Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм ДНК области q31.1 хромосомы 7 человека в семьях высокого риска муковисцидоза и региональных популяциях Украины

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм ДНК области q31.1 хромосомы 7 человека в семьях высокого риска муковисцидоза и региональных популяциях Украины"

ОРДША ЛШШ. ¡1 01ДШ ДРШЫ НАРОДОВ МАДОнИ ШУК УКРАИНЫ МСТКГУТ ¡лОЛШЛЯРЮЙ Б1ОЛОГШ И ШЬТМм

На правах рукописи ЛИВШИЦ Людмила Аврамовна

УДК 577.217.32:576.31

ЦОЛИМОтоМ № ОБЛАСТИ 431.1 ХРОМОСОМЫ 7 ЧЕЛОВЕКА

В СЕМЬЯХ ВЫСОКОГО Р'ьСКА ЬУКОВИОЩОЗА. 'л РКШШШМ ПОПУЛЯЦИЯХ УКРАШ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1991

Работа вылашюна. в отдано генетики чолсвйка Института талекудярпий биологии и генетики АН Украины,

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор медицинских наук, профессор В.С.Баознов,

доктор медицинских наук, профессор Г.И.Бундовская

член-корреспондент АН Украйни, доктор биологических наук, профессор В..А.Кордам

кандидат биологических наук 0.В.Евграфов

Всесоюзный научный гематологический центр Ш СССР, Москва

Защита диссертации состоится " Wj " QlMlbjt.JL 1991 г. s ¡0 часов на заседании специализированного совета Д 016,11.01 Института молекулярной биологии и генетики АН Украины во адресу: 252143, Киев 143, ул. акад.Заболотного, 150.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иолекулярной биологии и генетики Ali Украины.

Автореферат разослан II " ИСХ^Л 1991 г.

Ученый секретарь 4 свецкадазярованного совета иандзд&т биологических наук

/ /

х'/'/ !<' ('Л ' л.д.лукш

(JlT * (i

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем. Стремительное развитее методов молекулярной биология и генной инженерии существенным об; азом революционизировало изучение основ наследственности я открыло принципиально новые возможности прогресса в сельском хозяйстве, биотехнологической промышленности и медицине.

Вачсяым этапом в развитии биологических наук о человеке стало создание мевдународной программы "Геном человека",основной целью которой является определение нуклеотидной последовательности ДНК всего генома человека. Эти исследования о первую очередь направлена на изучение генов, мутации которых приводят к развитию тяжелых наследственных болезней, а имеют важное теоретическое и практическое значение для медицинской генетики в плане диагностики., профилактики и лечения наследственных болезней.

Муковисцидоз (MB), или кистозный фиброз подаелудочной железы, принадлежит к числу наиболее распространенных тяжелых наследственных болезней с ранней детской смертностью (Lowe с, et ai.,1949). Высокая частота заболевания (1:2000-2500 новорожденных белой расы) , гетерогенность клинического проявления, а также почти полное отсутствие эффективного лечения обуслов1иш. острую необходимость изучения молекулярной природы данного заболевания.

Успешное применение методов "обратной генетики" позволило в 1989 г. осуществить топкое физическое картирование гена муковис-цвдоза на хромосоме 7 в области cßl.I (Kommens J.ü. et al.,I9a9)» клонирование его и расшифровку нуклеотидной последовательности (Hiordan J.R., 1989).Важным вкладом в изучение патогенеза муковис-дидоза стало открытие трехнуклеотадной делении в 10-м эк^оне гена, названной поскольку она приводит к утрате фенилалани-на в 508-м положении предполагаемого белка, названного трансмембранным регуляторнш бачком муковисцвдоза (ТЕБМ.сгТй) (Keren в., et al., 1989). Дальнейшие исследования показали, что во многих странах мира л является наибачео распространенной причиной развития заболевания, однако частота ее существенно варьирует в разных популяциях стран мира (Cystic fibrosis Genetic Analyela Consortium, 1990). На сегодняшний день открыто примерно 100 различных мутаций гена ТРБМ, но.остаются пока до конца не выясненными пути реализации структурных нарушений ДЖ в патологические фенотипы. Существенный вклад в- изучение этого вопроса должны внести

начавшиеся структурно-Функциональные исследования ТРЕМ (Gregory u.J.i 1990).попнтки выделения и очистки данного балка (Gregory K.J., I9SI),a также анализ характера мутаций гена ТРЕМ у больных разными клиническими формами муковисцидоза (Cutting G.K.et ul., 1990; Deaa к. «t ы., 1990).Важны в этом плане также исследования по идентификации широкого спектра мутаций гена ТРЕМ и их распространения у больных из разных регионов земного шара.

Существенную роль в этих исследованиях играет анализ полиморфизма ДНК в локусах, тесно сцепленных с геном ТРЕМ, поскольку данные о неравновесии по сцеплению полиморфизма длины рестрикци-ошшх фрагментов (ЦЦРФ) в этих локусах с геном ТРЕМ важны при поиске новых мутаций гена и для решения вопроса о времени происхождения мутаций и их распространении в популяциях разных стран (Tuui L.-С., 1989).Такие исследования важнн так-также в практическом плане использования 1ЩРФ как генетических маркеров для прелатальнои диагностики муковисцвдоза.

Исследования ПДРФ-систем интересны также в аспекте популяци-онной генетики человека, в изучении варьирования нуклеотидных последовательностей ДНК его генома. По мнению Covalli-Storaa L. (1990), исследования матшвдиввдуальной изменчивости как нормального полиморфизма ДНК, так и мутаций, приводящих к развитию наследственной патологии, в популяциях человека должны неизменно дополнять анализ нуклеотадной последовательности ДНК, проведенный в рамках программы "Геном человека" на материале одного или двух индивидов.

Целью данной работы было изучение частоты встречаемости мутаций ая^оо' Ü551D ?и К553Х (в 10-м и П-м экзонах гена ТРЕМ) у больных различными клиническими формами муковисцидоза на Укрткке, и ассоциации этих мутаций с полиморфизмом ДИК в локусах ¡¿ET, ХНР, D7S2J, D73o хромосомы 7, тесно сцепленных с геном ТРЕМ, а такке исследование полиморфизма ДНК'в вышеперечисленных локусах у населения региональных популяций Украины.

Б процессе выполнения работы решались следующие задачи:

1. Получение банка образцов ДНК из лейкоцитов периферической крови членов семей с высоким риском муковисцидоза из разных регионов Украины, а также здорового взрослого населения (доноров) Киева, Львова и Кременчуга (Полтавской обл.).

2. Проведение ДНК-анализа мутаций (10-й экзон), 25^91.

G55I3 и (11-й экзон) гена ТРЕМ у де';ей, болышх разными

клиническими формами муковисцидоза, их родителей и здоровых сиб-

3. Проведение предварительных скринирующих исследований де-лецкл среди здорового взрослого населения некоторых регионов У крины.

4.-Изучение характера ассициации ПД№-аллелсй локусов МЕТ, D7Sd, IRP, D7S23 с мутациями гена ТРЕМ в семьях высокого риска муковисцидоза на Украине.

5. Изучение полиморфизма ДНК локусов D7S23, XRP и »7Sti в популяциях здорового взрослого населения .городов Киева, Львова( Кременчуга.

Научная новизна и практическая ценность работы. Создан банк из 169 образцов ДНК лейкоцитов периферической крови членов 60 семей с высоким риском муковисцидоза из разных регионов Украдны, а также из 365 образцов ДНК лейкоцитов периферической крови здоровых доноров Киева, Львова, Кременчуга.

Проведен £НК-ш>.алнз мутаций S54-9I, G55ID и К553Х в

10-м и И-м экзонах гена ТРЕМ у больных муковисцидозом на Украине. Показано, что деления F^ вносит существенный вклад в развитие тяжелых клинических форм муковисцвдоза на Украина.

Разработан модифицированный метод для одновременного ДНК-анализа делении- и некоторых мутаций в П-м экзонз гена ТрБЫ.

Проведены пилотные скршшрувдие исследования делении ?с0а у здорового взрослого населения разных регионов Украины. Показано, что ориентировочная частота гетерозиготных носителей этой мутация на Украине составляет 1:40.

Показано неравновесна но сцеплению мутаций в гене ТРЕМ и ПДРФ-гаплотипов Kg, С2 (локус D7S23) и Х^ (локус IRP). Показана равновероятная ассоциация мутаций в гене ТРЕМ с ПДРЗ-ганлотшхаш ло-куса D7So (сайт узнавания для Pstl).

Проведен анализ изменчивости ПДРФ-геновшоз локусов D7S23, 1нр и D7sa в региональных популяциях Украины. Полученные данные свидетельствуют о существенном вкладе полиморфизма ДНК в локусе D7S23 (система сь.?- Н1пв-1)в формировании генетической гетерогенностиг данных региональных популяций Украины. Проведена оценка генетического сходства исследуемых популяций, основанная на. анализе полиморфизма ДНК локусов D7-23, IRP и D73o.

Результаты р=и5отН тлеют те-з^гтческое значение в плане даль-

нсЯшего изучения частоты и спектра структурных нарушений гена ТРЕМ и их роли в развитии разных клинических форм мун.овисаидоза на Украине. Анализ неравновесия по сцеплению полиморфных маркерных систем Д1К с муковисцвдозом позволяет получить новые данные о возникновении и распространения мутаций в гене TPR! на Украине, позволит вплотную подойти к пояску новых мажорных мутаций, ответственных за развитие муковасцидоза в семьях высокого риска данного заболевания на Украине.

Полученные результаты показали принципиальную возможность использования полиморфизма ДНК в локусах D?t>2j>, IHP и. с?ао в анализе генетической гетерогенности региональных популяций Украины и могут быть перспектив™ для анализа генетической структуры популяций.

Полученные данные имеют важное практическое значение для выбора эффективной стратегии пренатальной диагностики и проведения скрининга мутаций гена ТРИ в семьях с высоким риском муковасцидоза на Украине. .

Данные о связи между наличием делении у больных и раз-

витием тяжелых форм муковисцидоза с недостаточностью функции поджелудочной железы позволят оптимизировать схемы лечения детей, больных муковисцвдозом.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 1-й 2 симпозиумах по генной терапии (Киев, 1989,1900), I и 2 Всесоюзных конференциях "Геном чаювека'ЧИереславль-Залесский, 1990.1991), Североамериканской конференции по муковисцидозу (Арлингтон, США, 1990).Европейской конференции по муковисцидозу (Копенгаген, I99IX

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литера^ туры, описания материалов и методов исследования, полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы -195 источников. Работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и II рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД! ИССЛЕДОВАНИЯ

Образцы периферической крови (5-20 мл) с глюгициром (стандартным консервантом донорской крови) больных муковисцвдозом, та родителей и здоровых сибсов были получены из учреждений, где они

проходили клиническое обследование: ШМ ПАТ им. И.'.<'..Гуйко МОЗ Украины, КГИУВ МЗ СССР, ДНИ! 11А1Ш ЮЗ Украины, Киевского и Криворожского межобластных медико-генетических центров МОЗ Украины.

Образцы донорской крови (20 глд) были получены на Киевской, Львовской и Кременчугской станциях переливания крови.

ДНК-зонды к локусам МЯТ и Ш* были любезно предоставлены проф.В.С.Баранову д-ром Кау '.Ш-Ъе (США) И проф. К.'.УиПаазоа (Великобритания).

Олагонуклеотидные праймсры .для поликеразной цшной реакция (ПЦР) были синтезированы твердофазным фосфатамидятшш способом сотрудником ЯМБиГ АК Украины С.С.Огняником и в Н11К"Энзим"(Лятва).

Выделение и очистку препаратов ДНК от лейкоцитов проводили по методу яенпег-ъ ег а1. (1388), выделение препаратов ДНК из биоптатов хориона и плаценты, а также выделение плазмщшой ДНК проводили по общепринятым методам (Т.Маниатис, 1985).

Препарата ДНК хранили в водных растворах при -20 °С.

Рестрикцконшгй анализ Д11К проводили с использованием энцо-нуклеаз рестрикции Ч1пб-1, Та<11, Шпс!.1:, Ваи^л производ-

ства НПО "Оерментас" и КПК "Биопол") и 1)<1е1 с последующим гель-электрофорезом в горизонтальных 0,8-1,0 или 1,4-2,0 % агарозных гелях (агароза стандартной ионной сшш фирмы "¿¡ег^а"), а также в 6-12 % ПААГ с последующим окрашиванием бромистым эткдяем.

Перенос денатурированных, фрагментов ЛДК на капроновые Фильтры ("Хийу'Калур",Эстония) и гибридизацию с ДЛК-зондами осуществляли по методу Саузсрна (1975). Клонированные в плаэмедах ДНК-зовдц

""" оо •

метили в реакции ник-траначяции,используял- Р-дЦТ^и наборы для ник-транслядии фирш"Ал1ег8Ьаа1" ' (Англия),до уд.акъЗ.Ю-Г.^ищ/лин/ШГ ДЕ1К. Налиме разную цепную реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси по методу ti.SsJ.ki (1985) на протяжении 30 циклов по схеме; 30 с денатурация (94 °С), 30 с - отжиг (55 °С), 60 о - синтез (72 °0) с продолжительностью стадии синтеза в последнем цикле до 10 мин.

Оценку неравновесия по сцеплению проводили с использованием тетрахорического коэффициента корреляции Пирсона и иго критерия £ (Г.Ф.Лакин,1980). Оценки гетсрозлготности определяли по методам г.^ и. е* а1.(1974) и СЬикгаусггу К. (1901), частоты генов я теоретическое распределение генотипов вычисляли по Ч.Ли (1978), показатели генетического сходства и соответствующие им крага-рии идентичности вычисляли по Л.А.Животовеко.му (1983). Девдрограм-

ш генетического сходства строили но методу невзвешеншх. групповых средних (Б.Дюра, Ц.Оделл, 1977). Основные вычисления проводили на компьютере IBM PC/XT по программа ••Systat" (,m<c.uisoatl985) и по оригинальным программам лаборатории генетики популяций Института общей генетики им.Н.И.Вавилова АН СССР.

Рдзшш и их оющав

Молекулярю-генетический анализ делеции i^o^ (10-й экзон), &55Ю и (II-й экзон) гена ТВБ!,1 в семьях высокого

риска муковисцидоза

Анализ некоторых мутаций в 10-м и 11-м экзонах TPS,) был проведен у 169 членов 60 семей с высоким риском муковисичдоза из разных регионов Украины.

Дая выявления делеции F^oa в экэоне гена проводили специфическую амаллфикаци» in vitro участка величиной 83 п.н.,огра-ииченного с 5 и 3 -концов последовательностями, описанными ранее (JUafihew С.а., 1989).

Появление продукта размером 80 п.н. свидетельствовало о наличии у данного индивида трзхнуклеотидной делеции этого участка. На рио.1 приведена электрофорограмма продуктов амплификации in vitro в исследуемом участке образцов ДЩ семьи С., в которой ребенок болен.муковисцидозом и есть здоровый сибс. Лолучегшые результаты свидетельствуют о том, что больной ребенок является гомозиготой ПО лРсоа> поскольку продукты а%яш<фикации исследуемого участка на обеих гомологичных хромо-сслах 7 имеют размер 80 п.н., тогда как у его родителей и здорового сибса были выявлеки как "долвтироваиные" (80 п.н.), так. а "нормальные" (ВЗ п.н.) продуд-su аишифакации. Следовательно, здоровый ctdc является гатерозЕ-готаша носителем д Рц,..как е

ягл пппвтал* ме^адм« "дг в семье и.:

его родктшш. ^¿.З - гетерозиготные носителе-,

: . Мл& шшлязе цугацкй 25531- 4-больной MB; 5-здоровий донор Gк S Н-ы экзон^

fcpiv^tej

• I. К , 83 U.K.

«¿toWiw*-"' 80 П.ц.

X 2 3 4 & Рис.1. ДНК-анализ делении

гена ТРЕМ проводили специфическую амплификацию in vitro фрагмента ДЕК уэ данного экзона размером в 425 п.н..фланкипутацяе последовательности которого гомологичны таковым олигонуклеотидныхпрай-меров, используемых для проведения ПЦР в данном участке (Cutting G.v... 1090). Затем продукты амплификации подвергали гидролизу эн-дону казаки рестршщии Hincii, SaujA и Ddsl. Ни в одной из проанализированных нами семей не была выявлена мутация S5491, приводящая к утрате сайта лля эндоиуклеазы Ddei.

На рис.2, приведены результаты анализа мутации G55ID в семье Л. двоих детей, умерших от муковисцитоза. При обработке продуктов акпляфпкации зндонуклеазой Sau3A у матери была выявлена

мутация, приводящая к возникновению

сайта узнавания SaujA, о чем свидетельствуют выявленные на электрофорезе фрагменты размером «¡43 и 182 п.н. Эта семья оказалась единственной из всех проанализированных нами на но-сительство данной мутации.

Для более эффективного ДНК-анализа мутаций в 10-м я 11-м экзонах. гена ТРШ в'целях гроведения дородовой диагностики или скрининга гетерозиготного носительства нами била проведена амплификация ДНК 1л vitro одновременно фрагментов 83 п.н. из 10-го экзона и 425 п.н. из II-го экзона гена ТРЕМ. На рис.3 продеть,длены результаты анализа далецли г,

ГУ?-,'1:1' ■,''.

425 п.н.

243 п.н. 182 п.н.

50а

и мутации В553Х, приводящей, к утрате сайта для эвдонуклеазн рестрикция Н1аси в амплпфышрованном участке. Эта мутация била выявлена только в данной семье П. У больного ребенка мутация (отцовского происхок-

дения) сочеталась с д (материнского происхождения). Результаты анализа частоты встречаемости проанализированных мутаций у детдй, Лг.л;.-^-: кавйсцидозои, представлены на рис.4.

Рис.2. ДКК-анализ мутации (¿55т методом ПЦР в се-мъе Л.: 1,2- родители боль -ного ребенка; 3 - маркер молекулярной массы - ДрК «рага Л, гвдролиэоваккач смесью рестриктаз ¡Шнии и лсоН!

|jj w fn,, «с/

&3 eesjtsrti 425 П.Н.

I to»

,.--239 п.н.

186 п.н.

63 п.н. 80 п.н.

12 3 4

Деления ?j0d была выявлена на 72 из 122 хромосом 7, с мутациями гена ТРЕМ, т.е. частота

в проанализированной группе составила 59,2 Полученные наш данные примерно совпадают с таковыми в странах Восточной Европы (Holloa et al., 1991; Kalaydieva L. et el. , 1991), однако следует отметить,что частота у больных на Украине несколько выше, чем у больных в РСФСР (Baranov V.S. et al., 1991), что может быть связано с вероятными различиями генофонда республик, а также с уровнем точности клинической диагностики муковисцидоза. Что же касается мутаций К553Х и G55ID, то они встречались лишь в единичных случаях с частотой 0,8 каждая. Эти данные несколько ниже, чем полученные для этих мутаций в некоторых странах Европы и для белых больных муковисцидозом В США (Tsui L.-c. et al., 1990), где частота их составила 5-10 %. На основании предварительного тестирования мутаций в шести семьях высокого риска была проведена дородовая диагностика с использованием ДНК-анализа биоптагов хориона (9-12 над беременности) и плаценты (18-19 нед беременности). Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности ДНК-анализа д для пренатадьной диагностики муковисцидоза (табл.1). Однако довольно большая доля мутаций (39,2) наш пока не идентифицирована, что может существенно затруднить дородовую диагностику, как это произошло в двух семьях, данные о которых представлены в табл.1. В этой связи перспективным является поиск других, возможно пока не известных, мутаций гена ТРЕМ у больных на Украине.

Бис.З. ДНК-анализ мутаций ДРчоа (10-й экзон тена ТРЕМ) и В553Х (11-й экзон) методом одновременной амплификации соответствующих ДНК-локусов с помощью ПЦР в семье П.: I - маркер молекулярной массы - ШК фага А, гвд-ролизованная Рв*1» 2,3-гетерозиготные носители; 4-больной МВ

Н553Х (0,8

05510

другие^-^

тации (39,

Б5Ч-91 -(0 Г») нами били проведены нредваритель-

дг^оа(59,2 нне скринирующие исследования ар10() у

— у здорового взрослого населения (доно-

ров Киева, Львова и Кременчуга. Среди 365 обследованных из этих регионов бы-(о',8 ло выявлено 9 гетерозиготных носителей дУ50У ^О), таюи.! образом ориентировочная частота этой мутация среди здорового взрослого населения составляет 0,12. Учитывая, ,что по наши,'! данным частота д среди всех мутаций в гене ТРЕМ составляет 59 %, частота гетерозиготных носителей мутаций гена ТРЕМ додана составлять 1:24, а частота рождения детей, больных муковисцидозоы.кв . Украине примерно 1:2300 новорожденных, что соответствует срсднеевреаейским данным (Из.гг1з д. вt а!., 1987).

Таблица I

Препатальная диагностика в шести семьях высокого риска муковисцидозз

Рис.4. Частота встречаемости мутаций гена ТРЕМ у больных .'¿В на Украине

о использованием ДНК-анализа У плода

Генотип больного

ребенка_

Срок беременности, нед

Генотип плода

Рекомендации по ведению береиан-ностн

л?5оа/лг50й лЗ?50а/х

9-12 18-19

+/+

Вынашивать Вннаиивать Прервать"

Анализ делении. ЕЧоб ^^ дополнен анализом ферментов амннотиче-ской жидкости, проведенным в Институте акушерства и гинекологии (г.Санкт-Петербург). Риск по результатам биохимического к ДНК-анализа составил 80 %. л - число диагносцированных плодов; + - нормальный аллель.

Особый интерес представляет анализ встречаемости мутаций гена ТРЕМ у больных с разными клиническими формами муковисцидоза (табл.2).

Следует отметить, что у большинства больных с тяжелой формой муковисцидозз, сопровождающейся нарушением функции поджелудочной лелезн, патологический процесс сочетался с наличием в го-

мозиготном состоянии шш в компаунде с другими мутациями. Среди

Таблица 2

Генотипы больных (/») с разными клиническими формами ыуковисцидоза

Клинические формы

Генотипы

с нарушением функции поджелудочной железы

без нарушения функции поджелудочной желе__зы

Смешанная

Кишечная

Легочная

х/х

39,5 42,1 18,4 (паза)

57.1 28,6 14,3 (а=7)

26,7

46.6

26.7

а - число проанализированных большх; х - другие мутации в гене ТРЕМ.

случаев со смешанной формой таких больных было 39,5 и 42,1 % соответственно. 3 этой же группе била обнаружена мутация Среди больных тяжелой кишечной формой гомозиготы лолг^оа составили 57,1, а носители д Р50ак другой мутации гена ТРЕМ - 28,6 %, тогда как больные муковисцидозом с мутациями, отличными от д среди этих групп встречались гораздо реже: со смешанной формой в 18,4 % случаев, с кишечной - ь 14,3 %. Кроме того, в этой группе .'••лл& обнаружена мутация II). У больных с прогностически более благоприятной легочной.формой муковисцидоза в равной мере были представлены гомозиготы по и гомозиготы по мутациям,отлич-

.шм от д (26,7 %). Большую кэ часть этой группы представляли больные, имевшие дв кошаузще с другими мутациями. Результаты молекулярно-генетического анализа мутаций гена ТРЕМ у больных с разными клиническими нормами свидетельствуют о решающем вкладе д г50о в Развитие недостаточности функций подаелудочной железы а других органов системы пищеварения. Полученные данные свидетельствуют также и о том, что клиническую гетерогенность муковисцидоза вред ли кож)о обосновать, исходя только из наличия тех или иных мутаций гена ТРИ/,, поскольку среди гомозигот поаг^ встречаются больные как с чисто киаечныш,. так и с чисто легочными формами. Кроме того, случаи различного клинического течения заболевания встречались дате в одно,! семье у детей с одинаковыми мутациями леность в ре:юн;:е прореки клпш:чсско;: гетс ¡»темности мс-ут ы-с

ти исследования по аияснеишо функций ХТБМ и соли ра.шых тшюн i.a-рушения этих функций и патогенезе заболевания.

Аллелынй полиморфизм ;Ж-ло.':усои MET, IKP, 2>, 1ГДЬ

Аллельний полиморфизм ДНК-лскус.а ПЕТ анализировала в иьчзях с высоким риском муковисцидоза и у здоровых людей (доноров г.Киева) методом блот-гибридизации с использованием зонда net Н и эн-донуклеазы рестрикции ffaql (white R.,et ai., 1985.).

Во всех анализируемых случаях, при гибридизации Та,гх -гидро-лизованньь:. образцов ДНК с ^Р-меченш зондом и были выяаяены следующие »ЩРЛ-аллели: Mj - отсутствие сайта узнавания тля Sail (фрагмент 7,5 т.н.и.) и М., - наличие сайта .узнаиаиия длл iagi (фрагмент 4,0 т.п.и.) (рис.5). Полученные данные свздетеллстъуят с щ-(fjltX] щественаом пре&нменаи чаитоти ¡Uj-ae-

' лелей в семьях о высоким рпзкмл муко-

висцидоза (0,75) но ерданению с груп-'7,5 т.н.н. ной здоровых доноров (0,48) 9.

«5я СЗ1 4 Отп,н. Р<0.5), при этом частота гомозигот

по этому аллаяю также существенно пре~

то од

■ вышала таковую в контрольно»! группе,

цияРс°то™а в доноров

цов ДНК членов семьи внео- аллели и Mg встречались нрикорно с

¿ГДх^ЛЖГ2-ВМ&; с одинаковой частотой, и шыоэиго, о - Mjivif; 4-42^2 ^2'h, П0 наигч!Ф сайта узнавшим для

Ta<il было больше, чем в семьях с зисо-шш риском муковисцидоза.

Аллельный полиморфизм ДНК-локуса IJRP выявляли в сетях с высоким риском муковисцидоза и у здоровых доноров методом блот-гибридизации с использованием ^Р-меченого зонда-XV-2с и эвдо-нуклеазы рестрикции iaql (Farraix п. ©t al.; 1988), а также при амплификации in vitro в той не участке XV-ao фрагментах) 1000п.н., включавшего потеняйалыш'Ч сайт узнавания дли ондоиуклеоэы рострик-ции Taqi. Фланкирующие последовательности данного участга гомологичны таковым олигонуклеотидных праймеров для иолимеразной цепной реакции (НозипЫош C.L. et ul., 1989).

Do всех анализируем« случаях при хт.бивдкзашп T^jl -гшдтю-

по

лпзовашшх образцов JliiK с Р-гляены-л зондом xv-iic 6iaa сияиле-

ны следующие ПДРФ-аллели: Xj - отсутствие сайта для Saql (фрагмент 2Д т.п.н.), наличие сайта узнавания для Taqi. (фрагмент 1,4 т.п.н.). Кроме того, во Есех образцах гибридизовался констан-

т.п.н. (рис.6). При использовании метода полимеразной цепной реакции с последующим расщеплением Taql-андонукле-азой в анализируемых группах были выявлены ЦДР-аллеяи: Xj - отсутствие сайта рестрикции дая Taql (фрагмент 1000 п.н.), Xg- наличие сайта узнавания Taql (фрагменты 600 и 400 п.н.) и соответствующие ем генотипы: гомозиготы XjXj и XgX? (рис.?).

Анализ распределения ЦЦРФ-геноги-пов дшшой системы (табл.3) свидетельствует о существенном избытке гомозигот по отсутствию сайта для Taiil в груше детей, больных муковисцкдозсм (64,5 %), и у гетерозиготных носителей (47,6 $) у тогда как среди здорового населения такой генотип встречается значительно райе (18,7 %). В то же про.я генотипы с аллелем Х2 встречались у детей и их родителей гораздо рсгл, чем у здоровых, доноров, причем особенно редки были, гомозигота $ среда бальных детей, 9.2 % среда гете-

розиготных носителей мутаций ТРЕМ). -

Акалзд полиморфизма длины рзстрпкционных фрагментов локуса • D7SU проводила о использование эцдокуглоази растрккции Petl.

Яра ааашЕфашщй la vitro участка JJ.li с потенциальным сайтом узнавания для Pstl, фяанкпрухшиа. последовательности которого гомологичны токовод соответствующих олгахшуклеотидных прайыеров дая ЛЦР, образовывался продукт размером 3S0 п.н. (Uorthx-up H.et ai-, 1989). Анализ. ЦДРФ-аляалей по наличию иди отсутствии) сайта узнавашя. да»г Ps-i бал проведен в группе детей, больных, ыуковис-цвдозом, мх родителей и у здоровых ладей (доноров). Во всех анализируемых группах бшш выявлена аллели Dj - отсутствие сайта для Pstl (фратоаят 380 п.н.) 2 i.-2 - налива сайта для. PscX (фрагкзк-ты 230 а 150 п.н.), а тгисае соотзетствуиз^о гм ИДВа-геногапы - гс~ . аэзжготи D-Ej. D2i>a е гетегозиготы (рас.8).

тный фрагмент размером 1,1

с

2,1 т.п.н.

' ш

12 3 4

1,4 т.п.н.

1,1 Т.П.Н.

Рис.6. Блот-гибридиза-ция с зондом XV-2с образцов ДНК членов семьи высокого риска MB, гидроли-зованнок ТпоХ: Х-ХтХй;

2-Х1Х2; з-Vxi; ¿->#2

Таблица 3

Распределение ЦДгФ-генотипов по аллельаш системам локусов В7323, 1НР

в сзмьях с высокий риском нуховисцадоза и у здоровых дгноров

Полийорфные систеш Ки-19 - РзЪ1 - СБ.? - Шпб-Х .1311 - РзЪ1 ХУ-2с - Тад1

Генотипы

К1К1 К^ К2К2 С1С1 С^ ОрО^ В1С2 в2р2Х1Х1 Х1Х2 Х2Х2

Дети, больные Ш - 0,39 0,61 0 0,38 0,62 0,27 0,5 0,23 0,65 0,29 0,06

Родители (гетероэигот- 0,1 0,72 0,18 0,1 0,71 0,19 0,22 0,49 0,29 0,48 0,43 0,9 £ ные родители)

Здоровые доноры 0,49 0,42 0,09 0,35 0,51 0,14 0,07 0,45 0,48 0,19 0,51 0,3

Исследуемая группа

Примечание. Индекс I - хромосома с отсутствием сайта рестрикции, 2-е наличаеы сайта реатршеции.

¡¡олучечги.ч; данные (та6л.3) свидетельствуют с существенном преобладании генотипов d1di (отсутствие сайта узнавания .для Psti) в группах бсшь-ных детей и гетерозиготных носителей над таковыми в группе здоровых доноров, где наиболее частыми были индивиды, гогозиготпые по наличию сайта узнавания для Pcti.

Анализ полиморфизма длины рестршшионнпх фрагментов в локусе D7S23 был проведен в участках №19 и CS.7 с использованием эндонуклеаз рестрикции Psvti v. iii;ifc-i соответственно .

Амплификация ДНК in vitro проводилась в участках КЫ-19 и CS.7 с использованием краимеров__для ЩР, последовательности которых гомологичны таковым, фланкирующим соответствующие участки, включающие сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции Psti (Feldnan C.i. et ai. , 1988) И Hiift-I (.ШИааш С., 1988), Соответствующие продукты амплификации имели слсдукщие размеры: 950 п.н. (участок KM-I9) и 330 п.н. (участок CS.7). При наличии тщлифяцированном фрагменте caiiTa узнавания для Tstl при электро-форетическш разделении выявляли фрагменты 650 и 300 п.н,(рис.9), тогда как при наличии сайта узнавания для Hin6-I образовывались близкие по величине фрагменты 164 и 166 п.н., которые при гель-электрфорезе определяли как одну полосу размером 165п.н. (рис.9). При анализе аллельного полиморфизма в системах KM-I9 - Psti к CS.7 - Hin6-I у детей, оольных муковисцидозом, и их родителей, а также у здоровых доноров были выявлены следующие ЦЩ?-аллели: Kj -наличие фрагмента размером 950 п.н. (отсутствие сайта рестрикции

1000 п.н. 600 п.н.

400 п.н.

Рис.7. ДЩканализ ДНК в полиморфной системе ХУ-2с - Тад1 методом ПЦР. 2 %-ный агарознык гель: I - ХхХу; 2- ХтХо; 3 - Х_[л1: 4 - маркер молекулярной массы - ДНК фага > , гидро-лизованная рестриктазой Рэ^

для Раъх), Кг,- фрагменты 650 и 300 п.н. - наличие сайта узнавания для Рот;Х. Соответственно иДРФ-генотипы были: К^Кт — гомозиготы с отсутствием сайта для РаЪ1 на обеих хромосомах 7, К^ - гетерозиготы по наличию соответствующего сайта , К2К2 -гомозиготы, у которых сайт узнавания для ГзЫ имеется-на обеих хромосомах 7. Для участки СБ. 7 С1 -фрагмент ЗЭОп.н. (отсутствие сайта для Н1пС-1), с2- фрагмент 165 п.н. (наличие сайта для н1п5-1) ПДРФ-гено-типы были следующие: гомозиготы С^С}- и С2С2 и гетерозиготы С^.

В табл.3 представлены результаты анализа ПД№-

генотипов в системах КМ-19 - Раъх и сз.7 - шпб~1 у дотей,больных куковисцйдозом, я их родителей (облигатяых гетерозиготных, носителей мутантного гена) и у здоровых доноров. Следует отметить явное преобладание, генотипов о аллелем К^ (наличие с011 та рестрикции Рз-ьи в группе больных детей и'¡ас родителей. При этом у детей полностью отсутствуют генотипы а наиболее частыми являются (61,4 %). Сходная, тенденция наблюдается и в распределения генотипов гетерозиготных носителей, но прн довольно низкой частоте гомозигот К-^К^ (10,5 %) болькую доли состаашжт гетерозиготы К^, тогда как гоюзнгаты К^ представлены реле (17,9 %). У здоровых доноров наблюдаются обратные тенденция: наиболее - многочисленную группу составляют генотипы с ачлелем Кц- (отсутствие сайта узнавания Ра«), тогда как аллель К, встречается реже, а гомозиготы К2К2 о^ень редки (8,6 %).

€>Т111_

«яг.т --.¡¿'¿О п>н>

'"•" ■' ——>» : 1Ьи Ц.ч.

12 о 4

Рис.8. ПДЮ-а^ализ Д{К ь полиморфной системе .^.И-Р»« методом ГОД?,, 2/—нн11 агарозшй .таь: I-паркер молекулярной массы - дП;; фагя Л , пздроли-зованная рестгиктазоп раы» 2 -1)1 £>21 3 - »2В2|

©й фЪ

-пущ I'V?? - {S?1*

' - I

г.

В23

330 п.н.--— _ ~ -— — — 300 U.K.

1 23 4 56 789

Рис.9. ПДРЭ-анализ ДНК в полиморфной системе Cs.7-Hln5-i (А) к К\Ы9 - Pstl (Б) методом 1ЩР. 2 #~ный агарозный гель: I - СтСо; 2 - СтСо; 3 - СуСо; 4 - СтСт; 5 - маркер молекулярной массы - ДШГфага А ."гидролизованная рестриктазой rati-, б-К^; V-KjKg-, B-KgKg; S - KJKJ

Для частот генотипов, содержавших ПДРФ-аллели Cj и С2,наблюдались те же закономерности, что и для ПДОй-генотипов в системе 1Ш-Х9 - Petl. Генотип C-^Cj не был выявлен ни в одном случае в группе больных детей. Преобладающий у них генотип С2С2 (62,2 %) был редким в группе здоровых доноров (13,9 %).

Проведенный анализ аллольного полиморфизма ДНК в локусах ЬШТ, IBP, D7S2J и D7S6 свидетельствуетчто среда больных муковисци--дозом крайне редко встречались гомозиготы по наличию сайта узнавания I&q.x в участке XV-2c к iiet Н, тогда как го-.;ознготы ко отсутствию сайтов для Ptsil и Шаб-I в участках К."-19 и сз.? ло-куса D7S2} вообще не обнаружены. Эти дашме согласуются с да:шы-ми,' полученными для больных муковисцидозом в Санкт-Петербурге (Баранов B.C. и др.,1991),а также в странах Западной Европы и Су-верной Анорики (Beaudet A. et al., 1986; K-ra^c-zai: Ц. et al., 1988; Kstiviile i. et al., Г988).В семъяу с высоким риском муко-висэддоза, в которых материал, получений от больного ребенка, был доступен для исследования, ана.ч;-*^роваяа наравковезае по сцеп-ленка ыутантвого гена ТРШ с ЦДР&.^ашютипаш в локусах D7S23, ISPjc Гаялотшты родит&и-^ах хромосом с кутаниями гена

1EEU определяла по ЦДР&-геао"Лау больного ребенка. Данные анализа расяредслеяак гапланш---»' четырех ЦДРФ-оастем показатели не-

равновесия по сцеплению ГА с соответствующими критериямих2и коэффициентами относительного апроксимального риска н приведены в табл.4.

Полученные показатели свидетельствуют о высокодостоверном неравновесии по сцеплению мезду наличием л и. сайтов узнава-нид янтонуклеазами рестрикции PstJ в системе КМ-19 (Х2=37,8), ¡linri-.; в системе es. 7 (X^47,9J, а такте медцу л РЦОои отсутствием на данной хромосоме 7 сайта узнавания для эвдонуклеазы îaql в системе xv~2c (Х^=з,78). Соответственно показатели относительного апроксимального риска H для гаплоткпов Kg, С^ и Xj- были довольно высоки: 11,9; 15,7; 3,66 соответственно. Такая же закономерность прослеживалась для ассоциации других мутаций в гене ТРЕЛ с соответствующими гаплотипами. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными другими авторами (Kstiviie х. et al., IS88; Krawcaal: H. et al., 1988; ¡..omet X. et al., 1988; Beaudet A. et ai., 1982). В то же время сцепление и других мутаций

гена ТРЕМ с наличием или отсутствием на данной хромосоме 7 сайта узнавания эндонуклеази PstI в локусе D7So было равновесным,т.е.

равно как и другие мутации, встречались на хромосомах 7 с галлотилсм Dj и практически равновероятно. Результаты исследований укладываются в гипотезу о едином европейском происхождения Л на хроуосоме 7 с гаплотипом KgC^Xj (Serre J.L. et al.. I99C> и дальнейшем распространении ее в разные страны, включая Украину и РСФСР (Баранов B.C. и др.,1991).

Полученные дачные о неравновесии по сцеплению между мутациями гена ТРЕМ, отличными от д р^0й и ПДР$-гаплотипами Kg, Cg, Хр полезны для поиска новых мутаций гена на хромосоме 7 с'этими гаплотипами, а также в плане использования их в пренататьной диагностике куковисцвдоза для проведения внутрисемейного анализа ПДРФ локусов 07S2J и . IRP- дак-анализ в системах КЛ-ИЬ - Pstl,*cs.7 -Hinâ-I и xv-2o - ïa^i этих локусов был диагностически информативен в S0 % проанализированных нами семей.

ПолиморЬизм ДПК-локусов D7S2}, ZKP и

D7So у здорового населения разных регионов Украины

Изучение распределения ЦЦРй-генотипов проводили в популяциях здорового населения городов Киева, Львова, Кременчуга (Полтавская оо.-i.l. Зо всех случаях, за исключением полиморфных вариантов системы Cb.v HinG-i в популяции г.Кременчуга, наблюдалось хорошее

Таблица 4

Ассоциация мутаций в гене ТРБМ с полиморфизмом ДНК в украинских семьях с высоким риском муковисцкдозв

Полиморфная

Число хромосом 7 с мутациями

Показатели сцепления

Относятель-

система дг5оа с другими мутациями Всего нормальных -V ГА2 2 В

СЭ.7 - Шлб-1 С1 3 9 К 50 0,63 37,8 0,38 6,85 11,9

% 45 15 60 22

КМ-19 - Рз« К1 2 9 II 55 0,7 47,9' 0,43 9,43 15,7

«2 46 17 63 19

- РБМ 19 9 28 37 0 - -0,15 0,96 0,89

а2 22 II 33 35

ГУ-2с - Тад! Х1 26 13 39 28 ■0,26 3,78 -0,3 з.и 3,66

Х2 3 4 7 18

Примечание. Шдекс I - отсутствие сайта рестрикции, 2 - наличие сайта

рестрикции;гд1_ коэффициент ассоциации меяду и сайтом рестрикции;гд2-

коэффициент ассоциации между другими мутациями и сайтом рестрикции.

Таблица Ь

Гооднгог гетерозиготнооть (наблюдаемая и изддаомел) и относительноз отклонение наблюдаемой гетерозиготностч от ожидаемой (D) для Щ'.Рй-алльлей четырех докусов хромосомы 7 человека в региональных пону.шцяях Украины

Популяция Гетерозиготнооть ta 0

наблюдаемая ожидаемая

Киевская 0,51+0,02 0,46+0,008 1,93 0,09

Кременчугская 0,49+0,03 0,45+0,01 1,44 0,01

Львовская 0,41+0,03 0,42+0,СГ 0,13 -0,009

ta - значение критерия Стьюдента для сравнения средних значений наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготнооти.

соответствие наблюдаемых и оаидаомнх но уравнению Хдрди-Вашсергь. распределений ПДРФ-генотипов.

При сопоставлении значений средней гетерозиготнооти по четырем ДНК-полиморфизмам (таол.5) было вычинено, что ьтот показатель существенно ниже во львовсксй по сравнению с киевской (Cd =-2,68, Р< 0,05) и кременчугской (cd =2,01, Р*.0,5)'популяциями.

Для оценки генетического расстояния между исследуемыми популяциями проводили анализ показателей сходства (г) и соответствующих им критериев идентичности (I). Полученные данные свидетельствуют о наличии достоверных генетических различий меэду киевской и львовской (г =0,9966+0,0018, 1 =15,95, Г <0,05), а также Львовской и кременчугской (г =0,9931+0,0028,1 =23,7, Р< 0,005).

I

2 ' з-

Рис.10. Дендрограмма генетического сходства популяций: I - львовская популяция, 2 - кременчугская популяция, 3 - киевская популяция

На рис.10 представлена дендрограмма генетического сходства региональных популяций Украины, на которой четко выделены два кластера, в один из которых входит популяция Львова, во второ',"; - популяции Киева и Кременчуга. При этом оценка генетической гетерогенности по всем полиморфным системам Д|{11 показала, что наибодез весомый-вклад в мекпопуллционные различия вносит полиморфизм в сис-теуе 03.7 - Н1пб-1, Х2(аг=2)=-2^,07, Р<о,ыи).

BiJBOjlU

1. I аз работай ¡/одифицированннй вариант метода полимеразной цепной " реакции, пригодный для одновременного выявления некоторых мутаций в 10-м и И-м зкзонах гена ТРЕМ (сиж).

2. Исследована частота встречаемости мутаций л (10-й экзон), R555X, G5;;td и S3W (П-й экзон) у оольных муковисцидозом на Украине. Установлено, что частота делеции составляет 59,2 %, мутации Н353Х и G55ID зарегистрированы в единичных случаях, мутация 05491 в исследованной группе больных не обнаружена.

3. Частота гетерозиготных носителей делеции среди здорового взрослого населения Укрэины составила 1:40. Целесообразно проведение поиска других мажорных мутаций, приводящих к развитию муковисцидоза на Украине.

4. Полученные данные позволяют сделать вывод о существенном вкладе делеции в развитие тяжелых клинических $юрм муковисцидоза. Анализ делеции в семьях высокого риска перспективен. для эффективной профилактики и пренатальной диагностики муковисцидоза на Украине.

5. ПДРФ-акалиэ 5 сайтов четырех ДНК-локусов (lüt, ihp, 073а и D?sas)i тесно сцепленных с геном ТРЕМ (CFTR), в семьях с высоким риском данного заболевания позволил установить достоверное неравновесное сцепление гаплотивов 1С,, Cg и Xj в системах КМ-19 -РэИ, Со.7 - Н1пб-1 (локус D7S23) и Х\'-2с Чло-кус IKP) с мутациями гена ТРЕМ и отсутствие неравновесия по сцеплению гена ТРЕМ (СИМ) Dj и D2-аллелями локуса D7S8.

6. Анализ полиморфизма ДИК локусов D7SP.J, хкр, d?sö в региональных популяциях Украины свидетельствует о генетической гетерогенности данных популяций, существенный вклад в которую вносят межпог.улнционше различия ь распределении ПДРй-генотипов системы OS.7 - НАпб-i.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лившиц Л.А., Кравченко O.A., Гриико В.И.," Булшевская Т.И., Баранов B.C. йолекулярно-генетический анализ делеции F50S гена Муковисцидоза методом полимеразной цепной реакции е- украинских семьях с высоким риском данного заболеваиял /7 Докл. АН Украины. - 1991. - & з: - С. 157-160.

2. Лившиц Л.А., Кравченко С.А., Гришке В.И., Гаврилюк О.И., Коваль-

• С.:;., byvnoL-oraa 'Г.И. , KiUi.i'.>;t ii.C. ;i..jiiiiij j.yoi

: ¡'GHiiib: ¡Ьрогпии-он U -жжуос;;') ipGw: cur.,» 7 4(ii(iB(iica /> if , ' ¿i пг-изтчга. - L'.'^L. - . 2r), - 0. 11. Г,'.

[■,. Jiia.;':»H . Ki>u)i4H!!iu; C.A., I'uui:iKi"i Б.;!. , I 'i..!., i.i-

каиол ]>.C. iiopuniiObeoHoe оцепление иолил'/^г.зма ,iv;;!iU> рестригс-нионннх a pr.v.ciio'on хришсога V человека с иут.щияив в vww щ коиисцидоза в укишшской поп/лшш // июлгшглэры и ю.ог:'.а. -1991. - Т.?, X' ^ - С.86-91.

1. Баранов КС., Иващенко Т.13., Гог Дулова Ь.й. , Воронин i o.JJ. , Гайцхоки B.C., Гольцов А.Л., Кабоев O.K., Шварц Ь:,а., Серии 11.Л., Лившиц Л.А., Бужиевская Т.Н., Веножинскнс МЛ'., Соколов Б.П., Калинин В.К., Орлов Л.й., Ромакенко и.!1., Лукьнненко A.if., Капранов К.И., j-ьчинский О.В. ¿ляельний полимощ-изм ДОС-локусов г,и;'Г, D7b<j, D?£23, сцепленных с геном муксвисцидоэа, в некоторых популяциях СССР, в семьях высокого риска и у больных мукоьиснидозом .// 1'еиотика. - 1991. - T.iiV, I L -- C.TT.'J-121.

b. Лившиц Xi.A., Къаъчьнко C.a. , рришко В. И., Еугмвскгл Т.Н., I'.a l-.чнов ii.C. Ш10ЛМШЙ ьоли/.юцЬизм и некоторых Дпи-л^кусах .хромосомы ? челонока н ciWbijy, о цукивпсцидозом ;; в яоьул.чциях разных роглоков Украины // И Оакзомз. копф.'Тоном чииовека-91": Гез. докл. (Пересланль-Зале.сскиЦ, нояб. 1991 г.). -',*■>, I9&L -С.122.

Ь. Baratiov V.sJ. , ivueoUtimo Т.К., (iorbunova V.H., Voronina O.V.,

Llvsliits L.A., Venozineitis, liouanenxo O.i'., GoLtzov A.A., ShwarGz ii.X., Kalinin V.H. Allelic polymorphism of DMA loci closely United to СР-сьт in affected and uoa-aifectej рлгвонь from rliiferon« nopa3.\tioaa of the OSSu // /bscracta« ititilntric imliacnolot;y. Hortli AaevJ caa Oyetio i?ibcjala ОопГоголос С Ас1ел~ fcton, Oct. >6, 1990). - P. 199.

У. Livchits li.A. , iCravciieri'tr; O.a. , (iriBOnto '/.I., Ocruytnko 1.1.G-. , i.I.BuJevnj.aja. Liana™ diflfiouillbrium betwoeu «y.jti« fibrosis p;c-ne mutations ana liPLP of human chromosome ? wi'thia the Ukrainian population // Abstracts the l?ta ¿urnoean 'Jvstlfi Fibrosis Confei-ence, Copenhagen, 17-21 June, 1991.

o. Baranov V.£i. , Ivaschemto Т.Е., Ourbaaova V.N. , Livshltz. L.A.. , VenozinsKis LI.Т., Geinbovukaya S.A., Kalinin V.H,, ¡lotianynico O.P., Geabitzrcaya Т.К.. Orluv A.V., Kapranov ГЛ., Lebedev V.U., iiihailov A.V. , Pigiaa T .V. , Shwed П. V. i'coi;uency oi the P 50сз ualetion in cyutic fibroais pabiants iron the Duropann part of the USER // Ншаад Genatlca. - 1991. - V.h7, - !?.6I-6^.

Я