Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ фенилкетонурии в Санкт-Петербурге

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ фенилкетонурии в Санкт-Петербурге"

Г' Г Б ОД На правах рукописи

2 2 АПР 1936

Барановская Светлана Станиславовна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ

(03.00.04. - биохимия) АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт- Петербург 1996

Работа выполнена в Отделе молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П.Константинова РАН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Шварц Е.И.

Официальные.оппоненты: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Хансон К.П.,

кандидат биологических наук Воронина О.В.

Ведущее учреждение: Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва .

Защита состоится "_" _1996г. в _часов на заседании

диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук К 001.23.01. при Санкт-Петербургском институте экспериментальной медицины по адресу: 197376. Санкт-Петербург, ул. академика Павлова. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН. ■ Автореферат разослан "_" _1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Куликова 0.Г.

Актуальность проблемы

Одной из актуальных проблем молекулярной генетики человека является создание национального банка данных о характере мутационных повреждений определенных генетических детерминант при наиболее распространенных наследственных патологиях.

Фенилкетонурия (ФКУ) - распространенное аутосомно-рецессив-ное заболевание, обусловленное дефицитом фермента печени фенила-ланингидроксилазы (ФАГ). Из-за высокой частоты встречаемости (1:7500 новорожденных) в Европейской популяции ФКУ представляет важную медико-социльную проблему. ■

Классическая ФКУ характеризуется прогрессирующей умственной отсталостью у больных, не получающих адекватного лечения с самого их рождения. Предпринятые еще в начале 50-х годов попытки диетической коррекции биохимических нарушений при ФКУ оказались успешными и послужили стимулом для создания в ряде стран программ массового скрининга новорожденных. Однако на сегодняшний день накапливаются даннче о недостатках диетотерапии. Ставшее массовым и считавшееся безопасным раннее прекращение диета (до 7 лет), как выяснилось , приводит к снижению у большинства больных показателей IQ, особенно связанных с абстрактным мышлением. Одной из проблем общественного здравоохранения стала проблема "материнской ФКУ" - рождение у женщин с ФКУ. прошедших диетотерапию, детей с умственной неполноценностью, тяжелой неврологической симптоматикой и пороками сердца.(даже если эти дети являются лишь гетерозиготными носителями дефектного гена). В связи с нерешенностью проблем ранней диагностики и лечения ФКУ больное медицинское и социальное значение имеет профилактика заболевания, ставшая возможной только с появлением молекулярно-генетических методов. Необходимость знания молекулярной природы мутационных повреждений гена ФАГ при данном заболевании связана с тем. что вследствие его органо-специфической экспрессии (гепатоциты) биохимический метод пренатальной диагностики невозможи..

Благодаря интенсивным исследованиям в 1982 году в лаборатории Savlo Woo (Baylor College, Houston, USA) был клонирован ген крысиной, а в 1985 году человеческой ФАГ. Определена локализация гена на 12 хромосоме (12q22-q24.1) и изучена структура и выраженный полиморфизм локуса ФАГ. Проводившиеся последние десять лет во всем мире исследования локуса ФАГ выявили гетерогенность

ФКУ ' на молекулярном уровне и определили целый спектр ФКУ-обус-лавливающих мутаиий.

В настоящее время известно около 200 ФКУ-мутаций гена ФАГ (РАН "utatlon Analysis Consortium, newsletter October 1994). Для каждой отдельной популяции существует свой специфический спектр мутаций, знание которого является необходимым для проведения мероприятий по медико-генетическому консультированию пациентов и планированию семьи, а также для проведения скрининговых программ с целью выявления гетерозиготных носителей ФКУ. Кроме того, изучение распространения мутаций, сходства и различий в строении мутантных генов различных этнических групп открывают новые возможности исследования миграции населения, родственных связей территориально отдаленных народов.

Данная работа является необходимым этапом поиска оптимальных подходов молекулярной диагностики ФКУ в Российской популяции. а также важна для выяснения популяционных особенностей структуры самого гена ФАГ. фланкирующих его ДНК последовательностей и молекулярной природы его мутаций, т.е. имеет непосредственное отношениё к пониманию структурно-функциональной организации генома челоЕэка. Таким образом, актуальность избранной темы не вызывает сомнений.

Цели и задачи исследования

Целью данного исследования являлся молекулярнс-генетический анализ локуса фенилаланишидроксилазы в Санкт-Петербургской популяции и определение спектра мутационных повреждений у больных фенплкетонурией.

Задачи исследования включали:

1) Определение в популяции Санкт-Петербурга частоты встречаемости наиболее распространенных Европейских ФКУ-мутаций;

2) Поиск мутаций, характерных для Петербургской популяции;

3) Изучение полиморфного минисателлитного 3'-участка гена ФАГ с целью использования его для пренатальной диагностики в семьях с ФКУ;

4) Анализ сцепления ФКУ-мутаций с полиморфным VNTR-локусом и выяснение механизмов распространения мутационных повреждений:'

5) Разработка на основе полученных данных оптимальной схемы молекулярной диагностики ФКУ.

- 5 -

Научная новизна полученных результатов В результате проведенного исследования определен спектр мутационных повреждений гена ФАГ у больных ФКУ Петербургской попу-ляичи. чт'о впервые позволяет говорить о создании надежной системы диагностики ФКУ в данной популяции. Обнаружено 10 мутационных повреждений гена ФАГ и два нейтральных полиморфизма.

Проведен семейный анализ полиморфного минисателлитного участка гена ФАГ и определена его информативность для пренаталь-ной диагностики ФКУ. Впервые для Восточной Европы изучено сцепление мутаций с идентифицированными полиморфизмами гена и с полиморфным УГШЬлокусом. Анализ сцепления мутаций Й243Х и 1*261(1 с данным полиморфным локусом опровергает существующее предположение об их едином происхождении в Европе

Обнаружена ранее неизвестная мутация - делеция одного нук-леотида в 11 зкзоне гена ФАГ (КЗбЗГэ) в одной азербайджанской семье и предложен рестрикцконный тест для быстрого ее скрининга.

Для одновременногс определения известного спектра мутационных повреждений предложено использовать ББСР-анализ как самостоятельный диагностический метод в различных популяциях с определенным ранее набором мутаций. Для Петербургской популяции разработана оптимальная схема проведения пренатальной диагностики ФКУ.

Научно-практическая значимость работа Теоретический интерес представляют:

- определение спектра мутационных повреждений гена ФАГ у больных ФКУ Санкт-Петербурга и понимание гетерогенной природы заболевания в Российской популяции;

- подтверждение выдвинутой ранее гипотезы о возможном Балто-Сла-вянском происхождении мутации 124081"/;

- получены данные, указывающие на то. что мутации Й243Х и К26Ю возникли по крайней мере дважды на разных гаплотипах;

- Обнаружение неизвестной ранее делеции одного нуклеотида КЗбЗГэ в гене ФАГ в азербайджанской сшье.

Практическая ценность работы:

- Впервые появилась возможность непосредственного определения ФКУ-мутаций в Санкт-Петербурге, что позволяет проводить не только диагностику ФКУ, но и скрининг на гетерозиготное носительство дефектного ФАГ гена;

- определена информативность для пренатальной диагностики анализа гипервариабельного по числу тандемных повторов 3'-участка гена (УЮ);

- ра?паботана оптимальная схема молекулярного обследования ФКУ-семей для проведения пренатальной диагностики для Санкт-Петербурга;

- предложен метод одновременного определения целого ряда мутаций в любых популяциях с известным спектром молекулярных повреждений.

Исключительная важность молекулярной диагностики определяется тем. что биохимический метод пренатальной диагностики невозможен вследствие органо-снецифического синтеза фермента в печеночной ткани (гепатоцитах).

Апробация работы

Предложенные к защите результаты были доложены на Всероссийской конференции "Геном человека", г.Черноголовка (1993); на Первой конференции молодых физиологов и биохимиков России. Санкт-Петербург' (1995). По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезиса.

Структура и обьем работы

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов ис-след.вания, обсуждения, выводов и списка литературы (145 наименований). Работа изложена на 122 страницах машинописного текста и сомзржит 13 таблиц и 30 рисунков и фотографий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика группы обследуемых больных ФКУ. Определение спектра мутационных повреждений проводилось в группе 70 больных ФКУ детей, состоящих на диспансерном учете в- медико-генетической консультации Санкт-Петербурга. Диагноз ФКУ был поставлен по двухэтапной системе биохимического обследования. На первом этапе использовался мочевой тест с 2,4- динитрофенилгидразином (ДНФГ); ка втором определение концентрации фенилаланина (ФА) в 'сыворотке крови. Уровень ФА в крови обследуемых больных при постановке диагноза был выше 15 мг%.

Для анализа распределения мутаций и VNTR-аллелей в семьях была выделена ДНК родственников первой степени родства пробандов (матери и отца), а также сибсов (здоровых братьев и сестер больных ФКУ детей).

Молекулярно-генетичоские методы.

ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови с использованием стандартных методов. Амплификация специфических участков ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводилась на автоматическом термоциклере производства ТТО "ИРЛЕН" (Гатчина) с использованием термостабильной Tth-ДНК-полимеразы. Температур-но-временной режим реакции подбирался для каждого фрагмента гена ФАГ.

Для определения частоты четырех наиболее распространенных европейских мутаций R408W, R158Q. IVSIO, IVS12 использовали ПЦР в сочетании с методом полиморфизма длины рестрикционных Фрагментов (ПДРФ). Мутация R408W (12 зкзон) создает в ПЦР-фрагменте сайт рестрикции для рестриктазы Sty I, отсутствующий в нормальной последовательности. Для мутаций R158Q. IVS10nt546, IVS12ntl сайты рестрикции для рестриктаз Mspl. Saul, Rsal, соответственно, создавались путем сайт-специфического мутагенеза в процессе ПЦР с модифицированным праймером. Ферментативный гидролиз прово-цили с использованием эндонуклеаз рестрикции и производства НПО "Фермент" и соответствующих буферов рестрикции. Продукты рестрикции разделяли электрофорезом в 6% акриламидном геле.

Для поиска новых мутационных повреждений гена ФАГ ис: эльзо-зали метод SSCP (Single Stranded Conformation Polymorphism) -детод полиморфизма конформации однонитевых фрагментов ДНК в не-яенатурирующих условиях. Для разделения цепей использовали iDE-гель (Hydrollnk, AT Blociiem). Электрофорез проводили при сомнатной температуре при 100V в течение 16-244. Окраску геля доводили с использованием нитрата серебра по стандартной мето-щке.

Определение первичной нуклеотидной последовательности амп-жфицированных участков гена ФАГ проводилось по модифицироваино-iy методу Сенгера с использованием однопраймерной ПНР с тррмо-шльной Tth-ДНК-полимеразой.

- 8 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация в Санкт-Петербурге некоторых ФКУ-м/тапий. характерных для Европейских популяций

Мутация 12 экзона 1?408К широко распространенная в Восточной и Северной Европе, была идентифицирована на 101 из 140 му-тантных хромосом. 34 пациента имели гомозиготное состояние по данной мутации Ш408№/Е408№), 33 -имели мутацию в компаунде с другими мутационными повреждениями и у троих пробандов И408№ не была найдена. Данная мутация является превалирующей для Петербургской популяции и составляет 72,2% всех мутантных аллелей.

Мутация И58(1, встречающаяся во многих Европейских популяциях, была найдена на двух мутантных хромосомах (1,4%). Обе мутации найдены в компаунде с 1}408И (Й1580/1ШШ). Сплайсинг-мутация Ш>12п1;1. встречающаяся с высокой частотой в Северной Европе, обнаружена у трех пробандов с генотипом 1У312пи/114081й. Частота данной мутации составляет, соответственно, 2,1% от всех ФКУ-аллелей. Сплайсинг-мутация ШЮпШб, характерная для' стран Средиземноморья. была найдена на одной хромосоме (0,7%) в компаунде с И4СШ.

Определение четырех данных мутаций позволило определить молекулярный дефект в 76,3% мутантных хромосом. Это позволило установить генотип у 41 ФКУ-пациента (58,5% всех пробандов).

Поиск других мутаций гена ФАГ

Методом ББСР были проанализированы 5, 7, 8. 11 и 12 экзоны гена ФАГ на наличие нуклеотидных замен. Известно, что около трети всех известных мутаций гена ФАГ приходится на его центральный 7 экзон, который был выбран первым для поиска новых мутаций. Показанием к секвенированию образца являлось любое отклонение в подвижности нитей ДНК по сравнению с контрольным образцом на фо-резе. В контрольном образце наблюдалось две полосы, соответствующие двум (смысловой и антисмысловой) нитям денатурированного ДНК-фрагмента. Анализ 7 экзона выявил семь групп с измененной относительно контроля подвижность?.). На рисунке 1 представлена типичная электрофореграмма с различным видом мутаций. Количество образцов б отдельной группе варьировало от одного до шести.' Последующее секвенирование выявило семь видов нуклеотидных замен

12 3 4

' ii.iNl

1

.11

! И

1

с

И - ' 1 ь

■ И .! 1 ^ - Н

» ; • . С

> ¿_д и-1 и >

с->т

И/Ы R2бlQ/N

Рис.1. ЗЗСР-анализ 7 зкзона

1-Н/К252М; 2-М/[?261С);

3-Ы/Р281Ь; 4-Н/И (дикий тип аллеля)

Рис.2. Идентификация мутации (7 экзон) в гетерозиготном состоянии

(в соответствии с количеством групп): шести мутаций и одного нейтрального полиморфизма. Типичный сиквенсный анализ представлен на рисунке 2. Все найденные мутации были описаны ранее для различных популяций.

Мутация (?261(3, в результате которой происходит значительное снижение активности фермента ФАГ (до 307.), была обнаружена у шести больных в гетерозиготном состоянии (все они имели генотип К408Ш/Я2610). Данная мутация была ранее описана для Евро™еиских популяций. Для подтверждения идентичности образцов с одинаковой подвижностью по БЗСР все шесть проб подверглись рестрикционному анализу. Известно, что нуклеотиднач замена !?261С} нарушает существующий в норме сайт рестрикции для фермента И1пП. Рестрик-ционный анализ подтвердил наличие во всех шести образцах мутации И2610 в гетерозиготном состоянии. Частота данной мутации в ис следуемой популяции, таким обрагом, составляет 4,2% (табл.1).

Другой мутацией, найденной также на шести хромосомах, оказалась мутация Р281Ь. Данная мутация описала ранее для Юго-Восточной Европы. Замена затрагивает последний нуклеотид 7 ;па>она и, обуславливая замещение пролина на лейцин в белке, приводит к нулевой активности фермента ФАГ. Мутация Р28Н, встретм>-ь чети

ре раза в компаунде с R408W (F281L/R408V/), один раз - с неиден-тифицированной мутацией (P281L/?) и один раз - с мутацией 7 эк-зона R252W (P281L/R252W). Частота мутационного повреждения P281L составляет 4.2% для данной популяции (табл.1).

На четырех мутантных аллелях была идентифицирована мутация R252W.. Данное мутационное повреждение описано ранее для Европейских и Средиземноморской популяций и приводит к полному отсутствию активности фермента ФАГ. Используя то, что мутация R252W нарушает существующий в норме сайт рестрикции для фермента Aval, все образцы данной группы подвижности были проанализированы на наличие данной мутации. Рестрикционный анализ подтвердил присутствие мутации R252W в гетерозиготном состоянии в образцах с идентичной SSCP-подвижностью. Данная мутация встретилась два раза в компаунде с R408W (R252W/R408W), один раз - с неидентифи-цированной мутацией (R252W/?) и один раз с P281L (R252W/P281L). Частота R252W составляет для нашей популяции 2.8% всех мутантных аллелей.

В 7 экзоне были обнаружены (по одному случаю или по 0.7%) две терминирующие мутации - R243X и R261X. Обе куклеотидные замены приводят к формированию преждевременных стоп-кодонов и обуславливают отсутствие ферментативной активности ФАГ. Обе мутации обнаружены в компаунде с R408W. Мутация R243X описана ранее для Восточной Европы (Венгрия); R261X - для отдельных Европейских стран и Японии." Отметин, что замена R261X является второй мутацией для исследуемой популяции, повреждающей 261 ко дон гена.

Еще одна мутация-7 экзона - Е280К - была найдена у одного ФКУ-пробанда в компаунде с R408W (частота ее для исследуемой популяции составляет О,1%). Мутация Е?80К обнаружена ранее в некоторых Европейских странах и, как отмечается, приводит к полному отсутствию активности ФАГ.

Секвенирование одного из шести образцов еще одной группы с аномальной подвижностью нитей показало присутствие замены G->A в третьем нуклеотиде 245 кодона 7 экзона, не приводящей к изменению смысла кодона на аминокислотном уровне. Данный нейтральный полиморфизм - V245V - описан ранее для ряда Европейских и Восточных популяций. Известно, что данная нуклеотидная замена нару-

Таблица I.

Спектр мутаций гена ФАГ и частота их распространения у больных ФКУ г. Санкт-Петербурга

Экзон Мутация Молекулярная замена Число мутантных аллелей/ на 140 хромосом % мутации

нуклеотчд-ная аминокислотная

12 Я408\У СО^-ТСС Агё-Тгр 101 72.2

7 ягбкз СвА-С/* Л А^-ап 6 4.2

7 Р281Ь ССв-СТв Рго- 1_еи 6 4.2 '

7 Я252\Ув ССО-ТСС Агр-Тгр 4 2.8

- 1УБ12 - 3 2.1

5 Я1580 СОС-САв Агд-С1п 2 1.4

7 [2.243Х ссл-тс;л А^-Зюр 1 0.7

7 Л261Х СОА-САА Агв-Бюр 1 0.7

- 7 Е280К САА-ААА 01и-Ьу8 1 0.7

- 1УБ10 - 1 0.7

126 89.7

шает один из двух присутствующих в 7 экзоне сайтов рестрикции для рестриктазы А1и1. Рестрикционный анализ шести образцов данной ББСР-группы показал присутствие во всех пробах данного полиморфизма У245У в гетерозиготном состоянии.

ЭЗСР-анализ ПЦР-фрагменгов. содержащих 5. 8 и 12 экзоны гена. не выявил новых нуклеотидных замен, но показал, что мутации 121580 и 12408« (определенные ранее рестрикционным анализом) легко детектируются данным методом.

ЗЭСР-анализ 11 зкзона и последующее секвенирование позволили выявить еще одну нуклеотидную замену (С->СЧ не приводящую к замене на аминокислотном уровне. Данный нейтральный полиморфизм Ь385Ь описан ранее для не. зторых Европейских популяций и встретился в нашей популяци1 на семи мутантных хромосомах.

Идентификация новой мутации КЗбЗГз

БЗСР-группа с аномальной подвижностью нитей ДНК (11 экзон). состоящая из двух пробандов одной'семьи, была интересна огсутс-

твием полис, соответствующих нормальному аллелю (рис.3). Пробан-т принадлежали к одной Азербайджанской семье из Грузии. (Обследуемая семья временно проживает в Санкт-Петербурге и данные по ней не были включены в результаты по Петербургской популяции). Последующее секвенирование показало наличие не описанной ранее мутации - делеции одного нуклеотида G в 363 кодоне (1089 позиция к-ДНК) в гомозиготном состоянии у двух ФКУ-пробандов (рис.4). Делеция нуклеотида K363fs приводит к сдвигу рамки считывания и формированию преждевременного стоп-кодона через 111 нуклеотидов.

Оба ФКУ-пациента при постановке диагноза имели уровень фе-нилаланин в крови выше 20 мгЖ; клиническое их обследование выявило все характерные симптомы ФКУ. Данная мутация является, очевидно, причиной классической формы фенилкетонурии у двух пробан-дов данной семьи.

Семейный SSCP-анализ (рис.3) показал, что мутация K363fs присутствует у родителей в гетерозиготном состоянии. Анализ родословных данной семьи выявил, что родители ФКУ-детей являются родственниками пятой степени родства (троюродными сибсами).

Нами был предложен тест для диагностики мутации K363fs. Данная делеция нарушает присутствующий в норме сайт рестрикции для рестриктазы Hindlll, что и может быть использовано для скрининга данного мутационного повреждения. Проведенный для данной семьи рестршщионннй анализ (рис.5) подтвердил результаты, полученные методом SSCP-анализа. Вопрос о распространении данной мутации з Азербайджанской популяции остаится открытым.

Анализ полиморфного 3'-участка гена ФАГ (VNTR)

Как известно, полиморфизм в о'-конце гена ФАГ обусловлен различным количеством 30-нуклеотидных АТ-богатых тандемных повторов - VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). В результате семейного анализа данного полиморфного участка было обследовано 140 мутантных и Ш нормальных независимых хромосом.

Точный размер ПЦР-фрагменгов был установлен с помощью образцов с известным количеством VNTR-повторов, любезно предоставленных Кузьминым А.И. (Baylor College, Houston. USA). Было найдено пять различных аллелей данного полиморфного участка' (из шести ранее описанных в Европейских популяциях) со следующими

1 2 3 4 5

I J

It

t-

' I

ij Ml

K3S3fs/

-a

K353fs/

K363fs/K353fs

Рис.3. Семейный SSCP-анализ делеции K363fs 1,2- два ФКУ-пробанда (K363fs/K363fs); 3- мать (K363fs/N); 4- отец (K363fs/N); 5- контрольная ДНК (N/N)

В-А Т C/G А Т С

S3

tel

del G-> -J—

1 2 3 4 5 6 пл. .'

320

232 WW

normal / mutant.

Рис.4. Идентификация делеции K363fs

Рис.5. ЩР/HindIII тест для скрининга мутации K363f's 1- N/N; 2,5- пробанды; 3,4- родители; 6- ЩР-фрагмент до обработки Hindi!I

1 2 3 4 5

- 14 -

ПК.

Ь50 560 530 5<Ю 470

У

и

¡?4СШ/ Н252У/ 3/7 I---1з/8

380

Рис.6. Семейный УЛТИ-анализ 5 - контрольная ДНК (УОТИ 3, б, 7, 8. 9); Информативная семья: 2- отец (УШта/УМ'ГК7)

R408W/R252W 3/8

Рис.7. Анализ

сцепления мутаций с

3- мать~ (У1Ш?3/УИТ1?8); 4- пробанд (УОТКЗЖПКЗ); УПТИ-аллелями 1 - наиденные УЛТЯ-аллели УЛТИ 3, 7, 8. 9, 12

длинами амллифицируемых фрагментов: 380 , 500 , 530, 560 и 650 п.н., что соответствует 3, 7, 8, 9 и 12 повторам (рис.6).

Распределение■количества повторов значительно различалось для мутантных и нормальных хромосом ФКУ-семей. Подавляющее большинство мутантных хромосом (82%) несли 3 копии повторов, тогла как среди нормальных хромосом 3 повтора встречалось только в 31,5%. Подобное распределение объясняется, очевидно, сцеплением УЭТЕЗ-аллеля с мажорной мутацией данной популяции И4СШ. УЭТК является вторым по частоте среди мутантных аллелей (11%) и преобладает среди нормальных (38%). Аллели и УЯТЙЭ одинаково распространены среди нормальных хромосом (13,5Х и 14,41, соответственно) и довольно редки среди ФКУ-хромосом (5% и 2%, соответственно). Аллель \ОТК12 крайне редок среди нормальных (0,3%) и не встречается среди мутантных хромосом.

Следующим этапом нашей работы было определение информативности УМТ1?-системы для пренатальной диагностики. Для этого было обследовано 50 полных семей (т.е. семей, где присутствуют ФКУ-пробанд, мать и отец). Все УМТН-аллели наследовались в соответствии с законом Менделя. В 25 семьях (т.е. в половине случаев), используя анализ наследования УМТЯ-аллелей, возможно проведение последующей пренатальной диагностики без знания молекуляр-

кого дефекта гена ФАГ у проСанда (рис.6). 4 семьи оказались абсолютно не информативны по данному методу и 21 семья - частично информативна. Таким образом, общая информативность У1ч"Ш-сис.темы для Петербургской популяции составляет 71%.

Недостатком УНТИ-анализа является то. что для его проведения необходимо наличие пробанда. что значительно ограничивает его применение.

Анализ сцепления ФКУ-мутаций с УЮ-зллелями

Изучение сцепления мутаций с гаплотипами дает основу для двух направлений исследований: выяснения происхождения конкретных мутаций (времени, места и механизма возникновения) и изучения . миграции населения по дрейфу характерных для данной популяции мутаций. Определение сцепления ФКУ-мутаций с полиморфным УйТИ-маркером проводилось с помощью семейного анализа (пример подобного анализа представлен на рисунке 7).

Данные нашего изучения мутации И408« вошли в общеевропейское исследование 14 стран по распространению данного мутационного повреждения в Европе. Как известно, мутация И408М имеет высокую частоту встречаемости во многих Европейских странах, где она оказалась сцепленной с двумя разными гаплотипами. Частота данной мутации в Петербургской популяции оказалась примерно равной частоте ее в Литве и Белоруссии (около 7055) и является наивысшей для Европы. Для исследуемой популяции мутация оказалась сцеплена исключительно с УГШ?3 (что соответствует второму ПДРФ-гаплоти-пу). Наблюдаемое значительное уменьшение на запад и восток частоты аллеля . й4081У/гаш10Тип2/У№П?3 ведет к предположению о Славянском или Балто-Славянском происхождении данного мутантного аллеля. Более низкая частота данного мутантного аллеля з популяциях. расположенных восточнее и юго-восточнее (Самара-58%: Ка-зань-51%) указывает на то. что данная мутация появилась у славян не из центральной Азии, а,напротив,была "введена" в Азиатские популяции с более недавней миграцией славян на восток.

Однако, как оказалось, данная мутация широко распространена также в Северо-Западной Европе (особенно в Ирландии), где она сцеплена исключительно с гаплотипом 1 (!М08№/гаплотип1/УитК8). В популяциях других Европейских стран присутствуют оба возможных аллеля в различных соотношениях. Сравнение градиентов частот

Таблица 2.

Сцепление ФКУ-мутаций с У1ЧТ11-аллелями в Петербургской популяции

Количество Количество Количество

Экзон Мутация мутантных копий аллелей,

аллелей/ УГЧТЯ- сцепленных с

140 хромосом повторов определенным

У1ЧТЯ-аллелем

12 101 3 101

7 11261 6 3 4

8 2

7 Р281Ь 6 7 4

8 2

7 И252\У 4 8 4

- П512 3 8 3

5 11158(3 2 3 2

7 И243Х 1 8 1

7 Я261Х 1 3 1

7 Е280К 1 9 1

11 КШЬ 2 8 2

распространения этих аллелей в Европейских популяциях с картой миграционных перемещений населения позволяет сделать предположение о двух независимых центрах возникновения одной мутации 124081) • в Европе. Подтверждением является тот факт, что мутация 1?408И затрагивает СрС динуклеотид. являющийся, как известно, "горячей" точкой мутагенеза.

Полученное сцепление мутаций 12158й и Ш12п1 с определенными УМТК-аллелями (табл.2), а также мутаций 7 экзона 12252Ю, #26IX. Е280К и Р2811 аналогично подобному сцеплению в Европейских популяциях. Анализ Европейских данных по сцеплению 121580. и Ш12пМ предполагает наличие единственного мутационного события для каждой из них (с последующим распространением по Европейской территории), тогда как анализ сцепления мутаций 7 экзона с \'МТЕ-аллелями предполагает существование по крайней мере двух независимых центров появления для каждой из них. Полученные нами результаты не противоречат данным гипотезам.

До недавнего времени единое происхождение мутации 8261й для

Европы не вызывало сомнений. Мутация 11261(1 широко распространена во многих Европейских странах, где она сцеплена с единственным У№П?-аллелем (гаплотип1/У№ГН8). В Петербургской популяции мутация 1*261(1 оказалась сцепленной с двумя У1Ш?-гаплотипами: с У1Ш8 (аналогично сцеплению в большинстве Европейских стран) и с УШИЗ (подобное сцепление найдено впервые). Причем необычное сцеплепие с У№Т!?3 обнаружено на большей части Й261(1-хромосом (на четырех из шести), т.е. данное мутационное повреждение существует по крайней мере на двух разных гаплотипах.

Необычное сцепление было обнаружено еще для одной мутации 7 экзона. Известно, что мутация Е243Х встречается на ФКУ-хромо-сомах 4 гаплотипа (УШТ*3) в Венгрии и, как отмечается, отсутствует в популяциях Западной и Северной Европы. Низкая частота и ограниченная территория распространения Е243Х указывают на то, что мутация произошла недавно на нормальной хромосоме 4 гаплотипа. Однако наши результаты по сцеплению мутации не совпадают с этим предположением. Единственная мутация, найденная в Петербурге, оказалась сцеплена с УТОВ. что исключает 4 гаплотип.

Выбор механизма возникновения мутаций 1*261(1 и И243Х на двух различных гаплотипах (рекомбинация, генная конверсия или независимое повторное возникновение на разных гаплотипах) зависит от дальнейших исследований. Следует отметить,однако, что обе мутации затрагивают СрО динуклеотид, являющийся "горячей" точкой мутагенеза, что делает механизм независимого возникновения мутаций в различных популяциях на разных гаплотипах наиболее вероятным. Подтверждением того, что данный участок гена является "горячей" точкой мутагенеза,служит тот факт, что и в 243-ем, и в 261-ом кодонах в разных популяциях обнаружено еще по одной мутации (1*243(1 и И261Х, соответственно).

Мутационные повреждения гена ФАГ можно разделить ка три группы в зависимости от места их происхождения: Скандинавские, Европейские и Средиземноморские (Турция). В данном исследовании обнаружены мутации всех трех групп, что отражает значительную гетерогенность популяции Санкт-Петербурга. Вклад "Турецких" мутаций составляет 14%; Скандинавских - только 2% от всех идентифицированных ФКУ-поврекденмй. Большая часть мутаций относится к Европейским (около 74%). Высокая частота (72%) Балто-славянской мутации К408И, очевидно..объясняется "эффектом основателя".

- 18 -

Анализ сцепления мутаций и нейтральных полиморфизмов Изучение сцепления ФКУ-мутаций с нейтральными полиморфизмами, найденными в гене ФАГ, проводилось с помощью семейного ЗБСР-анализа. Результаты исследования представлены в таблице 3. Сцепление мутации 7 экзона Н261Х с полиморфизмом этого же экзона У245У,описано впервые. Впервые было обнаружено также сцепление мутации 7 экзона Ъ252У с Ь385Ь (11 экзон).

Итак, в нашем исследовании наряду со сцеплением с определенными УЮТ-аллелями. четыре мутации оказались сцепленными с двумя нейтральными полиморфизмами, что может помочь пролить свет на механизмы возникновения и пути распространения данных мутационных дефектов гена ФАГ.

Таблица 3. Ассоциация между мутациями и нейтральными полиморфизмами гена ФАГ

Мутация Полиморфизм УЯТИ Частота

Я 158(1 У245У 3 2/2

1526IX У245У 3 1/1

1?252И Ь385Ь 8 4/4

№12пи Ь385Ь 8 3/3

Принципиальная схема определения информативности 'ФКУ-семей для пренатальной диагностики

Для проведения пренатальной диагностики существенно важным является выяснение информативности семьи, т. е. ее пригодности для молекулярно-генетического анализа. Кроме того, желательно, чтобы эти данные были получены заранее. Для определения ДНК-информативности семьи в данном исследовании использовали метод непосредственного определения мутаций (прямой метод) -а анализ сцепленных маркеров (непрямой метод). Принципиальная схема обследования ФКУ-семей с целью определения информативности для пренатальной диагностики представлена на рисунке 8.

Скрининг пробандов на наличие мутации Л4(Ш достаточно удобно проводить с помощью ПДРФ-метода. Почти половина пробандов являются для исследуемой популяции гомозиготами по данной мута-

- 19 -

Обследуемая семья ПДРФ: анализ на 11408У/

мутация 11408\У в гомозиготном состояния

семья информативна для пренатальной диагностики

Рис. 8. Принципиальная схема пренатальной диагностики ФКУ

ции.и. следовательно, их семьи Являются информативными для пренатальной диагностики. В случае частичной информативности (К408И/?) или отсутствия 1?4.08И дальнейшее исследование зависит от доступности ФКУ-пробанда в семье для ДНК-диагностики'. В случае полной семьи используется непрямой метод анализа (УЮ-рча-лиз), который сам по себе или в сочетании с идентифицированной ранее Й4СШ определяет возможность проведения пренатальной диагностики без полного знания молекулярных дефектов. В случае неинформативности (или частичной информативности) семьи при использовании данных методов, а также в случае отсутствия ФКУ-пробанда следующим этапом является определение других мутационных повреждений гена ФАГ. Данный этап проводился с использованием ПДРФ, ББСР и сиквенсного анализов. Знание спектра мутационных повреждений позволяет значительно упростить данную процедуру. В

✓ \

мутация Я408ДУ не найдена или в гетерозиготном состоянии

х-" X

только родители (нет пробанда)

родители и ФКУ-пробанд

• I

V N Т Я - анализ

V

анализ других мутаций (ПДРФ, ББСР)

связи с тем. что для любой популяшш,. как и для исследуемой, существует-целый спектр ФКУ-о5уславливающих мутаций, традиционный ПДРФ-анализ отдельно каждой мутации представляется крайне трудоемким и длительным. Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что БЗСР-анализ, вследствие своей 100%-воспроизводи-мости в идентичных условиях, может быть использован как самостоятельный диагностический метод. При наличии "панели" образцов ДНК с известными мутационными повреждениями легко определить мутацию в анализируемом образце без последующего секвенирования. Определение же отдельных мутаций требует наличия целого набора праймеров и рестриктаз.

На сегодняшний день мы обладаем набором ДНК с 10 идентифицированными мутациями, перекрывающим около 90% всех ФКУ-мутаций для Санкт-Петербурга, что позволяет нам проводить одновременное их определение в достаточно короткий срок. Эта принципиальная 4 стратегия может быть использована для любой популяции с определенным спектром ФКУ-мутаций (особенно это актуально в популяциях с отсутствием превалирующей мутации).

Результаты данного исследования показывают, что использование данных методов делает возможным на сегодняшний день в 94% случаев ФКУ-семей проведение пренатальной диагностики с целью предотвращения рождения больного ФКУ ребенка.

ВЫВОДЫ

1. В группе 70 больных фенилкетонурией. проживающих в'Санкт-Петербурге, идентифицировано ДО различных мутаций гена ФАГ, что составляет 90% всех мутантных аллелей.

2. В выборке 140 независимых мутантных аллелей гена ФАГ выявлена следующая частота мутаций: Е408Ш-72,2%; 1?261(1-4,2%; Р281Ь-4, 2%; Е252\'!-2,8%: Ш12-2,1%; й 158(1 -1.4%; Е261Х-0,7%; й243Х-0, 7%; Е280К-0, 7%; №10-0, 7%.

3. Обнаружена неизвестная ранее делеция одного нуклеотщк КЗбЗГз у двух ФКУ-пробандов в одной Азербайджанской семье и предложен метод быстрой ее идентификации на основе рестрикционного полиморфизма.

4. Охарактеризовано сцепление мутаций с \iNTR- аллелями (гипервариабельная З'-нетранслируемая область гена ФАГ): {М08У?/\™ТР.З; к261аЛШТ1?3 И Е261й/тй8; Р281Ь/УНТЕ7 и Р281ЬЛ/т8;

R252W/VNTR8; IVS12ntl/VNTR8; R158Q/VNTR3; R261X/VNTR3; R243X/VNTR8: E280K/VNTR9; K363fs/VNTR8.

5. Высокая частота мутации R408W (72%) в популяции Санкт-Петербурга и исключительное ее сцепление с VNTR3 указывают на то, что мутация имеет Балто-славянское происхождение.

6. Полученные результаты позволяют создать эффективную систему профилактики фенилкетонурии в Санкт-Петербурге.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кузьмин А.И.. Барановская С. С.,Иващенко Е.В.. Джони О.Н., Максимова С.П., Шварц Е.И. Спектр мутационных повреждений и ал-лельный полиморфизм тамдемных повторов в гене фенилаланингидрок-силазы у больных фенилкетонурией С-Петербурга. Третья конференция " Геном человека", Москва, 1993 (стр.80)

2. Максимова С.П., Барановская С.С., Шварц Е.И. Эффективность терапии больных фенилкетонурией в зависимости от молекулярного дефекта в гене фенилаланингидроксилазы. I Российский съезд медицинских генетиков, Москва, 1994 (стр.34)

3. ElsensmUh R.S., Goltsov A. A., O'Neill С.. Tyfleld L.A.. Schwartz Е. I., Kuzmln A. I., Baranovskaya S.S.. Tsukerman G.L.. Treacy E., Scrlver C. R., Guttler F., Elken H. G.. Guldberg P.. ApoldJ., Svensson E., Naughten £., Cahalane S.F., CrokeD.T., Cockburn F.. Woo S.L.C. (1995). Recurrence of the R408W Mutation In the Phenylalanine Hydroxylase Locus In Europeans. Am J Hum Genet 56:278-286

4. Барановская С.С.. Шевцов С.П., Максимова С.П.. Кузьмин А.И., Шварц Е.И. Спектр мутационных повреждений гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией г. Санкт-Петербурга. Доклады Академии Наук, 1995, том 340, N5, с. 709-711

5. Schwartz Е., Shevtsov S., Makslmova S.. Kuzmln A.. Baranovskaya S. Spectrum of Phenylalanine Hydroxylase Gene Mutations in PKU patients In St. Petersburg. Annual Meeting of European Society of Human Genetics. Berlin; May 23-28, 1995.

6. Baranovskaya S., Shevtsov S. P., Makslmova S.P., Kuzmin A. I., Schwartz E.I. A novel frameshift mutation In Phenylalanln Hydroxylase Gene In two PKU probands of one Azerbaijan family. Annual Meeting of European Socle.у of Human Genetics, Berlin; May 23-28, 19Э5.