Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование молекулярно-генетических основ атопического дерматита

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование молекулярно-генетических основ атопического дерматита"

На правах рукописи

ГИМАЛОВА ГА ЛИЯ ФУАТОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013

Уфа-2013

005540918

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Карунас Александра Доктор биологических наук

Станиславовна

Официальные оппоненты:

Викторова Татьяна Викторовна Доктор медицинских наук, профессор

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН г.н.с. лаборатории физиологической генетики

Спицын Виктор Алексеевич Доктор биологических наук, профессор

ГУ Медико-генетический научный центр РАМН Зав. лабораторией экологической генетики

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Защита диссертации состоится « & 201J г. в « ¿г » часов

на заседании диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71; с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru

e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан « /W-viZ/^Л 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н tys/yfe* С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Атопический дерматит (АД) - хроническое рецидивирующее воспалительное заболевание кожи аллергической природы, для которого характерна возрастная особенность локализации, интенсивный зуд и гиперчувствительность к аллергенам и неспецифическим раздражителям (Odhiambo et al., 2009). В течение последних десятилетий заболеваемость АД существенно выросла, и в настоящее время распространенность его составляет в среднем 10-20% (Odhiambo et al., 2009, Pawankar et al., 2011 ). Заболевание чаще встречается у детей и, как правило, проявляется в возрасте до 1 года. У большинства больных атопический дерматит является первым проявлением аллергии, на фоне которого в дальнейшей жизни могут развиться бронхиальная астма и аллергический ринит (Spergel, Palier, 2003). АД может продолжаться и в зрелом возрасте, существенно ухудшая качество жизни больных (Beattie et al., 2006).

АД имеет многофакторную природу и развивается при взаимодействии таких эндогенных факторов, как генетическая предрасположенность и атопия, с различными аллергенными и неаллергенными факторами внешней среды (Schultz Larsen, 1993; Bisgaard et al., 2008). Молекулярпо-геиетические исследования АД с использованием современных методов и подходов значительпо расширили знания о генетических факторах, способствующих формированию наследственной предрасположенности к данному заболеванию. Проведено множество ассоциативных исследований полиморфных локусов генов-кандидатов АД, которые показали, что в этиопатогенезе заболевания активное участие принимают гены, вовлеченные в атопический иммунный ответ организма - гены интерлейкинов IL4, ILIO, IL13, IL18, IL25, IL33, тимусного стромального лимфопоэтина TSLP\ в регуляцию барьерной функции эпителия - гены филаггрина FLG и ингибитора сериновых протеаз SPINK5; в распознавание консервативных структур микроорганизмов - гены образ-распознающих рецепторов (TLR1, TLR2, TLR6, TLR9, TLR10, NOD1, NÔD2) и др. (Kawashima et al., 1998; Chavanas et al., 2000; Tsunemi et al., 2002; Ahmad-Nejad et al., 2004; Hosomi et al., 2004; Palmer et al., 2006; Sohn et al., 2007; Barnes K.C., 2010; Gao et al., 2010; Qian et al., 2010; Bussmann С. et al., 2011; Behniafard et al., 2012). Показано, что важный вклад в развитие этого заболевания вносят различные взаимодействия генов между собой и с факторами окружающей среды (Cramer et al., 2010; Lesiak et al., 2011; Namkung et al., 2011; Deleuran et al., 2012). В результате полногеномных анализов сцепления выявлены хромосомные области, тесно сцепленные с развитием АД (lq21, 3q21, Зр24-22, 17q25) (Lee et al., 2000; Cookson et al., 2001; Bradley et al., 2002), идентифицирован позиционно-клонированный ген АД, кодирующий эпидермальный коллаген COL29A1 (3q22.1) (Soderhall et al., 2007). Полногеномные

анализы ассоциации АД позволили определить полиморфные локусы, ассоциированные с данным заболеванием и локализованные в областях llql3.5 (гены С11оф0, LRRC32) (Esparza-Gordillo et al., 2009); llql3.1 (ген OVO LI - человеческий гомолог гена ovo дрозофилы), 19р13.2 (ген актин-подобного белка 9 - ACTL9) и 5q31.1 (ген белка ЗА семейства кинезинов - KIF3Ä) (Paternoster et al., 2011; Hirota et al., 2012).

В России генетические исследования атопического дерматита единичны (Саликова и др., 2010; Тюменцева и др., 2011; Фрейдин и др., 2011; Карунас и др., 2012), а комплексное изучение роли генов цитокинов, образ-распознающих рецепторов и белков, ответственных за формирование и поддержание барьерной функции эпидермиса, в развитии АД ранее не проводилось. В связи с этим актуальным является углубленное молекулярно-генетическое исследование этой многофакторной патологии, которое позволит подробно охарактеризовать генетическую основу предрасположенности к АД, достоверно оценить роль исследуемых генов в развитии этого заболевания, что может послужить основой для разработки способов его прогнозирования и подходов ДНК-диагностики.

В связи с вышеизложенным, были определены цели и задачи настоящего исследования.

Цель работы - анализ роли полиморфных вариантов и мутаций генов-кандидатов в развитии атопического дерматита в Республике Башкортостан.

Задачи исследования:

1. Провести анализ мутаций и полиморфных вариантов генов, участвующих в формировании эпидермального барьера - филаггрина FLG и ингибитора сериновых протеаз SPINK5, у больных атопическим дерматитом и индивидов контрольной группы.

2. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов у больных атопическим дерматитом и индивидов контрольной группы.

3. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов цитокинов - интерлейкина 4 (IL4), а-цепи рецептора интерлейкина 4 (IL4R), интерлейкина 13 (IL13), интерлейкина 10 {ILIO), фактора некроза опухоли (TNFА) и эотаксина (CCL11), у больных атопическим дерматитом и индивидов контрольной группы.

4. Провести исследование полиморфных локусов, ассоциированных с атопическим дерматитом по данным полногеномных анализов и локализованных в областях 5q31.1 (ген KIF3A), llql3.1 {OVOL1), llql3.5 (CllorßO и LRRC32), 19р13.2 (ACTL9), у больных атопическим дерматитом и индивидов контрольной группы.

5. Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов генов с развитием атопического дерматита у индивидов различной этнической принадлежности.

6. Провести исследование ген-генных взаимодействий, предрасполагающих к развитию атопического дерматита.

Научная новизна исследования. Впервые определены частоты аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR9, TLR10, NODI, NOD2, CD14 у больных атоническим дерматитом и здоровых индивидов русской, татарской и смешанной этнической принадлежности, проживающих в Республике Башкортостан. Установлены частоты мутаций с.2282de 14, p.ArgSOIX и p.Arg2447X в гене филаггрина у больных АД и индивидов контрольной группы. С целью репликации результатов полногеномных анализов ассоциации атопического дерматита проведено исследование полиморфных локусов генов, локализованных в областях 5q31.1 (KIF3A), llql3.1 (OVOL1), llql3.5 ((CllorßO и LRRC32) и 19pl3.2 (ACTL9), у больных АД и в контрольной группе индивидов из РБ. Выявлены генетические маркеры риска развития заболевания с учетом этнической принадлежности индивидов. Установлены модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокинов, филаггрина, ингибитора сериновых протеаз, генов образ-распознающих рецепторов и генов, ассоциированных с развитием АД по данным полногеномного анализа, предрасполагающие к развитию АД у русских и татар.

Научно-практическая значимость работы. Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к атопическому дерматиту. Идентификация мутаций в генах белков, ответственных за формирование и поддержание эпидермального барьера организма, позволяет установить точную молекулярно-генетическую природу АД и подобрать эффективные методы его лечения. Результаты исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Конгрессах Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии EAACI Congress (Стамбул, 2011; Женева, 2012; Милан, 2013), Конференциях Европейского общества генетики человека (Амстердам, 2011; Нюрнберг, 2012; Париж, 2013), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Курск, 2011), V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012), II и III Всероссийской

школы - конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика -наука XXI века» (Уфа, 2011, 2012), Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов» (Уфа, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 6 - статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 175 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, который включает 240 источников. Содержит 33 таблицы и 29 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования. Материалом для исследования служили образцы ДНК 448 неродственных индивидов, больных АД в возрасте от 1 до 50 лет (средний возраст 13,29 лет). Все обследованные являлись пациентами Республиканского кожно-венерологического диспансера и детского отделения Клиники Башкирского государственного медицинского университета. Диагноз заболевания устанавливался квалифицированными врачами на основании данных клинического, общелабораторного и дополнительных методов исследования в соответствии с критериями программных документов по диагностике, лечению и профилактике заболеваний.

В состав группы больных входили индивиды различной этнической принадлежности, проживающие в Республике Башкортостан: 177 русских, 126 татар и 145 индивидов метисного происхождения (от смешанных браков русских и татар). Среднетяжелое течение атопического дерматита наблюдалось у 377 человек (153 русских, 106 татар, 118 метисов), тяжелое - у 71 человека (24 русских, 20 татар и 27 метисов). Среди больных 225 человек имели клинические проявления только АД (82 русских, 67 татар, 76 метисов) и 223 индивида имели АД и сопутствующие аллергические заболевания - бронхиальную астму, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит или сочетание данных патологий (95 русских, 59 татар, 69 метисов).

Контрольную группу составили 408 практически здоровых лиц, сопоставимых по полу, возрасту (от 4 до 60 лет, средний возраст 21,88 лет) и этнической принадлежности с больными и не имеющих отягощенной наследственности по

атопическим заболеваниям (152 русских, 109 татар и 147 метисов). Информированное согласие на участие в данном исследовании было получено от всех его участников.

Методы исследования. ДНК из периферической крови выделяли методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew et al., 1984). Анализ полиморфных вариантов генов ЯД IL13, IL4R, ILIO, TNFA, CCL1J, SPINK5 и мутаций в гене FLG проводили при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК с последующим рестрикционным анализом. Мутации в гене FLG также исследовали методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP-анализа) (Orita et al., 1989) с последующим секвенированием. Определение нуклеотидной последовательности образцов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism модель 3130x1 (Applied Biosystems). Генотипирование полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов и генов CllorßO, LRRC32 проводили с использованием системы для генотипирования OpenArray SNP Genotyping System (Applied Biosystems). Исследование полиморфных вариантов генов KIF3A, OVOL1 и ACTL9 выполняли при помощи ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией (FLASH/RTAS) (ООО «ТестГен», Москва).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ обеспечения MS Office Excel 2013 (Microsoft), PLINK (1.07) (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/index.shtml) (Purcell et al., 2007). Поправку на множественное тестирование вводили, используя метод оценки доли ложно-положительных результатов FDR (False Discovery Rate) (Benjamini, Hochberg, 1995). Анализ неравновесия по сцеплению и гаплотипический анализ выполняли с помощью программы Haploview 4.2 (Barett et al., 2005). Мета-анализ результатов исследований в трех выборках русской, татарской и смешанной этнической принадлежности проводили с использованием программы WinPepi v. 11.32 (http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html) (Abramson, 2011). Анализ межгенных взаимодействий выполняли при помощи программ MDR (Ritchie et al., 2001) и GMDR (Lou et al., 2007; Chen et al., 2011).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ мутаций и полиморфных вариантов генов, участвующих в формировании эпндермального барьера, у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе

В последнее время главную роль в развитии АД отводят повреждениям эпидермального барьера. Изменения последовательности нуклеотидов в генах, белковые продукты которых участвуют в формировании этого барьера, приводят к нарушению защитной функции эпителия, облегчению проникновения через него

аллергенов и микроорганизмов, общей сенсибилизации организма. В связи с этим нами было проведено исследование мутаций и полиморфных вариантов генов одних из основных белков, участвующих в поддержании целостности рогового слоя кожи -гена филаггрина FLG и гена ингибитора сериновых протеаз SPINK5, в группах больных АД и контроля различной этнической принадлежности.

Анализ мутаций в гене филаггрина у больных атоническим дерматитом и в контрольной группе индивидов

Мутации в гене филаггрипа являются основным из известных на сегодняшний день генетических факторов риска развития АД и других аллергических заболеваний на фоне АД (Palmer et al., 2006; Weidinger et al., 2007; Schuttelaar et al., 2009; Greisenegger et al., 2010; Irvine et al, 2011; Poninska et al, 2011; Li et al, 2013; Yu et al., 2013). Следствием мутаций является нарушение агрегации кератиновых филаментов и гидратации кожи, повышение чувствительности кожи к ультрафиолетовым лучам, изменение липидного состава, эпидермального гомеостаза и местного иммунного ответа (Jungersted et al., 2010; Mildner et al., 2010; Kezic et al., 2011).

Нами проведен анализ частоты встречаемости трех распространенных в европейских популяциях мутаций c.2282del4 (c.2282delAGCT), p.Arg50IX(с.1501С>Т) и p.Arg2447X (C.73390T) в гене FLG у больных АД и индивидов контрольной группы. Установлено, что в Республике Башкортостан наиболее часто встречающейся мутацией гена FLG является делеция c.2282del4, аллельная частота которой в объединенной выборке индивидов у больных АД составляет 6,61%, в контроле -1,12%. Данная мутация выявлена у 12,3% больных АД (у 4-х человек в гомозиготном состоянии и 50-ти человек - в гетерозиготном) и 2,23% индивидов контрольной группы (у 9-ти человек в гетерозиготном состоянии).

У больных АД русской и татарской этнической принадлежности частота мутации c.2282del4 в гене FLG была статистически значимо выше, чем у здоровых индивидов соответствующих контрольных групп (Рисунок 1). У русских мутация c.2282del4 обнаружена в гетерозиготном состоянии у 21-го больного АД (12,07%) и двух индивидов (1,33%) контрольной группы. Аллельная частота мутации c.2282del4 у больных АД составила 6,03%, а в соответствующем контроле — 0,97% (р=2,3*10"4, OR=9,57). У русских со среднетяжелой формой заболевания эта мутация встречалась с аллельной частотой 5,96% (p=2,9*10'<1; OR=9,44), а у больных тяжелой формой АД -с частотой 6,25% (р=0,0025; OR=9,93). В группе русских, больных АД без сопутствующих A3, аллельная частота этой делеции составляла 6,79% (р=0,00015; OR=10,85), у больных АД с сопутствующими A3 - 5,32% (р=0,0011; OR=8,47).

Рисунок 1. Исследование мутации c.2282de!4 в гене FLG.

А - Электрофореграмма рестрикционного анализа: дорожка 1 - образец ДНК больного АД. гомозиготы по мутации c.2282de/4, 2 - 8 - образцы ДНК без мутации c.2282del4, 9 - образец ДНК гетерозиготы по мутации. 10 - контрольный образец ДНК без мутации; Б - Аллельная частота мутации c.2282del4 гена филаггрина у больных АД русской и татарской этнической принадлежности.

В группе больных АД татарской этнической принадлежности обнаружено трое гомозиготных носителей делеции c.2282del4 (2.44%) и 17 гетерозигот по этой мутации (13,82%), в контроле она выявлена у одного индивида (0.92%) в гетерозиготном состоянии. Аллельная частота делеции c.2282del4 у больных АД составила 9,35%, в контрольной группе - 0,46% (р= 1,6*10"5, OR=22.38). У татар, больных АД средней тяжести, эта делеция встречалась с аллельной частотой 8,74% (р=0.00004; OR=20.78), у больных тяжелой формой АД ее частота была выше -12.50% (р=0,000003: OR=3LO). В группе больных АД. не имеющих сопутствующих A3, данная мутация была обнаружена с аллельной частотой 10.45% (р=0,000007; OR=25.32), у больных АД с сопутствующими A3 - 8,04%.

Среди индивидов смешанной этнической принадлежности мутация c.2282del4 выявлена у 12-ти больных АД (8,51%) в гетерозиготном состоянии и у одного (0,71%) - в гомозиготном. В контроле гетерозиготными носителями мутации являлись шесть человек (4,17%). Аллельная частота делеции c.2282del4 у больных АД составила 4.96%, а в контроле - 2,08%.

Проведен мета-анализ результатов исследования мутации c.2282del4 в гене филаггрина в трех выборках - русских, татар и метисов. Обнаружен высокий уровень гетерогенности исследуемых выборок по частоте встречаемости данной мутации (критерий гетерогенности Хиггинса 12=66,2%), в связи с чем рассматривалась модель со случайным эффектом (метод Дерсимоняна-Лэйрда). Выявлены статистически значимые различия между выборками больных АД и контрольной группой по частоте

встречаемости делеции c.2282del4 (р=0,0051). Показатель отношения шансов (OR) для мутантного аллеля по делеции c.2282del4 составил 5,76 (С195% 1,69-19,58).

Сравнение полученных результатов с данными литературы показало, что определенные в наших группах больных АД частоты гетерозиготного носительства мутации c.2282del4 сходны значениям их у больных АД европеоидного происхождения - голландцев (16,1%), немцев (13,6%) (Schuttelaar et al., 2009; Greisenegger et al., 2009), а также русских (9%) из г. Новосибирска (Саликова, 2011). У ирландцев с АД частота данной мутации была выше - она определялась у 26,9% больных, а у поляков ниже - у 6,0% больных (Palmer et al., 2006; Poninska et al., 2011).

Мутация p.Arg501X является второй по распространенности в популяциях Европы, однако в нашем исследовании была обнаружена низкая частота встречаемости этой мутации в РБ. В группе русских она выявлена в гетерозиготном состоянии у 3-х больных АД и у 4-х индивидов контроля (Рисунок 2). Аллельная частота мутации p.Arg501X составила 0,90% у больных АД и 1,36% в контроле. У татар данная замена в гетерозиготном состоянии обнаружена у 2-х больных АД и 1-го здорового индивида, аллельная частота мутации у больных АД равна 0,85%, у индивидов контрольной группы — 0,47%. Среди больных АД смешанной этнической принадлежности выявлены один гомозиготный и один гетерозиготный носители мутации p.Arg50IX, аллельная частота мутации составила 0,66%. В контрольной группе метисов обнаружен один гетерозиготный носитель этой мутации, аллельная частота мутации - 0,29%. В объединенной выборке индивидов различной этнической принадлежности аллельная частота мутации p.Arg501X составила 0,92% у больных АД и 0,71% в контроле.

Рисунок 2. Идентификация мутации p.Arg501X в гене FLG. А - SSCP-анализ: дорожка 1 - контроль, дорожки 2-5, 7, 8 - образцы ДНК больных АД, не имеющих мутации p.Arg501X, 6 - образец ДНК гетерозиготы по мутации p.Arg50IX; Б - сиквенс ДНК больного АД, гетерозиготы по мутации; В - сиквенс образца ДНК из контрольной группы.

Полученные нами данные согласуются с результатами ранее проведенных исследований: частота гетерозиготного носительства мутации p.Arg501X у больных АД из г. Новосибирска составляет 2.1%, у больных АД немецкого происхождения -2%, польского - 1,5% (Stemmler et al., 2007; Weidinger et al„ 2007; Poninska et al„ 2011; Саликова, 2011). В ряде исследований у больных АД частота мутации p.Arg501Xбыла выше - от 6% в Нидерландах и Австрии до 25% в Англии и 40% в Ирландии (Palmer et al., 2006; Barker et al., 2007; Greisenegger et al., 2009; Schuttelaar et al., 2009; Irvine et al.,2011).

Мутация p.Arg2447X в рассмотренных нами группах также являлась редкой (Рисунок 3). У русских данная мутация не выявлена. Среди татар гетерозиготными носителями мутации являлись 4 больных АД и 2 индивида контрольной группы. Аллельная частота мутации p.Arg2447X у татар, больных АД, составила 1,75%, в контроле - 1,33%. Среди индивидов смешанной этнической принадлежности эта мутация обнаружена у 3-х больных АД в гетерозиготном состоянии, аллельная частота мутации - 0,97%. В объединенных группах больных АД и контроля различной этнической принадлежности аллельная частота мутации p.Arg2447X составила 0,82% и 0.31%, соответственно.

Наши результаты согласуются с литературными данными, по которым мутация p.Arg2447Xвстречается с аналогичными частотами у больных АД из Ирландии (1,9%) и Германии (1%) (Sandilands et al., 2007: Weidinger et al., 2008: Greisenegger et al., 2010).

Рисунок 3. Идентификация мутации p.Arg2447X в гене FLG. А - электрофореграмма рестрикционного анализа: дорожка 1 - контроль, дорожки 2, 3, 5, 6. 7 - образцы ДНК больных АД, не имеющих мутации. 4 - образец ДНК гетерозиготы по мутации, Б -сиквенс ДНК больного АД, гетерозиготы по мутации. В - сиквенс образца ДНК из контрольной группы.

В целом, у 68-и человек (15.49%) объединенной выборки больных АД из Республики Башкортостан выявлены мутации в гене филаггрина: c.2282de!4 - у 50-ти человек в гетерозиготном состоянии и у 4-х - в гомозиготном; p.Arg501X - у 6-ти

индивидов в гетерозиготном состоянии и у 1-го - в гомозиготном; p.Arg2447X- у 7-и человек в гетерозиготном состоянии. Проведенное исследование свидетельствует о важной роли мутаций гена филаггрина, в особенности делении c.2282del4, в развитии атопического дерматита.

Анализ полиморфных вариантов гена SPINKS у больных атоническим дерматитом и в контрольной группе

Ген SPINK5 кодирует белок LEKTI, ингибитор сериновых протеаз, участвующий в поддержании целостности эпидермального барьера. Нами проведено исследование полиморфных вариантов rs77532553 (c.-206G>A) и rs2303067 (c.1258G>A, p.Glu420Lys) гена SPINKS у больных АД и в контрольной группе индивидов. У русских выявлена ассоциация полиморфного локуса rs77S32553 гена SPINKS с развитием АД. У больных достоверно чаще, чем в контроле, выявлялся генотип rs77532553*G/A (р=0,0347; OR=3,13). Кроме того, обнаружено, что в данной этнической группе генотип rs77532553*G/A (р=0,0225; OR=3,73) и аллель rs77532553*A (р=0,0329; OR=2,85) являются маркерами повышенного риска развития АД без сопутствующих A3, а генотип rs77532553*G/G (р=0,0259; (Ж=0,3) - маркером пониженного риска развития заболевания. По литературным данным, описанный полиморфный локус также ассоциирован с развитием аллергических заболеваний у китайцев (Liu et al., 2009).

При анализе полиморфного локуса rs2303067 (p.Glu420Lys) гена SPINKS не обнаружено достоверных различий между группами больных АД и здоровых индивидов русской и татарской этнической принадлежности.

Проведенный мета-анализ результатов исследования двух полиморфных локусов гена SPINKS в трех исследованных выборках — русских, татар и метисов, не выявил статистически значимых различий между больными АД и контролем.

Таким образом, в результате исследования полиморфных вариантов и мутаций генов, ответственных за формирование эпидермального барьера, нами обнаружена ассоциация генотипа rs77532S53*G/A полиморфного локуса rs77532553 гена SPINK5 с развитием АД у русских, а также показана значимость мутации c.2282del4 в гене филаггрина в развитии АД у индивидов различной этнической принадлежности, проживающих в Республике Башкортостан.

Анализ полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов, генов Cllorf30 и LRRC32 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе

В развитии аллергических заболеваний значительную роль играют полиморфные локусы генов образ-распознающих рецепторов, которые способны

узнавать консервативные молекулярные структуры различных патогенов и аллергенов, запуская систему врожденного иммунитета (Ahmad-Nejad et al., 2004; Novak et al., 2007; Kormann et al., 2008). С использованием системы OpenArray SNP Genotyping System в группах больных АД и контроля нами проведено генотипирование 62 полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов - То11-подобных рецепторов (TLRI, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR9, TLR10), NOD-подобных рецепторов (NODI, NOD2), рецептора липополисахаридов CD 14, а также генов CllorßO и LRRC32, локализованных в области 1Ц13.5 и выявленных при полногеномном анализе ассоциации АД. После проведения контроля качества гснотипирования для анализа ассоциации было отобрано 57 ОНП, прогенотипированных у 257 больных (104 русских, 61 татарин и 92 метиса) и 244 индивидов контрольной группы (90 русских, 73 татарина и 81 метис). Генотипирование данных полиморфных вариантов проводилось одновременно, в связи с чем при анализе ассоциации нами была введена поправка на множественность сравнений FDR (false dicovery rate) (Benjamini, Hochberg, 1995). В качестве статистически значимых рассматривались результаты с FDR<0,05.

У русских наиболее высокий уровень ассоциации с АД выявлен по полиморфному варианту rs5743571 (с.-160+438С>Т) гена TLRI. Маркерами повышенного риска развития заболевания в данной группе являются аллель rs5743571*C (р=0,0004, FDR=0,0234, OR=2,98) и генотип rs5743571*C/C (р=0,0021, OR=2,96) (Рисунок 4А). Кроме того, выявлена ассоциация АД у русских с полиморфным вариантом rs5743794 (g.30712C>T) гена TLR6: маркерами повышенного риска развития заболевания являются аллель rs5743794*C (р=0,0017, FDR=0,0496, OR=2,23) и генотип rs5743794*C/C (р=0,002, OR=2,68) (Рисунок 4Б). Следует отметить, что ранее была обнаружена ассоциация полиморфных вариантов генов TLR1 и TLR6 с развитием бронхиальной астмы и аллергического ринита в европейских популяциях (Tantisira et al., 2004; Hoff]an et al., 2005; Kormann et al., 2008), однако ассоциации этих генов с развитием АД выявлено не было.

У индивидов татарской этагической принадлежности между группами больных АД и здоровых индивидов выявлены различия в распределении частот аллелей по полиморфным локусам rsl816702 (р=0,0406) и rs4696483 (р=0,0249) гена TLR2, которые, однако, не достигли уровня статистической значимости при введении поправки на множественность FDR.

При анализе ассоциации полиморфных локусов генов TLR4, TLR5, TLR9, NODI, NOD2, CD14, CllorßO и LRRC32 статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов этих локусов в выборках больных АД и контроля не обнаружено.

OR-2,96 р-0,0021 /

сс ст тт

I Больные АД Контроль

СС СТ ТТ I Больные АД

А Б

Рисунок 4. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных локусов rs5743571 гена TLR1 (рисунок А) и rs5743794 гена TLR6 (рисунок Б) у больных АД и в контрольной группе индивидов русской этнической принадлежности.

Проведен анализ неравновесия по сцеплению полиморфных вариантов генов TLR1, TLR6 и TLRI0, локализованных в области 4р14. У русских и татар выявлен одинаковый гаплоблок протяженностью 31 т.п.н., включающий 7 полиморфных локусов (rsl 1466617, rsl0004195, rs4543123, rs4833095. rs5743604, rs5743571 и rs210152I) (Рисунок 5). В результате гаплотипического анализа по полиморфным вариантам данного гаплоблока обнаружены статистически значимые различия между больными АД и контрольной группой индивидов русской этнической принадлежности: наиболее распространенный гаплотип TTATACG встречался в группе больных значительно чаще (78,3%), чем в контроле (66,0%, р=0,0159). Кроме того, в группе больных АД была выше частота гаплотипа TAGCGCA (р=0,0043) и ниже - гаплотипа TAGCGTA (р=0,0194).

Мета-анализ результатов исследования полиморфных локусов генов образ-распознающих рецепторов, генов Cllorf30 и LRRC32, проведенный в трех выборках (русских, татар и индивидов смешанной этнической принадлежности) подтвердил ассоциацию с развитием АД полиморфных локусов rs5743571 (ORc=l,91, р=2,7хЮ"4) гена TLR1 и rs5743794 (ORc=l,66, р=0,001) гена TLR6, выявленную нами ранее у русских. Кроме того, была обнаружена ассоциация с развитием заболевания ОНП rs5743604 (ORa=1,50, р=0,011) гена TLR1, rsl 1466617 (ORT=l,55, р=0,019) гена TLR10 и rs2508755 (ORg=1,45, р=0,003) гена регулятора транскрипции EMSY С11ог/30 (chromosome 11 open reading frame 30) (Таблица 1).

А Б

Рисунок 5. Структура неравновесия по сцеплению между полиморфными локусами, локализованными в области 4р 14: А - у русских, Б - у татар (Нар1оу1е\у 4.2). Черными линиями очерчен гаплотипический блок. В ячейках указаны значения коэффициента неравновесия по сцеплению Б'. Различные оттенки красного цвета отображают силу неравновесия по сцеплению между ОН П.

Таблица 1

Результаты мета-анализа исследованных полиморфных локусов у больных АД и индивидов контрольной группы русской, татарской и смешанной этнической

принадлежности

Ген № rs Аллели Модель с фиксированным эффектом Модель со случайным эффектом Q I2

Р OR P(R) OR(R)

TLR1 5743571 С 2,7x10"4 1,91 0,011 1,88 0,1451 48,7%

Т 2,7x10"4 0,52 0,011 0,53 0,1451 48,7%

TLR1 5743604 А 0,011 1,50 - - 0,3696 0%

G 0,011 0,67 - - 0,3696 0%

TLR6 5743794 С 0,001 1,66 - - 0,3441 6,6%

Т 0,001 0,60 - - 0,3441 6,6%

TLR10 11466617 Т 0,019 1,55 - - 0,3811 0%

С 0,019 0,64 - - 0,3811 0%

СИофО 2508755 G 0,003 1,45 0,7497 0%

А 0,003 0,69 0,7497 0%

Примечание: Р - p-value fixed, P(R) — p-value random, Q - критерий гетерогенности Кохрена, I2 - критерий гетерогенности Хиггинса.

В целом, результаты данной работы подтверждают значительную роль системы врожденного иммунитета в патогенезе атопического дерматита и значимость

изменений нуклеотидных последовательностей генов ТоН-подобных рецепторов TLR1. TLR6 и TLR10 в развитии этого заболевания. Кроме того, проведенное исследование свидетельствует об участии полиморфного варианта гена регулятора транскрипции EMSY Cllorf30 в развитии атопического дерматита у жителей Республики Башкортостан.

Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с атопическим дерматитом в Республике Башкортостан

Цитокины играют ключевую роль во всех стадиях развития и поддержания аллергического воспаления. Нами проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных локусов rs2243250 гена IL4, rs2054I гена IL13, rsl805010 гена IL4R, rsl 7809012 гена CCL11, rsl800629 гена TNF А и rs1800872 гена ILIO у больных АД и в контрольной группе. Установлена ассоциация АД у русских с полиморфным вариантом rsl800872 (с.-627С>А) гена ILIO. Маркером повышенного риска развития АД, не сопровождающегося сопутствующими аллергическими заболеваниями, является генотип rs!800872*A/C (р=0,0406; OR=l,91) (Рисунок 6).

80 60 40 20 0

Генотип АА и Контроль

Рисунок 6. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rsl800872 гена ILIO у больных АД и в контрольной группе индивидов русской этнической принадлежности.

Исследование других полиморфных вариантов генов цитокинов не выявило статистически значимых различий между группами больных АД и контроля различной этнической принадлежности. Достоверных различий, как в группе русских.

OR=l,91 р=0,0406

Генотип АС Генотип СС ■ Больные только АД

Аллель А и Общая rpyi

•Я

Аллель С больных АД

так и у татар, не обнаружено и при сравнении с контролем групп больных АД различной степени тяжести и групп больных АД с сопутствующими аллергическими заболеваниями или без них.

Проведенный мета-анализ результатов исследования полиморфных вариантов генов цитокинов в трех выборках - русских, татар и метисов, не выявил статистически значимых различий между группами больных АД и индивидов контроля.

Таким образом, в результате проведенной нами работы обнаружена ассоциация полиморфного варианта rs!800872 гена ILIO с развитием атопического дерматита, не сопровождающегося другими аллергическими заболеваниями, у русских.

Анализ полиморфных вариантов генов, выявленных при полногеномных исследованиях, у больных атоническим дерматитом и в контрольной группе

Полногеномные исследования АД, проведенные в европейских и азиатских популяциях, показали ассоциацию с развитием заболевания полиморфных локусов rs2897442 (c.I130-2278G>A) гена белка ЗА семейства кинезинов KIF3A (5q31.1), rs479844 (g.I0857752A>G) гена человеческого гомолога гена ovo дрозофилы OVOL1 (llql3.1) и rs2164983 (g.52I83C>A), расположенного выше области гена актин-подобного белка 9 ACTL9 (19р13.2) (Paternoster et al., 2011; Hirota et al., 2012).

Нами проведен анализ ассоциации данных полиморфных вариантов с развитием АД у индивидов русской и татарской этнической принадлежности. Статистически значимых различий между больными АД и здоровыми индивидами не выявлено. Различия между контролем и больными АД различной степени тяжести и больными АД с сопутствующими A3 и без них также не обнаружены.

Проведенный мета-анализ в трех выборках индивидов русской, татарской и смешанной этнической принадлежности также свидетельствует об отсутствии ассоциации изученных полиморфных вариантов генов KIF3A, OVOL1 и ACTL9 с развитием атопического дерматита в Республике Башкортостан. Таким образом, в результате проведенной репликации результатов полногеномного анализа не выявлено ассоциации исследованных полиморфных локусов с развитием АД.

Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к атопическому дерматиту

При прогнозировании риска развития заболевания необходимо учитывать сложные взаимодействия различных генетических факторов, которые лежат в основе генетической предрасположенности к многофакторной патологии. Нами проведена оценка вклада полиморфных вариантов изученных ДНК-локусов и роли межгенных

взаимодействий в детерминацию риска развития атопического дерматита при помощи программ MDR и GMDR.

Определены две оптимальные статистически значимые модели межгенных взаимодействий, ассоциированные с развитием АД у русских. В состав четырехлокусной модели входят полиморфные варианты генов То11-подобных рецепторов: TLRI (rs5743571) - TLR2 (rsl816702) - TLR6 (rs5743794) - TLR10 (rs11466617) (Рисунок 7A). Анализ информационной значимости полиморфных локусов данных генов показал наиболее значимый вклад генов TLR1 и TLR6, показатели энтропии (Н) по которым составили 6,93% и 6,18%, соответственно. Более низкий информационный вклад у полиморфного локуса гена TLR10 (Н=2,34%), минимальный вклад у полиморфного локуса гена TLR2 (Н=0,03%). Сбалансированная точность данной модели составила 65,98%, чувствительность - 82,3%, специфичность - 50,66%, воспроизводимость результата - 10/10, OR=4,83 (С195% 1,42-16,46), р = 0,0107.

Кроме этого, у русских определена шестилокусная модель межгепного взаимодействия FLG (c.2282del4) - ILIO (rsl800872) - OVOL1 (Ы79844) - TLR6 (rs5743794) - TLRI (rs5743571) - CllorßO (rs2508755) (Рисунок 7Б). Согласно данной модели, значительный вклад в формирование предрасположенности к данному заболеванию так же, как и в четырехлокусной модели, вносят полиморфные локусы генов TLR1 (Н=10,52%) и TLR6 (Н=9,53%), умеренный вклад у мутации c.2282del4 гена филаприна FLG (Н=2,05%) и полиморфного локуса гена регулятора транскрипции EMSY CllorßO (Н=2,35%). Данная модель обладает высокими показателями сбалансированной точности (91,21%), чувствительности (85,86%) и специфичности (96,56%), а также низким значением р=0,0010, что свидетельствует о её хорошей прогностической значимости.

Исследование ген-генных взаимодействий у индивидов татарской этнической принадлежности выявило оптимальную трехлокусную модель межгенных взаимодействий, предрасполагающую к развитию АД (Рисунок 7В). В ее состав входят полиморфные локусы генов FLG (c.2282del4), TLR2 (rsl816702) и CllorßO (rs2508755). Все три локуса вносят приблизительно одинаковый вклад в развитие атопического дерматита: показатели энтропии составляют НС/,„^д=6,58%; IW=5,76% и yi-rLC, =5,34%. Сбалансированная точность модели - 68,22%, чувствительность 88,29%, специфичность 51,16%, OR=7,13 (С195% 1,36-37,38), р = 0,0107.

Анализ межгенных взаимодействий подтвердил полученные нами при анализе ассоциации АД с отдельными полиморфными вариантами генов результаты и показал

наличие множества взаимосвязей между генами, которые в совокупности оказывают влияние на развитие атопического дерматита.

U.72%] ■ -2.1

^..... 1

Л

-

>

Синергия

Аддитивность

Синонимия

В

Рисунок 7. Оптимальные модели межгенных взаимодействий, предрасполагающие к развитию АД у русских (А, Б) и татар (В).

Таким образом, результаты проведенного нами исследования демонстрируют значимость мутаций и полиморфных вариантов генов FLG. SPINK5, TLR1, TLR6, TLRIO, CllorßO и ILIO в развитии АД у индивидов русской и татарской этнической принадлежности. Определены маркеры повышенного и пониженного риска развития атопического дерматита, выявлены ключевые межгенные взаимодействия, детерминирующие развитие этого заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Установлена ассоциация атопического дерматита с мутацией с.2282del4 в гене филаггрина FLG у индивидов русской и татарской этнической принадлежности. Аллельная частота мутации c.2282del4 в гене FLG у русских, больных АД, составляет 6,03%, у татар - 9,35%, в общей выборке больных из Республики Башкортостан -6,61%. Мутации p.R501X и p.R2447X в гене FLG у больных АД из РБ встречаются с низкой частотой (0,92% и 0,82%, соответственно), статистически значимо не отличающейся от их частоты в контрольной группе.

2. Обнаружено, что развитие атопического дерматита у русских ассоциировано с полиморфными вариантами генов ТоИ-подобных рецепторов TLR1 Сrs5743571) и TLR6 (rs5743794). Установлено, что гаплотипами повышенного риска развития АД у русских являются гаплотипы TTATACG и TAGCGCA по полиморфным вариантам генов TLR1, TLR6 и TLR10 (rs11466617, rs10004195, rs4543123, rs4833095, rs5743604, rs5743571 и rs2101521).

3. Показано наличие ассоциации полиморфных локусов генов ТоИ-подобных рецепторов TLR1 (rs5743571, rs5743604), TLR6 (rs5743794), TLR10 (rs11466617) и гена регулятора транскрипции EMSY CllorßO (rs2508755) с развитием атопического дерматита при мета-апализе в трех выборках русской, татарской и смешанной этнической принадлежности.

4. Установлена ассоциация полиморфных вариантов rsl800872 гена интерлейкина 10 (ILIO) и rs77532553 гена ингибитора сериновых протеаз SPINK5 с развитием у русских атопического дерматита, не сопровождающегося сопутствующими аллергическими заболеваниями.

5. Выявлены модели межгенных взаимодействий, ассоциированные с развитием атопического дерматита у русских (TLR1-TLR2-TLR6-TLR10 и FLG-IL10-OVOL!-TLR6-TLR1-C11оф0) и татар (FLG-TLR2-CllotßO).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых научных журналах:

1. Федорова, Ю.Ю. Роль полиморфных вариантов генов системы биотрансформации в развитии аллергических заболеваний у татар / Ю.Ю. Федорова, A.C. Карунас, А.Х. Нургалиева, O.A. Гра, Г.Ф. Гималова. H.H. Рамазанова, JI.JI. Гурьева, А.Р. Бикташева, Э.И. Эткина, И.В. Голденкова-Павлова, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2010. - №6. - С.28-35.

2. Федорова, Ю.Ю. Анализ ассоциации полиморфных вариантов гена дизинтегрина и металлопротеазы 33 (ADAM33) с развитием бронхиальной астмы в Республике Башкортостан / Ю.Ю. Федорова, A.C. Карунас, Г.Ф. Гималова, H.H. Рамазанова, JI.JI. Гурьева, Л.А. Мухтарова, P.P. Мурзина, Р.Ф. Гатиятуллин, Ш.З.

Загидуллин, Э.И. Эгкина, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2011. - Т.10. - №8. - С.23-29.

3. Карунас, А.С. Полногеномный анализ ассоциации бронхиальной астмы в Волго-Уральском регионе России / А.С. Карупас, Б.Б. Юнусбаев, Ю.Ю. Федорова, Г.Ф. Гималова. Н.Н. Рамазанова, Л.Л. Гурьева, Л.Л. Мухтарова, Ш.З. Загидуллин, Э.И. Эткина, Э.К. Хуснутдинова // Молекулярная биология. - 2011. - Т. 45., №6. - С. 1-12.

4. Карунас, А.С. Анализ ассоциации мутаций в гене FLG с развитием аллергических заболеваний / А.С. Карунас, Г.Ф. Гималова, Ю.Ю. Федорова, М.М. Юнусбаева, Н.Н. Рамазанова, Л.Л. Гурьева, Э.Р. Гуменная, С.В. Левашева, А.Р. Бикташева, Л.А. Мухтарова, Ш.З. Загидуллин, Э.И. Эткина, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2012. - №1. - С.40-46.

5. Гималова, Г.Ф. Молекулярно-генетические аспекты атопического дерматита / Г.Ф. Гималова, А.С. Карунас, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика. - 2012. -№12.-С.18-26.

6. Карунас, А.С. Исследование роли полиморфных вариантов генов цитокинов в развитии бронхиальной астмы в Республике Башкортостан / А.С. Карунас, Ю.Ю. Федорова, Н.Н. Рамазанова, Е.С. Галимова, Г.Ф. Гималова. Л.Л. Гурьева, С.В. Левашева, А.Р. Бикташева, Л.А. Мухтарова, Ш.З. Загидуллин, Э.И. Эткииа, Э.К. Хуснутдинова // Пульмонология. - 2012. - №5. - С.55-59.

Тезисы докладов и статьи в сборниках конференций:

7. Гималова. Г.Ф. Анализ ассоциации мутаций в гене филаприна с атопическим дерматитом в Республике Башкортостан / Г.Ф. Гималова, А.С. Карунас, Ю.Ю. Федорова, М.М. Имангулова, Э.Р. Гуменная, А.Р. Бикташева, С.В. Левашева, Э.И. Эткина, Э.К. Хуснутдинова // Материалы II Всероссийской школы-конференции по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века». -Уфа: 2011.-Т.1 -№2. - С. 29-30.

8. Гималова. Г.Ф. Анализ ассоциации мутации 2282del4 в гене филаггрина с аллергическими заболеваниями в Республике Башкортостан / Г.Ф. Гималова, Ю.Ю. Федорова, А.С. Карунас, Э.К. Хуснутдинова, P.P. Валиев // Студент и наука. -2010. -С.78-79.

9.Gimalova. G. Analysis of filaggrin loss-of-function mutations in atopic dermatitis patients and populations of the Volga-Ural region of Russia / G. Gimalova, A. Karunas, Y. Fedorova, E. Gumennaya, M. Imangulova, A. Biktasheva, S. Levashova, E. Etkina, E. Khusnutdinova // 30th Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology. - Istanbul. - 2011. - P.57.

10. Gimalova. G.F. Association analysis of cytokine gene polymorphisms and atopic dermatitis in Volga-Ural region of Russia / G.F. Gimalova, A.S. Karunas, Y.Y.

Fedorova, E.R. Gumennaya, S.V. Levashova, A.R. Biktasheva, E.I. Etkina, E.K. Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. - 2011. - Amsterdam. - P.273.

11. Карунас, A.C. Исследование генетической предрасположенности к аллергическим заболеваниям в Республике Башкортостан / А.С. Карунас, Ю.Ю. Федорова, А.Х. Хузина, Г.Ф. Гималова. Н.Н. Рамазанова, Л.Л. Гурьева, С.В. Левашева, А.Р. Бикташева, JI.A. Мухтарова, Э.Р. Гуменная, P.P. Мурзина, Р.Ф. Гатиятуллин, Ш.З. Загидуллин, Э.И. Эткина, Э.К. Хуснутдинова // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» - Курск. - 2011. - С.59-60.

12. Гималова. Г.Ф. Полиморфные варианты генов толл-подобных рецепторов TLR1 и TLR10 в развитии атопического дерматита в Республике Башкортостан / Г.Ф. Гималова, А.С. Карунас, Ю.Ю. Федорова, Э.Р. Гуменная, С.В. Левашова, А.Р. Бикташева, Э.И. Эткина, Э.К. Хуснутдинова // Материалы Всероссийской школы - конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов» - Уфа. - 2012. -С.43-46.

13. Гималова. Г.Ф. Ассоциация полиморфных локусов, расположенных на хромосоме llql3.5, с развитием атопического дерматита в Республике Башкортостан / Г.Ф. Гималова, А.С. Карунас, Ю.Ю. Федорова, Э.Р. Гуменная, С.В. Левашева, А.Р. Бикташева, Э.И. Эткина, Э.К. Хуснутдинова // Материалы III Всероссийской школы -конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века». - Уфа. - 2012. - С. 33-34.

14. Гималова, Г.Ф. Ассоциация полиморфных вариантов генов цитокинов с развитием атопического дерматита в Республике Башкортостан / Г.Ф. Гималова, А.С. Карунас, Ю.Ю. Федорова, Э.Р. Гуменная, С.В. Левашова, А.Р. Бикташева, Э.И. Эткина, Э.К. Хуснутдинова // Материалы V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт -основа профилактической медицины в век нанотехнологий» - Санкт-Петербург. -2012.-С.30.

15. Gimalova, G.F. Cytokine gene polymoiphisms are associated with atopic dermatitis in Volga-Ural region of Russia / G.F. Gimalova, A.S. Karunas, Y.Y. Fedorova, E.R. Gumennaya, S.V. Levashova, A.R. Biktasheva, E.I. Etkina, E.K. Khusnutdinova // EAACI Congress. - Geneva. - 2012. - P.83.

16. Gimalova. G.F. Toll-like receptor genes variants and atopic dermatitis in Volga-Ural region of Russia / G.F. Gimalova, E. Prans, A.S. Karunas, Y.Y. Fedorova, E.R. Gumennaya, S.V. Levashova, A.R. Biktasheva, F..I. Etkina, S. Koks, E.K Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. - Nuremberg. - 2012. - P.223.

17. Gimalova. G.F. Genetic variation in toll-like receptor genes and atopic dermatitis in Volga-Ural region of Russia / G.F. Gimalova, E. Prans, A.S. Karunas, Y.Y.

Fedorova, E.R. Gumennaya, S.V. Levashova, E.I. Etkina, S. Koks, E.K. Khusnutdinova // European Human Genetics Conference. - Paris - 2013. - P.465.

18. Gimalova. G.F. Toll-like receptor gene polymorphisms are associated with atopic dermatitis in Volga-Ural region of Russia / G.F. Gimalova, E. Prans, A.S. Karunas, Y.Y. Fedorova, E.R. Gumennaya, S.V. Levashova, E.I. Etkina, S. Koks, E.K. Khusnutdinova // EAACI-WAO Congress. - Milan. - 2013. - P.71.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АД Атопический дерматит

A3 Аллергические заболевания

SNP Single nucleotide polymorphism

ПДРФ Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

ПЦР Полимеразная цепная реакция

FLG Филаггрин

SPINK5 Ингибитор сериновых протеаз LEKTI

IL4 Интерлейкин 4

IL4R а-цепь рецептора интерлейкина 4

ILIO Интерлейкин 10

IL 13 Интерлейкин 13

CCL11 Эотаксин

TNF Фактор некроза опухолей

TLR То11-подобный рецептор

NOD NOD-подобный рецептор

CllorßO Фактор транскрипции EMSY

LRRC32 Белок 32, содержащий лейцин-богатые повторы

K1F3A Белок ЗА семейства кинезинов

OVOL1 Транскрипционный фактор Ovo-like 1

ACTL9 Актин-подобный белок 9

OR Odds Ratio (отношение шансов)

95%CI Confidence interval (доверительный интервал)

GMDR Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction

Подписано в печать 14.11.2013. Бумага офсетная. Формат 60X84/16. Гарнитура Times. Усл.печ. л. 1,40. Тираж 100 зкч. Заказ 745.

Типография ИИЯЛ УНЦ РАН г.Уфа, пр. Октября, 71. тел. (347)235-60-50

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гималова, Галия Фуатовна, Уфа

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

04201452807

На правах рукописи

Гималова Галия Фуатовна

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н. Карунас А.С.

Уфа-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................10

1.1. Этиология и патогенез атопического дерматита....................................................11

1.2. Гены предрасположенности к атопическому дерматиту..................................15

1.2.1 Гены цитокинов....................................................................................................................21

1.2.2 Гены, участвующие в формировании эпидермального

барьера........................................................................................................................................27

1.2.3 Гены образ-распознающих рецепторов..........................................................32

1.3. Межгенные и ген-средовые взаимодействия............................................................38

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................41

2.1. Материалы исследования............................................................................................................41

2.2.Методы исследования....................................................................................................................42

2.2.1. Выделение геномной ДНК............................................................................................42

2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК..............................................43

2.2.3. Рестрикционный анализ................................................................................................43

2.2.4. Метод электрофореза............................................................................................................44

2.2.5. SSCP-анализ..............................................................................................................................44

2.2.6. Генотипирование полиморфных локусов с использованием системы OpenArray SNP Genotyping System......................................................46

2.2.7. Статистическая обработка полученных результатов..............50

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................................................54

3.1. Анализ мутаций и полиморфных вариантов генов, участвующих в

формировании эпидермального барьера, у больных атопическим

дерматитом и в контрольной группе..............................................................................54

3.1.1. Анализ мутаций в гене филаггрина у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе....................................................................54

3.1.2. Мета-анализ результатов исследования мутаций гена филаггрина..........................................................................................................................................66

3.1.3. Анализ полиморфных вариантов гена SPINK5 у больных

атопическим дерматитом и в контрольной группе............... 67

3.2.Исследование полиморфных локусов генов образ-распознающих рецепторов и генов CllorßO и LRRC32 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе...................................... 75

3.2.1. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов и генов CllorßO и LRRC32 с развитием атопического дерматита..................................... 75

3.2.2. Анализ ассоциации гаплотипов полиморфных локусов генов образ-распознающих рецепторов, локализованных в области 4р14, с атопическим дерматитом...................................... 87

3.2.3. Мета-анализ результатов исследования полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов и генов CllorßO и LRRC32........................................................ 89

3.3.Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов цитокинов с атопическим дерматитом в Республике Башкортостан................. 94

3.3.1. Анализ полиморфного локуса rs2243250 гена 1L4 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе................. 94

3.3.2. Анализ полиморфного локуса rs1800872 гена ILIO у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе................ 98

3.3.3. Анализ полиморфного локуса rs20541 гена IL13 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе................. 103

3.3.4. Анализ полиморфного локуса rs1805010 гена IL4R у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе................. 106

3.3.5. Анализ полиморфного локуса rs17809012 гена CCL11 у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе .... 110

3.3.6. Анализ полиморфного локуса rs1800629 гена TNF А у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе.................. 114

3.4.Анализ полиморфных локусов, выявленных при полногеномных исследованиях, у больных атопическим дерматитом и в контрольной группе..............................................................................118

3.5.Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании

предрасположенности к атопическому дерматиту............................................128

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................................................................................135

ВЫВОДЫ........................................................................................................................................................................144

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ....................................145

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................................146

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Атопический дерматит (АД) - хроническое рецидивирующее воспалительное заболевание кожи аллергической природы, для которого характерна возрастная особенность локализации, интенсивный зуд и гиперчувствительность к аллергенам и неспецифическим раздражителям (Odhiambo et al., 2009). В течение последних десятилетий заболеваемость АД существенно выросла, и в настоящее время распространенность его составляет в среднем 10-20% (Odhiambo et al., 2009, Pawankar et al., 2011). Заболевание чаще встречается у детей и, как правило, проявляется в возрасте до 1 года. У большинства больных атопический дерматит является первым проявлением аллергии, на фоне которого в дальнейшей жизни могут развиться бронхиальная астма и аллергический ринит (Spergel, Palier, 2003). АД может продолжаться и в зрелом возрасте, существенно ухудшая качество жизни больных (Beattie et al., 2006).

АД имеет многофакторную природу и развивается при взаимодействии таких эндогенных факторов, как генетическая предрасположенность и атопия, с различными аллергенными и неаллергенными факторами внешней среды (Schultz Larsen, 1993; Bisgaard et al., 2008). Молекулярно-генетические исследования АД с использованием современных методов и подходов значительно расширили знания о генетических факторах, способствующих формированию наследственной предрасположенности к данному заболеванию. Проведено множество ассоциативных исследований полиморфных локусов генов-кандидатов АД, которые показали, что в этиопатогенезе заболевания активное участие принимают гены, вовлеченные в атопический иммунный ответ организма - гены интерлейкинов IL4, ILIO, IL13, IL18, IL25, IL33, тимусного стромального лимфопоэтина TSLP; в регуляцию барьерной функции эпителия - гены филаггрина FLG и ингибитора сериновых протеаз SPINK5; в распознавание консервативных структур микроорганизмов - гены образ-распознающих

рецепторов (TLR1, TLR2, TLR6, TLR9, TLR10, NODI, NOD2) и др. (Kawashima et al., 1998; Chavanas et al., 2000; Tsunemi et al., 2002; Ahmad-Nejad et al., 2004; Hosomi et al., 2004; Palmer et al., 2006; Sohn et al., 2007; Barnes K.C., 2010; Gao et al., 2010; Qian et al., 2010; Bussmann C. et al., 2011; Behniafard et al., 2012). Показано, что важный вклад в развитие этого заболевания вносят различные взаимодействия генов между собой и с факторами окружающей среды (Cramer et al., 2010; Lesiak et al., 2011; Namkung et al., 2011; Deleuran et al., 2012). В результате полногеномных анализов сцепления выявлены хромосомные области, тесно сцепленные с развитием АД (lq21, 3q21, Зр24-22, 17q25) (Lee et al., 2000; Cookson et al., 2001; Bradley et al., 2002), идентифицирован позиционно-клонированный ген АД, кодирующий эпидермальный коллаген COL29A1 (3q22.1) (Soderhall et al., 2007). Полногеномные анализы ассоциации АД позволили определить полиморфные локусы, ассоциированные с данным заболеванием и локализованные в областях llql3.5 (гены CIlorf30, LRRC32) (Esparza-Gordillo et al., 2009); llql3.1 (ген OVOL1 - человеческий гомолог гена ovo дрозофилы), 19р13.2 (ген актин-подобного белка 9 - ACTL9) и 5q31.1 (ген белка ЗА семейства кинезинов - KIF3A) (Paternoster et al., 2011; Hirota et al., 2012).

В России генетические исследования атопического дерматита единичны (Саликова и др., 2010; Тюменцева и др., 2011; Фрейдин и др., 2011; Карунас и др., 2012), а комплексное изучение роли генов цитокинов, образ-распознающих рецепторов и белков, ответственных за формирование и поддержание барьерной функции эпидермиса, в развитии АД ранее не проводилось. В связи с этим актуальным является углубленное молекулярно-генетическое исследование этой многофакторной патологии, которое позволит подробно охарактеризовать генетическую основу предрасположенности к АД, достоверно оценить роль исследуемых генов в развитии этого заболевания, что может послужить основой для разработки способов его прогнозирования и подходов ДНК-диагностики.

В связи с вышеизложенным, были определены цели и задачи настоящего исследования.

Цель работы

Анализ роли полиморфных вариантов и мутаций генов-кандидатов в развитии атопического дерматита в Республике Башкортостан.

Задачи исследования

1. Провести анализ мутаций и полиморфных вариантов генов, участвующих в формировании эпидермального барьера - филаггрина FLG и ингибитора сериновых протеаз SPINK5, у больных атопическим дерматитом и индивидов контрольной группы.

2. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов у больных атопическим дерматитом и индивидов контрольной группы.

3. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов цитокинов - интерлейкина 4 (IL4), а-цепи рецептора интерлейкина 4 (IL4R), интерлейкина 13 (IL13), интерлейкина 10 (ILIO), фактора некроза опухоли (TNF А) и эотаксина (CCL11), у больных атопическим дерматитом и индивидов контрольной группы.

4. Провести исследование полиморфных локусов, ассоциированных с атопическим дерматитом по данным полногеномных анализов и локализованных в областях 5q31.1 (ген KIF3A), llql3.1 (OVOL1), llql3.5 (CllorßO и LRRC32), 19p 13.2 (ACTL9), у больных атопическим дерматитом и индивидов контрольной группы.

5. Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов генов с развитием атопического дерматита у индивидов различной этнической принадлежности.

6. Провести исследование ген-генных взаимодействий, предрасполагающих к развитию атопического дерматита.

Научная новизна исследования

Впервые определены частоты аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов образ-распознающих рецепторов TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR9,

TLR10, NODI, N0D2, CD14 у больных атопическим дерматитом и здоровых индивидов русской, татарской и смешанной этнической принадлежности, проживающих в Республике Башкортостан. Установлены частоты мутаций c.2282del4, p.Arg501XvL p.Arg2447Xb гене филаггрина у больных АД и индивидов контрольной группы. С целью репликации результатов полногеномных анализов ассоциации атопического дерматита проведено исследование полиморфных локусов генов, локализованных в областях 5q31.1 (KIF3A), llql3.1 (OVOL1), 1 lql3.5 (CllorßO и LRRC32) и 19p 13.2 (ACTL9), у больных АД и в контрольной группе индивидов из РБ. Выявлены генетические маркеры риска развития заболевания с учетом этнической принадлежности индивидов. Установлены модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокинов, филаггрина, ингибитора сериновых протеаз, генов образ-распознающих рецепторов и генов, ассоциированных с развитием АД по данным полногеномного анализа, предрасполагающие к развитию АД у русских и татар.

Научно-практическая значимость работы

Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к атопическому дерматиту. Идентификация мутаций в генах белков, ответственных за формирование и поддержание эпидермального барьера организма, позволяет установить точную молекулярно-генетическую природу АД и подобрать эффективные методы его лечения. Результаты исследования могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту

1. Развитие атопического дерматита у индивидов русской и татарской этнической принадлежности ассоциировано с мутацией c.2282del4 в гене филаггрина FLG. Аллельная частота мутации c.2282del4 в гене FLG у русских, больных АД, составляет 6,03%, у татар - 9,35%.

2. Развитие атопического дерматита у русских ассоциировано с полиморфными вариантами генов То11-подобных рецепторов TLR1 (rs5743571) и TLR6 (rs5743794). Гаплотипами повышенного риска развития АД у русских являются гаплотипы TTATACG и TAGCGCA по полиморфным вариантам генов TLR1, TLR6 и TLR10 (rsl 1466617, rs10004195, rs4543123, rs4833095, rs5743604, rs5743571 и rs2101521).

3. Полиморфные локусы генов То11-подобных рецепторов TLR1 (rs5743571, rs5743604), TLR6 (rs5743794), TLR10 (rsl 1466617) и гена регулятора транскрипции EMSY CllorßO (rs2508755) ассоциированы с развитием атопического дерматита по данным мета-анализа, проведенного в трех выборках русской, татарской и смешанной этнической принадлежности.

4. Полиморфные варианты генов интерлейкина 10 ILIO (rsl800872) и ингибитора сериновых протеаз SPINK5 (rs77532553) ассоциированы с развитием у русских атопического дерматита, не сопровождающегося сопутствующими аллергическими заболеваниями.

5. Модели межгенных взаимодействий ассоциированы с развитием атопического дерматита у русских (TLR1-TLR2-TLR6-TLR10 и FLG-ILIO-OVOLI-TLR6-TLR1-CllorßO) и татар (FLG-TLR2-CllorßO).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Атопический дерматит (АД) - это хроническое аллергическое заболевание кожи многофакторной природы, которое имеет рецидивирующее течение, возрастные особенности клинических проявлений, характеризуется экссудативными и/или лихеноидными высыпаниями, повышением уровня сывороточного IgE и гиперчувствительностью к специфическим (аллергены) и неспецифическим раздражителям. АД, как правило, является первым проявлением аллергии у ребенка (Odhiambo et al., 2009).

АД является одним из наиболее распространенных аллергических заболеваний у детей. Среднемировая распространенность его составляет около 15-30% у детей и 2-10% у взрослых (Odhiambo et al., 2009). В России у детей 6-7 лет распространенность АД составляет 6,6%, 13-14 лет - 3,8% (Кондюрина и др., 2004). На протяжении последних десятилетий распространенность заболевания растет, что говорит о серьезности проблемы АД в развитых и развивающихся странах (Odhiambo et al., 2009).

Симптомы АД в 45 % случаев появляются у детей до 6 месяцев, в 60% - до 1 года, в 85% - до 5 лет. Заболевание может продолжаться в зрелом возрасте и приводит к физической и эмоциональной дизадаптации пациента и членов его семьи. Пациенты с тяжелой формой заболевания и их семьи сталкиваются с существенным ухудшением качества жизни (Beattie et al., 2006), кроме того, АД представляет серьезную экономическую нагрузку на общество в целом (Boguniewicz et al., 2007, Mancini et al., 2008). Почти y половины детей на фоне АД в дальнейшем формируется бронхиальная астма или аллергический ринит, и в связи с этим предполагается, что АД является «отправной точкой» последующих аллергических заболеваний (Spergel, Palier, 2003). Это явление называется атопическим маршем (Gustafsson et al., 2000; Spergel, Palier, 2003).

Во всем мире активно ведутся молекулярно-генетические исследования АД и других аллергических заболеваний с использованием всех существующих в настоящее время методов и подходов. Это значительно расширило знания о генетических факторах, способствующих формированию наследственной

предрасположенности к аллергическим заболеваниям. Обнаружены новые гены, полиморфные варианты которых ассоциированы с АД в различных популяциях.

Новое понимание генетики и патофизиологии АД указывает на важную роль структурных нарушений эпидермиса и иммунной регуляции при заболеваниях кожи, а также в развитии астмы и аллергии.

1.1. Этиология и патогенез атопического дерматита

АД, как и другие аллергические заболевания, развивается при сложном взаимодействии многочисленных внутренних и внешних факторов риска. Среди факторов, вызывающих развитие АД, значительную роль играют внутренние: генетическая предрасположенность и атопия. Риск развития АД у детей выше в семьях, где родители имеют аллергические реакции. Так, если оба родителя здоровы, риск развития АД у ребенка составляет 10-20%, если болен один из родителей - 40-50%, если больны оба родителя - 60-80% (Schultz Larsen, 1993). Тем не менее, существенна и роль влияний окружающей среды. Например, с распространенностью АД ассоциированы такие факторы, как городская среда и высокий уровень образования, тогда как для жителей сельской местности данное заболевание не столь характерно. Из числа экзогенных влияний наибольший вклад в развитие данного заболевания вносят различные аллергены. Пищевые аллергены считаются основными факторами, способствующими развитию дерматита у детей раннего возраста. В старшем возрасте более распространена сенсибилизация к пыльцевым, бытовым, эпидермальным и бактериальным аллергенам. Кроме того, имеются данные о роли в развитии заболевания таких факторов среды, как аллергенов клещей домашней пыли, воздействие на кожу детергентов, жесткой воды и т.д. (Bisgaard et al., 2008).

Патогенез АД во многом остается неясным. На сегодняшний день выделяют два основных, тесно взаимосвязанных друг с другом