Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая и биохимическая характеристики наследственного гемохроматоза 1 типа у детей

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая и биохимическая характеристики наследственного гемохроматоза 1 типа у детей"

На правах рукописи

АВЕРЬЯНОВА НАТАЛЬЯ СЕРГЕЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННОГО ГЕМОХРОМАТОЗА 1 ТИПА

У ДЕТЕЙ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 ЛЕН 7010

Москва - 2010

004616239

Работа выполнена на базе лаборатории мембранологии с группой генетических исследований научно-исследовательского института Педиатрии Учреждения Российской академии медицинских наук Научного центра здоровья детей Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Спицын Виктор Алексеевич

Доктор медицинских наук, профессор Журков Вячеслав Серафимович

Асанов Алий Юрьевич Пинслис Всеволод Григорьевич

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

о о

Защита состоится « _2010г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 212.203.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.

Автореферат разослан " 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

О.Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Синдром перегрузки железом (СПЖ) в детском возрасте является угрожающим состоянием и приводит к поражению различных органов и систем. Известно, что СПЖ может иметь как первичный, так и вторичный характер. Среди причин первичной перегрузки железом большой удельный вес занимают наследственные нарушения обмена железа - наследственные гемохроматозы. Известно 5 типов наследственных гемохроматозов, обусловленных мутациями в разных генах: H FE, гепсидина (HAKÍP), гемоювелина (JIJV), траисферринового рецептора 2 типа (T/R2), ферропортина (McKusick V.A., OMIM, 2005). Наиболее распространенным является наследственный гемохроматоз 1 типа (НГХ 1 типа), обусловленный мутациями в гене HFE. Заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Частота НГХ 1 типа в Европейской цопуляции составляет от 3 до 8 на 1000 населения, а частота гетерозиготного носительства достигает 10 % (Merryweather-Clarke А.Т. et al, 2000). В России частота данного заболевания приближается к европейской (Баев А.А., 2006; Михайлова C.B. с соавт.; 2006, Литвинова М.М., 2009). Избыточное накопление железа в организме сопровождается развитием цирроза печени, сахарного диабета, кардиомиопатии, нарушением выработки гормонов гипофизом и др. Риск развития гспатцеллюлярной карциномы в 200 раз выше у больных с НГХ 1 типа, чем в среднем в популяции (Шерлок Ш., 1999). Накопление железа в органах и тканях при НГХ начинается с рождения и идет постепенно. Клиническая манифестация НГХ 1 типа чаще наступает после 40 лет, когда избыток железа достигает критического уровня и патологические изменения в организме приобретают необратимый характер (Краснопольская К.Д., 2005). Несмотря на этот общеизвестный факт, у пациентов детского возраста выявляют изменения биохимических параметров обмена железа, а в ряде случаев и неспецифические клинические симптомы (Полякова С.И. с соавт., 2004). Высказывается предположение, что гетерозиготное носительство мутаций, приводящих к НГХ 1 типа, может способствовать нарушению обмена железа при ряде сопутствующих соматических заболеваний (Баев А. А. 2005, Merryweather-Clarke А.Т. et al, 2003; Кулагина Е.А., 2006).

В литературе встречаются единичные работы, посвященные диагностике НГХ 1 тала у российских детей (Красилышкова М.В., 1999; Аскерова Т.А., 2001; Козырева Н.В., 2008). До настоящего времени молекулярно-генетических исследований НГХ 1

типа у российских пациентов детского возраста практически не проводилось. Характер изменения биохимических показателей обмена железа у детей с мутациями в гене НРЕ не изучался. Группы риска развития НГХ 1 типа среди российских детей не определены.

Таким образом, актуальным является разработка критериев дифференциальной диагностики первичного и вторичного СПЖ у детей на основе биохимических показателей обмена железа и молекулярно-генетических исследований. Выявление групп риска развития НГХ 1 типа и разработка алгоритма обследования детей с СПЖ позволит проводить раннюю диагностику НГХ 1 типа и профилактику тяжелого течения и неблагоприятного исхода заболевания. Цель исследования

Изучение молекулярно-генетических и биохимических особенностей проявления наследственного гемохроматоза 1 типа у детей с СПЖ. Задачи исследования

Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. Сформировать репрезентативную выборку пациентов с признаками СПЖ для проведения молекулярио-генетического анализа гена НРЕ.

2. Получить данные о спектре мутаций гена НРЕ и их частоте, а также проанализировать связь генотипа с биохимическими показателями обмена железа и клиническими особенностями у детей изучаемой выборки.

3. Провести полное секвенирование гена НЕЕ у детей с наиболее выраженными биохимическими и клиническими признаками СПЖ и отсутствием гомозиготного генотипа по частым мутациям гена НЕЕ с целью поиска редких мутаций изучаемого гена, а также полное секвенирование генов ШУ и НАМР с целью исключения ювенильного гемохроматоза (типы 2А и 2В) у детей с ярко выраженной клинической картиной и исключенным НГХ 1 типа.

4. У всех детей с биохимической картиной перегрузки железом и в контрольной группе оценить частоту мутации У250Х гена трансферриновсго рецептора 2 Тг/2, вызывающей наследственный гемохроматоз 3 типа.

5. Разработать практические рекомендации по применению молекулярно-генетических исследований НГХ 1 типа у детей из групп риска и протокол молекулярно-генетического обследования на НГХ.

Научная новизна работы

Впервые определены частоты мутаций С282У, Н630 и 865С гена НЕЕ в выборке российских детей с соматическими заболеваниями и биохимическими признаками СЛЖ.

Впервые показано, что в группе детей с различными соматическими заболеваниями (преимущественно с поражением печени и ЖКТ), сопровождающимися биохимическими признаками СПЖ, частота мутации НбЗЭ достоверно более высокая, чем у детей контрольной группы.

Впервые проведено сопоставление биохимических и некоторых клинических признаков НГХ 1 типа у детей с различными генотипами по мутациям в гене ЯРЕ. Показана прямая зависимость средних значений биохимических показателей обмена железа от числа мутантных аллелей Н6311 Доказано, что превышение нормальных значений степени насыщения трансферрина железом (СНТЖ) может служить показанием для направления детей на молекулярно-генетическую диагностику НГХ 1 типа.

Практическая значимость работы

Доказана необходимость молекулярно-генетической диагностики НГХ 1 типа у детей с признаками СПЖ и различными соматическими заболеваниями (преимущественно печени и ЖКТ). Это позволит контролировать избыточное накопление железа в организме и своевременно проводить специфическую профилактику осложнений, и тем самым повысить качество жизни пациентов.

Разработан протокол молекулярно-генетического обследования детей с СПЖ, который может использоваться при дифференциальной диагностике, медико-генетическом консультировании, в научно-образовательной деятельности.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У пациентов детского возраста НГХ 1 типа, обусловленный мутациями в гене ЯF£, может проявляться изменением биохимических показателей обмена железа, а в ряде случаев поражением печени, эндокринной системы, сердца, что является достаточными критериями для направления детей на молекулярно-генетическое обследование.

2. Гомозиготный генотип по мутации Н63Б или компаунд-гетерозиготные генотипы Н63Б/С282У или Н630/565С являются наиболее частой причиной НГХ 1 типа у детей исследованной выборки.

3. Значительное превышение доли детей с гетерозиготным генотипом по мутации H63D в выборке детей с БППЖ по сравнению с контрольной группой свидетельствует об этиологической значимости данной мутации в развитии СПЖ у российских детей с соматическими заболеваниями.

4. Статистически достоверных различий в частоте мутантного аллеля C282Y в выборке детей с СПЖ по сравнению с группой детей с нормальными показателями обмена железа и общепопуляционной частотой не обнаружено.

5. Определены частоты гетерозигот по мутации S65C гена HFE в исследуемых выборках.

Внедрение результатов работы в клиническую практику

Результаты работы внедрены в клиническую практику отделений НЦЗД РАМН, используются при медико-генетическом консультировании пациентов НЦЗД РАМН и в учебном процессе студентов кафедры медицинской генетики Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Апробация и публикации

Материалы диссертации представлены на Съезде Генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 21-28 июня 2009 г., Москва (стендовый доклад); на VI Съезде Российского Общества Медицинских генетиков в рамках научной конференции «Молекулярные основы наследственной патологии», 14-18 мая 2010 г., Ростов-на-Дону (устный доклад); на научных конференциях лаборатории мембранологии с группой генетических исследований НЦЗД РАМН. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка и приложений. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 38 таблицами. Библиографический список литературы включает 157 источников, из них 118 зарубежных.

Материал исследования

В исследование было включено 133 ребенка, находившихся на стационарном лечении в различных отделениях НЦЗД РАМН в период с 2005 по 2009 год. Из них 80

мальчиков и 53 девочки. Средний возраст детей составил 13,6 ± 3,1 лет (от 3 до 18 лет). Для оценки клинико-биохимических и молекулярно-генетических особенностей проявления наследственного гемохроматоза у российских детей были сформированы три фуппы пациентов. Группа пациентов с биохимическими признаками перегрузки железом (БПТТЖ) составила 63 ребенка, у которых концентрация железа в сыворотке была выше 23,6 мкмоль/л (35,9±1,2 мкмоль/л), а значения СНТЖ более 40,0% (51,2±1,9%). Среди детей группы БППЖ были также дети, имеющие кроме биохимических, неспецифические клинические признаки перегрузки железом: гиперпигментацию, гепатомегалию, признаки патологии печени по данным УЗИ (диффузные изменения паренхимы, фиброз, цирроз), хронические гепатиты различной этиологии, гипербшшрубинемию, кардиомиопатшо, нарушения ритма сердца, нарушения функции эндокринных желез, утомляемость, головные боли.

В контрольную группу были включены 49 пациентов, у которых концентрация железа в сыворотке не превышала 23,6 мкмоль/л и значения СНТЖ были не более 40%, т. е. не превышали нормальных значений, принятых в лаборатории биохимии НЦЗД РАМН, а также не имеющих патологии печени, сердца и эндокринных желез.

В группу с наследственными заболеваниями (НЗ), протекающими преимущественно с поражением печени, вошел 21 пациент с диагнозами - болезнь Вильсона-Коновалова, гликогеновая болезнь III типа, болезнь Гоше и др. Биохимические параметры обмена железа у этих детей варьировали от нормальных до превышающих референтные значения.

Дети, в анамнезе которых отмечались гемотрансфузии или систематический прием препаратов железа, не были включены в исследование

У всех детей были исследованы основные показатели обмена железа, а также состояние ЖКТ, печени, сердца, щитовидной железы. Все дети были генотипированы по трем частым мутациям в гене HFE (C282Y, H63D и S65C) и по мутации Y250X гена Trft. У детей с выраженными клиническими признаками НГХ, но не имеющих частых мутаций в гене HFE были исследованы гены HFE, HJV, НАМР методом секвенирования.

Методы исследования

Биохимические методы исследования. Концентрация железа в сыворотке крови (Fe сыв) и общая железоснязывающая способность (ОЖСС) определялись с помощью наборов IRON/TIBS BECKMAN (США) и набора калибраторов SYNCHRON Systems

IRON/TIBC Calibrator Kit на аппарате SYNCHRON CX-4-Pro System. Уровень ферритина (Фр) в сыворотке крови определяли иммунотурбидиметрическим методом при длине волны 700 нм на аппарате Synchron. Использовали реактивы Randox (Великобритания). Содержание трансферрина (Тф) в сыворотке крови определялось иммунотурбидиметрическим методом на спектрофотометре при длине волны 340 нм, с использованием реактива Sentinel СН, Италия на аппарате Synchron.

Степень насыщения трансферрина железом (СНТЖ) рассчитывали по формуле: СНТЖ = Fe сыв (мкмоль/л) / ОЖСС (мкмоль/л) * 100%.

Все вышеуказанные параметры обмена железа определялись в лаборатории клинической биохимии НЦЗД РАМН. Значения всех параметров обмена железа у пациентов сопоставляли с референтной базой, представленной в таблице 1.

Молекулярно-генетические методы. Для выделения геномной ДНК из лейкоцитов венозной крови использовали набор реактивов «Wizard Genomic DNA Purification Kit» фирмы «Promega» (США) в соответствии с протоколом производителя.

Таблица 1

Референтные диапазоны показателей обмена железа у детей *

Показатели обмена железа Fe сыв. мкмоль/л ОЖСС мкмоль/л СНТЖ % Тф сыв. г/дл. Фр сыв. мг/дл

Референтные диапазоны 9,3 - 23,6 45,0-81,0 20,0-40,0 200,0-360,0 1-5 лег 10-60 5 -Юлет 10-140 10-18 10-300

* Приняты в лаборатории клинической биохимии НЦЗД РАМН.

Для определения мутаций C282Y и H63D гена HFE использовали метод аллельспецифичной ПЦР с праймерами, опубликованными ранее (Potekhina Е. S. et all, 2005), и некоторыми модификациями (таб. 2). Для детекции мутации S65C гена HFE были разработаны праймеры и тест-система с использованием метода анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (рестриктаза Hinfl («Fermentas»). Генотип по мутации Y250X гена трансферринового рецептора 2 Trf2 также определяли методом рестрикционного анализа (рестриктаза FspBl («Fermentas»). Последовательности праймеров любезно предоставлены лабораторией молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики человека

Уфимского научного центра РАМН, возглавляемой профессором Хуснутдиновой Э.К. (таб. 2).

Таблица 2

Последовательности праймеров для выявления мутаций в генах HFE и Тг/2

№ Мутация Наимено- Сиквепс (5' - 3') Длина

№ вание продукта

пп праймера (п.н.)

Ген

1 F-C282Y TTG AAC CTG GGA AG С GGA AGT 1333

2 C282Y Rmut -C282Y CCT GGG TGC ТСС ACC TGG T 838

3 Fwt -C282Y GGG AAG AGC AGA GAT ATA CGT G 541

4 R-C282Y GGT GCT CTG AAG ATG TTT GTT GAA

5 F-H63D CCC AGG TTT TCA GGA GGC TTA GGT 950

6 H63D Rmut -H63D CTC CAC ACG GCG ACT CTC АТС 650

7 Fwt -H63D AGC TGT TCG TGT TCT ATG АТС 340

8 R-H63D GGT CCC TAT TTC CAC CAT CC

9 S65C F- S65C GTGCCTCAGAGCAGGACCTTG 249

10 R-S65C CCCCTCTCCACATACCCTTGC

Ген TrJ2

11 Y250X F- Y250X TGC ACT GGG TCG ATG AG 355

12 R- Y250X CTC AAG CCC TCC CTC T

Дизайн праймеров для амплификации локуса S65C и секвенирования осуществлялся на основании данных GeneBank с использованием программ «Vector NTI Suite 8» и «Oligo 6.31».

Состав реакционной смеси для амплификации фрагментов, содержащих локусы C282Y, H63D и S65C, был стандартным: Taq Буфера х10 (рН 8.6) - 2,5 мкл; Taq полимеразы 5ед/мкл - 1 мкл; хлорида магния 25 тМ р-ра - 1,5 мкл; смеси дНТФ (5тМ) - 0,5 мкл; геномной ДНК - 100 нг; деионизированной воды до конечного объема 25 мкл. Для амплификации фрагмента содержащего локус Y250X была использована полимераза Taq HotResqu 5ед/мкл - 1 мкл и буфер С х10 - 2,5 мкл с хлоридом магния, остальные составляющие те же. Для локуса C282Y использовали следующие количества праймеров: F-C282C - 3 pmol; R- C282Y - 5 pmol; Rmut-C282Y - 2 pmol; Fwt C282Y - 7 pmol. Для локуса H63D использовали по 8 pmol каждого праймера (F-H63D, Rmut-H63D, Fwt-H63D, R-H63D). Для локусов S65C и Y250X использовали по 10 pmol каждого праймера .

Разделение и детекцию продуктов амплификации и ферментативпого гидролиза проводили с помощью горизонтального электрофореза в 2,0 % и 3,5 % агарозном геле.

Таблица 3

Последовательности праймеров для секвенирования генов НРЕ, ШУ, НАМР

№ пп Праймер Сиквенс(5'-3') Длина фрагментов (П.Н.) Температу ра отжига, "С

1 НРЕ1 Рог ССТАСТТТССССААТСАЛСЛЛ Кем ЛООТССТССААЛСГГАССААЛ 446 60

2 НРЕ2 Бог ССТССТАСТЛСАСАТСОТТААС Яеу ОСАААТТССТТСССТСТТСС 428 60

3 НРЕЗ Рог ССЛОООЛАОАОООЛЛСОЛАТ Иеу (¡ССАСТАОАОТАТАСОСКЗСА 426 65

4 НРЕ4 Рог АТССССТСТССТСАТССТТС Неу ТСССАТААТТ АССГССТСАО 389 60

5 НРЕ5 Рог ОАОШТСЮСААТСАААОССТ Кеу СТССООСАОАСОТАСТААСЛ 201 65

6 ПРЕ6 Рог АОАОАОААОАСОСАЛОАТСС Кеу ТСГСОТААСОТТАТСАСТЛОС 532 60

7 ШУ1 Рог АССОТСААСТСАОТАССС Яеу ОАСАОАСАТССААСТАООТа 328 60

8 Н.ГУ2 Рог ОССАСАСТТАТАОТТТОАСОА Яеу СССТАСАТА<ЗСАСССТАСС 390 65

9 ш\'з-1 Рог СССГСАТСАОАТТТССААСАО Кеу ТСТОАААОТСАТООТСОААОС 547 60

10 ШУЗ-2 Рог СООАСССТГСТСАСТАТОАА Иеу САОАСОТТСАССААОААЛАОО 344 60

И 1Ц\'4-1 Рог ОТАСКЮАТСАОСТААТАСГССААС Кеу ТОАТССАСААООАОЛОСТСС 406 60

12 ШУ4-2 Рог СТАТСААТСХЗАООТСАССОАС Иеу САТСАААОАСАСАООААТСОААС 342 60

13 ШУ4-3 Рог СООООАССТАТААССАТТОАТ Яеу ССССТССТТССТТТААТСАТГС 370 60

14 ШУ4-4 Рог ССАТТСАСТААСОСК}АССАТС Иеу ССТТТСАССТСТТСССТСТТ 375 60

15 ШУ4-5 Рог СТТСАССААТТПТССАСССТС Яеу СТОАТАСТТССОАОСССТСТ 491 60

16 НАМР_рг1 Рог ООСТАСААТСТСАССТСГСС Яеу САСАСАТСТСТАОТСССАСС 471 65

17 НАМР_рг2 Рог САТАОСТСАСТССЛАССТСА Яеу ОСААСАСТАСАТАвСССТСА 384 65

18 НАМР_ргЗ Рог СААССТАТССАССТОТООТО Яеу ТСТСООАССОтАСТОАСАОТ 469 60

19 НАМР_е*оп1 Рог ТГАТСТСТСШЗССТТТТСО Яеу ТСССТСТССТССГГССТОТТ 411 60

20 НАМР_ехоп2,3 Рог САСТТ(Х;АОАООАОСАОСТТ Кеу САСАСАСТССССАОАСЛОАЛ 397 60

Амплификацию фрагментов для секвенирования экзонов генов НЕЕ, HJV, НЛМР проводили с использованием последовательностей разработанных нами праймеров (таб. 3). Праймеры для секвенирования подбирались таким образом, чтобы амплифицировать как экзоны генов, так и экзон-интронные области, включая промоторы генов и возможные сайты сплайсинга. Непосредственно сиквенсовую реакцию и капиллярный электрофорез проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (http://www.genome-centre.narod.ru/), организованном при поддержке РФФИ (руководитель д.м.н., профессор ГГолтараус А. Б.)

Статистические методы. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием параметрической и непараметрической статистики. Расчеты осуществляли с использованием пакета «Statistica 6.0». Анализ качественных признаков проводили с использованием критериев Стьюдента, */Д двустороннего теста Фишера, непараметрического критерия Манн-Уитни. Для поиска зависимостей между учитываемыми параметрами проводился корреляционный анализ с использованием рангового коэффициента корреляции Спирмена. Уровень значимости р < 0,05 был принят достаточным для признания различий достоверными.

Результаты и обсуждение собственных исследований

1. Распределение частот генотипов HFE в исследуемых группах.

Распределение частот мутаций гена HFE в Европейских популяциях характеризуется пестротой и выраженной неравномерностью. Известно, что частота мутации C282Y уменьшается с севера на юг и с запада на восток, тогда как частота мутации H63D, более древней по происхождению, напротив, увеличивается в тех же направлениях. Таким образом, отмечается определенная клинальная изменчивость частот, что может свидетельствовать о селективной роли данной генетической системы или о влиянии значительных миграционных потоков, формирующих наблюдаемую картину.

По литературным данным доля гомозигот по мутации H63D в группах пациентов существенно отличается в различных регионах Европы: во Франции от 4,9 до 8,5 %, в Италии 4,0 - 7,6 % (Merryweather-Clarke А.Т. et al, 2000), в центральной Испании - 20,0% (Diego С. и др. 2004). По нашим данным, частота гомозигот H63D/H63D в группе обследованных детей с БППЖ составила 14,3% и была ближе

9

всего к частоте, полученной испанскими исследователями на выборке взрослых пациентов. Частота компаунд-гетерозигот Н630/С282У и Н63Э/865С в группе детей с БППЖ составила 4,8 % и 3,2 % соответственно (рис. 1 А). В контрольной группе и группе с НЗ гомозигот по мутации НбЗЭ и компаунд-гетерозигот по частым мутациям не выявлено (рис. 1Б и 1В).

Частота гетерозигот Н63Н/Н630 в группе детей с БППЖ составила 34,9 %, что оказалось более чем в 3 раза выше, чем в контрольной группе и группе детей с НЗ. Различие в частотах генотипа НбЗН/НбЗО высоко значимы (Р<0,05). Эти данные свидетельствуют о накоплении пациентов, гетерозиготных по мутации НбЗБ, в группе детей с БППЖ. Частота аллеля НбЗЭ (0,357) была достоверно выше в группе с БППЖ, чем в контрольной группе (0,061) (%2 = 27,45; = 1; Р = 0,0001) и группе детей с НЗ (0,048) (£ = 14,98; сИ-= 1; Р = 0,0001).

C282Y/H63D 4,8%

S65S/S65C 3,2%

H63D/S65C 3,2%

H63HiH63D

C282C/C282Y 7,9 %

H63D/H63D 14,3%

H63HM63D 12,3%

C282C/C282Y 6,1%

S65SJS65C 2,0 %

H63HiH63D 9,5%

C282C(C282Y 9,5%

В

WT 81,0%

Рис. 1. Распределение частот генотипов по мутациям C282Y, H63D и S65C гена HFE в группах БППЖ (А), контрольной (Б) и НЗ (В).

В среднем, более 80% пациентов с НГХ 1 типа в Европе являются гомозиготами по мутации C282Y.: например, 94,6 % в Германии (Nielsen et al, 1998),

67,0 % в Испании (Fabrega et al., 1999), 48,0 % в Словении (Cukjati M. et al, 2007) и 33,0 % - на юге Италии (Piperno et al,1998). Пациенты, гомозиготные по мутации C282Y, в исследуемой выборке не выявлены, что отличает наши данные от результатов других исследований, полученных на выборках взрослых пациентов.

В настоящем исследовании также не обнаружено гомозиготных генотипов по мутации S65C. Частота встречаемости компаунд-гетерозигот H63D/S65C в группе БППЖ составила 3,2%, что сопоставимо с данными других исследователей (Мига С.,1999; Щербинина СЛ. с соавт., 2005; Михайлова C.B. с соавт., 2006).

При сравнении частот встречаемости гетерозиготных генотипов по мутациям C282Y и S65C (рис.1) в исследуемых группах детей статистически значимых различий не выявлено. В Европе частота гетерозигот C282C/C282Y в среднем достигает 9,2 %, (Merryweather-Clarke А. Т., 2000), а частота гетерозигот S65S/S65C -от 1,6 - до 5,5 % (Camaschelia С. Et al., 2002).

В ряде исследований было показано, что этиологически значимой в возникновении НГХ 1 типа у российских пациентов является мутация C282Y, которая встречается в гомозиготном состоянии примерно в 5,1 % (Лавров А. В., 2004), 6,0 % (Баев A.A., 2006), 5,9% (Михайловой C.B. с соавт., 2005) случаев. В настоящем исследовании ведущей причиной развития НГХ 1 типа выступает мутация H63D, а именно гомозиготный генотип. Возможно, одной из причин расхождений наших данных с работами указанных исследователей может являться существенная разница в источниках формирования выборок больных с СПЖ. В работах Баева A.A. и Лаврова A.B. наряду с пациентами гастроэнтерологического и гепатологического отделений, в выборки были включены пациенты из отделеши гематологии центра диагностики гемохроматозов. К тому же, в отличие от настоящего исследования, в этих работах были обследованы пациенты с развернутой клинической картиной НГХ, тогда как у пациентов ведущим было основное соматическое заболевание, протекающее на фоне СПЖ.

При сопоставлении частот аллелей C282Y, H63D и S65C, полученных в настоящем исследовании (группа детей с БППЖ) и в выборках взрослых пациентов из групп высокого риска развития НГХ 1 типа (исследования Лаврова A.B., 2004, Михайловой C.B. и соавт., 2006 и Баева A.A., 2006) статистически значимых различий в частотах встречаемости исследуемых аллелей не выявлено. Однако выборка детей отличалась по спектру выявлешшх генотипов HFE (таб.4).

Таблица 4

Частоты генотипов и аллелей то мутациям C282Y, H63D и S65C гена HFE в группах детей и взрослых с высоким риском развития НГ'Х

Мутация Генопип/ аллель Частота (для генотипов в %; доя аллелей в долях)

Дети с БППЖ (настоящее исследование) (N=63) Взрослые с предположительн ым диагнозом НГХ (N=67)* Взрослые с клиническими признаками НГХ (N=39)" Взрослые сГХ (N=50)'"

C282Y YY 0,0 6,0 5,1 6,0

CY 7,9 7,5 2,6 14,0

Y/D 4,8 3,0 5,1 6,0

СС 87,3 83,5 87,2 74,0

Y 0,063 0,112 0,090 0,160

С 0,937 0,888 0,910 0,840

H63D DD 14,3 4.5 2,6 6,0

HD 34,9 34,3 41,0 40,0

Y/D+C/D 7,9 3,0 5,1 6,0

НН 42,9 58,2 51,3 48,0

D 0,357 0,231 0,256 0,290

H 0,643 0,769 0,744 0,710

S65C СС 0,0 0,0 ни ни

SC 3,2 4,5 ни ни

ся> за 0,0 ни ни

SS 93,6 95,5 ни ни

с 0,032 0,022 ни ни

s 0,968 0,978 ни ни

ни - не исследовано

Рассчитано по данным Михайловой C.B. и соавт. (2006), ** Рассчитано по данным А.ВЛаврова (2004), *** Рассчитано по данным А.А.Баева (2006)

2. Биохимические показатели обмена железа в исследуемых группах. При

сравнении средних значений показателей обмена железа в группах БППЖ и контрольной получено статистически значимое различие для уровня гемоглобина крови, содержания эритроцитов, концентрации железа в сыворотке, содержания трансферрина в сыворотке, а также для ОЖСС и СНТЖ (р<0,05),

При сравнении средних значений концентрации ферритина в сыворотке у детей в группе БППЖ и контрольной группе достоверных различий выявлено не было. В

отличие от взрослых пациентов, в детском возрасте накопление железа находится на начальной стадии и уровень ферритина часто не превышает границы референтных значений.

Проведенное сопоставление средних значений биохимических показателей обмена железа у детей с различными генотипами по исследуемым мутациям в группе БППЖ показало, что у детей гомозигот H63D/H63D и компаунд-гетерозигот H63D/C282Y и H63D/C65S средняя концентрация железа в сыворотке (40,1±2,3) достоверно выше, чем у детей без мутаций (32,9±1,2) (t = 2,95; df = 32; Р = 0,0058). Такая же закономерность наблюдалась для СНТЖ при значениях 58,6±4,3 и 44,5±2,7 (t = 2,93; df = 32; Р = 0,0062) (таб. 5).

У пациентов в группе с БППЖ, гетерозиготных по одной из частых мутаций, отмечались более высокие средние значения содержания железа и ферритина в сыворотке, и более высокий средний уровень СНТЖ по сравнению с пациентами, не имеющими частых мутаций гена HFE. Различие было статистически не значимым, тем не менее, такая тенденция изменений биохимических показателей обмена железа указывает на возможность развития СПЖ у гетерозиготных носителей частых мутаций в гене HFE при наличии ряда провоцирующих факторов: употребление в пищу воды, с повышенным содержанием железа, вирусная нагрузка на печень, передозировка препаратов железа и др. лекарственных препаратов. Эти данные согласуются с данными других исследователей о совместном влиянии гетерозиготного генотипа и других патогенных факторов на показатели обмена железа (Мига С.,1999, Кулагина Е. А., 2006).

Для оценки связи между числом мутантных аллелей и значениями биохимических показателей у детей в группе БППЖ был проведен корреляционный анализ (с применением рангового коэффициента корреляции Спирмена). Нами получена статистически значимая прямая связь числа мутантных аллелей в гене HFE (по любой из частых мутаций) с уровнем содержания железа в сыворотке (R = 0,25; df = 61; Р = 0,05) и СНТЖ (R = 0,333; df = 61; Р = 0,008). Предполагая, что наличие различных (С282У, H63D и S65C) мутантных аллелей гена HFE могло по-разному влиять на уровень биохимических показателей обмена железа, была предпринята попытка оценить связь исследуемых показателей обмена железа только с наличием аллеля H63D. При перерасчете выявлена статистически значимая прямая связь числа

мутантных аллелей НбЗО со средним уровнем содержанием железа в сыворотке и СНТЖ.

Таблица 5

Биохимические показатели у детей в группе БППЖ в зависимости от генотипа

Показатель ХсР±т/ генотип, число детей, N Ре (мкмоль/л) ОЖСС (мкмоль/л) СНТЖ (%) Тф сыв. (мг/дл) Фр сыв. (мг/дл)

Гомозиготы 63БЕ) и компаунд-гетерозиготы N=14 40,1 ±2,3 67,4±3,6 58,6±4,3 224,1±18,5 104,1 ±20,3

Гетерозиготы* N=29 35,8±2Д 69,5±2,3 52,2±2,8 216,9±12,4 123,5±23,4

Без частых мутаций N=20 32,9±1,2 77,3±3,7 44,5±2,7 243,8±16,3 67,9±15,2

* гетерозиготы по одной из частых мутаций в гене НЕЕ

Предположение о том, что аллель НбЗО вносит наиболее существенный вклад в зависимость уровня СНТЖ от числа мутантных аллелей гена НЕЕ у пациентов исследованной выборки получило подтверждение. Данные непротиворечиво свидетельствуют об участии мутации 11631} в гетерозиготном состоянии в формировании СПЖ у обследованных пациентов. Вместе с тем, четких закономерностей связи количества мутантных аллелей гена НЕЕ с концентрацией трансферрина и ферритина в группе больных с БППЖ не было выявлено.

3. Связь основных клинических проявлений СПЖ с генотипом по НЕЕ. В результате оценки характера клинических проявлений НГХ 1 типа у детей с СПЖ было показано, что статистически достоверных различий между группой пациентов -носителей одного или двух мутантных аллелей (по любой из исследованных мутаций гена НЕЕ) и группой пациентов без частых мутаций не выявлено (таб. 6). Полученные данные свидетельствуют о том, что у детей выявляются только минимальные клинические проявления СПЖ, без развития классической клинической картины НГХ 1 типа. Эти признаки в сочетании с биохимическими изменениями, характерными для НГХ 1 типа, являются показанием для направления ребенка на молекулярно-гснетическую диагностику НГХ 1 типа.

Таблица 6

Клинические проявления СПЖ у детей группы БППЖ с разными генотипами

Клинический признак Доля детей с нарушениями, %

Гомозиготы и компаунд-гетерозиготы* N=14 Гетерозиготы** N=29 Без частых мутаций в гене НЕЕ N=20

Поражение печени 64,3 93,1 85,0

Нарушение деятельности сердца 83,4 86,2 85,0

Нарушение пигментации кожи 28,5 20,7 28,6

Нарушение толерантности к глюкозе 21,4 13,8 20,0

*- гомозиготы НбЗЭ/ Н63Б и компаунд-гетерозиготы Н630/С282У и Н630/С655,

** - гетерозиготы по С282У, НбЗО и Ъ65С в сумме

4. Поиск редких мутаций в гене НРЕ и других генах наследственного гемохроматоза. Некоторым пациентам из обследованной выборки диагноз НГХ был поставлен на основе клинических признаков. Однако, частых мутаций в гене НЕЕ у них не было выявлено. Поэтому необходимо было исключить другие генетические причины данного состояния.

Известно, что причина раннего дебюта заболевания может быть связана с одновременным наследованием мутаций гена НЕЕ и мутации У250Х гена Тг/2. Для исключения этой причины ранней манифестации НГХ был проведен поиск мутации У250Х в гене Тг/2 у детей с БППЖ и в контрольной группе. Мутации У250Х в гене Тг/2 у обследованных пациентов не было выявлено .

Чтобы исключить наличие у наших пациентов других, более редких мутаций в гене НЕЕ, а также, учитывая возраст наших пациентов и описанные в литературе случаи одновременного наследования мутаций в гене НЕЕ и генах гемоювелина и гепсидина (HVJ и НАМР ), приводящих к ювенильному гемохроматозу, был проведен поиск мутаций в этих генах методом секвенирования. В подгруппу было включено 5 человек с клиническим диагнозом «наследственный гемохроматоз» и отсутствием

гомозиготного генотипа по частым мутациям гена НРЕ. Мутаций в исследованных генах у этих пациентов обнаружено не было.

На основе полученных данных нами был разработан протокол медико-генетического обследования детей с наследственными гемохроматозами (рис. 2). Первый этап обследования - выявление детей с биохимическими признаками СПЖ и клиническими симптомами гемохроматоза среди пациентов с соматическими заболеваниями. Далее проводится молекулярно-геиетическое обследование по трем частым мутациям гена НЕЕ. По результатам генотипирования у детей с гомозиготными и компаунд-гетерозиготными генотипами диагноз НГХ 1 типа считается подтвержденным; у детей, гетерозиготных по одной из частых мутаций и детей, не имеющие частых мутаций в гене НЕЕ, при наличии клинической картины СПЖ необходимо исключить сначала другие мутации гена НЕЕ, а при их отсутствии, мутации в генах гемоювелина, гепсидика, ферропортина и ТфР2. Такое обследование дает возможность быстро и эффективно выявлять больных с наследственными гемохроматозами на ранней, иногда доклинической стадии развития заболевания, что позволит предотвратить развитие тяжелой клинической картины в старшем возрасте.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наследственный гемохроматоз 1 типа является одним из немногих наследственных заболеваний обмена веществ, для которых существует эффективная и доступная терапия. Однако данное заболевание, как правило, диагностируется во взрослом возрасте при наличии развернутой клинической картины, которая проявляется в виде тяжелых необратимых поражений ряда органов и тканей (цирроза печени, сахарного диабета, кардимиопатии). Тем не менее, эти явления можно предотвратить в случае ранней диагностики НГХ 1 типа, на доклинической стадии, когда заболевание проявляется в виде биохимических признаков СПЖ. В практике педиатров часто возникает необходимость дифференциальной диагностики СПЖ первичного и вторичного характера. Выше изложенные причины обусловили проведение данного исследования. В настоящем исследовании впервые проведено молекулярно-генетическое обследование детей с соматическими заболеваниями и СПЖ, а также дана биохимическая характеристика различных генотипов по мутациям в гене НЕЕ.

Дети с биохимическими и/ или клиническими признаками синдрома перегрузки железом

Рис. 2. Протокол молекулярно-генетического обследования детей на наследственные гемохроматозы.

При расчете частот встречаемости генотипов по исследуемым мутациям гена НЕЕ в нашей выборке был выявлен ряд особенностей. Основными вариантами гена НЕЕ, определяющими наследственный гемохроматоз 1 типа в настоящей выборке детей, были гомозиготы НбЗО/ПбЗО и компаунд-гетерозиготы Н63Б/С282У и Н63Б/865С. Отбор детей по биохимическим критериям СПЖ на молекулярно-генетическую диагностику позволил выявить высокий суммарный процент (22,3 %) детей с подтвержденным диагнозом НГХ 1 типа. Полученные данные с высокой частотой аллеля НбЗЭ в группе детей с БППЖ подтверждают вовлеченность этого аллеля в механизм развития СПЖ у обследованных детей.

В ходе работы было показано, что повышение СНТЖ у детей является прямым показанием для проведения молекулярно-генетического обследования на НГХ 1 типа. Анализ взаимосвязи биохимических показателей с различными генотипами по трем мутациям в гене ЯF£ в группе детей с БППЖ показал, прямую зависимость СНТЖ и

концентрации железа в сыворотке от числа мутантных аллелей НбЗВ. Показано, что у детей гетерозигот по мутации Н63П присутствуют биохимические признаки СПЖ, которые могли быть спровоцированы сопутствующей патологией.

Сопоставление клинических признаков СПЖ с генотипами по НЕЕ у детей в группе БПГ1Ж показало, что проявления НГХ 1 типа в детском возрасте имеют нсспецифический характер.

На основе полученных данных разработаны протокол молекулярно-генетического обследования детей на НГХ и практические рекомендации для врачей.

ВЫВОДЫ

1. НГХ 1 типа у детей с соматическими заболеваниями может проявляться изменениями биохимических показателей обмена железа, из которых наиболее информативным и значимым для обоснования необходимости дальнейшего молекулярно-генетического обследования является степень насыщения трансферрина железом.

2. Основной причиной наследственного гемохроматоза 1 типа в исследуемой выборке российских детей является гомозиготный генотип по мутации Н630 и компаунд-гетерозиготные генотипы Н63И/С282У и Н63ВД>65С гена НЕЕ.

3. В выборке детей с биохимическими признаками синдрома перегрузки железом частота гетерозигот НбЗЭ достоверно выше по сравнению с контрольной группой, что может рассматриваться как указание на участие данного аллеля в развитии патологии обмена железа у детей с сопутствующими соматическими заболеваниями.

4. Частота гетерозигот С282У, оцененная на выборке детей с синдромом перегрузки железом, статистически не отличается от частоты, оцененной в группе детей с нормальными показателями обмена железа, а так же от общепопуляционной частоты.

5. В группе детей с БППЖ и контрольной группе частоты гетерозигот по мутации Э65С гена НЕЕ составили соответственно 3,2 % и 2,0%. Полученные оценки частот статистически не различались.

6. Разработан и внедрен в практику протокол молекулярно-генетического обследования детей на наследственные гемохроматозы.

Практические рекомендации

1. При выявлении синдрома перегрузки железом у детей с соматической патологией необходимо направлять этих пациентов на молекулярно-генетическое исследование с целью исключения НГХ 1 типа, а так же других типов наследственных гемохроматозов.

2. При диагностике мутантного генотипа по гену HFE у ребенка с соматической патологией внимание врачей должно быть обращено на контроль и коррекцию уровня железа.

3. Разработанный протокол молекулярпо-генетического обследования может быть использован в отделениях крупных научно-практических центров и при медико-генетическом консультировании семей с гемохроматозом для оценки риска потомства, определения прогноза течения заболевания, скорости прогрессирования и выбора адекватных методов терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полякова С.И., Журкова Н.В., Потапов A.C., Аверьянова Н.С. Гемохроматоз: состояние проблемы // Справочник педиатра. - 2006. - №12.- С. 18-28.

2. Полякова С.И. Чибисов И.В., Потапов A.C., Сенцова Т.Б., Баканов М.Й., Аверьянова Н.С., Журкова Н.В., Пинелис В.Г. Возрастные особенности уровня ферритина - ключ к ранней диагностике гемохроматоза // Материалы VII съезда научного общества гастроэнтерологов России, Москва. - 2007. -С.194.

3. Полякова С.И., Аверьянова Н.С., Тихомиров Е.Е., Баканов М.И., Пинелис В.Г., Потапов A.C., Журкова Н.В. Фенотипические и молекулярно-генетические корреляции доклинического наследственного гемохроматоза у детей // Материлы XIII Росс. Гастроэнтерологической недели. Росс. Журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2007.-Т. 17. - №5. - С.114.

4. Полякова С.И., Журкова Н.В., Аверьянова Н.С., Чибисов И.В., Потапов A.C., Куприянова О.О., Баканов М.И., Пинелис В.Г., Строкова Т.В. Алгоритм ранней диагностики гемохроматоза // Сб. матер. XI Конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 5-8 фев. 2007 г. - М.: Изд.

Группа «ГЭОТАР-Медиа», 2007. - С. 546.

19

5. Полякова С.И., Строкова Т.В., Баканов М.И., Потапов A.C., Сенякович В.М., Аверьянова Н.С., Журкова Н.В. Обмен железа у детей с холестатичсскнми и метаболическими заболеваниями печени II Росс. Журя гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктол. Прил. № 29. материалы XII Российской конференции «Гепатология сегодня», Москва, 19-21 марта 2007 г. - М.-С.54.

6. Полякова С.И., Потапов A.C., Сурганова A.A., АЕеркина Н.В., Цимбалова Е.Г., Аверьянова Н.С., Тихомиров Е.Е., Журкова Н.В. Парадоксы железа у детей с соматической патологией // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. Прил. № 31. Материалы XIII Российской конференции «Гепатология сегодня», Москва, 17-19 марта 2008 г.-М.- T. XVIII. - №1 - С.82.

7. Полякова С.И., Аверьянова Н.С., Потапов A.C., Журкова Н.В. Туманова Е.Л., Баканов М.И., Пинелис В.Г. Гемохроматоз у детей и подростков: трудности диагностики на раннем этапе // Росс. Журн. гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктол. Прил. X» 34. Материалы XV Российской гастроэнтерологической недели, Москва, 12-14 октября 2009 г.-М,- T. XIX. - №5.- С.124.

8. Polyakova S., Bezrukavnikova L., Averyanova N., Potapov A., Chetkina T., Senyakovich V., Bakanov M. Hepatic iron content in children with major mutation of hereditary haemochromatosis II 4th Europediatrics, Moscow, 3-6 June, 2009.-M. -abstr.448.

9. Аверьянова H.C., Давыдова O.H., Журкова H.B., Полякова С.И., Пинелис В.Г., Асанов А.Ю. Молекулярно-генетические аспекты наследственного гемохроматоза у детей // Материалы Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дм рождения Ч.Дарвина и V сьезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров Москва, 21 июня-28 июня 2009 г. -М.: -В 2-х частях. Часть I. - С. 379.

10. Асанов АЛО., Аверьянова U.C., Журкова Н.В., Полякова С.И., Давыдова О.Н., Диагностика наследственного гемохроматоза 1тина в группе детей с клиническими проявлениями гемосидероза // Сб. научных трудов. Современные технологии профилактики наследственных болезней и детской инвалидности (к 40-летию медико-генетического центра).- Спб. ГУЗ МГЦ.: «Феникс», 2009.- С. 111-112.

11. Аверьянова Н.С., Журкова Н.В., Полякова С.И., Асаков А.Ю., Пинелис В.Г. Наследственный гемохроматоз у детей - необходимость молекулярно-генетической диагностики // Медицинская генетика. Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г.- Ростов-на-Дону.- С. 3.

12. Полякова С.И., Аверьянова Н.С., Баканов М.И., Потапов А.С., Журкова Н.В., Пинелис В.Г. Биохимические критерии перегрузки железом у детей с мутациями в гене НЕЕ // Медицинская генетика. Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г.- Ростов-на-Дону,- С. 144-145.

13. Аверьянова Н.С., Полякова С.И., Журкова Н.В., Кондакова О.Б., Асанов АЛО. Исследование частых мутаций гена HFE у детей с синдромом перегрузки железом // Педиатрия. Журнал им. Сперанского.- 2010.- т.о9.- № 6.- С. 156.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БППЖ - биохимические признаки синдрома перегрузки железом ЖКТ - желудочно-кишечный тракт НГХ - наследственный гемохроматоз НЗ - наследственные заболевания

ОЖСС - общая железосвязывающая способность сыворотки

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

СНТЖ - степень насыщения трансферрина железом

СПЖ - синдром перегрузки железом

Тф сыв. - трансферрин сыворотки

Фр сыв. - ферритин сыворотки

Fe сыв. - концентрация железа в сыворотке

НАМР — ген гепсидина

НЕЕ - ген наследственного гемохроматоза 1 типа (от англ. high ferum)

Я/К-ген гемоювелина

T/R2 - ген трансферринового рецептора 2 типа

WT - от англ. wild type - «дикий тип»

Аверьянова Наталья Сергеевна Молекулирно-генстическая и биохимическая характеристики наследственного гемохроматоза 1 типа у детей

Биохимические и молекулярно-генетические особенности наследственного гемохроматоза 1 типа были исследованы у детей с синдромом перегрузки железом. Основной причиной НГХ 1 типа у детей в исследованной выборке являлись гомозиготный генотип по мутации H63D и компаунд-гетерозиготные генотипы C282Y/H63D и H63D/S65C. Установлено, что биохимические признаки синдрома перегрузки железом могут отмечаться у детей с различными соматическими заболеваниями, что определяет необходимость проведения молекулярно-генетического исследования для подтверждения наследственного характера синдрома перегрузки железом у пациентов детского возраста. Разработан и внедрен в практику протокол молекулярно-генетического обследования детей с признаками СПЖ. Результаты исследования рекомендованы для практического применения в работе врачей-педиатров, генетиков в медико-генетических консультациях и научно-образовательной деятельности.

Averyanova Natalya Sergeevna Molecular genetic and biochemical characteristics of hereditary haemochromatosis type 1 in children

Biochemical and molecular-genetic features of hereditary haemochromatosis type 1 were studied in children with iron overload. Our patients with hereditary haemochromatosis showed a homozygous genotype for the H63D mutation and compound heterozygous genotype C282Y/H63D and H63D/S65C in HFE gene. Biochemical signs of iron overload syndrome could be observed in children with different somatic diseases therefore molecular-genetic study is necessary to confirm hereditary haemochromatosis in children. We have developed and introduced a special protocol of molecular-genetic investigation of children with iron overload syndrome. These results can be used by pediatricians, in medico-genetic consultation and in scientific and educational activities.

Подписано в печать 18.11.2010 г.

Печать трафаретная Усл.п.л. -1,5 Заказ № 4604

Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36

(499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Аверьянова, Наталья Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:.

1.1 Определение и классификация гемохроматозов.

1.2 Молекулярные механизмы обмена железа и их регуляция.

1.3 Клиническая характеристика НГХ 1 типа.

1.4 Биохимические показатели обмена железа в диагностике НГХ.

1.5 Молекулярно-генетическая характеристика НГХ 1 типа.

1.5.1 Спектр мутаций гена ЯЕЕ и их частоты.

Г.5.2 Клиническое значение мутаций С282У, НбЗО и 865С.

1.5.3.Исследование мутаций гена НРЕ у детей.

1.5.4 Причины ранней манифестации;НГХЛтипа.

1.5.5 Доклиническая диагностика НГХ 1типа.

ГЛАВА 2 . МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы исследования.39 °

2.2 Методы исследования.л.40?

2.2.1 Методы определения показателей обмена железа.40.

2.2.2 Молекулярно-генетические методы.4,1;

2.2.3 Статистические методы.51'

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ЗЛ Характеристика исследуемой выборки пациентов.

3.1 Л Группа пациентов с БППЖ.

3.1.2 Контрольная группа пациентов.

311.3 Группа пациентов с

3.2 Результаты молекулярно-генетических исследований мутаций С282У, Н63Б и Б65С в гене НРЕ.

3.2.1 Распределение частот генотипов по мутациям С282У, НбЗО и

Б65С гена в группах БППЖ, НЗ и контрольной!.

3:2.2 Распределение частот аллелей по мутациям: С282У, НбЗБ и Б65С гена НЕЕ в группах БППЖ, НЗ и контрольной.

3.3 Гематологические и биохимические показатели обмена железа у пациентов с разным генотипом по НЕЕ.

3.3.1 Группа БППЖ.

3.3.2 Группы контрольная и НЗ.

3.4 Клинические проявления СПЖ у детей с разным генотипом по НЕЕ.

3.4.1 Поражение гепатобилиарного тракта.

3.4.2 Заболевания желудочно-кишечного тракта.

3.4.3 Поражение сердечно-сосудистой системы.

3.4.4 Нарушение пигментация кожи.

3.5 Поиск мутации У250Х в гене Тг/2.

3.6 Поиск мутаций в генах НЕЕ, НК/, НАМР методом секвенирования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая и биохимическая характеристики наследственного гемохроматоза 1 типа у детей"

Актуальность проблемы. Синдром перегрузки железом (СПЖ) в детском возрасте является угрожающим состоянием и приводит к поражению различных органов и систем. Известно, что СПЖ может иметь как первичный, так и вторичный характер. Среди причин первичной перегрузки железом большой удельный вес занимают наследственные нарушения обмена железа - наследственные гемохроматозы. Известно 5 типов наследственных гемохроматозов, обусловленных мутациями в разных генах: HFE, гепсидина (НАМР), гемоювелина (HJV), трансферринового рецептора 2 типа (TfR.2), ферропортина [114]. Наиболее распространенным является наследственный гемохроматоз 1 типа (НГХ 1 типа), обусловленный мутациями в гене HFE. Заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу. Частота НГХ 1 типа в Европейской популяции составляет от 3 до 8 на 1000 населения, а частота гетерозиготного носительства достигает 10 % [118]. В России частота данного заболевания приближается к европейской [2, 3, 19, 20^ 111]. Избыточное накопление железа в-организме сопровождается развитием цирроза печени, сахарного диабета, кардиомиопатии, нарушением, выработки гормонов гипофизом и др. Риск развития гепатоцеллюлярной карциномы в 200 раз выше у больных с НГХ 1 типа, чем в среднем в популяции [5]. Накопление железа в органах и тканях при НГХ начинается с рождения и идет постепенно. Клиническая манифестация НГХ 1 типа чаще наступает после 40 лет, когда избыток железа достигает критического уровня и патологические изменения в организме приобретают необратимый характер [14]. Несмотря на этот общеизвестный факт, у пациентов детского возраста выявляют изменения биохимических параметров обмена железа, а в ряде случаев и неспецифические клинические симптомы [26]. Высказывается предположение; что гетерозиготное носительство мутаций, приводящих к НГХ 1 типа, может способствовать нарушению обмена железа при ряде сопутствующих соматических заболеваний [2,15, 119].

В литературе встречаются единичные работы, посвященные диагностике НГХ 1 типа у российских детей [1, 11, 12, 13]. До настоящего времени молекулярно-генетических исследований НГХ 1 типа у российских пациентов детского возраста практически не проводилось. Характер изменения биохимических показателей обмена железа у детей с мутациями в гене НЕЕ не изучался. Группы риска развития НГХ 1 типа среди российских детей не определены.

Таким образом, актуальным является разработка критериев дифференциальной диагностики первичного и вторичного СПЖ у детей на основе биохимических показателей обмена железа и молекулярно-генетических исследований. Выявление групп риска развития НГХ 1 типа и разработка алгоритма обследования детей с СПЖ позволит проводить раннюю диагностику НГХ 1 типа и профилактику тяжелого течения и неблагоприятного исхода заболевания.

Цель исследования.

Изучение молекулярно-генетических и биохимических особенностей проявления наследственного гемохроматоза 1 типа у детей с СПЖ.

Задачи исследования.

Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. Сформировать репрезентативную выборку пациентов с признаками СПЖ для проведения молекулярно-генетического анализа гена НЕЕ.

2. Получить данные о спектре мутаций гена НЕЕ и их частоте, а также проанализировать связь генотипа с биохимическими показателями обмена железа и клиническими особенностями у детей изучаемой выборки.

3. Провести полное секвенирование гена НЕЕ у детей с наиболее выраженными биохимическими и клиническими признаками СПЖ и отсутствием гомозиготного генотипа по частым мутациям гена НЕЕ с целью поиска редких мутаций изучаемого гена, а также полное секвенирование генов НЗУ и НАМР с целью исключения ювенильного гемохроматоза (типы

7 •

2А и 2В) у детей с ярко выраженной клинической картиной и исключенным НГХ 1 типа.

4. У всех детей с биохимической картиной перегрузки железом и в контрольной группе оценить частоту мутации У250Х гена трансферринового рецептора 2 Тг/2, вызывающей наследственный гемохроматоз 3 типа.

5. Разработать практические рекомендации по применению молекулярно-генетических исследований НГХ 1 типа у детей из групп риска и протокол молекулярно-генетического обследования на НГХ.

Научная новизна работы

Впервые определены частоты мутаций С282У, НбЗО и 865С гена НЕЕ в выборке российских детей с соматическими заболеваниями и биохимическими признаками СПЖ.

Впервые показано, что в группе детей с различными соматическими заболеваниями (преимущественно с поражением печени и ЖКТ), сопровождающимися биохимическими признаками СПЖ, частота мутациим НбЗБ достоверно более высокая, чем у детей контрольной группы.

Впервые проведено сопоставление биохимических и некоторых клинических признаков НГХ, 1 типа у детей с различными генотипами по мутациям в гене НЕЕ. Показана прямая зависимость средних значений биохимических показателей обмена железа от числа мутантных аллелей НбЗБ. Доказано, что превышение нормальных значений степени насыщения трансферрина железом (СНТЖ) может служить показанием для направления детей на молекулярно-генетическую диагностику НГХ1 типа.

Практическая значимость работы

Доказана необходимость молекулярно-генетической диагностики НГХ 1 типа у детей с признаками СПЖ и различными соматическими заболеваниями (преимущественно печени и ЖКТ). Это позволит, контролировать избыточное накопление железа в организме и • своевременно проводить специфическую профилактику осложнений, и тем самым повысить качество жизни пациентов.

Разработан протокол молекулярно-генетического обследования детей с СПЖ, который может использоваться при дифференциальной диагностике, медико-генетическом консультировании, в научно-образовательной деятельности.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У пациентов детского возраста НГХ 1 типа, обусловленный мутациями в гене НЕЕ, может проявляться изменением биохимических показателей обмена железа, а в ряде случаев поражением печени, эндокринной системы, сердца, что является достаточными критериями для направления детей на молекулярно-генетическое обследование.

2. Гомозиготный генотип по мутации НбЗБ или компаунд-гетерозиготные генотипы НбЗО/С282У или Н63В/865С являются наиболее частой причиной НГХ 1 типа у детей исследованной выборки.

3. Значительное превышение доли детей с гетерозиготным генотипом по мутации НбЗБв выборке детей с БППЖ по сравнению с контрольной, группой свидетельствует об этиологической значимости данной мутации в развитии СПЖ у российских детей с соматическими заболеваниями.

4. Статистически достоверных различий в частоте мутантного аллеля С282У в выборке детей с СПЖ по сравнению с группой детей с нормальными показателями обмена железа и общепопуляционной частотой не обнаружено.

5. Определены частоты гетерозигот по мутации 865С гена НЕЕ в исследуемых выборках.

Внедрение результатов работы в клиническую практику Результаты работы внедрены в клиническую практику отделений НЦЗД РАМН, используются при медико-генетическом консультировании пациентов НЦЗД РАМН и в учебном процессе студентов кафедры медицинской генетики Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Апробация и публикации. Материалы диссертации представлены на Съезде Генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, 21-28 июня 2009 г., Москва (стендовый доклад); на VI Съезде Российского Общества Медицинских генетиков в рамках научной конференции «Молекулярные основы наследственной патологии», 14-18 мая 2010 г., Ростов-на-Дону (устный доклад); на научных конференциях лаборатории мембранологии с группой генетических исследований НЦЗД РАМН. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка и приложений. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 38 таблицами. Библиографический список литературы включает 157 источников, из них 118 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Аверьянова, Наталья Сергеевна

100 выводы

1. НГХ 1 типа у детей с соматическими заболеваниями может, проявляться изменениями биохимических показателей обмена железа, из которых наиболее информативным и значимым для обоснования необходимости дальнейшего молекулярно-генетического обследования является степень насыщения трансферрина железом.

2. Основной причиной наследственного гемохроматоза 1 типа в исследуемой выборке российских детей является гомозиготный генотип по мутации НбЗБ и компаунд-гетерозиготные генотипы Н63Б/С282У и Н63Б/865С гена ЯРЕ.

3. В выборке детей с биохимическими признаками синдрома перегрузки железом частота гетерозигот НбЗБ достоверно выше по сравнению с контрольной группой, что может рассматриваться как указание на участие данного аллеля в развитии патологии обмена железа у детей с сопутствующими соматическими заболеваниями.

4. Частота гетерозигот С282У, оцененная на выборке детей с синдромом перегрузки железом, статистически не отличается от частоты, оцененной в группе детей с нормальными показателями обмена железа, а так же от общепопуляционной частоты.

5. В группе детей с БППЖ и контрольной группе частоты гетерозигот по мутации Б65С гена НЕЕ составили соответственно 3,2 % и 2,0%. Полученные оценки частот статистически не различались.

6. Разработан и внедрен в практику протокол молекулярно-генетического обследования детей на наследственные гемохроматозы.

Практические рекомендации

1. При выявлении синдрома перегрузки железом у детей с соматической патологией необходимо направлять этих пациентов на молекулярно-генетическое исследование с целью исключения НГХ 1 типа, а так же других типов наследственных гемохроматозов.

2. При диагностике мутантного генотипа по гену НРЕ у ребенка с соматической патологией внимание врачей должно быть обращено на контроль и коррекцию уровня железа.

3. Разработанный протокол молекулярно-генетического обследования может быть использован в отделениях крупных научно-практических центров и при медико-генетическом консультировании семей с гемохроматозом для оценки риска потомства, определения прогноза течения заболевания, скорости прогрессирования и выбора адекватных методов терапии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аверьянова, Наталья Сергеевна, Москва

1. Аскерова Т.А. Раннее выявление наследственного гемохроматоза. Педиатрия. №5, 2001, с. 98 100.

2. Баев А. А. Сравнение клинических и лабораторных показателей у гомо- и гетерозигот по мутациям в гене наследственного гемохроматоза (HFE) в разных группах больных: Автореф. дисс. на соискание уч. степени канд. мед. наук / А.А. Баев. Москва, 2006. - 30 с.

3. Болезни перегрузки железом (гемохроматозы). / Под ред. А.Г. Румянцева и Ю.Н. Токарева М.: ИД Медпрактика-М, 2004.328 с.

4. Володичева Е. М., Цыба H. Н., Щербинина С. П. Клинический анализ крови при наследственном гемохроматозе Гематология и трансфузиология №5 2003

5. Зборовский, С. С., Мисюрин, А. В., Щербинина, С. П. Первый опыт генетического тестирования наследственного гемохроматоза в России /ТГематол. и трансфузиол. -2001.- Т. 46. №3 - С. 64-65.

6. Зборовский С.С., Щербинина С. П., Левина A.A. Диагностика наследственного гемохроматоза у больных с антигенами HLA-A1 и HLA-A1 и В8 //Гематол. и трансфузиол. -2005. -Т.50.- № 1.- С. 39-41.

7. Красильникова, М. В., Сеттарова, Д. А., Левина, А. А., Сметанина, Н. С., Токарев, Ю: Н. Наследственный гемохроматоз у детей //Гематол. и трансфузиол. -1999. -Т.44.- № 2.- С. 24-27.

8. Козырева Н.В.,. Казакова Л.М., Шабалдин A.B. Обмен железа у детей -носителей мутации C282Y гена гемохроматоза HFE // Педиатрия : журнал-им. Г. Н. Сперанского / Союз педиатров России. 2008. - Том 87,N 4 . - С. 6971.

9. Краснопольская К.Д. Наследственные болезни обмена веществ. Справочное пособие для врачей М.: РОО «Центр социальной адаптации и реабилитации детей «Фохат». - 2005 г.- 243-247.

10. Лавров А. В Исследование генетических факторов, определяющих развитие наследственного гемохроматоза // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2003. - N 2 . - С. 92-98.

11. Лавров А. В., Баев А. А., Суркова И. К. и др. Анализ частот мутаций C282Y и H63D гена наследственного гемохроматоза (HFE) у госпитализированных больных // Медицинская генетика : Ежемесячный научно-практический журнал. 2004. - Том 3,N 8 . - С. 380-387.

12. Лавров A.B., Литвинова М.М., Бочков Н.П. Генетика и молекулярные механизмы патогенеза наследственного гемохроматоза. Ж. Молекулярная медицина, 2004, 1, стр. 10-20.

13. Михайлова C.B., Онопченко О.В., Суханов A.B., Максимов В.Н., Гаскина Т.К., Ромащенко А.Г., Воевода М. И. Гаплотипический анализ гена HFE в популяции русских и среди пациентов с мультифакторными заболеваниями //ВестникВОГиС.-2006.-Т. Ю.-№3.-504-513.

14. Морщакова Е. Ф., Павлов А. Д. Регуляция гомеостаза железа Гематология и трансфузиология №1 2003

15. Павлов Ч. С., Баев А. А., Лавров А. В. и др. Значение мутаций гена гемохроматоза в развитии синдрома перегрузки железом // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. , 2005. - N 3 . - С. 17-23.

16. Павлов Ч.С., Баев A.A., Лавров A.B., Маевская М.В. Особенности клинической картины у гетерозигот по мажорным мутациям генов наследственного гемохроматоза (НГХ)./Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. №1,2004. с. 15-17.

17. Павлов Ч.С., Лавров A.B., Баев A.A., Суркова И.К., Сухарева Г.В., Асанов А.Ю., Бочков Н. П. /Анализ частот мутаций C282Y и H63D гена наследственного гемохроматоза (HFE) у госпитальных больных. Медицинская генетика. Том 4, №8, 2004.С. 56-61.

18. Полякова С.И., Потапов A.C., Полякова O.A. Наследственный гемохроматоз у детей // Вопросы современной педиатрии. -2004, т. 3- № 5. -с. 118-121.

19. Полякова С.И., Баканов М. И., Потапов А. С. Ферритин: референсные значения у детей // Российский педиатрический журнал.- 2008.-№ 2.-С. 4-7.

20. Романова Е.А., Мигунова Е.В., Васильев С.А. и др. Случай наследственного гемохроматоза с преимущественным поражением суставов // Гематология и трансфузиология : Научно-практический журнал. , 2004. -N 6 . - С. 42-45.

21. Самоходская Л. М.,. Лавров, А. В Ефименко А. Ю. и др. Особенности генетики наследственного гемохроматоза в русской популяции // Медицинская генетика: ежемесячный научно-практический журнал. 2007. -Том 6.-N 1 . - С. 32-35:

22. Серов В.В. Патологическая анатомия. Курс лекций: учеб. пособие для? вузов / В.В. Серов, М.А. Пальцев. — М.: Медицина, 1998. 640 с.

23. Хусаинова P.M., Федорова С.А., Хуснутдинова Э.К. Скрининг Cys282Tyr и ИзбЗАзр-мутаций в гене HFE у народов Волго-Уральского региона и Республики Саха (Якутия) // Мед. генетика. 2003. №5. С. 207-211.

24. Хусаинова Р. И., Хуснутдинова И. Н., Хуснутдинова Э. К. .Анализ мутаций C282Y и H63D в гене гемохроматоза (HFE) в популяциях Средней Азии.// Медицинская генетика.- 2006.-Т.42.-№ 3. -421-426 .

25. Шарандак А. П., Кириченко JI. JL, Королев А. П. , Юнусов М. А. Специфическая кардиомиопатия у больных гемохроматозом // Кардиология : Научно-практический журнал. 2005. - Том 45,N 6 . - С. 96-100.

26. Щербинина С.П., Романова Е.А., Зборовский С.С. Молекулярно-генетическая диагностика наследственного гемохроматоза // Гематол. и трансфузиол. -2005. -Т.50.- № 1.- С. 23-27.

27. Щербинина С.П., Романова Е.А., Левина А.А., Мамукова Ю.И., Цибульская М.М. Диагностическое значение комплексного исследования показателей метаболизма железа в клинической практике // Гематология и трансфузиология.-Т.50.-№5.- 2005.-С.23 28.

28. Adams PC, Kertesz АЕ, McLaren СЕ, Barr R, Bamford A, Chakrabarti S. Population screening for hemochromatosisra comparison of unbound ironbinding capacity, transferrin saturation, and C282Y genotyping in 5,211 blood donors. Hepatology 2000;31:1160-4.

29. Agostinho M.F., Arruda V.R., Basseres D.S., Bordin S., Soares M C, Menezes R.C., Costa F.F., Saad S.T. Mutation analysis of the HFE gene in Brazilian populations/ZBlood Cells Mol. Dis. -1999. -Vol. 25. -P. 324-327.

30. Aguilar-Martinez P., Lok Chun Yu, Cunat Séverine, Cadet E., Robson K.,° Rochette J. Juvenile hemochromatosis caused by a novel combination of hemojuvelin G320V/R176C mutations in a 5-year old girl // Haematologica 2007;92:421-422

31. Alexander J. Kowdley K.V. HFE-associated hereditary hemochromatosis // Genet. In Med.- 2009.- V.ll.-№ 5.- P. 307-313.

32. Allen KJ, Nisselle AE, Collins VR, Williamson R, Delatycki MB. Asymptomatic individuals at genetic risk of hemochromatosis take appropriate steps to prevent disease related to iron overload//Liver Int. 2008 Mar;28(3):363-9.

33. Allen, KJ. Gurrin, L.C. Constantine, et al. Iron overload related disease in HFE hereditary hemochromatosis // N Engl J Med. 2008. - Vol. 358(3). - P. 221-230.

34. Andrews N.C. Disorders of Iron Metabolism. New England Journal of medicine 1999.-vol.341 N26-p.1986-1995.

35. Asberg A, Tretli S, Hveem K, Bjerve KS. Benefit of population-based screening for phenotypic hemochromatosis in young men // Scand J Gastroenterol .- 2002.- V.37.-№ 10.- P.1212-9.

36. Bacon BR, Powell LW, Adams PC, Rresina TF, Hoofiiagle JH. Molecular medicine and hemochromatosis: at the crossroads. Gastroenterology. 1999; 116:

37. Barton J.C., Acton R.T., Prasthofer E.F., Rivers C.A. Hemochromatosis in a Lithuanian with HFE C2S2Y homozygosity and C282Y allele frequencies in the Baltic Sea region//Eur. J. Haematol. -2001. -Vol. 67. -P. 263-264.

38. Barut G., Balci H., Bozdayi M., Hatemi I., Ozcelik D., Senturk H. Screening for iron overload in the Turkish population//Dig. Dis. -2003. -Vol. 21. -P. 279-285.

39. Beckman L.E., Saha N. Spitsyn V., Van Landeghem G., Beckman L. Ethnic differences in the HFE codon 282 (Cys/Tyr) polymorphism//Hum. Hered. -1997. -Vol. 47. -P. 263-267.

40. Beutler E Hemochromatosis: Genetics and Pathophysiology Annu. Rev. Med. 2006. 57:331-47

41. Beutler E., West C., Gelbart T. HLA-H and associated proteins in patients with hemochromatosis // Mol Med. 1997 June; 3(6): P. 397-402.

42. Beutler E: The HFE Cys282Tyr mutation as a necessary but not sufficient cause of clinical hereditary hemochromatosis. Blood 2003; 101: P. 3347- 3350.

43. Beutler E: The significance of the 187G (H63D) mutation in hemochromatosis. Am J Hum Genet 1997.-61:762.-P.2291-301.

44. Beutler, E. Penetrance of 845G~> A (C282Y) HFE hereditary haemochromatosis mutation in the USA / E. Beutler, V.J. Felitti, J.A. Koziol, N.J. Ho, T. Gelbart // Lancet. 2002. - Vol. 359(9302). - P. 211-218.

45. Brissot P et al. Current approach to the management of hemochromatosis. Hematology 2006; P. 36-41.

46. Brissot P., Moirand R., Jouanolle A.M., Guyader D., LeGall J.Y., Deugnier Y., David V. A genotypic study of 217 unrelated« probands diagnosed as «genetic hemochromatosis» on «classical» phenotypic criteria//J. Hepatol. -1999. -Vol. 30. -P. 588-593.

47. Britton, R.S. Pathophysiology of iron toxicity / R.S Britton, G.A. Ramm, J.K. Olynyk, R. Singh, R. O'Neill, B.R. Bacon // Adv Exp Med Biol. 1994. -Vol. 356.-P. 239-253.

48. Britton, R.S. Role of free radicals in liver diseases and hepatic fibrosis / R.S. Britton, B.R. Bacon // Hepatogastroenterology. 1994. - Vol. 41. - P. 343-348. .

49. Burt M.J., George P.M., Upton J.D., Collett JA, Frampton C.M., Chapman T.M., Walmsley T.A., Chapman B.A. The significance of haemochromatosis gene mutations in the general population: implications for screening // Gut. 1998.-V.43.-№ 6.-P. 830-836.

50. Cadet E., Robson K., Rochette J. Juvenile hemochromatosis caused by a novelcombination of hemojuvelin G320V/R176C mutations in a 5-year old girl, //haematologica/the hematology journal 2007; 92(03) P.421-22.

51. Cadet E.D., Capron M. Gallet, M-L Omanga-Lerker, H Boutignon, C Julier, K J H Robson, J Rochette Reverse cascade screening of newborns for hereditary haemochromatosis: a model for other late onset diseases? //J Med Genet 2005; 42:P. 390-395.

52. Camaschella C, Roetto A, De Gobbi M: Genetic haemochromatosis: genes and mutations associated with iron loading. Best Pract Res Clin Haematol 2002; 15: P. 261-276.

53. Camaschella C. Understanding iron homeostasis through genetic analysis of hemochromatosis and related disorders. Blood 2005; 106:P. 3710-3717.

54. Camaschella, C. The gene TFR2 is mutated in a new type of haemochromatosis mapping to 7q22 / C. Camaschella, A. Roetto, A. Cali, M. De Gobbi, G. Garozzo, M. Carella, N. Majorano, A. Totaro, P. Gasparini // Nature Genet.-2000.-Vol. 25.-P. 14-15

55. Castiella A., Zapata E., Juan M., Otazua P., Fernandez J., Zubiaurre L., Arriola J. Significance of H63D homozygosity in a Basque population withhemochromatosis // Journal of Gastroenterology and Hepatology.-2010.-V. 25.-№7.-P. 1295-1298.

56. Catherine Mura, Odile Raguenes, and Claude Fe'rec Blood, Vol 93, No 8 (April 15), 1999: P. 2502-2505

57. Chales G, Guggenbuhl P.When and how should we screen for hereditary hemochromatosis? //Joint Bone Spine. 2003 Aug;70(4):P. 263-70.

58. Chang J.G., Liu T.C., Lin S.F. Rapid diagnosis of the HLA-Hgene Cys 282 Tyr mutation in hemochromatosis by polymerase chainreaction -a very rare mutation in the Chinese population/ZBlood. -1997.-Vol. 89. -P. 3492-3493.

59. Cheng R, Barton JC, Morrison ED, Phatak PD, Krawitt EL, Gordon SC, Kowdley KV. Differences in hepatic phenotype between hemochromatosis patients with HFE C282Y homozygosity and other HFE genotypes // J Clin Gastroenterol. 2009.-V.43.-№ 6.-P. 569-73.

60. Conrad M.E., Umbreit J.H. Iron Absorption and Transport An Update.-Am.J.Hematol., 2000, 64, P.287-298

61. Crawford D.H., Jazwinska E.C., Cullen L.M, Powell L.W. Expression of HLA-linked hemochromatosis in subjects homozygous or heterozygous for the C282Ymutation//Gastroenterology.-1998.-Vol. 114.-P. 1003-1008.

62. Diego C, Murga MJ, Martinez-Castro P. Frequency of HFE H63D, S65C, and C282Y Mutations in Patients with Iron Overload and Controls from Toledo, Spain Genet Test. 2004 Fall;8(3):P. 263-7.

63. Diego C., Opazo S. Murga M., Martinez-Castro P. H63D homozygotes with hyperferritinaemia: is this genotype, the primary cause of iron overload? // European Journal of Haematology. 2007.- V. 78.- P. 66-71.

64. Drakesmith H, Sweetland E, Schimanski L et al: The hemochromatosisprotein HFE inhibits iron export from macrophages. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: P.15602 -15607.

65. Drakesmith H., Townsend A. The structure and function of HFE // BioEssays-2000.- V. 22.- № 7.- P. 595-598.

66. Drakesmith, H. Resistance to hepcidin is conferred by hemochromatosis-associated mutations of ferroportin / H. Drakesmith, L.M. Schimanski, E. Ormerod etal.//Blood.-2005.-Vol. 106(3).-P. 1092-1097.

67. Eaton J.W. Molecular bases of cellular iron toxicity / J.W. Eaton, M. Qian. // Free Radical Biolog and Medicine. 2002. -Vol. 32(9). - P. 833-840.

68. Feder J.N. Gnirke A., Thomas W. et al. A novel MHC class I-like gene is mutated in patients with hereditary haemochromatosis // Nature Genet. 1996. — Vol. 13.-P. 399-408.

69. Fleming R., Sly W. Mechanism of iron accumulation in hereditary hemochromatosis. Annual Review of Physiology 2002 Vol. 64: P. 663-680

70. Migas, C.C. Holden, A. Waheed, R.S. Britton, S. Tomatsu, B.R. Bacon, W.S. Sly // Proc. Nat. Acad. Sei. 2000. - Vol. 97. - P. 2214-2219.

71. Frazer, D.M. Iron Imports. I. Intestinal iron absorption and its regulation;/ D.M. Frazer, G.J. Anderson // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol: 2005. -Vol. 289.-P. G631-G635.

72. Gac G, Dupradeau FY, Mura G et al: Phenotypic expression of the C282Y/Q283P compound heterozygosity in HFE and molecular modeling of the Q283P mutation effect. Blood Cells Mol Dis 2003; 30: P. 231-237.

73. Gac G., Mura C, Ferec C. Complete scanning of the hereditary hemochromatosis gene (HFE) by use of denaturing HPLC//Clin. Chem. -2001. -Vol. 47. -P. 1633-1640.

74. Gac Le G., Ferec C. The molecular genetics of haemochromatosis //European Journal of Human Genetics . 2005.- 13. P;1172-1185.

75. Ganz T. Hepcidin and its role in regulating systemic, iron metabolism// Hematology. 2006; P. 29-35.

76. Hanson EH, Imperatore G, Burke W: HFE gene and hereditary hemochromatosis: a HuGE review. Human Genome Epidemiology. Am J Epidemiol 2001; 154: P.193- 206;

77. Hoppe C, Watson RM, Long CM, Lorey F, Robles L, Klitz W, Styles L, Vichinsky E. Prevalence of HFE mutations in. California newborns, Pediatr Hematol Oncol. 2006 Sep;23(6):P.507-16.

78. Human Gene Mutation Database of Cardiff University // http://www.hgmd.cf.ac.uk/docs/copyright.html

79. Jacobs E.M., Verbeek AL, Kreeftenberg 1IG, van Deursen GT, Marx JJ, Stalenhoef AF, Swinkels DW, de Vries RA. Changing aspects of HFE-relatedI113hereditary haemochromatosis and endeavours to early diagnosis // Neth. J Med.-2007.-V. 65.-№ 11.- P.419-24.

80. Kawabata, H. Molecular cloning of transferrin receptor 2: a new member of the transferrin receptor-like family / H. Kawabata, R. Yang, T. Hirama, P.T. Vuong, S. Kawano, A.F. Gombart, H.P. Koeffler // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274.-P. 20826-20832.

81. King C, Barton D. Best practice guidelines for the molecular genetic diagnosis of Type 1 (HFE-related) hereditary haemochromatosis // BMC Med Genet.-2006.- V. 7.-81.

82. Lazarescu A, Snively BM, Adams PC. Phenotype variation in C282Y homozygotes for the hemochromatosis gene.Clin Gastroenterol Hepatol. 2005 Oct;3(10):P. 1043-6.

83. Lee PL, Barton JC. Hemochromatosis and severe iron overload associated with compound heterozygosity for TFR2 R455Q and two novel mutations TFR2 R396X and G792R.Acta Haematol. 2006; 115(1-2):1P. 02-5.

84. Leone P.E., Gimenez P., Collantes J.C., Paz-Y-Mino С Analysis of HFE gene mutations (C282Y, H63D, and S65C) in the Ecuadorian population//Ann. Hematol. -2005. -Vol. 84. -P. 103-105.

85. Litvinova, M.M. Biochemical signs of hemochromatosis in a cohort of Canadian and Russian patients under 30 years old with different HFE genotype / M.M. Litvinova // European Journal of Human Genetics. 2009. - Vol. 17 (2). -P. 63-64.

86. McKie A.T., Marciani P., Rolfs A. Et al. A Novel Duodenal Iron Regulated Transporter, JRFG-1, Implicated in the Basoleteral Transfer of Iron to the Circulation.-Mol.Cell., 2000, 5, 2, P.299-309

87. McKusick V.A. Hemochromatosis, HFE1 (235200), HFE2A (#602310), HFE2B (606464), HFEF3(604250), HFE4(606069) Neonatal (#231100) OMIM//URL:<http://www.ncbi.nlm.nih> gov/ent-rez/query.fcgi?db=OMIM (2005)

88. McLaren, C.E., McLachlan, G. Halliday J.et al. Powell Distribution of transferring saturation in an Australia population: relevance to the early diagnosis of hemochromatosis // Gastroenterology. 1998. - Vol. 114(3). - P. 543-549.

89. Merryweather-Clarke A.T., Pointon J.J., Shearman J.D., Rob-son K.J. Global prevalence of putative haemochromatosis mutations//J. Med. Genet. -1997. -Vol. 34. -P. 275-278.

90. Merryweather-Clarke AT, Pointon JJ, Jouanolle AM, Rochette J, Robson KJH. // Geography of HFE C282Y and H63D mutations. Genet Test 2000;4:P. 183-98.

91. Muin J. Khoury, M.D., Ph.D., Linda L. McCabe, Ph.D., and Edward R.B. McCabe, M.D., Ph.D. Population Screening in the Age of Genomic Medicine The New England Journal of Medicine 2003, 348:50-583

92. Mura C, Raguenes O, Ferec C. HFE mutations analysis in 711 hemochromatosis probands: evidence for S65C implication in mild form of hemochromatosis //Blood.-1999. V.93.- № 8.-2502-2505.

93. Bennoun, I. Devaux, C. Beaumont, B. Grandchamp, A. Kahn, S. Vaulont // PNAS. 2001. - Vol. 98(15). - P. 8780-8785.

94. Nicolas, G. Hepcidin, a new iron regulatory peptide / G. Nicolas, L. Viatte, M. Bennoun, C. Beaumont, A. Kahn, S. Vaulont // Blood Cells Mol Dis. 2002. -Vol. 29(3).-P. 327-335.

95. Niederau C, Strohmeyer G. Strategies for early diagnosis of haemochromatosis // Eur J Gastroenterol Hepatol.- 2002.- V. 14.-№ 3.-P.217-21.

96. Olynyk J.K., Trinder D., Ramm G.A., Britton R.S., Bacon B.R. Hereditary hemochromatosis in the post-HFE era // Hepatology. -2008.- V.48.-№ 3.- P. 9911001.

97. Ombiga J., Adams L.A., Tang K., Trinder D., Olynyk J.K. Screening for HFE and iron overload //Semin Liver Dis. 2005 Nov;25(4):402-10.

98. Omer Т., Jeanine J. Houwing-Duistermaat R. et al. A population-based study of the effect of the HFE C282Y and H63D mutations on iron metabolism // European Journal of Human Genetics (2003) 11, 225-231.

99. Perez-Aguilar F, Benlloch S, Berenguer M. Study of patients referred for elevated ferritin levels and/or transferrin saturation: significance of non-alcoholic fatty liver disease. Gastroenterol Hepatol. 2004 Nov;27(9): p. 508-14.

100. Pietrangelo A, Caleffi A, Henrion J, Ferrara F, Corradini E, Kulaksiz H, Stremmel W, Andreone P, Garuti C. Juvenile hemochromatosis associated with pathogenic mutations of adult hemochromatosis genes.//Gastroenterology 2005 Feb; 128(2):470-9.

101. Pietrangelo A. A. Pietrangelo, G. Casalgrandi, D. Quaglino, R Gualdi, D. Conte, Si Milani, G. Montosi, L. Cesarini, E. Ventura, G. Cairo // Gastroenterology. 1995. - Vol. 108. - P. 208-217.

102. Pietrangelo A. Hereditary hemochromatosis: a new look at an old disease. N Engl J Med 2004; 350:2383-2397.

103. Pietrapertosa, A., Vitucci A., Campanale D. et al. HFE gene mutations an Apulian population: Allele frequencies // European Journal of Epidemiology. -2003.-Vol. 18(7).-P. 685-690.

104. Pinto J. P Overexpression of HFE in HepG2 cells reveals differences in intracellular distribution and co-localization of wt- and mutated forms /Jorge P. Pinto, P. Ramos, de Sousa M. // Blood Cells, Molecules, and Diseases — 2007. -Vol. 39.-P. 75-81.

105. Pintoa J., Ramosa P., Sousaa M. Overexpression of HFE in HepG2 cells reveals differences in intracellular distribution and co-localization of wt- and mutated forms // Blood Cells, Molecules, and Diseases.-2007.-V. 39.- № 1.- P. 7581.

106. Roetto A., Totaro A., Piperno A., Piga A., Longo F., Gtozzo G., Call A., De Gobbi M., Gasparini P., Camaschella C New mutations inactivating transferrin receptor 2 in hemochromatosis type 3//Blood. -2001. -Vol. 97, №9. -P. 2555-2560.

107. Samarasena J, Winsor W, Lush R, Duggan P, Xie Y, Borgaonkar M. Individuals homozygous for the H63D mutation have significantly elevated iron indexes. Dig Dis Sci.-2006 .-;51(4).- P.803-7.

108. Sheldon, J.H. Haemochromatosis / J.H. Sheldon. London: Oxford Univ Pr,, 1935.-339 p.

109. Trinder D., Fox C., Vautier G., Olynyk J.K. Molecular pathogenesis of iron overload /Gut.- 2002.-51.-290-295.

110. Truksa J, Peng H, Lee P, Beutler E. Bone morphogenetic proteins 2, 4, and 9 stimulate murine hepcidin 1 expression independently of Hfe, transferrin receptor 2 (Tfr2), and IL-6. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 10289-10293.

111. Villiers, J.N.P. Spectrum of mutations in the HFE gene implicated in haemochromatosis and porphyria / J.N.P. de Villiers, R. Hillermann, L. Loubser, M.J. Kotze // Hum. Molec. Genet. 1999. - Vol. 8. - P. 1517-1522.

112. Waalen J, Nordestgaard BG, Beutler E: The penetrance of hereditary hemochromatosis. Best Pract Res Clin Haematol 2005; 18: 203- 220.

113. Zlocha J, Kovacs L, Pozgayova S, Kupcova V, Durinova S. Molecular genetic diagnostics and screening of hereditary hemochromatosis // Vnitr Lek. 2006.-V. 52.- №6.-602-8.