Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и анализ синаптофизин-дефицитных мышей

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Получение и анализ синаптофизин-дефицитных мышей"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи ) ь I-,1 УДК 591.88:599.323.4

1 о >' ' Г; 1Г.Г--1

I 0 Ы;.! ):-{;!/

ЭШКИНД ЛЕОНИД ГИРШЕВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ СИНАПТОФИЗИН-ДЕФИЦИТНЫХ МЫШЕЙ

( 03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1997 год

г

а выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета еского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова и в ,ении клеточной биологии Немецкого онкологического центра, г. »ельберг, ФРГ.

кучный руководитель - доктор медицины, профессор Р.Е.Лёйбе

Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор

А.В.Зеленин

доктор медицинских наук, профессор А.А.Ставровская

Ведущее учреждение - Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится "У/Г" МС/3. в — на заседании специализированного совета Д.053.05.68 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу : Москва, 119899, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

м-1

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " 5" С1 Г) П>е/1 $ 1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е.Н.Калистратова

Актуальность проблемы. В течение последних нескольких лет широкое распространение получил метод генного замещения, позволяющий получать мутантных мышей, в которых полностью отсутствует определенный генный продукт. Этот метод основан на генетической модификации эмбриональных стволовых ( ЭС ) клеток мыши путем гомологичной рекомбинации. Полученные таким образом животные являются удобными объектами при изучении самых разнообразных биологических процессов, а также, могут являтся хорошей моделью различных генетических болезней человека.

Одной из важных проблем клеточной биологии является изучение механизмов мембранно-ассоциированного экзоцитоза, который структурно и функционально высоко консервативен во всех эукариотических клетках от дрожжей до нейронов ( Ferro-Novick and Jahn, 1994 ). Хотя экзоцитоз имеет место в практически каждой клетке, определенные ткани высоко специализированы для такой функции. В первую очередь, это нервные клетки, где информация передается из одной клетки в другую за счет секреции трансмедиатора в синапсах. До секреции нейротрансмедиатор хранится в первичных клеточных органеллах - синаптических пузырьках, которые сосредоточены в нервных окончаниях. Синаптические пузырьки проходят определенный цикл преобразований, ключевым событием которого является экзоцитоз через мембранное слияние, осуществляемый в результате ■ каскада межбелковых взаимодействий ( Sudhof, 1995 ).

Синаптофизин ( СФ ) является одним из основных трансмембранных белков синаптических пузырьков. Интерес к СФ был вызван тем, что с одной стороны он хорошо изучен молекулярно, широко распространен в нервных и нейроэндокринных тканях. Кроме того, имеется несколько сходных по структуре белков ( синаптопорин, синаптогирин и пантофизин). С другой стороны, возможные функции СФ до сих пор являются продетом предположений. Так, ряд косвенных фактов указывают на участие СФ в 0&pa3üsa;::v.« синаптических пузырьков (Leube et all., 1988; Troyanovsky et all., 1993; Leube et all., 1994 ), мб^бра^ных пор ( Thomas et all., 1988 ) и регуляцию экзоцитоза пузырьков ( Sollner et all., 1993.; Edelmann et all., 1995; Washborne et all., 1995 ), т.е. осуществление синаптической передачи ( Adler et all., 1992 ).

В связи с этим актуальным является получение СФ-дефицитных мышей, что может помочь в изучении возможных функций СФ. Цель и задачи работы. Основная цель данной работы заключалась в изолировании линий ЭС клеток, в которых ген СФ был "поломан" в результате гомологичной рекомбинации, а также, если, это не сопряжено с летальным эффектом, в получении мутантных мышей во всех клетках которых отсутствует продукт гена СФ. Были поставлены следующие задачи:

1) получить геномный фрагмент ДНК 5'- области гена СФ ( около 10 кб );

2) методами генной инженерии сконструировать замещающий вектор для гомологичной рекомбинации;

3) получить клоны ЭС клеток, содержащие мутантный ген СФ;

4) получить химерных мышей с использованием мутантных ЭС клонов;

5) методами генетического скрещивания получить мутантных мышей, содержащих нулевую аллель гена СФ;

6) доказать, что в мутантных мышах полностью отсутствует продукт гена СФ;

7) описать основные фенотипические свойства СФ-дефицитных мышей;

8) изучить экспрессию других синаптических белков, а также родственных белков в случае отсутствия СФ;

9) методами иммунофлуоресцентной и электронной микроскопии изучить нервные и нейроэндокринные ткани в СФ-дефицитных мышах;

10) исследовать синаптическую проводимость в СФ-дефицитных мышах. Научная новизна работы Впервые получены мутантные мыши, в которых ген СФ был разрушен методом гомологичной рекомбинации в ЭС клетках* Показано, что эти мутантные мыши являются СФ-дефицитными, т.е. СФ полностью не экспрессируется а гомозиготных мышах.

Впервые показано, что:

1) СФ-дефицитные мыши обладают нормальной жизнеспособностью и плодовитостью;

2) отсутствие СФ не приводит к заметным изменениям структуры нервных и нейроэндокринных тканей у СФ-дефицитных мышей;

3) не происходит заметных изменений в уровне экспрессии других синаптических белков;

4) нет заметных компенсанаторных изменений в экспрессии родственных белков;

5) отсутствие СФ не приводит к нарушению синаптической передачи. Сделан вывод, что СФ не является жизненно важным для выполнения основных синаптических функций, что опровергает существовавшие ранее предположения.

Научно-практическое значение работы. Полученные нами СФ-дефицитные мыши являются удобной моделью для изучения тонких функций СФ. В настоящее время проводятся исследования поведенческих изменений у СФ-дефицитных мышей, а также аксон-дендритного роста в первичных культурах нервных клеток. СФ-дефицитные мыши используются в скрещиваниях с другими мутантными мышами: трансгенными мышами тканеспецифически экспрессирующими мутантные формы СФ, а также, мышами дефицитными по другим родственным СФ белкам ( пантофизин, синаптопорин). Предполагается

использование СФ-дефицитных мышей для получения кДНК библиотеки мыши с целью обнаружения других родственных СФ белков. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на конференции Немецкого анатомического общества ( Wurzburg, 10.1994 ), конференции Американского общества клеточных биологов ( Washington, 12.1995 ). Материалы диссертации докладывались на семинаре кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ (9.1996 ). По материалам диссертации опубликовано 6 статей.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и обсуждения выводов. Работа представлена на 117 стр. и состоит из 1 таблицы, 7 рисунков и 8 фотографий. Список литературы включает 203 наименований работ. Материал и методы исследований

Для изолирования 5'- области мышиного гена СФ был осуществлен скрининг геномной библиотеки в бактериофаге лямбда Fix II из мышей линии SV129 ( Stratagene, San Diego ) с использованием меченой пробы Bam Hl/Hind III крысиного СФ кДНК клона pSR 5. Фаговую ДНК выделяли по методу Lehrach et al.( 1988 ). Выделение ДНК из плазмид осуществляли в соответствии с протоколом для Mini, Midi, Maxi Kit ( Qiagen Gmbh, Germany ). Субклонирование фрагментов ДНК в плазмидных векторах осуществляли по протоколам, описанным в руководстве по молекулярному клонированию ( Sambrook et al., 1989 ).В работе испильсс"эяи следующие бактериальные штаммы: Е. coli DH 5а; Е. coli TG-1; Е. coli shure; Е. coli XL2-Blue. A laiOKO плаямиды: Bluescript II SK +/- , p72, pGEM 7(neo), pBT/SP-TK .

Культивирование эмбриональных стволовых клеток мыши ( R I, получены на пассаже 9 ) проводили на монослое из митомицин-инактивированных первичных эмбриональных фибробластах ( ПЭФ ) мыши (13-16 день беременности ) в среде ДМЕМ ( 4,5 гр./л глюкозы, Flow Labs ) содержащей 0,1 мМ дополнительных аминокислот ( ЮОхсток, Gibco ), 1 мМ пирувата натрия ( ЮОхсток, Gibco ), 10 мкМ бетта-меркаптоэтанола ( Sigma ), 2 мМ L-глютамина ( ЮОхсток, Gibco ), 20% эмбриональной коровьей сыворотки ( ЭКС ), инактивированной нагреванием , 1000 ед./мл фактора ингибирующего дифференцировку LIF ( Gibco BRL ). Среду меняли каждый день и пересевали каждый второй день. Трансфекцию ЭС клеток проводили методом электропорации ( 240 V, 500мкФ. Bio-Rad Lab, Germany ). Для позитивной селекции использовали

G418 ( 300 мкг/мл, Gibco ), а для негативной gangcyclovir ( 2мМ, Cymogen, Sytex, Germany ).Заморозку ЭС клонов осуществляли в 90% ЭКС + 10% ДМСО.

Геномную ДНК из ЭС клонов выделяли в лизисном буффере: 100 мМ Трис-HCI, pH 8,5; 5 мМ ЭДТА, 0,2% ДСН, 200 мМ NaCI и 100 мкг/мл протеиназы К ( 10 мг/мл сток, Sigma ). Перенос ДНК с агарозного геля ( 0,7% ) на нейлоновый фильтр ( Biodyne В, Pall ) проводили по стандартной методике в 0,4 M NaOH. Для радиоактивного мечения использовали « Р dCTP: 3000 Ci/мМ ( Amersham-Buchler ). Мечение проводили по методу "рассеянной" затравки.

Все эксперименты с мышами проводились в беспатогенных условиях, при постоянном световом цикле ( светлый период с 6 утра до 6 вечера ). Анестезию проводили путем внутрибрюшной инъекции 0,2%/ 10 гр. веса раствора Rompun и Ketanet ( Bayer ). В работе использовались мыши линии C57BL/6 для получения бластоцист и рэндомбредные мыши NMR I. Химерных мышей получали методом инъекции 10-15 ЭС клеток в полость бластоцисты, с использованием инвертированного микроскопа Zeiss IM 35 на микроманипуляторе Leitz ( Fa. Leitz, Wetzlar ).

Геномную ДНК из кусочков мышиных хвостов выделяли по стандартной методике в лизисном буффере: 50 мМ Трис - HCl, pH 8,0; 100 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCI, 1% ДСН, 0,5 мг/мл протеиназы К. Выделение РНК из тканей осуществляли в гуанидин изоцианатном буффере с помощью гомогенизатора Politron. Poly-A-PHK приготовили методом аффинной хромотографии с помощью oligo( dt )- целлюлозы ( Pharmacia, Sweden ). Электрофорез РНК проводили в агарозном геле, содержащем формальдегид. Переносили РНК на нейлоновую мембрану Biodyne А ( Pall, Dreieich) путем каппилярного переноса в 10x SSC. Для гибридизации использовали буффер содержащий 50% формамида, 5xSSC, 15 мМ цитрат натрия, 5 х Денхарт, 1% ДСН, 100 мкг/мл дрожжевой т-РНК. В качестве пробы к СФ использовали Eco R I вставку в pSR 5, содержащую кДНК крысиного СФ гена. Для получения пробы к синаптопорину получили antisens transcript мышиного кДНК клона рР02. Для обнаружения мРНК пантофизина использовали рибопробу, полученную с помощью Т7-РНК полимеразы из клона pPhM 1 содержащего кДНК мышиного пантофизина. Для выделения белков из тканей мозга использовали растворяющий белки буффер: 2% ДСН, 100 ДТТ, 60 мМ Трис-HCI, 0,001% бромфеноловый голубой, 10% глицерол. Большие фрагменты ДНК разрушали добавлением бензоназы ( Merck, Germany ).

Белки разделяли электрофорезом в ДСН-полиакриламидном геле, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и инкубировали с антителами по методу, как это описано в статье Leube ( 1994 ).

Для приготовления синаптосом, мозг гомогенизировали с помощью стекло-тефлоноеого гомогенизатора в буффере : 320 мМ сахарозы, 4 мМ Хепеса ( pH 7,3 ),0,2 мМ фенилметилсульфанилфлюоридина, 1 мкМ пепстатина. Центрифугировали при 1000g Юминут. Надосадочную жидкость повторно центрифугировали при 12000 g 15 минут, и осадок рессуспензировали в буффере для гомогенизации и центрифугировали при 12000g 15 минут.

Иммуногистология. Криосрезы ( 5 мкм ) фиксировали в 2% формальдегиде, обрабатывали 0,1% раствором сапонина 10 минут и инкубировали в течение 10 минут в СФБ с добавлением 1% козлиной сыворотки и 50 мМ хлорида аммония. Альтернативно, криосрезы фиксировали в холодном ацетоне при -20 ° С. Вторые антитела были сцеплены либо с Texas Red, либо с cyanine Су2 ( Dianova, Hamburg, Germany; Biotrend, Köln, Germany ). Электронная микроскопия и иммунно-электронная микроскопия выполнялась как описано в статье Wiedenmann and Franke (1985 ).

4. Результаты собственных исследований.

4.1. Клонирование мышиного гена синаптофизина и приготовление конструкции для таргетинга.

Поели 3-х рзуи.лов скрининга было получено 4 фаговых клона, один из которых ( обозначенный XGSM 1 ) англизировался подробно. Была составлена рестриктная карта и проведено сиквенирование отдельных участков. Было определено , что этот фрагмент содержит три первых экзона СФ и прилегающих с 5'-конца приблизительно 12,5 кб фланкирующих последовательностей. Положение интрон/экзон участков было идентичным , как это определено для крысиного и человеческого синаптофизина. Из этого клона , конструкция для таргетинга была сконструирована следующим образом: 5,2-кб Eco RI фрагмент, содержащий 5' конец СФ был выделен из фага XGSM I и вставлен в Bluescript вектор ( плазмида pGSM 10 ). 500 нуклеотидный Spe l/Kpn I фрагмент, содержащий 2-ой экзон с прилегающеми интронными последовательностями был субклонирован из pGSM 10 в Bluescript ( pGSM 4 ). В эту плазмиду была сделана 1,8 кб вставка Eco R I /Hind III u гена устойчивости к генетицину под PGK промотора ( из плазмиды pGEM

7 Neo ) путем лигирования по тупым концам в сайт Pst I, находящийся во втором экзоне СО. Таким образом была получена плазмида pGSM 11. Паралельно, была сконструирована плазмида pGSM 18 путём вставки 3,2 кб фрагмента Eco R l/SpH I из pGSM 10 в вехтор pSP72. Затем вставка 2.5 кб Spe I/Kpn I из pGSM 11 была переставлена с 500 нп сегментом клона pGSM 18, что дало плазмиду pGSM 19. Одновременно, 5'- локализованый 5,25 кб Eco Я I Фрагмент был выделен из фагого клона GSM 1 и вставлен в правильной ориентации в pGSM 19 ( плазмида pGSM 20 ). Затем, 11 кб Cía l/Hind Шфрагмент был перенесён в pBT/SP-TK ( Хва^1 ), которая содержит ген тимидин киназы простого герпеса под контролем PYF'41 энхансера и тимидин киназного промотора. Таким образом была получёна окончательная плазмида pGSM 21. изображеная на фото 1а. Этот зектор содержит уникальный Cía I сайт. Вектор для таргетинга содержит 7,5 кб гомологии с геном СФ с 5'- конца и только 700 нп с 3'- конца.

fc'.yUI ttuKI Suhl ti Jlil

__T T ■■ iu tt'M T__

i *T

I T T

Murine SynJutQutv/ъш G«n*

Г jrije'.iny ton'iU'wt.'.

neu — r<

ECJSI ttoHi Sum UoiM

t_i_t t

—1 » 1 —ж---П- — - Htcuntutneu byruütaühyjlii <

IVhr.

i i

bunl UuHl

Фото 1а-с

а. Карта мышиного гена синаптофизина с расположенными на 5'-конце первыми тремя экзонами £•/, ЕИ и НШ ( чёрные прямоугольники), конструкция для таргетинга, и измененный генный локус после гомологичной рекомбинации. Последовательности гена устойчивости к неомицину обозначены волнистой линией, ген тимидин киназы (ТК ) , используемый для негативной селекции показан справа на конструкции для таргетинга ( направление транскрипции указано стрелками для обоих генов ). Позиции важных рестрикционных сайтов обозначены. Проба, используемая для Саузерн блот анализа, находящаяся вне конструкции обозначена также. Прерывистой линией показаны соседние к гену области.

S

4.2. Получение СФ-дефицитных ЭС клеточных клонов и мышей.

ЭС клетки были разморожены на 11 пассаже и росли на митомицин инактивированом фидере из мышиных фибробластов. В результате 2-х независимых экспериментов по электропорации было получено 600 клонов. В среднем, в ходе позитивно-негативной селекции была получена 7 кратная редукция по сранению с позитивной селекцией. Каждый из 600 клонов был заморожен и из части клеток была выделена ДНК. Клоны анализировали гибридизацией по Саузерну с использованием 1,8 кб ЭрН 1/Есо 131 фрагмента из рвЭМ 10. Этот фрагмент гибридизовался либо с 5кб фрагментом в диком типе, либо 7-кб фрагментом в результате гомологичной рекомбинации. Всего было получено 10 позитивных клонов, содержащих рекомбинантный ген СФ в результате гомологичной рекомбинации. Три клона ( 320, 321 и 324 ) были выбраны для инъекции в бластоцисты из мышей линии С57В1./6. В результате инъекций получили по 5 химерных мышей, из каждого инъецированого клона. Большинство химер по окраске шерсти были практически полностью цвета агути, то есть содержали большой процент клеток ЭС происхождения. Было получено 12 химерных самцов и 3 самки. По 2 самца каждого клона использовали для скрещевания с инбредными самками С57В1./6 линии ( поколение Р ). Самки , окраски агути , были гетерозиготами по мутантной СФ аллели. Большинство химер производили очень большой процент потомства агути ( 90-100% ). Поэтому , самки-дочери от самца N 12522 скрещивали возвратно с стцо«*, так как он давал только потомство агути. Самки-дочери от самца N 12518 скрещивали с С5^61/0 са:/ц?ми. так как этот самец имел около 10% потомства черного цвета. В каждом поколении животных проверяли на предмет их генетического статуса гибридизацией по Саузерну. В последующих поколениях, гомозиготные самки скрещивались с гомозиготными самцами путём инбридинга. Всего было получено несколько сотен мышей обоего пола, утративших одну ( самцы ) или обе аллели (самки ) гена синаптофизина дикого типа. Никто из этих мышей не показывал видимых отклонений фенотипа. Вес, общее поведение и подвижность были без изменений. Более того, СФ-дефицитные мыши были плодовиты и давали потомство нормального размера. Не обнаружено увеличения смертности за время наблюдения после рождения ( около 18 месяцев ).

4.3.Экспрессия синаптических белков в СФ-дефицитных мышах.

Для того, чтобы исключить вероятность наличия следовых количеств синаптофизина или мутантных форм белка,был сделан тщательный иммунологический анализ с использованием панели различных антител против разных эпитопов СФ. Для идентификации СФ использовали следующие антитела: 1- мышиные моноклональные антитела SV 38, распознающие цитоплазматический С-конец; 2 -аффино-очищенные антитела из кролика против пептида, локализованого в цитоплазматическом С-конце; 3-мышиные моноклональные антитела SVP 38; 4- аффиноочищенные антитела кролика против эпитопа на N-конце. В дополнение, использовали антитела для обнаружения других синаптических белков: синаптобревина 2, SV 2, синапсина 1( а+в ), секреторного транспортного мембранного белка SCAMP, синтаксина, SNAP 25 и белков нейрофиламентов NF-L и NF- М.. Для анализа использовали тотальные гомогенаты мозга из гомозиготных мутантных самцов ( - ), из гетерозиготных самок ( +/- ) и мышей дикого типа ( +/+ ). OB H и с одним из антител против СФ, не было обнаружено сигнала соответствующего СФ ( или белка с измененной подвижностью ), в случае гомозиготных мышей. Напротив, экспрессия других синаптических белков была показана в мутантных мышах. При этом не было обнаружено значительных различий в уровне экспрессии этих белков в образцах мышей различных по генотипу СФ.

Так как были не доступны иммунологические препараты к другим членам семейства СФ ( синаптопорину и пантофизину ) использовался "Нозерн" блот анализ, Для гибридизации использовали random primer меченую пробу для синаптофизина ( SPH ), специфическую рибопробу для синаптопорина ( SPO ) и рибопробу для пантофизина ( РРН ). В результате, не было обнаружено видимых количеств мРНК СФ или РНК другого размера. Не обнаружено также больших различий в уровне мРНК в СФ-дефецитных мышах по сравнению с нормальными для синаптопорина, за исключением небольшого увеличения сигнала для пантофизина.

В совокупности из этих исследований можно исключить вероятность того, что "нокаут" был не полный, а синаптофизин экспрессируется частично или измененно.

4.4.Синапсы и синаптические пузырьки в СФ-дефицитных мышах.

Не было обнаружено отличий в тканевой архитектуре различных отделов мозга при исследовании обычных формалиновых срезов гистологическе-ми методами окрашивания. В дальнейшем анализе, распределение синаптических пузырьков изучали с использованием иммунофлуоресцен-тной микроскопии на тканевых срезах из нормальных и мутантных животных. Например, типичная картина окрашивания была получена в мозжечке, с использованием антител против СФ,синаптобревина 2 и БУ 2. Пространственная организация нейронов особенно наглядна в сетчатке. Двойное окрашивание показывает, что синаптобревин 2 в мутантных мышах локализован во внутреннем и внешнем синаптических слоях , то есть областях, где образуются синаптические контакты. Кроме того, электронно-микроскопически исследовали гломерулы в гранулярном слое мозжечка, который как известно , содержит большое количество синаптических пузырьков . В этой области не много или совсем отсутствует синаптопорин ( Магдиеге-Роиеу е1 а1., 1991; Рукэе е1 а1., 1993 ). Такие области легко найти в СФ-дефицитных мышах . Подсчёт средней плотности упаковки синаптических пузырьков для мутантных мышей дал 166 пузырьков в одном квадратном микрометре, по сравнению 187 пузырьками для дикого типа. Пузырьки гомогенны в размерах. Средний диаметр 39,9 нм , что очень сходно с нормальными мышами ( средний диаметр 42,5 нм. ). Некоторые пузырьки стыкованы в активной зоне, рядом с областью 1,ипс:г:т!1и°окой щели с типичным постсинаптическими уплотнениями. Для сравнения композиционного состаса скептических пузырьков из мутантых мышей и мышей дикого типа использовали иммунно- электронную микроскопию, с мечением антителами против различных синаптических белков. Синаптосомы, содержащие пузырьки, были специфически мечены антителами против синаптобревина 2.

4.5.Нейроэндокринные ткани в СФ-дефицитных мышах. Высокий уровень экспрессии СФ можно обнаружить в медулярной части поджелудочной железы мышей дикого типа в небольших пузырьках , а также в некоторых катехоламин -содержащих пузырьках ( Ваиег{етс1 е1 а1., 1995 ). Иммунореактивность синаптобревина 2 также ограничена медулярным слоем у мутантных и нормальных мышей. Наконец, островки Лангерганса, как типичный пример нейроэпителиальных клеток, исследовали методом двойной иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием различных антител. Снова, ограниченное

мультипунктирное распределение видно в островках и нейронах с антителами к синаптобревину 2 у нормальных и мутантных мышей. В дополнение, было проведено тестирование образцов крови нормальных мышей и синаптофизин-дефицитных, с целью сравнения по ряду показателей ( сахар, гастрин, PRA, норадреналин, адреналин и допамин ). Измерения были проведены в отделении кардиологии медицинской клиники Университета г. Хейдельберг ( Dr. med. М. Haass:, Ruprecht - Karls-Universitat, Heidelberg ). Использованные методы анализа не позволили выявить сколько-нибудь заметных различий между нормальными и мутантными мышами по содержанию в крови ряда эндокринных факторов.

4. б.Электро-физиологическое исследование

Эти эксперементы были проведены как на клеточный культурах, так и in vivo. В первом случае, ( работа была проведена совместно с лабораторией Prof. Dr. В. Wiedenmann, Free University of Berlin, Berlin, Germany ) методом in vitro дифференцировки ЭС клеток. Получали культуры, содержащие первичные нейронные клетки и измеряли уровень секреции GABA. В культурах из двух мутантных клонов не обнаружили разницы с уровнях выделения трансмидиатора с клетками дикого типа. Во втором случае работа проводилась в лаборатории клеточной физиологии ( Max-Planck-Institut, Heidelberg, FRG, Prof. Dr: B.Sakman ) Dr. Gerard Borst. В этой лаборатории налажена методика прямых измерений пре- и постсинаптической пары нейронов в особом отделе мозжечка, так называемых срединных ядрах трапециодного тела ( in the medial nucleus of the trapezoid body, MNTB ). Пресинаптические потенциалы действия вызывают постсинаптические потенциалы возбуждения ( т. называемые excitatory postsynaptic currents, EPSCs ) Из 8-9 дневных мышат ( "нокаут" и дикого типа ) получали 100 микронные срезы мозга ( из не фиксированых препаратов с помощью вибротома ) , содержащие определенную область MNTB. В этой области находится много синапсов с характерными телами нейронов. В индивидуальную пре- и постсинаптическую пару вводили микроэлектроды. После специфического возбуждения пресинаптического нейрона снимали показания на постсинаптическом. Были использованы различные условия измерения . Не было найдено различия по следующим параметрам: - Кальциевой зависимости ( в диапозоне от 2 мМ до 0,5 мМ кальция ). -Амплитуде EPSCs при 2 мМ кальция. -Амплитуде спонтанных EPSCs

-Минимальной задержки ЕРБСэ при 2 мМ кальция.

В результате был сделан вывод о незначительной роли синаптофизина в осуществлении быстрой синаптической передачи в МЫТВ нейронах. 5.Обсуждение.

Нами впервые было показано, что один из наиболее зкспрессирующихся белков синаптических пузырьков- синаптофизин, не является необходимым для выполнения основных синаптических функций. В мышах, не содержащих СФ, нервные и нейроэндокринные ткани развиваются нормально и содержат нормальные синаптические пузырьки. Это явилось неожиданным результатом, хотя подобное отсутствие драматических изменений фенотипа было показано также для ряда других синаптических белков ( Р^аЫ е! а1., 1993, 1995; Серрег1 е1 а1., 1994 ).Позднее наши результаты были подтверждены ( МсМаИоп е1 а1., 1996 ). Отсутствие важной функции удивительно по двум причинам: Во-первых, ввиду обильности экспрессии синаптофизина и широкой его распространенности . А во-вторых, это противоречит предыдущим исследованиям , в которых была показана необходимость СФ для синаптической передачи. Однако, эти эксперименты выполнены не прямым путём, а с использованием антител или "антисенс" РНК техники. Отсутствие заметных фенотипических изменений у СФ-дефицитных мышей можно объяснить следующим образом :

1). Синаптофизин является функционально избыточным белком. Так как в мутантных мышах имеется также синаптопорин , возможно замещение им функций СФ. Одна<о, СФ и синаптопорин имеют различную картину распределения ( см. литературный обзор ). Так как Си> ясллсзтся членом семейства полипептидов (1_еиЬе 1994 ), возможно, что другие родственные белки могут замещать уничтоженные функции в мутантных мышах. Хотя мы не обнаружили драматических изменений в уровне мРНК синаптопорина или пантофизина, нельзя исключить , что небольшое различие в уровне белка может компенсировать функцию утраченного гена. В работе МсМаЬюп е1 а1. ( 1996 ) также посвященной получению синаптофизин-дефицитных мышей, было показано, что за исключением небольшого уменьшения ( ? ) эспрессии синаптобревина 2, экспрессия других белков не изменена. В том числе и синаптогирина, как возможного кандидата в семейство СФ ( ЭисИ^, !995 ).

2). Возможно , существуют другие, ещё не идентифицированые члены семейства СФ или, что альтернативно, не родственные молекулы могут помогать в этом фенотипическом "спасении". Это как бы особая форма

избыточности. Тем не менее, мы не обнаружели заметных изменений в уровне экспрессии других синаптических белков, особенно синаптобревина 2 и SCAMP , которые структурно связаны СФ ( Brand and Castle, 1993 )

3). Нельзя исключить полностью, что СФ имеет не значительную функцию, которую не удалось обнаружить в настоящем изучении.

4). СФ представляет в эволюции пережиток без функции. Хотя многие аргументы, такие как избыточность, эволюционный консерватизм и межбелковые взаимодействия СФ, опровергают такую возможность. Наши мутантные мыши могут помочь в выяснении вопроса об обнаруженной недавно сильной ассоциации между синаптобревинами, особенно синаптобревином 2 с синаптофизином. ( Calakos and Scheller, 1994; Edelmann et al., 1995; Washbourne et al., 1995 ) Заметим однако, что распределение и локализация синаптобревина 2 не изменена в мутантных мышах. Только увеличение интенсивности свечения синаптобревина замечено нами в синаптофизин-дефицитных мышах, особнно в медулярной части надпочечников. Напротив, в работе McMahon et al., 1996 обнаружено снижение экспрессии синаптобревина 2 в мутантных и гетерозиготных мышах на 15 %. Тем не менее было бы интересно количественно сравнить уровень синаптобревина 2 в различных тканях между нормальными и мутантными мышами. Интересно, связывается ли синаптобревин 2 с другими альтернативными партнёрами СФ, такими как синаптопорин, пантофизин, SCAMP и, также другими полипептидами в синаптофизин-дефицитных мышах ?

Хотя невозможно получить окончательный ответ на эти вопросы в настоящем исследовании, наиболее вероятно, что функция СФ компенсируется либо синаптопорином ( хотя он имеет гетерогенное и ограниченное распределение ), либо пантофизином ( повсеместно представленым в небольших пузырьках вне зависимости от их состава ) или синаптогирином ( не смотря на его низкую степень гомологии ) . В дальнейшем интересно осуществить двойной или даже тройной "нокаут" СФ, пантофизина и/или пантофизина /синаптогирина. Нами уже получены клоны ЭС клеток с разрушенным геном пантофизина, а также гетерозиготные мыши,несущие одну мутантную аллель гена. По-видимому, пантофизин ответственен за какую-то фундаментальную клеточную функцию, так как гомозиготные эмбрионы погибают на ранней стадии эмбриогенеза. Нами сейчас проводятся исследования в этом направлении.

Можно предположить, что в организме, утратившем продукт одного гена, помимо компенсанаторных процессов, могут происходить вторичные фенотипические изменения. Эти изменения ( развития, физиологии или даже поведенческие ) может быть на прямую даже не связаны с функцией интересуемого гена. Для изучения первичных и вторичных изменений необходима координированная работа учёных из разных областей биологии. С этой целью, мы послали наших синаптофизин-дефицитных мышей в несколько лабораторий. Пока получены предварительные результаты, которые однако позволяют предположить наличие таких вторичных фенотипических изменений. В частности, в лаборатории профессора B.Wiedenmann ( Free University of Berlin ) Dr. M. Bergmann проводил морфометрическое исследование аксонов на модели первичной культуры нейронов из клеток эмбрионального мозга СФ мышей и неожиданно обнаружил усиленное разрастание дендритов по сравнению с контрольными клетками, тогда как аксонапьный рост не был затронут.

В другом случае, Dr. J. Lemos ( Cold Spring Harbor Laborotory, USA ) выявил, что наши мутантные мыши имеют дефицит в обучении при использовании "rotor test", где исследуется двигательный опыт.

Выводы.

1. Получе;^; мыши н которых ген синаптофизина был разрушен методом генного таргетинга в эмбриональных стволовых клетках.

2. Синаптофизин полностью не эспрессируется в гомозиготных мутантных мышах. Это подтверждено методами иммуноблот анализа, "Нозерн" гибридизации и иммунофлуоресцентной микроскопии.

3. Синаптофизин-дефецитные мыши обладают нормальной жизнеспособностью и плодовитостью.

4. Нервные и нейроэндокринные ткани мутантных мышей имеют структуру без видимых изменений и содержат синаптические пузырьки.

5. Не обнаружено заметных изменений в белковом составе синаптических пузырьков.

6. В мутантных мышах не нарушена синаптическая передача.

7. На основе изложенных данных делается вывод, что синаптофизин -основной белок небольших синаптических пузырьков не является жизненно необходимым. Опровергаются существовавшие ранее

предположения о необычайно важных функциях синаптофизина в организме.

Список работ, опубликованных по теме диссертации;

1. Troyanovsky S.M., Eshkind L.G., Leube R.E., and Franke W.W. Contributions of cytoplasmic domains of desmosomal Cadherins to desmosome assembly and intermediate filament anchorage. Cell, vol.72, 561574, 1993.

2. Schafer S., Troyanovsky S.M., Heid H.W., Eshkind L.G., Koch P.J., Franke W.W. Cytoskeletal architecture and epithelial differentiation: Molecular determinants of cell interaction and cytoskeletal filament anchorage. Acad. Sei. Paris, Sciences de la vie. 316: 1316-1323,1993.

3. Troyanovsky S.M., Troyanovsky R.B., Eshkind L.G., Krutovskikh B.A., Leibe R.E., and Franke W.W. Identification of the plakoglobin-binding domain in desmoglein and its role in plaque assembly and intermediate anchorage. The Journal of Cell Biology, vol. 127, n 1.,1994.

4. Troyanovsky S.M., Troyanovsky R.B., Eshkind L.G., Leibe R.E., and Franke W.W. Identification of amino acid motifs in desmocollin, a desmosomal glycoprotein, that are requered for plakoglobin binding and plaque formation. Proc. Natl. Acad. Sei, vol. 91, pp. 10790-10794,1994.

5. Eshkind L.G., Leube R.E. Mice lacking synaptophysin reproduce and form typical synaptic vesicles. Cell&Tissie Research, 282; 423-433,1995.

6. Chitaev N.A., Leube R.E., Troyanovsky R.B., Eshkind L.G., Franke W.W. The binding of plakoglobin to desmosomal Cadherins: patterns of binding sites and topogenic potencial. The Journal of Cell Biology, vol. 133, n 2, 1996.