. 1986. V. 39. P. 681-693.

54. Beaudet A. L., Feldman G. L., Fernbach S. D., et al. Linkage disequilibrium, cystic fibrosis, and genetic counseling // Am. J. Hum. Genet. 1989. V. 44. P. 319326.

55. Bergelson J.M., Cunningham J. A., Droguett G. et al. Isolation of common receptor for coxsackie B and adenoviruses 2 and 5 // Science. 1997. V. 275. P. 1320-1323.

56. Berger A., Ikuma M., Hunt J. et al. A Pilot Survey of Cystic Fibrosis Clinical Manifestations in CFTR Mutation Heterozygotes // J. Biol. Chem. 2002. V. 277: P. 2125-2131.

57. Boat T., Welsh M. and Beaudet A. Cystic fibrosis // A. L. Ed. 1989. P. 26492680.

58. Boat T.F. Phenotypic diagnosis of CF/Symposium Session Summaries // Pediatric Pulmonol. Suppl. 1994. V. 10. P. 135.

59. Bombieri C., Benetazzo M., Saccomani A. et al. Complete mutational screening of the CFTR gene in 120 patients with pulmonary disease // Hum. Genet. 1998. V. 103. P. 718-722.

60. Bombieri C., Giorgi S., Carles S. et al. A new approach. For identifying non-patogenic mutations. An analysis of the cystic fibrosis transmembrane regulator gene in normal individuals // Hum. Genet. 2000. V. 106. P. 172-178.

61. Bombieri C., Pignatti P. Cystic fibrosis mutation testing in Italy // Genet Test. 2001. V.5. P. 229-233.

62. Brock D. Heterozygote screening for cystic fibrosis // Eur. J. Hum. Genet. 1995. V. 3. P. 2-13.

63. Brookes A. J. The essence or SNPs // Gene. 1999. V. 234. P. 117-186.

64. Boucher R.C. Status of gene therapy for cystic fibrosis lung disease // J Clin Invest. 1999. V.103. P.441-446.

65. Cantet S., Fanjul M., Bremont F. et al. Cytological characterization of apatitic calcium phosphate structures in bronchial epithelial tissue cultured from a child with cystic fibrosis (deltaF508) // Virchows Arch. 200I.V. 439. P. 683-690.

66. Castellani C., Quinzii C., Altieri S. et al. Mutations That Change the Position of the Putative gamma Phosphate Linker in the Nucleotide Binding Domains of CFTR Alter Channel Gating// Genet Test. 2001 V. 5. P. 249-254.

67. Cheng S.H., Gregory R.J., Marshall J. et al. Deffective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis // Cell. 1990. V.63. P.827-834.

68. Chevalier-Porst., Bonardont A., Chazalette J. et al. 40 Kilobasedeletion (CF44dele4-10) removes exons 4-10 of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene //Hum. Mutat. 1998. V. 1. P. 291-294.

69. Chiba-Falek O., Kerem E., Shoshani T. et al. The molecular basis of disease variability among cystic fibrosis patients carrying the 3849+lOkb C > T mutation // Genomics. 1998. V. 53. P. 276-283.

70. Chiba-Falek O., Nissim-Rafmia M., Argaman Z. et al. Serening of CFTR mutations in an isolated population: identification of carriers and patients // Eur. J. Hum. Genet. 1998. V. 6. P. 181-184.

71. Chikhi L., Destro-Bisol G., Bertorelle G. Et al. Clines of nuclear DNA markers suggest a largely neolitic ancestry of the European gene pool // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V. 95 P. 9053-9058.

72. Chillon M., Casals T., Mercier B., et al. Mutations in the cystic fibrosis gene in patients with congenital absence of the vas deferens // N. Engl. J. Med. 1995. V. 332. P. 1475-1480.

73. Chu C., Trapnell B., Curristin S. et al. Genetic basis of variable exon 9 skipping in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator mRNA // Nat. Genet. 1993. V.3. P. 151-156.

74. Claustres M., Desgeorges M., Moine P. et al. CFTR haplotypic variability for normal and mutant genes in cystic fibrosis families from southern France // Hum. Genet. 1996. V. 98. P. 336-344.

75. Claustres M, Gerrard B, Kjellberg P, Desgeorges M, Démaillé J, Dean M Screening for cystic fibrosis mutations in southern France: identification of a frameshift mutation and two missense variations // Hum Mutat. 1992. V.l. N 4. P. 310-313

76. Clarke L. L., Grubb B. R., Gabriel S. E. et al. Defectiv epitelial chlorid transport in a gene- targeted mouse model of cystic fibrosis // Science. 1993. V. 257. P. 1128 1128.

77. Collins F. S. Positional cloning: let's call it reverse anymore // Nature Genet. 1992. V. l.P. 3-6.

78. Collins F. S. Shattuck lecture medical and societal consequences of the Human Genome Project// New Engl. J. Mod. 1999. V.341. P. 28-37.

79. Conrad C., Allen S., Afione S., Reynolds T. et al. Safety of single-dose administration of an adeno-associated vims (AAV)-CFTR vector in the primate lung// Gene therapy. 1996. V. 3. P. 658-668.

80. Crystal G., MaElvaney G., Rosenfeld M. et al. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis //Nature Genet. 1994. V. 8. P. 42-51.

81. Cuppens H., Lin W., Jaspers M. et al. Polyvariant mutatnt CFTR gene: the polymorphic (TG)m locus explains the partial penentrance of the T5 polymorphism as a disease mutation // J. Clin. Invest. 1998. V. 101. P. 487- 496.

82. Cutting G. R., Curristin S. M., Nash E., et al. Analysis of four diverse population groups indicates that a subset of cystic fibrosis mutations occur in common among Caucasians // Am. J. Hum. Genet. 1992. 50: 1185-1194.

83. Cutting G.R., Kasch L.M., Rosenstein B.J. et al. A cluster of cystic fibrosis mutations in the first nucleotide-binding fold of the cystic fibrosis conductance regulator protein//Nature. 1990. V. 346. P. 366-369.

84. Dean M., White M., Amos J. et al. Multiple mutations in highly conserved residues are found in mildly affected cystic fibrosis patients // Cell. 1990. V. 61. P. 863-870.

85. Dean M., Morag P., Le Beau M. et al, The human onkogene is related to the tyrosine kinase oncogenes //Nature. 1985. V. 318. P. 385-388.

86. Delaney S.J., Alton E.W., Smith S.N. et al. Cystic fibrosis mice carrying the missense mutation G551D replicate human genotype-phenotype correlations // EMBO J. 1996. V.15. P.955-963.

87. Dequeker E., Cassiman J-J. Evaluation of CFTR gene mutation testing methods in 136 diagnostic laboratories: report of a large European external quality assessment // Europ. J. Hum. Genet. 1998. V.6. P. 165-175.

88. Dequeker E., Cuppens H., Dodge J. et al. Recommendations for quality improvement in genetic testing for cystic fibrosis European Concerted Action on cystic fibrosis // Europ. J. Hum. Genet. 2000. V. 8. P. 2-24.

89. Dohle G., Halley D., Van Hemel J. et al. Genetic risk factors in infertile men with severe oligozoospermia and azoospennia // Hum Reprod. 2002. V. 17. P. 1316.

90. Dork T., Dworniczak B., Aulehla-Scholz C. et al. Distinct spectrum of CFTR gene mutations in congenital absence of vas deferens // Hum.Genet. 1997. V.100. P.365-377.

91. Dork Th., Mekus B., Macek J. et al. Characterisation of a novel 21-kb deletion, CFTRdele2,3(21kb), in the CFTR gene: a cystic fibrosis mutation of Slavic origin common in Central and East Europe // Hum. Genet. 2000. V. 106. P. 259-268.

92. Dork Th., Neumann T., Wulbrand U. et al. Intra- and extragenic marcer haplotypes of CFTR mutations in cystic fibrosis families // Hum. Genet. 1992. V. 88. P. 417-425.

93. Dumar V., Gervais R., Rigot JM. et al. Abnormal distribution of CF delF508 allele in azoospermic men with congenital aplasia of epididymus and vas deference // Lancet. 1990. V.336. P. 512.

94. Dumar V., Gervais R., Rigot JM. et al. Congenital bilateral absence of the vas deferens (CBAVD) and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR): correlation between genotype and phenotype // Hum. Genet. 1997. V.97. P. 7-10.

95. Eiberg H., Morh J., Schmiegelow K., Nielsen L.S., Williamson R. Linkage relationship of paraoxonase (PON) with other markers: Indication of PON-cystic fibrosis syntheny // Clin.Genet. 1985. V. 28. P. 265-271.

96. El-Harith E.-H. A., Stuhrmann M., Dork T., et al. PCR-based analysis of cystic fibrosis mutations specific for Saudi patients // Saudi Med. J. 1998. V. 19. P. 148-152.

97. Ernst R. K., Yi E. C., Guo L., Lim K. B.; Burns J. L., Hackett M., Miller S. I. Specific lipopolysaccharide found in cystic fibrosis airway Pseudomonas aeruginosa// Science. 1999. V. 286. P. 1561-1565.

98. Estivill X., Bancells C., Ramos C. et al. The Biomed CF Mutation Analysis Consortium Geographic Distribution and Regional Origin of 272 Cystic Fibrosis Mutations in European Populations // Hum. Mutat. 1997. V.10. P.135-154.

99. Farral M., Wainwright B.J., Feldman G.L. et al. Recombination between IRP and Cystic Fibrosis // Amer. J. Human Genet. 1988. V. 43. P. 471-475.

100. Ferec C., Audrezet M. P., Mercier B., et al. Detection of over 98% cystic fibrosis mutations in a Celtic population // Nature Genet. 1992. V. 1. P. 188-191.

101. Ficher H., Illek B., Machen T. Regulation of CFTR by protein phosphatase 2B and protein kinase C // Eur. J. Physiol. 1998. V. 436. P.175-181.

102. Gabriel S.E., Brigmann K.N. Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin measured directly in the CFTR (-/-) mouse model // Pediatric Pulmonology. 1994, LBS, abs. 39 a.

103. Garry R., Cutting M.D. Implications of CFTR functions on the understending of the relationship between genotipe/phenotype // Pediatric Pulmonology. 1995. V.12. P. 119-127.

104. Gasparini P., Borgo G., Mastella G. et al. Nine cystic fibrosis patients gomozygous for the CFTR nonsense mutation R1162X have mild or moderate lung disease // J.Med.Genet. 1992. V.29. N 8. P. 558-562.

105. Gibson A., Wagner L., Collins F. et al. A bacterial system for investigating transport effects of cystic fibrosis-assosiated mutations // Science. 1991. V. 254. P. 95-97.

106. Girodon E., Cazeneuve C., Lebargy F. CFTR gene mutations in adults with disseminated bronchiectasis //Eur. J. Hum. Genet. 1997. V. 5. P. 149-155.

107. Gomez-Llorente M., Suarez A., Gomez-Llorente C. Analysis of 31 CFTR mutations in 55 families from the south of Spain // Early. Hum. Dev. 2001. V. 65. P. 161-164.

108. Green E. D., Olson M. V. Chromosomal region of the cystic fibrosis gene in yeast artificial chromosomes: a model for human genom mapping // Science. 1990. V. 250. P. 94-98.

109. Gregory R.J., Cheng S.H., Rich D.R. et al. Expression and characterization of the cystic fibrosis transmembrane regulator //Nature. 1990. V.347. P. 382-386.

110. Grygorczyk R., Hanrahan J. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and adenosine triphosphate // Science. 1997. V. 275. P. 1324-1326.

111. Grubb B., Pikles R., Ye H. et al. Inefficient gene transfer by adenovirus vector to cystic fibrosis airway epitelia of mice and humans // Nature. 1994. V. 371. P. 802-806.

112. Harris A., Chalkley G., Goodman Sh., Coleman L. Expression of the cystic fibrosis gene in human development//Development. 1991. V. 113. P. 305-310.

113. Hasty P, O'Neal W. K., Liu K.Q. et al. Severe phenotype in mice with termination mutation in exon 2 of cystic fibrosis gene // Somat. Cell Mol. Genet. 1995. V.21. P. 177-187.

114. Hergersberg M., Balakrishman J., Bettecken T. et al. A new mutation, 3905insT, accounts for 4,8% of 1173 CF chromosomes in Switzerland and causes a severe phenotype // Hum. Genet. 1997. V.100. P. 220-223.

115. Highsmith W.E., Burch L.H., Zhou Z. et al., Identification of a splice site mutation (2789+5G>A) associated with small amounts of normal CFTR mRNA and mild cystic fibrosis // Hum. Mut. 1997. V.9. P. 332-338.

116. Jackson M. S., Canessa C. M., Olsen J. C. et al. CFTR as a cAMP dependent regulator of sodium channels // Science. 1995. V. 269. P. 847-850.

117. Jeffreys A. J., Royle N. J., Wilson V. et al. Spontaneous mutation rates to new length alleles at tandem- repetitive hypervariable loci in human DNA // Nature. 1988. V. 332. P. 278-281.

118. Jetten A., Yankaskas J., Stutts J. Persistence of abnormal chloride conductance regulation in transformed cystic fibrosis epitelia // Science. 1989. V. 244. P. 14721475.

119. Jiang, C., Finkbeiner W.E., Widdicombe J.H., McCray P. and Miller S.S. Altered fluid transport across airway epithelium in cystic fibrosis // Science. 1993. V. 262. P. 424-431.

120. Jiang Q., John F. Engelhardt. Cellula heterogeneity of CFTR expression and function in the lung: implication for gene therapy of cystic fibrosis // Eur. J. Hum. Genet. 1998. V. 6. P. 12-31.

121. Kartner N., Augustinas O., Jensen T.J., Naismith A.L., Riordan J.R. Mislocalization of delta F508 CFTR in cystic fibrosis sweat gland // Nature Genetics. 1992. V. 1. P. 321-328.

122. Kerem B., Harel-Nave N., Augarten A. et al. Clinical presentation of patients carrying the 5 thymideine tract in intron 8-from healthy individuals to typical CF// Pediatric Pulmonology. 1995. V. 12. P.203.

123. Kerem E., Kalman Y. M., Yahav Y., et al. Highly variable incidence of cystic fibrosis and different mutation distribution among different Jewish ethnic groups in Israel //Hum. Genet. 1995. V. 96. P. 193-197.

124. Kerem B., Kerem E. The Molecular Basis for Disease Variability in Cystic Fibrosis //Eur. J. Hum. Genet. 1996. V. 4. P.65-73.

125. Kerem B., Rommens J.M., Buchanan J. A. et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis // Science. 1989. V. 245. P. 1073-1080.

126. Kerem B., Zielenski J., Markiewicz D. et al. Identification of mutations in regions corresponding to the 2 putative nucleotide (ATP)-binding folds of the cystic fibrosis gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 8447-8451.

127. Krawczak M., Konecki D.S., Schmidtke I. et al. Allelic association of the cystic fibrosis locus and two DNA markers, Xv-2c and KM-19 in 55 German families //Hum. Genet. 1988. V. 80. P. 78-80.

128. Kunselmann K., Schreiber R. CFTR, a regulator of channels // J. Membrane Biol. 1999. V. 168. P. 1-8.

129. Lerer I., Laufer-Cahana A., Rivlin J. et al. A large deletion mutation in the CFTR gene (3120+lkbdel8, 6kb): a founder mutation in the Palestinia Arabs // Hum. Mutat. 1999. V. 13. P. 337.

130. Lyamichev V., Most A., Hall J. Polymorphism identification and quantitative detection of genomic DNA by invasive clevage of oligonucleotide probes // Nature Biotechnol. 1999. V.17. P. 292-296.

131. Magnani C., Cremonesi L., Giunta A. Short direct repeats at the breakpoints of a novel large deletion in the CFTR gene suggest a likely slipped mispairing mechanism//Hum. Genet. 1996. V. 98. P.102-108.

132. Marchand E., Verellen-Dumouling C., Mairesse M. Frequence of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutation and 5T allele in patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis // Chest. 2001. V. 119. P. 762-767.

133. Marx J.L. The cystic Fibrosis gene is found // Science. 1989. V. 245. P. 19-21.

134. Mateu E., Calafell F., Lao O. et al. Wordwide genetic analysis of the CFTR region//Am. J. Hum. Genet. 2001. V. 68. P. 103-117.

135. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in molecular biology / Ed. Walker J.M.N.Y.; Haman Press. 1984. P. 3134.

136. Mathews C., Tabcharani J., Hanrahan J. The CFTR chloride channel: nucleotide interactions and temperature-dependent eating // J. Membrane Biol. 1998. V.163. P.55-66.

137. Mekus F., Ballmann M., Bronsveld I. et al. Cystic fibrosis like disease unrelated to the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator // Hum. Genet. 1998. V. 102. P. 582-586.

138. Messaound T., Verlingiie C., Denamur E. et al. Distribution of CFTR mutations in cystic fibrosis patients of Tunisian origin: idendification of two novel mutations // Eur. J. Hum. Genet. 1996. V. 4. P. 20-24.

139. Miller P., Hamosh A., Malec M. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene mutation in allergic bronchopulmonary aspergillosis // Am. J. Hum. Genet. 1996. V. 59. P. 45-51.

140. Mornet E., Chateau C., Simon-Bouy B. et al. Carrier detection and prenatal diagnosis of cystic fibrosis using an intragenic TA-repeat polymorphism // Hum. Genet. 1992. V. 88. P. 479-481.

141. Morral N., Bertranpetit J., Estivill X. The origin of the major cystic fibrosis mutation (delF508) in European populations //Nat. Genet. 1994. V. 7. P. 169-175.

142. Morral N., Bosch A., Gaona A. et al. Identification and analysis of three GT dinucleotide repets flanking exon 9 of the cystic fibrosis transmembran conductance regulator (CFTR) gene // Amer. J. Hum. Genet. 1990. V. 47. P. A229.

143. Morral N., Dork Th. et al. Haplotype analysis of 94 cystic fibrosis mutations with seven polymorphic CFTR DNA markers // Hum. Mutat. 1996. V.8. P. 149159.

144. Morral N., Nunes V., Casals T. CA/GT microsatellite allele within the Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene are not generated by unequalcrossingover//Genomics. 1991. V. 10. P. 692-698.

145. Morral N., Nunes V., Casals T. et al. Uniparental inheritance of microsatellite alerts of the cystic fibrosis gene (CFTR): identification of a 50 kilobase deletion//Hum. Mol. Genet. 1993. V. 2. P. 677-681.

146. Nakamura Y., Leppert M., O'Connell P. et al. Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping // Science. 1987. V. 235. P. 1616-1622.

147. Nakkash L., Hwang T. Activation of wild-type and delF508 -CFTR by phosphodiesterase inhibitors through cAMP-dependent and-independent mechanisms //Eur. J. Physiol. 1999. V. 473. P. 553-561.

148. Nei M. Molecular Evolutionary Genetics. New York: Columbia University Press, 1987. 275 p.

149. Noone P., Zhou Z., Silverman L. et al. Cystic fibrosis gene mutations and pancreatitis risk: relation to epithelial ion transport and trypsin inhibitor gene mutations // Gastroenterology. 2001. V. 6. P. 1310-1319.

150. Onay T., Topaloglu O., Zielenski J. et al. Analysis of the CFTR gene in Turkish cystic fibrosis patients: identification of three novel mutations (3172delAC, P1013L and Ml 0281) // Hum. Genet. 1998. V. 102. P. 224-230.

151. Orita M., Jwahana H., Kanazawa H., Sekya T. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. V. 86. P. 2766-2770.

152. Orozco L., Velazquez R., Zielenski J. et al. Spectrum of CFTR mutations in Mexican cystic fibrosis patients: identification of five novel mutations (W1098C, 846delT, P750L, 4160ms GGGG and 296-lG>A) // Hum. Genet. 2000. V.106. P. 360-365.

153. Perez-Lezaun et al. Allele frequencies for 20 microsatellite loci in a worldwide population survey//Hum. Hered. 1997. V. 47. P. 189-196.

154. Pier G., Grout M., Zaidi T. et al. Role of mutant CFTR in hipersusceptibility of cystic fibrosis patients to lung infections // Science. 1996. V. 271. P. 64-66.

155. Pier G., Grout M., Zaidi T. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator is an epithelial cell receptor for clearance of Pseudomonas aeruginosa from the lung //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P.12088-12093

156. Pignattti P., Bombieri C., Marigo C. et al. Increased incidence of cystic fibrosis gene mutations in adults with disseminated bronchiectasis // Hum. Mol. Genet. 1995. V.4. P. 635-639.

157. Raman V., Clary R., Siegrist K. et al. Increased prevalence of mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in children with chronic rhinosinusitis//Pediatrics. 2002. V. 109. P.13-16.

158. RatcliffR, Evans M.J., Cuthbert A.W. et al. Production of a severe cystic fibrosis mutation in mice by gene targeting // Nat. Genet. 1993. V.4. P.35-41.

159. Rave-Harel N., Kerem E., Nissim-Ratinia M. et al. The Molecular Basis of Partial Penetrance of Splicing Mutations in Cystic Fibrosis // Am. J. Hum. Genet. 1997.V. 60. P.87-94.

160. Ravnik-Glavac M., Svetina N., Zorn B. et al. Involvement of CFTR Gene Alterations in Obstructive and Nonobstructive Infertility in Men // Genet. Test. 2001. V. 5. P. 243-247.

161. Reddy M., Quinton P., Haws C. et al. Faiure of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to conduct ATP // Science. 1996. V. 271. P. 1876-1879.

162. Reynolds J., Tiu A., Berg B. et al. Asymptomatic cystic fibrosis diagnosed in an adult evaluated for hematuria // Am. J. Kidney. Dis. 2002. V. 39. P. 3-7.

163. Riordan J.M., Rommens J.M., Kerem B. et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA // Science. 1989. V. 245.P.1066-1073.

164. Rodman D.M., Zamudio S. The cystic fibrosis heterozigotes Advantage in surviving cholera ? // Med. Hipotes. 1991. V. 36. P. 253-258.

165. Roff D. F., Bentzen P. The statistical analysis of mitochondrial DNA: x 2 and problem of small samples // Mol. Biol. Evol. 1989. V. 6. P. 539-545.

166. Romeo G., Devoto M., Galietta L.J. Why is the cystic fibrosis gene so frequent? // Hum Genet. 1989. V. 84. № 1. P. 1-5.

167. Romey M., Guittard C., Chazalette J. et al. Complex allele (102T>A+S549R(T>G) is associated whis milder forms of cystic fibrosis than allele S549R (T>G) alone // Hum. Genet. 1999. V. 105. P. 145-150.

168. Romey M., Tuffery S., Desgeorges M. et al. Transcript analysis of CFTR frameshift mutation in lymphocytes using the reverse transcriprion-polymerase chain reaction technique and the protein trancation test // Hum. Genet. 1996. V. 98. P. 328-332.

169. Rommens J.M., Iannuzzi M.C., Kerem B. et al., Identification of Cystic Fibrosis gene: Chromosome walking & jumping // Science. 1989. V. 245. P. 10591065.

170. Schneider S., Roessli D., Excoffier L. ARLEQUIN ver 2.0: a software for population-genetics data analysis. Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, 2000,.

171. Schreiber R., Greger R., Nitschke et al. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates water conductance in Xenopus oocyte. // Eur. J. Physiol. 1997. V. 434. P. 841-847.

172. Schwarz M., Anuret M., Claustres M., Eiken H.G., Eiklid K., Schaedel C., Stolpel L., and Tranebjaerg L. 394delTT: a nordic CF mutation // Hum. Genet. 1994. V. 93. P. 157-161.

173. Scoted V., De Braekeleer M., Audrezet M. et al. Prevalence of CFTR mutation in hypertrypsinemia detected through neonatal screening for cystic fibrosis // Clin. Genet. 2001. V. 59. P. 42-47.

174. Serre J. L., Simon-Bouy B., Mornet E. et al. Studies of RFLP closely linked to the cystic fibrosis locus throughout Europe lead to new considerations in population genetics//Hum. Genet. 1990. V. 84. P. 449-454.

175. Sheppard D., Rich D., Ostedgaard L. er al. Mutation in CFTR assosiated with mild-disease-form CI channels withaltered pore properties // Nature. 1993. V. 362. P. 160-164.

176. Shults B., Bridges R., Frizzell R. Lack of conventional ATPase properties in CFTR chloride channel gating // J. Membrane Biol. 1996. V.151. P. 63-75.

177. Smith A.E., Cheng S.H., Marshall J. et al. Processing of CFTR // Pediatric Pulmonology. 1992. V. P. 187-188.

178. Stewart B., Zabner J., Shuber A. et al. Normal sweat chloride values do not exclude the diagnosis of cystic fibrosis // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 1995. V. 151. P. 899-903.

179. Strandvik B., Bjorck E., Fallstrom M. et al. Spectrum of Mutations in the CFTR Gene of Patients with Classical and Atypical Forms of Cystic Fibrosis from Southwestern Sweden: Identification of 12 Novel Mutations // Genet. Test. 2001. V. 5. P. 235-242.

180. Stutts J., Canessa C., Olsen J. et al. CFTR as a camp-dependent regulator of sodium channels // Science. 1995. V. 269. P. 847-849.

181. Swofford L., Selander B. BIOSYS-2: Computer program for the analysis of allelic variation in genetics. Department of genetics and development University of Illinois, current release: 1997.

182. The CF mutation database 2002: http//www. genet, sickkids. on. cax/cftr

183. Trezise A., Buchwald M. In vivo cell-specific expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.\// Nature. 1991. V. 353. P. 434-437.

184. Truninger K., Ammann R., Blum H. et al. Genetic aspects of chronic pancreatitis: insights into aetiopathogenesis and clinical implications // Swiss. Med. Wkly. 2001. V. 131. P. 565-574.

185. Wagner J., Vassilakis A., Yee K. et al. Two novel mutations in cystic fibrosis patient of Chinese origin//Hum. Genet. 1999. V. 105. P. 511-515.

186. Wainwright B. J., Scambler P. J., Schmidtke J., et al. Localization of cystic fibrosis locus to human chromosome 7cen-q22 // Nature. 1985. V. 318. P. 384-385.

187. Weber W., Cuppens H., Cassiman J. et al. Capacitance measurements reveal different pathways for the activation of CFTR // Eur. J. Physiol. 1999. V. 438. P. 561-569.

188. Weber J.L. and C. Wong. Mutation of human short tandem repeats // Hum. Molec. Genet. 1993. V. 2. P. 1123-1128.166

189. Weinreich F., Wood P., Riordan J. et al. Direct action of genistation on CFTR // Eur. J. Physiol. 1997. V. 434. P. 484-491.

190. Welsh M.J., Smith A.E. Molecular mechanisms of CFTR chloride channel dysfunction in cystic fibrosis // Cell. 1993. V. 73. P.1251-1254.

191. White R., Woodward S., Leppert M. et al. A closely linked genetic marker for cystic fibrosis // Nature. 1985. V. 318. P. 382-384.

192. Wilson D. C., Ellis L., Zielenski J., et al. Uncertainty in the diagnosis of cystic fibrosis: Possible role of in vivo nasal potential difference measurements // The J. of Pediatrics. 1998. V. 132. P.596-599.

193. Zielenski J., Markiewicz D., Rinisland F. et al. A cluster of highly polymorphic dinucleotide repeats in intron 17b of the cystic fibrosis transmembran conductance regulator (CFTR) gene // Amer. J. Hum. Genet. 1991. V.49. P. 12561262.

194. Zielenski J., Rosmahel R., Bozon D. et al. Genomic DNA sequence of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene // Genomics. 1991. V. 10. P. 214-228.

195. Zsembery A., Jessner W., Sitter G. et al. Correction of CFTR malfunction and stimulation of Ca-activated CI channels restore HC03- secretion in cystic fibrosis bile ductular cells //Hepatology. 2002. V. 35. P. 95-104.