Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический анализ показателей перекисного окисления липидов мембран эритроцитов при муковисцидозе

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический анализ показателей перекисного окисления липидов мембран эритроцитов при муковисцидозе"

КИЕВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ИНСТИТУТ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ. ВРАЧЕЙ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ .

На правах рукописи

БАРБОВА Наталья Ивановна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИГЩОВ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ МУКОШСЦИДОЗЕ

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученей степени кандидата медицинских наук

Киев-1991

Работа выполнена в Центральном ордена Ленина институте усовершенствования врачей Министерства здравоохранения СССР.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор С.И.Козлова доктор медицинских наук Н.И.Капранов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор О.И.Ласица доктор биологических наук Н.Ф.Стародуб

Ведущая организация - Одесский медицинский институт.

13 часов на заседании специализированного Совета (Д.074.44.04) при Киевском государственном институте усовершенствования врачей Министерства здравоохранения Украины (252112, г.Киев, ул-. Дорогожицкая, 9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ¡¿невского государственного института усовершенствования врачей.

Автореферат разослан " 1991 года.

Защита состоится

года в

Ученым секретарь специализированного Совета

Горовенко Н.Г.

Актуальность проблемы. Клинико-генетическое изучение нас^ед-' ственшх болезней человека имеет зажсе значение в связи с их тя~ : иелым'течением, отсутствием в большинстве случаев достаточно эффективного лечения и высокой степенью риска их наследования в семьях.

Муксвксцддсз - одно из наиболее распространенных кенделирув-• щих заболеваний, приводящее к инвалидизации и значительному сокращена продолжительности жизни. Эта патология занимгет особо« место среди наследственных болезней и является одной из основных проблем в области клинической генетики (Бочков h.fi.,Гинтер а.К., 1981; Рачинский C.B.,Капранов Н. И., 1985; Капранов Н.И.Д9Ы; sait h Ch., 1976; Еошшепз J.M. et al.', 1989 И др.).

Муковисцвдоз - универсальная зкзокрннопатия с аутосомно-ре-цессивным типом наследования. По данным различных авторов частота муковасцидоза в Ёвропз колеблется от 1:1600 до 1:2500 новорожденных (Вельтищев ïi.iù. .Каганов С.К)./Галь В,1966; РачинскиД C.B. и соавт.,1968; Bernard Е. ,1964 и др.). Частота гетерозиготного не— сительства гена муковисцидоза составляет от 2 до 10% (Гедиольд П., йгайнбикер Ф.' и соавт., 1978; Hennequet А. ,1973; Hussa! et al., 1982), т.е. в среднем каждый 20-й житель йзропы является гетерозиготным носителем патологического гена.

Интерес к проблемам, связанным с исследованием муповисцидоза, значительно возрос в связи с открытием в 1989 году гена иуко-висцвдоза, локализованного на длинном плече 7-й хромосомы. Геи, содержащий около 250 тыс»пар оснований ДНК, кодирует белок, имеющий сродство к клеточной мекбране, внедренный в ее липидный би-слой. Идентифицированная Ьар-Ches Tail Collins i\ и сотр.

(I939Î мутация Р 5С8, изменяет ваяиув область з прогнозируемом полилопгкдs, регулирущуп связывание АТЙ с белком муковисцидоза, в результате таг о нарушается транспорт хлоридов чвк-^.у мембрану.

В связи с изложенным, несомненна. ахггуаяып-м :. : ..следований, проводимых на уровне клеточных мембран у больных иук.зпецвдозом.

Несмотря на значительнее успехи в области молекулярной генетики муховисцидоза, многие вопросы клинической генетиси заболевания до настоящего времени не реаекы: затруднена диагностика стертых и атипичных форгл, нет достоверных тестов для дн.мюстики ге-терозкгстного носительства, лечга'нз муковисцидоза -прелному остается симптоматическим, не уг"-нены подходы :с ог-лдел<=нип осо-

бенностей течения и прогноза заболевания.

В этой связи изучение новых патогенетических маркеров заболевания и нссительства ге^и, прнб.г кенных к его первичному дефекту, таких как фенотип клеточных мембран, и поиск дополнительных критериев для более точной диагностики муковксцидоза, является перспективным не только с точки зрения профилактики и диагностики, но и возможных новых методов патогенетически обоснованного лечения больных.

Цель и задачи исследования. Целью настояцего исследования является изучение состояния клеточных мембран по показателям пе-рекисного окисления мембранных фосфолипидов к генетический анализ этлх показателей при муковпсцидозе.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести клинкко-гекеалогический анализ в выборке се .ей о муковисцидозоы.

2. Исследовать перекисное окисление лппидов мембран эритроцитов у сольных муковисцидозом и их родителей по следующим показателям: гемолиз до и после инкубации, содержание малонового ди-альдегида до и после инкубации, его форм, интенсивность его _ дальнейшей деградации, индекс деформируемости эритроцитов, антиокислительная активность.

2. Изучить корреляции показателей перекисного окисления ли-пидов с особенностями клинического течения заболевания.

4. Выявить малые аномалии развития у больных муковисцидозом и изучить их спектр.

Научная новизна. Впервые в рамках одного исследования проведен комплексный анализ состояния клеточных мембран по показателям порскисного окисления липидоэ мембран эритроцитов в сопоставлении с выраженность» клинических си-ггегоАЯл с использованием клинических, генетических и 6яохи;йа:чг.ских методов исследования. Это позволило взвить резоргм едор;вЬя, определить тдкесть и прогнозировать исход заболевания для применения индивидуального подхода к лечению больного.

Впервые установлен ряд генетических закономерностей, характеризующих состояние клеточных мембран при ыуковисцвдозе: выделены основные типы карушгняй перекиснсго окисления лкпидов (ПОЛ) меыорач, выступайте а качества диагностически и прогнсстичес:«« критериев для больных муковисцидозом; оценены фенстяпичёские кор-

реляции и наследуемость показателей ГиЛ у пробандов н их родителей; оценен вклад наследственных факторов з феноткпичеекую изменчивость при муковисцидозе.

Полученные данные позволили оценить функциональные изменения липидов клеточных мембран при муковисцидозе и уточнить некоторое патогенетические механизмы связей мекду показателями ПОЛ и клиническим течением муковисцидоза.

Практическая ценность работы.Результаты работы могут быть использованы в качестве практических рекомендаций для врачей, осуществляющих первичный контакт с больными муковисцидсзом.Получены новые дополнительные фенотипические и биохимические критерии для более точной диагностики и подходов к лечении муковисцидоза, включая применение мембраностабилизирующих препаратов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Апробация работы. Материалы исследования доложены на П Всесоюзном съезде медицинских генетиков (5 декабря 1390 года) в г. Амма-Ате, на клинической конференции кафедры медицинской генетики ЦОЛИУ врачей с участием сотрудников Института педиатрии Хй1 СССР (30 августа 1991 года), на заседании специализированного Совета по генетике Д 074.44.04 в г.Киеве (30 сентября 1991 года).

Объем и структура исследования. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и иснользованных методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Текст излажен на 142 страницах машинописного текста, содержит 22 таблица 9 рисунков. Библиографический указатель включает 92 работы отечественных авторов и 109 работ иностранных авторов.

СиДЕВХАКШЗ РАЕ01Ы

Материал и методы исследования. Материалом для анализа послужили 60 семей, выявленных через больных муковисцидозом детей. Проведено клиническое наблпдение за 72 пробандами (43 мальчиками и 29 девочками) в возрасте от 5 месяцев до 16 лет на базе пульмонологической клиники ШИ педиатрии АЛН СССР за пзрисд с •февраля 1969 по февраль 1931 года и собрана генеалогическая информация о 116 их родственниках I степени родства (107 родителях

h 10 сибсаг.). Сибсы больных муковисцидозомЛО человек в возрасте от 4,5 до 19 лет (4 мальчика и 6 девочек),были фенотишчески здоровы.

Для решения поставленных задач был применен комплексный кли-аико-генетическкй подход к исследованию муковисцидоза, включающий детальное изучение клинических и биохимических проявлений заболевания с использованием методов генетического анализа.

Клинико-генеалогический метод включал клиническое обследование, составление и анализ родословных. Диагноз муковисцидоза у наблюдавшихся больных базировался на данных клинико-рентгено-логическэго, функционального обследования и во всех случаях подтверждался высоким содержанием электролитов в поте. Содержание электролитов в поте у детей определялось по классической методике Гибсона и Кука, но сбор пота осуществлялся без применения гш-локарпинового электрофореза. Для определения концентрации хлора в поте пользовались простым титрометрическим методом itopo, а концентрацию ионоз натрия определяли на пламенном фотометре.

У всех больных при осмотре обращалось внимание на наличие микроаномалий фенотипа - малых аномалий развития (MAP), ivbi исходили из того, что MAP - это морфологические изменения, не являющиеся косметическими дефектами, наличие которых не влияет на • функцию соответствующих органов - (Marden ,1964). Наличие aîaF оценивалось по разработанной схемб. Б качестве контроля для интегральной сценки полученных данных использовали результаты О.М.Гофмана (1387), полученные при изучении среднепопуляционных частот (ДаР у здоровых детей и взрослых.

На каждого обследованного заполнялись разработанные нами кар? ты фенопипа, куда вписывались данные объективного исследования, анамнестические сведения, результаты лабораторных и инструментальных методов исследования, родословная и результаты специальных биохимических исследований.

Биохимические исследования проводились в лаборатории клинической биохимии (руководитель - проф.М.И.Баканов) НИИ педиатрии А/,M СССР с помощью ведущего научного сотрудника докт. биол.наук. В.В.Банковой.

В данной работе использованы новые методы оценки активности uù,'l (ь.й.Банкова и сотр. .1986,1988). Сущность методов оаклачается в последовательном определении в одной пробе аритроцитой степени гемолиза и содержания в них 4ДА до и после инкубации проб с вкчис-

лением соотношения малоновый диалъдегид/перекисшй гегдолуэ (¡.1ДА/ПГ), определения связанной формы »¡Да, определении пнтепсиз-ности деградации ¡«ДА.

Для определения МДЛ кспользозали реакцию с тиобарбитуровоп кислотой с последующим епектрс^отометрированив!.! при дяинах ьола 532 и 600 км (Gutteridge J .И. и ссаЕг. ,1963; Rico-Evana С, с сслит. , •1985). Для анализа брали 5 мкл уплотненной взвеси эритроцитов (или 400 мкч 5% Еззеси эритроцитов), применяя ыпкрскгьету нч 500 мкл. ипреденяли такке обпуга антиокпслительнуа активность (¡'.СА) по количеству образовавшегося иода из KI при действии перекис: водорода за I минуту. В эритроцита}-. определял»: дгфир.гируе-

мости, используя мембранный фильтр Sinpoi- с диаметром пор u, 23 am. Вое показатели определяли в 5;* взрееи эритроцитов. Дзкп'Л »:стод требует всего 100 мкл отмытых эритроцитов или 200-250 м:;л периферической крови. Непременным ус лопнем являлась работа со сгекк-ми, только что отмытыми эритроцитами.

Все исследования процессов ГшЛ у больных мукояисцидозом проводились в период ьеустсйчиеой клинической ремиссии или на этапе начавшегося обострения заболевания до назначения больному антибактериальной терапии, чтобы исключить ее ялияние па результата исследования.

Контролем служили показатели ПОЛ, полученные В.Е.Етл:созой и сотр. (1969) при изучении возрастных изменений системы Ьил-ЛСл у 60 детей разного возраста и 30 взрослых.

Оценка типов активности 110л у обследованных пробандос, их родителей и сибсов проводилась по клаокфнкнцми Ь.В.Банковой (IS90), в которой выделяется 7 основных типов фуькцио: адьного состояния систеш ПиЛ-АСА. Из них 3 типа встречаются у здэропчх людей, а 4 - при патологии. Нормально функционирующей мембране в спокойном сосиянии соответствует первый, в этом случае процессы ПОЛ, А0А и дальнейшего метаболизма ¡.1ДА сбалы,-.'кровени. второй тип характеризуется повышенной интенсивностью in л. После длительного стресса, в сост янии после напряжения наблюдаетея третий тип функционального состояния систем:.! ПОЛ-пОл. при на рушении процессов адаптации происходит резкое увелителип скорости UW1, сопровождающееся такими изменениями величин параметров которые можно считать н^руяекигали процессов ПОЛ - четгерт-г? тип из-

о.

кенек;;й ииЛ. Такал ситуация может привести либо к истощению субстрата ПОЛ, либо к накоплению ЛДА з клетке Г5 и б типы изменений ¡¡■и/), Последнче 2 типа от:; еятся к типам угнетения перекисного окисления липидов. При пятом типе накапливается продукт ГЮЛ -малоновый диальдегид, который тормозит ПОЛ по принципу отрицательной обратной связи, шестой тип такхе характеризуется угнетением ■ пил, но в результате истощения субстрата. Последним, седьмым типом изменений системы ПОЛ-АОА считают ее разбалансировку, которая характеризуется потерей многих связей системы, появлением наряду с признаками,свидетельствующими о повышении ПОЛ, признаков, указывающих на его снижение. Такое состояние возникает у тяжелых больных.

Сегрегационный анализ проводился по простому методу Вайнбер-га с целью подтверждения аутосомно-рецессивного типа наследования в исследуемой выборке семей с муковисцидозом.

Генетический анализ изучаемых количественных признаков, характеризующих перекиское окисление липццов эритроцитэрных мембран, проводился путем вычисления коэффициента наследуемости и определения фототипических корреляций между показателями механического гемолиза (¿Л"1), концентрации связанного-ЗДА (ЛЩАСВЯЗ>), интенсивности деградации ЛДА ( Д >ИДА), соотношения иЩА/ПГ, типов активности пил родителей и пробандов. При этом коэффициенты корреляции рассчитывались как межклассовые для следующих пар: среднеродитель-ская - ребенок, мама - ребенок, папа - ребенок.

Для обработки материала использовались стандартные статистические методы: определение средних величин, стандартных отклонений, оценка достоверности с помощью критериев X" и Стыодента, корреляционный анализ.

Характеристика клинического полиморфизма муковмецидоза у пробачдез. Ёыраиеннисть клинических проявлений заболевания у 72 прсбалдов зарьировала в широких пределах: от среднетккелых преимущественно кишечных форм (у 5 детей) до крайне тяжелых смешанных (у 64 больных) с частыми обострениями, Еыраженным кишечным синдромом и глубоким поражением бронхолегочной системы.

Начальные проявления муковисцидоза у 14% больных отмечались с рождения, у 5Ь/о - в возрасте до 3 месяцев, у Ш/а больных ~ в ¿озрасте до б месяцев, у 93% - в возрасте до I года, у 97% пробан-дсв - и возрасте до 2 лет. У половины детей муковиецздоз .начался ки^ечього синдрома, у 47% - с респираторного, у - одновремен-

но кишечными и респираторными нарушениями.

У большинства обследованных болыдх (64 пробандь.) С^я установлена легочно-кгснечная (смешанная) ф:>-;:.<а муковлсцлдоги у -преимущественно килечная к у 3 - легочная фора.

Клиническое состояние болькач ..ь. :т..'.еат воя.т::я -наймов с».-.о оценено по шкале ¿вахмана в модификации С.З.Рачк-.с^сго " п.Капранова (1565), что показано б табл.1.

Т&бл. I

Распределение больных мукогксцидозогл по шкале швахмана

№ * гг, группы- Тяжесть состояния : абс.число больных Л'

I гр. Состояние тяжелое (40 баллов и менее) 19 26,:?

Г1 гр. Состояние средней тяжести (41-55 баллов) 35 46,7

Ш гр. Состояние удовлетворительное (56-70 баллов) 18 '¿5,0

Выраженность клинических симптомов зависела от тяч.ест/ состояния больного. Наиболее частыми были жирный стул (почти у 96% больных), характерный для муковисцидоза мучительный малопродуктивный кашель и хронический гайморит (у 93>о), недостаточность поджелудочной железы и эмфизема легких (у 90%); у Ьч% пробандов обнаруживалась деформация ногтей в виде "часовых стекол", йиле-ввдная деформация грудины наблюдалась у 21S& больных детей, признаки хронического легочного сердца - у 17%, выпадение прямой кишки -у 11% больных.

Основными клиническими симптомами чуковисцидоза у пробандов были респираторный и кишечный, тогда как время, выраженность и характер их проявления варьировали у разных больных. У 91, пробандов отмёчались изменения кислотно-основного состояния организма, у 70,9% больных наблюдался ацидоз, преимущественно респираторный; у 6,9% больных - алкалоз. Признаки Гкперкашмк отмечались у 69,4% детей.

ь.

Р£ЗУЖГЛТи И ОЕСУЩгШИ Г>-ч';т",'-г;с.!;к'-1 чна'1из муковисцидоза. Клинико-генеэлогическое учучен.:е ее ■л".: с мукчвис „дозом. "обрака генеалогическая инфор-

о СО ссмьях, в которых был 61 больной муковисцидозом. В ■10 семьях были еде здоровые дети. В 18 семьях было 20 умерших предположительно больных муковисцидозом детей (8 девочек и 12 мальчиков), а двух семьях от муковисцидос-а умерли по 2 ребенка. Большинство детей умерли в возрасте до 6 месяцев. У 6 умерших диагноз муковисцидоза подтверждался паталогоанатомически, смерть остальных детей наступила в возрасте до I года ст пневмонии, вирусной диареи и кишечной непроходимости. В Ь семьях отмечались случ;. и 1.;ертворождений.

'ч/бций вид родословных свидетельствует о так называемом "горизонтальном" типе передачи оаболеьалил. Мужчины и женщины поражаются примерно с одинаковой частотой. Б результате сегрегационного анализа, проведенного по простому методу Вайнберга, получили сегрегационную чистоту 0,2727. Зта величина статистически недостоверно отличается от расцепления- при рецессивном типе наследования (0,25), поэтому в нааей выборке больных подтвсждается . ре:;":ссивная модель наследования муковисцидоза.

Ач-'-цг/л генетических связей ме:кду показателя?.»! перекисного окис пени:; липидов иечбран эритроцитов, Полученные данные о ПОЛ клеточных мембран пробандол и их родителей были проанализированы по показателям наследуемости для оценки вклада генетических факторов в их происхождение.

/з Есей совокупности изучаемых признаков для оценки фено-типически'. корреляций между родителями и потомками и показателя наследуемости нами выбраны следующие: механический гемолиз, концентрация связанного .ИДл, интенсивность деградации «4ДА, соотношение ДЦ^/ц'. У пробакдов установлены достоверные отличия этих параметров от групп здоровых и больных детей с другой патологией.

Коэффициенты фенетип/.ческой корреляции и оценка наследуемости количественных признаков, характеризующих ЬОЛ эритроцитов больных муковисцидозом и их родителей, представлены в табл.2.

Как видно из табл.2 статистически значимые оценки^насле-дуемости были установлены для 84%). 4ДАеВяз. = ^= 66%).

деградации 0$* = 0£?>), соотношения ДДа/ь;'(Д = 100,4.),, типа

Табл.л

Коэффициенты корреляции мелду показателями ПОЛ пробондов и их родителей и оценка

наследуемости {$•) этих показателе»!

:_'Гкг. пары -родитель - потомок "___

Признак : екая'-^ребенок" |аача ~ Ребзн0к ! ~

: Коэффициент: ¡Коэффициент: :Коэффиц. :/о __: корреляции :/7 ,%:корреляции ,% ^с.рро-гкц.

100 0,29+0.14* 5о

64 0,52^0,12х 100 х

66 0,24+0,14 48 100 0,32+0,14" 04

40 0,72+0,10Х 100

Примечание, х - результат статистически достоверен (р<0,05).

активности ПОЛ 100%) (для пар: среднеродительская - ребенок).

Не обнаружено значимого влияния средовых факторов на фенотк-пическую корреляцию изученных признаков.

Оценка состояния клеточных мембран при .цуковисьчисзо по показателям переписного окисления лигидов

Для сопоставления показателей мембранного метаболизма (ГОЛОД) с клиническими проявлениями муковиоц»1доза обследованные больные были разделены на 5 групп в зависимости от типа активности ПОЛ. В I группу вошли 13 больные со 2 и 3 топами нарушений НиЛ (средняя сценка клинического состояния по шкале Швах^ана 65,9+3,1), во И группу - 13 бальных с 4 типом функционального состояния системы ПОЛ-АОА и средней оценкой клгличсского состояния 53,7^3,7 баллов; в Ш группу - 15 больных с 6 '^.пом, характеризующим угкетеши

Механический х х

гемолиз 0,42+0,11 64 С,52Л,П

Связанный да 0,43+0,12х 86 0,32+0,12х

Дотация дяд/Иг X 0,33+0,12 0,54^0, ЦХ 66 100 0,33+0,12Х 0,51+0,11*

Тип активное' ти ПОЛ "о, 70+0,09Х 100 0,20+0,13

iluji, л оценкой 55,0+2,4 балла; в 1У группу вошли 17 больных с переходными типами изменений i.Gji и средней оценкой клинического состояния 51,2+3,2; в У группу- - ж4 больных с 7 типом нарушений liu.'i и средней оценкой по шкале швахмана 43,7+3,2 балла. Состав групп был однородным не только по количественному, но и по качественному составу. Так, во всех группах преобладали мальчики, оснсзная масса детей в каждой группе была в возрасте старше 3-х лет. Это облегчило проведение сравнительного анализа.

У больных всех групп за исключением первой было достоверно повышено содержание МДА (см. табл.3). Установлено, что патологические состояния нередко сопровождаются накоплением ДЦА в организме (Казана 6.И.,19ьЗ, -Jain S.E., I9b4,I387 и др.). Поранение клеточных мембран при муковисцидозе - результат длительного тяжело прэтекахмегс патологического процесса. Длительное повышение содержания аЩл приводит к "засорении" им клетки и угнетению активности Пил. Нарушается способность биологического материала клетки связывать МДА (у больны:: П-1У групп).

Интерес представляет изучение динамики изменений показателей гемолиза эритроцитов и содержания у больных муковисцидозом- в заьиоилости от типа нарушений ПОЛ. В норме наблюдается соответствие между приростом гемолиза и ¡Щк за время инкубации, для нормал! ного функционирования системы П0Л-А0А необходима положительная корреляция между содержанием »!ДА в рритрсцитах и степенью кх гемолиза после инкубации Ш.В.Банкова, 1990). Я I и П группах положительная корреляция сохраняется, в ы-1У группах она нарушается. Это гоьорит о глубоких устойчивых нарушениях ПОЛ, о тякелом тсчекли заболевания и vie благоприятном прогнозе, отрицательный прирост ¿1ДА за время инкубации (в 1У и У группах) свидетельствует об истощении субстрата [Юл - мембранных фосфолииидов и дезорганизации л/.пидкего слоя клеточной мембраны, повышении ее проницаемости, нарушении структуры и функциональной неполноценности. Танк.: образом, при муковисцвдозе отсутствует положительная корреля-цйэнпйя связь мезду содержанием ¡ЛДЛ в эритроцитах и степенью их гемолиза после инкубации, коэффициент корреляции V) равен Г = =-0,06 (р>0,0:>).

Суммируя полученные данные о показателях ПОЛ мембран эритроцитов у больных муковисцидозом и принимая во внимание особенност1 клинического течения заболевания у больных разных групп, однород-

Табл.3

Показатели перекисного окисления липидов эритроцитов у обследованных прсбандов

I ! !

! Тип 1 ^еханичес-Шорекиснкй № . I нарушений ! кий гемо- ! гемолиз,

п/п

1

ПОЛ

I лиз,% I

! ! ! ..Щ/1 после! Интен-!

! ¡'.1ДА до Ш1-! Сзязглнкй! инкубации! сиь- ! 1 кубации, ! ! нмоль [ность !(ггл/пр

|нмоль/Юёэр! I И-Р-

! /0 ! !4ДА,% 1

2,3 ти- ■! (п=13)

4 тип (п=13)

6 тип (п-15)

4. Переходные типы (И-17)

5. 7 тип (п-14)

6. Контр.гр. (споровые дети; п=Ю

!,20+0,16

1,16+0,15

ххх 1,87+0,23

ХУХ

1,81+0,23' хх

2,14+0,41 О,£7+0,13

1,97+0,22 1,30+0,16

1,97+0,23 1,96.10,29

к\) »/СО

2,15^0,3? 1,70^0,05

I,67+0>¿2

ххх 1,64+0,11

ххх

X".

I,Ьу,р,

71,35+4, £8 х

62,22+4,74

xx)

хх

5о, У>+4, ¿7

1,77+0,31

?., 75+0,47

1,5йлР,12

1,87+0,30 1,79+0,25

39,57+ +3,53"

24,30+ |+2,66

х>

41,30+ +3,92

х

40,73+ +4,12"

1.00+0, Со 1.2.^1+1,13

I

I

30,96+ ~ о,

.£Ь~0,16|26,0+ ' +3

0,93+

+р,он

хх 1,94 + 0,4 Г

ххх 1,25 +

+0,06

1,45+

О, До

1,44 н 0,4&~

0,'г5+

.¡римзчанис: х - рг_з;;::чн£

хх - ДССТОЬ^т. х:о: - д ост зз е

паз.

п« ср-л,о ¿- ..учкчй з,лорс:;::.с ,;;леЛ. 1р<0,&с<); со / тьлл и.ч.'.о!):

1ич.и£ го рлоо-г.. Гл.ть.;и (,р< 0,001;.

Риз.1. Характеристика изменений ПОЛ клеточных иембрдч и прогноз изменении смсте:;! ИОД-АОА при муков;:гцц%о

повки^ма активности ¡тзд-дногу. окисления..щщов

4 тип изменений ПОЛ (у больных) средняя оценка по шкале ^вахмана оЗ,'?_тЗ,7

ПОВШШИЕ АКТИВНОСТИ ПОЛ 2,3 типы изменений Пил (у 1С/6 больны>:) средняя оценка по шкале шВ^хмана (35,9+3,1

УГНШШШ АКТИВНОСТИ ПШЖИСНОГО ОКИСЛгЯМ

лшщов___

. РАЗБ/ЛАНСйРиВКд

СКСТКЛЫ ПОЛ-АОА (у 19*)

оценка по шка" }

Швахмана 43,4+^,2 тяжелое соматическое состояние

б тип изменений ПОЛ (21$) средняя оценка по шкале ¿¿шахмана 55,0+2,4

I

Перехода« типы (24%)

^ г- А \с>\

кз чих:

•7 (Ь5,о%) ■7 1ч1,к%)

Смерть (4%)

средняя оценка по шкале и:Еахмана э 1,2+3,2

( I

РАЗРЫХЛЕНИЙ И даОЕГАКИЗАЦКЯ ЛЖЭДНОГО БИСЛОЯ, БСИШАЯ ДХТУПНОСТЬ Ш&ОДйВДОВ К ПЕРЕОКИСМйШ,

РАЗРУтши ¿шерш (деструктивный црицахы).

ГО

них по возрастному и половому составу, но отличающихся по типу изменений системы ПОЛ-ЛОА, можно выдвинуть гипотезу о возможном прогнозе изменений системы ПОЛ-ЛОА (рис.1). Повышение активности ПОЛ (2 и 3 типы изменений), отмечающееся у больных с удовлетворительным клиническим состоянием (оценка по шкале швахмана 65,9^3,1) монет сохраниться, но сопровождаться некоторыми нарушениями (4 тип изменений ПОЛ) или перейти к угнетен™ активности ИОЛ (б тип или переходные типы - 5 и б с элементами разбаланеиро-ванности системы ПОЛ-АСА соответственно у 35,3^ и у '41,2% больных 1У группы).Это влечет за собой длительное угнетение активности ПОЛ, равно кок и повышение ее, оно может призести к разбалансиров-ке систем ГЮЛ-АОА (в накей Еыборке - у 19% больных)' и тяжелому соматическому состоянию с летальным исходом в 4% случаев.

аслученнке результаты свидетельсвуют о необходимости быстрой коррекции нарушений на уроЕне клетки у больных муковисцидозом детей, а высокая корреляция клинических проявлений и биохимических показателей, характеризующих пОЛ, позволяет назначить индивидуальное лечение мембрзноетабилизирующими препаратами ка;к-дсчу обследованному больному, учитывая механизм действия пригоняемых препаратов и исходя из обнаруженных нарушений ПОЛ.

Для проведения сравнительного анализа показателей ПОЛ при муксвисцидозе и других заболеваниях проанализировали данные ряда исследователей, изучавших процессы ПОЛ теми же методами, которые использовались нами, при различных патологических состояниях. (В.В.Банкова, Н.Ф.Прищепова и соавт.,1967; Л.А.й!сстаким,19ЬУ). Ьыявлено достоверное повышение содержания лЩА до и после инкубации при муковисцчдозе по сравнению с хронической пневмонией, содержания МДА и степени гемолиза при муксвисцидозе от соответствующих параметров, полученных при исследовании эритроцитов детей, страдающих хроническими заболеваниями печени, спастической дисплейной, иРЬИ. Это свидетельствует с специфических структурных и функциональных повреждениях плазматических мембран при муковис-цидозе.

Анализ средних величин показателей ПОЛ у пробандоз показал, что у них по сравнения о контрольной группой достоверно повышен механический гемолиз, сч»г.-:ен прирост гемолиза за вре.и :ккублд':и. повышено содержание ДДд до и после инкубации, шгенсиздссгь '.с:-

градации ЭДА и соотношение ¿1Дй.Л1Г, достоверно снижено процентное' содержание МДА, связанного с аминогруппами белков, достоверно понижена антиокислительная активность и индекс деформируемости эритроцитов (ДИ). Это отражено в табл.4.

Высокий механический гемолиз свидетельствует об увеличении вязкости к "ломкости" эритроцитарных мембран при муковисцидозе. Нами установлены низкие цифры прироста гемолиза за время инкубации (24,4чр,22%).Этот показатель отличается от контроля с высокой степенью достоверности (рО.СВД). Прирост гемолиза in vitro служит одним из показателей активности 11ÜJI в организме. Установлено, что прирост гемолиза может быть низким или отсутствовать в 2-х случаях: 1)при задержке в клетке ¿{ДА; 2)при истощении субстрата ПОЛ. И в том и в другом случае в этих клетках снижена интенсивность ПОЛ.

Наиболее четким критерием, указывающим на патологические изменения плазматических мембран, является соотношение ДДА/11Г. У обследованных пробандов отмечалось достоверное повышение этого показателя, что наблюдается при угнетении ПОЛ in viva

При оценке содержания МДА в эритроцитах пробандов учитывалось содержание его форм в клетке. Обнаружено достоверное повышение концентрации МДА до инкубации. Известно, что МДА. в клетка присутствует в двух формах; свободной и связанной с аминогруппами, в частности белков и фосфолипидов. Эта форма близка к шиффовьм основаниям. Одной из причин накопления иЗДА в клетке может быть повышение его связывания клеткой (Банкова Б.В.,1990). У наблюдаемых пробандов наряду с накоплением »({ДА, количество связанного ВДА достоверно ниже, чем в контрольной группе (табл.4). В данном случае снижение процента связанного л1ДА при высоком содержании общего 4ДА указывает не только и не столько на поьышенный синтез йЩА, но и на некоторую несостоятельность клетки, ее рецепторного аппарата.

У Сольных муковисцидозом не выявлено повышение интенсивности деградации ДЦА., по-видимому, это объясняется высоким содержанием „УД в клетке. Обнаруженные нарушения ПОЛ сопровождаются снижением í.'j¡>. и индекса, деформируемости эритроцитов, что свидетельствует об угнетении üuJi у обследованных пробандов.

У сибсов больных муковисцидозом детей интенсивность ПОЛ не

Табл.4

Показатели перекисного окисления липидов эритроцитов больных муковисцидозом (J + м)

Ьаиме- iulexa- {aepe-нование|ничес- ;кисный

' tf Tili n £}_« Г» ПИ».-"»_

!

I Прирост

I 1.ЧЯА П

;кий ге-,гемо- !гемолиза!

1'ЛГ ti^ : % \ 1

ГРУШЩ {молиз, ¡лизД !

I У" ! i

кмоль !

Юьэр.{. f t /3

!МДА Ш [Дегра-

ThmÖ^Ti^J™

!ю6

%

3Ü.

А I АОА ! Д11 МДАЛ1Г !нмоль1? I

1_~ !эрит

iioV

¡за мин. |

дельные муковис-

Ц'ЩОЗОМ . х

дети 1,64+ 2,04ч (п-72) i<)j2b

Контроль-пая группа ^ 0,67- 1,70+ (n=cO) ^pjÖ

X X XX X X X X

24,4+ 1,68+ Ь2,ЗЬ+ 1,95+ 35,36+ 1,40+ 1,21+ 0,211+ ¿£,22 +0,1Ь +4,96 +0,29 ±3,21 +0,14 ¿0,21 +0,019

94,5+ 1,00+ 72,54+ 1,28 + 26,00+ +6,15 +0,05 ¿1,13 +0,16 +3,42

0,75+ 3,33+ 0,292+ +0,11 +0,20 +0,019

Примечание: х - достоверность с контрольной группой (р<0,05);

ОДА 1 - содеш^ание ¿¡ЩА до инкубации; ДДА II - содержание связанной формы ДЦА {а%); ДЦД ш,- содержание ¿^ДА после 10 мин. инкубации.

была изменена. Достоверно значимых отличий полученных парамет- . ров ПОЛ от величин показателей контрольной группы не Быявлено.

У облигатных носителей гена муковисцидоза показатели интенсивности деградации ¡¿Дк и соотношения 4ДА/ПГ достоверно повышены по сравнению с контрольной группой. Остальные параметры, характеризующие ПОЛ эритроцитов, соответствовали контролю. Глубоких устойчивых изменений активности ПОЛ эритроцитов у гетеровиготных носителей гена муковисцидоза с помощью примененного микрометода не выявлено.

При сравнении изменений наиболее валсных показателей ПОД (гемолиза эритроцитов и содержания малснового диальдегида) у го-мо- и гетерозигот, выявлено, что л!Г у больных детей (гомозигот) достоверно выше, чем у здоровых детей той же возрастной группы. Эта же особенность отмечалась и у родителей больных детей (гете-розигот) (рис.2). Прирост гемолиза за время инкубации соответствует интенсивности мембранного метаболизма. Г1Г у гомозигот выше, чем в контрольной группе, а величина прироста гемолиза после инкубации - ниже (это видно по характеру кривой прироста). У гете-розигот ПГ ниже, чем в контрольной группе, а прирост гемолиза за время инкубации также незначителен. Кривые прироста гемолиза после инкубации у гомо- и гетерозигот параллельны, что свидетельств вует об одной и той же тенденции к снижении интенсивности мембранного метаболизма у гомо- и гетерозигот. Снижение прироста га-модиаа за период инкубации позволяет думать об угнетении ПОЛ и значительных структурных нарушениях мембраны.

У гомозигот достоверно повышено содержание МДА в эритроцита^ как до, так и после инкубации, у гетерозигот эти показатели соот^ ветствуьт норме. У больных детей отсутствует прямая связь между приростом гемолиза за период инкубации и приростом ь!ДА, что указывает ;:а тяжесть поражения мембран при этом заболевании и. хронй зацию патологического процесса. У гетерозиготных носителей гена муковисцидоза наблюдается соответствие между МГ и МДА. до инкубации с одной стороны и ПГ и ЛДА после инкубации с другой, кривые прироста гемолиза и иЩ'1 за время инкубации параллельны, что указывает на сбалансированность процессов у родителей больных муко-чисцидозом детей.

Сопоставлял показатели ПОл обследованных больных муковисци-дззоь; с сира.г:еннзстьд клинических проявлений заболевания, уста-

Рис.2. ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЙ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОЛИЗА ЭРРТ7ШШОВ И СОДЕРЖАНИЯ И А. ДО И ПОСТЕ ИНКУБАЦИИ • ' ,

V

нмо,

МГ

ПГ

1ь/1С6 эр.

«НА 1

ВДА Ш

МГ ПГ

МЗА 1

ВДА И

- гомозиготы /больше МВ дога/

-н - гетерознгош /родители больных • иШ детей/

---• ~ контрольная

группа /здоровые дети/

- контрольная груша /здоровы 9 взрослке/

(<ГГ - механический гемолиз /гемплпз до инкубации/

ПГ - перекисний гемолиз /гемолиз после инкубации/

ОДА 1 - МИД до инкубации

1-Щ Ш

ЧГСА П01!ле илкубзцги

1

новлена положительная корреляционная связь между глубиной пов-рездения клеточных мембран и тяжестью клинических проявлений му-ковисцидоза с коэффициентом корреляции Z =0,72+0,06.

Таким образом, при муковисцидозе выявлены достоверные изменения параметров ПОЛ, не наблюдающиеся при других патологических состояниях. Это связано, по-видимому, с тем, что первичный биохимический дефект заболевания проявляется на уровне плазматических мембран. Следствием изменений, которые наблюдались при муковисцидозе (никого прироста гемолиза за время инкубации при повышенном содержании МДА за этот период, сопровождающегося незначительным повышением интенсивности деградации малонового ди°дьдегидь и снижением его связанной с аминогруппами фракции) является накопление 4ЦА в клетке на фоне разбалансированности процессов ПОЛ.

У всех пробандоь обнаружено повышение содержания АЩА в эритроцитах. Известно, что МДА приводит к повышению вязкости мембраны, уменьшению деформационной способности эритроцитов, снижению активности многих мембранных ферментов (Jain З.К. et al., 1963,1934,1986, Pfafferott С. с соавт. ,1982), к повышенны перок-'сидации фосфолихшдов, разрыхлению и дезорганизации липидного би« слоя, что ведет к большей доступности фосфолипидов внутренних слоев к ПОЛ. Это возможно только в условиях глубоко зашедшего патологического процесса, так как в норме и при наличии острых воспалительных заболеваний или состояний, сопровождающихся гипоксией тканей, переокислению доступны лишь фосфолипиды наружного бислоя клеточных мембран (Karleson J., 1978, Кеппа 1.С.,1979, Jain

В.Г. 1984, Gossum а.В.,1968). Подобная картина наблюда-

лась у обследованных больных муковисцедозом. В тан их условия*: клетка ¿л vitro гибнет (об этом свидетельствует высокая степень механического гемолиза), в условиях же.организма больного иуко-висцидозом, клетка продолжает работать в необычном режиме, который сложно объяснить на основе классических механизмов перекисно-го скопления липидоь.

Учитывая вышеизложенное, можно предположить, что функциональнее нарушения, которые* были зафиксированы с помощью примененного микро:,;етода. являются следствием нарушения структуры клеточной мембран из-гаа наличия з ее состоьэ нового компонента, органического соединения. "гист-1Ш1Яю.ца,о" мембрану неадекватно реагировать и:> ус-ог»:?., создаваемые in vitre .

Рис.3. Гипотетическая модель регуляции нарушений ПОЛ при мукозисцидозе

НОРМ А

Л У К О В И С II И Д О 3

ПОДВЕРГАЮТСЯ ПЕР£КЖИСЛУ иКйСЛЛШ)

Фосфолипида наружного липидного слоя мембраны n^^

домен

Мембранные белки дочен^"

¿осфолийиды внутреннего л ищущего слоя мембраны

1

НЕ ДХТУПНЫ XlEPEKKCKüjäy ьКИСЛ^НИА)

Мембрано-

ШТйшЬНИЕ СУБСТРАТА ПЕР^КИСНОГО

ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ_

стабилизи- Уменьшение количества фосфолипидов, рующий способных к переокислению

препарат |

Фосйслипиды наружного липидного слоя // " мембраны

R-домен <____у С FIR

/ ' ~

/ У

НОРМАЛИЗАЦИЯ

ПЕРКлЖНОГС

ОКИОМШ

жадов,

ОПХРВДОВАННОЕ ВЛИЯНИЕ НА С Р Т R

Фосфслипиды внутреннего липидного слоя мембраны

• ДХТУПНЫ ПОЛ

разрыхление фосфолипидного слоя, деструктивные процессы, ведущие к разрушению мембраны

2.0.

Несомненно, что полученные нами результаты, косвенно связаны с первичным биохимическим дефектом заболевания. Так, известно, что Ш?ТЛ является трансл;е.мбранньы, будучи составной частью мембраны в виде хлорцдного канала или иным образом, он изменяет ее. проницаемость и структуру (Ш.огдап -1.Е., Ношшепа <Т.М. еЪ а1.,1939) Установлено наличие в полкпептиде СРГО Б-домена, который представ ляет собой область белково-липидного взаимодействия, отдельные свойства которой отличаются от свойств окружающего этот домен участка мембраны. Ясно, что при этом изменяется свойства липид-ного бислоя, состояние жирнокислотных цепей, упаковка липидных молекул, доступность фосфолипидов к перечислению (Я.Кагава,1985).

Установлено, что вещества, изменяющие структуру липидного бислоя, действуют и на функциональные свойства белков, входящих в состав мембраны (Р.У.Штрауб, Л.Болис,1983). Это свидетельствует о целесообразности дальнейших специальных исследований состояния липидного бислоя клеточных мембран при муковисцидозе с целью поиска и применения в клинике лекарственных средств, нормализующих процессы ПОЛ мембратшх фосфолипидов и опосредованно влияющих '•на первичный биохимический дефект заболевания (рис.3).

Анализ выявленных микроаномалий фенотипа.Учитывая тот факт, что целью нашей работы явился поиск дополнительных диагностических критериев муковисцидоза, кроме фенотипа клеточных мембран нами изучены и другие дополнительные фенотипические признаки. Для этого проведен анализ спектра микроаномалий фенотипа, встречающихся при муковисцидозе.

У 73,6% больных наблюдались микроаномалии фенотипа или малые , аномалии развития (МР), что превышает среднепопуляционную частоту (35,6%) с высокой степенью достоверности (р<0,01). У здоровых детей и'взрослых по данным О.М.Гофмана (1987) не встречается более 3 ¿(АР, у £6,4$ обследованных нэли больных встречалось 4 и более ¡¿АР. Среднее число МАР на одного обследованного больного муко-чисцидозом з 5 раз превышало этот показатель у здоровых. Анализ количественного распределения МАР у сибсов и родителей пробандов ■ »се вылвил достоверно значимых отличий от группы здоровых.

С наибольшей частотой у болъньх мукойисцидозом встречались следуд:.'Кй ЛАР: высокое нобо - 32,Ь%, ьупэчная грыжа - 30,6$ и ге-мянглоьм на толо - ¿0,Ьд>. Ьыяьлсншп мк.кропркзнаки не являются

строго специфичными для муковисцидоза, так как встречаются и при других наследственных заболеваниях, но могут служить допол- • нительными диагностическими критериями в сочетании с другими симптомами заболевания.

ВЫВОДЫ

I. Показатели перекисного окисления липидов мембран эритроцитов характеризуются значительным вкладом наследственных факторов, при этом вклад последних в фенотипическую изменчивость изученных признаков по коэффициенту наследуемости (А^) составил: А1Г » 845?; ВДАСВЯ3.= 86%; дегр.МДА » 66%; МДА.Л1Г = 100 %; тип активдости ПОЛ » 100%. Сегрегационная частота в изучаемой зыбор-ке больных муковисцидозом составляет 0,2727, что соответствует аутосомно-рецессивному типу наследования.

2. У больных выявлены мембранодеструктйвные процессы, со- • прозождающиеся различными нарушениями мембранного метаболизма: достоверно повышен механический гемолиз, снижен прирост гемолиза, за время инкубации, повышено содержание общего МДА, снижено содержание связанной его формы, повышена интенсивность деградации '•ЩА (активность альдегидп,егидрогеназы)и соотношение ¿ЛДА/ПГ,снижена антиокиолительная активность и индекс деформируемости эритроцитов (Р<0,01). Между этими нарушениями и тяжестью клинических проявлений муковисцидоза существует прямая корреляция с коэффициентом, равны;.! 0,72+0,06.

3. Интенсивность перекисного окисления мембранных фосфолипи-дов повышена у 36,11% больных, угнетена - у 40,28%, в остальных случаях (19,44%) изменения параметров свидетельствуют о разбалан-сированности перекисных процессов. На разбалансированность процессов мембранного метаболизма при муковисцвдозе указывает несоответствие между концентрацией общего и связанного ¿ЩА в клетке, нарушение положительной корреляции между содержанием ДЦА в эритроцитах и степенью их гемолиза после инкубации. При муковигцидозе вта связь отсутствует, коэффициент корреляции равен -0,06.

4. Досто.верное повышение соотношения ДЦАЛ1Г=» 1,40^0,14 указывает на угнетение перекисного окисления липидоп при муковпсцидо-пе. Понижение активности ПОЛ у больных муковисцидозом происходит л результате истощения субстрата ПОЛ, сопровождается накоплением ДЦА в клетке и свидетельствует о дезорганизации липидкого слоя клеточной мембраны.

5. У 73,6$ больных .чуковисцидозом наблюдались'микроанома-лии фенотипа, что достоверно вше среднепопуляционной частоты (р<0,01). Среднее число МАР на одного больного муковиоцидозом

В 5 раз вше этого показателя у здоровых. К наиболее часто встречающимся МАР относятся: высокое небо - 32,8$, пупочная грыжа -30,6/5, гемангиош на теле - 20,8$. Сочетание данных признаков может служить дополнительным диагностическим критерием в диагностике муковисдадоза.

6. У родителей больных муковдсцидозом детей не обнаружено накопление МАР, но выявлено достоверное повышение показателей интенсивности деградации МДА и соотношения ВДА/ПГ, что монет рассматриваться ь качестве возможного признака гетерозиготного носл-тельства.

1. Характеристика перекисного окисления липвдов мембран эритроцитов прп муковисцвдозе.//Второй Всес. съезд медицинских генетиков, Алма-Ата, 4-6 декабря 1990г.:Тез. докл. - М., 1990.-С.38.

I •

2. Современные достикения диагностики, лечения, профилактики и организации социальной помощи больным цуковисцвдозом. //Тез« докл. I Всес. конгресса по болезням органов дыхания, Киев, 9-12 октября 1990г. - Киев, 1Э90. - К 524.(соавт. Капранов Н.И., Гришина И.О., Каширская Ц.Ю., Торчинский М.Ю.)

3. Клиническое значение определения перекиснртст окисления липидов мембран эритроцитов при муковисцидозе.//Педиатрия. - 1991«

й 5, - С.66-71. (соавт. Банкова В.В., Капранов Н.И., Козлова С.И.).

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации