Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование мутаций в генах гемохроматоза и рецептора трансферрина2 в популяциях Центральной Евразии и у больных многофакторными заболеваниями

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование мутаций в генах гемохроматоза и рецептора трансферрина2 в популяциях Центральной Евразии и у больных многофакторными заболеваниями"

005010518

На правах рукописи

ХУСНУТДИНОВА НАТАЛЬЯ НИКОЛАЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ ГЕМОХРОМАТОЗА И РЕЦЕПТОРА ТРАНСФЕРРИНА2 В ПОПУЛЯЦИЯХ ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЕВРАЗИИ И У БОЛЬНЫХ МНОГОФАКТОРНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9 ОЕВ 2012

Уфа- 2012

005010518

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Хуснутдинова Эльза Камилевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Мустафина Ольга Евгеньевна

доктор биологических наук, профессор Спицын Виктор Алексеевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится «^7 » февраля 2012 г. в « /£ » часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: www.ibg.anrb.ru/dissov.html, e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан » января 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета

С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Наследственный гемохроматоз (НГХ) является одним из частых заболеваний обмена веществ, встречается с частотой 3-8 случаев на 1000 человек в европейских популяциях (Balan, 1994; Baer, 1995; Beutler, 2002; Delatycki, 2005; Bacon, 2011). Патогенетической характеристикой НГХ является увеличение абсорбции железа, приводящее к прогрессирующему накоплению его в различных органах и развитию цирроза печени, диабета, кардиомиопатий, артрозов и эндокринных нарушений (Pietrangelo, 2004; Adams, 2007; Olynyk, 2008; Andrews, 2008). Для НГХ характерна высокая генетическая гетерогенность с различным уровнем пенетрантности (European Association For The Study Of The Liver, 2010). Существуют несколько форм НГХ, ассоциированных с различными генами и типами наследования. Самая распространенная форма НГХ (более 95% всех случаев) - тип 1, вызываемая дефектами в гене HFE (Simon, 1996). Продукт гена HFE - трансмембранный гликопротеин HFE, который является регулятором поглощения железа (Parkkila, 1997; Feder, 1998; Lebron, 1998). В настоящее время в гене HFE выявлено 11 мутаций, сцепленных с заболеванием. В 60-96% случаев НГХ больные европеоидного происхождения являются гомозиготами по мутации C282Y и 5% - компаунд-гетерозиготами по мутациям C282Y, H63D и S65C гена HFE (Beutler Е, 1996; Bacon BR. 1999; Pietrangelo, 2010). Роль мутаций H63D и S65C гена HFE в развитии нарушений метаболизма железа недостаточно изучена, результаты многочисленных исследований противоречивы (Mura, 1999; Gochee, 2002; Samarasena, 2006). Индивиды, носители мутаций H63D и S65C гена FIFE, имеют повышенную вероятность развития «мягкой» формы гемохроматоза, фенотипические проявления которой, судя по всему, зависят от влияния факторов внешней среды и каких-либо дополнительных генетических модифицирующих факторов (Waheed, 1997; Bonkovsky, 2002). Вследствие гетерозиготных мутаций в гене гемохроматоза {FIFE) небольшие количества железа могут аккумулироваться, способствуя увеличению тяжести или прогрессированию «негемохроматозных» заболеваний (Ellervik, 2007; Sikorska, 2011; Ishizu, 2011). Существуют выраженные этнические различия в распространенности мутаций C282Y, H63D и S65C гена HFE в популяциях мира, наиболее часто встречающихся в европейских популяциях, реже - у народов Юго-Восточной Азии и очень редко - в популяциях Африки, Центральной и Южной Америки (Beckman, 1999; Chandok, 2011).

Известно существование нескольких форм НГХ, не связанных с мутациями в гене HFE, а развивающихся из-за повреждения других генов белков, участвующих в обмене железа, таких как ферропортин-1, трансферриновый рецептор 2 и гепсидин (Roetto, 1999; Camaschella, 2000; Mattman, 2000; Donovan, 2000; Kato, 2001). Одновременно, поскольку железо играет важную роль в функционировании клетки, изменения в содержании железа могут играть патофизиологическую роль в развитии не только НГХ, но и ряда многофакторных заболеваний. (Kohgo, 2008). Объяснение генетических основ НГХ вызвало новый интерес ко всем аспектам этого заболевания. Несмотря на значительный прогресс в понимании регуляции метаболизма железа и молекулярных основ различных форм НГХ, остается открытым рад ключевых вопросов, касающихся распространенности и происхождения мутаций в генах, ответственных за развитие заболевания.

В настоящее время в Волго-Уральском регионе и Средней Азии гемохроматоз клинически не диагностируется, во многих популяциях Восточной Европы данные как по распространенности заболевания, так и по частоте гетерозиготного носительства мутаций в ответственных генах отсутствуют. В связи с этим является актуальным изучение распространенности наиболее частых мутаций в гене HFE, оценка их гетерозиготного носительства в различных популяциях Евразии, а также функциональной значимости мутаций в генах НГХ, в развитии широко распространенных социально значимых заболеваний человека.

Целью исследования является оценка распространенности мутаций в генах гемохроматоза (FIFE) и рецептора трансферрина 2 (TJR2'), ассоциированных с наследственным гемохроматозом, в различных популяциях Центральной Евразии и их вклада в развитие ряда многофакторных заболеваний.

Задачи исследования:

1. Оценить распространенность мутации C282Y (c.845G>A, rsl800562) в гене HFE в популяциях Центральной Евразии.

2. Изучить частоту мутации H63D (C.1870G, rsl799945) в гене HFE в популяциях Центральной Евразии.

3. Провести генотипирование полиморфных локусов с.340+4Т>С (rs2071303, IVS2(+4)T>C), с.893-44Т>С (rsl800708, IVS4(-44)T>C), c.l007-47G>A (rsl572982, IVS(~47)A>G) в гене HFE и анализ их гаплотипов у индивидов, гомозиготных по мутации H63D в гене HFE.

4. Провести анализ распространенности мутации 565С (с.193А>Т, гб 1800730) в гене НЕЕ в популяциях Волго-Уральского региона.

5. Определить частоту мутаций С282У (с.845Б>А, гб1800562), 1163 Э (с.187С>С, ге1799945), Б65С (с.193А>Т\ ге 1800730) в гене гемохроматоза {ИГЕ) и У250Х (с.750С>0) в гене рецептора трансферрина 2 (7)2^) у больных сахарным диабетом 2 типа, хронической сердечной недостаточностью и циррозами печени.

6. Оценить значимость мутаций в генах НЕЕ и Т/Я2 в развитии изученных многофакторных заболеваний.

Научная новизна исследования. Впервые получены сведения о распространенности мутаций С282 У, НбЗО в гене НЕЕ в популяциях Центральной Евразии и мутаций 565С в гене НЕЕ и У250Х в гене Т]Ю. в Волго-Уральском регионе России. Выявлено три гаплотипа, сцепленных с мутацией НбЗй, на основе исследования полиморфных вариантов с.340+4Т>С (ге2071303), с.893-44Т>С (гэ1800708), с.1007-47С>Л (^1572982) гена НЕЕ, что свидетельствует о неоднократном возникновении данной мутации на территории Центральной Евразии. Проведена оценка значимости мутаций С2827, НбЗО, БбЗС в гене НЕЕ и У250Х в гене 1/02 в развитии сахарного диабета 2 типа, цирроза печени и различных типов ремоделирования сердца при хронической сердечной недостаточности в РБ с учетом этнической принадлежности больных.

Научно-практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить имеющиеся знания о распространенности мутаций в гене НЕЕ в популяциях Волго-Уральского региона, Центральной Азии и Восточной Европы, а также проливают свет на происхождение мутации НбЗБ гена НЕЕ в Центральной Евразии. Результаты исследования могут быть внедрены в практику медицинских учреждений и использованы для проведения медико-генетического консультирования. Материалы диссертации могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских учебных заведениях и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на 5 съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005), Международных конференциях европейского общества генетиков человека

«European Human Genetics Conference» (Прага, Чехия, 2005; Амстердам, Нидерланды, 2006; Барселона, Испания, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы (285 источников, в том числе 11 отечественных и 274 зарубежных). Иллюстративный материал содержит 11 рисунков и 23 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы исследования. Анализ распространенности мутаций в гене HFE проведен с использованием образцов ДНК 2164 человек из 20 популяций России и бывших Республик СССР, полученных от практически здоровых неродственных индивидов, собранных во время экспедиционных выездов 2001-2004 годов, а также предоставленных Республиканским Центром охраны здоровья матери и

ребенка Минздрава Республики Казахстан, Алматы (табл.1).

Таблица 1

___________Объемы выборок и характеристика исследованных популяций

Популяции Место забора материала Языковая принадлежность N* C282Y N* H63D N* S65C

башкиры Бурзянский, Илишевский районы, Башкортостан тюркская ветвь алтайской языковой семьи 79 79 404

татары Альметьевский, Елабужский районы, Татарстан 110 110 76

чуваши Цивильский район, Чувашия 56 56

якуты дисперсная выборка из Республики Саха (Якутия) 84 84

казахи Жамбыльский, Жалагашский, Абайский районы, Казахстан 258 258

уйгуры Алматинская область, Казахстан 116 116

туркмены Чарджоуская область, Узбекистан 18 18

узбеки дисперсная выборка из Узбекистана 81 81

киргизы Ферганская область, Узбекистан 31 31

таджики Самаркандская область, Узбекистан 42 42

курды Алматинская область, Казахстан иранская группа индоевропейской языковой семьи 49 49

молдаване Тянгушевский район, Молдавия 94 94

коми Коми-пермяцкий автономный округ, Коми романская языковая семья 51 51

удмурты Шарканский район, Удмуртия финно-угорская ветвь уральской языковой семьи 61 61

мордва Старошайгинский район, Мордовия 42 42

марийцы Звениговский район, Мари-Эл 56 56

карелы Кандопожский, Прионежский районы, Карелия 100 100

русские Архангельский район, Башкортостан славянская ветвь индоевропейской языковой семьи 51 51 84

белорусы дисперсная выборка из Беларуссии 96 96

украинцы Полтавский район, Украина 94 94

Примечание: *число индивидов, генотипированных по мутациям гена НЕЕ В работе также использована ДНК 406 больных, представляющих 3 группы

высокого риска развития наследственного гемохроматоза и 519 индивидов без признаков хронических заболеваний в качестве контрольной выборки (табл.2).

Таблица 2

Численность и характеристика больных с многофакторными заболеваниями

Заболевание Количество Средний возраст Пол Этиология заболеваний

цирроз печени (ЦП) 100 45,9 46 м 54 ж 52 вирусной, 48 невирусной этиологии

хрошиеская сердечная недостаточность (ХСН) 203 < 60 лет 170 м 33 ж 82 с эксцентрической гипертрофией ЛЖ (ОТС менее 0.45, дилатация ЛЖ), 107 с концентрической гипертрофией ЛЖ (ОТС более 0.45, ЛЖ более 1.5 см).

Сахарный диабет (СД) 103 52,4 70 ж 30 м Сахарный диабет 2 типа

Всего 420 человек

Забор крови больных ЦП осуществляли на базе гастроэнтерологического

отделения Республиканской клинической больницы им. Г.Г.Куватова (г.Уфа), больных ХСН - на базе кафедры госпитальной терапии Башкирского государственного медицинского университета и городской клинической больницы №13 г. Уфы, больных сахарным диабетом - в эндокринологическом

отделении городской клинической больницы № 22 г. Уфы. Диагнозы были подтверждены клинически, лабораторно, инструментально и морфологически.

Методы исследования. Экстракция геномной ДНК проводилась из венозной крови методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984). Генотипирование мутаций C282Y (c.845G>A, rsl 800562), II63D (c.1870G, rsl799945), S65C (с.193А>Т, rsl800730) в гене гемохроматоза (HFE) и Y250X (c.750C>G) в гене TJR2, полиморфных локусов с.340+4Т>С (rs2071303, IVS2(+4)T>Q, с.893-44Т>С (rsl800708, IVS4(-44)T>C), c.1007-47G>A (rsl572982 JVS(-47)A>G) гена HFE проводилось методами ПЦР-ПДРФ анализа с использованием праймеров и ферментов рестрикции, описанных ранее (Beutler, 1996,1997; Mura, 1999; De Gobbi, 2001).

Статистическая обработка полученных результатов. В качестве инструмента вычислений использован пакет прикладных программ «SPSS v.13.0» (Biihl, 2006). Для оценки неравновесия по сцеплению пары полиморфных локусов использовался показатель D', рассчитанный с помощью программы HaploView 4.2 (Barret, 2005). Построение карт осуществлялось с помощью пакета SURFER 9.0 (Golden Software, Inc., Golden, CO, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ мутаций в гепе гемохроматоза (HFE) в популяциях Центральной Евразии С целью изучения распространенности гемохроматоза на территории России и бывших республик СССР проведено изучение мажорных мутаций C282Y и H63D в гене HFE в 4 популяциях Восточной Европы (карелы, молдаване, белорусы, украинцы), в 9 популяциях Волго-Уральского региона (коми, удмурты, мордва, марийцы, татары, чуваши, 2 этногеографические группы башкир и русские), в 6 популяциях Средней Азии (узбеки, казахи, киргизы, таджики, курды уйгуры), а также у якутов. Проведен анализ частот аллелей и генотипов локусов C282Y и H63D в гене HFE в зависимости от языковой принадлежности и территориальной локализации популяций Центральной Евразии. Учитывая низкую частоту мутации S56C в гене HFE в популяциях мира, мы провели исследование распространенности данной мутации только в трех наиболее многочисленных этнических группах Республики Башкортостан: русских (84 человека), татар (76 человек) и башкир (406 человек).

Изучение распространенности мутации C282Y в гепе HFE. Проведенное нами исследование показало неравномерность распространенности мутации C282Y в гене HFE в исследованных нами популяциях Центральной Евразии. Мутация C282Y выявлена во всех исследуемых популяциях Восточной Европы с частотой от 0,016 у украинцев до 0,06 в популяции карелов. В среднем для исследуемого региона частота мутации C282Y оказалась равной 0,03, что сопоставимо с таковой в популяциях Центральной Европы (McLaren, 1995; Burke, 1998; Powell, 2000). Частота C282Y мутации в популяциях Волго-Уральского региона варьировала от 0,009 у марийцев до 0,066 у удмуртов, составляя в среднем 0,03, схожая с таковой в популяциях Восточной и Центральной Европы. Данная мутация не обнаружена у северо-западных башкир (Илишевского района Башкортостана), а также у якутов. Частота мутации C282Y в популяциях Средней Азии составила 0,005, что на порядок ниже, чем в популяциях Волго-Уральского региона и Европы и выше, чем в популяциях Юго-Восточной Азии, где представлена с частотой 0,0032 (Cullen, 1998; Pointon, 2003) и у народов Сибири - 0,002 (Михайлова, 2003). Наибольшая частота мутации C282Y выявлена в популяциях финно-угорского происхождения (4%), сопоставимая с таковой в популяциях русских, чехов, австрийцев, французов, немцев, исландцев и нидерландцев, ниже, чем в популяциях Северной Европы. Все выявленные мутации C282Y являются случаями гетерозиготного носительства, в гомозиготном состоянии эта мутация в популяциях Центральной Евразии не обнаружена. Частота мутации C282Y варьировала от 0,9% у марийцев до 6,6% у удмуртов, демонстрируя неоднородность финно-угорской группы народов. Это подтверждается и проведенными ранее исследованиями финноугорских популяций Сибири (ханты, манси), у которых мутация C282Y не была выявлена (Михайлова, 2005). С меньшей частотой мутация C282Y встречалась в популяциях славянской и романской групп (2,5% и 2,1%, соответственно), сопоставимая с таковой в Южной Франции (Mercier, 1998), Гренландии (Merryweather-Clarke, 1999). В славянских популяциях Западной Европы наблюдается широкая вариация в частоте данной мутации - от 1,5% у сербов до 5% у чехов и не выявлена у болгар, что также свидетельствует о гетерогенности народов, принадлежащих к славянской языковой семье по исследуемому локусу.

Низкая частота мутации C282Y обнаружена у народов, принадлежащих к тюркской и иранской языковой группе (1,3% и 0,6%, соответственно). Такие

низкие частоты С282У мутации характерны для популяций Южной Европы и выше, чем в популяциях Юго-Восточной Азии и Сибири, соответствуя градиенту снижения частоты данной мутации с севера на юг и с запада на восток. Для определения распространенности мутации С282У в популяциях мира, с учетом полученных нами данных и доступных литературных данных, мы построили карту, демонстрирующую пространственное распределение частот гетерозиготного носительства мутации С282У на территории Евразии (рис. 1). Ареал распространения мутации С282У демонстрирует наибольшую частоту в Северной Европе с постепенным снижением градиента частоты с севера на юг и с запада на восток. Характер распространенности мутации С282У в изученных нами этнических группах соответствует их географическому расположению и вписывается в географический градиент снижения частоты с запада на восток, что дает основание предполагать, что она распространилась по миру в результате смешения с европейцами, мигрировавшими из Северной Европы.

0.16 0.13 0.1 -1 0.13 0.12 0.11 0.1 0.09 0.08 О 07 0.0(3 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 О

-20 О 20 40 60 SO 100 120 140 160 ISO

Рисунок 1. Распространенность мутации C282Y в гене HFE в популяциях мира

При анализе географической распространенности гемохроматоза по миру и частоты мутаций в гене HFE, очевидно, что мутация C282Y пришла из северной Европы, а ее недавний возраст больше согласуется с теорией викингов (Brissot, 2001). Выявлен общий европейский гаплотип, ассоциированный с данной мутацией в популяциях Юго-Восточной Азии (Cullen, 1998), что дает основание

предполагать, что она распространилась по миру в результате смешения с европейцами, мигрировавшими из Северной Европы.

Изучение распространенности H63D мутации в гене HFE. Проведенное нами исследование показало неравномерность распространенности мутации H63D в гене HFE в исследованных нами 20 популяциях Центральной Евразии, варьируя от 2,4% у таджиков до 27% у мордвы, демонстрируя выраженную этноспецифичность исследуемого генетического маркера. В популяциях Восточной Европы мутация H63D обнаружена с более высокой частотой, варьируя от 9,6% у молдаван до 20,8% у белорусов. Мутация H63D встречается в гомозиготном состоянии в популяциях карелов (1%), украинцев (2,1%) и белорусов (8,3%) и не обнаружена у молдаван. Частота гетерозиготного носительства мутации H63D - 19,2% для молдаван, 21% для карелов, 29,8% для украинцев и 41,6% для белорусов. В среднем для исследованных нами популяций Восточной Европы частота мутации H63D в гене HFE соответствует среднеевропейскому уровню. Частота H63D мутации в Волго-Уральском регионе колебалась от 0,08-0,089 в популяциях марийцев, коми и татар до 0,27 у мордвы. В популяциях удмуртов, мордвы, чувашей и башкир Илишевского района обнаружен гомозиготный генотип *63D/*63D с частотой 0,016; 0,098; 0,036 и 0,019 соответственно. По литературным данным, мугация H63D в гомозиготном состоянии встречается среди здоровых людей в европейских популяциях с частотой от 0,03 до 0,042 (Camaschella, 1997), у белых американцев частота этого генотипа - 0,016 - 0,02 (Marcela, 1999). Частота гетерозиготного носительства мутации H63D для всех популяций Волго-Уральского региона в среднем, составила 21,7%, что несколько ниже, чем в Европе (24,75%), но выше чем в Азии (3,6-16,8%). Выявлена неоднородность коренных народностей по распространенности этих мутаций. Мутация H63D обнаружена во всех изученных нами популяциях Средней Азии с частотой от 0,024 у таджиков до 0,139 у туркменов. В целом, в исследуемом регионе ее частота составила 0,074, что ниже, чем в Европе (0,25), где частота H63D мутации колеблется от 0,12 до 0,29 (Burke, 1998) и в популяциях Волго-Уральского региона (0,22), с вариациями частоты от 0,08 до 0,27 и обнаружена в гомозиготном состоянии в популяциях удмуртов, мордвы, чувашей и башкир. При этом частота данной мутации в популяциях Средней Азии выше, чем в популяциях Юго-Восточной Азии (0,035) (Pointon,

2003) и соответствует таковой в популяциях Сибири (0,074) (Михайлова, 2003). В гомозиготном состоянии мутация H63D выявлена только у туркменов, где частота генотипа *63D/*63D составила 5,6%, что, видимо, связано с тем, что выборка состоит из туркменов, проживающих на территории Узбекистана, имеющих ограниченную численность, что не исключает возможность инбридинга.

Анализ распространенности мутации H63D в гене HFE в зависимости от лингвистической принадлежности популяций показал, что наибольшая ее частота вьмвлена для славянской группы, состоящей из популяций русских, белорусов и украинцев - 0,172, что сопоставимо с таковой в большинстве стран Центральной Европы. В популяциях, принадлежащих к финно-угорской группе народов, также наблюдается высокая частота данной мутации, составляя 0,127, обнаруживая сходство с популяциями Северной Европы (Cardoso, 1998; Milman, 2005). В данной группе частота мутации варьирует от 0,08 у марийцев до 0,139 у удмуртов, за исключением популяции мордвы, где ее частота достигает 0,274, что может свидетельствовать о высокой распространенности заболеваний, связанных с перегрузкой железом у мордвы. У финно-угров Западной Сибири выявлена схожая картина распространенности мутации H63D, ее частота варьировала от 0,113 у хантов до 0,151 у манси и составила в среднем 0,13 (Михайлова С.В., 2003). У тюрко-язычных народов, представленных в нашем исследовании популяциями Волго-Уральского региона, Средней Азии, а также якутами, частота мутации H63D в гене HFE была ниже, чем у славянских и финно-угорских народов, составляя в среднем 0,098 и схожа с таковой у молдаван (0,096) - единственного представителя романской языковой семьи. Обнаружена широкая вариация в распространенности данной мутации в тюркоязычных популяциях Центральной Евразии, достигая двукратных различий - от 0,056 у узбеков до 0,119 у якутов. У тюрков Средней Азии наблюдается более низкая частота H63D мутации (0,077 в среднем) по сравнению с тюркскими популяциями Волго-Уральского региона (0,112 в среднем) и якутами (0,119). Интересен факт, что для тюркоязычных популяций Волго-Уральского региона характерна распространенность мутации I163D как для большинства европейских популяций, в то время как частота мутации C282Y в гене HFE значительно ниже, чем у европейцев. У тюрков Средней Азии частота мутации H63D схожа с таковой у алтайцев (0,085), тувинцев (0,05) и нивхов (0,047) и выше, чем у китайцев (0,028), японцев (0,01) и ряда

других восточноазиатских популяций. В популяциях таджиков и курдов, принадлежащих к иранской языковой семье, частота мутации НбЗЭ оказалась несколько ниже, демонстрируя сходство с популяциями Юго-Восточной Азии.

Пространственное распределение частот гетерозиготного носительства мутации НбЗО в гене Ш на территории Евразии, построенное на основании полученных в этом исследовании результатов и доступных литературных данных, представлено на рис. 2. Как видно из карты, нет четкого градиента снижения частоты мутации НбЗО с запада на восток, характерного для мутации С282У. Наблюдается несколько очагов накопления мутации, исключающее ее распространение из одного источника. С целью подтверждения этой гипотезы мы провели анализ внутригенных полиморфных локусов в гене НЕЕ для определения гаплотипов, сцепленных с мутацией и выявления происхождения мутации НбЗО.

0 2" 0.2

—О 18 . .. . |0.16 ..[О 14

..\0Л2

0 1

.. 0 08

0.06 0.04

..: 002

О

Рисунок 2. Распространенность мутации НбЗО в гене НРЕ в популяциях мира.

Анализ полиморфных вариантов 1У$2(+4)Т>С, 1У84(-44)Т>С, 1У8(-47)Л>С гена НЕЕ и их гаплотипов у носителей мутации НбЗО гена НЕЕ

Мутация НбЗО - более старая мутация, чем С282У, является более частой и распространенной, обнаружена почти во всех изученных популяциях мира и представлена большим разнообразием гаплотипов. Учитывая, что в изученных нами популяциях Центральной Евразии мутация НбЗП встречается с высокой частотой, мы провели анализ трех внутригенных интронных однонуклеотидных полиморфных локусов с.340+4Т>С (гб207 1303, 1У82(+4)Т>С), с.893-44Т>С,

ге 1800708, 1УБ4(-44)Т>С), С.1007-470А (га1572982, 1¥8(-47)А>С) гена НРЕ с целью определения происхождения мутации НбЗИ и возможных путей ее распространения на данной территории. Для исследования были отобраны 26 индивидов, гомозиготных по мутации Н63В и 50 человек с отсутствием данной мутации, соответствующих по полу, этнической принадлежности и возрасту обследуемой группе. Распределение частот аллелей и генотипов изученных диаллельных полиморфных локусов гена НРЕ в контрольной выборке индивидов с отсутствием мутации Н63В схожи с таковыми в европейских популяциях (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp) (табл.З).

Таблица 3

Распределение частот генотипов локусов с.340+4Т>С (г$2071303, 1У82(+4)Т>С), с.893-44Т>С, ге 1800708, ПЪ4(-44)Т>С), с. 1007-470А (ге 1572982, №(~47)А>СР)

Г енотип Полиморфные локусы

1У52(+4)Т>С 1У84(-44)Т>С 1У8(-47)А>С

Г енотипы Частоты Г енотипы Частоты Генотипы Частоты

Гомозиготы по мутации НбЗО *т*т 0 фу*-}' 1 *А*А 0

*т*с 0,731 *х*с 0 *А*в 0,269

*с* с 0,269 *С*С 0 *с*о 0,731

Без мутации НбЗИ 0,40 *гр*,р 0,640 *А*А 0,340

*т*с 0,480 0,280 *А*й 0,790

*с*с 0.120 *с*с 0,080 0,240

Проведенный нами анализ гаплотипов на основе изученных полиморфных вариантов гена НРЕ показал, что изученные локусы находятся в тесном неравновесии по сцеплению у индивидов, гомозиготных по мутации Н63В, и образуют единый гаплоблок протяженностью 3 килобазы (Р’=1) (рис. 3 А).

Рисунок 3. Анализ неравновесия по сцеплению полиморфных локусов 1У82(+4)Т>С, 1У84(-44)Т>С, 1У8(-47)А>0 гена НРЕ и их гаплотипов у гомозигот по мутации НбЗБ (А) и в контрольной группе (Б).

Обнаружено 3 гаплотипа, самым частым оказался гаплотип *СТА - 0,611, гаплотипы *ТТА и *TTG встречались с частотой 0,222 и 0,167, соответственно. В контрольной группе индивидов без носительства мутации H63D локусы IVS2(+4)1>C, IVS4(-44)T>C, IVS(-47)A>G образуют 7 гаплотипов, самым частым из них оказался гаплотип *TTG (0,348). Частота гаплотипа *СТА была статистически значимо выше у носителей мутации H63D по сравнению с группой сравнения, частота гаплотипа *TTG - достоверно выше у контроля (табл 4).

Таблица 4

Сравнительный анализ распределения частот гаплотипов на основе анализа локусов IVS2(+4)T>C, IVS4(-44)T>C, IVS(-47)A>G гена HFE между носителями

мутации H63D и контрольной группой

Г аплотипы H63D/H63D N/N X2 Р

СТА 0,611 0,216 21,665 3,2467Е-6

TTG 0,167 0,348 5,702 0,0169

ТТА 0,222 0,186 0,439 0,5074

TCG 0 0,106 6,692 0,0097

CCG 0 0,068 3,748 0,0529

ССА 0 0.048 2,154 0,1422

CTG 0 0,029 0,881 0,3479

В европейских популяциях мутация H63D сцеплена с гаплотипом *СТА, что свидетельствует о монофилетичности происхождения данной мутации в Европе (Beutler, 1997; Rochette, 1999; Aguilar-Martinez, 1999). Однако в Шри-Ланке мутация H63D оказалась ассоциирована с тремя другими гаплотипами (*TTG, *ТТА, *CTG) (Rochette, 1999). У вьетнамцев мутация H63D была сцеплена как с европейским гаплотипом *СТА, так и с другими гаплотипами (Pointon, 2003). Исследование жителей Южного Китая также выявило существование нескольких гаплотипов, ассоциированных с мутацией H63D, что свидетельствует о неоднократном мутационном событии (Cullen, 1998). Исследования жителей Новосибирска показали, что мутация H63D имеет общие корни с европейскими популяциями в данном регионе России (Михайлова, 2006).

В нашем исследовании у индивидов, гомозиготных по мутации H63D гена HFE, с высокой частотой выявлен европейский гаплотип *СТА, однако обнаружены и гаплотипы *TTG, *ТТА, сцепленные с исследуемой мутацией в Шри-Ланке, что свидетельствует о неоднократных мутационных событиях в изученных нами популяциях Центральной Европы. Мутация H63D, видимо, частично

распространилась из Западной Европы, а также возникала несколько раз в результате спонтанных мутаций на территории Центральной Евразии.

Учитывая обширность изучаемого нами региона, мы разделили выборку гомозигот по мутации Н63В в зависимости от географического расположения популяций. Проведен анализ сцепления, частот и спектра гаплотипов у белорусов, украинцев и карелов, представляющих популяции Восточной Европы, а также отдельно рассмотрели представителей Волго-Уральского региона. У носителей мутации Н63Б из популяций Восточной Европы локусы IV82(+4)Т>С, 1УЙ4(-44)1>С, 1У8(-47)А>0 оказались в неравновесии по сцеплению ДО’=1, ЬСЮ=1,91; г2=0,542) и образовали гаплоблок с тремя гаплотипами. Частым оказался европейский гаплотип *СТА (0,591), однако с достаточно высокой частотой выявлены гаплотипы *ГГС и *ТТА. У представителей Волго-Уральского региона, гомозиготных по мутации НбЗБ, также выявлено неравновесие по сцеплению локусов 1У82(+4)Т>С, 1У84(-44)Т>С, 1У8(-47)А>0 гена ШЕ (0’=1, 1.00=0,3 2; 1^=0,123) и три типа гаплотипов. Европейский гаплотип *СТА оказался самым частым (0,633), с достаточно высокой частотой выявлен гаплотип *ТТА (0.300), частота гаплотипа *ТШ оказалась низкой (0,067).

Среди представителей популяций Средней Азии выявлен всего один гомозиготный случай по мутации НбЗО у индивида туркменской этнической принадлежности. У него обнаружено сочетание генотипов *ТС/*ТТ/*ОА локусов 1У82(+4)Т>С, 1У84(-44)Т>С, 1У8(-47)А>0 гена НРЕ, что предполагает

существование нескольких гаплотипов, сцепленных с мутацией НбЗО. С большой долей вероятности можно предположить, что у представителей Средней Азии с мутацией НбЗО ассоциированы такие же три гаплотипа *СТА, *ГШ, *ТТА, сцепленные с мутацией Н63Б в Волго-Уральском регионе и в Восточной Европе.

Таким образом, исследование полиморфных локусов с.340+4Т>С (гэ2071303), с.893-44Т>С (ге1800708), С.1007-470А (гв1572982) в гене НЕЕ выявило сцепление мутации Н63Б с тремя гаплотипами *СТА, *ТТО, *ТТА, что свидетельствует о частичном распространении данный мутации в популяциях Центральной Евразии из Западной Европы, а также о возможном неоднократном возникновении мутации на исследуемой территории.

Изучение распространенности мутации 565С в гене НРЕ. Мутация Б65С обнаружена в популяции русских с частотой 0,011, у башкир - 0,004, у татар -

0,012, что сопоставимо с таковой в европейских популяциях. По литературным данным частота мутации в65С в популяциях европейского происхождения составляет 1,5-2% и не встречается в популяциях Азии и Африки (Мига, 1999). Анализ распространенности мутации Я65С в популяциях мира позволяют сделать предположение о монофилетичном происхождении данной мутации в популяциях Центральной Европы и ее распространении по миру с уменьшением градиента частоты с севера на юг и с запада на восток в результате этнокультурных контактов и миграции населения.

а

Рисунок 4. Распространенность мутации 865С в популяциях мира.

АНАЛИЗ МУТАЦИЙ С2Н2Г, Н631), 565С В ГЕНЕ НЕЕ И У250Х В ГЕНЕ Т/Я2 С МНОГОФАКТОРНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

В настоящее время в Республике Башкортостане гемохроматоз клинически не диагностируется, и отсутствуют данные по частоте заболевания в популяциях Волго-Уральского региона. Нами сформирована выборка больных циррозами печени (ЦП), сахарным диабетом 2 типа (СД2) и хронической сердечной недостаточностью (ХСН), представляющих 3 группы высокого риска развития НГХ, и проведено исследование мутаций С282У, НбЗО, 865С в гене НЕЕ и У250Х в гене ТУг2 с целью выявления случаев НГХ и определения роли изученных мутаций в развитии трех многофакторных заболеваний.

Мутантные аллели гена НЕЕ найдены у 24% больных циррозами печени (рис. 5). Мутация С282У, являющаяся причиной 65-90% первичного гемохроматоза 1

типа, обнаружена в гетерозиготном состоянии у 1 пациента 44 лет с циррозом печени смешанной этиологии (алиментарно-токсической+вирусной). С наибольшей частотой выявлена мутация НбЗЭ, которая встречалась у 16% пациентов, из них у

14 больных ЦП в гетерозиготном варианте и у одной пациентки 50 лет с первичным билиарным циррозом в гомозиготном состоянии. Среди гетерозиготных носителей мутаций НбЗО по три пациента с ЦП неясного генеза, с первичным билиарным циррозом, ЦП смешанной этиологии, вирусной этиологии и по одному пациенту с ЦП алкогольно-токсического генеза и с болезнью Бадда-Киари.

Рисунок 5. Частоты генотипов исследованных локусов у больных ЦП из РБ.

В зависимости от этиологии ЦП частота мутации НбЗО варьировала от 5,8% у больных ЦП вирусного генеза до 10,4% у пациентов с ЦП невирусной природы, достигая 1,8 кратных различий. У мужчин с циррозом печени мутация НбЗО встречается реже, чем у женщин, однако различия не достигают статистической значимости. В нашем исследовании частота мутаций гена НИЕ оказалась ниже, чем в исследовании Кулагиной Е.А. (2009), составляя 23% у больных ЦП вирусной и 25% невирусной этиологии, что, видимо, связано с существованием выраженных этнических различий в их популяционных частотах. Частота мутации С2827 гена НЕЕ у больных ЦП в целом оказались ниже, чем в контрольной группе, мутация НбЗВ у больных ЦП по своей частоте соответствовала среднепопуляционному уровню. Мутация БббС выявлена у 7% пациентов ЦП различного генеза (вирусной С, неясного генеза, смешанной этиологии и как исход аутоиммунного гепатита). У женщин, больных ЦП, данная мутация встречалась чаще (4,6%) по сравнению с мужчинами (2,2%). У одной больной 32 лет с циррозом печени смешанной этиологии выявлены мутации НбЗО и 5<55С в компаунд-гетерозиготном состоянии. Частота

мутации Y250X гена TJR2 у больных ЦП составила 5,5%, варьируя от 3,3% у мужчин до 7,4% у женщин. Данная мутация выявлена в гетерозиготном состоянии у 5% больных с поздним проявлением ЦП (средний возраст 59,4 года), при этом у женщин встречается чаще (7,4%), чем у мужчин (3,3%) вне зависимости от этиологии ЦП. У 3-х пациентов женского пола мутация Y250X обнаружена в гомозиготном состоянии. В контрольной группе здоровых индивидов данная мутация не выявлена.

Таким образом, проведенное нами изучение показало, что распространенные мутации C282Y (c.845G>A) и H63D (c,187C>G) в гене HFE не играют значимой роли, тогда как редкие мутации S65C (с.193А>Т) в гене HFE и Y250X (c.750C>G) в гене TJR2, возможно, являются генетическими факторами, участвующими в развитии ЦП в РБ.

Предполагается, что мутации в гене HFE могут играть этиологическую роль в развитии сердечной недостаточности или влиять на прогноз течения заболевания, однако данные противоречивы, что может быть обусловлено различиями в распространенности ССЗ, региональными и этническими особенностями изученных популяций (Waalen, 2002; Ellervik, 2007; Kohgo, 2008).

У больных ХСН из РБ частота мутации C282Y составила 0.03, варьируя от 0.024 у мужчин до 0.061 у женщин. При разделении выборки больных в зависимости от типа ремоделирования сердца, наблюдается повышение частоты данной мутации до 0,047 в группе больных с эксцентрической ГЛЖ по сравнению с больными с концентрической формой ГЛЖ, у которых частота мутации C282Y составила лишь 0,017. При этом исследуемая мутация чаще встречается как у мужчин, так и у женщин с эксцентрической формой ГЛЖ, чем у мужчин и женщин с концентрической ГЛЖ. Причем, наиболее отчетливо данная тенденция отмечается для женщин с эксцентрической формой ГЛЖ, однако различия не достигают статистической значимости, вероятно, из-за малочисленности выборок. Все выявленные мутации C282Y являются случаями гетерозиготного носительства, в гомозиготном состоянии эта мутация в выборке больных ХСН не обнаружена. В группе больных ХСН частота мутации C282Y соответствовала среднепопуляционной. При разделении группы больных в зависимости от типа ремоделирования сердца наблюдается тенденция повышения частоты исследуемой

мутации у больных с эксцентрической формой ГЛЖ (0,047) по сравнению с контрольной выборкой (0,029).

Мутация НбЗВ в гене ЖЕ выявлена в общей выборке больных ХСН с частотой 0,145, тогда как в контрольной выборке ее частота была ниже и составила 0,113, различия не достигают статистической значимости (^=2,104; р=0,073). Средний возраст носителей мутации 1163В составил 47,73±5.58 лет. При разделении общей выборки больных на группы в зависимости от формы ГЛЖ отмечается повышение частоты исследуемой мутации у больных с эксцентрической ГЛЖ до 0,167 по сравнению с группой больных с концентрической ГЛЖ, у которых частота мутации НбЗВ не превышает 0,129, однако, различия не достоверны. Среди больных, носителей мутации НбЗВ, 26,42% оказались с ИБС с развитием застойной сердечной недостаточности и 29,70% больных с дилатационной кардиомиопатией. Среди пациентов с концентрическим типом ремоделирования 27,08% больных гипертонической болезнью и 21,05% больных гипертрофической кардиомиопатией являлись носителями данной мутации. У мужчин наблюдается более высокая частота исследуемой мутации вне зависимости от типа ремоделирования сердца. У 2% больных ХСН мутация НбЗВ обнаружена в гомозиготном состоянии, тогда как в контрольной группе частота гомозигот по данной мутации составила всего 0,4%. Все случаи гомозигот по мутации НбЗВ выявлены только у мужчин как с экцентрической ГЛЖ (1,2%), так и с концентрической формой ГЛЖ (2,7%). Мужчины относились к возрастной группе от 32 до 50 лет, страдали длительно (более 10 лет) гипертонической болезнью 3 степени, у всех выявлена выраженная ГЛЖ. Один из этих пациентов в возрасте 32 лет умер от геморрагического инсульта и по результатам патологоанатомического исследования страдал тяжелой формой поражения поджелудочной железы. Второй пациент, гомозиготный по мутации НбЗВ, умер в возрасте 48 лет от развития острой коронарной недостаточности.

Мутация Б65С гена ИРЕ выявлена в общей выборке больных с частотой 0,005, что соответствует частоте данной мутации в контрольной выборке, варьируя от

0,003 у мужчин, больных ХСН, до 0,017 у женщин. По одному больному с концентрической и эксцентрической формами ГЛЖ оказались носителями мутации 865С.

Нами выявлены два случая компаунд гетерозигот по мутациям С282Ї и НвЗИ. Оба пациента мужского пола, с концентрической и эксцентрической формами ремоделирования миокарда. Первый пациент страдал дилатационной кардиомиопатией, умер в возрасте 35 лет от явлений застойной сердечной недостаточности, причем имел наследственную отягощенность по дилатационной кардномиопатии, мать умерла в возрасте 39 лет от ДКМП. Второй пациент более

15 лет страдал гипертонической болезнью, умер в возрасте 50 лет от острой коронарной недостаточности, при патологоанатомическом исследовании выявлена выраженная симметричная гипертрофия стенок ЛЖ (более 2.0см).

Рисунок 6. Частоты генотипов мутаций С282Г, Н63В и 565С в гене 1ШЕ у больных ХСН из РБ.

Таким образом, мутации С282У, НбЗО и 865С в гене НЕЕ обнаружены у 33,9% больных ХСН из РБ (рис. 6), у 37,65% мужчин и у 24,24% женщин. При этом частота трех исследованных мутаций достигает 43,53% у больных с экцентрической формой ГЛЖ по сравнению с больными с концентрическим типом ГЛЖ, у 28,81% которых выявлены мутации гена НЕЕ. Наблюдается повышение частоты мутаций как у женщин (50%), так и у мужчин с экцентрической ГЛЖ (43,59%). Достаточно высокая частота исследованных мутаций в гене НРБ у пациентов с ХСН из РБ позволяет предположить, что НЕЕ мутации могут быть вовлечены в процессы ремоделирования миокарда у больных ССЗ трудоспособного возраста.

Сахарный диабет является эндокринной патологией, очень часто связанной с гемохроматозом. Не у всех больных гемохроматозом развивается сахарный диабет, но высокая частота ассоциации побуждает изучить вопрос о роли мутаций в гене НЕЕ в развитии сахарного диабета в различных популяциях. Сахарный

вббСЛЧ

Н63Б/Н<

2%

НбЗЮЛЧ

25%

диабет типа 2 развивается примерно у 20-50% пациентов с гемохроматозом. (Меёегаи, 1985; Ба^юп, 1992; МосгикЫ, 2001). Однако исследования связи между С282У и НбЗБ мутациями в гене ЖЕ и диабетом спорны и не являются окончательными. Мутация С282У не обнаружена в исследованных нами выборках больных сахарным диабетом 2 типа из РБ. Частота мутации НбЗВ оказалась 0,136 обнаружена у 24 больных СД2 в гетерозиготном состоянии и у двух пациентов выявлена в гомозиготном варианте. Наблюдается вариация частоты мутации от 13% у женщин до 15% у мужчин, больных СД2. При этом, оба случая гомозигот по мутации НбЗО оказались у женщин, гетерозиготное носительство составило от

0,206 у женщин до 0,300 у мужчин. В контрольной группе частота мутации НбЗВ была незначительно ниже, чем у больных и составила 0,112.

Рисунок 7. Распределение частот генотипов мутаций С282У, НвЗИ и 565С в гене НРЕ у больных сахарным диабетом 2-го типа из РБ.

Случаев гомозиготного генотипа по мутации НбЗВ у контроля не обнаружено. Мутация 5<55С является более редкой, ее частота у больных СД2 составила 0,015, варьируя от 0,014 у женщин до 0,017 у мужчин. В контрольной группе мутация 865С выявлена с частотой 0,012, различия не достигают статистической значимости. Ассоциации мутаций С282У, НбЗО и Б65С в гене НЕЕ с развитием сахарного диабета 2 типа в РБ не обнаружено.

Таким образом, мутация С282У (с.8450>А) в гене гемохроматоза (НРЕ) не является генетическим фактором риска развития хронической сердечной недостаточности, сахарного диабета 2 типа и циррозов печени в РБ. Обнаружена возможная роль И63В (с.187С>0) мутации в гене НРЕ в процессах ремоделирования миокарда при развитии сердечной недостаточности у больных

Н63М\

в65С^

2.90%

Н<Ш)/П63Г>

' 1.90%

сердечно-сосудистой патологией и мутаций 565С (с.193Л>Т) в гене НРЕ и У250Хв гене 7УК2 в развитии циррозов печени у жителей РБ.

ВЫВОДЫ

1. Мутация С282У (с,8450>А) гена НРЕ выявлена в популяциях финноугорского происхождения с частотой 4%, в популяциях славянской и романской групп в 2,5% и 2,1%, у тюркских и иранских народов в 1,3% и 0,6% случаев, соответственно. Обнаружен градиент снижения частоты мутации с запада на восток и севера на юг, что дает основание предполагать о ее распространенности в популяциях Центральной Евразии из Западной Европы.

2. Обнаружена неравномерность распространенности мутации НбЗО (с.187С>0) в гене НРЕ в исследованных 20 популяциях Центральной Евразии и несколько очагов ее накопления. Наибольшая частота мутации выявлена у славянских (17,4%) и финно-угорских народов (12,7%), ниже в тюрко- (9,8%) и ираноязычных популяциях.

3. Исследование полиморфных вариантов с.340+4Т>С (гб2071303), с.893-44Т>С (ге1800708), С.1007-470Л (гз1572982) в гене НРЕ выявило сцепление мутации НбЗО с тремя гаплотипами *СТА, *ТТС, *ТТА, что свидетельствует о частичном распространении мутации НбЗО из Западной Европы и о возможном ее неоднократном возникновении на территории Центральной Евразии.

4. Частота мутации 865С (с.193А>Т) в гене ЯКЕ составила 1,23% у татар, 1,07% у русских и 0,36% у башкир и сопоставима с таковой в европейских популяциях.

5. Мутации С282У, НбЗО и 5(55С в гене НРЕ выявлены у 24% больных циррозами печени различной этиологии, 28,1% больных сахарным диабетом 2-го типа и у 33.9% больных хронической сердечной недостаточностью из РБ.

6. Мутация У250Х в гене Щ2 обнаружена у 5% больных циррозами печени в гетерозиготном и у 3% в гомозиготном состоянии, не выявлена у больных хронической сердечной недостаточностью и сахарным диабетом 2-го типа из РБ.

7. Обнаружена возможная роль НбЗО (с. 187С>0) мутации в гене НЕЕ в процессах ремоделирования миокарда при развитии сердечной недостаточности у больных сердечно-сосудистой патологией и мутации 565С (с.193А>Г) в гене НРЕ У250Хв гене Т/И2 в развитии циррозов печени у жителей РБ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хуснутдинова Н.Н., Хусайнова Р.И., Хуснутдинова Э.К. Анализ CYS282TYR и HIS63ASP мутаций в гене HFE в популяциях казахов и уйгуров // Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков. Медицинская генетика. 2005. № 6. С. 285.

2. Khusnutdinova N., Khusainova R., Cvyatova G., Khusnutdinova E. Screening for Cys282Tyr and His63Asp mutations of HFE gene in Kazakhs and Uygurs populations of the Central Asia // Abstracts of the European Human Genetics Conference. Prague. 2005. P. 229.

3. Khusainova R. I., Khusnutdinova N. N., Khusnutdinova E. K. Analysis of C282Y and H63D mutations of HFE gene in populations of Central Asia // Abstracts of European Human Genetics Conference. Amsterdam. 2006. European Journal of Human Genetics. V. 14. P. 339

4. Хусайнова Р.И., Хуснутдинова H.H., Хуснутдинова Э.К. Анализ C282Y и H63D мутаций в гене гемохроматоза (HFE) в популяциях Средней Азии // Генетика. 2006. Т. 42. № 3. С. 333-338.

5. Khusnutdinova N. N., Khusainova R. I., Khusnutdinova E. K. Study of HFE gene mutations distribution in populations of Central Eurasia // Abstracts of European Human Genetics Conference. Barselona. 2008. European Journal of Human Genetics. V. 16. P. 379.

6. Гусманова Г.Т., Хусайнова Р.И., Хуснутдинова H.H., Калимуллина Д.Х., Хуснутдинова Э.К. Поиск генетических факторов предрасположенности к развитию цирроза печени у больных из Республики Башкортостан // Медицинская генетика. 2011. Т.10. №8. С. 34-38.

7. Пушкарева А.Э., Хусайнова Р.И., Хуснутдинова Н.Н., Хуснутдинова Э.К.

Генотипы HFE у больных с хронической сердечной недостаточностью: клиникогенетические аспекты и прогноз // Сердечная недостаточность. 2011. 6. С. 356-

362.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ДКМП - дилатационная кардиомиопатия

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ГЛЖ - Гипертрофия левого желудочка сердца

ГХ - гемохроматоз

ЛЖ - левый желудочек сердца

НГХ - наследственный гемохроматоз

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

РБ - Республика Башкортостан

СД2 - сахарный диабет 2 типа

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания

ОТС - относительная толщина стенок

ХСН - хроническая сердечная недостаточность

ЦП - цирроз печени

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Подписано в печать 23.01.12 г. Формат 60x84 1/16.

Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 602. Гарнитура «ТітезКеууІІотап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО.

Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хуснутдинова, Наталья Николаевна, Уфа

61 12-3/560

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН

Хуснутдинова Наталья Николаевна

ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ ГЕМОХРОМАТОЗА И РЕЦЕПТОРА ТРАНСФЕРРИНА 2 В ПОПУЛЯЦИЯХ ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЕВРАЗИИ И У БОЛЬНЫХ МНОГОФАКТОРНЫМИ

ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

д.б.н., профессор Э.К. Хуснутдинова

Уфа-2012

На правах рукописи УДК 575.18:616.697

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

1.1. История изучения и этиология наследственного гемохроматоза.............10

1.2. Гомеостаз железа...................................... ......................................................12

1.3. Патогенез и патоморфология наследственного гемохроматоза...............17

1.4. Диагностика наследственного гемохроматоза......................................20

1.5. Генетические основы наследственного гемохроматоза............ .................23

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................43

2.1. Материалы исследования..............................................................................43

2.2. Методы исследования................................... .................................................46

2.2.1. Выделение геномной ДНК.........................................................................46

2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК...........................................47

2.2.3. Рестрикционный анализ................................ ..............................................47

2.2.4. Метод электрофореза..................................................................................49

2.3. Статистическая обработка полученных результатов............. ....................49

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................51

3.1. Анализ мутаций в гене гемохроматоза {НЕЕ) в популяциях Центральной Евразии...................................................................................................................51

3.1.1. Изучение С282Г мутации в гене гемохроматоза {НЕЕ) в популяциях Восточной Европы................................................................................................52

3.1.2. Изучение С282Г мутации в гене гемохроматоза {НЕЕ) в популяциях Волго-Уральского региона и в Республике Саха (Якутия)..............................53

3.1.3. Изучение С282У мутации в гене гемохроматоза {НЕЕ) в популяциях Средней Азии.........................................................................................................56

3.1.4. Распространенность мутации С282У в гене НЕЕ в популяциях Центральной Евразии...........................................................................................60

3.1.5. Изучение НбЗй мутации в гене гемохроматоза (НЕЕ) в популяциях Восточной Европы................................................................................................64

3.1.6. Изучение мутации Н63В в гене гемохроматоза {НЕЕ) в популяциях

Волго-Уральского региона и в Республике Саха (Якутия)..............................66

2

3.1.7. Анализ Н63Б мутаций в гене гемохроматоза {НЕЕ) в популяциях Средней Азии.........................................................................................................69

3.1.8. Распространенность мутации НбЗО в гене НЕЕ в популяциях Центральной Евразии...........................................................................................71

3.1.9. Анализ полиморфных вариантов с.340+4Т>С, с.893-44Т>С, с.1007-470>А гена НЕЕ их гаплотипов..........................................................................74

3.1.10. Изучение распространенности мутации Б65С в гене гемохроматоза

(НЕЕ) в популяциях Волго-Уральского региона..............................................82

3.2. Исследование мутаций С282ГиНбЗО в гене НЕЕ и ¥25 ОХ в гене ТЩ в

группах риска развития гемохроматоза..............................................................85

3.2.1. Анализ мутаций С282У, НбЗО, 865С в гене гемохроматоза (НЕЕ) и

У250Хв гене рецептора трансферрина (Т/г2) у больных циррозами печени.. 85

3.2.2. Исследование мутаций в генах НЕЕ и Т/Л2, ассоциированных с гемохроматозом, у больных с хронической сердечной недостаточностью.... 92

3.2.3. Исследование мутаций С282У, НбЗИ, Б65С в гене гемохроматоза (НЕЕ) и У250Х в гене рецептора трансферрина (Т/г2) у больных сахарным диабетом

2 типа....................................................................................................................101

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................107

ВЫВОДЫ.............................................................................................................118

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................................120

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ДКМП - дилатационная кардиомиопатия

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ГЛЖ - Гипертрофия левого желудочка сердца

ГХ - гемохроматоз

ЛЖ - левый желудочек сердца

НГХ - наследственный гемохроматоз

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

РБ - Республика Башкортостан

СД2 - сахарный диабет 2 типа

ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания

ОТС - относительная толщина стенок

ХСН - хроническая сердечная недостаточность

ЦП - цирроз печени

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ВВЕДЕНИЕ

Наследственный гемохроматоз (НГХ) является одним из частых

заболеваний обмена веществ, встречается с частотой 3-8 случаев на 1000

человек в европейских популяциях [Balan, 1994; Ваег, 1995; Beutler, 2002;

Delatycki, 2005; Bacon, 2011]. Патогенетической характеристикой НГХ

является увеличение абсорбции железа, приводящее к прогрессирующему

накоплению его в различных органах и развитию цирроза печени, диабета,

кардиомиопатий, артрозов и эндокринных нарушений [Pietrangelo, 2004;

Adams, 2007; Olynyk, 2008; Andrews, 2008]. Для НГХ характерна высокая

генетическая гетерогенность с различным уровнем пенетрантности [European

Association For The Study Of The Liver, 2010]. Существуют несколько форм

НГХ, ассоциированных с различными генами и типами наследования. Самая

распространенная форма НГХ (более 95% всех случаев) - тип 1, вызываемая

дефектами в гене HFE [Simon, 1996]. Продукт гена HFE - трансмембранный

гликопротеин HFE, который является регулятором поглощения железа

[Parkkila, 1997; Feder, 1998; Lebron, 1998]. В настоящее время в гене НЕЕ

выявлено 11 мутаций, сцепленных с заболеванием. В 60-96% случаев НГХ

больные европеоидного происхождения являются гомозиготами по мутации

C282Y и 5% - компаунд-гетерозиготами по мутациям C282Y, H63D и S65C

гена НЕЕ [Beutler, 1996; Bacon. 1999; Pietrangelo, 2010]. Роль мутаций H63D

и S65C гена HFE в развитии нарушений метаболизма железа недостаточно

изучена, результаты многочисленных исследований противоречивы [Mura,

1999; Gochee, 2002; Samarasena, 2006]. Индивиды, носители мутаций H63D и

S65C гена НЕЕ, имеют повышенную вероятность развития «мягкой» формы

гемохроматоза, фенотипические проявления которой, судя по всему, зависят

от влияния факторов внешней среды и каких-либо дополнительных

генетических модифицирующих факторов [Waheed, 1997; Bonkovsky, 2002].

Вследствие гетерозиготных мутаций в гене гемохроматоза (HFE) небольшие

количества железа могут аккумулироваться, способствуя увеличению

тяжести или прогрессированию «негемохроматозных» заболеваний [Ellervik,

5

2007; Sikorska, 2011; Ishizu, 2011]. Существуют выраженные этнические различия в распространенности мутаций C282Y, H63D и S65C гена HFE в популяциях мира, наиболее часто встречающихся в европейских популяциях, реже - у народов Юго-Восточной Азии и очень редко - в популяциях Африки, Центральной и Южной Америки [Beckman, 1999; Chandok, 2011]. Известно существование нескольких форм НГХ, не связанных с мутациями в гене HFE, а развивающихся из-за повреждения других генов белков, участвующих в обмене железа, таких как ферропортин-1, трансферриновый рецептор 2 и гепсидин [Roetto, 1999; Camaschella, 2000; Mattman, 2000; Donovan, 2000; Kato, 2001]. Одновременно, поскольку железо играет важную роль в функционировании клетки, изменения в содержании железа могут играть патофизиологическую роль в развитии не только НГХ, но и ряда многофакторных заболеваний. [Kohgo, 2008]. Объяснение генетических основ НГХ вызвало новый интерес ко всем аспектам этого заболевания. Несмотря на значительный прогресс в понимании регуляции метаболизма железа и молекулярных основ различных форм НГХ, остается открытым ряд ключевых вопросов, касающихся распространенности и происхождения мутаций в генах, ответственных за развитие заболевания.

В настоящее время в Волго-Уральском регионе и Средней Азии гемохроматоз клинически не диагностируется, во многих популяциях Восточной Европы данные, как по распространенности заболевания, так и по частоте гетерозиготного носительства мутаций в ответственных генах отсутствуют. В связи с этим является актуальным изучение распространенности наиболее частых мутаций в гене HFE, оценка их гетерозиготного носительства в различных популяциях Евразии, а также функциональной значимости мутаций в генах НГХ, в развитии широко распространенных социально значимых заболеваний человека.

Целью исследования является оценка распространенности мутаций в

генах гемохроматоза (НЕЕ) и рецептора трансферрина 2 (TJR2),

6

ассоциированных с наследственным гемохроматозом, в различных популяциях Центральной Евразии и их вклада в развитие ряда многофакторных заболеваний.

Задачи исследования:

1. Оценить распространенность мутаций С282У (с.845С>А, ге 1800562) и НбЗО (с.187С>в, ^1799945) в гене НЕЕ в популяциях Центральной Евразии.

2. Провести генотипирование полиморфных локусов с.340+4Т>С (Г82071303, Ш2(+4)Т>С), с.893-44Т>С (Ъ1800708, Ш4(-44)Т>С), с. 1007-4Ю>А (гб 1572982, Ш5(-47)А>С) в гене НРЕ и анализ их гаплотипов у индивидов, гомозиготных по мутации НбЗО в гене НЕЕ.

3. Провести анализ распространенности мутации 865С (с.193А>Т, ге 1800730) в гене НЕЕ в популяциях Волго-Уральского региона.

4. Определить частоту мутаций С282Г (С.8450А, ге 1800562), НбЗО (с.187С>0, гб1799945), ЖС (с.193А>Т, гб 1800730) в гене гемохроматоза {НЕЕ) и У250Х(с. 750С>С) в гене рецептора трансферрина 2 (Т/Я2) у больных сахарным диабетом 2 типа, хронической сердечной недостаточностью и циррозами печени.

5. Оценить значимость мутаций в генах НЕЕ и Т/Я2 в развитии изученных многофакторных заболеваний.

Научная новизна исследования. Впервые получены сведения о

распространенности мутаций С282У, НбЗО в гене НЕЕ в популяциях

Центральной Евразии и мутаций Б65С в гене НЕЕ и У250Х в гене Т/Я2 в

Волго-Уральском регионе России. Выявлено три гаплотипа, сцепленных с

мутацией НбЗО, на основе исследования полиморфных вариантов

с.340+4Т>С (гз2071303), с.893-44Т>С ^1800708), с. 1007-470А (гб1572982)

гена НЕЕ, что свидетельствует о неоднократном возникновении данной

мутации на территории Центральной Евразии. Проведена оценка значимости

7

мутаций С282У, НбЗО, 865С в гене НЕЕ и У250Х в гене Т/И2 в развитии сахарного диабета 2 типа, цирроза печени и различных типов ремоделирования сердца при хронической сердечной недостаточности в РБ с учетом этнической принадлежности больных.

Научно-практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить имеющиеся знания о распространенности мутаций в гене НЕЕ в популяциях Волго-Уральского региона, Центральной Азии и Восточной Европы, а также проливают свет на происхождение мутации НбЗО гена НЕЕ в Центральной Евразии. Результаты исследования могут быть внедрены в практику медицинских учреждений и использованы для проведения медико-генетического консультирования. Материалы диссертации могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских учебных заведениях и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту:

1. Частота мутации С282У (с.8450>А) гена НЕЕ в популяциях финно-угорского происхождения - 4%, в популяциях славянской и романской групп - 2,5% и 2,1%, у тюркских и иранских народов - 1,3% и 0,6%, соответственно. Градиент снижения частоты мутации с запада на восток и севера на юг дает основание предполагать о ее распространенности в популяциях Центральной Евразии из Западной Европы.

2. Неравномерность распространенности мутации Н63В (с. 187С>С) в гене НЕЕ в исследованных 20 популяциях Центральной Евразии и несколько очагов ее накопления. Наибольшая частота мутации - у славянских (17,4%) и финно-угорских народов (12,7%), ниже в тюрко- (9,8%) и ираноязычных популяциях.

3. Сцепление мутации Н63В с тремя гаплотипами *СТА, *ТТО, *ТТА

полиморфных вариантов с.340+4Т>С (гз2071303), с.893-44Т>С (ге 1800708),

8

с.1007-47С>А (ГЭ1572982) в гене НЕЕ, свидетельствующее о частичном распространении мутации НбЗО из Западной Европы и о возможном ее неоднократном возникновении на территории Центральной Евразии.

4. Мутация Б65С (с.193А>Т) в гене НЕЕ обнаружена с частотой 1,23% у татар, 1,07% у русских и 0,36% у башкир, частота схожа с таковой в европейских популяциях.

5. У 24% больных циррозами печени различной этиологии, 28,1% больных сахарным диабетом 2-го типа и у 33.9% больных хронической сердечной недостаточностью из РБ выявлены мутации С282У, НбЗО и 865С в гене НЕЕ.

6. У 5% больных циррозами печени выявлена мутация У250Х в гене Т/Я2 в гетерозиготном и у 3% в гомозиготном состоянии, не обнаружена у больных хронической сердечной недостаточностью и сахарным диабетом 2-го типа из РБ.

7. Роль НбЗО (с.187С>С) мутации в гене НЕЕ в процессах ремоделирования миокарда при развитии сердечной недостаточности у больных сердечно-сосудистой патологией и мутации 865С (с. 193А >Т) в гене НЕЕ, ¥25ОХ в гене Т{Я2 в развитии циррозов печени у жителей РБ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. История изучения и этиология наследственного гемохроматоза

Наследственный гемохроматоз (НГХ) объединяет группу заболеваний, которые могут привести к прогрессирующим перегрузкам железом и приводить к циррозам печени, первичному раку печени, сахарному диабету, гипогонадотропному гипогонадизму, заболеваниям суставов, и кардиомиопатиям [European Association For The Study Of The Liver, 2010].

В медицинской практике НГХ до 1960 года обнаруживался редко. А.Мс Donald и S.S.Mallory описали лишь 1100 случаев, a D.Finch указывает о частоте заболевания 1:20000 и 1:7000 смертельных исходов в Калифорнии. Однако, за последние годы показатель частоты данного заболевания значительно увеличился и является одним из самых высоких для наследственных заболеваний (3-8:1000 населения) у лиц европеоидного происхождения. НГХ поражает значительно чаще мужчин, чем женщин. Объясняется это, скорее всего, физиологической потерей крови у женщин [Beutler, 1996; Bacon. 1999; Pietrangelo, 2010].

Взаимосвязь между перегрузкой железом и циррозом печени впервые постулировал Труссо в 1865 году [Glycosurie ТА, 1865].

Термин "гемохроматоз" был введен в медицинскую литературу немецким патологоанатомом Даниэлем Фридрихом фон Реклингхаузеном в 1889 году, который впервые документировал связь между гемохроматозом и перегрузкой железом [Von Recklinghausen, 1935]. НГХ стали рассматривать как уникальный клинический фенотип, когда Иосиф Шелдон подробно описал клинико-фенотипические аспекты 311 случаев заболевания. Он заключил, что НГХ является редким заболеванием, поражающим одного из 2000-5000 пациентов и предположил, что заболевание возникает из-за врожденной ошибки метаболизма и наследуется по рецессивному типу. Пациенты жили не более 2 лет с момента постановки диагноза и умирали от осложнений, вызванных инфекциями или диабетом до изобретения инсулина [Sheldon, 1935].

Клинические наблюдения и исследования метаболизма железа внесли свой вклад в понимание заболевания. В 1937 году были идентифицированы первые белки, участвующие в метаболизме железа [Laufberger, 1937]. Когда Шейла Шерлок впервые провела биопсию печени в 1945 году, этот метод стал применяться для быстрой диагностики гемохроматоза [Sherlock, 1945; Davis, 1950]. После этого, Дэвис и Эрроусмит представили лечение, которое сохраняет свою актуальность и по сей день, опубликовав результаты своих опытов по кровопусканию в трех случаях гемохроматоза [Davis, 1952].

В 1955 году, Finch S.C. и Finch С.А. представили всеобъемлющий обзор по гемохроматозу и выдвинули концепцию "болезни накопления железа", основанное на нарушении усвоения железа из пищи или из-за переливания крови, вызывая полиорганное повреждение тканей. Изменения индексов железа плазмы крови являются универсальными симптомами пациентов и признаны ранними фенотипическими аномалиями. Две трети клинических случаев заболевания были диагностированы в среднем возрасте. Несмотря на гепатомегалию и фиброз, у половины пациентов наблюдаются минимальные нарушения биохимических показателей. Риск развития рака печени был увеличен у пожилых пациентов. Пигментация кожи, сахарный диабет и нарушения сердечной деятельности являются самыми частыми непеченочными нарушениями при гемохроматозе [Finch S., Finch С., 1955].

Гемохроматоз был окончательно идентифицирован как наследственное аутосомно-рецессивное HLA-связанное заболевание в 1975 году [Simon, 1975]. После этого популяционные исследования, оценка FELA, а также тщательный скрининг семей способствовали увеличению числа случаев обнаружения от 0,3% до 1,2% в европейских популяциях [Leggett, 1990]. Почти у всех пациентов с циррозом выявляется слабость, вялость, потеря либидо. Также были распространены сердечные и эндокринные осложнения [Niederau, 1985]. Niederau с соавт. сообщили об избыточной смертности от рака печени, диабета, кардиомиопатии, цирроза печени. Тем не менее, при

отсутствии диабета и цирроза печени, смертность среди больных гемохроматозом была на уровне среднепопуляционного [Niederau, 1996].

Важная веха была достигнута в 1996 году, когда был идентифицирован кандидатный ген НГХ на хромосоме 6, названный HFE [Feder, 1996]. Две частые мутации были обнаружены в гене HFE: во-первых, тирозин был заменен на цистеин в 282 положении аминокислоты (C282Y), во-вторых, аспартат был заменен на гистидин в