Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие мутантных генов Fgf5go-Y, hr, we и wal, нарушающих развитие и рост волос у мыши

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие мутантных генов Fgf5go-Y, hr, we и wal, нарушающих развитие и рост волос у мыши"

На правах рукописи

003491948

Нестерова

I _

Анастасия Петровна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МУТАНТНЫХ ГЕНОВ Еф80'\ кг, ме и лча1, НАРУШАЮЩИХ РАЗВИТИЕ И РОСТ ВОЛОС У МЫШИ

Специальность 03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2010

1 3 20 ¡0

Работа выполнена в лаборатории генетики развития

Учреждения Российской Академии Наук Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Конюхов Борис Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Асланян Марлен Мкртичевич

кандидат биологических наук Костюченко Маргарита Владимировна

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится « 4 » марта 2010 года в_

часов на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской Академии Наук Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3.

Факс: (499) 132-89-62, e-mail: iogen@vigg.ru, сайт: www.vigg.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан « ^ »_(

Ученый секретарь диссертационного совета

ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования

Изучение генетического контроля процессов развития волосяного покрова у млекопитающих является актуальной задачей генетики развития, и имеет важное прикладное значение для дерматологии и косметической медицины. Патологии роста волос и самообновления клеток волосяных фолликулов часто связаны с этиологией многих серьезных заболеваний кожи, в том числе и онкологических (Patzelt et al., 2008).

Сам волосяной фолликул млекопитающих является уникальным объектом исследований, поскольку каждый волос много раз повторяет свой цикл развития, который включает стадии роста (анагена), регрессии (катагена) и покоя (телогена). При этом патологическое выпадение (алопеция), так же как и чрезмерный рост волос часто является следствием нарушения смены стадий цикла волосяных фолликулов.

Несмотря на существование различий в развитии и росте волос у мыши и человека, лабораторные мыши (Mus musculus) являются традиционной и адекватной моделью изучения аналогичных процессов работы волосяных фолликулов у человека (Porter, 2003). Многие особенности аномалий волос и кожи у человека были выяснены благодаря изучению мышей, со спонтанными мутациями, нарушающими формирование волосяного покрова.

В настоящее время известно более 100 мутантных генов, вызывающих нарушения роста и развития волос у мыши (Mouse Genome Database, www.infonriatics.jax.org). Молекулярные функции многих из этих генов остаются плохо изученными. В их числе гены wellhaarig (we), waved alopecia (wat), hairless (hr) и angora (Fgf5K"). Действие мутантного гена we приводит к возникновению волнистого шерстного покрова у гомозиготных мышей, Мутантный ген wal в гомозиготном состоянии также приводит к формированию волнистого шерстного покрова с последующим облысением. Мутантный ген hr обусловливает полное отсутствие волос у гомозигот. И наконец, мутантный ген Fgf5x" в гомозиготном состоянии увеличивает длину всех типов волос.

Только недавно стали выясняться молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе развития, роста и цикла волосяных фолликулов. Главной причиной разных патологий роста волос оказалось нарушение работы одних и тех же генных регуляторных сетей, управляющих физиологией клеточных систем в составе волосяного фолликула. Ключевыми генными регуляторными сетями, функционирующими в коже млекопитающих, являются сети WNT, BMP, SHH, FGF, EGF. Эти генные регуляторные сети определяют ритм и хронологию смены стадий цикла фолликулов.

Генная регуляторная сеть BMP (bone morphogenetic proteins) управляет процессами дифференцировки клеток - предшественников волоса и принимает участие в контроле пролиферации стволовых клеток волоса. У мутантных мышей причины патологий строения стержней волос, сопровождающихся их выпадением, могут быть связаны с нарушением работы генной регуляторной сети BMP.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы был анализ взаимодействия мутантных генов hr, Fgf5g0'Y, we и wal, нарушающих формирование шерстного покрова у мыши. Исходя из цели исследования, были поставлены следующие задачи:

1) Изучить взаимодействие мутантного гена Fgf5g0~Y с мутантными генами hr и wal.

2) Исследовать взаимодействие мутантных генов Fgf5s°'r, we и wal у тройных гомозигот.

3) Изучить характеристики циклов волосяных фолликулов у мышей генотипов we/we wal/wal, Fgf5s°~Y/Fgf5g0~Ywal/wal и Fgf5s°~ Y/Fgf5g0'Y we/we wal/wal.

4) Исследовать особенности экспрессии мРНК генов Втр2 и Idl— маркеров генной регуляторной сети BMP, у мутантных мышей в период формирования первой и второй генерации волос.

Научная новизна и практическая значимость работы

Создана коллекция линий мышей с различными сочетаниями гомозиготных аллелей мутантных генов FgfS""'y/Fgf5g"~Y hr/hr, we/we wal/wal, Fgf5g°-Y/Fgf5g0-Ywal/wal и Fgf5g"-Y/Fgf5g"-Y we/we wal/wal и

проведен подробный генетический анализ этих мутаций и их влияния на развитие шерстного покрова мыши.

Установлено, что мутантный ген Fgf5g0'y является модификатором эффектов генов Иг и wal, а также модификатором эффекта взаимодействия генов we и wal. Модификации проявляются в изменении сроков и характера развития алопеции у мышей.

Показано, что транскрипционная активность ВМР-регуляторных генов Втр2 и Idl у мышей C57BL/6 зависит от стадий цикла волосяных фолликулов. У мутантных мышей we/we wal/wal выявлены нарушения динамики транскрипционной активности и сверхэкспрессия генов Втр2 и Idl, с чем связано сокращение стадии анагена и развитие сильной алопеции.

Показано, что у тройных гомозигот Fgf5s"~y/Fgf5K"'r we/we wal/wal ген Fgf5g"'y обуславливает снижение транскрипционной активности гена Idl, тем самым, ослабляет эффект взаимодействия мутантных генов we и wal, что приводит к восстановлению роста волос.

Практическое значение работы состоит в том, что созданные мутантные линии мышей могут быть использованы в качестве модельной системы наследственных заболеваний кожи и волос у человека. Особый интерес с прикладной точки зрения представляет возможность направленного изменения экспрессии ключевых участников генных сетей и влияния на цикл волосяных фолликулов с целью усиления или подавления роста волос.

Апробация работы

Результаты исследований докладывались на 10 - й и 11 - й международной Пущинской конференции молодых ученых, Пущино, Россия (2006 и 2007 гг.); международной конференции молодых ученых но молекулярной биологии и генетике, посвященной 120 -летию со дня рождения Н.И.Вавилова, Киев, Украина (2007 г.); пятом Съезде ВОГиС, Москва, Россия (2009 г.); всемирном конгрессе «Ген», Фошан, Китай (2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 140 странице и включает в себя стандартные разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и приложение. Список литературы включает 163 источника, из которых 14 -отечественных и 149 иностранных авторов. В работе содержится 9 таблиц и 47 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии мышей, используемые в работе.

Мутантные линии мышей angora - Y, wellhaarig, waved alopecia и hairless были получены из научно-исследовательской лаборатории экспериментально - биологических моделей РАМН. Были использованы также ранее полученные в лаборатории генетики развития двойные гомозиготные мыши черного окраса а/а we/wewal/wal.

Получение двойных и тройных гомозигот.

Для получения двойных гомозигот Fgf5g0'Y/Fgf5s"'Y hr/hr сперва были получены мыши +/+hr/hr на бэкграунде мышей C57BL/6. Для получения мышей генотипа Fgf5K"'Y/Fgf5x"'Y/ hr/hr были проведены 4 типа скрещиваний (рис.1).

Для получения мышей генотипа Fgf5s°~Y/Fgf5e°~Ywal/wal также были проведены четыре типа скрещивания (рис.1). В качестве контроля использовали мышей +/+ wal/wal, окраса агути, которых были отобраны из потомства мышей F2 после результатов анализирующего скрещивания.

Для получения тройных гомозигот Fgf5g0~ï/Fgf5s°-ywe/wewal/wal были использованы полученные ранее в нашей лаборатории мыши генотипов а/а we/wewal/wal и мыши А/А Fgf5g°~Y/Fgf5g0'Ywal/wal. Ген we тесно сцеплен с геном а на хромосоме 2, поэтому гомозиготы по гену we имеют черный окрас шерстного покрова (рис.1). Наличие двойной дозы гена Fgf5s"'Y у тройных гомозигот подтверждали также с помощью метода ПЦР. ДНК выделяли из тканей ушной раковины двухмесячных мышей.

Изучение шерстного покрова животных и гистология.

Шерстный покров у мышей изучали визуально, начиная с 5 дней после рождения до 10-месячного возраста. Для морфологического анализа волосы классифицировали под бинокуляром в слое глицерина, подразделяя их на 4 типа: направляющие первого порядка, направляющие второго порядка, остевые и пуховые. Мышей анестезировали авертином («Avertin»).

Для приготовления гистологических срезов использовались кусочки кожи передней области спины мышей размером 10x5 мм. Кусочки кожи у мышей C57BL/6 брали через 7, 16, 20, 24, 30, 40, 45, 50 дней после рождения, согласно литературным данным о длительности стадий в цикле волос (Muller-Rover et al., 2001). Кусочки кожи у мышей генотипов we/we wal/wal, Fgf5K"~Y/Fgf5KU~Ywe/wewal/wal и Fgf5g"~y/Fgf5go~]wal/wal (сибсов из двух или трех пометов) брали в промежутке с 7 по 40 день жизни мышей с интервалом в 2 дня, а также на 45, 50, 60 и 90-й день жизни. Фиксация кусочков кожи проводили раствором Буэна в течение 24-х часов. Получали продольные и поперечные парафиновые серийные срезы толщиной 7 мкм на санном микротоме МС-2. Депарафинизированные срезы подвергали окраске по Маллори и эозином и гематоксилином (Соколов и др., 1988).

Определяли стадии цикла волосяных фолликулов направляющих волос G1 и G2 у мышей разных генотипов согласно руководству по точной классификации стадий цикла волос у мыши, предложенной Мюллер-Ровер с соавторами (Muller-Rover et al., 2001). Используемая классификация позволяет определить шесть подстадий роста ВФ (анаген 1 - анаген VI), восемь подстадий регрессии ВФ (катаген I -катаген VIII) и стадию покоя (телоген) в цикле роста волоса. За день на который начинается стадия анагена, катагена или телогена принимали определенный день после рождения мыши, в который был фиксирован образец кожи, когда морфология более 50% фолликулов различимых на срезах (при анализе примерно 40 ВФ в каждом образце) впервые соответствовала критериям данной стадии.

Р: Р, : ВС: Рве:

Схема скрещивания для получения мышей генотипа Рф Гф кг/Иг:

^Рф^/Рф^^ X ¿+/+Иг/1гг +/Рф*°-г+/11г

?(? +/Рф*°'г+/Иг

Рф *°-г/Рф

ТС Рве.- :

Рве «Рве

+/Рф +/+ +/Рф е°-г +/Нг Рф^/Рф^+Лг Рф1°-Г/Рф''"-Г +/+

1)4 Рфх°-г/Рф *°-г +/? X в +/+ Иг/Иг

I

+/Рф +/11Г

+/Рф Иг/Иг 2)$+/+ +Лг х $ рф *°-г/ Рф +/?

+/Рф*°-Г+/+ +/Рф *°'г+/Иг +/Рф*"-Г Иг/Иг

$Рф*°-г/Рф*>-г +/1,г х $ Рф Рф *°-г+/Иг ;

Рф «"-7 Рф *°-г +/+ Рф *°-г/Рф *°-г +/1,г Рф*°-Г/Рф*°-Г Иг/Иг ? Рф *°-г/ Рф ""'Ч/кг х с^Рф г°"7 Рф Аг/йг

«»-г

Рфг°'Ч Рф^' ЫИг

Схема скрещивания для получения мышей генотипа 1Рф№~ул\>а1/\уа\:

Р: $ +/+и'а//и-а/ х ЗРф^/Рф*0-'1

I

Р, : +/Рф /+\т1

ВС: §<3 +/Рф*°-г/+ма1 х $(?+/+»»• а1/па1

4

Fsc■ +/+ иа/Лга/ (агути)

НРф *°-г \wlhval Сагути) +/Рфе"'г +Лт1 +/+ +Ма1

ТС Рве:

$(?+/?!га/Лга/ х 5 с? Рф*0-Г/Рф*0-Г+/+

I

+/Рф п'Ы/ка!

Рве хРве:

? +/Fgß s"'y walAval * S+/Fgf5 g'"] wa/Aial i

, Fgf5 s"-1" wal/wa!

+/- walhval_

■-•*>/ Fgf5so ï walAval

Схема скрещивания для получения мышей генотипа

Fgf5K"'ï/Fgf5g"'ywe/wewal/wal: Р : ? А/А FgfîP-'/FgfSt-'walAniI х в а/а we/wewal/wal

I

F, : А/а i Fg/5 >"-r+\re/wal/'wal

ВС: A/a+/Fgf5?"-ÏJrwc\val\ral * A/a+/Fgf5 +we/wai/wal

_4,

FBC

au FgfS^-'/FgfS6'-1 ii'ê/ii'e ira//W q/ц +/Fg/5S""' ii'e /n'e wal/wal_

м'а1А\'а1

и др.

ТСТос:

?<? а/а .'/Л^' ™?Л.г> тМгл/ х 2<? а/о ^/У""' ^/З"""'+/++/+

I

аа+ +Аге +Лга/

а а Г^З ':"~)/Fgf5 +/»'£ +Лго/

Рис. 1. Схемы скрещиваний для получения мышей /^^/З ""'у/ Fgf.5

/7///7Г, и '//^/З1-'""^м^еЛ 1 .■«//! 1'ст/.

Р - родители , - первое поколение, ВС - возвратное скрещивание, ТС - анализирующее скрещивание, | - конечный генотип.

Качественная и количественная полнмеразиая цепная реакция.

ДНК выделяли из тканей ушной раковины мышей при помощи набора реагентов ДНК - ЭКСПРЕСС (Литех, Россия). Для оценки уровня экспрессии генов Втр2 и Id! в коже у мышей разных генотипов выделяли тотальную РНК из кусочков кожи размером 10x5 мм с верхней области спины мышей с использованием набора реагентов Trizol RNA Prep 100 (IsoGen, Россия). Кусочки кожи брали у тех же мышей, от которых брали образцы для гистологического анализа, либо у их сибсов через 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 дней после рождения мышей. Концентрацию полученных тотальных ДНК и РНК измеряли при помощи спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США), после чего концентрацию во всех пробах доводили до

величины 100 нг/мкл. Реакцию обратной транскрипции проводили, используя набор реагентов GenePak® RT Core (IsoGen, Россия). Для проведения качественной полимеразной реакции использовался набор Encyclo™ PCR kit (Евроген, Россия). Для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени использовали наборы реагентов (Синтол, Россия) с интеркалирующим красителем SYBR Green I, и пассивным рефересным красителем ROX и прибор iCycler iQ (BioRad, США). В качестве стандартов использовали 2-х, 3-х и 4-х кратное разведения очищенных продуктов ПЦР с праймерами к генам Втр2 и Idl. Для дополнительного анализа данных ПЦР в реальном времени значение Ct для проб нормализировали по значению С( в реакции с праймерами к гену домашнего хозяйства Gapdh (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изучение взаимодействия мутантных генов angora-Y (FgfSs°'Y) и

hairless (hr).

Мутантный ген Fgf5g0'Y в гомозиготном состоянии увеличивает длину всех типов волос, а у гомозигот по гену hr наблюдается полное выпадение волос, начиная с 14-дневного возраста. У мышей генотипов +/+hr/hr и +/Fgf5x"'r hr/hr с 14-дневного возраста начинается облысение, и к 3-недельному возрасту мыши +/Fgf5go'Y hr/hr и +/+ hr/hr оказываются полностью лишенными шерстного покрова (табл.1, рис. 2).

У двойных гомозигот Fgf5g°'Y/Fgf5g0~Y hr/hr волосы начинают выпадать только с 18-дневного возраста. В течение 10-12 дней после начала облысения у двойных гомозигот выпадают все волосы, за исключением вибрисс и некоторых волос на пальцах (таблица 1, рис.2). Морфологический анализ волос, выщипанных со средней части спины 21-дневных мышей мышей Fgf5g0'Y/Fgf5ga'Y hr/hr, показал ,что пуховые волосы состоят из пяти сегментов (в норме - три сегмента), как и у одинарных гомозигот по гену angora-Y. Волосы остальных типов двойных гомозигот этого возраста также были существенно длиннее, чем в норме.

Таблица 1. Начало и окончание алопеции у мышей различных генотипов.

Генотип Чис да мы шей Дни после рождения

В 14 15 17 18 19 2 22 27 28 29 30 31

^Р'hr/hr 48 ? 38 1 В 21 И 3

+/FgfF' hr/hr 42 5 36 1 37 5

+/+hr/hr (F2) 51 8 40 3 41 7

Примечание: Подчеркнутые цифры - число мышей с начальными признаками алопеции; неподчеркнутые - число мышей с полной алопецией.

1'Ш

Мыши +/+ hr/hr (F2). Слева направо: 15,17,19 и 21 день после рождения.

J , * *

• щ у

Мыши Fgf5go~Y/Fgf5s°'Y hr/hr. Слева направо: 20, 23, 26 и 29 дней после

рождения.

Рис.2. Развитие алопеции у мышей +/+ hr/hr и Fgf5g0~y/Fgf5g0~Y hr/hr.

Следовательно, ген Fgf5go"Y в одинарной дозе не влияет на сроки облысения мышей /гг//гг, а двойная доза этого гена отодвигает начало облысения двойных гомозигот

Fgf5g°-r/ Fgf5ga'r hr/hr на 4 дня и пролонгирует срок облысения у них более, чем в 1,5 раза по сравнению с гомозиготами по гену hr.

Изучение взаимодействия мутантных генов angora-Y (Fgf5g0'y)

и waved alopecia (wal). I

У гомозигот +/+wal/wal первые признаки алопеции у большинства животных появляются в 3-месячном возрасте. Облысение идет от шеи и лопаточной области в каудальном направлении. Волосы разрежены на спине, и сквозь них просвечивает кожа. Облысение выражено сильнее у самок, чем у самцов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ген Fgf5g"'Y является модификатором гена wal. У мышей генотипа +/Fgf5go')wal/wal признаки первой алопеции появляются примерно на полтора месяца раньше, чем у мышей +/+ wal/wal (табл.2). К концу первого - началу второго месяца у всех мышеи +/Fgf58"'Ywal/wal появляются первые признаки алопеции, при этом размеры и формы алопеции отличаются у разных особей. У 35 - 37 - дневных животных этого генотипа на голых участках кожи появляются волосы второй генерации (G2), и к 1,5 месяцам после рождения мыши +/Fgf5e°-Ywal/wal имеют волнистую шерсть и вновь напоминают мышей генотипа +/+ wal/wal.

Двойная доза гена Fgf5go'y еще более усиливает эффекты гена wal. К концу первого месяца у большинства двойных гомозигот вся спина становится голой, но на ней сохраняются редкие длинные курчавые волосы (рис.3). У некоторых мышей этого генотипа признаки алопеции выражены значительно слабее.

Рис.3. Фенотип мышей в начале

второго месяца жизни. Алопеция у 26 - дневного самца генотипа go'Y/Fgf5g°~Y wal/wal (вверху). Появление волос второй генерации у этого же самца в 35 - дневном возрасте (внизу).

Процесс появления волос G2 занимает около 12 дней. К концу второго месяца выпадение волос повторяется (табл.3). Отрастание волос G3 у мышей Fgß^Y/ Fgfy^walfwal начинается после двух месяцев после рождения, однако нормально сформированный шерстный покров появляется не у всех двойных гомозигот.

Изучение волосяного покрова мышей Fgf5g"~y/Fgf'5K"~Y wal/wal в возрасте от 3-х до 10-ти месяцев показало, что 24% самок и 67% самцов не имеют признаков алопеции, а остальные животные были с признаками алопеции разной степени выраженности. Мы выделили три основных степени развития алопеции у взрослых мышей генотипа Fgf5s°'Y/Fgf5s"'Y wal/wal: I - незначительная, волосы на спине короткие, слегка волнистые; II - сильная разреженность волос, видна кожа на всей поверхности спины; III - обширная алопеция по всей спине. Согласно этой классификации из 76% самок с алопецией больше половины имели III степень развития и лишь около четверти - I степень. Из 33% самцов, имеющих алопецию, почти равное количество мышей имели I, II и III степень.

Таблица 2. Выпадение волос Gl у мышей генотипов

Fgf5g0'Y/Fgf5g0'Ywal/wal и +/Fgf5g°-ywal/wal

Генотип Дни после рождения

18-20 21-23 24-26 27-29

Fgf5g"-r/Fgf5g0-r wal/wal 0/42 11/42 13/42 18/42

+/Fgf5g°-r wal/wal 0/42 0/42 9/42 33/42

+/+ wal/wal F2 0/42 0/42 0/42 0/42

Таблица 3. Выпадение волос G2 у мышей генотипа

_Fgf5g0-Y/Fgf5s°-Ywal/wal_

Генотип Дни после рождения

AS-AI 48-50 51-53 54-56

Fgf5s°'r/Fgf5ga~y wal/wal 0/42 18/42 15/42 9/42

+/Fgf5go'y wal/wal 0/42 0/42 0/42 0/42

+/+ wal/wal F2 0/42 0/42 0/42 0/42

Примечание: О - генерация волос. В числителе - число мышей с первыми признаками алопеции, в знаменателе - общее число мышей.

Изучение взаимодействия мутантных генов angora (FgfSgoY),

waved alopecia (wal) и wellhaarig (we) у тройных гомозигот.

Анализ развития алопеции у мышей генотипа we/wewal/wal, проведенный в настоящем исследовании, полностью подтвердил данные, полученные ранее в лаборатории генетики развития. Ген we значительно усиливает эффекты гена wal, то есть является его модификатором. Это проявляется в развитии выраженной алопеции и выпадении практически всех волос у мышей we/we wal/wal (Конюхов Б.В., 2004).

Более чем у 50% 16-дневных мышей этого генотипа появляется алопеция в шейной и межлопаточной областях (табл. 4). Примерно через неделю двойные гомозиготы становятся практически голыми, а затем начинают отрастать волосы второй генерации (G2), и весь процесс роста и выпадения волос вновь повторяется. Мыши этого генотипа вновь становятся голыми в 1,5-месячном возрасте и остаются такими до старости. У мышей wal/wal признаки первой алопеции наблюдаются только после 2-месячного возраста, то есть значительно позже, чем у мышей we/wewal/wal.

У тройных гомозигот а/а Fgf5g"-Y/Fgf5g,hYwe/wewal/wal признаки алопеции - выпадение волос первой генерации (G1) в области шеи наблюдаются на неделю позже, чем у мышей +/+we/we wal/wal. При этом признаки алопеции появляются не одновременно у всех мышей и этот процесс растягивается примерно на неделю. С возрастом алопеция (разреженность волосяного покрова) усиливается и распространяется, как обычно, в каудальном направлении. После выпадения волос первой генерации (G1) мыши генотипа Fgf5g0'Y/Fgf5g"'Ywe/wewal/wal некоторое время остаются голыми, а затем начинают отрастать волосы второй генерации (G2). Выпадение волос G2, как и волос Gl, у мышей Fgf5s°'Y/Fgf5g"'Y we/we wal/wal запаздывает на 7 дней по сравнению с этим процессом у мышей +/+ we/we wal/wal (табл.4).

У 41% мышей Fgf5s°~r/Fgf5g0~Y we/we wal/wal старше 3 месяцев развивается нормальный шерстный покров, а остальные животные имеют алопецию разной степени выраженности, начиная с разреженности волосяного покрова, сквозь который местами просвечивает кожа (27%), до частичного облысения спины (32%) (рис.4).

Одинарная доза гена Fgf5s"A также ослабляет развитие алопеции. Однако это влияние слабее, чем при двойной дозе гена Fgf5go'Y: появление первой алопеции у мышей +/Fgf5g0' we/wewal/wal сдвигается только на три дня позже, чем у мышей +/+ we/we wal/wal.

Таблица 4. Выпадение волос у мышей с различными генотипами.

Генотип Дни после рождения

14-16 (Gl) 17-20 (Gl) 21-23 (Gl) 24-26 (Gl) 30-37 (G2) 38-45 (G2) 46-53 (G2)

Fgf5go-'/ Fgf5g0'r we/wewal/wal 38/61 23/61 44/61 17/61

+/Fgf5g0-r we/wewal/wal 40/56 16/56 46/56 10/56

+/+we/we wal/wal 37/70 33/70 54/70 16/70

+/+ +/+ wal/wal F2 0/44

Примечание, в - генерация волос. В числителе — число мышей с первыми признаками алопеции, в знаменателе - общее число мышей. У мышей +/+ +/+ м>а1/м>а1 признаки первой алопеции отмечены у 18 из 44 наблюдаемых животных лишь в возрасте 61—75 дней.

Рис. 4. Разная степень алопеции у шестимесячных мышей we/wewal/wal (слева) и Fgf5g0'y/Fgf5g0'} we/we wal/wal (три справа).

Изучение циклов волосяных фолликулов у мышей генотипов

we/wewal/wal, Fgf5go'Y/Fgf5s"~r wal/wal и Fgf5p"Y/Fgf5g"'Y we/wewal/wal Смена стадий анагена, катагена и телогена первой и второй генерации волос у мышей проходит по достаточно четкому временному графику (Paus et al, 1999; Muller-Rover et al., 2001) (рис.5).

0-16 16-19 19-28 28-42

дней после рождения Рис. 5. Последовательная смена стадий цикла волосяных фолликулов у мышей С57ВЬ/6 в течение двух недель после рождения.

Гистологический анализ показал, что длительность стадии анагена волос первой генерации у мышей С57ВЬ/6 составила 16 дней, катагена -4 дней, а телогена - 8 дней, что соответствует литературным данным. Вторая генерация волос у мышей нормального генотипа развивается менее синхронно по сравнению с первой генерацией волос, а у мышей мутантных генотипов асинхронность циклов фолликулов второй генерации выражена еще сильнее.

В результате взаимодействия мутантных генов у/е и \vcil

значительно изменяется развитие, рост волос и продолжительность стадий в цикле волосяных фолликулов у двойных и тройных гомозигот. Гистологический анализ срезов волосяных фолликулов направляющих волос у мышей Рфк°'уч>а1/ч>а1 показал, что что число фолликулов на стадии анагена VI - катагена 1 С1 начинает преобладать у 7 - дневных двойных гомозигот (81% от всех учитываемых фолликулов на двух сериях срезов); а на стадии телогена 61 у 24 - дневных (74%), и на стадии анагена 1 в2 у 32 - дневных мышей (90%).

Fgf5%°~ Y/Fgf5g0~Y wal/wal we/we wal/wal

анаген 57%

■ анаген катаген

телоген

29%

8%

катаген

анаген

натаген

1телоген

Fgf5g0'r/Fgf5g"-у we/we wal/wal Рис. 6. Длительность стадий цикла волосяных фолликулов направляющих волос мышей разных генотипов. Внешний круг - длительность стадий цикла фолликулов у мышей нормального генотипа, внутренний круг - у мышей мутантного генотипа.

Рис. 7. (а) сальные железы у 15- дневных мышей C57BL/6; (б) патологически увеличенные сальные железы у 15 - дневных мышей we/we wal/wal; (в) фолликулы G1 направляющих волос у 10 - дневных мышей C57BL/6, стержни волос нормального строения; (г) фолликулы G1 направляющих волос у 10 - дневных мышей we/we wal/wal, нарушена ориентация гранул меланина. Парафиновые срезы кожи спины, окраска гематоксилином - эозином.

700 000,00 §■ 600 000.00 I 500 000.00 ?3 <100 000.00

5 :оо ооо.оо -

г 100 000.00

® 0.00

„ , 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ...

К'»/'-' День ЖИ1НИ Ш

—- норма (С57Виб) — »еЛтенэС««/ РдЪ**'' 'РэЪ^иеыетЧна!

Рис.8. Колебания транскрипционной активности генов Втр2 и Ы1 в материале кожи мышей разного возраста.

| 3 000 000.00

о

2 500 000.00

X

о 2 000 000.00

§■ 1 500 000.00 ш

* I 000 000.00 о.

* 500 000.00

г

О 0,00

Втр2

Ы1

а Р

■о

и

1

.«В 300 000

с

с 250 000

8 200 000

§ 150 000

са

100 000

а

= 50 000

с

* 0

1 700 000

о

с 600 000

X 8 500 000

400 000

9

а 300 000

& 200 000

2

= 100 000

С

X 0

/ \

/ \ / \

/ \ / \

/ ч / \

/ < 1

и

1 400 000 1 200 000 1 000 000 300 000 600 000 400 000 200 000

—А V 1\

4 * Р у

Г р V V N

5 1 0 1 5 20 2 5 30 35 4 0 45 50 День жизни

3 000 000 ' 2 500 000 2 000 000 ' 1 500 000 1 000 000 500 000

/

/ \

/ \

/ \

1 /■V —Г

5 1 0 1 5 2 0 25 30 35 40 45 50 День жизни

5 1 0 1 5 20 25 30 35 4 0 45 50 День жизни

3 1 200 000

е

с 1 000 000

X

8 800 000

600 000

400 000

а

= 200 000

0

1 /1 \

/ V / \ /

/ \| / \

/ \ / \

/ \ 9 \ ч

— - V-

5 1 0 15 20 2 5 30 35 4 0 45 50 день жизни

Рис.9. Динамика транскрипционной активности генов Втр2 и Ы1 в коже мышей разных генотипов на различных стадиях развития волосяных фолликулов. Цветом обозначены стадии цикла волосяных фолликулов (анаген - зеленый, катаген - желтый, телоген - оранжевый).

Следовательно, по сравнению с нормой у мутантных мышей Fgf5ga'r/Fgf5s°'Y wal/wal стадия анагена направляющих волос G1 сокращена, а стадия катагена, наоборот, очень продолжительная и составляет 53% от длительности всего цикла волос первой генерации (14 % - в норме) (рис.6).

У мышей we/we wal/wal также стадии анагена и телогена G1 направляющих волос сокращены, а стадия катагена, длится дольше по сравнению с нормой (рис. 6). У 12-дневных мышей we/we wal/wal 100% фолликулов находятся на стадии анагена VI - катагена I G1; у 20 -дневных мышей we/we wal/wal - 14% на стадии телогена, 26%- на стадии катагена VIII G1; у 24 - дневных 84% на стадии анагена I G2 и 16 % на стадии телогена G1.

У мышей we/we wal/wal также наблюдаются патологии строения стержней волосяных фолликулов и увеличение размеров сальных желез. В формирующихся стержнях всех типов волос у мышей we/we wal/wal гранулы меланоцитов дезориентированы, сами стержни волос извиты и неравномерной толщины (рис. 7). Эти патологии являются, очевидно, проявлением эффектов мутантного гена we, для которого показано нарушение кератинизации клеток ВКВ у мышей генотипа we/we (Конюхов, Куприянов, 1990).

Кроме нарушения формирования стержней волос у мышей we/we wal/wal были обнаружены аномалии в развитии сальных желез волосяных фолликулов. С момента вступления волосяных фолликулов в стадию катагена G1 сальные железы сильно увеличиваются в размере и окружают стержни волоса с двух сторон (рис.7). С началом стадии анагена G2 размеры сальных желез уменьшаются, но снова резко увеличиваются к началу стадии телогена G2.

Разрастание сальных желез может быть как следствием нарушения экспрессии участников генных сетей, контролирующих развитие адипоцитов (BMP, SHH), так и компенсаторным механизмом восстановления нормальной теплорегуляции, которая нарушается из-за тотальной потери волос у мышей we/wewal/wal.

У тройных гомозигот Fgf5g0-Y/Fgf5s°-Y we/wewal/wal только к 18 дню после рождения фолликулы вступают в стадию анагена VI -катагена I. На 20 - 24 дни после рождения мышей волосяные фолликулы проходят фазы катагена. Таким образом, у тройных

гомозигот стадия анагена и кагагена направляющих волос G1 значительно длиннее, чем у мышей нормального генотипа. Стадия телогена волос G1 у тройных гомозигот очень короткая: на 24 день после рождения мыши дегенерируют 23% фолликулов, а на 26 день часть фолликулов уже вступает в стадию анагена.

Анализ экспрессии мРНК генов Втр2 и Idl — маркеров генной регуляторной сети BMP в ходе никла волосяных фолликулов у мыши.

В материале кожи мышей C57BL/6 и мутантных мышей разного возраста методом ПЦР в реальном времени были измерены количественные уровни мРНК генов Втр2 и ¡di. Белок ВМР2 - один из основных индукторов генной регуляторной сети BMP, который связывается с рецептором BMPR1 и активирует его. Ген Idl является непосредственным геном-мишенью сети BMP, и на его экспрессию не влияет работа других генных сетей (Ying et al., 2003).

В диссертации показано, что транскрипционная активность генов Втр2 и Idl в коже мышей мутантных и нормального генотипов в течение первых двух месяцев жизни имеет периодические колебания. Уровень транскрипционной активности гена Idl усиливается при усилении экспрессии гена Втр2, что подтверждает зависимый характер экспрессии гена Idl в коже от активности сети BMP (рис.8).

Более поздний рост экспрессии гена Idl в коже мышей C57BL/6, по сравнению с экспрессией гена Втр2, может быть связан с тем, что существует много факторов влияющих на активность сети BMP кроме гена Втр2 (например, ВМР4, TGFR, SMAD, RAS и др.) (Wordinger, Clark, 2007).

Полученные нами данные показывают, что в коже у мышей we/wewal/wal активность генов Втр2 и Idl значительно выше чем в норме (максимальное значение транскрипционной активности гена Втр2 у мышей C57BL/6 составило около 250 тыс. копий/200нг пробы тотальной кДНК, гена Idl - 1 300 млн. копий/200нг; у мышей we/we wal/wal 600 тыс. копий/200 нг и 2 млн. 800 тыс. копий/200 нг соответственно).

Взаимодействие гена Fgf5g"~r с генами we и wal приводит к понижению экспрессии генов Втр2 и Idl в коже у тройных гомозигот

и частичной нормализации динамики экспрессии ВМР-зависимых генов по сравнению с таковой у мышей we/we wal/wal (рис.8).

ОБСУЖДЕНИЕ

Взаимодействие мутантного гена angora-Y(Fgf5s°'Y) с мутантными генами hairless (hr), wellhaarig (we), и waved alopecia (wal).

Полученные данные показывают, что ген Fgf5ga'r является модификатором эффектов генов Иг и wal, что выражается в изменении сроков и (или) характера наступления алопеции. Ген Fgf5g0'r также является модификатором эффекта взаимодействия генов we и wal, так как он уменьшает степень развития алопеции у мышей генотипа Fgf5g0~ r/Fgf5g0~r we/we wal/wal по сравнению с мышами +/+ we/we wal/wal.

Гены - модификаторы могут усиливать или ослаблять те или иные мутантные фенотипы или приводить к нормализации тех или иных аномалий развития, которые обусловлены мутантными генами. Определение генов - модификаторов позволяет ускорить поиск ключевых молекул многих биологических процессов в организме животных и человека. Однако молекулярные механизмы модификации аномального фенотипа в большинстве случаев еще неизвестны (Nadeau, 2003).

В случае взаимодействия мутантных генов Fgf5s°'Y и Иг можно говорить об участии этих генов в независимых молекулярных механизмах в волосяном фолликуле. Эффект мутации в гене Нг приводят к нарушению процессов дифференцировки стволовых клеток волосяного фолликула и выпадению волос у мутантных мышей Иг/Иг на стадии позднего анагена. Делеция в гене фибробластного ростового фактора 5 (Fgf5) обуславливает отсутствие экспрессии белка FGF5, который необходим для инициации стадии катагена (у мутантных мышей Fgf5g0/Fgf5g0 стадия анагена длится дольше и волосы становятся более длинными).

У мышей Fgf5g0'Y /Fgf5g°~YИг/Иг полностью проявляются эффекты мутантного гена Fgf5g0'r (пролонгирование стадии анагена), так и мутантного гена Иг (тотальная алопеция на стадии катагена). Поэтому стадия анагена у двойных гомозигот заканчивается на 4 дня позже, чем у мышей Иг/Иг и облысение у двойных гомозигот начинается на 4 дня позже по сравнению с началом облысения мышей Иг/Иг.

В тоже время, ген Fgf5K", взаимодействуя с геном wal, не удлиняет стадию роста волос, а наоборот, приводит к развитию сильной алопеции у мышей Fgß^/Fgß11" wal/wal. Молекулярно-генетическая структура мутантных генов we и wal и их функции остаются не изученной. Тем не менее, изучение взаимодействий этих генов между собой, а также с геном Fgf5s"''1 показывает, что все три изучаемых гена, вероятно, являются участниками общего генетического механизма контроля развития волосяных фолликулов и взаимодействующих генных регуляторных сетей.

Работа генной регуляторнои сети BMP в цикле волосяного фолликула у мышей нормального и мутантных генотипов.

Генная регуляторная сеть BMP имеет большое значение в качестве регулятора пролиферации и дифференцировки клеток волоса в ходе цикла развития волосяного фолликула. При нарушении работы сети BMP происходит прекращения роста волос и развивается алопеция. Однако, конкретные механизмы и схемы взаимодействия сети BMP с другими сигнальными сетями в процессе формирования волос не ясны. Сопоставление полученных в этой работе данных о динамике экспрессии генов Втр2 и Id1 в коже мышей C57BL/6 в течение 50 дней жизни с длительностью стадий цикла волосяных фолликулов направляющих волос Gl и G2 показало, что транскрипционная активность этих генов соотносится со стадиями цикла волос (рис.9).

Полученные в диссертации данные подтверждают результаты других авторов о высокой активности сети BMP в анагене (Plikus et al.,

2008). Мы впервые показали, что уровень транскрипционной активности гена Втр2 снижается два раза за весь цикл: в конце стадии анагена и телогена (рис.9; 15, 30 дни после рождения).

Различия, в динамиках транскрипционной активности генов Втр2 и ¡di вероятно связаны с тем, что существует много факторов влияющих на активность генной регуляторной сети BMP кроме гена Втр2 (Wordinger, Clark, 2007). Также у новорожденных мышей процесс начального морфогенеза волоса продолжается в течение первых дней жизни. В связи с этим некоторые исследователи не называют первую волну роста волос у мыши анагеном (Schneider et al.,

2009). Возможно, эти процессы также могут быть причиной различий в

динамике транскрипционной активности генов Втр2 и Idl в первом цикле волосяных фолликулов. Транскрипционная активность гена Idl в анагене второй генерации волос уже совпадает с транскрипционной активностью гена Втр2.

У мышей we/we wal/wal максимумы уровней экспрессии генов Втр2 и Idl приходится на стадию катагена, а не телогена, как у мышей C57BL/6. (рис.9). Данные о транскрипционной активности генов Втр2 и Idl соотносятся с результатами гистологического анализа и формированием шерстного покрова у мышей we/we wal/wal. Рост экспрессии генов Втр2 и Idl у мышей старше 14 дней сопровождается интенсивным выпадением волос на стадии раннего катагена. После выпадения первой генерации волос у мышей we/we wal/wal останавливается физиологический цикл волосяных фолликулов и при этом, практически не выявляется экспрессия эффектора сети BMP, гена Idl.

Анализ экспрессии генов Втр2 и Idl в коже у тройных гомозигот Fgf5s"'Y/Fgf5s°'Y we/we wal/wal показывает, что влияние мутантного гена Fgf5s°'Y компенсирует эффекты взаимодействия генов we и wal и восстанавливает активность сети BMP, которая нарушается в результате взаимодействия мутантных генов we и wal у двойных гомозигот (рис.9/

Анализ участков 2-й и 14-й хромосом, в которых находятся группы сцепления генов we и wal, позволил нам определить гены, которые, возможно, являются нормальными аллелями изучаемых мутантных генов. Вероятными кандидатами на роль нормального аллеля мутантного гена we являются гены трансглютаминаз Tgm3 и Tgmó. Кандидатами нормального аллеля гена wal могут быть гены дельта-протокадгеринов Pcdh9 и Pcdh20.

Трансглютаминазы принимают участие в процессе эндоцитоза молекул эпидермальных ростовых факторов (Reinheckel, 2005) а дельта - протокадгерины необходимы для инициации специфического ответа клетки на внешнее воздействие и передачи межклеточных сигналов (Frank, Kemler, 2002).

Эффекты мутантных генов we и wal могут быть связаны с нарушением работы генной регуляторной сети EGF (epidermal growth factors), так как сильное изменение работы сети EGF, и в сторону

ингибирования и в сторону активации, приводит к появлению волнистых волос, а иногда к развитию алопеции (Alexandrescu et al., 2009). Работа сети EGF активирует сеть ERK (RAS/ERK), что в свою очередь приводит к увеличению скорости деления кератиноцитов при одновременном ослаблении их дифференцировки. Эффект уменьшения скорости дифференцировки связывают с тем, что МАР-киназы, входящие в состав ERK сети ингибируют работу генной регуляторной сети BMP (Moustakas, 2001).

Можем предположить, что снижение активности сети EGF (и соответственно снижение активности протеинкиназ в сети ERK.) вследствие мутаций в генах Tgm3 и Pcdh9 может быть причиной сверхэкспрессии генов Втр2 и Idl в коже и смещения стадий в цикле развития волосяных фолликулов у мышей we/we wal/wal (рис.10).

Мутация в гене Fgf5 приводит к продолжению активной работы рецептора FGFR1 и дополнительной активации сети ERK в позднем анагене (Wu. 2008). Поэтому, возможно, в коже у тройных гомозигот Fgf5g"'v/Fgf5!l"~) we/we wal/wal экспрессия гена Idl, эффектора сети BMP, снижается в результате возобновления угнетения сети BMP под действием сети ERK, по сравнению с мышами we/we wal/wal.

на стадии позднего анагена волосяных фолликулов.

выводы

1. Мутантный ген Fgf5g0'Y является модификатором гена hairless у мыши. Это обусловлено тем, что ген Fgf5g0'Y в гомозиготном состоянии существенно удлиняет фазу анагена в цикле волосяных фолликулов, а эффекты гена hr начинают проявляться только при вступлении волосяных фолликулов в стадию катагена.

2. Ген Fgf5s"'Y является также модификатором мутантного гена wal. Взаимодействие мутантных генов Fgf5g0'r и wal приводит к раннему развитию алопеции и более продолжительной стадии катагена волосяных фолликулов, чем у мышей +/+wal/wal.

3. Ген Fgf5go'Y ослабляет эффект взаимодействия генов we и wal. У тройных гомозигот, Fgf5g°~r/Fgf5g0~Y we/we wal/wal, алопеция развивается позже и выражена слабее, а стадия анагена волосяных фолликулов длится значительно дольше, чем у двойных гомозигот +/+ we/we wal/wal.

4. Уровни транскрипционной активности генов Втр2 и Idl в коже мышей C57BL/6 зависят от стадии цикла волосяных фолликулов. Временной профиль транскрипционной активности гена Idl повторяет таковой гена Втр2 в цикле второй генерации волос.

5. В коже мышей we/we wal/wal транскрипционная активность генов Втр2 и Idl повышена по сравнению с мышами C57BL/6. Мутантный ген Fgf5s°~ частично нормализует у тройных гомозигот эффект влияния мутантных генов we и wal на транскрипционную активность генов Втр2 и Idl.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Нестерова А.П. Взаимодействие генов angora и hairless у мыши // Сборник тезисов. 10-я международная Пущинская конференция молодых ученых, 17-21 апреля, 2006, Пущино, Россия.

2. Конюхов Б.В, Мартынова М.Ю., Нестерова А.П. Ген angora -модификатор гена hairless у мыши // Генетика. 2007. Т.43. №2. С. 254 -260.

3. Маланина Н.А., Конюхов Б.В., Нестерова А.П. Ген angora усиливает эффекты гена waved alopecia у мыши // Генетика. 2007. Т.43. №11. С.1571 - 1777.

4. Нестерова А.П. Роль изучения спонтанных мутаций генов, влияющих на развитие волосяного покрова мыши в раскрытии механизмов алопеции // Сборник тезисов. 11 - я международная Пущинская конференция молодых ученых, 29 октября - 2 ноября, 2007, Пущино, Россия.

5. Nesterova А.P. Interaction between Fgf5, waved alopecia and wellliaarig genes affect alopecia expansion in mice // Abstract book. Conference for young scientists, Phd students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120 th anniversary of M.I. Vavilov, Sept.20 - 22, 2007, Kyiv, Ukraine.

6. Конюхов Б.В, Нестерова А.П., Малииина Н.А. Ген angora ослабляет эффект взаимодействия мутантных генов wellhaarig и waved alopecia у мыши // Генетика. 2009. Т.45. №5. С.1 -4.

7. Nesterova A.P.. Golova/enko-Abramov Р.К.. Platonov E.S. Hair growth disorders caused by mutant genes lv\ we, wal and Fgf5-V"~} in mice are associated with disruption of BMP and WNT pathways in skin // Proceedings of World Congress Gene 2009, Dec.l - 7, Foshan, China.

в. Конюхов Б.В., Нестерова А.П. Ген angora ~ модификатор мутантных генов, нарушающих развитие волосяного покрова у мыши. Пятый съезд Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров, 2009, 21-27 июня, Москва, Россия.

Подписано в печать 26 января 2010 г. Объем 1,0 п.л. Тираж 70 экз. Заказ № 62

Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нестерова, Анастасия Петровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Формирование и рост волос у млекопитающих

1.2. Генетический контроль циклического развития волосяных фолликулов у мыши и человека

1.2.1. Генная регуляторная сеть BMP в контроле развития волосяного фолликула

1.3. Мутантные гены, нарушающие развитие волосяного покрова

1.3.1. Ген hairless (hr) 3 О

1.3.2. Ген angora (Fgf58°-Y)

1.3.3. Ген wellhaarig (we)

1.3.4. Ген waved alopecia (wal)

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Линии мышей, используемые в работе

2.2. Получение двойных и тройных гомозигот

2.3. Изучение шерстного покрова животных

2.3. Гистологические методы

2.4. Полимеразная цепная реакция

2.5. Оценка уровня экспрессии генов методом ПНР в реальном времени

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Изучение взаимодействия мутантных генов angora-Y (Fgf58°~y) и hairless (hr)

3.2. Изучение взаимодействия мутантных генов angora-Y (Fgf5g0'Y) и waved alopecia (wal)

3.3. Изучение взаимодействия мутантных генов angora (Fgf5go'Y), waved alopecia (wal) и wellhaarig (we) у тройных гомозигот

3.4. Изучение циклов волосяных фолликулов у мышей генотипов we/we wal/wal, Fgf5g,)'Y/Fgf5s°'y wal/wal и Fgf5go~Y'/Fgf5go'Y we/we wal/wal

3.5. Анализ экспрессии мРНК генов Втр2 и Idl — маркеров генной регуляторной сети BMP в ходе цикла волосяных фолликулов у мыши

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4. 1. Взаимодействие мутантного гена angora-Y (Fgf5go'Y) с мутантными генами hairless (hr), wellhaarig (we), и waved alopecia (wal)

4. 2. Работа генной регуляторной сети BMP в цикле волосяного фолликула у мышей нормального и мутантного генотипов

4.2.1. Работа генной регуляторной сети BMP в цикле волосяного фолликула у мышей С57/В

4.2.2. Работа генной регуляторной сети BMP в цикле волосяного фолликула у мышей we/we wal/wal и Fgf58°~ 108 Y/Fgf5g0'Ywe/we wal/wal

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие мутантных генов Fgf5go-Y, hr, we и wal, нарушающих развитие и рост волос у мыши"

Актуальность проблемы. Изучение генетического контроля процессов развития волосяного покрова у млекопитающих является актуальной задачей генетики развития, и имеет важное прикладное значение для дерматологии и косметической медицины.

Общее число волосяных фолликулов на теле взрослого человека составляет около 6 млн. Несмотря на то, что у человека волосы уже не выполняют многие из своих изначальных биологических функций, волосы, по-прежнему, имеют большое значение для поддержания нормальной физиологии кожи человека. Патологии роста волос и самообновления клеток волосяных фолликулов часто связаны с этиологией многих серьезных заболеваний кожи, в том числе и онкологических (Patzelt et al., 2008).

Сам волосяной фолликул млекопитающих является уникальным объектом исследований, поскольку каждый волос много раз повторяет свой цикл развития, который включает стадии роста (анагена), регрессии (катагена) и покоя (телогена). Цикл волоса является сложной саморегулиремой системой, и любой сбой в работе этой системы приводит к развитию заболеваний волос. При этом патологическое выпадение (алопеция), так же как и чрезмерный рост волос часто является следствием нарушения смены стадий цикла волосяных фолликулов.

Морфологические изменения и процессы в ходе патологического развития волос хорошо известны и описаны для разных типов мутаций шерстного покрова у животных и многих заболеваний кожи и волос у человека, но только недавно стали выясняться молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе развития, роста и цикла волосяных фолликулов. Волосяные фолликулы, не модифицированные в результате специализации, имеют очень сходное строение у целого ряда видов млекопитающих. Среди млекопитающих, используемых в экспериментальной биологии и медицине, лабораторные мыши (Mus musculus) являются традиционным модельным объектом, генетика которого изучена достаточно хорошо. Несмотря на существование различий в работе циклов роста волосяных фолликулов и различий в строении генов у мыши и человека, мыши являются хорошим объектом для изучения аналогичных процессов работы волосяных фолликулов у человека (Porter, 2003). Особенно ценными являются мутантные линии мышей, являющихся носителями той или иной наследственной аномалии. Многие особенности развития заболеваний волос и кожи у человека были выяснены благодаря изучению мышей, со спонтанными мутациями, нарушающими формирование волосяного покрова.

В настоящее время известно более 100 мутантных генов, вызывающих нарушения роста и развития волос у мыши (Mouse Genome Database, www.infonTiatics.jax.org). Молекулярные функции многих из этих генов остаются плохо изученными. В их числе гены wellhaarig (we), waved alopecia (wal), hairless (hr) и angora (Fgf5g0). Действие мутантного гена we приводит к возникновению волнистого шерстного покрова у гомозиготных мышей, Мутантный ген wal в гомозиготном состоянии также приводит к формированию волнистого шерстного покрова с последующим облысением. Мутантный ген hr обусловливает полное отсутствие волос у гомозигот. И наконец, мутантный ген Fgf5s° в гомозиготном состоянии увеличивает длину всех типов волос.

Несмотря на то, что патологии роста волос развиваются по абсолютно разным причинам, в основе проявляющегося эффекта лежит нарушение работы одних и тех же генных регуляторный сетей, регулирующих физиологию клеточных систем в составе волосяного фолликула. Ключевыми генными регуляторными сетями, функционирующими в коже млекопитающих, являются сети WNT, BMP, SHH, FGF, EGF. Известно, что в цикле волосяного фолликула молекулярные участники WNT, SHH и FGF генных регуляторных сетей определяют характер миграции и пролиферации клеток волосяного фолликула. Генная регуляторная сеть BMP контролирует процессы пролиферации и терминальной дифференцировки клеток-предшественников волоса. Взаимодействие генных регуляторных сетей определяет ритм и хронологию смены стадий цикла фолликулов. Недавно было высказано предположение о существовании зависимости между активностью сети BMP и циклом волосяных фолликулов (Plikus, 2008). Согласно этим данным, снижение уровня экспрессии гена Втр2 в коже у мышей на стадии телогена волосяных фолликулов является необходимым условием для инициации следующего цикла волос.

Особый интерес с прикладной точки зрения представляет возможность направленного изменения экспрессии ключевых участников генных сетей и влияния на цикл волосяных фолликулов с целью усиления или подавления роста волос. Дальнейшие исследования участников основных генных регуляторных сетей, которые определяют судьбу клеток волосяных фолликулов, должны привести к пониманию механизмов регуляции роста волос и созданию методик лечения заболеваний волос качественно нового уровня.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы был анализ взаимодействия мутантных генов hr, Fgf5go'r, we и wal, нарушающих формирование шерстного покрова у мыши. Исходя из цели исследования, были поставлены следующие задачи:

1) Изучить взаимодействие мутантного гена Fgf58°'Y с мутантными генами hr и wal.

2) Изучить взаимодействие мутантных генов Fgf5go'Y, we и wal у тройных гомозигот.

3) Исследовать характеристики циклов волосяных фолликулов у мышей генотипов we/we wal/wal, Fgf5go~Y/Fgf58°~Ywal/wal и Fgf5g0~ Y/Fgf58°~Y we/we wal/wal.

4) Изучить особенности экспрессии мРНК генов Втр2 и Idl— маркеров генной регуляторной сети BMP, у мутантных мышей в период формирования первой и второй генерации волос.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Нестерова, Анастасия Петровна

выводы

1. Мутантный ген Fgf5go'Y является модификатором гена hairless у мыши. Это обусловлено тем, что ген Fgf58°'Y в гомозиготном состоянии существенно удлиняет фазу анагена в цикле волосяных фолликулов, а эффекты гена hr начинают проявляться только при вступлении волосяных фолликулов в стадию катагена.

2. Ген Fgf58°'Y является также модификатором мутантного гена wal. Взаимодействие мутантных генов Fgf58°~Y и wal приводит к раннему развитию алопеции и более продолжительной стадии катагена волосяных фолликулов чем у мышей +/+wal/wal.

3. Ген Fgf58°'Y ослабляет эффект взаимодействия генов we и wal. У тройных гомозигот, Fgf58°'Y/Fgf58°'Y we/we wal/wal, алопеция развивается позже и выражена слабее, а стадия анагена волосяных фолликулов длится значительно дольше, чем у двойных гомозигот +/+we/we wal/wal.

4. Уровни транскрипционной активности генов Втр2 и Idl в коже мышей C57BL/6 зависят от стадии цикла волосяных фолликулов. Временной профиль транскрипционной активности гена Idl повторяет таковой гена Втр2 в цикле второй генерации волос.

5. В коже мышей we/we wal/wal транскрипционная активность генов Втр2 и Idl повышена по сравнению с мышами C57BL/6. Мутантный ген Fgf58°'Y частично нормализует у тройных гомозигот эффект влияния мутантных генов we и wal на транскрипционную активность генов Втр2 nidi.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нестерова, Анастасия Петровна, Москва

1. Бердалиев А. С., Конюхов Б.В. Изучение места действия гена angora Y и его взаимодействия с геном fuzzy-Y у мыши // Извест. Акад. Наук, сер. биол. 1991. №3. С. 352-360.

2. Бландова З.К., Душкин В.А., Малашенко A.M., Шмидт Е.Ф. Линии лабораторных животных для медико — биологических исследований. М.: Наука, 1983. 190 с.

3. Головатенко-Абрамов U.K., Платонов Е.С. Генные регуляторные сети, контролирующие морфогенез волосяного фолликула у мыши // Усп. Соврем. Биол. 2009. Т. 129. №2. С.144- 157.

4. Конюхов Б.В, Мартынова М.Ю, Нестерова А.П. Ген angora -модификатор гена hairless у мыши // Генетика. 2007. Т.43. №2. С. 254 260.

5. Конюхов Б.В, Нестерова А.П., Малинина Н.А. Ген angora ослабляет эффект взаимодействия мутантных генов wellhaarig и waved alopecia у мыши // Генетика. 2009. Т.45. №5. Р.1 4.

6. Конюхов Б.В., Бердалиев А. С. Анализ экспрессии мутантного гена angora Yу мыши // Онтогенез. 1990. Т.21. №5. С.502 - 507.

7. Конюхов Б.В., Куприянов С.Д. Мутантный ген wellhaarig нарушает дифференцировку клеток волосяных фолликулов мыши // Онтогенез. 1990. Т.21. №1.С.56 62.

8. Конюхов Б.В., Малинина Н.А., Мартынова М.Ю. Ген we модификатор гена wal у мыши // Генетика. 2004. Т.40. №7. С.968 - 974.

9. Мартынова М.Ю., Исаев Д. А.,Конюхов Б. В. Анализ действия мутантного wellhaarig гена у химерных мышей // Генетика. 2002. Т.38. №11.Р.1511 — 1517.

10. Малинина Н.А., Конюхов Б.В., Нестерова А.П. Ген angora — усиливает эффекты гена waved alopecia у мыши // Генетика. 2007. Т.43. №11. С. 1571 — 1577.

11. Малшина Н.А., Мартынова М.Ю., Конюхов Б.В. Мутантный ген wal действует в клетках волосяных фолликулов // Онтогенез.1999. Т.ЗО. №5. С. 362-365.

12. Мартынова М.Ю., Исаев Д.А., Конюхов Б.В. Анализ эффектов мутантного гена hairless у химерных мышей // Генетика. 2003. Т.39. № 9. С.1252- 1257.

13. Соколов В.Е., Скурат JI.H., Степанова JI.B. и др. Руководство по изучению кожного покрова млекопитающих. М.: Наука, 1988. 279 с.

14. Сорокина Ю.Д., Бландова З.К. Наследственное изменение кожного и шерстного покрова у мышей BALB/c-wa/Г Биологическая характеристика лабораторных животных и экстраполяция на человека экспериментальных данных: Материалы Всесоюз. конф. М., 1980. С.79 80.

15. Abe J. Bone morphogenetic protein (BMP) family, Smad signaling and Id helix-loop-helix proteins in the vasculature: the continuous mystery of BMPs pleotropic effects // Mol. Cell. Cardiol. 2006. V. 41. P.4-7.

16. Ahmad W., Panteleev A., Christiano A.M. The molecular basis of congenital atrichia in humans and mice: mutations in the hairless gene // Investig. Dermatol.Symp. Proc. 1999. V. 4 (3). P. 240 243.

17. Alexandrescu D.T., Kauffman L., Dasanu C.A. The cutaneous epidermal growth factor network: Can it be translated clinically to stimulate hair growth? // Dermatology on-line. 2008. V. 15 (3).

18. Allen M., Grachtchouk M.,Sheng H., Grachtchouk V., Wang A., Wei, Liu J., Ramirez A., Metzger D., Chambon P., Jorcano J., Dlugosz A. Hedgehog signaling regulates sebaceous gland development (SHH) // Am. J. of Pathol. 2003. V.163 (6). 66 69.

19. Alonso L. andFuchs E. The hair cycle // J. OfCell Science. 2006. V.119. P. 391 -393.

20. Andl Т., Reddy S.T., Gaddapara Т., Millar S.E.WNT signals are required for the initiation of hair follicle development // Dev. Cell.2002.V.2. P.643-653.

21. Balemans W., Van Hul W. Extracellular regulation of BMP signaling in vertebrates: a cocktail of modulators // Dev. Biol. 2002. V. 250. P. 231-250.

22. Blanpain C., Lowry W. E., Geoghegan A., Polak L., Fuchs E. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche // Cell. 2004. V. 118. P. 635 648

23. Blume-Peytavi U., Tosti A., Whiting D. A., Trueb R. M. Hair Growth and Disorders / Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 2008. 1 p.

24. Botchkarev V.A. Bone morphogenetic proteins and their antagonists in skin and hair follicle biology // J.Invest.Dermatol. 2003. V.120 (1).P.36 47.

25. Botchkarev V.A., Botchkareva N.V., Sharov A.A., Funa K., Huber O., et al. Modulation of BMP signaling by noggin is required for inductionof the secondary (nontylotrich) hair follicles //J. Invest. Dermatol.2002.V.l 18. P.3-10.

26. Brooke H. C. J.Hairless mice // J. Heredity. 1926. V.l7. P. 173 174

27. Bryant D.M., Wylie F.G., Stow J.L. Regulation of endocytosis, nuclear translocation, and signaling of fibroblast growth factor receptor 1 by E — cadherin // Mol Biol Cell. 2005. V.16 (1). P.14 23.

28. Cachon-Gonzalez M.B., San-Jose I, Cano A. et al. The hairless gene of the mouse: relationship of phenotypic effects with expression profile and genotype // Devel. Dynam. 1999. V.216. P.l 13 126.

29. Campagna D.R., Custodio A.O., Antiochos В., Cirlan M., Fleming M. Mutations in the serum/glucocorticoid regulated kinase 3 (Sgk3) are responsiblefor the mouse fuzzy (fz) hair phenotype // J. Invest.Dermatol. 2008.V.128.P.730 732

30. Chase H.B., Rauch H., Smith V. W. Critical stages of hair development and pigmentation in the mouse // Physiol. Zool. 195l.V. 24. P.l 9.

31. Chen D., Zhao M., Mundy G.R. Bone morphogenetic proteins // Growth Factors. 2004. V. 22. P.233 41.

32. Chen Y. Smad8 mediates the signaling of the receptor serine kinase // Proc. Natl Acad. Sci.l997.V. 94. P.12938 12943.

33. Clements D.A., Wang J.K., Dionne C.A., Golfarb M. Activation of fibroblast growth factor (FGF) receptors by recombinant human FGF 5 //Oncogene. 1993. V.8. P. 1311-1316.

34. Cotsarelis G. Epithelial stem cells: A folliculocentric view // J. Invest. Dermatol. 2006. V.126. P.1459-1468.

35. Courtois M., Loussouarn G., Hourseau S. Periodicity in the growth and shedding of hair// Br. J. Dermatol. 1996. V.134.P.47-54.

36. Cui C., Schlessinger D.ED A Signaling and Skin Appendage Development // Cell Cycle. 2006.V. 5 (21). P.2477 2483.

37. Davisson M.T. Committee on standardized genetic nomenclature for mice, rules and guidelines for genetic nomenclature in mice // Mouse Genome. 1994. V.92 (2). P. vii xxiii.

38. Dickie M.M. New mutations: angora // Mouse News Letter. 1963. N.29. P.39.

39. Ellis J.A., Scurrah K.J., Cobb J.E., Zaloumis S.G., Duncan A.E., Harrap S.B. Baldness and the androgen receptor: the AR polyglycine repeat polymorphism does not confer susceptibility to androgenetic alopecia // Hum Genet. 2007. V.121 (3-4). P.451 -457.

40. Falcon-Perez J., Dellangelica E. The Pallidin (Pldn) Gene and the Role of SNARE Proteins in Melanosome Biogenesis // Pigment. Cell. Res. 2002. V.15. P. 82-86.

41. Ferby /., Reschke M., Kudlacek O., Knyazev P., Pante G., Amann K, Sommergruber W., Kraut N., Ullrich A., Fassler R., Klein R. Mig6 is a negative regulator of EGF receptor-mediated skin morphogenesis and tumor formation // Nat Med. 2006.V.12 (7). P.862.

42. Freeman T.C.; Dixon A.K; Campbell E.A.; Tait T.M.; Richardson P.J.; Rice KM.; Maslen G.L.; Metcalfe A.D.; Streuli C.H.; Bentley D.R Expression Mapping of Mouse Genes //MGI Direct Data Submission. 1998.

43. Fuchs E. Scratching the surface of skin development // Nature. 2007. V. 445 (7130). P.834-842.

44. Fuchs, E., and Horsley, V. More than one way to skin. Genes Dev. 2008. V. 22. P. 976-985.

45. Gat U., DasGupta R., Degenstein L., Fuchs E. De Novo hair follicle morphogenesis and hair tumors in mice expressing a truncated beta catenin in skin // Cell. 1998. V. 95. P. 605 - 614.

46. Ghazizadeh S., Taichman L.B. Multiple classes of stem cells in cutaneous epithelium: a lineage analysis of adult mouse skin // EMBO J. 2001.V.20 (6). P.1215 -22.

47. Gilboa L, Nohe A, Geissendorfer T, Sebald W, Henis YI, Knaus P. Bone morphogenetic protein receptor complexes on the surface of live cells: a new oligomerization mode for serine/threonine kinase receptors. Mol Biol Cell. 2000. V. 11. P. 1023-1035.

48. Godwin AR., Capecchi MR. Hox cl3 mutant mice lack external hair // Genes. Dev. 1998.V.12. P.ll-20.

49. Graff R. J., Simmons D., Meyer J., Martin-Morgan D., Kurtz MAbnormal bone production associated with mutant mouse genes pa and we // J. of Heredity. 1986. V. 77 (2). P. 109 113.

50. Green M.C. Catalog of mutantgenesand polymorphic loci//Genetic variants and strains of the laboratory mouse. / Eds. M.F. Lyon, A.G. Searle. N.Y.: Oxford Univ.Press. 1989. P. 12-404.

51. Hammerschmidt M., Brook A., McMahon A. P. The world according to hedgehog // Trends Genet. 1997. V. 13. P. 14 21.

52. Hebert J.M., Rosenquist Т., Gotz J., Martin G.R. FGF5 as regulator of the hair growth cycle: Evidence from targeted and spontaneous mutations // Cell. 1994. V.78.P.1017- 1025.

53. Heisenberg C. P., Tada M., Ranch G. J., Saude L., Concha M. L., Geisler R., Stemple D. L., Smith J. C., Wilson S. W. Wntl 1 mediates convergent extension movements during zebrafish gastrulation // Nature. 2000. V. 405. P. 76 81.

54. Hertwig P. Neue Mutationen und Koppelungsgruppen bei der Hausmaus // Z. Indukt. Abstammungs Vererbungsl. 1942. B.80. S.220 - 246.

55. Hruska K, Mathew S, Saab G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification // Circ.Res. 2005. V.97. P. 105-114.

56. Huber О., Кот R., McLaughlin J., Ohsugi M., Herrmann B. G., Kemler R. Nuclear localization of beta-catenin by interaction with transcription factor LEF — 1 // Mech. Dev. 1996. V. 59. P. 3 10.

57. Huelsken J., Vogel R., Erdmann В., Cotsarelis G., Birchmeier W. beta-Catenin controls hair follicle morphogenesis and stem cell differentiation in the skin //Cell. 2001. V. 105. P. 533-545.

58. Kawabata M. Identification of type I receptors for osteogenic protein 1 and bone morphogenetic protein - 4 // J. Biol. Chem. 1995. V. 269. P.16985 - 16988.

59. Kawano M. Comprehensive analysis of FGF and FGFR expression in skin: FGF 18 is highly expressed in hair follicles and capable of inducing anagen from telogen stage hair follicles // J. Invest. Dermatol. 2005. V.124. P.877 -885.

60. Kim I., Gormanfi J., Parkll S., Chungll S., Steinert P. The deduced sequence of the novel protransglutaminase E (TGase3) of human and mouse // J. of Biol. Chem. 1993. V.268 (17). P.12682 12690.

61. Kligman A.M. The human hair cycle // J. Invest. Dermatol. 1959. V.33. P.307 -316.

62. Kulessa Н., Turk G., Hogan B.L. Inhibition of Bmp signaling affects growth and differentiation in the anagen hair follicle // EMBO J. 2000. V.l9. P. 66646674.

63. Kwabi-Addo В., Ozen M., Ittmann M. The role of fibroblast growth factors and their receptors in prostate cancer // Endocr. Relat.Cancer. 2004. V.ll (4). P.709 724.

64. Lee D., Cross S.H., Strunk K.E., Morgan J.E., Bailey C.L., Jackson I.J., Threadgill D. W. Wa5 is a novel ENU-induced antimorphic allele of the epidermal growth factor receptor // Mamm Genome. 2004. V.l5 (7). P.525 536.

65. Lin K., B15lChudova D., Hatfield W., Smyth P., Andersen B. Identification of hair cycle-associated genes from time-course gene expression profile data by using replicate variance // PNAS. V. 101 (45).P. 15955-15960.

66. LinkR.E., Paus R., Stenn K.S. et al. Epithelial growth by rat vibrissae follicles in vitro requires mesenchymal contact via native extracellular matrix // J.Invest. Dermatol. 1990. V.95. P.202 207.

67. Lowry W. E., Blanpain C., Nowak J. A., Guasch G., Lewis L., Fuchs E. Defining the impact of beta catenin/Tcf transactivation on epithelial stem cells // Genes Dev. 2005. V. 19. P. 1596 - 1611.

68. Luetteke N.C., Phillips H.K., Oiu Т.Н. et al. The mouse waved 2 phenotype results from a point mutation in the EGF receptor tyrosine kinase // Genes and Develop. 1994. V.8. N 4. P. 399 - 413.

69. Lyons K.M., Pelton R. W., Hogan B.L. Patterns of expression of murine Vgr — 1 and BMP 2a RNA suggest that transforming growth factor-beta-like genes coordinately regulate aspects of embryonic development // Genes Dev. 1989. V.3 (11). P.1657 — 68.

70. Ma L., Liu J., Wu T. et al. «Cyclic alopecia» in Msx2 mutants: defects in hair cycling and hair shaft differentiation // Development. 2003. V.130. P. 379 389.

71. Мак K.K., Chan S.Y. Epidermal growth factor as a biologic switch in hair growth cycle IIJ. Biol. Chem. 2003. V.278. P. 26120-26126.

72. Mann G.B. , Fowler K.J., Gabriel A. et al. Mice with a null mutation of the TGFa gene have abnormal skin architecture, wavy hair and curly whiskers and often develop corneal inflammation // Cell. 1993. V. 73. P. 249 261.

73. Matsuzaki T. Technologies for hair reconstruction and their applicability for pharmaceutical research // Develop. 2003. V. 130. P. 379 389.

74. McGrath JA, Wessagowit V. Human hair abnormalities resulting from inherited desmosome gene mutations // Keio J Med. 2005.V.54 (2).72 9.

75. Mill P., Mo R, Fu H., Grachtchouk M., Kim P. C., Dlugosz A. A., Hui С. C. Sonic hedgehog-dependent activation of GH2 is essential for embryonic hair follicle development // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 282 294.

76. Millar Sarah E. Molecular mechanisms regulating hair follicle development // J. of Invest. Dermatol. 2002. V.l 18. P. 216 225.

77. Moraitis A. N., Giguere V., Thompson С. C. Novel mechanism of nuclear receptor corepressor interaction dictated by activation function 2 helix determinants.// Mol. Cell. Biol. 2002. V. 22. P. 6831 6841

78. Morris, R. J., Tryson, K. A. Wu K. Q. Evidence that theepidermal targets of carcinogen action are found in the interfollicular epidermis of infundibulum as well as in the hair follicles // Cancer Res. 2000. V.60. P. 226 229.

79. Mouse Genome Database, www.informatics.jax.org

80. Moustakas A., Heidi C.H. From mono-to oligo-Smads: the heart of the matter in TGFp signal transduction // Genes Dev. 2002. V. 16. P. 67 871.

81. Moustakas A., Souchelnytskyi S., Heldin C.H. Smad regulation in TGF beta signal transdaction //J. Cell. Sci. 2001. V.l 14(24). P.4359-4369.

82. Nadeau J.H. Modifier genes in mice and humans // Nat. Rev. Genet. 2001. V.2.P.165 174.

83. Nadeau J.H.Genetics. Modifying the message // Science. 2003. Y.301 (5635). P.927 — 928.

84. Nakamura M., Sundberg J.P., Paus R. Mutant laboratory mice with abnormalities in hair follicle morphogenesis, cycling and/or structure: annotated tables // Exp. Dermatol. 2001. V.10. P. 369 390.

85. National Center for Biotechnology Information (NCBI)

86. Negin P., Mohney R., Dunn S., Das M., Scappini E., О'Bryan J. Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling // Mol. Pharm. 2006. V. 70 (5). P.1643-1653.

87. Nehls M., Pfeifer D., Schorpp M., Hedrich H., Boehm T. New member of the windeg-helix protein family disrupted in mouse and rat nude mutations // Nature. 1994. V. 372. P. 103-107.

88. Okada T. The critical roles of serum/glucocorticoid-regulated kinase 3 (SGK3) in the hair follicle morphogenesis and homeostasis // Am. J. of Pathol. 2006. V.168. P.1119- 1133.

89. Ota Y., Saitoh Y., Suzuki S., Ozawa K, Kawano M., Imamura T. Fibroblast growth factor 5 inhibits hair growth by blocking dermal papilla cell activation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 290.P.169-176.

90. Ozawa K, Suzuki S., Asada M. An alternatively-spliced FGF — 5 mRNA is abundant in brain and translates into a partial agonist/antagonist for FGF — 5 neurotrophic activity // Biol. Chem. 1998. V.273. P. 29262 29271.

91. Panteleyev A. A., Botchkareva N. V., Sundberg J. P., Christiano A. M., Paus R. The role of the hairless (hr) gene in the regulation of hair follicle catagen transformation//Am. J. Pathol. 1999. V.155. P.159 171.

92. Patzelt A., Knorr F., Blume-Peytavi U., Steny IV., Lademann J. Hair follicles, their disorders and their opportunities // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2009. V.71(2). P. 173-180.

93. Paus R., Cotsarelis G. The biology of hair follicles // N. Engl. J. Med. 1999. V. 341. P. 491-497.

94. Paus R., FoitzikK. Conclusions and Perspectives. In search of the "hair cycle clock": a guided tour // Differentiation. 2004. V. 72. P.489-511.

95. Pennycuik P.R., Raphael K.A. The angora locus (go) in the mouse: hair morphology, duration of growth cycle and site of action // Genet.Res. 1984. V.44. P.283 -291.

96. Per a E. M, De Robertis E. M. A direct screen for secreted proteins in Xenopus embryos identifies distinct activities for the Wnt antagonists Crescent and Frzb -1И Mech. Dev. 2000. V. 96. P. 183 195.

97. Peters E., Botchkarev V.A. Neuroimmunologyof hair follicle / Blume — Peytavi U., Tosti A., Whiting D. A., Trueb R. M. Hair Growth and Disorders / Springer Verlag Berlin Heidelberg. 2008. p. 41.

98. Peters J., Selley R. L., Cocking Y. Mouse gene list 1997 // Mouse genome. 1997. V.95.N2.P. 193-466.

99. Petiot A., Conti F., Grose R., Revest J., Hodivala-Dilke K., Dickson С. A crucial role for Fgfir2 Illb signalling in epidermal development and hair follicle patterning // Development.2003. V. 130. P. 5493 - 5501

100. Philpott M.P., Kealey T. Effects of EGF on the morphology and patterns of DNA synthesis in isolated human hair follicles // J. Invest. Dermatol. 1994. V.102. P.186- 191.

101. Plikus M. V., Mayer J. A., de la Cruz D., Baker R. E., Maini P. K., Maxson R., Chuong C.-M. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration // Nature. 2008. V. 451. P. 340 345.

102. Porter R. Mouse models for human hair loss disorders // J. Anat. 2003. V.202. P.125-131.

103. Powers C. J.,McLeskey .S W., Wellstein A. Fibroblast growth factors, their receptorsand signaling // Endocrine-Related Cancer. 2000. V.7. P. 165-197

104. Redies C., Vanhalstb K., and Royb F. d-Protocadherins: unique structures and functions // Cell. Mol. Life Sci. 2005. V.62. P. 2840-2852.

105. Reilly G.C., Golden E.B., Grasso-Knight G., Leboy ^.^Differential effects of ERK and p38 signaling in BMP 2 stimulated hypertrophy of cultured chick sternal chondrocytes // Cell. Commun. Signal. 2005. V.3 (1). P.3.

106. Rendl M., Lewis L., Fuchs E.A. Molecular dissection of mesenchymal-epithelial interactions in the hair follicle // PLoS Biology. 2005. V.3 (11). P. 19101924.

107. Rendl M., Polak L., Fuchs E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle inductive properties // Genes Dev. 2008. V.22 (4). P.543 - 57.

108. Reynolds A.J., Lawrence C.M., Jahoda C.A. Human hair follicle germinative epidermal cell culture // J Invest Dermatol. 1993. V.l01 (4). P.634 638.

109. Rodbell M. Signal transduction: evolution of an idea // Environ Health Perspect. 1995. V.103 (4). P. 338 45.

110. Rosenqist T.T., Martin G. Fibroblast growth factor signalling in the hair growthcycle: expression of the fibroblast growth factor receptor and ligand genes in the murine hair follicle // Developmental Dynamics. 1996. V. 205. P.379 386.

111. Sato N., Leopold P. L., Crystal R. G. Induction of the hair growth phase in postnatal mice by localized transient expression of Sonic hedgehog // J. Clin. Invest. 1999. V. 104. P. 855 864.

112. Schmidt-Ullrich R., Paus R. Molecular principles of hair follicle induction and morphogenesis // Bioessays. 2005. V.27 (3). P.247 61.i 130. Schmidt-Ullrich R., Tobin D.J., Lenhard D., Schneider P., Paus R.,

113. Scheidereit C. NF-kappaB transmits Eda Al/EdaR signalling to activate Shh and!cyclin D1 expression, and controls post initiation hair placode down growth // Development. 2006. V. 133 (6). P.1045 - 57.

114. Schmitt, A., Rochat, A., Zeltner, R., Borenstein, L., Barrandon, Y., Wettstein, F. O., Iftner, T. The primary target cells of the highrisk cottontail rabbit papillomavirus colocalize with hair follicle stem cells // J. Virol. 1996.V. 70. P.1912- 1922.

115. Schneider M, Schmidt-Ullrich R., Paus R. The Hair Follicle as a Dynamic Miniorgan // Current Biology. 2009. V. 19. P. 132-142.

116. Schweizer J., Langbeinb L., Rogersa M., Hair follicle-specific keratins and their diseases // Experimental Cell Research. 2007. V.313. P.2010 2020.

117. Sheldahl L., Park M., Malbon C., Moon R. Protein kinase С is differentially stimulated by Wnt and Frizzled homologs in a G-protein-dependent manner // Curr. Biol. 1999. V. 9. P. 695 698.

118. Sorokina I.D. Blandova Z.K. Waved alopecia. Mouse News Lett. 1985. V.73. P.23.

119. Stenn K.S., Paus R. Control of hair follicle cycling // Physiol. Rev. 2001. V.81. P.449 494.

120. Sundberg J.P. Handbook of mouse mutations with skin and hair abnormalities: animal models and biomedical tools / CRC Press. Boca Raton. 1994.

121. Suzuki S., Ota. K, Ozawa K.Jmamura T. Dual mode regulation of hair growth cycle by two Fgf products gene // J. Invest. Dermatol. 2000. V.l 14. P.456 463.

122. Thesleff I. Epithelial-mesenchymal signalling regulating tooth morphogenesis //J.Cell. Sci. 2003. V. 116. P. 1647-1648.

123. Tobin D. Biology of Hair Follicle Pigmentation / Blume — Peytavi U., Tosti A., Whiting D. A., Trueb R. M. Hair Growth and Disorders / Springer Verlag Berlin Heidelberg. 2008. p. 51.

124. Urist M.R. Bone formation by autoinduction // Science. 1965. V. 150 V. 893 -899.

125. Viti J., Gulacsi A., Lillien L. Wnt regulation of progenitor maturation in the cortex depends on Shh or fibroblast growth factor 2 // J. Neurosci. 2003. V. 23. P. 5919-5927.

126. Vog tA.K., McElwee J., Blume-Peytavi U. Biology of the Hair Follicle / Blume Peytavi U., Tosti A., Whiting D. A., Trueb R. M. Hair Growth and Disorders / Springer - Verlag Berlin Heidelberg. 2008. p. 1.

127. Wang J., Shackleford G. M. Murine WntlOa and WntlOb: cloning and expression in developing limbs, face and skin of embryos and in adults // Oncogene. 1996. V. 13. P. 1537 1544.

128. Whiting D.A. Possible mechanisms of miniaturization during androgenetic alopecia or pattern hair loss // J Am Acad Dermatol. 2001. V.45 (3). P.81 86.

129. Wong M. L., Medrano J.F. Real-time PCR for mRNA quantitation // Biotechniques. 2005. V.39 (1). P.75 85.

130. Wordinger R., Clark A. Bone morphogenetic proteins and their receptors in the eye // Exp. Biol. Med. 2007. V.232. P.979-992

131. Wozney, J.M. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities // Science. 1988. V. 242. P. 1528 1534.

132. Wu Z, Zhang L., Yabe Т., Kuberan В., Beeler D., Love A., Rosenberg R. The involvement of heparan sulfate (HS) in FGF1/HS/FGFR1 signaling complex // J. Biol. Chem. 2008. V.278. P.17121-17129.

133. Xian W., Schwertfeger K., Vargo-Gogola Т., Rosen J. Pleiotropic effects of FGFR1 on cell proliferation, survival, and migration in a 3D mammary epithelial cell model // J. Cell. Biol. 2005. V. 171(4). P.663-673.

134. Ying Q., Nichols J., Chambers I., Smith A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self renewal in collaboration with STAT3 // Cell. 2003. V.l 15. P. 281-292.

135. Yuhki Munehiro BMPR1A signaling is necessary for hair follicle cycling and hair shaft differentiation in mice // Development. 2004. V. 131. P. 1825 1833.

136. Zarach J. M., Beaudoin G. M. J. Ill, Coulombe P. A., Thompson С. C. The со repressor hairless has a role in epithelial cell differentiation in the skin // Development. 2004. V. 131. P. 4189 - 4200.

137. ZhanX., Bates В., HuX., Goldfarb M. The human FGF 5 ongocen encodes a novel protein relates to fibroblast grouth factors // Mol. Cell. Biol. 1988.V.8. P. 3487-3495.

138. Zhang J., Fang S., Wangw C. A. Novel nonsense mutation and polymorphisms in the mouse hairless gene // J. Invest. Dermatol.2005.V.124. P. 1200 -1205.

139. Zocchi L. Identification of Transglutaminase 3 Splicing Isofonns // J. of Invest.Dermatol. 2007. V.127. P. 1791-1794.

140. Zwijsen A., Verschueren K., Huylebroeck D. New intracellular components of bone morphogenetic protein/Smad signaling cascades // FEBS Lett. 2003. V.546. P. 133-139.