Генетическая гетерогенность и фенотипическое разнообразие гемохроматоза у лиц молодого возраста

Литвинова, Мария Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическая гетерогенность и фенотипическое разнообразие гемохроматоза у лиц молодого возраста
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическая гетерогенность и фенотипическое разнообразие гемохроматоза у лиц молодого возраста"

На правах рукописи

ои^4-----

ЛИТВИНОВА МАРИЯ МИХАЙЛОВНА д 3 ££}-] 2003

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ И ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ГЕМОХРОМАТОЗА У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА

03.00.15.-Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2009

003476333

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН

Научный руководитель: академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Бочков Николай Павлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Журков Вячеслав Серафимович

кандидат медицинских наук Павлов Чавдар Савов

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита состоится « 5 »в «/У» часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при МГНЦ РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан -ЯР«аЛишсыю г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Р-А- Зинченко

Актуальность проблемы

Наследственный гемохроматоз (НГХ) признан одним из наиболее частых аутосомио-рецессивных заболеваний в Европе. Частота данного заболевания среди европеоидов составляет 0,2-0,8%, при этом каждый 10-й человек является гетерозиготным носителем мутации (Worwood М., 1994; Adams P.G. et al., 2005; Володичева Е.М., 2003; Лавров А.В., 2004). Поскольку классическая форма гемохроматоза начинает проявляться в возрасте 40-45 лет, то и обследованный контингент всех предыдущих работ в среднем оказался именно такого возраста. Не было проведено исследований в отношении изменения уровней показателей обмена железа в зависимости от возраста пациентов, а это крайне важно для организации своевременной профилактики клинических проявлений заболевания.

В генетические лаборатории, занимающиеся диагностикой НГХ, наряду с пациентами среднего возраста, довольно часто обращаются молодые люди, и даже родители с детьми. Зачастую исследование на наиболее частые мутации гена HFE, ответственного за развитие классической формы гемохроматоза, таким пациентам не рекомендуют. Происходит это в силу общепринятого мнения о позднем начале проявления данного вида патологии. Действительно, в таких ситуациях часто требуется генетическая диагностика на наличие мутаций в генах других типов гемохроматоза, манифестирующих в более раннем возрасте {HJV, HAMP, FPN1 и др.). В настоящее время, кроме наиболее частой классической формы гемохроматоза (1-й тип), выделяют еще 4 типа: ювенильный (2-й тип), гемохроматоз 3-го, 4-го типов и неопатальный гемохроматоз (Roetto A. et а!., 1999; Camaschella С. et al., 2000; Montosi G. et al., 2001). Молекулярно-генетические основы большинства из перечисленных патологий открыты менее 10 лет назад. И хотя на сегодняшний день нет четких статистических данных о заболеваемости гемохроматозом неклассических типов, такие случаи описаны во многих странах мира. К сожалению, среди российского населения прицельных исследований по всем формам гемохроматоза еще не проводилось. В России применяется генетическая диагностика лишь в отношении классической формы НГХ.

Именно поэтому необходимо проанализировать молекулярно-генетические причины и фенотипическое разнообразие форм гемохроматоза и разработать схему обследования молодых пациентов.

Цель и задачи исследования

Цель: изучение генетических причин и фенотипического разнообразия гемохроматоза у лиц молодого возраста.

Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. Создать и проанализировать базы данных больных с риском НГХ (Канада и Россия) и сформировать группы исследования;

2. Изучить взаимосвязь повышения показателей обмена железа с генотипом UFE и возрастом пациентов;

3. Провести анализ мутационных изменений в генах HJV, НАМР и FPN1 у больных гемохроматозом пациентов молодого возраста;

4. Описать фенотипическое разнообразие НГХ при различных генетических вариантах этого заболевания;

5. Разработать протокол обследования пациентов молодого возраста на предмет генетических причин гемохроматоза.

Научная новизна и практическая значимость В России проблема гемохроматоза молодого возраста еще не поднималась. Впервые проведен анализ зависимости биохимических признаков гемохроматоза у лиц в возрасте до 30 лет от различных генотипов по мутациям C282Y и H63D гена HFE, ответственного за развитие классической формы заболевания (1-й тип НГХ). Это позволило сориентироваться, с какого возраста можно ожидать изменения показателей обмена железа при мутациях гена HFE с целью проведения превентивного лечения.

Кроме того, продемонстрированы особенности течения заболевания у лиц с мутациями в генах других типов НГХ (2А, 2В, 3-го и 4-го типов). Полученные сведения позволили разработать оптимальный протокол молекулярно-генетического обследования молодых пациентов с признаками перегрузки организма железом. Эти сведения могут быть использованы при консультировании пациентов молодого возраста с подозрением на НГХ.

Описана неизвестная ранее мутация в гене ферропортина (FPN1). Таким образом, пополнена мировая база известных мутаций этого гена. Определение молекулярно-генетической причины заболевания в большой семье позволит проводить раннюю генетическую диагностику родственникам пробанда и, в случае положительного результата, своевременно осуществлять профилактику развития клинических симптомов заболевания.

Положения, выносимые на защиту 1. Биохимические признаки наследственного гемохроматоза 1-го типа проявляются в возрасте до 30 лет. Повышение показателей ферритина и насыщения трансферрина в основном наблюдается у гомозигот по мутации C282Y гена HFE.

2. Наличие признаков перегрузки организма железом у лиц подросткового возраста является показанием для проведения молекулярно-генетического анализа на предмет гемохроматоза 1-го типа. Это позволит своевременно начать эффективное лечение по выведению излишка железа из организма.

3. Полученная частота аллеля 282У гена НРЕ у пациентов моложе 30 лет из терапевтических отделений Москвы не отличается от общепопуляционной частоты этой мутации для Московского региона. Следовательно, такие пациенты не относятся к группе риска по гемохроматозу.

4. Обнаружена новая N1850 мутация гена РРМ1, кодирующего трансмембранный белок ферропортин. Гетерозиготное носительство мутации ассоциировано с клиническими и биохимическими признаками гемохроматоза.

5. Гемохроматоз 4-го типа (ген РРИ!) может проявляться смешанным характером показателей метаболизма железа: нормальными уровнями насыщения трансферрина на фоне повышенного ферритина сыворотки крови среди пациентов в возрасте до 20 лет и высокими цифрами обоих показателей у людей более старшего возраста.

6. Настоящая работа продемонстрировала разнообразие генетических причин и широкий фенотипический полиморфизм наследственного гемохроматоза у лиц молодого возраста.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на итоговой научной студенческой конференции «Татьянин день» Школы молодых исследователей «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (работа удостоена медали Н.И. Пирогова за лучшую научную студенческую работу ММА имени И.М. Сеченова 2005г); Итоговой научной конференции по защите дипломных работ выпускников факультета подготовки научно-педагогических кадров ММА имени И.М. Сеченова (Москва, 2006 г.); научных конференциях кафедры медицинской генетики ММА им. И.М. Сеченова; Европейской конференции по генетике человека 2009 (Вена, Австрия, 2009 г.). Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании ученого совета МГНЦ РАМН 10 июня 2009 года.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации.

Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, проанализированы базы данных больных с подозрением на НГХ, сформированы соответствующие группы обследования. Разработку протоколов секвенирования и непосредственный анализ генов ШУ, НАМР, РРШ осуществляла самостоятельно. Также у части больных проводила генотипирование НРЕ на предмет наличия мутаций С282У и НбЗБ. Автор провел статистический анализ всех

полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты своей работы в различных научных журналах.

Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в 9 печатных работах. Из них 5 статей (2 в отечественных и 3 в зарубежных журналах) и 4 тезисов. Две статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук. Внедрение результатов работы в клиническую практику. Результаты работы внедрены в клиническую практику и используются при медико-генетическом консультировании пациентов в МГНЦ РАМН и ММА им. И.М. Сеченова. Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы (161 наименование). Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами и 25 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Формирование выборок. Для формирования выборок пациентов были использованы база данных пациентов с риском гемохроматоза (Центр здоровья детей и женщин Британской Колумбии, Ванкувер, Канада) и база данных пациентов терапевтического профиля (лаборатория мутагенеза, МГНЦ РАМН, Москва, Россия). В первую базу вошли пациенты с клиническими и/или биохимическими признаками НГХ, а так же пациенты с семейной историей данного заболевания. Вторая база состояла из пациентов отделений гастроэнтерологии, гепатологии, кардиологии и эндокринологии (предполагаемые группы риска по наличию НГХ). В центре здоровья детей и женщин Британской Колумбии на каждого пациента, вошедшего в базу, заполнялась анкета, в которой отражалась история заболевания (возраст манифестации, наличие клинических признаков, биохимические маркёры заболевания, проводимая терапия и пр.).

В группу исследования были отобраны пациенты в возрасте до 30 лет. Канадская выборка молодых пациентов составила 201 человек, выборка пациентов русской популяции - 137 человек. Все пациенты были генотипированы на наличие мутаций C282Y и H63D гена HFE. Канадская база данных содержала информацию об уровнях ферритина и насыщения трансферрина (основные показатели обмена железа в организме) на всех пациентов. Из 137 русских больных лишь 24 человека были обследованы с точки зрения обмена железа. В связи со столь малым количеством обследованных русских пациентов, анализ корреляции генотип-фенотип осуществлялся на пациентах канадского происхождения.

Показатели железа. Уровни ферритина и трансферрина канадских больных определялись с использованием N Latex Ferritin и N Antisera to Human Transferrin методик (Dade Behring Inc., Newark, USA). Уровень железа измерялся с помощью VITROS Dry chemistry Fe slides и VITROS 250 и 950 химических систем (Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Rochester, NY, USA).

Референсные значения показателей ферритина и насыщения трансферрина отличаются в зависимости от пола и возраста обследуемого. В качестве критерия превышения нормы использовалась таблица норм, разработанная на основании исследования местной популяции в биохимической лаборатории Центра здоровья детей и женщин Британской Колумбии (Ванкувер, Канада) (табл. 1) (Lockitch G. et al., 1988).

Таблица 1.

Уровень ферритина и насыщения трансферрина у здоровых людей в зависимости от пола и возраста_

Возраст Ферритин, мкг/л Насыщение трансферрина, %

Мужчины | Женщины Мужчины Женщины

0-7 дней 6-400 7-44

8 дней - 5 лет 9-30

6-9 лет 13-66 17-42

10-13 лет 29-84 9-49 11-36 | 2-40

14-17 лет 6-33

18-19 лет 15-250 10-200

20-50 лет 6-45

51-70 лет 15-370 10-225

>71 лет 15-410 10-160

Генотипирование на наличие мутаций C282V и H63D гена 11FE (НГХ 1-го типа)

ДНК выделяли из цельной крови с помощью коммерческих наборов ДНК-Экспресс («Литех», Россия) и Puregene DNA Purification Kit (Gentra Systems, Minneapolis, MN, USA).

Генотипирование пациентов осуществлялось с использованием праймеров, указанных в табл. 2. В России ПЦР смесь состояла из 0,2шМ каждого дНТФ, 1,5тМ (для C282Y) и 2,5тМ (для H63D) MgCl2l 0,6цМ каждого праймера, 0,04U Taq ДНК-полимеразы и ~100нг ДНК в общем объёме реакции 25 (xL. Температурная программа: 95°С - 5мин; 30 циклов: 94°С - 40сек, 59°С (дам C282Y) или 65°С (для H63D) - 40сек, 72°С - 40сек; далее 72°С - 5мин; 10°С - хранение. В Канаде для ПЦР смеси использовали 0,2тМ каждого дНТФ, l,5mM MgC12, 1,25цМ каждого праймера, 0,025U Taq ДНК-полимеразы и ~100нг ДНК в общем объёме реакции 25jiL.

Температурная программа была одинаковой для обеих мутаций: 94°С - 5мин; 29 циклов: 94°С - ЗОсек, 55°С - ЗОсек, 72°С - Шин; далее 72°С - 7мин; 4°С - хранение.

Таблица 2.

Последовательность праймеров для генотипирования на наличие мутаций гена ЯРЕ

Мутация Праймер Сиквенс (5'-3') Продукт

гена (пн)

HFE

Россия

C282Y F CTACCCCCAGAACATCACCA 394

R CTCCAATGACTAGGGTGCCA

H63D F AAGCTTTGGGCTACGTGGATGATCAG 212

R CCCTCTCCACATACCCTTGCTG

Канада

C282Y F TGGCAAGGGTAAACAGATCC 389

R TACCTCCTCAGGCACTCCTC

H63D F ACATGGTTAAGGCCTGTTGC 208

R GCCACATCTGGCTTGAAATT

Рестрикционный анализ проводили с помощью ферментов Rsal и Ksp22I или DpnII для детекции C282Y и H63D у русских и канадских пациентов, соответственно («СибЭнзим», Россия и New England BioLabs Inc., Canada). Продукты рестрикции разделялись на 1,8% агарозном или 6% полиакриламидном геле. Молекулярно-генетическое исследование других генов гемохроматоза

Из группы молодых канадских пациентов с риском гемохроматоза было просеквенировано 52 человека на наличие мутаций в генах других типов НГХ, манифестирующих в раннем возрасте (гены HJV, НАМР и FPN1). При этом 39 человек просе квенированы на наличие мутаций в генах HJV и НАМР, 18 пациентов -на наличие мутаций в гене FPN1. Секвенирование генов HJV, НАМР и FPN1

ПЦР: Условия ПЦР и последовательность нуклеотидов праймеров, использованных для амплификации экзонов генов гемоювелина (HJV), гепсидина (НАМР) и ферропортина (FPN1) указаны в табл. 3. ПЦР всех экзонов проводились согласно следующей программе: 94°С - 5мин; 29 циклов: 94СС - ЗОсек, соответствующей температуры отжига (табл. 3) - ЗОсек, 72°С - 1мин; далее 72°С - 5мин; 4°С - хранение. Для всех анализируемых экзонов использовалась Taq ДНК полимераза из GIBCO-In Vitrogen Canada (Canadian Life Technologies/In Vitrogen Canada). Секвенирование: В целях последующего секвенирования сразу за ПЦР проводили электрофорез в 0,8% агарозном геле с последующей экстракцией и очищением ПЦР продуктов с использованием QAquick Gel Extraction Kit (метод микроцентрифуг) (QIAGEN Inc., Canada). Для определения концентрации полученных продуктов

проводили электрофорез в 2% агарозном геле, используя low DNA mass ladder (Canadian Life Technologies/In Vitrogen Canada). Для подготовки пробы к секвенированию использовали BigDye Terminator Ready Reaction Mix (Applied Biosystems, USA), соответствующее количество очищенного ПЦР продукта (табл. 3) и стандартные условия, рекомендуемые производителем. Секвенирование осуществляли на ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer. Результаты анализировали с использованием ABI Prism SeqScape Software версии 2,1 (Applied Biosystems, USA). Рестрикционный анализ; Для проведения рестрикционного анализа 138пн ампликона гена FPN1 использовалась рестриктаза Ahdl (New England BioLabs Inc., Canada). Реакция проводилась в условиях 37°С в течение 2 часов, за которой следовал электрофорез в 6% полиакриламидном геле. Замена A>G в составе праймера 6RM создаёт сайт распознавания для рестриктазы Ahdl. В результате, 138пн ампликон разрезается с образованием 115пн и 23пн фрагментов. Лица, гомозиготные по аллелю wt, продуцируют один 138пн фрагмент, в то время как гетерозиготы по мутантному аллелю-2 фрагмента-138пн и 115пн. Статистическая обработка

Статистическую обработку проводили с использованием программы Exel Microsoft Office ("Microsoft"). При анализе предполагаемых различий между выборками исходили из нуль-гипотезы об отсутствии различий, которую проверяли с помощью расчета критерия X1 и его сравнения с табличными данными. При малочисленных группах использовали критерий X2 с поправкой Йетца. Уровень значимости р<0,05 был принят достаточным для признали» различий достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Мутации C282Y и H63D гена IIFE как причина гемохроматоза у лиц молодого возраста.

Распределение частот мутаций H FE

Из 137 человек русской выборки пациентов женщины составили 36%, мужчины - 64%. В канадской выборке, состоявшей из 201 пациента, соотношение лиц женского пола к лицам мужского было приблизительно одинаковым (женщины 51%, мужчины 49%). Средний возраст пациентов русской выборки составил 21 год, аналогичный показатель для канадской выборки - 22 года.

При расчете распределений по различным генотипам C282Y/H63D гена HFE получены следующие данные: для России YY/HH - 0%, CY/HD - 3%, CY/HH - 6%, CC/HD - 28%, CC/DD - 3%, СС/НН - 60%; для Канады YY/HH - 17%, CY/HD - 15%, CY/HH - 37%, CC/HD -13%, CC/DD -1%, СС/НН -17% (рис. 1).

Таблица 3.

Последовательность праймеров и условия амплификации генов ШУ, НАМР и N1

Экзон Пранмер Сиквенс (5'-3') Продукт (пн) Объём реакции (мкл) £ Е, "3 Т отжига (°С) Количество ампликона Л.г-Ч

Я/И

1 1Р 1Ы ТСАСАСААОСТСОААТТСОА ОАОАСАТССААСТАООТОТТТСТАА 500 30 1,5 60 10

2 2Р 2Я ССССАААТТССАОТСТСТТ СТСАТТСАСССТСАСАТОС 382 30 1,5 60 8

3 ЗР зя АСАСТССОАТАОАССАОАОО ОСАОСАТТССТСТТСААТАО 712 30 1,5 60 12

4 4аР 4аЯ ТОСАСТОААСССААААТСАА ООАССТААОАОССТТССТСА 625 30 1,5 60 15,5

4ЬР 4ЬЯ АСТТТАССОГСОСАССТСАС ССТАСОСССТССТТССПТА 263 30 1,5 60 4

4сР 4сЯ АТССТСООООАОСТАТААСС ТССТТТСАОСТСТТСССТСТ 649 30 1,5 60 15

4с1Р ССОССТСТТСАССААТТПТ ТАСТТССОАОСССТСТТТСА 491 30 1,5 60 8

НАМР

1 1Р Ж ТТСССССТТАТСТСТСССОССТТ СТСТСССАТСССТССТССССТС 321 60 1,8 69 10

23 2-ЗР 2-ЗЯ ТТТАААССАСТТСОАОАООАОСАСО ТСООСАОАОАОАААООАСААСАОА 482 30 1,5 69 10

FPN1 (*праймер, содержащий замену нуклеотидов)

1 № т ААООТТСАСОООАССТСОТСТССС СТСОТСТАОАСТТССТТСТСТССА 572 100 2,5 68 10

2 2Р ж АТТСтаСССТСАОСТСАТТААСТО ААСТООААОТТСОСТТААТАСААС 221 100 2,5 65 4

3 ЗЯ СТСТСАТААТСТАСССАССААОТС СТАОСТСАООСАТТСОТСССАТСА 326 100 2,5 65 5

4 4Р 4Я ОТСТСОАТАЛСААСАСТСТСАСТС АТАСТТААТОАСТСССТСТТСТСО 373 100 2,5 68 5

5 5Р 5Я ТАТСТАСАСТОТОСТАААСТСАСА ССОАТТТАААОТСААТССТААСАТ 239 100 2,5 65 5

6 6Р 6Я ТАТТСТСТАААТСОССАСТСТСТС ОАТСТТСАССААСАТТТААООТСТ 382 75 2,0 60 6

61Ш* ТСОССААСАСССАТСООООАСААО 138 25 2,0 60

7 711 теАСАСТТСАТСАТТАТТССТТОО ТААТССАТТСТСГОААССТАСАТТ 897 100 2,5 65 23

8 8Р 8Я СТАТАТТТТССАТАТСТСААСАОА ТТСТАТСТАСТСАТОАОАААТАОО 690 75 2,0 60 17

сс* 601

СУМ)

15%

СУНН

37*

Рис. 1. Распределение генотипов С282У и Н630 гена НЕЕ в группе больных моложе 30 лет (а - Россия; б - Канада)

Русская выборка пациентов состояла из людей, проходивших обследование и лечение в отделениях гастроэнтерологии, гепатологии, кардиологии и эндокринологии. Такое формирование группы было продиктовано спектром клинических симптомов гемохроматоза, которые включают в себя, прежде всего, поражение желудочно-кишечного тракта и печени, сердечно-сосудистую патологию и нарушение со стороны работы желёз внутренней секреции. Именно поэтому изначально мы предполагали, что группа пациентов, названных нами пациентами терапевтического профиля, может рассматриваться в качестве группы риска по наличию гемохроматоза. Однако полученное в этой группе пациентов распределение частот генотипов по двум самым частым мутациям (С282У и НбЗЭ) гена НЕЕ, ответственного за развитие классической формы заболевания, опровергло эту гипотезу. Частоты аллелей 282У и 630 в группе пациентов терапевтического профиля не превышали общепопуляционных частот, полученных для Московского региона. Последнее свидетельствует в пользу того, что данная группа пациентов не относится к группе риска по НГХ 1 -го типа (табл. 4).

Канадская группа молодых пациентов с риском НГХ была сформирована по более жестким критериям, которые включали в себя наличие клинических или биохимических признаков заболевания и/или семейной истории гемохроматоза. Частота аллеля 282У в этой группе пациентов составила 43,03% и значительно превышала общепопуляционную частоту этого аллеля - 4,3% (&гоиагс1 I. е1 а1., 2002). Частота гомозиготного по мутации С282У генотипа оказалась равной 17,41%. В то же время, установленная частота аллеля 63П не отличалась от общепопуляционной (табл. 4). Обнаруженное «обогащение» группы канадских пациентов мутацией С282У гена НЕЕ, говорит о том, что использованные критерии формирования группы риска по НГХ оправданы и достаточны.

Распределение частот аллелей и генотипов, как в российской, так и в канадской группе пациентов соответствовало закону Харди-Вайнберга.

Таблица 4.

Частоты аллелей и генотипов по мутациям С282У и Н630 гена НЕЕ в исследуемых группах. Для сравнения приводятся общепопуляционные частоты

Аллель/ генотип Канада Россия

пациенты с риском НГХ (201 человек), % общая популяция (881 новорожденный) *, % пациенты терапевтического профиля (137 человек), % общая популяция (840 доноров)**, %

С 56,97 95,69 95,62 96,5

У 43,03 4,31 4,38 3,5

СС 31,34 91,37 91,24 93,4

СУ 51,24 8,63 8,76 6,4

УУ 17,41 0 0 0,2

Н 84,83 80,99 81,39 84,8

О 15,17 17,76 18,61 15,2

НН 70,65 65,61 65,69 72,5

НО 28,36 30,76 31,39 24,6

БО 1 2,38 2,92 2,9

* Girouard J. et al., 2002; ** Самоходская JI.M. и др. 2007

Корреляция генотип-фенотип

Как уже упоминалось ранее, из-за недостаточно полного обследования русских пациентов в отношении параметров обмена железа, анализ корреляции генотип-фенотип осуществлялся только на пациентах канадского происхождения.

Для изучения связи мутаций с повышением показателей обмена железа, из канадской группы пациентов до 30 лет были отобраны больные с повышенными уровнями ферритина и/или насыщения трансферрина. Группа составила 107 человек. Средний возраст пациентов этой группы оказался 23 года, при этом 57% составили мужчины, 43% - лица женского пола. Остальные пациенты вошли в группу с нормальными показателями (п=94). В этой группе средний возраст составил 21 год, 40% - мужчины, 60% - женщины. Распределение пациентов по возрасту в обеих группах указано в табл. 5.

Таблица 5.

Распределение канадских пациентов с повышенными и с нормальными показателями

обмена железа по возрасту

Возраст Пациенты с повышенными показателями железа Пациенты с нормальными показателями железа

число % число %

1-10 лет 5 4,7 И 11,7

11-20 лет 33 30,8 30 31,9

21-30 лет 69 64,5 53 56,4

Всего 107 100,0 94 100,0

Частота лиц с генотипом УУ резко отличалась в двух группах. В выборке

пациентов с нормальными показателями ферритина и насыщения трансферрииа частота этого генотипа составила 1,06%, в то время как в группе пациентов с повышенными показателями она была 31,78% (р«0,001; Х2=30,38 с учетом поправки Йетца на множественные сравнения). Количество гетерозиготных носителей мутации С282У, наоборот, увеличилось в группе пациентов с нормальными уровнями железа по сравнению с группой с повышенными показателями (61,70% против 42,06%, р=0,05). В целом, частота аллеля 282У в группе с повышенными показателями возросла до 52,80% против 31,91% в группе с нормальным уровнем железа (р«0,001; Х2=17,81) (табл. 6).

Таблица 6.

Сравнение частот С282У и Н63Б в канадской группе пациентов с повышенными и с

нормальными показателями обмена железа

Генотип НЕЕ (С282У/Н63Б) Группа с повышенными показателями железа (Р~490,66мкг/л; Т8~70%) Группа с нормальными показателями железа (Г~62,97мкг/л; Т8-27%)

Полученные Ожидаемые Полученные Ожидаемые

число % % число % %

УУ 34 31,78 27,88 1 1,06 10,18

СУ 45 42,06 49,84 58 61,70 43,46

сс 28 26,17 22,28 35 37,23 46,36

У 113 52,80 60 31,91

с 101 47,20 128 68,09

РО 1 0,93 2,38 1 1,06 2,22

НП 31 28,97 26,08 26 27,66 25,35

нн 75 70,09 71,54 67 71,28 72,44

О 33 15,42 28 14,89

н 181 84,58 160 85,11

По частотам аллелей и генотипов мутации Н63В различий между двумя

группами обнаружено не было. Данный факт свидетельствует в пользу того, что именно мутация С282У, а точнее гомозиготность по этой мутации, вносит

наибольший вклад в повышение показателей ферритина и насыщения трансферрина у молодых лиц с признаками НГХ в канадской популяции.

Для того чтобы понять, с какого возраста целесообразнее начинать проводить генетическую диагностику НГХ 1-го типа у пациентов с повышенными показателями железа выборка канадских пациентов была подразделена на 3 группы: 0-10 лет, 11-20 лет, 21-30 лет. Соотношение лиц по возрастам между группой пациентов с повышенными и с нормальными показателями железа не отличалось друг от друга (р=0,16) (табл. 5). Последнее свидетельствует в пользу того, что повышение показателей ферритина и насыщения трансферрина не зависит от возраста.

Поскольку, группа лиц с повышенными показателями обмена железа «обогащена» гомозиготами по мутации C282Y, а повышение уровней ферритина и насыщения трансферрина не зависит от возраста, то исключать НГХ 1-го типа следовало бы среди пациентов всех возрастов. К сожалению, в нашей группе гомозиготных по C282Y пациентов младше 14 лет не оказалось. Поэтому определенно можно говорить лишь о возрастном уровне отсечки в 14 лет, т.е. подростковом возрасте (рис. 2).

Графики показывают, что после этого возраста практически у всех пациентов уровни ферритина и насыщения трансферрина уже повышены. При этом уровень ферритина у разных людей варьирует в больших пределах, тогда как уровень насыщения трансферрина у всех кроме двух пациентов оказался выше нормы. Для исключения влияния на показатели наличия мутаций в других генах, связанных с обменом железа в организме, 22 пациента этой группы были просеквенированы на наличие мутаций в генах гемоювелина (HJV) и гепсидина (НАМР). Ни у одного из них мутаций в указанных генах найдено не было.

Обнаруженная особенность проявления биохимических маркёров НГХ 1-го типа у молодых лиц, гомозиготных по мутации C282Y HFE, позволяет сделать вывод о целесообразности проведения молекулярно-генетического анализа на наличие мутаций в гене HFE детям и подросткам с признаками перегрузки организма железом. Это позволит своевременно, не дожидаясь манифестации клинических симптомов, начать эффективное лечение по выведению излишка железа из организма.

а ..---"-

->-«-I-г

, Предел нормы муж . жен

♦жен □ муж

Возраст, года

1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

□ ♦

0 15

♦

1 □ □ * □ ♦

' жен □ муж

....... Усрвднедоый урсвеи» предела норыы

Возраст, годы

Рис. 2. Уровни ферритина (А) и насыщения трансферрина (Б) у канадских пациентов, гомозиготных по мутации С282У гена //ЕЕ, в зависимости от пола и возраста

2. Молекулярно-генетические причины гемохроматоза молодого возраста, не связанного с мутациями гена НР'Е

В качестве попытки обнаружения других причин гемохроматоза у молодых лиц группы риска канадского происхождения было проведено секвенирование кодирующих областей и экзон-интронных соединений генов ШУ, НАМР и Семья с мутацией в генеШУ

Пробанд 3. в возрасте 13 лет обратился в больницу для обследования по поводу задержки полового развития. При обследовании гормонального статуса пациента было выявлено низкое содержание тестостерона. В возрасте 18 лет после обнаружения выраженной кардиомиопатии, требовавшей сердечной трансплантации, был заподозрен диагноз ювенильного гемохроматоза. Определение показателей обмена железа выявило значительное увеличение уровней ферритина (1328мкг/л) и насыщения трансферрина (100%). Сразу были назначены лечебные флеботомии, которые вскоре привели к значительному улучшению сердечной функции, в результате чего. пациент больше не нуждался в трансплантации. Оказалось, что старший брат пробавда (Л, 21 год) тоже обладал очень высокими показателями обмена железа (ферритин 2467мкг/л; насыщение трансферрина 96%). Интересен тот факт, что даже при таких высоких показателях у него не было диагностировано ни гипогонадизма, ни нарушения сердечной деятельности. Сестра-близнец пробанда не проявляла ни клинических, ни биохимических признаков гемохроматоза (рис. 3).

Пробанд и его родственники первой степени родства были протестированы на наличие мутаций в генах Н1У, НАМР и Также они были обследованы на

наличие частых мутаций С282У и НбЗБ гена НЕЕ. В генах НАМР и РРЫ1 никаких мутаций обнаружено не было. В 4-м экзоне гена ШУ зарегистрирована наиболее часто встречаемая среди пациентов с признаками ювенильного гемохроматоза мутация С320У. На основании гаплотипирования, проведенного в содружественной лаборатории, оказалось, что отец пробанда является гетерозиготным носителем делеции в гене ЯУК, а пробанд и его брат - компаундными гетерозиготами 0320\7<3е1. Здоровая сестра пробанда оказалась гетерозиготной носительницей делеции, унаследованной от отца, второй нормальный аллель она унаследовала от гетерозиготной по мутации С320У матери. Все сибсы обследованной канадской семьи западноевропейского происхождения так же были гетерозиготными носителями мутации С282У гена ЙР£.

И ?

и ■

О, 21 год НРБ: СУ/НН Р. 2467цдЛ ТБ 96%

Рис. 3. Родословная семейного случая ювенильного гемохроматоза 2А типа

Известно, что мутация Б320У гена ШУ сопровождается уменьшением уровня гепсидина в моче (Рарашко1аои в., 2004). Гепсидин, являясь ключевым регулятором гомеостаза обмена железа в организме, осуществляет контроль за абсорбцией элемента в кишечнике. При нарушении его влияния на этот процесс в организме начинает накапливаться чрезмерное количество железа.

Таким образом, диагноз ювенильного гемохроматоза 2А типа в описанной семье был подтвержден молекулярно-генетически. На примере описанной семьи видно, что при одинаковом патологическом генотипе даже у родственников (пробанд и его брат) проявления заболевания могут сильно варьировать. Безусловно, существует целый ряд как генетических, так и средовых модифицирующих факторов, влияющих на степень выраженности признаков патологического состояния. К сожалению, на сегодняшний день большинство из них пока не известно. Семья с заменами ДНК в генах НАМР и /•'ЛУ/

Пробанд 23-х лет обладал повышенными уровнями ферритина ЗЗбмкг/л и насыщения трансфсррина 94% и жаловался на чувство чрезмерной утомляемости, впервые появившееся в возрасте 21 год (рис. 4). Генотипирование на наличие мутации С282У в гене НЕЕ определило нормальный генотип. Секвенирование генов ff.IV, НАМР и №Л7 выявило несколько изменений: гомозиготное состояние по неизвестной замене во 2-м интроне гена НАМР (1У82+12А>С) и гетерозиготное носительство замены 1У84+20С>Т в 4-м интроне гена ЕРЫ!.

45 лет

'РЕ: СС/НН . 90||д/|_

3 26%

I., 44 года

НРБ: СУ/НН Р. 26цд/1_ ТЭ 21%

лет НРЕ: СУ/НН 1323цд/|_ ТБ 100%

Гетерозиготы по (1е1 <Н.Л/) М и Ж

ШКоипаундные гетерозиготы в320У/<1е| <НЛ/) и ^^ Гвтерозигота по взгОУ (Н-ГУ) Ж

№ЕС282У/Н630

Р, 19лет НРБ: СУ/НН Р. ЗОцд/1. Тв 24%

Н. 23 года F 336;j? L TS9-T

F. пет F Шде*. tsi-

FPN1 НАМР

i\"s4+:oc-T (rclcytmnoia)

I\S2+I:AС

(гомофпота) I\TW+liA>C

(гстеро-я1гота)

Рис. 4. Родос лонная пациента с признаками ювенильного гемохроматоза

Для более четкого понимания значимости обнаруженных изменений в развитии признаков гемохроматоза было решено проанализировать остальных членов семьи пробанда (брат, отец и мать). Все родственники пробанда 1 -ой степени родства имели нормальные показатели обмена железа. При секвенировании брата и матери было выявлено гетерозиготное носительство по обеим нуклеотидным заменам. Отец пробанда оказался гетерозиготой по замене IVS2+12A>C в гене НАМР, но не был носителем второй замены в гене FPN1. Из характера распределения биохимических показателей обмена железа и генотипа родственников 1-ой степени родства складывается впечатление о большей значимости замены НАМР. К тому же обнаруженная замена гена НАМР (IVS2+12A>C), находилась значительно ближе к экзон-интронному сочленению (12-е положение). Известно, что по мере удаления от экзон-интронного сочленения вероятность влияния изменения ДНК на функционирование гена уменьшается. В то же время, в пользу значимости этой замены свидетельствует тот факт, что она была обнаружена в гомозиготном состоянии лишь у пробанда с ярковыраженными клиническими и биохимическими признаками НГХ. Гетерозиготное носительство замены гена НАМР даже у людей в значительно более позднем возрасте (мать, 51 год и отец, 53 года) не приводило ни к каким проявлениям. Безусловно, для однозначного ответа на вопрос, является ли замена IVS2+12A>C гена НАМР значимой для развития заболевания, необходимо более детальное её изучение. Большая семья с новой мутацией в гене FPN1

В клинику обратилась женщина с 4-мя детьми. Самой женщине 42 лет, родом из канадской семьи скандинавского происхождения, на основании жалоб на боли в суставах и животе, а также высоких показателей ферритина сыворотки крови 2248

мкг/л (N 10-200 мкг/л) и насыщения трансферрина 65% (N < 45%) ранее был поставлен диагноз гемохроматоза. У всех детей женщины (15-20 лет) отмечены высокие уровни ферритина (274-977мкг/л) на фоне нормальных показателей насыщения трансферрина (25-46%). Незадолго до этого на основании клинических проявлений артралгии и гиперпигментации кожи, а также уровня ферритина 8000 мкг/л и насыщения трансферрина 92%, сестре отца пробанда (Ш.З) был так же поставлен диагноз гемохроматоза (рис. 5).

Пробанд и его ближайшие родственники были проанализированы на наличие мутаций C282Y и H63D в гене HFE. Диагноз гемохроматоза 1-го типа не подтвердился. Поскольку у детей пробанда (15-20 лет) отмечены высокие уровни ферритина на фоне нормальных показателей насыщения трансферрина, что было описано для гемохроматоза 4-го типа, было решено провести секвенирование ДНК пробанда и её ближайших родственников на наличие мутаций в гене ферропортина (FPN1; SLC40A1).

В результате секвенирования гена ферропортина было обнаружено гетерозиготное носительство неизвестной ранее мутации N185D (c.553A>G) пробандом и всеми детьми, в то время как муж имел генотип дикого типа. После обнаружения мутации ещё 21 член 4-х поколений семьи со стороны отца пробанда был протестирован на наличие N185D с помощью методики рестрикционного анализа. Наличие мутации N185D в гетерозиготной форме ассоциировалось с клиническим и биохимическим диагнозом гемохроматоза (р«0,001; Х2=13,4) (рис.

5).

Одиночная замена нуклеотида c.553A>G находится в 6-м экзоне гена и ведёт к замене аспарагиновой кислоты на аспарагин в позиции 185-ой аминокислоты белка ферропортина (N185D). Согласно последней предположительной модели строения белка ферропотина, мутация N185D вызывает изменение структуры аминокислотной последовательности на границе внутриклеточного и трансмембранного доменов (Liu Х-В. et al., 2005). Использование специальных браузеров (UCSC genome browser (http://genome.ucsc.ed u/V) не определило данную замену нуклеотидов как полиморфизм. Более того, скрининг ДНК 50-ти контрольных образцов не обнаружил этой мутации. Данная нуклеотидная замена находится в последовательности 28 аминокислот (173 - 200), консервативной для различных видов животных. Это указывает на важную роль этого участка для обеспечения правильного строения и адекватного функционирования протеина.

010

0& Щ

&ТШ

3 4

5 6

Odúdaééñ

234 5 6 7 89

•ÉH

ij 2 3 4

10 11

aim

5 6 7 8

1 2

Рис. 5. Родословная семейного случая гемохроматоза 4-го типа Женщины обозначены круглыми знаками, мужчины - квадратными. Закрашенные знаки -носители мутации N185D гена FPN1 с клиническими и/или биохимическими проявлениями, заштрихованный знак - пресимлтоматический носитель мутации. Пронумерованные лица, за исключением Ш.7, протестированы на наличие N185D.

Пробанд слабо реагировала на лечение терапевтическими флеботомиями, вскоре после начала которых у неё развилась анемия. Врачами был разработан индивидуальный режим кровопусканий данной больной. Трое из четверых детей V.5, V.6, V.7 и V.8 двух сестёр, носительниц мутации, с установленным диагнозом гемохроматоза, находящихся на лечении флеботомиями, тоже оказались носителями N185D. В силу слишком юного возраста пациенты не проявляли клинических симптомов заболевания. Однако биохимическое исследование показателей железа двоих из носителей N185D мутации б-ти летних мальчиков-близнецов (V.6; V.7) выявило высокие показатели ферритина сыворотки крови (109; 220 мкг/л) (N 13-66 мкг/л). Анализ биохимического фенотипа носителей N185D мутации выявляет повышенные уровни ферритина крови во всех случаях, для которых информация об этом показателе была доступна. Важно отметить, что наблюдается тенденция к росту показателей железа в зависимости от возраста (рис. 6).

Все мутации гена №Л7 подразделяются на 2 основных типа: потери функции и усиления функции. Обнаруженная нами мутация N1850, по всей видимости, относится к группе потери функции, т.к. биохимические характеристики её носителей очень похожи на аналогичные при носительстве описанной ранее и отнесенной к этой группе мутации А11Т) (рис. 6). Последняя ведёт к потере функции ферропортина, обусловливая неспособность ретикулоэндотелиальных клеток выводить железо из их внутриклеточной среды. В такой форме Ре не доступно для эритропоэза, что, в свою очередь, усиливает абсорбцию элемента в тонком кишечнике. А

Ферритин

мсг/л 10000

гооо

6000 "I

4000 О

2000 0

ПО*»

го

Возраст, годы

100 80 60 40

О -1

Насыщение трансферрина ♦

♦ ♦ ♦

□ ^

ап"

20 40 60 80

Возраст, годы

♦ А770 (Рю1гапде!о е1 а1, 19Э9)

О N1850 (настоящая работа)

Рис. 6. Концентрация ферритина (А) и уровень насыщения трансферрина (Б) в зависимости от возраста (на момент постановки диагноза) у носителей мутации N1850 в сравнении с носителями описанной ранее мутации А77Б гена РРЫ1

На основании проведенного исследования, а также используя данные литературы, был разработан протокол молекулярно-генетического обследования пациентов молодого возраста на' предмет диагностики различных типов гемохроматоза (рис. 7).

Клинические и биохимические признаки НГХ у лиц молодого возраста

Генотипироваже НРЕ (С282У и Н630) лг \

Гомозигота Друпте

С232У генотипы

Диагноз НГХ 1-го типа подтвержден

Диагноз НГХ 4-го типа подтвержден

Высокий ферритин и нормал»ный уровень насыщения трансферрина в детском и подростковой возрасте

Анализ гена ЯРМ *

У162йе| А770

X \

Секвенирование

1 1 да нет

Гипогонадизм. сердечнососудистая патология на фоне очень высоких уровней ферритина и насыщения трансферрина

Анализ гена ШУ

С3320\/ нет да

1 1

Секвенирование

1 1

нет да -

Секвенирование гена НАМР

I 1

Диагноз НГХ 2-го А типа подтвержден

Да-

Диагноз НГХ 2-го В типа подтвержден

Поиск мутаций в других генах обыена железа

Секвенирование гена ТРР2

I I

<-нет да

Диагноз НГХ 3-го типа подтвержден

Рис. 7. Протокол молекулярно-генетического обследования пациентов молодого возраста с признаками НГХ

ВЫВОДЫ

1. Биохимические признаки наследственного гемохроматоза 1-го типа проявляются уже в возрасте до 30 лет. Большинство пациентов с повышенными показателями ферритина и насыщения трансферрина являются гомозиготами по мутации С282У гена ШЕ, т.е. больны наследственным гемохроматозом.

не дожидаясь манифестации клинических симптомов, начать эффективное лечение по выведению излишка железа из организма.

3. Полученная частота аллеля 282Y гена HFE у пациентов терапевтических отделений моложе 30 лет в Москве не отличается от общепопуляционной частоты этой мутации для Московского региона. Следовательно, такие пациенты не относятся к группе риска по гемохроматозу.

4. Исследование большой семьи с признаками гемохроматоза выявило существование новой N185D мутации гена FPN1, кодирующего трансмембранный белок ферропортин. Мутация ассоциирована с клиническими и биохимическими признаками гемохроматоза. Заболевание наследуется по аутосомно-доминангному типу.

5. Гемохроматоз 4-го типа (ген FPN1) может проявляться смешанным характером показателей метаболизма железа: нормальными уровнями насыщения трансферрина на фоне повышенного ферритина сыворотки крови среди пациентов в возрасте до 20 лет и высокими цифрами обоих показателей у людей более старшего возраста.

6. Настоящая работа продемонстрировала разнообразие генетических причин (HFE, HJV, НАМР, FPN1) и широкий фенотипический полиморфизм (от проявления только высокими биохимическими маркёрами до тяжелейшей кардиомиопатии) наследственного гемохроматоза у лиц молодого возраста.

7. Разработан протокол молекулярно-генетического обследования при подозрении на наследственный гемохроматоз у пациентов в возрасте до 30 лет.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Лавров, A.B. Генетика и молекулярные механизмы патогенеза наследственного гемохроматоза / A.B. Лавров, М.М. Литвинова, Н.П. Бочков II Молекулярная медицина. - 2004. -Ns 1. - С. 10-20.

2. Morris, T.J. A novel ferroportîn mutation in a Canadian family with autosomal dominant hemochromatosis I T.J. Morris, M.M. Litvinova, D. Ralston, A. Mattman, D. Holmes, G. Lockitch // Blood cells Mol Dis. - 2005. - Vol. 35(3). - P. 309-314.

3. Potekhina, E.S. Unique genetic profile of hereditary hemochromatosis in Russians: high frequency of C282Y mutation in population, but not in patients / E.S. Potekhina, A.V. Lavrov, L.M. Samokhodskaya, A.Y. Efimenko, A.V. Balatskiy, A.A. Baev, M.M. Litvinova, L.A. Nikitina, G.A. Shipulin, N.P. Bochkov, V.A. Tkachuk, V.N. Bochkov // Blood Cells Mol Dis. - 2005. - Vol. 35(2). - P. 182-188.

4. Литвинова, M.M. Новая мутация в гене ферропортина (FPN1), обнаруженная среди членов семьи с признаками аутосомно-доминантного гемохроматоза /

М.М. Литвинова // Тезисы работ участников Открытого российского конкурса на лучшую научную работу студентов 2005 года по разделу «Медицинские науки», Школы молодых исследователей «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» и итоговой научной студенческой конференции «Татъянин день». - Москва. - 2006. - С. 27-28.

5. Литвинова, М.М. Новая мутация в гене ферропортина (FPN1) в семье больных аутосомно-доминантным гемохроматозом / М.М. Литвинова // Анналы Факультета подготовки научно-педагогических кадров. - Москва. -2006.-С. 23-24.

6. Литвинова, М.М. Гемохроматоз молодого возраста, его причины и молекулярио-генетические механизмы I М.М. Литвинова [Электронный ресурс] II - Резюме. - 2006. - Режим доступа: http://www.mma.nl/article/idl3705.

7. Lockitch, G. A pediatric perspective on hemochromatosis: not just "an old man's disease". Eine pädiatrische Sichtweise der Hemochromatosis: nicht nur ein Altersleiden / G. Lockitch, M.M. Litvinova // Journal of Laboratory Medicine / LaboratoriumsMedizin. - 2006. - Vol. 30(1). - P. 33-39.

8. Самоходская, Л.М. Особенности генетики наследственного гемохроматоза в русской популяции / Л.М. Самоходская, A.B. Лавров, АЛО. Ефименко, A.B. Балацкий, П.И. Макаревич, A.A. Баев, М.М. Литвинова, И.К. Суркова, Л.А. Никитина, Е.Б. Яровая, В.Н. Тутубалин, Н.П. Бочков, В.А. Ткачук // Медицинская генетика. - 2007. - Т.6, №1(55). - С. 32-35.

9. Litvinova, М.М. Biochemical signs of hemochromatosis in a cohort of Canadian and Russian patients under 30 years old with different HFE genotype / M.M. Litvinova // European Journal of Human Genetics. - 2009. - Vol. 17 (2). - P. 6364.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НГХ - иаследствешшй гемохроматоз

F - ферритин

TS - насыщение трансферрина

wt - дикий тип аплеля (от англ. wild type)

Подписано в печать:

12.08.2009

Заказ № 23 54 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Литвинова, Мария Михайловна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Общая информация о наследственном гемохроматозе.

1.1.1 Определение.

1.1.2 История открытия заболевания.

1.1.3 Классификация.

1.1.4 Клинические проявления гемохроматоза.

1.1.5 Механизмы повреждающего действия избыточного количества железа.

1.2 Молекулярные механизмы патогенеза наследственного гемохроматоза различных типов.

1.2.1 Гемохроматоз 1-го типа.

1.2.2 Гемохроматоз 2-го типа.

1.2.3 Гемохроматоз 3-го типа.

1.2.4 Гемохроматоз 4-го типа.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Мутации C282Y и H63D гена HFE как причина гемохроматоза у лиц молодого возраста.

2.1.1 Формирование выборок обследуемых.

2.1.2 Показатели железа.

2.1.3 Генотипирование на наличие мутаций C282Y и H63D гена HFE.

2.2 Молекулярно-генетические причины гемохроматоза молодого возраста, не связанного с мутациями гена HFE.

2.2.1 Секвенирование гена HJV.

2.2.2 Секвенирование гена НАМР.

2.2.3 Тестирование гена. FPN1.

2.3 Статистическая обработка.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

3.1 Мутации C282Y и H63D гена HFE как причина гемохроматоза у лиц молодого возраста.

3.1.1 Распределение частот мутаций HFE.

3.1.2 Корреляция генотип-фенотип.

3.2 Молекулярно-генетические причины гемохроматоза молодого возраста, не связанного с мутациями гена HFE.

3.2.1 Семья с мутацией в гене HJV.

3.2.2 Семья с заменами ДНК в генах НАМР и FPN1.

3.2.3 Большая семья с новой мутацией в гене FPN1.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическая гетерогенность и фенотипическое разнообразие гемохроматоза у лиц молодого возраста"

Наследственный гемохроматоз (НГХ) признан одним из наиболее частых аутосомно-рецессивных заболеваний в Европе. Частота данного заболевания среди европеоидов составляет 0,2-0,8%, при этом каждый 10-й человек является гетерозиготным носителем мутации (Worwood М., 1994; Adams Р.С. et al., 2005). В России было проведено лишь несколько исследований в этом направлении, все они были посвящены изучению классической формы НГХ (Володичева Е.М., 2003; Лавров А.В., 2004; Баев А.А., 2006). Поскольку считается, что классическая форма гемохроматоза начинает проявляться в возрасте 40-45 лет, то и обследованный контингент всех предыдущих работ в среднем оказался именно такого возраста. Не было проведено исследований в отношении изменения уровней показателей обмена железа в зависимости от возраста пациентов, а это крайне важно для организации своевременной профилактики клинических проявлений заболевания.

В генетические лаборатории, занимающиеся диагностикой наследственного гемохроматоза, наряду с пациентами среднего возраста, довольно часто обращаются молодые люди, и даже родители с детьми. Зачастую исследование на наиболее частые мутации гена HFE, ответственного за развитие классической формы заболевания, таким пациентам не рекомендуют. Происходит это в силу общепринятого мнения о позднем начале проявления данного вида патологии. Действительно, в таких ситуациях часто требуется генетическая диагностика на наличие мутаций в генах других типов гемохроматоза, манифестирующих в более раннем возрасте (HJV, HAMP, FPN1 и др.). В настоящее время, кроме наиболее частой классической формы гемохроматоза (1-й тип), выделяют еще 4 типа: ювенильный (2-й тип), гемохроматоз 3-го, 4-го типов и неонатальный гемохроматоз (Roetto A. et al., 1999; Camaschella С. et al., 2000; Montosi G. et al., 2001). Молекулярно-генетические основы большинства из перечисленных патологий открыты менее 10 лет назад. И хотя на сегодняшний день нет четких статистических данных о заболеваемости гемохроматозом неклассических типов, такие случаи описаны во многих странах мира. К сожалению, среди российского населения прицельных исследований по всем формам гемохроматоза еще не проводилось. В России применяется генетическая диагностика лишь в отношении классической формы НГХ.

Цель и задачи исследования Цель данной работы - изучение генетических причин и фенотипического разнообразия гемохроматоза у лиц молодого возраста.

Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:

2. Изучить взаимосвязь повышения показателей обмена железа с генотипом HFE и возрастом пациентов;

4. Описать фенотипическое разнообразие НГХ при различных генетических вариантах этого заболевания;

Научная новизна В России проблема гемохроматоза молодого возраста еще не поднималась. Впервые проведен анализ зависимости биохимических признаков гемохроматоза у лиц моложе 30-ти лет от различных генотипов по мутациям C282Y и H63D гена HFE, ответственного за развитие классической формы заболевания (1-й тип НГХ). Описана неизвестная ранее мутация в гене ферропортина (FPN1) - 4-й тип НГХ. Проанализированы проявления заболевания при различных типах гемохроматоза и представлен протокол генетического обследования молодых пациентов с признаками перегрузки организма железом.

Теоретическая и практическая значимость Полученные сведения, позволили разработать оптимальный протокол молекулярно-генетического обследования молодых пациентов с признаками гемохроматоза, а также сориентироваться, с какого возраста можно ожидать изменения показателей обмена железа при мутациях гена HFE с целью проведения превентивного лечения. Продемонстрированы особенности течения заболевания у лиц с мутациями в генах различных типов гемохроматоза (2А, 2В, 3-го и 4-го типов). Эти сведения могут быть использованы при консультировании пациентов молодого возраста с подозрением на НГХ.

Пополнена мировая база известных мутаций гена FPN1 (SLC40A1). Определение молекулярно-генетической причины заболевания в большой семье позволит проводить раннюю генетическую диагностику родственникам пробанда и, в случае положительного результата, своевременно осуществлять профилактику развития клинических симптомов заболевания.

Положения, выносимые на защиту

1. Биохимические признаки наследственного гемохроматоза 1-го типа проявляются в возрасте до 30 лет. Повышение показателей ферритина и насыщения трансферрина в основном наблюдается у гомозигот по мутации C282Y гена HFE.

3. Полученная частота аллеля 282Y гена HFE у пациентов моложе 30 лет из терапевтических отделений Москвы не отличается от общепопуляционной частоты этой мутации для Московского региона. Следовательно, такие пациенты не относятся к группе риска по гемохроматозу.

4. Обнаружена новая N185D мутация гена FPN1, кодирующего трансмембранный белок ферропортин. Гетерозиготное носительство мутации ассоциировано с клиническими и биохимическими признаками гемохроматоза.

5. Гемохроматоз 4-го типа (ген FPN1) может проявляться смешанным характером показателей обмена железа: нормальными уровнями насыщения трансферрина на фоне повышенного ферритина сыворотки крови среди пациентов в возрасте до 20 лет и высокими цифрами обоих показателей у людей более старшего возраста.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, проанализированы базы данных больных с подозрением на НГХ, сформированы соответствующие группы обследования. Разработку протоколов секвенирования и непосредственный анализ генов HJV, НАМР, FPN1 осуществляла самостоятельно. Также у части больных проводила генотипирование HFE на предмет наличия мутаций C282Y и H63D. Автор провел статистический анализ всех полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты своей работы в различных научных журналах.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на итоговой научной студенческой конференции «Татьянин день» Школы молодых исследователей

Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (работа удостоена медали Н.И. Пирогова за лучшую научную студенческую работу ММА имени И.М. Сеченова 2005г); Итоговой научной конференции по защите дипломных работ выпускников факультета подготовки научно-педагогических кадров ММА имени И.М. Сеченова (Москва, 2006 г.); научных конференциях кафедры медицинской генетики ММА им. И.М. Сеченова; Европейской конференции по генетике человека 2009 (Вена, Австрия, 2009 г.).

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 9 печатных работах. Из них 5 статей (2 в отечественных и 3 в зарубежных журналах) и 4 тезисов. Две статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику Результаты работы внедрены в клиническую практику и используются при медико-генетическом консультировании пациентов в МГНЦ РАМН и ММА им И.М. Сеченова.

Структура и объём диссертации Диссертационная работа состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы (161 наименование). Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами и 25 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Литвинова, Мария Михайловна

выводы

1. Биохимические признаки наследственного гемохроматоза 1-го типа проявляются уже в возрасте до 30 лет. Большинство пациентов с повышенными показателями ферритина и насыщения трансферрина являются гомозиготами по мутации C282Y гена HFE, т.е. больны наследственным гемохроматозом.

2. Показанием для проведения молекулярно-генетического анализа на наличие гемохроматоза 1-го типа являются признаки перегрузки организма железом у лиц подросткового возраста. Подтверждение диагноза позволит своевременно, не дожидаясь манифестации клинических симптомов, начать эффективное лечение по выведению излишка железа из организма.

3. Полученная частота аллеля 282Y гена HFE у пациентов терапевтических отделений моложе 30 лет в Москве не отличается от общепопуляционной частоты-этой мутации для Московского региона. Следовательно, такие пациенты не относятся к группе риска по гемохроматозу.

6. Настоящая работа продемонстрировала разнообразие генетических причин (HFE, HJV, HAMP, FPN1) и широкий фенотипический полиморфизм (от проявления только высокими биохимическими маркёрами до тяжелейшей кардиомиопатии) наследственного гемохроматоза у лиц молодого возраста.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В настоящей работе продемонстрирована генетическая гетерогенность причин наследственного гемохроматоза и его фенотипическое разнообразие. На основании полученных данных, в том числе сопоставляя их с данными литературных источников, можно предложить следующие практические рекомендации:

1. Несмотря на общепринятое мнение о позднем (после 45 лет) начале манифестации НГХ 1-го типа, при обращении пациента молодого возраста (до 30 лет) с признаками перегрузки организма железом следует исключить у него гомозиготность по мутации C282Y в гене HFE.

2. При установлении гомозиготного носительства мутации C282Y гена HFE у ребенка, следует приступить к слежению за уровнями ферритина и насыщения трансферрина, начиная по крайне мере с 14-ти летнего возраста. Это позволит своевременно принять меры профилактики в отношении избыточного накопления железа в организме и не допустить развития фиброза печени и ряда других грозных осложнений гемохроматоза.

3. Разработанный протокол обследования молодых пациентов с подозрением на НГХ поможет правильно проводить дифференциальный диагноз между различными типами гемохроматоза.

4. Разработанный протокол секвенирования и указанные в обсуждении особенности последовательности анализа различных экзонов генов HJV, НАМР и FPN1 могут быть использованы при налаживании соответствующей ДНК-диагностики в нашей стране.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Литвинова, Мария Михайловна, Москва

1. Володичева, Е.М. Современная диагностика наследственного гемохроматоза в России: Автореф. дисс. на соискание уч. степени канд. мед. наук / Е.М. Володичева. — Москва, 2003. 28 с.

2. Ивашкин, В.Т. Гастроэнтерология, национальное руководство / В.Т. Ивашкин, Т.Л. Лапина. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 700 с.

3. Козырева, Н.В. Распространенность мутации C282Y гена наследственного гемохроматоза у детей кемеровской области / Н.В. Козырева, ЛМ. Казакова, А.В. Шабалдин, Е.Н. Бородина // Педиатрия. -2008.-Т. 87, №2.-С. 147-148.

4. Лавров, А.В. Молекулярно-генетическая характеристика наследственного гемохроматоза у российских больных: Автореф. дисс. на соискание уч. степени канд. мед. наук / А.В. Лавров. Москва, 2004. ^31 с.

5. Лавров, А.В. Генетика и молекулярные механизмы патогенеза наследственного гемохроматоза / А.В. Лавров, М.М. Литвинова, Н.П. Бочков // Молекулярная медицина. 2004. -№1. - С. 10-20.

6. Самоходская, Л.М. Особенности генетики наследственного гемохроматоза в русской популяции / Л.М. Самоходская, А.В. Лавров, А.Ю. Ефименко, А.В. Балацкий, П.И. Макаревич, А.А. Баев, М.М.

7. Литвинова, И.К. Суркова, ji.a. Никитина, Е.Б. Яровая, В.Н. Тутубалин, Н.П. Бочков, В.А. Ткачук // Медицинская генетика. 2007. - Т.6, №1(55). - С. 32-35.

8. Серов, В.В. Патологическая анатомия. Курс лекций: учеб. пособие для вузов / В.В. Серов, М.А. Пальцев. М.: Медицина, 1998. - 640 с.

9. Ю.Струтынский, А.В. Основы семиотики заболеваний внутренних органов: Атлас / А.В. Струтынский, А.П. Баранов, Г.Е. Ройтберг, Ю.П. Гапоненков. -М.: МЕДпресс-информ, 1997. 224 с.

10. Abboud, S. A novel mammalian iron-regulated protein involved in intracellular iron metabolism / S. Abboud, DJ. Haile // J. Biol. Chem. — 2000.-Vol. 275.-P. 19906-19912.

11. Adams, P. EASL International Consensus Conference on Hemochromatosis, II: expert document / P. Adams, P. Brissot, L.W. Powell // J Hepatol. — 2000. Vol. 33. - P. 487-496.

12. Anderson, G.J. Control of iron absorption / G.J. Anderson // J. Gastroenterol. Hepatol. 1996. - Vol. 11. - P. 1030-1032.

13. Andrews, N.C. Iron homeostasis: insights from genetics and animal models / N.C. Andrews // Nat. Rev. Genet. 2000. - Vol. 1. - P. 208-217.

14. Aust, S.D. Ferritin as a source of iron and protection from iron-induced toxicities / S.D. Aust // Toxicol Lett. 1995. - Vol. 82-83. - P. 941-944.

15. Bacon, B.R. The pathology of hepatic iron overload: a free radical-mediated process? / B.R. Bacon, R.S. Britton // Hepatology. 1990. - Vol. 11. - P. 127-137.

16. Barton, J.C. Blood lead concentrations in hereditary hemochromatosis / J.C. Barton, M.A. Patton, C.Q. Edwards, L.M. Griffen, J.P. Kushner, R.G. Meeks, R.W. Leggett // J. Lab. Clin. Med. 1994. - Vol. 124, P. 193-198.

17. Beutler, E. Ferroportin 1 (SCL40A1) variant associated with iron overload in African-Americans / E. Beutler, J. Barton, V. Felitti, T. Gelbart, C. West, P.L. Lee, J. Waalen, C. Vulpe // Blood Cells Mol. Dis. 2003. - Vol. 31, № 3.-P. 305-309.

18. Beutler, E. Penetrance of 845G-> A (C282Y) HFE hereditary haemochromatosis mutation in the USA / E. Beutler, VJ. Felitti, J.A. Koziol, N.J. Ho, T. Gelbart // Lancet. 2002. - Vol. 359(9302). - P. 211218.

19. Britton, R.S. Role of free radicals in liver diseases and hepatic fibrosis / R.S. Britton, B.R. Bacon // Hepatogastroenterology. 1994. - Vol. 41. - P. 343348.

20. Britton, R.S. Pathophysiology of iron toxicity / R.S Britton, G.A. Ramm, J.K. Olynyk, R. Singh, R. O'Neill, B.R. Bacon // Adv Exp Med Biol. -1994. Vol. 356. - P. 239-253.

21. Cairo, G. Inappropriately high iron regulatory protein activity in monocytes of patients with genetic hemochromatosis / G. Cairo, S. Recalcati, G. Montosi, E. Castrusini, D. Conte, A. Pietrangelo // Blood. 1997. - Vol. 89. -P. 2546-2553.

22. Camaschella, C. The gene TFR2 is mutated in a new type of haemochromatosis mapping to 7q22 / C. Gamaschella, A. Roetto, A. Cali, M. De Gobbi, G. Garozzo, M. Carella, N. Majorano, A. Totaro, P. Gasparini // Nature Genet. 2000. - Vol. 25. - P. 14-15.

23. Conrad, M.E. Intestinal mucosal mechanisms controlling iron absorption / M.E. Conrad, W.H. Crosby // Blood. 1963. - Vol. 22. - P. 406-415.

24. Cotran, R.S. Robbins pathologic basis of disease: 6-yh ed. / R.S. Cotran, V. Kumar, T. Collins. Philadelphia: W.B. Saunders company, 1999. - 14251. P

25. Cullen, L.M. Neonatal screening for the hemochromatosis defect / L.M. Cullen, L. Summerville, T.V. Glassick, D.H. Crawford, L.W. Powell, E.C. Jazwinska // Blood. 1997. - Vol. 90, №10. - P. 4236-4237.

26. Diamond, T. Osteoporosis in hemochromatosis: iron excess, gonadal deficiency, or other factors? / T. Diamond, D. Stiel, S. Posen // Ann. Inter. Med. 1989. - Vol. 110. - P. 430-436.

27. Drakesmith, H. Resistance to hepcidin is conferred by hemochromatosis-associated mutations of ferroportin / H. Drakesmith, L.M. Schimanski, E. Ormerodetal.//Blood.-2005.-Vol. 106(3).-P. 1092-1097.

28. Eaton, J.W. Molecular bases of cellular iron toxicity / J.W. Eaton, M. Qian. // Free Radical Biology and Medicine. 2002. -VoL 32(9). - P. 833-840.

29. Edwards, C.Q. Homozygosity for hemochromatosis: clinical manifestations / C.Q. Edwards, G.E.Cartwright, M.H. Skolnick, D.B. Amos // Ann. Intern. Med. 1980. - Vol. 93. - P. 519-525.

30. Edwards, C.Q. Hereditary haemochromatosis / C.Q. Edwards, M.M. Dadone, M.H. Skolnick, J.P. Kushner // Clin Haematol. 1982. - Vol. 11.-P. 411-435.

31. Fargion, S. Survival and prognostic factors in 212 Italian patients with genetic hemochromatosis / S. Fargion, C. Mandelli, A. Piperno // Hepatol. — 1992. Vol. 15. - P. 655-659.

32. Feder, J.N. The hemochromatosis gene product complexes with the transferrin receptor and lowers its affinity for ligand binding / J.N. Feder,

33. D.M. Penny, A. Irrinki, V.K. Lee, J.A. Lebron, N. Watson, Z. Tsuchihashi,

34. E. Sigal, P.J. Bjorkman, R.C. Schatzman // Proc Natl Acad Sci USA. -1998. Vol. 95. - P. 1472-1477.

35. Ferguson, C.J. Cellular localization of divalent metal transporter DMT-1 in rat kidney / C.J. Ferguson, M. Wareing, D.T. Ward, R. Green, C.P. Smith, D. Riccardi // Am J Physiol Renal Physiol. 2001. - Vol. 280. - P. F803-F814.

36. Finch, S.C. Idiopathic hemochromatosis, an iron storage disease / S.C. Finch, C.A. Finch // Medicine. 1955. - Vol. 34. - P. 381-430

37. Milder, M.S. Idiopathic hemochromatosis, an interim report / M.S. Milder, J.D. Cook, S. Stray, C.A. Finch // Medicine. 1980. - Vol. 59. - P. 34-39.

38. Frazer, D.M. Iron Imports. I. Intestinal iron absorption and its regulation / D.M. Frazer, G.J. Anderson // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. -2005. Vol. 289. - P. G631-G635.

39. Gardi, C. Effect of free iron on collagen synthesis, cell proliferation and MMP-2 expression in rat hepatic stellate cells / C. Gardi , B. Arezzini , V. Fortino , M. Comporti // Biochem Pharmacol. 2002. - Vol. 64(7). - P. 1139-1145.

40. Girouard, J. Prevalence of HFE gene C282Y and H63D mutations in a French-Canadian population of neonates and in referred patients / J. Girouard, Y. Giguere, R. Delage, F. Rousseau // Human Molecular Genetics. 2002. - Vol. 11 (2). - P. 185-189.

41. Gunshin, H. H. Gunshin, B. Mackenzie, U.V. Berger, Y. Gunshin, M.F. Romero, W.F. Boron, S. Nussberger, J.L. Gollan, M.A. Hediger // Nature (London). 1997. - Vol. 388. - P. 482-488.

42. Jezequel, P. Allele frequencies of hereditary hemochromatosis gene mutations in local population of west Brittany / P. Jezequel, M. Bargain, F. Lellouche, F. Geffroy, I. Dorval // Hum. Genet. 1998. - Vol. 102 (3). - P. 332-333.

43. Jouanolle, A.M. Novel mutation in ferroportin 1 gene is associated with autosomal dominant iron overload / A.M. Jouanolle // J Hepatol. 2003. — Vol. 39.-P. 286-289.

44. Kawabata, H. Molecular cloning of transferrin receptor 2: a new member of the transferrin receptor-like family / H: Kawabata, R. Yang, T. Hirama, P.T. Vuong, S. Kawano, A.F. Gombart, H.P. Koeffler // J. Biol. Chem. 1999. -Vol. 274. - P. 20826-20832.

45. Koss, L. Hepcidin Decreases Ferroportin 1 Expression in a Mouse Macrophage Cell Line / L. Koss // Journal of Undergraduate Research, University of Florida. — 2005. — Vol. 6(6). — Режим доступа: http://web.clas.ufl.edu/jur/200503/papers/paperkoss.html.

46. Krause, A. LEAP-1, a novel highly-disulfide bonded human peptide, exhibits antimicrobial activity / A. Krause, S. Neitz, H.J. Magert, A. Schulz, W.G. Forssmann, P. Schulz-Knappe, K. Adermann // FEBS Letters. 2000. -Vol. 480.-P. 147-150.

47. Krikker, M.A. A foundation for hemochromatosis: Letter / M.A. Krikker // Ann. Inter. Med. 1982. - Vol. 97. P. 782-783.

48. Le Gac, G. Complete Scanning of the Hereditary Hemochromatosis Gene {HFE) by Use of Denaturing HPLC / G. Le Gac, С. Mura, C. Ferec // Clinical Chemistry. 2001. - Vol. 47. - P. 1633-1640.

49. Lee, P.L. Hemojuvelin (HJV) mutations in persons of European, African-American and Asian ancestry with adult onset haemochromatosis / P.L. Lee, J.C. Barton, D. Brandhagen, E. Beutler // Brit. J. Haemat. 2004. - Vol. 127.-P. 224-229.

50. Lesnefsky, E.J. Tissue iron overload and mechanisms of iron-catalyzed oxidative injury / E.J. Lesnefsky // Adv Exp Med Biol. 1994. - Vol. 366. -P. 129-146.

51. Link, G. Identification of thiolic sarcolemmal proteins as a primary target of iron toxicity in cultured heart cells / G. Link, A. Pinson, C. Hershko // Adv Exp Med Biol. 1994. - Vol. 356. - P. 267-276.

52. Liu, X-B. Functional Consequences of Ferroportin Mutations / X-B. Liu, F. Yang, D.J. Haile // Blood Cells Mol. Dis. 2005. - Vol. 35. - P. 33-46.

53. Lucotte, G. A European allele map of the C282Y mutation of hemochromatosis: Celtic versus Viking origin of the mutation? / G. Lucotte, F. Dieterlen // Blood Cells, Molecules, and Diseases. 2003. - Vol. 31(2). -P. 262-267.

54. Lynch, S.R. Food iron absorp tion in idiopathic hemochromatosis / S.R. Lynch, B.S. Skikne, J.D. Cook//Blood. 1989. - Vol. 74. - P. 2187-2193.

55. MacDonald, R.A. Primary haemochromatosis: inherited or acquired? / R.A. MacDonald// Progress in Haematology. 1966. - Vol. 5. - P. 324-353.

56. Mattman, A. Transferrin receptor 2 (T£R2) and HFE mutational analysis in non-C282Y iron overload: identification of a novel TfR2 mutation / A. Mattman, D. Huntsman, G. Lockitch, S. Langlois, N. Buskard, D. Ralston,

57. Y. Butterfield, P. Rodrigues, S. Jones, G. Porto, M. Marra, M. De Sousa, G. Vatcher//Blood. 2002. - Vol. 100.-P. 1075-1077.

58. McLaren, G.D. Regulation of intestinal iron absorption and mucosal iron kinetics in hereditary hemochromatosis / G.D. McLaren, M.H. Nathanson, A. Jacobs, D. Trevett, W. Thomson // J. Lab. Clin. Med. 1991. - Vol. 117 -P. 390-401.

59. Merryweather-Clarke, A.T. Global prevalence of putative haemochromatosis mutations / A.T. Merryweather-Clarke, J.J. Pointon, J.D. Shearman, K.J: Robson // J. Med. Genet. 1997. - Vol. 34(4). - P. 275-278.

60. Milman, N. Hereditary haemochromatosis in Denmark 1950-1985 / N. Milman // Dan Med Bull. 1991. - Vol. 38. - P. 385-393.

61. Mims, M.P. Identification of a human mutation of DMT1 in patient with microcytic anemia and iron overload / M.P. Mims, Y. Guan, D. Pospisilova, M. Priwitzerova, K. Indrak, P. Ponka, V. Divoky, J.T. Prchal // Blood.-2005.-Vol. 105(3).-P. 1337-1342.

62. Monnier, P. RGM is a repulsive guidance molecule for retinal axons / P. Monnier, A. Sierra, P. Macchi, L. Deitinghoff, J.S. Andersen, M. Mann, M. Flad, M.R. Hornberger, B. Stahl, F. Bonhoeffer, B.K. Mueller // Nature. 2002. - Vol. 419. - P. 392 - 395.

63. Mukhopadhyay, C.K. Role of ceruloplasmin in cellular iron uptake / C.K. Mukhopadhyay, Z.K. Attieh, P.L. Fox // Science. 1998. - Vol. 279. -P. 714-771.

64. Mura, C. HFE mutations analysis in 711 hemochromatosis probands: evidence for S65C implication in mild form of hemochromatosis / C. Mura, O. Raguenes, C. Ferec // Blood. 1999. - Vol. 93. - P. 2502-2505.

65. Myers, B.M. Alterations in the structure, physicochemical properties, and pH of hepatocyte lysosomes in experimental iron overload / B.M. Myers, F.G. Prendergast, R. Holman, S.M. Kuntz, N.F. LaRusso // J Clin Invest. 1991. - Vol. 88. - P. 1207-1215.

66. Nemeth, E. Hepcidin is decreased in TFR2 hemochromatosis / E. Nemeth, A. Roetto, G. Garozzo, T. Ganz, C. Camaschella // Blood. — 2005. -Vol. 105(4).-P. 1803-1806.

67. Nghia, T.V. Le. Ferroportin 1: a new iron export molecule? / T.V. Le Nghia, R. Des // The international Journal of Biochemistry & Cell Biology. -2002.-Vol. 34(2).-P. 103-108.

68. Nicolas, G. Hepcidin, a new iron regulatory peptide / G. Nicolas, L. Viatte, M. Bennoun, C. Beaumont, A. Kahn, S. Vaulont // Blood Cells Mol Dis. 2002. - Vol. 29(3). - P. 327-335.

69. Niederau, C. Survival and causes of death in cirrhotic and in noncirrhotic patients with primary hemochromatosis / C. Niederau, R. Fischer, A. Sonnenberg, W. Stremmel; H.J. Trampisch, G. Strohmeyer // N Engl J Med. 1985. - Vol. 313, P. 1256-1262.

70. Niederau, C. Epidemiology, clinical spectrum, and prognosis of hemochromatosis / C. Niederau, G. Strohmeyer, W. Stremmel // Adv Exp Med Biol. 1994. - Vol. 356. - P. 293-302.

71. Njajou, O.T. A mutation in SLC11A3 is associated with autosomal dominant hemochromatosis / O.T. Njajou, N. Vaessen, M. Joosse, B.

72. Berghuis, J.W. van Dongen, M.H. Breuning, P.J. Snijders, W.P. Rutten, L.A. Sandkuijl, B.A. Oostra, C.M. van Duijn, P. Heutink // Nat Genet. -2001. Vol. 28. - P. 213-214.

73. Olynyk, J.K. A long-term study of the interaction between iron and alcohol in an animal model of iron overload / J.K. Olynyk, P. Hall, W. Reed, P. Williams, R. Kerr, M. Mackinnon // J Hepatol. 1995. - Vol. 22. - P. 671-676.

74. Olynyk, J.K. A population-based study of the clinical expression of the hemochromatosis gene / J.K. Olynyk, D.J. Cullen, S. Aquilia, E. Rossi, L. Summerville, L.W. Powell // N Engl J Med. 1999. - Vol. 341(10). - P. 718-724.

75. Park, C.H. Hepcidin, a Urinary Antimicrobial Peptide Synthesized in the Liver / C.H. Park, E.V. Valore, A.J. Waring, T. Ganz // J. Biol. Chem. -2001.-Vol. 276(11).-P. 7806-7810.

76. Parkkila, S. Immunohistochemistry of HLA-H, the protein defective in patients with hereditary hemochromatosis, reveals unique pattern of expression in gastrointestinal tract / S. Parkkila, A. Waheed, R.S. Britton,

77. J.N. Feder, Z. Tsuchihashi, R.C. Schatzman, B.R. Bacon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 2534-2539.

78. Pietrangelo, A. Hereditary Hemochromatosis — A New Look at an Old Disease / A. Pietrangelo // N Engl J Med. 2004. - Vol. 350(23). - P. 2383-2397.

79. Pietrangelo A. The ferroportin disease / A. Pietrangelo // Blood Cells Mol. Dis. 2004. - Vol. 32. - P. 131-138.

80. Pietrangelo A. A. Pietrangelo, G. Casalgrandi, D. Quaglino, R Gualdi, D. Conte, S. Milani, G. Montosi, L. Cesarini, E. Ventura, G. Cairo // Gastroenterology. 1995. - Vol. 108. - P. 208-217.

81. Pietrapertosa, A. HFE gene mutations an Apulian population: Allele frequencies / A. Pietrapertosa, A. Vitucci, D. Campanale, A. Palma, R. Renni, G. Delios, N. Tannoia // European Journal of Epidemiology. — 2003.-Vol. 18(7).-P. 685-690.

82. Powell, L.W. Intestinal mucosal uptake of iron and iron retention in idiopathic hemochromatosis as evidence for a mucosal abnormality / L.W. Powell, C.B. Campbell, E. Wilson // Gut. 1970. - Vol. 11. - P. 727-731.

83. Powell, L.W. Primary iron overload / L.W. Powell, E. Jazwinska, J.W. Halliday // Iron Metabolism in Health and Disease / J.H. Brock, J.W. Halliday, M.J. Pippard, L.W. Powell. Philadelphia: WB Saunders, 1994. -P. 227-270.

84. Restagno, G. A pilot C282Y hemochromatosis screening in Italian newborns by TaqMan technology / G. Restagno, A.M. Gomez, L. Sbaiz, M.

85. DeGobbi, A. Roetto, E. Bertino, C. Fabris, G.C. Fiorucci, P. Fortina, C. Camaschella // Genet Test. 2000. - Vol. 4(2). - P. 177-181.

86. Rouault, T.A. Hereditary hemochromatosis Sometimes having a real complex can be a good thing / T.A. Rouault // Hepatology. - 1998. - Vol. 28.-P. 890-891.

87. Ryan, T.P. The role of iron in oxygen-mediated toxicities / T.P. Ryan, S.D. Aust // Crit Rev Toxicol. 1992. - Vol. 22. - P. 119-141.

88. Santos, M. Defective iron homeostasis in beta2-microglobulin knockout mice recapitulated hereditary hemochromatosis in man / M. Santos, M.W. Schilham, L.H. Rademaker, J.J. Marx, M. de Sousa, H. Clevers // J. Exp. Med. 1996. -Vol. 184.-P. 1975-1985.

89. Townsend // Blood. 2005. - Vol. 105. - P. 4096-4102.

90. Sham, R.L. Autosomal dominant hereditary hemochromatosis associated with a novel ferroportin mutation and unique clinical features / R.L. Sham, P.D. Phatak, C. West, P. Lee, C. Andrews, E. Beutler // Blood Cells Mol. Dis. -2005. Vol. 34. - P. 157-161.

91. Sheldon, J.H. Haemochromatosis / J.H. Sheldon. London: Oxford UnivPr, 1935.-339 p.

92. Simon, M. Association of HLA-A3 and HLA-B14 antigens with idiopathic hemochromatosis / M. Simon, M. Bourel, R. Fauchet, B. Genetet // Gut. 1976. - Vol. 2. - P. 332-334.

93. Smith, P.M. Iron absorption in idiopathic hemochromatosis and its measurement using a whole-body counter / P.M. Smith, B.E. Godfrey, R. Williams // Clin. Sci. 1969. - Vol. 37. - P. 519-531.

94. Steinberg, K.K. Prevalence of C282Y and H63D mutations in the 1 hemochromatosis (HFE) gene in the United States / K.K. Steinberg, M.E.

95. Cogswell, J.C. Chang, S.P. Caudill, G.M. McQuillan, B.A. Bowman, L.M.

96. Grummer-Strawn, E.J. Sampson, M.J. Khoury, M.L. Gallagher // J. Am. Med. Assoc. 2001. - Vol. 285(17). - P. 2216-2222.

97. Subramaniam, V.N. Ferroportin disease due to the A77D mutation in Australia / V.N. Subramaniam, D.F. Wallace, J.L. Dixon, L.M. Fletcher,

98. D.H. Crawford// Gut. -2005. Vol. 54. - P. 1048-1049.

99. Tector, A.J. Hepatic mitochondrial oxidative metabolism and lipid peroxidation in iron-overloaded rats fed ethanol / A.J. Tector, J.K. Olynyk, R.S. Britton, C.G. Janney, R. O'Neill, B.R. Bacon // J Lab Clin Med. 1995. -Vol. 126.-P. 597-602.

100. Trinder, D. Iron uptake from plasma transferring by the duodenum is impaired in the HFE knockout mouse / D. Trinder, J.K. Olynyk, W.S. Sly,

101. E.H. Morgan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99(8). - P. 56225626.

102. Tsukamoto, H. Experimental liver cirrhosis induced by alcohol and iron / H. Tsukamoto, W. Home, S. Kamimura, 0. Niemela, S. Parkkila, S. Yla-Herttuala, G.M. Brittenham // J Clin Invest. 1995. - Vol. 96. - P. 620630.

103. Valberg, L.S. Alteration in cobalt absorption in patients with disorders of iron metabolism / L.S. Valberg, J. Ludwig, D. Olatunbosun // Gastroenterology. 1969. - Vol. 56. - P. 241-251.

104. Von Recklinghhausen, F.D. Uber Haemochromatose: Versammling Dtsch Naturforsch Artze / F.D. Von Recklinghhausen. Heidelberg: Taggeblatt (62), 1889. - 925 p.

105. Wallace, D.F. Identification of ferroportin disease in the Indian subcontinent / D.F. Wallace, P. Browett, P. Wong, H. Kua, R. Ameratunga, V.N. Subramaniam // Gut. 2005. - Vol. 54. - P. 567-568.

106. Wallace, D.F. Autosomal dominant iron overload due to a novel mutation of ferroportin 1 associated with parenchymal iron loading and cirrhosis / D.F. Wallace, R.M. Clark, H.A. Harley V.N. Subramaniam // J Hepatol. 2004. - Vol. 40. - P. 710-713.

107. Wallace, D.F. Novel mutation in ferroportinl is associated with autosomal dominant hemochromatosis / D.F. Wallace, P. Pedersen, J.L. Dixon, P. Stephenson, J.W. Searle, L.W. Powell, V.N. Subramaniam // Blood. 2002. - Vol. 100. - P. 692-694.

108. Winterbourn, C.C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction / C.C. Winterbourn // Toxicol Lett. 1995. - Vol. 82-83. - P. 969974.

109. Witte, D.L. Hereditary hemochromatosis / D.L. Witte, W.H. Crosby, C.Q. Edwards, V.F. Fairbanks, F.A. Mitros // Clinica Chim Acta. 1996. -Vol. 245.-P. 139-200.

110. Worwood, M. Genetics of haemochromatosis / M. Worwood // Baillieres Clin Haematol. 1994. - Vol. 7. - P. 903-918.

Информация о работе

Литвинова, Мария Михайловна
кандидата медицинских наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.15

Диссертация

Генетическая гетерогенность и фенотипическое разнообразие гемохроматоза у лиц молодого возраста - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы