Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ полиморфизма и идентификация мутаций гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза в популяциях человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ полиморфизма и идентификация мутаций гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза в популяциях человека"

РГ6 од

. САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННИЙ УНИВЕРСИТЕТ

1 Р ч\ч -

) ( ! 1 » * ) I * .

на правах рукописи УДК 575.1:616.007.07

йгбангла Клемент

АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МУТАЦИИ ГЕНА ТРАНСНЕНБРАННОГО РЕГУЛЯТ0РН0Г0 БЕЛКА НУКОВИСЦИДОЗА В ПОПУЛЯЦИЯХ ЧЕЛОВЕКА. .

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1993

- г -

Работа выполнена в лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней научно-исследовательского института аку«ерства и гинекологии им.Д.О.Отта Российской АМН и «а кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета.

V

Научные руководители: доктор медицинских наук,профессор В.С.Баранов доктор биологических наук.профессор Л.З.Кайданов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,профессор B.C. Гайцхоки доктор биологических наук,профессор Н.В. Токнлин

Ведущее учреждение: Петербургский Институт ядерной физики РАН.

Защита диссертации состоится в "Л" час,

на заседании специализированного совета Д.063.57.21 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности " Генетика " при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу:199034. Санкт-Петербург, Университетская набережная.?/^.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке имени Горького СПб.государственного университета

Автореферат, разослан

Учений секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

1993г

Мамон /I,А.

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема: Молекулярный анализ структурно-функциональной организации генома зукариот и, в первую очередь, человека -одно из Магистральных быстро развивавшихся направлений современной генетики и молекулярной биологии. Решавшие успехи последних лет в этой области стали возможными благодаря появлению высокоэффективных и достаточно экономичных биотехнологических приемов и методов,широкое применение которых ознаменовало начало качественна, нового этапа исследований в генетике зукариот, сделало вполне реальным картирование всех генов человека и выяснение первичной нуклеотидкой последовательности его генома. Естественно, что исследования подобного рода весьма актуальны как в плане Программы "Геном человека", так и для решения проблем медицинской генетики, поскольку на их основе разрабатываются наиболее эффективные стратегии ранней диагностики и профилактики наследственных болезней.Именно в такой направлении и была выполнена данная работа,

Нуковисцидоз (MB) -кистозный фиброз подкелудочной велеэы.наибо- . лее частое из всех известных на сегодняшний день аутосокно-рецес-сивных заболеваний, встречается в европейских популяциях с частотой J:2000 - 1:2500 новороменных. В среднем кгядый двадцатый витель Европы и Северной Америки является гетерозиготным носителем ыутантного гена муковисцидоза и каядэя четырехсотая супружеская пара имеет примерно 25Z риск ровдения больного ребенкз [European workins group on CF Genetics (EHGCFG). 1990].Только в США в 1990г. зарегистрировано до 13000 больных MB, а число гетерозиготных носителей предполоаительно составляет около 13 млн.человек. Считается, что егегодно в России роядается около 750 больных MB при средней частоте 1:2500 новорожденных в европейской части России (Капранов H.H. и др.,1992).

Цель работы. Изучить полиморфизм популяций и провести идентификацию мутаций гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза (ТРБМ) в некоторых популяциях, в семьях высокого риска и ц больных ИВ.

Основные задачи работы.

1.Проанализировать особенности ДНК полиморфизма SB и 8-го инг-ронов гена ТРБМ в некоторых популяциях СНГ, в семьях высокого риска и у. больных МБ.

2,Изучить частоту наиболее распространенных мутаций экзонов 7СR334H,R34PP) и 1KG542X.G551D.S553X) гена ТРБМ у больных HS в разных популяциях.

3.Провести анализ информативности семей высокого риска МБ на носительсво некоторых молекулярных маркеров гена ТРЕМ и апробиро-' вать этот подход для ДНК-диагностики MB у плода на ранних сроках развития, используя метод анализа полиморфизма внутри гена и метод прямой идентификаций мутаций посредством полимеразной цепной реакций (ПЦР).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Частота гекса- и гепта-такдемннх тетра'мерных GATT повторов (ТТП) 6В интрона гена ТРБМ у русских северо-западного региона России и Санкт- Петербурга оказалась сходной с таковой в популяциях Узбекистана.Азербайджана и Грузии; разница частот ТТП аллелей между грузинской и азербайджанской популяциями и между грузинской и узбекской популяциями статистически достоверна; обнаружен ранее неизвестный окта-копийный повтор (КП) ТТП 6В интрона гена ТРЕМ в 2-х семьях татарской национальности.

2. 6КП 6В интрона гена ТРБМ находится в полном сцеплении с наиболее распространенной мутацией delF508,обусловленной делецией 3-х нуклеотидов в 10-ом экзоне гена ТРБМ,а также обнаруживает неравновесие по сцеплении с другими изученными в данной работе мутациями этого же гена .

3. Обнаружены выраженные меяпопуляционные различия в частотах некоторых аллелей, обусловленных различиями в числе динуклеотид-ных CA/GT повторов в 8-ом интроне гена ТРБМ в русской,грузинской и узбекской популяциях.

4.Различия в числе динуклеотидных CA/GT повторов в 8-ом интроне гена ТРБМ, обнаруженные в исследованных семьях русской национ-нальности с MB. определяют 7 различных аллелей из 8 характерных-для данного полиморфизма. Их частоты существенно варьируют как в нормальных, так и в мутантных хромосомах; хромосомам с мутацией delF508 гена ТРБМ соответствуют только аллели 2(23КП) и ВС 1 РКПï в данной выборке.

5.Частота мажорных для Западной Европы мутаций G551D.G542X и R334H гена ТРБМ у больных MB северо-западного региона России и Санкт Петербурга оказалась сравнительно низкой, а мутации R347P и R553X того не гена в исследованной нами выборке больных MB вообще не обнаружены.

В. Анализ полиморфизма RB интрона гена ТРБМ, обусловленого ТТП в сочетании с детекцией мажорной для русской популяций мутации' deIF508 того же гена судественно повышает информативность семей высокого риска по MB. т.е. делает их пригодными для молекулярной

диагностики на ранних стадиях внутриутробного развития плода.

Научная новизна. В работе впервые проведен анализ частит тан-демных тетрамерных 6АТТ повторов 6В илтрона гена ТРЕМ в 4-х различных популяциях СНГ и выявлены достовернные различия соотношения 6КП и 7КП аллелей этого гена между грузинской и азербайджанской (р<0,05) и «езду грузинской и узбекской (р<0,05) популяциями.

Найден ранее неизвестный окта(8)~ копийный повтор 6В интрона гена ТРЕМ у представителей татарской национальности.

Впервые обнаружено,что 6КП 6В интрона гена ТРЕН во всех изученных хромосомах сцеплен не только с мутацией йе1Р508 этого гена,' но и с его другими мутациями.

Впервые проанализирована частота микросателлитных динуклеотид-ннх тандемных повторов С МДТП > СА/67 8-го интрона гена ТРЕМ в трех различиях популяциях (русекой. узбекской и грузинской). Обнаружены виравенные межпопуляционные различия в распределении некоторых из аллелей, обусловленных различиями в числе динуклеотидных тандемных повторов (ДТП) СА/БТ в данном интроне этого гена.

Впервые в семьях высокого риска с куковисцидозом показано, что мутация ¿8^508 гена ТРЕМ неслучайно сцеплена с повторами 2 (23КП) и 6(17КП) ДТП СЙ/6Т 8-го интрона этого гена .

Впервые установлено, что манорные для популяций Западной Европы и Северной Америки мутации гена ТРБИ 65510, 6542Х. Й334Н, 1?347Р и Й553Х в популяциях России и СНГ встречаются сравнительно редко.

Практическая значимость работы. Обнарузенное неслучайное сцепление 6КП 6В интрона гена ТРБЫ не только с мутацией йе1Е508, но и с другими мутациями гена, имеет большое практическое значение, так как позволяет широко использовать эти генетические особенности на начальном этапе скринирования при молекулярной диагностике МВ.

Совместное использование анализа полиморфизма 6В интрона гена ТРЕМ в сочетании с пряной идентификацией мутации с!е1Р508 существенно повышает число информативных семей с высоким риском МВ, т.е. делает их пригодными для молекулярной диагностики на ранних сроках беременности.

Апробация работы . Основные положения диссертации были представлены в виде постерннх докладов на 6-й Ежегодной Северо-Амери-.канской конференции по муковицидозу (Вавингтон,1992). на XI Международном Конгрессе по муковисцидозу (Дублин.1992), в виде доклада на II1-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыха-

ния (Санкт-Петербург. 1992). на заседании Общества Медицинских генетиков (1992).

Публикации. По теме диссертации опубликованы пять работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения. 3 глав, выводов и списка литературы.• Диссертация излоаена на 120 страницах машинописного текста и содеркит 13 таблиц и 18 рисунков. Список литературы содервит 124 источника .из них 14 русских авторов и 110 иностранных.

Материалы и методы исследования. В качестве материала использовали пятна крови,нанесенные на фильтровальную бумагу, и полученные из крови ДИК доноров- русской (Санкт-Петербург и свверо-за-падный регион Россиской Федерации), азербайджанской,узбекской и грузинской национальностей, больных МБ и их родителей, а таете ДНК из клеток биопсатов хориона и амниотической видкости (ftSI плодов от беременных группы высокого риска,направленных на прена-тальнув диагностику МВ.Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови,биоптатов хориона и амниоцитов.а такне анализ расцепления фрагментов ДНК посредством эндонуклеаз.мечение праймеров,ДНК-по-лимеразную цепную реакции(ПЦР) проводили согласно общепринятым методам (Маниатис и др.1983.198?).Использованные олигонуклеотид-ные лрайыеры. а такяе термофильная ДНК-полимераза и эндонуклеазы синтетизированы на Обьединении " Фермент"(г.Вильнюс).

Результаты и их обсуядение.

Анализ тетрануклеотидных тандемных повторов интрона 6В гена ТР5М.

Повторы 6В интрона гена ТРБМ обнарувиваются в виде гепта (?-копийный повтор-7КП) или гекса (6-копийный повтор-бКП) повторов. Результаты исследования частот 6КП и 7КП аллелей в некоторых популяциях СНГ приведены в табл.1, и свидетельствует о том, что аллель 7КП в русской, азербайдаанской, узбекской и грузинской популяциях достоверно чаце встречается, чем аллель 6КП (р<0,05).Достоверные мевпопуляционные различия по распределении этих аллелей в данной выборке обнарухивався только мевду грузинской и узбекской (уГ(3-4)=4.г,р<0,05КтаблЛ) и невду грузинской и азербайдванской популяциями 2-4)=4,2 р<0.05)(табл.1'). -

Из данных, приведенных в табл.2, следует, что наблюдаемые и теоретически овидаеиые частоты генотипических классов находятся в хороаем соответствии (р>0.05).Это может означать.что в исследованных популяциях не происходит избирательной.элиминации одного из аллелей, т.е. оба аллеля являются , по-вис,имоиу. селективно

нейтральными.Такой результат полностьв согласуется с аналогичным выводом.сделанным американскими авторами при анализе ТТП аллелей 6В интрона гена ТРЕМ (С11е1тЬ еЬ а!...991).

Во всех опубликованных сообщениях по ТТП повторам (СЬеЬаЬ еЬ а1..1991¡Гимбовская и др.,1993, 5с1>маК2 е1 а1 .,1993) и в данной Таблица.1 Частоты аллелей 7 КП и б КП 68 интрона гена ТРЕМ в некоторых популяциях.

аллели оценка достоверности межпопуляционных различий

п/п популяции 7 КП 6 КП

N частота (7.) ■ N частота С 7.)

1 Русские 50 80,6 .12 19,4 1-2 р >0.05 .1-3 р >0,05 1-4 р>0,05 2-3 р >0,05 2-4 р< 0,05 3-4 р<0,05

2 Азербайджанцы 38 76,0 12 24.0

3 Н.збеки 39 78,0 И 22,0

4 Грузины 136 89,5 16 10,5

работе проанализировано в обцей слояности более 800 нормальных и мутантных хромосом и во всех случаях зарегистрированы либо гек-саС6),либо гепта-(7) варианты тандемных повторов.т.е.этот диморфный полиморфизм представляется достаточно стабильным.Тем болре неожиданной находкой явилось обнаружение окта-(8)- мерного варианта ТТП 6В интрона гена ТРБМ у двух представителей татарской национальности. Этот 8КП выявлен у отца больного ребенка с НВ,однако, он не был зарегистрирован у пробанда и, следовательно, находился в сцеплении с нормальным аллелем гена ТРБМ. Второй случай окта-мерного варианта ТТП аллеля найден в другой татарской семье, в которой один из детей болел МВ.Интересно то, что в семье представлены все варианты аллелей ТТПДрис.П.Зти находки опровергают существующее представление о диморфном состоянии аллелей, обусловленных различиями в числе ТТП 6В интрона гена ТРБМ.Необходимы дополнительные популяционные исследования лиц татарской национальности и,возможно,других популяционных групп тюркского происхождения для выяснения размаха вариабильности данной аллельной

системы.

Анализ тандеиных тетрамерных GATT повторов интрона 6В гена TPSM ' у больных и у родителей детей с MB.

В работе исследовано распределение ТТП-аллелей в нормальных хромосомах (123) и в мутантных. т.е. с мутацией гена ТРЕМ.(192). Причем, последняя группа включала как хромосомы с мутацией de1F508 Таблица 2

Наблюдамое и теоретически ожидаемое (по формуле Харди-Вайнберга) распределение генотипов 7/7. 7/6, 6/6 в некоторых популяциях при исследовании ТТП 6В интрона гена ТРЕМ.

популяции частоты генотипов

7/7 7/6 6/6

теор. набл. теор. набл. теор. набл.

Русские 0.66 0,65 0,31 0.32 0,04 0,03

Азербайджанцы 0,58 0,52 0,36 0,48 0.00 0,00

Узбеки 0,61 0,56 0,34 0,44 0,05 0,00

Грузины 0,79 0,79 0,20 0.21 0,01 0,00

( 63), так и хромосомы, несуцие неидентифицированные мутации этого гена ( 129).Заметим такие, что практически все обследованные семьи относились к русской популяции Европейской части России.Полученные результаты представлены в табл.3 Как следует из приведенных данных, в "здоровых" хромосомах 7КП встречался достоверно чаще. чем 6КП,(р<0,05).И соотноиение 7КП:6КП при этом хоро-во согласуется с распределением этих аллелей среди русских. Иная картина наблюдается в распределении 7КП и 6КП в хромосомах с му-тантным геном ТРБМ. Прежде всего, обращает на себя внимание,что все 63 хромосомы с йе1Р508 имеют 6ИП и ни в одном случае эта мутация не сцеплена с 7КП. Сложнее обстоит дело с распределением 7КП и 6КП в "больных" хромосомах, ни несущих мутации йе1Р508. Согласно намим данным (табл.3),6КП в иутантных хромосомах представлен несколько чаще, чем в "здоровых". Более того, ресчеты коэффициента стандартного неравновесия (51) и коэффициента аппрок-

еимативного (относительного) риска (г) показывают, что 6КП неслучайно сцеплен с ыутантными хромосомами (г=1,3; ^ - 4,28;

05>.3ти результаты позволяют прийти к выводу о том,что помимо (1е1Р508 ,6КП также сцеплен еще с какой-то мутацией (мутациями) гена ТРБН-, идентификация которых может иметь важное диагностическое значение. Следует, однако,отметить,что выявленное в данной работе неслучайное сцепление 6КП с неизвестной мутацией, пока

Рисунок 1.

Анализ тетрануклеотидных повторов в семье К.

в интроне

гена ТРБИ

1

7КП/8КП

8КП/7КП

I

7КП/8КП

8КП/6КП

»ЭТТ~

у-кл-Ь

I

1

4

является единственным, поскольку в работах других авторов (СЬеЬаЬ е1 а1.,1991; Гиыбовская и др.1993) частота этого повтора в мутантных хромосомах без йе1Г508 не отличалась от среднепопуля-ционной. Причи ы наблюдаемых различий остаются неизвестными. ' Вполне вероятно, что они обусловлены особенностями клинических форм МВ в проанализированных выборках больных МБ. т.е.тем.что именно в нашей группе больных МВ преобладала пока неидентифициро-ванная мутация гена ТРБМ, тесно сцепленная с ВКП, тогда как в группах больных из других лабораторий эта же неизвестная мутация встречалась редко.Таким образом, проведенные исследования доказы-

Таблица.3

Частоты аллелей 7 КП и 6 КП интрона 6Б гена ТРБМ в мутантных. и нормальных хромосомах .

Обозначения: N -число хромосом

МВ—нормальные хромосомы" МВ+ -мут'антные хромосомы

вавт перспективность направленного поиска неизвестной малорной мутации гена ТРБМ в навей выборке больных МВ.

Популяционный анализ микросателлитных СЙ/6Т повторов интрона 8 гена ТРЕМ.

Данные о частотах аллелей,обусловленных различиями в числе микросателлитных СА/ЬТ повторов в 6-ом интроне гена ТРБМ в сравниваемых популяциях приведены в табл.4. Как .следует из этих дакних, в исследованной выборке русской популяции из 8 возмовных аллелей этой системы идентифицированы только 6, причем частоты этих аллелей существено варьировали. Особенно многочисленную группу составили частоты аллелей 6С17КП) и 7С16КП) на долю которых приходилось 76,5У. всех аллелей , тогда как остальные аллели (1(24КП),2(23КП),3(22КП), 8(15КП)) встречались сравнительно редко, а аллели 4(21КП) и 5(18КП) вообще не были выявлены.В узбекской популяции обнарувены только 5 аллелей, причем не найден весьма частый для русской популяции аллель 2, тогда как частоты других аллелей в этой этнической группе статистически не отличаются от таковых у русских.Обращает на себя внимание то, что набор соответствующих аллелей в грузинской популяции ограничен только 3-мя аллелями, причем на доли только одного аллеля (7) приходится 79,IX.что достоверно больче.чем частота этого аляеля в русской популяции 8,4 р<0,05 ).Аллели 1-5 у грузин вообще не обнару-«ены,тогда как аллель 8 встречается реме, чем у узбеков.Эти раз-

аллели хромосомы

МВ- МВ+

N частота с йе1 Р508 без бе 1 Г508

N частота К частота г

7 КП 98 0,80 0 0,00 88 0,68 0,11 0.5

6 КП 25 0,20 63 1,00 41 0,32 1,9

личиа статистически достоверны С табл.4).Полученные данные заметно отличаются и от таковых в литературе.В частности,первооткрыватели данного полиморфизма при анализе испанской популяции обнаруки-ли.что аллель 7 присутствует в 79У. хромосом, б - в ИХ, и 2 - в ?,5У., а остальные аллели представлены единичными случаями (Morral et al..1991).Найденные величины близки к частотам в грузинской популяции, но существенно отличны от таковых в русской.Весьма специфичный набор этих аллелей характерен и для узбекской популяции.

Таблица.4

Частоты аллелей обусловленных различиями в числе Cft/GT динуклео-тидных повторов в 8-ом нитроне гена ТРБЫ в некоторых популяциях .

аллели 8-го интрона и число копий

популяции

РусскиеШ

У.

Грузины(II)

У.

Нзбеки(Ш)

N У.

Достоверность

J

%

I-II I-III II-III

К24КП)

2( 23КП) 3(2::ш) 4С21КП) 5С18КП) 6(17КП) 7(16КП) 8( 15КП i

всего

1

?

3

О

о-

14 35

4

64

1.8

10,9 4,6 0.0 0,0 21,9 54,7 6,3

0

0 О

о о 11 49

62

0.0

0,0 0.0 0.0 0.0 17.8 79,0 3.2

4

0 1

О

О ?

39 9

60

6.7

0,0 1.7 0.0 о.с 11.7 65.0 15,0

0.97

7,10*

2,97

0,33

8.40*

0,65

2,08

7,10*

0,90

2,29 1,38 2,56

4,27* 1.07

0.89 2.01 5,15ч

N

N

Обозначение: * -частоты аллелей в сравниваемых популяциях достоверно отличаются (р<0,05).

Таким образом, анализ полученных и литературных данных свидетельствует о значительных межпопуляционных различиях частот динуклеотидных СА/БТ повторов 8-го интрона гена ТРБМ. Изучение данного полиморфизма мояет представить значительный интерес для

решения различных вопросов популяционной генетики человека. Анализ мивросателлитных динуклеотидных повторов интрона 8 гена ТРБМ у больных и в семьях выс о кого риска . Как следует из данных, суммированных в табл.5..распределений

динуклеотидных CA/GT повторов .8-ого интрона гена ТРБМ в хромосомах с мутациями гена ТРБМ различно и зависит от наличия (или отсутствия) мутации *delF508.TaK,B хромосомах, несущих эту мутацию встречаются, лишь -повторы 2(23КП) или 6(17КП), причем повтор 6 . встречается- несколько чаще, чем повтор 2. В тоже время в хромосомах без de1F508. т. е. несущих .какие-то иные мутации гена ТРБМ. обнаружены те же повторы, что и в "здоровых" хромосомах примерно в техже соотношениях. Тесное сцепление de1F508 с повторами 2 и б ранее было отмечено в работе других авторов (Morral et . al., 19ai).Причина ассоциации двух разных повторов с одной и той ве мутацией , по всей вероятности, связана с мутацией (ошибкой кроссинговера ?) в области динуклеотидних повторов, возникшей yse после появления мутации delF508. Более того, учитывая явное преобладание повтора 6 , можно предполагать, что именно в хромосоме с этим повтором изначально возникла мутация delFS08 и лишь на следующем этапе мутационные изменения затронули другие области микросателлитных динуклеотидных повторов. Оба эти гаплотипа ( аллель 6—de 1F508 и аллель 2-delF508) в дальнейшем закрепились в популяции. Это предполояение требует дальнейшей проверки в связи с тем,что, в отличие от русской популяции, оба повтора (2 и В) в мутантных хромосомах с delF508 в испанской популяции представлены примерно одинаково часто.причем повтор 2 даже несколько превалирует (512 и 42% соответственно) (Morral et al..1991). Для решения вопроса с каким из этих двух динуклеотидных повторов 8-ого интрона гена ТРБМ первично была сцеплена мутация delF508 целесообразно-исследовать гаплотипы больных MB в тех странах, где частота мутации de1F508 особенно велика ( напоимер: Дания,Великобритания).

Идентификация мутаций в гене ТРБМ.

В работе предпринята попытка направленного поиска 5 различных мутаций - G551D, Q542X, G553X , R334H, R347P гена ТРБМ, некоторые из которых по литературным данным встречаются почти в 5'/. случаев всех мутантных хромосом при MB . Всего проанализировано ИЗ хромосом.не несущих delF508. Во всех случаях исследовали ДНК больных MB. Исследование проводилось с помощью ПЦР. Результаты данной серии исследований суммированы в табл.6. Как следует из приведенных данных,в изученных нами хромосомах выявлено 4 случая мутации: в двух -мутация G542X и по одному -G551D и R334H; Мутаций R347P и R553X в исследованных нами, образцах не найдено.Существенно отметить,что во всех 4-х случаях найденные мутации находились в сцеплении с 6КП интрона 6В гена ТРБМ. Таким образом, частота этих му-

таций у лиц русской национальности больных МВ достаточно низкая.Эти результаты хорошо согласуются с ранее полученными данными в лаборатории пренатальной дианостики ИАГ им. Отта (Иваненко, 1992) на другой выборке больных с МВ. Все эти данные доказывают специфичность распространенности мутаций гена ТРБМ в различных популяциях.Более того, учитывая высокую частоту заболевания МВ в России и других странах СНГ, оправдан целенаправленный поиск новых мажорных мутаций гена ТРБМ в популяциях на территории Таблица 5.

Частоты аллелей обусловленных различиями в числе СА/ЬТ ди-нуклеотидных повторов в 8-ом интроне гена ТРБМ в мутантмнх и нормальных хромосомах.

аллели 8-го интрона и число копий

хромосомы

нормальные

мутантные

с (1е1 Р508

без бе 1 Р508

У.

У.

У.

Н24КП) 2(23КП) 3(22КП 1 4(21КП) 5( !8КП) ЧС 1?КП) ?(16КП) 8С15КП)

1

7

3 О О

14

33

4

64

1,6 10,9 4.6 0.0 0.0 21.9 54,7 6,3

0 И 0 о о 18 о о

29

О.'О 38,0 0,0 0,0 0,0 62.0 0.0 0.0

2 4 1 1

0 13 25

1

47

4,3

8.5 2.1 2,! 0.0 27,7 53,2 2.1

N

N

N

всего

Обозначение: И-число хромосом, бывшего СССР.

Анализ информативности семей высокого риска и пренатальная диагностика МВ.

Этот анализ позволяет выявить в семьях высокого риска МВ му-тантную хромосому и проследить ее наследование в поколениях. В работе изучена информативное1Ь 54 полных самой!в таких семьях

присуствувт оба родители и по крайней мере один ребенок) с высоким риском МВ и перспективных для последующей пренатальной диагностики.Полученные результаты приведены в табл.?. Учитывая высокую частоту гетерозигот по ТТП 6В интрона гена ТРЕМ в семьях с МВ, анализ информативности был начат с изучений именно этого молекулярного маркера.Действительно, используя данный подход, информативность была установлена у 37 из 54 семей,причем половина из них оказалась полностью информативными. Анализ мутации йе1Р508 позволил выявить информативность примерно у половины всех изучен-, ных семей (28 из 54), причем только 13 из них были полностью информативны по данному признаку.Еще в 4-х случаях семьи оказались частично информативными по 3-м другим мутациям -6542Х,е55Ю и 1Ш4И.Суммирование полученных результатов, а точнее сочетанный мо-Таблица 6.

Частоты мутаций гена ТРБМ среди мутантных хромосом по ИЬ

с отсутствием с!е1Р508.

мутации хромосомы

Всего с мутацией частота Ш

6 5510 ИЗ 1 0,88

С 542Х 104 2 1,92

Я 334Н 109 1 0,91

И347Р 109 0 0,00

И353Х ИЗ 0 0,00'

лекулярный анализ по всем изученным маркерам показал, что только 8 из 54 семей с МВ являются неинформативными для пренатальной диагностики молекулярными методами, тогда как 24 семьи полностью информативны и 22 семьи-частично информативны. Таким образом, разработанный нами алгоритм молекулярного исследования семей,иу»-. дающихся в пренатальной диагностике МВ,позволяет обнаружить информативность в Ь5~/. случаев. Естественно, что при наличии в семье больного ребенка показатель информативности может быть существенно увеличен и уже сейчас полную информативность в таких семьях.

можно довести д?яе до 100%. В зтом плане особенно перспективным представляется включение в схему обследования высокополиморфних динуклеотидных СЙ/БТ повторов 8-го интрона (ожидаемая информативность около 802). Согласно схеме,разработанной в Лаборатории пре-натальной диагностики ИйГ (Баранов и др.1991) и дополненной данными молекулярного анализа (Иващенко, 1992 ), исследование' информативности семей для пренатальной диагностики МВ следует начинать с анализа больного, либо обоих родителей на ногительство мутации йе!Р508.Б результате проведенной работы становится очевид-Таблица.7

Информативность исследованных семей высокого риска. ,

исследуемые молекулярные маркеры гена ТРЕМ число полных семей

полностью информ. частично информ. не информ. всего

N У. N У. и У.

ТТП б интрона 18 33,3 19 35,2 17 31,5 54

¿И Р508 13 24,1 15 27,8 26 48,2 54

Б 542Х 0 0,0 2 3.7 52 96,3 54

й 55Ю 0 0.0 1 1,9 53 98.2 54

Я 334Н 0 0.0 1 1.3 53 98,2 54

при сочитании всех пяти молекулярных маркеров 24 44.4 22 40.7 8 14.8 54

ным. что обследование семей с высоким риском следует начинать с анализа ТТЛ интрона 6В и дополнять её тестированием мажорных нутаций. лреаде всего йе1Р508. Кодифицированный вариант схему молекулярной диагностики МВ приведен на рис.2. Согласно разработанной схеме, нами проведена пренаталъная диагностика КС в 45 семьях

Рис.2. Принципиальная стратегия пренатальной диагностики МВ.

СЕМЬИ ВЫСОКОГО РИСКА.

РОДИТЕЛИ И ' БОЛЬНОЙ

ТОЛЬКО РОДИТЕЛИ (БОЛЬНОЙ УШЕ ПОГИБ)

АНАЛИЗ МАТЕРИАЛА (ПЯТНА КРОВИ ИЛИ ДНК) НА ТТП ИНТРОНй 6В.ГЕНА ТРБМ

I

МУТАЦИИ у НЕ ОБНйРУЗГЕНЫ

ь

ПДРФ АНАЛИЗ ОБРАЗЦОВ ДНК

АНАЛИЗ МАТЕРИАЛА НА МАЮРНЫЕ МУТАЦИИ ГЕНА ТРБМ

* 1

. НУТАЦИИ У

0БНАРУ8ЕНЫ

у МУТАЦИИ НЕ 0БНАРУ8ЕЙЙ

СЕМЬЯ ПОЛНОСТЬЮ ИНФОРМАТИВНА

пд

1-й ТРИМЕСТР

СЕМЬЯ ЧАСТИЧНО ИНФОРМАТИВНА

I

ПД

1-й ТРИМЕСТР

МУТАЦИЯ НАЙДЕНА У ПЛОДА

АНАЛИЗ* АНАЛИЗ V

ФЕРМЕНТОВ А2 ФЕРМЕНТОВ А2 2-й ТРИМЕСТР 2-И ТРИМЕСТР группы высокого риска. В 22 случаях диагностика проводилась, в 1-м, а в 14 во 2-м триместрах беременности. В результате молекулярного анализа плодного материала, полученного с помощью хорион-биопсии, плацентоцентеза или амниоцентеза, в 27 случаях диагноз НВ у плода был отвергнут и женщинам рекомендалось продолжать беременность.В качестве иллюстрации приведем следующий пример: Родословная и результаты ДНК анализа семьи К. .проходившей пр'ена-тальную диагностику в 1-м триместре беременности, представлены на

рис.3.

Вместе с тем, у 11 плодов с вероятностью близкой к 100Х установлено наличие мутантных аллелей гена ТРБМ в гомозигоном состоянии. Эти беременности по желании женщин были прерваны.Б 8 случаях частично информативных семей, как показал молекулярный анализ, плод по-лучил одну мутантнуи хромосому по исследуемым молекулярным' маркерам, тогда как мутантную хромосому другого родителя в связи с отсутствием в семье больного ребенка.маркировать не удалось. Следовательно вероятность НВ в этих случаях составляла 50%. Seu-линам было рекомендовано провести дополнительное биохимическое исследование содерЕания ферментов микроворсинок кишечника,плода Рис .3. Пренатальная.диагностика в семье К.

+

6КП

+

7КП

1

ф-

+

6КП

А

6КП

+

6КП

-а

А

6КП

+

7КП

А

6КП

delF508 ТТП

J

Обозначение: +(отсутсвует с1еШ08) ; А(присутствует йе!ГЬ08) АВ (Баранов и др.1991). В 3-х случаях диагноз МВ у плода был подтвержден, в 5 -отвергнут. Во всех случаях прерывания беременности р связи с НВ у плода диагноз верифицировали п^токорсллоги-ческими и биохимическими методами (Горбунова и др.1389) Таким образом, иэ 46 случаев пренагальной диагностики МБ диагноз • МВ бил

S9 по gone

•J; ,V.

подтвержден и 14. Следовательно, полученные результаты находятся в хорошем соответствии с аутосоинорецессивным типом наследования этого заболевания и согласуются с ранее опубликованными обобщенными данными (Вагапоу е1 а1.,1992) об отсутствии презиготической и постзиготической селекции гамет или зародышей человека, несущих мутацию гена ТРБМ.

В И В О Д И

1.Проанализирована частота тандемных тетрамерных повторов (ТТП) 6В интрона гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидо-за (ТРИ) в 4-х различных популяциях СНГ. Обнаружено сходство в соотношении частот аллелей.обусловленных 7 копийкыи (7КП) и 6 ко-пкйным (6КП) повторами в 6В интроне гена ТРБМ, в русской,азербайджанской и узбекской популяциях и достоверное отличие частот этих аллелей ме^ду азербайджанской и грузинской I5,72;р<0,05) и между узбекской и грузинской (^=4,28:р<0,05) популяциями.

2.Обнаружен ранее неизвестный 8 (окта) копийный повтор 6В интрона гена ТРБМ в двух татарских семьях.

3.Остановлено, что 6КП 6В интрона гена ТРБМ у больных МВ русской популяции находится в полном сцеплении с наиболее частой мутацией йеШОв в этом же гене и обнаруживает неравновесие по сцеплению с некоторыми другими, в т.ч. и пока неидентифицированными мутациями, приводящими к МВ.

4.Выявлены достоверные меапопуляционные различия частот некоторых аллелей,обусловленных разным количеством динуклеотидных тандемных СА/ЕТ повторов в 8-ом интроне гена ТРБМ у лиц русской, грузинской и узбекской национальностей.

5. В семьях с МВ найд-но семь различных аллелей,обусловленных разным количеством динуклеотидных тандемных СЙ/6Т повторов в 8-ом интроне гена ТРБМ. Их частота существенно отличается в нормальных и мутантных хромосомах: причем, мутация (1е1Р508 гена ТРБМ встречается исключительно в компаунде с повторами 2С23КП) и 6С17КП) этого интрона.

6. Мутации £5510, С542Х и Я334Н у больных с муковисцидозом Санкт -Петербур-а и Северо-западного региона России зарегистрированы в единичных случаях : мутации К347Р и К553Х в исследованной выборке больных МВ вообще не выявлены.

?.Исследование ТТП 6В интрона гена ТРБМ в сочетании, с идентификацией наиболее частой в русской популяции мутации <1е1Р508 этого гена существенно повывает информативность семей высокого риска по НВ. что позволяет проводить в зтих семьях пренатальнуд диагностику

- 19 -

у«е на ранних сроках беременности.

Список основных работ опубликованных по теме диссертации 1. йгбангла К..Осиновская Н.С..Иваненко Т.3..Баранов B.C.. Моле-нулярно-генетический анализ тандемных повторов в интроне 6В гена ТМРБ в некоторых популяциях и у больных муковисцидозом //Генетика. -1992.-N.il.-С.145-149.

2. Иваненко Т.З.. Агбангла К., Баранов B.C., Анализ внугригешшх полиморфизмов и мутации гена транснембранного регуляторного белка муковисцидоза // ВИНИТИ.-1993.-N.3.- С.76.

3. Баранов В..Горбунова В.,Иваненко Т..Осиновская Н.,Нащеева Т., Агбангла К.,Вахарловский В..Лебедев В., Молекулярный анализ,гена и преиатальиая диагностика «уковисцидоза // Пульмонология ,-1992,-N. .4.-С.842,

4. Павлов Г,В.,Вилков В.Н..Осиновская Н.С,.Агбангла К,, Клинико-генвтические аспекты оптимизации дифференцированного лечения больных муковисцидозом //Пульмонология. -1992.-К,4.-С.866.

5. Т. Ivaschenko, N. Oslnovaskaya, М. Dean*, С, Asbangla,Mutation Identification S RFLP analysis of CFTR gene In Russia //А». Ни», fienet.- 1991.- Suppl.Uol.49.- P.243.