Роль фактора некроза опухолей в поддержании гемопоэза у мышей

Друцкая, Марина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль фактора некроза опухолей в поддержании гемопоэза у мышей
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль фактора некроза опухолей в поддержании гемопоэза у мышей"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В.А.ЭНГЕЛЫАРДТА

На правах рукописи

ДРУЦКАЯ Марина Сергеевна

РОЛЬ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ В ПОДДЕРЖАНИИ ГЕМОПОЭЗА У МЫШЕЙ

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной иммунологии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга Российской академии наук (г. Москва, Россия), Гематологическом Научном Центре Российской академии медицинских наук (г. Москва, Россия) и Национальном Институте Рака (г. Фредерик, США).

Научные руководители:

Кандидат биологических наук Д.В.Купраш Доктор биологических наук Д.Р.Келлер

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор И.Г. Козлов

(Российский государственный медицинский университет)

Доктор биологических наук, профессор B.C. Прасолов (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН)

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится ¿3 _2006 г. в

часов на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомнпъся в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан _ 7J 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

¿4-96

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Изучение молекулярных основ процессов, связанных с регуляцией гемопоэза, является одним из важнейших вопросов современной молекулярной биологии, в частности биомедицины. Процессы регуляции кроветворения чрезвычайно сложны, т.к. должны обеспечивать адекватный ответ на потребности организма в различных клеточных элементах на протяжении всей его жизни. Гемопоэтическая система представляет собой совокупность клеточных популяций от наиболее примитивных плюрипотентных стволовых кроветворных клеток до зрелых клеток крови, каждая из которых обладает определенным пролиферативным потенциалом и выполняет специализированные функции. Стабильное кроветворение обеспечивается за счет постоянной продукции зрелых клеток крови. Известно, что ежедневный оборот клеток в кроветворной системе взрослого человека составляет около 1x1012 клеток. Такая количественная регуляция гемопоэза осуществляется на уровне коммутированных, т.е. «определившихся» в типе дифференцировки, клеток-предшественников, утративших способность к длительному самоподцержанию и полипотентностъ. Регуляция отдела плюрипотентных стволовых кроветворных клеток, обеспечивающих неистощаемость кроветворения на протяжении всей жизни организма, осуществляется локально стромалышм микроокружением. Тем самым, регуляция гемопоэза у млекопитающих осуществляется на двух принципиально разных уровнях. В настоящее время охарактеризовано большое количество сигнальных молекул, действующих через клеточные рецепторы и участвующих в регуляции пролиферации и дифференцировки коммитированных кроветворных клеток-предшественников соответствующих рядов кроветворения, т.е. обеспечивающих количественную регуляцию гемопоэза. Однако молекулярные механизмы процессов, связанных с регуляцией стволовых кроветворных клеток, до сих пор остаются мало изученными.

В течение многих лет исследователи занимаются изучением физиологической роли цитокинов, участвующих в регуляции жизненно важных для организма процессов, таких как иммунньр шрет, лмеостаз. морфогенез и

БИБЛИОТЕК^. СПс О»

гемопоэз. Известно, что цитокины являются медиаторами этих процессов и на молекулярном уровне обеспечивают взаимодействие клеток различных тканей и органов между собой, что является неотъемлемым условием функционирования целого организма. Одним из таких цитокинов является фактор некроза опухолей (ФНО), который был впервые описан как белковый фактор, вырабатываемый макрофагами в ответ на стимуляцию бактериальным эндотоксином, активность которого способна приводить к геморрагическому некрозу опухолей на экспериментальных моделях (Carswell et al. 1975;01d 1988). Однако дальнейшие исследования показали, что ФНО обладает множеством физиологических активностей. Такая плейспропность ФНО в первую очередь связана с тем, что спектр клеток организма, способных экспрессировать ФНО или его рецепторы ФНОР1/р55 и ФНОР2/р75, а также родственные им молекулы (лиганды JITa, JITp, LIGHT и рецептор JITpP), чрезвычайно широк. Изучение мышей с генетической инактивацией ФНО убедительно продемонстрировало исключительную важность ФНО для защиты организма. В частности, стало ясно, что ФНО является важнейшим медиатором иммунного ответа и воспаления, а также участвует в формировании и поддержании структуры вторичных лимфоидных органов. Известно, что повышенный уровень ФНО в сыворотке крови часто ассоциируется с патофизиологией некоторых инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также септического шока. В настоящее время препараты, системно блокирующие действие ФНО, широко применяются в лечении ревматоидного артрита, болезни Крона, анкилозирующего спондилеза (окостеняющего воспаления позвоночника) и некоторых других аутоиммунных заболеваний. В последние годы активно разрабатываются клинические протоколы по применению ФНО-блокаторов при лечении миелодисплазий. Однако у небольшой части пациентов, находящихся на анти-ФНО терапии, наблюдаются серьезные побочные эффекты, связанные с подавлением функций иммунной системы. В связи с этим, актуальным остается вопрос об установлении всех физиологических функций ФНО в контексте целого организма.

Большой интерес представляет изучение роли ФНО в регуляции гемопоэза. Известно, что некоторые цитокины способны оказывать

преимущественно стимулирующее или ингибирующее воздействие на определенную популяцию кроветворных клеток. Как оказалось, плейотропность ФНО определяет более сложный характер его воздействия на гемопоэтические клетки. В частности, исследования в культуре с добавлением экзогенного ФНО продемонстрировали его роль в качестве бифункционального регулятора гемопоэза in vitro. При этом характер воздействия ФНО на гемопоэтические клетки in vitro обусловлен стадией дифференцировки клеток в культуре, наличием таких ростовых факторов как ИЛ-3, ФРСК, ГМ-КСФ и др., а также количественным содержанием самого ФНО. Однако результаты таких исследований позволили лишь косвенно судить о физиологической роли ФНО в гемопоэзе in vivo, вследствие чего и возникла необходимость проведения дополнительных исследований на генетически модифицированных мышах.

Целя н задачи исследования.

Были поставлены следующие задачи:

1. Установить роль ФНО в экспериментальном гемопоэзе in vitro.

2. Исследовать кроветворную систему мышей, дефицитных по ФНО, с целью выяснения роли ФИО на различных уровнях гемопоэза in vivo.

3. Исследовать кроветворную систему мышей, мутантных сразу по трем родственным генам: ФНО, ЛТа и JITp (комбинированный ФНО/ЛТ нокаут) (Kuprash et al. 2002), как на уровне зрелых клеток крови, так и на уровне кроветворных клеток-предшественников и стволовых клеток костного мозга.

4. Установить влияние ЛТ сигнала на функциональное состояние стволовых кроветворных клеток при помощи конкурентной репопуляции костного мозга облученных реципиентов смесью костного мозга мышей с одиночной и тройной инактивацией генов ФНО/ЛТ.

Научная новизна.

В настоящей работе в рамках международного проекта впервые проведены исследования по изучению различных аспектов гемопоэза у мышей, дефицитных по ФНО и по ФНО/ЛТа/ЛТр. Уникальность этих исследований заключается в том, что впервые удалось оценить физиологическую роль ФНО в регуляции гемопоэза как in vitro в культуре кроветворных клеток, так и in vivo в контексте целого организма. Так, было показано, что существенное увеличение миелопоэза in vitro в культурах кроветворных клеток, полученных из ФНО-дефицитных мышей, соответствует in vivo увеличению количества гранулоцитарно-макрофагальных предшественников у мышей, дефицитных по ФНО. Изучение гемопоэза у мышей, дефицитных по ФНО/ЛТа/ЛТР, позволило исследовать вопрос о «вырожденности» сигнала, передаваемого ФНО и ЛТа через одни и те же рецепторы. Показано, что у мышей с комбинированной инактивацией ФНО/ЛТ увеличено количество стволовых кроветворных клеток и ранних кроветворных предшественников, образующих колонии в селезенке облученных реципиентов (КОЕ-с), в костном мозге. Морфологический анализ костной ткани ФНО/ЛТа/ЛТ(5-дефицитных мышей выявил ряд аномалий, предположительно связанных с дефектным кроветворным микроокружением.

Практическая значимость.

Результаты, полученные в данной работе, представляют интерес не только для фундаментальной науки о цитокинах как регуляторах гемопоэза, но и для практического применения в медицине. В настоящее время инактивация ФНО in vivo с помощью высокоаффинных блокаторов широко используется для лечения таких аутоиммунных заболеваний как ревматоидный артрит, болезнь Крона, анкилозирующий спондилёз и др. Помимо этого, несистемное (местное) введение ФНО до сих пор используется для лечения некоторых видов онкологических заболеваний. Понимание роли ФНО как регулятора гемопоэза в физиологических и патологических условиях необходимо для разработки наиболее эффективных методов терапии.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на нескольких международных симпозиумах и конференциях, в том числе на Всесоюзной конференции "Цитокины, воспаление, иммунитет" (Санкт-Петербург, Россия, 2002), 29-ой Научной конференции Международного общества по экспериментальной гематологии (Тампа, США, 2000), Совместном симпозиуме Общества по биологии лейкоцитов и Международного общества по цитокинам (Мауи, США, 2001), 10-ой Международной конференции по цитокинам суперсемейства Фактора Некроза Опухолей (Лозанна, Швейцария, 2004).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура в объем работы.

Диссертация состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, полученные результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Материалы диссертации изложены на ^страницах машинописного текста и включают рисунков, 3 таблицы и список

литературы из/^^ источников.

Список сокращений

БОЕ-э - бурстобразующая единица эритроидная; ГМ-КСФ колониестимулируюпщй фактор гранулоцитарно-макрофагальный; ДККМ длительная культура костного мозга; ДТ - мыши дикого типа; КОЕ-гм -колониеобразующая единица транулощггарно-махрофагальная; КОЕ-к колониеобразующая единица в культуре; КОЕ-с - колониеобразующая единица в селезенке; КМ - костный мозг; ЛТ - лимфотоксин; ЛТа - лимфотоксин альфа; ЛТ|3 -лимфотоксин бета; ЛТрР - рецептор лимфотоксина бета; СКК - стволовая кроветворная клетка; ФИО - фактор некроза опухолей; ФНОР1 - рецептор ФНО (р55); ФНОР2 -рецептор ФНО (р75); G-CSF - колониестимулируюпщй фактор гранулоцитарный; IL-3 - интерлейкин 3; IL-6 - интерлейкин 6; КО - knock-out («нокаутная мышь», полученная при инактивации гена в эмбриональных стволовых клетках); SCF - stem cell factor, фактор роста стволовых клеток (ФРСК).

Основное содержание работы

Целью данной работы было выявление возможной роли фактора некроза опухолей и лимфотоксина а (ЛТа) в кроветворении у мышей. В качестве объекта исследований использовали мышей, дефицитных по ФНО (Kuprash et al. 2005, Marino et al. 1997), а также мышей с комбинированной инактивацией, дефицитных по продуктам всех трех генов ФНО локуса (ФНО, ЛТа и ЛТр), созданных в нашей лаборатории (Kuprash et al. 2002). В ходе работы были проведены исследования in vitro на культурах кроветворных клеток и in vivo на животных. Использованные методы позволили оценить динамику кроветворения у нокаута ых животных и проследить различия на уровне как самых примитивных кроветворных клеток-предшественников - стволовых кроветворных клеток (СКК), способных длительно репопулировать костный мозг облученных реципиентов, так и более зрелых предшественников, способных формировать колнии in vivo в селезенке облученных реципиентов или колонии в культуре in vitro. Изучение этих параметров позволило нам оценить роль сигнала, передаваемого ФНО и ЛТ через ФНО-рецепторы в регуляции кроветворных клеток-предшественников, находящихся на разных уровнях дифференцировки в иерархии кроветворной системы.

ФНО как ингибитор миелопоэза in vitro

Физиологическая роль ФНО в процессах, связанных с гемопоэзом, носит многосторонний характер. Многочисленные данные о возможной роли ФНО в регуляции гемопоэза основываются преимущественно на проведенных in vitro исследованиях с использованием рекомбинантного ФНО. Известно, что ФНО может оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее воздействие на гемопоэтические клетки in vitro в зависимости от наличия других ростовых факторов в культуре, а также от количественного содержания самого ФНО (Jacobsen et al. 1995, Snoeck et al. 1996, Rusten et al. 1995, Dybedal et al. 2001 и др.). В связи с этим нам представлялось важным исследовать физиологическую роль ФНО в регуляции кроветворных клеток-предшественников in vitro. Для этого мы изучали гемопоэз на модели длительной культуры костного мозга (ДККМ) ФНО-дефицитных мышей, что позволило получить новые сведения о

роли ФНО в развитии кроветворной ткани и охарактеризовать динамику пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток с изначально нарушенным сигнальным каскадом, опосредованным ФНО. Мы установили, что в ФИО-дефицитных культурах происходит двукратное увеличение клеточной продукции по сравнению с культурами дикого типа (ДТ) (Друцкая и др. 2001, Шйзкауа е! а1. 2005). Добавление рекомбинантного ФНО (10 нг/мл) к ДККМ, полученных от ФНО-дефицитных мышей, приводило к снижению общего числа клеток в культуре до уровня ДТ (Рис. 1 А).

недотъ я культур*

дней в культуре

8 7 » 11 недель 8 культуре

Рисунок 1. Увеличение общего числа клеток и кроветворных клеток-предшественников в культурах костного мозга, полученных от ФНО-дефицигных мышей. А. Повышенная продукция клеток в ФНО-дефицитных ДККМ. В. Повышенная клеточная продукция при стимуляции клеток костного мозга, полученного от ФНО-дефицитных мышей, твСР (100нг/мл), т1Ь-3 (30нг/мл), ЫЬ-6 (50нг/мл), ЬО-С8Р (50нг/мл). С. Нормальное содержание кроветворных клеток-предшественников, образующих колонии в агаровых культурах в присутствии твСР (100нг/мл) и ш1Ь-3 (ЗОнг/мл) (КОЕ-к), в костном мозге ФНО-дефицитных мышей (0) и повышенное содержание КОЕ-к в ДККМ, полученных от ФНО-дефицитных мышей.

Аналогичные данные были получены и при культивировании клеток костного мозга без стромы в присутствии гемопоэтических ростовых факторов, стимулирующих пролиферацию и дифференцировку кроветворных клеток-

предшественников миелоидного направления (Рис.1В). Интересно, что достоверных отличий в количестве кроветворных клеток-предшественников, образующих преимущественно смешанные колонии миелоидного типа в агаровых культурах (КОЕ-к) при стимуляции SCF(100 нг/мл) и IL-3 (30 нг/мл), в костном мозге мышей контрольной и исследуемой групп выявлено не было (день 0) (Рис. 1С). Однако анализ количественного содержания КОЕ-к в длительных культурах костного мозга (ДККМ) показал, что в культурах, полученных из костного мозга нокаутаых мышей, постепенно возрастало количество КОЕ-к в сравнении с ДТ (Рис. 1С). Эти результаты позволили предположить, что различия в характере кроветворения в культурах костного мозга, полученного от ФНО-дефицишых мышей и мышей ДТ, обусловлены ингибирующим воздействием ФНО на пролиферацию кроветворных клеток-предшественников в процессе миелопоэза in vitro.

Помимо повышенной пролиферативной активности в ДККМ, полученных от ФНО-дефицитных мышей, мы наблюдали и другие эффекты, свидетельствующие об участии ФНО и в дифференцировке кроветворных клеток-предшественников в культуре. Так, морфологический анализ окрашенных Giemsa клеток в культуре костного мозга нокаутных мышей выявил повышенное содержание примитивных недифференцированных форм (миелобласты, промиелоциты) и уменьшение числа зрелых клеток, находящихся на терминальной стадии дифференцировки (сегментированные нейтрофилы) по сравнению с ДТ (Таблица 1).

Таблица 1. Дифференцировка нейтрофилов в длительных культурах костного мозга.

Миелобласты и промиелоциты Миелоциты Метамиелоциты Нейтрофилы

ДТ 7.3 ±2.4 13.7 ±4.8 25.3 ±5.1 49.7 ± 2.1

ФНО'" 16.9±3.1* 14.5 ±3.9 48.1 ±6.5** 17.6 ±5.2***

Процентное содержание клеток в ДККМ на 10-й неделе культивирования. *Р < 0.02 при сравнении миелобластов/промиелоцитов, **Р < 0.01 при сравнении метамиелоцитов и ***р < 0.001 при сравнении нейтрофилов из ФНО-дефицитных ДККМ с ДТ.

Эти данные указывают на то, что недостаток экспрессии ФНО может влиять на задержку в дифференцировке клеток-предшественников. Ранее сообщалось, что у мышей, дефицитных по ФНО, наблюдается пониженная экспрессия ГМ-КСФ, необходимого для дифференцировки гранулоцитов и макрофагов (Marino et al, 1997), однако это наблюдение не было соотнесено с возможными дефектами в гемопоэзе. Недавно была показана роль ФНО в регуляции пролиферации и дифференцировки тучных клеток, предположительно образующихся из общего с гранулоцитами миелоидного предшественника (Wright et al. 2006).

Нормальное кроветворение у ФНО-дефицитных мышей.

На следующем этапе работы мы попытались установить возможные нарушения в характере кроветворения у мышей, дефицитных по ФНО. Для этого мы оценивали как общую клеточность костноого мозга, так и количественное и процентное содержание зрелых клеток миелоидного, эритроидного и лимфоидного типа дифференцировки. Мы установили, что у мышей, дефицитных по ФНО, в костном мозге несколько увеличено количество клеток, экспрессирующих маркеры нейтрофилов и макрофагов (Таблица 2), что коррелировало с повышенным содержанием нейтрофилов в крови по сравнению с мышами ДТ (Таблица 3).

Таблица 2. Общая клеточность и экспрессия миелоидных, лямфоидных н эритроидных маркеров в костном мозге.

Миелоидные клетки (% Mac-lVGr-l4} В-клетки (% В220+) Эршроидные клетки (% Terll9+/CD71+) Общая клеточность костного мозга, х106/бедро

ДТ 39 ± 1 34 ±3 20 ±3 22 ±6

ФНО"/_ 49 ±5* 29 ±3 16 ±2 19 ±4

Клетки костного мозга были выделены из бедренной кости, окрашены флюоресцентными антителами к поверхностным маркерам и проанализированы на цитофлюориметре. *Р < 0.001 при сравнении экспрессии Мас-1+/Сгг-1+с ДТ

Таблица 3. Анализ клеток в крови.

Эритроциты (106/цл) Лейкоциты (103/цл) Лимфоциты (103/цл) Нейтрофилы (103/цл)

ДТ 9.0 ±1.0 9.0 ±1.4 6.6 ± 1.1 1.5 ±0.3

ФНО -/- 10.3 ± 0.4 11.3 ±3.0 7.8 ±1.6 2.8 ±1.7*

*Р < 0.02 при сравнении количества нейтрофилов с ДТ

При этом содержание кроветворных клеток-предшественников, образующих колонии в селезенке облученных реципиентов (КОЕ-с), и более зрелых миелоидных кроветворных клеток-предшественников (КОЕ-к), образующих преимущественно смешанные колонии в агаровых культурах при стимуляции SCF(100 нг/мл) и IL-3 (30 нг/мл), а также коммитированных гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников (КОЕ-гм) и эритроидных - образующих бурсты в метилцеллюлозе (БОЕ-э), не отличалось у ФНО-дефицитных мышей и мышей ДТ (Рис 2). Эти первоначальные данные могли быть интерпретированы либо как указание на незначительный вклад ФИО в регуляцию гемопоэза, кажущимся в противоречии с яркими эффектами ФИО in vitro, либо как свидетельство существования в организме альтернативных сигнальных каскадов, способных компенсировать отсутствие ФИО in vivo. Отметим, что единственный известный цитокин, способный передавать сишал через рецепторы ФИО, но не являющийся ФНО, это - JITa.

Рисунок 2. Нормальное количество кроветворных клеток-предшественников в костном мозге ФНО-дефицитных мышей. Для определения числа КОЕ-с летально облученным реципиентам внутривенно вводили 3x104 клеток костного мозга, а через 12 дней подсчитывали количество колоний в селезенке. Для КОЕ-к и КОЕ-гм - 2.5-5x104 клеток КМ выращивали в 1мл агаровых культур в присутствии SCF(100 нг/мл) + IL-3 (30 нг/мл) или GM-CSF (50 нг/мл), соответственно. Для БОЕ-э - 8х104 клеток КМ культивировали в метилцеллюлозе в присутствии Еро (6 Ед/мл), SCF (100 нг/мл) и IL-3 (30 нг/мл). Число КОЕ-гм и БОЕ-э оценивали на 7-ой день культивирования.

ФНО - ингибитор ранних (КОЕ-с) и коммитированных кроветворных

клеток-предшественников (КОЕ-ги) in vivo.

Нами были получены данные, свидетельствующие, с одной стороны, о нормальном количестве кроветворных клеток-предшественников в костном мозге нокаутных мышей, с другой - о значительном увеличении количества этих клеток в длительных культурах костного мозга, полученного от нокаутных мышей. Для более детального исследования динамики кроветворения и возможного участия ФНО в регуляции кроветворных клеток-предшественников in vivo из костного мозга ФНО-дефицитных мышей и мышей ДТ методом препаративной проточной цитофлюорометрии была выделена LinnegcKitpo,Scal°eg фракция клеток костного мозга, содержащая преимущественно коммитированные кроветворные клетки-предшественники, и Lin"egcKitposScalpos фракция клеток костного мозга, обогащенная ранними кроветворными клетками-предшественниками, в том числе стволовыми кроветворными клетками. Количество Linne8cKitpo8Scalpoe клеток, полученных из костного мозга ФНО-дефицитных мышей, не отличалось от ДТ, однако количество ранних предшественников (КОЕ-с), содержащихся в этой фракции, а также размер самих колоний, образованных ФНО-дефищггными предшественниками костного мозга в селезенке облученных реципиентов, был значительно больше, чем в контрольной группе (Рис.ЗА и ЗВ). Отметим, что аналогичные данные были получены и при анализе LinnegcKitposScalpos фракции клеток, выделенных из костного мозга мышей, дефицитных по двум рецепторам ФНО (р55 и р75). Более того, количество КОЕ-с и размер самих колоний превосходили те, что были получены при трансплантации клеток костного мозга из ФНО-дефицитных мышей. Эти результаты могут являться косвенным свидетельством того, что не только ФНО, но и родственный ему цитокин ЛТа участвует в регуляции ранних кроветворных предшественников, передавая сигнал через ФНОР1 (р55) и ФНОР2 (р75). Помимо этого, количество коммитированных гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (КОЕ-гм) как в Lin^cKit^Scal"®8, так и в LinnegcKitposScalpos фракциях клеток костного мозга, полученного из ФНО-дефицитных мышей, было значительно больше, чем в ДТ (Рис.ЗС).

ДТ «НМ- |*W-p7W-

Рисунок 3. Повышенное содержание числа ранних и коммутированных предшественников в Ьт°еесК!1,10'8са1р<" фракции клеток костного мозга, полученного из ФНО-дефицитных мышей. А. Очищенные при помощи проточной цигофлюорометрии 1лп™,сКйро'8са1р<* клетки костного мозга мышей вводили внутривенно летально облученным реципиентам (ШО3 клеток/мышь). Через 12 дней подсчитывали число КОЕ-с. В. Макроскопические колонии на селезенке после фиксации. С. Очищенные при помощи проточной цигофлюорометрии Ьш°е,,сК11^*8са1ро' и Ьш°°гсКЛ1'°,8са1 клетки выращивали в агаровых культурах (3x103 клеток/мл) в присутствии вМ-СвР (50нг/мл), через 7 дней подсчитывали КОЕ-гм.

Эти результаты согласуются с ранее опубликованным данными о том, что у мышей, дефицитных по ФНОР1(р55), наблюдается увеличение количества коммитированных клеток-предшественников миелоидного типа в костном мозге (Rebel et al. 1999). В совокупности полученные данные позволяют предположить, что ФНО оказывает ингибирующее воздействие как на ранние (КОЕс), так и на коммитированные гранулоцитарно-макрофагальные кроветворные клетки-предшественники (КОЕ-гм) in vivo. Однако стоит отметить, что в выделенных фракциях Lin^cKit^Scal1"8 и LinЮ!8cKitpoвScalpo^ обогащенных преимущественно коммутированными кроветворными клетками-предшественниками и более примитивными кроветворными предшественниками, в том числе стволовыми кроветворными клетками, соответственно, отсутствуют клетки лимфоидного происхождения, экспрессирующие JITa и ЛТр. Таким образом, эти данные могут косвенно

свидетельствовать о возможной «вспомогательной» роли ЛТ в регуляции гемопоэза и объяснить отсутствие разницы в КОЕ-с и КОЕ-гм в опытах, использующих нефракционированные клетки костного мозга (Рис.2).

Нарушенная динамика гемопоэза у мышей с комбинированным

ФНО/ЛТ дефицитом.

Анализ клеток костного мозга мышей с комбинированной инактивацией ФНО/ЛТа/ЛТ(3 выявил ряд существенных нарушений в динамике кроветворения по нескольким параметрам по сравнению как с мышами ДТ, так и ФНО-дефицитными мышами. У этих мышей, так же как и у описанных ранее мышей, дефицитных по ФНОР1 (Zhang et al. 1995, Rebel et al. 1999), наблюдается значительное увеличение количества Lin"egcKitposScalpoe клеток в костном мозге (Рис.4А). При этом было увеличено количество кроветворных клеток-предшественников миелоидного типа (КОЕ-к), образующих преимущественно смешанные колонии в агаровых культурах при стимуляции SCF (100нг/мл) и IL-3 (ЗОнг/мл), и ранних кроветворных клеток-предшественников, образующих колонии в селезенке облученных реципиентов (КОЕ-с) (Рис.4В).

Далее, мы обнаружили, что у мышей с комбинированным ФНО/ЛТа/ЛТр дефицитом количество гранулоцитарно-макрофагальных кроветворных клеток-предшественников (КОЕ-гм) снижено по сравнению с ДТ, а количество эритроидных кроветворных клеток-предшественников (БОЕ-э) не изменено (Рис.4В), что может свидетельствовать об участии сигнала, передаваемого ФИО и ЛТ через ФНО-рецепторы, в количественной регуляции миелопоэза in vivo на уровне гранулоцитарно-макрофагальных кроветворных клеток-предшественников. Известно, что количественная регуляция гемопоэза, обусловленная запросом на зрелые клетки, осуществляется при участии различных ростовых факторов, способных индуцировать дифференцировку и пролиферацию коммитированных клеток-предшественников, утративших способность к длительному поддержанию и полипотентность. В крови мышей с комбинированной инактивацией ФИО и ЛТ во много раз увеличено количество абсолютно всех клеток миелоидного типа дифференцировки (нейтрофилы, моноциты, эозинофилы, базофилы), а также лимфоцитов (Таблица 4). При этом

нарушений в количестве эритроцитов не наблюдается, а анализ экспрессии маркеров дифференцировки выявил повышенное содержание макрофагов и гранулоцитов, а также Т-лимфоцитов в костном мозге мышей, дефицитных по ФНО/ЛТа/ЛТр (Рис.5).

Рисунок 4. Анализ ранних клеточных популяций в костном мозге мышей с комбинированным ФНО/ЛТ дефицитом. А. Увеличение числа Lin™4cKitp°"Scalp™клеток в костном мозге нокаутных мышей. Клетки костного мозга окрашивали флюоресцентными антителами к поверхностным маркерам дифференцировки гранулоцитов (Gr-1), макрофагов (Мас-1), эршроцигов (Terl 19) и лимфоцитов (В220 и СШе), а также c-Kit и Sca-1. Далее оценивали количество недифференцированных клеток (Lin04), экспрессирующих c-Kit (рецептор фактора роста стволовых клеток) и Sca-1 (антиген стволовых клеток).

В. Количественная оценка популяций кроветворных клеток-предшественников в костном мозге мышей с тройной инактивацией генов ФНО/ЛТ локуса. Дня определения числа КОЕ-с летально облученным реципиентам внутривенно вводили 3x104 клеток костного мозга, а через 12 дней подсчитывали количество колоний в селезенке. Для КОЕ-к и КОЕ-гм

- 2,5-5x10'' клеток КМ выращивали в 1мл агаровых культур в присутствии 8СР(100нг/мл) +11,-3 (ЗОнг/мл) или ОМ-СЭР (50нг/мл), соответственно. Для БОЕ-э

- 8х104 клеток КМ культивировали в 1 мл метилцеллюлозы в присутствии Еро (6 Ед/мл), ЭСК (100 нг/мл) и 1Ь-3 (30 нг/мл). Колонии в культурах подсчитывали на 7-ой день культивирования.

КОБ« КОБ* КОБ-га БОБ*

Эритроциты (106/цл) Миелоидные Лимфоциты клетки (103/цл) (103/цл)

ДТ 8.9 ±1.1 2.2 ± 0.5 6.5 ± 0.3

ФНО/ЛТа/JITß"'" 9.3 ± 0.5 10.3 ± 4.2* 45.2 ± 5.9*

*Р < 0.0001 при сравнении числа миелоидных клеток и лимфоцитов с ДТ

Рисунок 5. Нарушенное соотношение зрелых клетчных популяций в костном мозге мышей, дефицитных по ФНО/JITa/JITß. Клетей костного мозга были вьщелены из бедренной костя, окрашены флюоресцентными антителами к поверхностным маркерам и проанализированы на цитофлюориметре. CD3e соответсвует популяции Т-лимфоцитов, В220 - В-лимфоцитам, Gr-1/ Мас-1 -нейтрофилам, а Terl 19/CD71 эритроидным клеткам.

В отличие от регуляции коммитированных клеток-предшественников, утративших способность к длительному поддержанию и полипотентность, регуляция СКК носит локальный характер и осуществляется на принципиально другом уровне под строгим контролем стромального микроокружения. Строма кроветворных органов имеет довольно сложный состав и включает эндотелиальные, жировые, гладкомышечные или ретикулярные клетки, фибробласты, остеобласты и внеклеточный матрикс, представленный преимущественно коллагеновыми волокнами, протеогликанами и гликопротеидами. Стромальные и гемопоэтические клетки находятся в тесном взаимодействии друг с другом, которое осуществляется за счет молекул адгезии. Помимо молекул адгезии важную роль в этих взаимодействиях играют рецепторы цитокинов и хемокинов, с которыми связываются либо растворимые лиганды внеклеточного матрикса, либо мембранно-связанные. При этом стромальные клетки формируют микроокружение, которое, в свою очередь, влияет на гемопоэз, а от качества гемопоэза зависит функционирование стромы.

□ДТ ■ ФНСУЛТаШТ>/-

2010

сои та Mactnri T«rti«con

В последние годы удалось на молекулярном уровне охарактеризовать специализированные гемопозтические ниши костного мозга и прояснить многие аспекты регуляции СКК кроветворным микроокружением (Wilson and Trumpp, 2006).

ДТ ФНО/ЛТа/ЛТр-/-

Рисунок 6. Измененная структура костно-мозговой ткани у мышей с комбинированным ФНО/ЛТ дефицитом выражается в повышенном содержании клеток в полости, отсутствии жировых кластеров («белые пятна» в ДТ, образующиеся при вымывании жировоой ткани во время фиксации) и истощенном слое соединительной ткани, прилегающей к остеокластам (верхняя часть) - зоне активной ресорбции кости. Продольный срез большой берцовой кости, метафиз при увеличении в 100 и 400 раз. Окрашивание гемотоксилином и эозином.

Несмотря на то, что общая клеточность костного мозга у мышей с комбинированным ФНО/ЛТ дефицитом не отличается от ДТ (25.6 ± 5.4 и 24.4 ± 4.6 хЮ6 клеток/бедро, соответственно) распределение клеток в костном мозге носит иной характер. Интересно, что у мышей с комбинированной инактивацией генов ФНО/ЛТ локуса наблюдается гиперпролиферация клеток в области метафиза в костном мозге, а жировые кластеры, состоящие из адипоцитов - неотъемлемого компонента кроветворного микроокружения -практически отсутствуют (Рис.6). Недавно было показано, что именно в этой части костного мозга, благодаря губчатому строению кости, локализовано

наибольшее количество СКК, находящихся в тесном взаимодействии с остеобластами и другими клетками кроветворного микроокружения (Calvi et al. 2003, Zhang et al. 2003, Adams et al. 2005).

У мышей с комбинированным ФНО/JIT дефицитом значительно

повышено количество СКК в костном мозге.

Проведенные ранее исследования показали, что у мышей, дефицитных по ФНОР1, наблюдается значительное увеличение количества LmnegcKitpo'Scalpo' клеток по сравнению с контрольной группой и мышами, дефицитными по ФНОР2 (Zhang et al. 1995). Более того, у стареющих мышей (>6 мес.), дефицитных по ФНОР1, происходит увеличение как общего количества клеток костного мозга, так и количества коммитированных клеток-предшественников миелоидного типа дифференцировки и зрелых клеток в крови. При этом у таких стареющих мышей количество стволовых кроветворных клеток костного мозга значительно меньше, чем у мышей ДТ (Rebel et al. 1999). Основываясь на этих двух исследованиях, можно было предположить, что передача сигнала через ФНОР1 играет важную роль в регуляции отдела стволовых кроветворных клеток костного мозга. Более того, отсутствие этого сигнала нарушает строгий баланс между процессами пролиферации (самообновлением) и дифференцировки СКК, в результате чего происходит ускоренное истощение популяции СКК и увеличение количества коммитированных клеток-предшественников. Следует отметить, что приведенные данные могут лишь косвенно свидетельствовать об участии ФИО в регуляции СКК in vivo, т.к. известно, что помимо ФИО, передачу сигнала через ФНОР1 осуществляет родственный ему цитокин, ЛТа. Именно поэтому изучение динамики кроветворения и регуляции стволовых кроветворных клеток у мышей, дефицитных как по ФИО, так и по ФНО/ЛТа/ЛТР, представлял особый интерес.

Следующий этап исследования кроветворения у мышей, дефицитных по ФИО, а также у мышей с комбинированной инактивацией генов ФНО/ЛТ локуса, заключался в анализе самых примитивных кроветворных клеток-предшественников - стволовых кроветворных клеток. Для этого оценивали способность СКК, полученных из костного мозга нокаутных мышей,

репопулировать костный мозг облученных реципиентов наряду с СКК, полученных из костного мозга мышей ДТ (Рис.7). В условиях конкурентной репопуляции, когда летально облученному реципиенту трансплантируют дифференциально маркированную смесь кроветворных клеток из двух источников: нормальных гемопоэтических клеток и клеток, полученных из ФНО или ФНО/ЛТа/ЛТр-дефицитных мышей, можно судить о конкурентной способности примитивных стволовых кроветворных клеток нокаутных мышей репопулировать костный мозг наравне с СКК мышей ДТ, т.е. оценивать физиологические потенции этих клеток. Популяцию СКК различают по способности к кратковременной (через 2 месяца) и длительной (через 4-6 месяцев) репопуляции костного мозга облученных реципиентов. В наших экспериментах в качестве реципиентов использовали конгенных мышей, отличающихся от мышей линии С57В1/6 лишь экспрессией Ьу5.2 маркера вместо Ьу5.1 на поверхности большинства клеток организма, что позволило получить и различать три группы костномозговых химер. Первая группа (контрольная) после облучения была восстановлена смесью клеток костного мозга ДТ, полученного от двух конгенных доноров в соотношении Ьу5.2 (ДТ) / Ьу5.1 (ДТ) = 10/1. Второю и третью группу мышей восстанавливали смесью клеток костного мозга мышей ДТ (Ьу5.2) и нокаутных мышей Ьу5.1 (ФНО/ЛТа/ЛТр-/- и ФНО-/-, соответственно) в том же соотношении: Ьу5.2 (ДТ) / Ьу5.1 (КО) = 10/1. Способность СКК, полученных из нокаутных мышей, репопулировать костный мозг облученных реципиентов оценивали через 4-6 месяцев после трансплантации. Для этого сравнивали экспрессию Ьу5.1 миелоидными клетками (0-1+ клетки) и В-лимфоцитами (В220+ клетки) в костном мозге и Т-лимфоцитами (СБЗе+ клетки) в селезенке мышей в трех группах.

контрольной группой. Как уже обсуждалось, у мышей с тройным нокаутом увеличена популяция Шпе8сКкро'8са1рсв клеток в костном мозге (Рис.4А). По всей видимости, это происходит за счет увеличения как мультипотентных кроветворных клеток предшественников, образующих колонии в селезенке облученных реципиентов (КОЕ-с; Рис.4В), так и за счет увеличения популяции самых ранних кроветворных клеток-предшественников - СКК, способных к длительной репопуляции костного мозга облученных реципиентов.

анализ экспрессии 1_у5.1 маркера в костном мозге и селезенке реципиента

Рисунок 7. Повышенная способность СКК костного мозга мышей с тройной инактивацией генов ФНО локуса репопулировать костный мозг летально облученных реципиентов.

Заключение:

В данной работе показано, что ФНО и ЛТ, играющие важную роль в иммунном ответе и воспалении, важны также для регуляции кроветворной системы через сложную систему сигналов, регулирующих пролиферацию, апоптоз и взаимодействие со стромальным микроокружением. Дальнейшее изучение роли этих цитокинов в кроветворении и установление тонких молекулярных механизмов передачи сигнала, в частности, разграничение функций ФНО и ЛТа, может открыть новые перспективы в понимании регуляции гемопоэза на молекулярном уровне, а также в более глубоком понимании возможностей и ограничений при терапии заболеваний с применением цитокинов или их блокаторов.

Выводы:

1. Установлено, что ФНО является мощным ингибитором миелопоэза in vitro, участвует в регуляции пролиферации и последующей дифференцировке гранулоцитарно-макрофагалыгах кроветворных клеток-предшественников.

2. Установлено, что у мышей, дефицитных по ФНО, увеличено количество коммитированных гранулоцитарно-макрофагалышх клеток-предшественников и ранних мультипотентных кроветворных клеток-предшественников в костном мозге.

3. Обнаружено, что мыши с комбинированной инактивацией генов ФНО/ЛТ локуса имеют ряд существенных нарушений в гемопоэзе: нарушена количественная регуляция гемопоэза; многократно повышено количество зрелых клеток в крови и нарушено их соотношение в костном мозге нокаутных мышей; снижено количество коммитированных кроветворных клеток-предшественников миелоидного типа, при этом увеличены популяции более ранних кроветворных клеток-предшественников, в том числе стволовых кроветворных клеток.

4. Установлено, что стволовые кроветворные клетки, полученные от мышей с комбинированной инактивацией генов ФНО/ЛТ локуса, репопулируют костный мозг облученных реципиентов с большей эффективностью, чем ДГ. Эти данные могут быть объяснены кооперацией сигналов от ФНО и ЛТ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Друцкая М.С., Купраш Д.В., Недоспасов С.А., Чертков И.Л., Дризе Н.И. Кроветворение у мышей дефицитных по фактору некроза опухоли: аномалии выявляемые в длительной культуре костного мозга. 2001. Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. 131(2), 150-152.

2. Drntslcaya MS, Ortiz М, Liepinsh DJ, Kuprash DV, Nedospasov SA, Keller JR. Inhibitory Effects of Tumor Necrosis Factor on Hematopoiesis Seen in Vitro Are Translated to Increased Numbers of Both Committed and Multipotent Progenitors in TNF-deficient Mice. 2005. Exp. Hem. 33(11), 1348-1356.

3. Kuprash DV, Tumanov AV, Liepinsh DJ, Koroleva EP, Drntslcaya MS, Kruglov AA, Shakhov AN, Southon E, Murphy WJ, Tessarollo L, Grivennikov SI, Nedospasov SA. Novel tumor necrosis factor-knockout mice that lack Peyer's patches. 2005. Eur J Immunol. 35(5), 1592-1600.

4. Wright HV, Bailey D., Kashyap M., Kepley CL, Drntslcaya MS, Nedospasov SA, Ryan JJ. IL-3 mediated TNF production is necessary for mast cell development. 2006. J. of Immunology. 176(4), 2114-2121.

5. Liepinsh, D.J., Grivennikov, S.I., Lagarkova, M.A., Drntskaya, MA, Klarmann, K.D., Lockett, S.J., McAuliffe, M„ Tessarollo, L., Keller, J.R., Kuprash, D.V. and Nedospasov, S.A. Novel Lymphotoxin a knockout mice with unperturbed TNF expression: reassessing LTa biological functions. 2006. Mol. Cell. Biol. 26(8), 541550.

Тезисы конференций:

1. Drntslcaya MS, Kuprash DV, Nedospasov SA, Keller JR. Dual function of TNF as regulator of myelopoiesis in long-term bone marrow cultures. Abstract for joint meeting of the Society of Leukocyte Biology and the International Cytokine Society, Maui, USA. 2001. J. of Leukocyte Biology. 125 Suppl. S

2. С.И. Гривенников, A.B. Туманов, M.C. Друцкая, Д. Такеда, Е. Саутон, JI.H. Друцкая, Б. Клозен, И. Фостер, JI. Тессаролло, Д.В. Купраш, С.А. Недоспасов. Фактор некроза опухолей, производимый Т-лимфоцитами и макрофагами, необходим для устойчивости к листериозу. "Цитокины, воспаление, иммунитет", стр. 110, Санкт-Петербург, 2002.

3. Drntslcaya MS, Ortiz М, Kuprash DV, Nedospasov SA, Keller JR. Dual role of tumor necrosis factor in regulation of hematopoiesis. Abstract for 10th International TNF Superfamily Conference, Lausanne, Switzerland, 2004.

*-57Н

Подписано в печать 06.03.2006 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 497 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Друцкая, Марина Сергеевна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы

Кроветворная система: устройство и регуляция.

Семейство ФНО: цитокины-лиганды и их рецепторы.

Молекулярные механизмы передачи сигнала.

• Физиологическая роль ФНО в гемопоэзе.

Изучение кроветворения у мышей, дефицитных по рецепторам

ФНОР1 и ФНОР2.

Применение ФНО-блокаторов в медицине. Материалы и методы исследований

Мыши.

Генетическое типирование мышей.

Получение клеточных взвесей.

Проточная цитометрия.

Препаративная проточная цитометрия.

Длительные культуры костного мозга.

Культивирование клеток костного мозга в присутствии ростовых факторов.

Метод экзогенных селезеночных колоний.

Культуры клеток-предшественников гранулоцитов и макрофагов и полипотентных миелоидных клеток-предшественников. ф Культуры эритроидных клеток-предшественников.

Получение костпо-мозговых химер для опыта по конкурентной репопуляции.

Статистический анализ.

Результаты и обсуждение

ФНО как ингибитор миелопоэза in vitro.

Роль ФНО в регуляции пролиферации и дифференцировке тучных клеток.

Минимальиые аномалии в кроветворении у ФНО-дефицитных мышей.

ФНО - ингибитор ранних (КОЕ-с) и коммитированных кроветворных клетокпредшественников (КОЕ-гм) ш vivo.

Нарушенная динамика гемопоэза у мышей с комбинированным ФНО/JIT дефицитом.

У мышей с комбинированным ФНО/ЛТ дефицитом повышено количество СКК в костном мозге.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль фактора некроза опухолей в поддержании гемопоэза у мышей"

Изучение молекулярных основ процессов, связанных с регуляцией гемопоэза, является одним из важнейших вопросов современной молекулярной биомедицины. Процессы регуляции кроветворения чрезвычайно сложны, т.к. должны обеспечивать адекватный ответ на потребности организма в различных клеточных элементах на протяжении всей его жизни. Гемопоэтическая система представляет собой совокупность клеточных популяций от наиболее примитивных плюрипотентных стволовых кроветворных клеток до зрелых клеток крови, каждая из которых обладает определенным пролиферативным потенциалом и выполняет специализированные функции. Стабильное кроветворение обеспечивается за счет постоянной продукции зрелых клеток крови. Известно, что ежедневный оборот клеток в кроветворной системе взрослого человека

19 составляет около 1x10 клеток. Такая количественная регуляция гемопоэза осуществляется на уровне коммитированных, т.е. «определившихся» в типе дифференцировки, клеток-предшественников, утративших способность к длительному самоподдержанию и полипотентность. Регуляция отдела плюрипотентных стволовых кроветворных клеток, обеспечивающих пеистощаемость кроветворения на протяжении всей жизни организма, осуществляется локально стромальным микроокружепием. Тем самым, регуляция гемопоэза у млекопитающих осуществляется на двух принципиально разных уровнях. В настоящее время охарактеризовано большое количество сигнальных молекул, действующих через клеточные рецепторы и участвующих в регуляции пролиферации и дифференцировки коммитированных кроветворных клеток-предшественииков соответствующих рядов кроветворения, т.е. обеспечивающих количественную регуляцию гемопоэза. Однако молекулярные механизмы процессов, связанных с регуляцией стволовых кроветворных клеток, до сих пор остаются мало изученными.

В течение многих лет исследователи занимаются изучением физиологической роли цитокинов, участвующих в регуляции жизненно важных для организма процессов, таких как иммунный ответ, гомеостаз, морфогенез и гемопоэз. Известно, что цитокины являются медиаторами этих процессов и на молекулярном уровне обеспечивают взаимодействие клеток различных тканей и органов между собой, что является неотъемлемым условием функционирования целого организма. Одним из таких цитокинов является фактор некроза опухолей (ФИО), который был впервые описан как белковый фактор, вырабатываемый макрофагами в ответ на стимуляцию бактериальным эндотоксином, активность которого способна приводить к геморрагическому некрозу опухолей на экспериментальных моделях (Carswell et al. 1975; Old 1988). Однако дальнейшие исследования показали, что ФИО обладает множеством физиологических активностей. Такая плейотропность ФНО, в первую очередь, связана с тем, что спектр клеток организма, способных экспрессировать ФНО или его рецепторы ФНОР1/р55 и ФНОР2/р75, а также родственные им молекулы (лиганды JITa, ЛТр, LIGHT и рецептор ЛТрР), чрезвычайно широк. Изучение мышей с генетической инактивацией ФНО убедительно продемонстрировало исключительную важность ФНО для защиты организма. В частности, стало ясно, что ФНО является важнейшим медиатором иммунного ответа и воспаления, а также участвует в формировании и поддержании структуры вторичных лимфоидных органов. Известно, что повышенный уровень ФНО в сыворотке крови часто ассоциируется с патофизиологией некоторых инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также септического шока. В настоящее время препараты, системно блокирующие действие ФНО, широко применяются в лечении ревматоидного артрита, болезни Крона, анкилозирующего спондилеза (окостеняющего воспаления позвоночника) и некоторых других аутоиммунных заболеваний. В последние годы активно разрабатываются клинические протоколы по применению ФНО-блокаторов при лечении миелодисплазий. Однако у небольшой части пациентов, находящихся на анти-ФНО терапии, наблюдаются серьезные побочные эффекты, связанные с подавлением функций иммунной системы. В связи с этим, актуальным остается вопрос об установлении всех физиологических функций ФНО в контексте целого организма.

Большой интерес представляет изучение роли ФНО в регуляции гемопоэза. Известно, что некоторые цитокины способны оказывать преимущественно стимулирующее или ингибирующее воздействие на определенную популяцию кроветворных клеток. Как оказалось, плейотроппость ФНО определяет более сложный характер его воздействия на гемопоэтические клетки. В частности, исследования в культуре с добавлением экзогенного ФНО продемонстрировали его роль в качестве бифункционального регулятора гемопоэза in vitro. При этом характер воздействия ФНО па гемопоэтические клетки in vitro обусловлен стадией дифференцировки клеток в культуре, наличием таких ростовых факторов как ИЛ-3, ФСК, ГМ-КСФ и др., а также количественным содержанием самого ФНО. Однако результаты таких исследований позволили лишь косвенно судить о физиологической роли ФНО в гемопоэзе in vivo, вследствие чего и возникла необходимость проведения дополнительных исследований на генетически модифицированных мышах. Исследования с культурами костного мозга, полученного от ФНО-дефицитных мышей, свидетельствуют об ингибирующей роли ФНО в миелопоэзе как на уровне гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников так и на уровне зрелых клеток в культуре (Дризе и др. 2000; Друцкая и др. 2001; Drutskaya et al. 2005). Одним из механизмов такого ингибировапия предположительно является опосредованная ФНО через ФНОР1 индукция апоптоза (Нифонтова и др. 2003).

Целью данного исследования было выявление физиологической роли ФНО в гемопоэзе in vivo и in vitro, а также решение вопроса о возможной «вырожденности» гемопоэтических функций ФНО и ЛТа за счет передачи сигнала через одни и те же рецепторы. Для разрешения этого вопроса исследования проводили на уникальной панели мышей, дефицитных («нокуатных») по генам ФНО и J1T, созданных в нашей лаборатории.

Кроветворная система: устройство и регуляция.

Кроветворная система представляет собой сложную иерархию различных клеточных популяций, каждая из которых находится на определенном уровне дифференцировки от наиболее примитивных до зрелых клеток крови, обладает характерным для данной популяции пролиферативным потенциалом и выполняет специализированные функции (Bedi and Sharkis 1995). В современной литературе различают следующие отделы кроветворной системы: отдел примитивных стволовых кроветворных клеток (п-СКК), отдел мультипотентных кроветворных предшественников (МПП), отдел олиго- и монопотентных (коммитированных) кроветворных предшественников, а также зрелые клетки крови (Рис. 1). Разделение между лимфоидным и миелоидным ростками дифференцировки происходит на этапе появления общего лимфоидпого и общего миелоидного предшественников (ОЛП и ОМП, соответственно) (Kondo et al. 1997; Akashi et al. 2000). Стабильность кроветворения обеспечивается, с одной стороны, за счет постоянного самообновления популяций кроветворных клеток-предшественников и самоподдержания популяции стволовых кроветворных клеток, с другой, - постоянной продукцией зрелых клеток крови. Известно, что регуляция гемопоэза у млекопитающих происходит на двух принципиально различных уровнях. В то время как регуляция пролиферации коммитированных клеток-предшественников происходит гуморально в ответ на запросы организма (Ogawa 1994), регуляция в отделе стволовых кроветворных клеток осуществляется стромальиым микроокружением и носит локальный характер (Muller-Sieburg and Deryugina 1995; Lemischka and Moore 2003).

СКК-дркм (J

Миелопоэз г—

СКК-кркм МПП со

•v омп

О мэп

БОЕ-э КОЕ-мег

КОЁ-э

КОЕ-м КОЕ-г КОЕ-зо КОЕ-баз

V„f ▼

Q, ? с j.

V ,

6' 4

Мегакариоцит

Эритроцит ф Нейтрофил Базофил Эозинофил

Тучная Клетка (?)

Про-В Про-Т о о пД-В

J> Y о о в т ^ Лимфоциты

Макрофаг

Дендритная Клетка (?) I I

Стволовые

Кроветворные

Клетки

Мультипотентные Клетки

Предшественники

Олигопотентные и Коммитированные Клетки

Предшественники

Зрелые

Клетки

Крови

Рисунок 1. Схема кроветворения и основные пути дифференцировки кроветворных клеток. На схеме не обозначен предшественник тучных клеток, предположительно они образуются из общего с гранулоцитами и макрофагами миелоидного предшественника (Arinobu et al. 2005). До последнего времени оставалось не выясненным происхождение и дендритных клеток. Однако недавно было показано, что субпопуляция дендритных клеток образуется из общего с макрофагами моноцитарного предшественника (Fogg et al. 2006).

Гемопоэз у млекопитающих происходит в костном мозге, а у грызунов еще и в селезенке. За один день в организме взрослого человека продуцируется и погибает 200x109 эритроцитов (book: Erslev et al., 1983) и 70x109 нейтрофилов (Dancey et al. 1976). Такой впечатляющий по своим масштабам процесс самообновления обеспечивает небольшая популяция стволовых кроветворных клеток, составляющая лишь 0.01%-0.05% от общего числа ядросодержащих клеток костного мозга (Morrison et al. 1995).

Стволовые кроветворные клетки (СКК) полипотентны. Это единственные клетки гемопоэтической ткани, которые в процессе кроветворения способны дифференцироваться во всех направлениях лимфо- и миелопоэза. Они обладают высоким пролиферативным потенциалом и способны к поддержанию кроветворения в течение длительного периода. В частности, при трансплантации костного мозга, благодаря именно этим клеткам можно наблюдать восстановление гемопоэтической системы у реципиентов (Spangrude et al. 1995b; Erna et al. 2000).

Само по себе понятие «стволовости» в литературе трактуется по-разному, что затрудняет четкое определение стволовой кроветворной клетки (Ogawa 1993). Некоторые исследователи под этим понятием подразумевают способность СКК продуцировать дочерние клетки с тем же пролиферативным потенциалом, что и родительские. Другие -основывают понятие «стволовости» на способности СКК к поддержанию кроветворения в течение длительного времени. Иногда стволовыми кроветворными клетками называют клетки, способные и к кратковременному поддержанию гемопоэза, т.е. способные продуцировать хотя бы одну генерацию дочерних клеток, без учета дальнейшего клонообразования (Дризе 1990). Так в современной литературе выделяют два типа стволовых кроветворных клеток в зависимости от способности этих клеток к длительному или же кратковременному поддержанию гемопоэза (СКК-дркм и СКК-кркм, соответственно) (Рис. 1). В данной работе стволовыми кроветворными клетками будут называться полипотентные клетки-предшественники с высоким пролиферативным потенциалом, находящиеся на самом примитивном уровне дифференцировки в иерархии кроветворных клеток.

Многочисленные исследования показали, что в норме большинство СКК находятся в Go стадии клеточного цикла. Об этом, в первую очередь, свидетельствуют данные, полученные при воздействии на клетки костного мозга 5-ФУ (Hodgson and Bradley 1979) или радиоактивного тимидина (Нага and Ogawa 1978), вызывающих гибель пролиферирующих клеток и не влияющих на «арестованные» в Go СКК.

На сегодняшний день получены исчерпывающие экспериментальные доказательства, свидетельствующие о полипотептпости СКК, т.е. способности к дифференцировке во все без исключения типы кроветворных клеток. Для этого использовали различные методы маркирования кроветворных клеток-предшественников, например, с помощью облучения, вызывающего хромосомные аберрации, или ретровирусов, способных к интеграции в случайные участки генома. Было показано, что маркированные СКК могут дифференцироваться по всем возможным направлениям, о чем свидетельствовало появление исходных маркеров в популяции зрелых миелоидных и лимфоидных клеток (Smith et al. 1991; Spangrude et al. 1995; Keller and Snodgrass 1990; Jordan and Lemischka 1990; Osawa et al. 1996; Krause et al. 2001).

Следует отметить, что популяция СКК является гетерогенной. Гетерогенность отдела СКК обусловлена, в первую очередь, способностью каждой отдельной клетки поддерживать лимфомиелопоэз в течение определенного времени после трансплантации. Так, например, показано, что у мышей в первые несколько недель после трансплантации костного мозга процесс репопуляции обеспечивается большим количеством плюрипотентных клеток-предшественников, в то время как на более поздних стадиях (через несколько месяцев) гемопоэз поддерживается всего лишь несколькими плюрипотентными предшественниками (Harrison 1993; Lemischka 1992; Дризе и др. 2001). Известно, что СКК способные к длительной или кратковременной репопуляции костного мозга могут быть фепотипически различимы по маркерам, экспрессированным на клеточной поверхности (Morrison and Weissman 1994;Spangrude and Johnson 1990). Таким образом, гетерогенность отдела СКК определяется «примитивностью» этих клеток, которая, в свою очередь, обусловлена их пролиферативным потенциалом и оценивается способностью этих клеток репопулировать костный мозг облученных реципиентов в течение определенного времени.

Сложный процесс регуляции кроветворения должен, с одной стороны, удовлетворять запрос организма на определенный клеточный состав и соотношение между клетками крови по всем линиям дифференцировки, с другой - обеспечивать неистощаемость популяции кроветворных клеток-предшественников. Если предположить, что дифференцировка СКК зависит от потребностей организма в клетках того или иного типа, то как же тогда обеспечивается сохранение пула СКК в случае сильного гемопоэтического стресса, вызванного, например, кровопотерей, облучением или введением цитостатиков, когда большая часть кроветворных клеток-предшественников погибает, а оставшиеся - подвергаются сильному воздействию дифференцировочиых факторов? В 1964 г. была предложена так называемая стохастическая модель кроветворения, согласно которой пролиферация и дифференцировка СКК, а также выбор направления дифференцировки происходит независимо от запроса организма (Till et al. 1964). В доказательство этому служат результаты многочисленных in vitro и in vivo исследований (Ogawa 1999; Muller-Sieburg etal. 2002; Envere/al. 1998). С другой стороны, существует и другая составляющая регуляции отдела СКК - это стромальное микроокружение, которое способно модифицировать кинетику пролиферации этой клеточной популяции. Стромальные клетки находятся в тесном контакте с популяцией СКК. Об этом, в первую очередь, свидетельствуют данные, полученные в длительных культурах костного мозга, где более зрелые клетки-предшественники функционируют в жидкой среде, в то время как более примитивные клетки-предшественники и СКК тесно взаимодействуют со стромальными клетками, образующими подслой прилипающих клеток в культуре (Muller-Sieburg and Deryugina 1995; Rogers and Berman 1993). Современные методы иммунногистохимического анализа позволяют проследить тесное взаимодействие СКК с клетками кроветворного микроокружения и in vivo. (Calvi et al. 2003; Zhang et al. 2003)

Строма кроветворных органов имеет довольно сложный состав и включает эндотелиальные, жировые, гладкомышечные или ретикулярные клетки, фибробласты, остеобласты и внеклеточный матрикс, представленный преимущественно коллагеновыми волокнами, протеогликанами и гликопротеидами (Fuchs et al. 2004; Watt and Hogan 2000; Klein 1995). Как уже упоминалось ранее, стромальные и гемопоэтические клетки находятся в тесном взаимодействии друг с другом, которое осуществляется за счет молекул адгезии. Помимо молекул адгезии, важную роль в этом взаимодействии играют рецепторы цитокинов, с которыми связываются либо растворимые лиганды внеклеточного матрикса, либо мембранно-связанные лиганды (Рисунок 2). По всей видимости, решение СКК на пролиферацию или дифференцировку, так же как и выбор направления дифференцировки обеспечивает совокупность внутренних (генетических) и внешних стромальных) стимулов.

Рисунок 2. Молекулярные сигналы, обеспечивающие взаимодействие стволовой кроветворной клетки со стромой (Wilson and Trumpp 2006)

Таким образом, регуляция гемопоэза осуществляется на двух принципиально отличных друг от друга уровнях. Количественная регуляция гемопоэза, обусловленная запросом на зрелые клетки, происходит на уровне коммитированпых клеток-предшественников, утративших способность к длительному поддержанию и полипотептность (Меи^а^ 1998). Такая регуляция осуществляется при участии различных ростовых факторов, способных индуцировать дифференцировку и пролиферацию коммитированных клеток-предшественников соответствующих рядов кроветворения. В отличие от гормональной регуляции на уровне коммитированных клеток-предшественников, регуляция СКК носит локальный характер и осуществляется на принципиально другом уровне под строгим контролем стромалыюго микроокружепия.

В настоящее время различают три категории цитокинов, участвующих в регуляции гемопоэза. Эта классификация основана на степени дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников: (1) регуляторы коммитированных монопотентных кроветворных клеток-предшественников, (2) регуляторы полипотентных кроветворных клеток-предшествепников, (3) регуляторы «молчащих», непролиферирующих, стволовых кроветворных клеток и лимфопоэза. К первой группе цитокинов относятся такие факторы как эритропоэтин, М-КСФ, Г-КСФ, ИЛ-5. Эти цитокипы способствуют терминальной дифференцировке коммитированных клеток-предшественников до зрелых клеток соответствующего направления. Ко второй группе, регулирующей полипотентные предшественники, находящиеся в клеточном цикле, относятся ИЛ-3, ГМ-КСФ, ИЛ-4. И, наконец, третья группа, способная активировать «молчащие» СКК, а также поддерживать лимфопоэз, включает такие цитокины как ИЛ-б, Г-КСФ, ИЛ-11, ИЛ-12, ЛИФ, ФСК. Помимо вышеперечисленных ростовых факторов важную роль в регуляции гемопоэза играют так называемые негативные регуляторы, к которым относятся некоторые интерфероны, ФНО, TGFp и др. (Ogawa 1993). Подробнее роль ФИО в гемопоэзе будет обсуждаться дальше.

Семейство ФНО: цитокины-лигапды и их рецепторы.

В настоящий момент в литературе описано около пятидесяти молекул, лигандов и рецепторов, относящихся к суперсемейству ФНО (Недоспасов 2003; Locksley et al. 2001; Fu and Chaplin 1999; Aggarwal 2003). С одной стороны, лиганды суперсемейства ФНО, передавая сигнал через свои рецепторы, участвуют в поддержании нормальных функций организма, таких как иммунный ответ, гемопоэз и морфогенез. С другой - доказано участие этих молекул в развитии онкологических и аутоиммунных заболеваний, отторжении ткани при трансплантации, резорбции кости, септическом шоке и вирусной репликации. На клеточном уровне взаимодействие лигандов и рецепторов этого суперсемейства может индуцировать пролиферацию, дифферепцировку, выживание или же апоптоз. При этом передача сигнала внутри клетки осуществляется через активацию различных сигнальных каскадов при участии молекул NF-кВ, Jun/Fos, р38 МАРК and ERK1/ERK2.

Подсемейство ФНО входит в состав суперсемейства и включает близкородственные лиганды: ФНО, JITa, JITp и LIGHT, и их рецепторы; ФНОР1, ФНОР2, JITpP, HVEM (рецептор герпес-вируса) и DcR3 (рецептор-приманка или «пустышка» 3). Характерной особенностью взаимодействия лигандов и рецепторов подсемейства ФНО является избыточность сигнала, при которой лигапд может взаимодействовать сразу с несколькими рецепторами, а рецептор принимать сигнал от нескольких лигандов (Рис. 3).

Рисунок 3. Схема передачи сигналов цитокинами подсемейства ФНО/JIT.

Это обстоятельство усложняет задачу исследователей по выявлению физиологической роли отдельных лигандов и рецепторов подсемейства ФНО. Первые подходы к изучению структуры ФНО, механизма и характера его воздействий были сделаны после клонирования кДНК ФНО (Pennica er а/. 1984; Wang et al. 1985). ФНО и наиболее близкородственный ему цитокин, лимфотоксин а (ЛТ) (Kolb and Granger 1968; Ruddle and Waksman 1967), были первыми представителями быстро растущего семейства ФНО лигандов. Гены, кодирующие данные цитокины, а также ЛТр, тесно генетически сцеплены и расположены в пределах 15Кб в локусе ФНО внутри локуса (Рис. 4), кодирующего гены главного комплекса гистосовместимости на хромосоме 17 мыши и хромосоме 6 человека (Nedospasov et al. 1986; Browning and French 2002; Murphy et al. 1998). В биологически активной форме лиганды подсемейства ФНО образуют тримеры, которые, в свою очередь, способствуют тримеризации соответствующих рецепторных молекул на поверхности клетки и последующей передаче внутриклеточного сигнала.

Промотор гена ЛТр. Сайт связывания нескольких транскрипционных факторов, в том числе ЫР-кВ^е1.

NF-kB/Rel -зависимый энхансер транскрипции гена ФНО и, возможно, ЛТа.

Проксимальный» промотор гена ФНО.

AU-богатый участок, регулирующий время жизни мРНКФНО

Промотор гена ЛТа, содержит участки связывания ядерных белков семейства ЫРАТ.

Интронный энхансер

Дистальная» область промотера гена ФНО. Сайт связывания NF-kB/Rel.

Рисунок 4. Конфигурация локуса ФНО/ЛТ мыши и расположение некоторых регуляторных элементов, участвующих в транскрипционном и посттранскрипционном контроле (Недоспасов 2003).

При этом цитокины-лиганды подсемейства ФНО могут функционировать как в растворимой, так и в мембранно-связанной форме, в виде трансмембранных белков Н-го типа. Так, ФНО и ЛТа являются растворимыми гомотримерами и взаимодействуют с рецепторами ФНОР1 и ФНОР2, которые также называют исходя из молекулярной массы этих белков: 55KÜa и 75кОа, соответственно р55 и р75 (Ware et al. 1995). Что касается ФНО, то он преимущественно существует в растворимой форме, хотя его мембранно-связанная форма также биологически активна (Grell et al. 1995; Grell et al. 1998a; Kinkhabwala et al. 1990). Лимфотоксин ß преимущественно функционирует в виде мембранного комплекса с лимфотоксином ос (ЛТщЛТрг). Такой гетеротример взаимодействует со специфичным для него ЛТр рецептором, экспрессия которого наблюдается преимущественно среди клеток нелимфоидного происхождения (Crowe et al. 1994).

В отличие от JIT, который продуцируется клетками лимфоидного происхождения: Т и В лимфоцитами и NK клетками (Ware et al. 1992), ФНО экспрессируют многие клетки организма, в том числе макрофаги, активированные лимфоциты, нейтрофилы, дендритные и эндотелиальные клетки, фибробласты и многие другие типы клеток как гемопоэтической, так и не-костномозговой природы (Pfeffer 2003; Cuturi et al. 1987; Kelker et al. 1985). Основной рецептор ФНО, ФНОР1, экспрессируется большинством клеток организма, а ФНОР2 - преимущественно клетками иммунной системы и эндотелия. Такой характер экспрессии указывает на роль лигандов и рецепторов ФНО в передаче сигналов между клетками иммунной системы, но, помимо этого, обеспечивает взаимодействие клеток иммунной системы с клетками других тканей и органов, что, в конечном итоге, обеспечивает поддержание гомеостаза целого организма.

Молекулярные механизмы передачи сигнала.

Все рецепторы семейства ФНО по структуре своего цитоплазматического домена могут быть разбиты на две подгруппы: содержащие и не содержащие так называемый «домен смерти». Изначально предполагали, что ингибирующее воздействие ФНО на клеточную пролиферацию, а точнее передача апоптотических сигналов, происходит при участии ФНОР1, в то время как все активационные сигналы передаются через ФНОР2, который не содержит «домена смерти». Однако дальнейшие исследования усложнили картину, показав, что оба рецептора способны передавать сигналы как на клеточную активацию, так и на апоптоз. Еще в 90-х годах было обнаружено, что помимо цитотоксической активности ФНО, передаваемой через ФНОР1 и индуцирующей клеточную гибель, ФНОР1 также может передавать активирующий сигнал на пролиферацию фибробластов и сиитез простагландина (Engelmann et al. 1990; Espevik et al. 1990). С другой стороны было показано, что ФНОР2 отвечает за передачу активирующего сигнала на пролиферацию Тлимфоцитов (Grell et al. 1998a; Tartaglia et al. 1993a) и синтез ГМ-КСФ in vitro (Vandenabeele et al. 1992), а также ингибирует пролиферацию ранних гемопоэтических клеток-предшественников in vitro (Jacobsen et al 1995) и передает сигнал на апоптоз зрелым Т-лимфоцитам (Zheng et al. 1995). В отличие от ФНОР2, молекулярный механизм передачи сигнала через ФНОР1 является изучен достаточно полно. Характерной особенностью этого рецептора является наличие «домена смерти», что в классификации ФНО рецепторов позволяет относить его к группе «рецепторов смерти», к которой также принадлежит и Fas рецептор. Однако в отличие от Fas рецептора, ФНОР1 способен при участии целого ряда адаптерных молекул одновременно запускать каскады, приводящие к противоположным по результату сигналам, а именно активации нескольких ключевых транскрипционных факторов, таких как NFkB и API, фосфорилировапию многих клеточных субстратов соответствующими протеинкиназами, активации каспаз и, как следствие, программированной клеточной смерти (Рис. 5) (Wallach et al. 1999; Micheau and Tschopp 2003; Shaulian and Karin 2002; Karin and Lin 2002). Транскрипционные факторы NFkB и API, в свою очередь, способны активировать транскрипцию более чем сотни генов, среди которых провоспалительные цитокины и молекулы адгезии, большинство из которых вовлечены в развитие и регуляцию иммунного ответа, процесса тесно связанного с гемопоэзом. Важно, что среди генов, находящихся под контролем активирующих каскадов ФНОР1, есть гены, обеспечивающие защиту от апоптоза. Так, белки XIAP, с-1АР1,2 и c-FLIPl являются ингибиторами каспаз, в то время как Bcl-xL и AI ингибируют апоптотические сигналы, передаваемые через митохондрию (Karin and Lin 2002) (Grivennikov et al. 2006, в печати). Таким образом, в ответ на действие ФНО в большинстве клеток «по умолчанию» реализуется суммарный сигнал активации. Но в специальных условиях, когда продукция протективных факторов ослаблена (это может быть связано с общим состоянием биосинтеза белка, т.е. отражать «голодание» или старение клетки), суммарным эффектов действия ФНО через ФНОР1 будет программируемая клеточная гибель. В частности, было показано, что ФНО может индуцировать сигнальный каскад, приводящий к ингибированию экспрессии ЬТЕЯ Г, каталитической субъединицы теломеразы, и таким образом оказывать негативное воздействие на выживание, процесс репарации ДНК и генетическую стабильность СЭ34+ клеток (Веупе-Яаигу е/ а1. 2005). fc-Jun) ( Bid ) jBid

SURVIVAL inflammation cytokines, adhesion molecules cytC cas

A Apaf-1

ЦЦУШЛ,:

Рисунок 5. Основные пути передачи сигнала ФНОР1 (Опуепшкоу а1. 2006, в печати). Недавно был предложен новый механизм возможной ФНО опосредованной регуляции гемопоэтических клеток-предшественников.

Физиологическая роль ФНО в гемопоэзе.

Фактор некроза опухолей (ФНО) был впервые описан как белковый фактор, предположительно вырабатываемый макрофагами в ответ на стимуляцию бактериальным эндотоксином, и способный приводить к геморрагическому некрозу опухолей на экспериментальных моделях (Carswell et al. 1975; Old 1988). При этом еще в 1893 году американский хирург William Coley наблюдал проявление той же активности, описывая случаи спонтанной регрессии опухоли у больных острыми инфекционными заболеваниями (Coley 1893). Несмотря на то, что ФНО традиционно относят к классу провоспалительных цитокинов, он обладает наиболее широким среди всех известных цитокинов спектром физиологических активностей. Такая многофункциональность обусловлена тем, что в соей растворимой или мембранно-связанной форме ФНО может экспрессироваться многими типами клеток в разных количествах и с разной кинетикой в зависимости от типа индуцирующего сигнала.

Физиологическая роль ФНО в процессах связанных с гемопоэзом также носит многосторонний характер. В современной литературе встречаются данные, свидетельствующие как об ингибирующем, так и о стимулирующем воздействии ФНО на гемопоэтические клетки-предшественники in vitro (Jacobsen et al. 1992; Jacobsen et al. 1994; Rusten et al. 1994a; Rogers and Berman 1994; Caux et al. 1990; Snoeck et al. 1996). Так, была показана роль ФНО в регуляции дифференцировки коммитированных макрофагальных, гранулоцитарных и эритроидных клеток-предшественников (Caux et al. 1991; Fahlman et al. 1994; Witscll and Schook 1993; Rusten and Jacobsen 1995; Dybedal et al. 2001). Исследования последних лет с культурами клеток костного мозга, полученного из ФНО-дефицитных мышей, свидетельствуют также и о возможном участии ФНО в дифференцировке дендритных (Abe et al. 2003; Lardon et al. 1997) и тучных клеток (Wright et al. 2006). Показано, что ипгибирующее воздействие на кроветворные клетки-предшетсвешгики in vitro может осуществляться как при участии ФНОР1, так и при участии ФНОР2 (Dybedal et al. 2001 ; Jacobsen et al. 1994; Jacobsen et al. 1995). Однако, стоит отметить, что исследования по изучению роли этих рецепторов в регуляции гемопоэза in vivo не выявили существенных нарушений в кроветворении у мышей, дефицитных по р75/ФНОР2, в отличие от мышей, дефицитных по ФНОР1 (Rebel et al.

1999; Zhang et al, 1995). Помимо этого, существуют данные, свидетельствующие о том, что ФНО участвует в регуляции экспрессии различных гемопоэтических ростовых факторов, таких как ИЛ-1, ИЛ-6, ГМ-КСФ, Г-КСФ, как кроветворными так и стромальными клетками и таким образом стимулирует миелопоэз in v/7ro(Jacobsen et al. 1994). Такая непрямая регуляция гемопоэза может осуществляться также за счет ФНО опосредованной регуляции экспрессии некоторых рецепторов ростовых факторов. Так, например, показано, что ФНО способен стимулировать экспрессию рецепторов ИЛ-3 и ГМ-КСФ (Elbaz et al. 1991) и, наоборот, оказывать ингибирующее воздействие на экспрессию рецептора Г-КСФ (Jacobsen et al. 1992) и c-Kit (рецептор фактора стволовых клеток) (Jacobsen et al. 1995; Rusten et al. 1994b; Khoury et al. 1994).

Вышеперечисленные данные свидетельствующие о возможной роли ФНО в регуляции гемопоэза основывались преимущественно на исследованиях с использованием рекомбинантного ФНО in vitro. Эти исследования показали, что многофункциональность ФНО в регуляции гемопоэза определяется такими факторами как стадия дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников, количественного содержания ФНО и присутствия других цитокинов и ростовых факторов в культуре, способных индуцировать пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических клеток-предшественников in vitro. Длительные культуры костного мозга, максимально приближенные к in vivo модели кроветворения, показали динамику кроветворения на уровне зрелых клеток и гетерогенной популяции клеток-предшественников. В частности, исследования с культурами костного мозга, полученного из ФНО-дефицитных мышей, свидетельствуют об ингибирующей роли ФНО в миелопоэзе как на уровне гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников, так и на уровне зрелых клеток в культуре (Дризе и др. 2000; Друцкая и др. 2001;Drutskaya et al. 2005). Интересно, что помимо повышенной клеточной продукции в ФНО-дефицитных длительных культурах костного мозга, значительно увеличена и продолжительность жизни этих культур по сравнению с ДТ (Эршлер и др. 2002; Нифонтова и др. 2003). Одним из механизмов такого ингибирования предположительно является опосредованная ФНО через ФНОР1 индукция апоптоза (Нифонтова и др. 2002). Однако более ранние исследования по изучению кроветворения в длительных культурах костного мозга показали, что ФНО может также оказывать и стимулирующее воздействие на пролиферацию и дифференцировку самых ранних кроветворных клеток-предшественников (Rogers and Berman 1993). Тем не менее, наиболее интересный аспект, а именно регуляция примитивных стволовых кроветворных клеток остается малоизученным.

Отдельным вопросом в изучении физиологической роли ФНО в регуляции кроветворения является его влияние па взаимодействия между кроветворными и стромальными клетками костного мозга. Известно, что стромалыюе микроокружение играет ключевую роль в регуляции пролиферации и дифференцировки стволовых кроветворных клеток (СКК) (Wilson and Trumpp 2006). К стромальным клеткам, в первую очередь, относятся фибробласты, адипоциты, гладкомышечпые и эндотелиальные клетки, макрофаги и остеобласты. Известно, что в длительной культуре костного мозга ФНО может индуцировать перестройку кроветворного микроокружения ингибируя пролиферацию адипоцитов (Khoury et al. 1992), а также изменять адгезивные свойства эндотелиальных клеток (Hahne et al. 1993;VandenBerg et al. 2004). Как уже упоминалось, остеобласты играют важную роль в формировании «гемопоэтической ниши» для п-СКК (Calvi et al. 2003; Zhang et al. 2003). При этом показано, что ФНО принимает непосредственное участие в регуляции остеогенеза (Azuma et al. 2000; Gerstenfeld et al. 2001; Zhang et al. 2001). Большое количество исследований свидетельствует о важной роли как ФНО, так и близкородственного J1T в регуляции формирования лимфоидпой стромы in vivo (Pasparakis et al. 1996; Pasparakis et al. 2000; Tumanov et al. 2003), а также опосредованной через ФНОР1 активации экспрессии целого ряда хемокипов (Algood et al. 2003; Tessier et al. 1998; Tessier et al. 1997). Предполагается, что экспрессия некоторых из этих хемокинов необходима также для взаимодействия между стромальными и кроветворными клетками костного мозга (Bruno et al. 2004). Однако возможная роль ФИО и JIT в регуляции стромалыюго микроокружения костного мозга in vivo пока не изучена. Интересно, что у больных ревматоидным артритом, заболевания, характерной особенностью которого является сверхэкспрессия ФИО, наблюдается пониженное содержание кроветворных клеток предшественников костного мозга, а также нарушения функций стромальных клеток костного мозга (Papadaki et al. 2002). Возможно, что опосредованная ФИО регуляция стромального микроокружения, которое в свою очередь регулирует кроветворные клетки-предшественники, является еще одним важным компонентом физиологической роли ФНО в гемопоэзе.

Результаты этих исследований лишь косвенно могут свидетельствовать о физиологической роли ФНО в регуляции отдела стволовых кроветворных клеток in vivo в силу ряда обстоятельств. Во-первых, только в последние годы стало возможным получить функционально однородные популяции СКК для изучения роли ФНО в пролиферации и дифференцировке примитивных гемопоэтических клеток-предшественников in vitro. Во-вторых, как уже упоминалось ранее, ключевую роль в регуляции стволовых кроветворных клеток играет стромалыюе микроокружение. Эта регуляция осуществляется локально, т.е. функционально активные клетки стромы находятся в непосредственном контакте с гемопоэтическими клетками. Ясно, что при получении фракции п-СКК для in vitro анализа происходит разобщение сложной сети взаимодействий между кроветворными предшественниками и стромальным микроокружением. В-третьих, in vitro исследования не позволяют изучать динамику СКК, способных к длительной репопуляции костного мозга, т.е. отвечающих за поддержание кроветворения на протяжении всей жизни организма, что представляется наиболее важным аспектом для понимания динамики кроветворения при трансплантации костного мозга. И, наконец, изучение роли ФНО в регуляции п-СКК осложняется высокой вырожденностью сигналов, передаваемых через два его рецептора, ФНОР1 и ФНОР2.

Достижения последних лет в области молекулярной генетики сделали возможным получение генетически модифицированных животных. В частности, стало возможным получение мышей, со специфической инактивацией гена-мишени или целого семейства родственных генов. Интересно, что первые исследования по выявлению возможной роли ФНО в регуляции гемопоэза были сделаны с использованием мышей, дефицитных по двум рецепторам ФНО, ФНОР1/р55 (Pfeffer et al. 1993) и ФНОР2/р75 (Erickson et al. 1994). Результаты этих исследований не выявили существенных нарушений в кроветворении у мышей, дефицитных по ФНОР2. Однако мыши, дефицитные по ФНОР1, имели ряд важных отличий от мышей ДТ, что свидетельствует о возможной роли этого рецептора, а, следовательно, и сигнала передаваемого через данный рецептор в регуляции гемопоэза на уровне стволовых кроветворных клеток (СКК). Следует отметить, что передача сигнала опосредованного ФНО осуществляется преимущественно через р55/ФНОР1, а не р75/ФНОР2 (Tartaglia et al. 1993b; Weiss et al. 1997; Grell et al. 1998b).

Однако полноценные, исследования по выявлению физиологической роли ФНО в кроветворении in vivo, с использованием мышей, дефицитных по ФНО, до сих пор не проводились. Более того, в наших работах помимо изучения гемопоэза у ФНО-дефицитных мышей, был проведен анализ гемопоэза у мышей, дефицитных сразу по трем генам ФНО/ЛТа/JITß («тройной нокаут») (Kuprash et al. 2002), что позволило исследовать вопрос о «вырожденности» сигнала, передающегося ФНО и ЛТа через одни и те же рецепторы. Преимущество исследований с использованием генетически модифицированных животных заключается в том, что стало возможным изучение динамики пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток с изначально нарушенным сигнальным каскадом опосредованным ФНО и JIT в контексте целого организма. Кроме того, были получены трансгенные мыши, у которых мышиный ген ФНО функционально замещен его человеческим гомологом, что позволило исследовать влияние повышенной экспрессии человеческого ФНО на гемопоэтическую систему и более детально исследовать воздействие препаратов, широко используемых при лечении аутоиммунных заболеваний и блокирующих действие ФНО, в т.ч. на гемопоэз.

Изучение кроветворения у мышей, дефицитных но рецепторам ФНОР1 и ФНОР2

Анализ популяций стволовых кроветворных клеток и кроветворных клеток-предшественников костного мозга КО мышей и мышей ДТ показал, что у мышей, дефицитных по ФНОР1, наблюдается значительное увеличение в количестве этих клеток по сравнению с контрольной группой и мышами, дефицитными по ФНОР2 (Zhang et al. 1995). Эти результаты могут свидетельствовать об ингибирующем воздействии ФНО на пролиферацию и дифференцировку ранних кроветворных клеток-предшественников in vivo, причем эта регуляция осуществляется, главным образом, через ФНОРI. Через несколько лет были опубликованы еще более интригующие результаты, свидетельствующие об участии ФНОР1 в передаче регуляторных сигналов стволовым кроветворным клеткам костного мозга. Было показано, что при анализе клеток костного мозга стареющих мышей (>6 мес.), дефицитных по ФНОР1, наблюдаются существенные нарушения в динамике кроветворения по многим параметрам по сравнению с мышами ДТ (Rebel et al. 1999). В первую очередь, у таких стареющих мышей популяция стволовых кроветворных клеток костного мозга значительно меньше, чем у мышей ДТ. Во-вторых, у КО мышей со временем происходит увеличение как общего количества клеток костного мозга, так и количества коммитированпых клеток-предшественников миелоидного типа дифференцировки и зрелых клеток периферической крови. Эти данные абсолютно не противоречат ранее полученным результатам Zhang et al. (1995).

Исходя из двух вышеперечисленных исследований можно предположить, что передача сигнала через ФНОР1 играет важную роль в регуляции отдела стволовых кроветворных клеток костного мозга. Более того, отсутствие этого сигнала нарушает строгий баланс между процессами пролиферации (самообновлением) и дифференцировки п-СКК, в результате чего происходит ускоренное истощение популяции п-СКК и увеличение количества коммитировапных клеток-предшественников. Однако следует отметить, что эти данные могут лишь косвенно свидетельствовать об участии ФНО в регуляции п-СКК in vivo, т.к. известно, что помимо ФНО передачу сигнала через ФНОР1 осуществляет родственный ему цитокип, лимфотоксип а (JITa). Именно поэтому изучение динамики кроветворения и регуляции стволовых кроветворных клеток у мышей, дефицитных по ФНО, должно было прояснить физиологическую роль ФНО в гемопоэзе in vivo. Помимо этого, был исследован вопрос и о возможной избыточности сигнала передаваемого ФНО и ЛТ через ФНОР1 и ФНОР2 в регуляции гемопоэза in vivo. Для этого некоторые исследования проводили с использованием мышей, дефицитных как по ФНО, так и по ЛТ.

Применение ФНО-блокаторов в медицине

Еще в 80-х годах было сформулировано представление о «хорошем» и «плохом» ФНО, который помимо вышеописанных нормальных физиологических функций может являться и медиатором разрушительных для организма процессов. Известно, что повышенный уровень ФНО в сыворотке больных часто ассоциируется с развитием некоторых инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также септического шока. В настоящий момент роль ФНО в патофизиологии целого ряда аутоиммунных заболеваний является неоспоримым фактом. В первую очередь речь идет о ревматоидном артрите и других типах артрита (Feldmann and Maini 2001 ; Kavanaugh et al. 2000; Fleischmann 2003), болезни Крона (Beutler 2001; Baert et al. 1999), анколизирующем спондилезе (Braun et al. 2003), псориазе (Mease and Goffe 2005) и др. Применение блокаторов, таких как Infliximab (сделанного на основе мопоклонального антитела, специфически распознающего и нейтрализующего ФИО человека) и Etanercept (генно-инжеперпый вариант растворимого рецептора ФНОР2, который может нейтрализовать как ФНО, так и растворимый JITa), способных биохимически подавлять функции ФНО in vivo является чрезвычайно перспективным направлением в лечении многих аутоиммунных заболеваний (Hochberg et al. 2003; Haraoui 2005; Scallon et al. 2002).

В последние годы особый интерес вызывает возможность применения ФНО-блокаторов при лечении различного рода миелодисплазий (Deeg et al. 2002; Deeg et al. 2004; Maciejewski et al. 2002). Синдром миелодисплазии (СМД) включает в себя целую группу гематологических заболеваний, связанных с нарушениями в регуляции отдела стволовых кроветворных клеток, что в некоторых случаях приводит к развитию у пациентов лейкемий. Однако почти половина летальных исходов от этого заболевания связаны не с клеточной трансформацией, а с клеточной недостаточностью в крови (анемия, нейтропения, тромбоцитопеиия) (Mangi and Mufti 1992; Molldrem et al. 2002). При этом, характерной особенностью СМД является повышенная клеточпость костного мозга, связанная с увеличением числа CD34+клеток, фенотип характерный для кроветворных клеток-предшествеппиков (Raza et al. 1996). Исследования показали, что одной из причин нарушений в регуляции гемопоэза у больных СМД является повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов, в частности ФНО, что приводит к увеличению клеточного апоптоза как в костном мозге, так и в крови (Gersuk et al. 1998; Mundle et al. 1999a; Mundle et al. 1999b; Zang et al. 2001). Первые клинические испытания заключались в попытке подавить функцию Т-лимфоцитов, продуцирующих провоспалительные цитокины, с помощью анти-тимоцит глобулина (АТГ) (Steensma et al. 2003; Molldrem et al. 2002). Однако в настоящее время активно изучается вопрос о целесообразности применения как АТГ, так и ФНО-блокаторов при терапии СМД (Deeg et al. 2004).

Однако системное ингибирование ФНО сопряжено с серьезными опасностями для организма, так как в его отсутствии изменяется структура лимфоидных органов и нарушается индукция многих механизмов антибактериальной защиты (Ehlers 2005). Так, например, у пациентов, страдающих ревматоидным артритом и находящихся на терапии с применением блокаторов ФНО, во много раз возрастает вероятность реактивации инфекционного туберкулеза (Fleischmann 2003; Wallis et al. 2004; Means et al. 2001; Wolfe et al. 2004; Gomez-Reino et al. 2003). В последние годы в литературе стали встречаться данные описывающие единичные случаи возникновения лимфом у пациентов, находящихся на анти-ФНО терапии (Brown et al. 2002; Broussais et al. 2005). С другой стороны, нельзя не упомянуть о клинических испытаниях анти-ФНО для лечения некоторых видов рака, поскольку для некоторых неоплазий ФНО - в явном несоответствии со своим названием - играет про-туморогенную роль (Szlosarek et al. 2006; Scott et al. 2003)

Материалы и методы исследований

Мыши.

В ходе работы использовали несколько линий ФНО-дефицитных мышей. Большая часть экспериментальной работы была проведена на "пео-Ггее" ФНО-дефицитных мышах, полученных ранее в нашей лаборатории с помощью ЬохР-Сге технологии (КиргаБЬ е/ а1. 2005) (Рис. 6В). В отдельных экспериментах параллельно проводили исследования на ФНО-дефицитных мышах, полученных с помощью «обычной» технологии, в результате которой часть кодирующей области гена была замещена маркером позитивной селекции, так называемой «нео-кассетой» (Раэрагак^ е/ а1. 1996;Маппо е( а1. 1997) (Рис. 6С и 60), при этом результаты по кроветворению, полученные на разных линиях ФНО-дефицитных мышей не имели радикальных отличий. Мыши, дефицитные по ЛТа, а также мыши с комбинированной инактивацией ФНО/ЛТ локуса были ранее получены в нашей лаборатории (ЫертвЬ е( а1. 2006 и КиргавЬ е1 а\. 2002, соответственно).

1Кб лтр

А ФНО/ЛТ локус ДГ | д ц

ФНО

ЛТа

-г~ш-имд—амнь

3 Кирга$Ь И а1.2005 лтр

НМЮ

ЛТа нь

Маппа «* »1.1997 лтр I ■ Шг

ФНО

ЛТа

А—ИЧГ^П—ОМНЬ в

Ра^агакЬ <* а1. 1996 лтр | г»«}

ФНО

ЛТа

-сгзи-юйен) шжнкнь

Рисунок 6. Схема инактивации гена ФНО в различных линиях исследуемых мышей.

Исходно все КО мыши были получены на смешанной генетической основе С57В1/6 х 8у129. Далее, КО мышей с вышеописанными генотипами скрещивали 8-10 раз с инбредной линией мышей С57В1/6. Работу проводили на мышах самцах и самках в возрасте 8-12 недель на момент начала опыта, в качестве контроля использовали С57В1/6 мышей или мышей дикого типа, полученных при скрещиваниях (littermate controls), соответствующего пола и возраста.

Гснстическое типирование мышей.

Анализ генотипа экспериментальных животных проводили при помощи метода ПЦР на геномной ДНК, выделенной из фрагмента хвоста. Для этого у мышей отрезали кончик хвоста длиной 0.3-0.5 мм и растворяли в лизирующем растворе (ЮОмМ Tirs-HCl, рН=8; 200мМ NaCl; 0.5% SDS; 0.5мМ EDTA, рН=8; 20 мкл протеиназы К, 10мг/мл). Пробы инкубировали при постоянном покачивании (3 часа, 55°С), затем центрифугировали (10 мин, 13000 об/мин) и переносили супернатант в чистую пробирку. Далее, к клеточному лизату добавляли 250 мкл 6М NaCl, встряхивали пробирку и центрифугировали (10 мин, 13000 об/мин). Супернатант переносили в чистую пробирку, стараясь не захватить осадок, и добавляли 800 мкл изопропанола. Пробирку переворачивали до выпадения плотного белого осадка. ДНК осаждали центрифугированием (10 мин, 13000 об/мин). Осадок однократно промывали 500 мкл 75% этанола и повторно осаждали (10 мин, 13000 об/мин). ДНК растворяли в 500 мкл ТЕ буфера, рН=7.5 (ЮмМ Tirs-HCl, рН=7.5; 1мМ EDTA, рН=8) и хранили при 4°С.

Для типирования "neo-free" ФНО-дефицитных мышей, полученных ранее в нашей лаборатории с помощью LoxP-Cre технологии (Kuprash et al. 2005) использовали праймеры К041 и К049 (дикий тип - 300 bp, нокаут - 450 bp). Для анализа генотипа двух линий ФНО-дефицитных мышей, полученных с помощью «обычной» технологии, использовали два набора праймеров: 549а, 549Ь и 549с для типирования мышей, полученных в лаборатории Pasparakis et al. (дикий тип - 250 bp, нокаут - 330 bp) и ММ01-02, ММ97-43 и ММ97-44 для типирования мышей, полученных в лаборатории Marino et al. дикий тип - 210 Ьр, нокаут - 600 Ьр). Мышей с комбинированной инактивацией ФНО/ЛТ локуса, ранее полученных в нашей лаборатории (КиргаэЬ е1 а1. 2002), типировали с помощью праймеров gtypel, gtype2 и §1уре4 (дикий тип - 350 Ьр, нокаут - 220 Ьр). Мышей, дефицитных по ЛТа, были типированы как описано в оригинальной статье по их получению (ЫертвЬ а1. 2006)

Последовательности праймеров, используемых для генетического типирования:

К041 5-TGAGTCTGTCTTAACTAACC

К042 5-CCCTTCATTCTCAAGGCACA

К049 5-CTCTTAAGACCCACTTGCTC

549а 5'-CAACCCACGGCTTCTTTCTG

549Ь 5'-ACAGAGTCAGGACCTCGGAC

549с 5-TCGCCAATGACAAGACGCTG

ММ01-02 5-ATCCTGGAGGGGAAGAGACAA

ММ97-43 5'-CCTTCTATCGCCTTCTTGACG

ММ97-44 5-ATCAGTTCTATGGCCCAGACC gtypel 5-CGGGTCTCCGACCTAGAGATC gtype2 5'-CCACAACAGGTGTGACTGTCTC gtype4 5-CCACTTGTCCAGTGCCTGCTC

Получение клеточных взвесей.

Для стерильного получения клеточной взвеси мышь забивали путем дислокации позвонка, и обмакивали в ванночке, содержащей 75% этанол. Далее, разрезали кожу между реберным краем и бедром. С помощью пинцетов тянули кожу в районе разреза так, чтобы оголить бедро. Лапку фиксировали в полусогнутом состоянии, и ножницами вырезали бедренную кость, освобождали ее от мягких тканей и удаляли эпифизы. Придерживая кость глазным пинцетом, шприцом с иглой для подкожных инъекций вымывали костный мозг 1-2 мл среды или PBS. Полученные клетки превращали в одноклеточную взвесь путем повторного пропускания через шприц и сохраняли на льду.

Для получения сплепоцитов мышь забивали, извлекали из брюшной полости селезенку и переносили в ситечко для клеточных взвесей, которое помещали в лунку 6-ти луночной платы. Селезенку растирали в 1-2 мл среды или PBS тупым концом внутреннего стержня шприца. Полученную взвесь пропускали через сито для клеточных взвесей и сохраняли на льду.

Для забора клеток крови мышей анестезировали. Стеклянный капилляр вводили под глазное яблоко и собирали кровь в пробирку, предварительно обработанную гепарином. Для дальнейшего анализа эритроциты лизировали в лизирующем буфере (0.15 М NH4CI, 1.0 мМ КНСОз, 0.1 мМ EDTA, рН=7.3), с последующим двукратным промыванием клеток PBS.

Для анализа популяции тучных клеток in vivo из брюшной полости выделяли фракцию клеток с помощью перитонеального лаважа. Для этого мышам внутрибрюшинно вводили 4 мл полной питательной среды RPMI. Далее, мышей забивали, интенсивно массировали брюшину в течение 1 мин. и проводили забор перитонеальных клеток. Анализ перитонеальных тучных клеток проводили с помощью проточной цитометрия.

Проточная цитометрия.

Цитофлуориметрический анализ зрелых клеточных популяций проводился как описано в Current Protocols in molecular biology and immunology, 1987-2002, John Wiley & Sons, Inc., New York. Клетки костного мозга, селезенки или крови после лизиса эритроцитов и последующего отмывания инкубировали с aHTH-CD16/CD32 антителами (Fc-block, BD Pharmingen) для блокирования неспецифического связывания. Затем клетки опять отмывали и окрашивали флуоресцентными антителами, мечеными FITC, РЕ CyChrome и др., к поверхностным маркерам дифференцированных клеток (Macl -макрофагальный, Grl - гранулоцитарный, CD3 - Т-клеточный, В220 - клеточный, Terl 19

- эритроидпый, BD Pharmingen). Для анализа тучных клеток выделяли фракцию перитопеальных клеток, отмывали и инкубировали с aHTH-CD16/CD32 антителами (Fc-block, BD Pharmingen) для блокирования песпецифического связывания. Затем клетки опять отмывали и окрашивали флуоресцентными апти-c-Kit-FITC и анти-IgE-PE . Для анализа ранних клеточных популяций (LinnegcKitposScalpos и LinnegcKitposScalneg фракций) клетки костного мозга инкубировали с aiiTH-CDl6/CD32 антителами (Fc-block, BD Pharmingen) для блокирования неспецифического связывания, отмывали и окрашивали смесью биотинилированных антител к поверхностным маркерам дифференцированных клеток (Macl - макрофагальный, Grl — гранулоцитарный, CD3 - Т-клеточный, В220 - В-клеточный, Terl 19 - эритроидный, BD Pharmingen), опять отмывали и окрашивали флуоресцентными антителами к c-Kit (рецептор фактора роста стволовых клеток) и Sca-1 (антиген стволовых клеток), мечеными FITC и РЕ, соответственно. Для детекции биотинилированных антител клетки инкубировали со стрептавидином конъюгированным с флуоресцентной меткой (Streptavidin-tricolor (ТС), BD Pharmingen). Анализ проводили на приборе FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) используя программы CellQuest и WinMDI.

Препаративная проточная цитометрип.

Для выделения фракций обогащенных кроветворными клетками-предшественниками и стволовыми кроветворными клетками (LinnegcKitposScalncg и LinneêcKitposScalpos, соответственно) сначала получали мононуклеарную фракцию клеток костного мозга. Для этого из бедренной кости выделяли костный мозг и получали одноклеточную взвесь, которую разделяли в градиенте плотности используя Lymphocyte Séparation Mix (Organon Technika, Durham, NC). Далее, мононуклеарную фракцию клеток костного мозга инкубировали на льду в течение 30 минут в присутствии смеси антител к маркерам дифференцировки гранулоцитов (Gr-1/RB6-8C5), В-клеток (B220/RA3-6B2), Т-клеток (CD8 /Lyt-2 и CD4/L3T4), макрофагов (CD1 lb/Mac-1) и эритроидиых клеток (Тег-119) из расчета 0.1 мкг антитела/106 клеток. Затем клетки отмывали и ресуспендировали в среде из расчета 108 клеток/мл для последующей иммунодеплеции. Для этого использовали магнитные шарики, покрытые антителами к крысиному иммуноглобулину G (anti-rat IgG, Dynal, New Hyde Park, NY) и получали очищенную от зрелых дифференцированных клеток (Linneg) фракцию клеток костного мозга. Очистку LinnegcKitposScalneg и LinnegcKitposScalpos клеток осуществляли при помощи клеточного сортера BD FACS Star, используя анти-c-Kit-FITC и airra-Sca-l-PE антитела. Степень очистки изучаемых клеточных популяций составляла >95%, что было подтверждено последующим FACS анализом. Анализ проводился на приборе FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) используя программы CellQuest и WinMDI. Очищенные LinnescKitposScalnee и LinnegcKitposScalpos клетки костного мозга культивировали in vitro или трансплантировали облученным реципиентам для оценки количественного содержания коммитированных и ранних кроветворных клеток-предшественников, соответственно.

Длительные культуры костного мозга.

Длительные культуры костного мозга вели по методу Декстера (Dexter et al. 1977). Костный мозг одной бедренной кости мыши в виде крупных клеточных агрегатов стерильно вымывали 5 мл среды Фишера в пластиковый матрас с площадью дна 25 см2. Культуру вели в 10 мл питательной среды: 8 мл среды Фишера (Gibco-BRL), 100 мкл 200мМ L-глутамииа (Gibco-BRL), 10 мкл 1мМ гидрокортизона (Sigma), 2 мл лошадиной сыворотки (Hyclone) и антибиотики из расчета 50 мкг/мл стрептомицина и 100ед/мл пенициллина. Культуру вели при 33°С с еженедельной сменой 50% среды. Клетки, удаленные при смене среды, осаждали центрифугированием и использовали для дальнейшего анализа.

Для морфологического анализа клеток в ДККМ на 10-й неделе культивирования 1х105 клеток из неприлипающей фракции осаждали центрифугированием па стекло с последующим окрашиванием May-Grunwald-Giemsa. Для каждой культуры определяли морфологию 400 клеток и вычисляли процентное соотношение миелобластов, промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов и сегментированных нейтрофилов в ФНО-дефицитных и контрольных ДККМ.

Культивирование клеток костного мозга в присутствии ростовых факторов

Клетки костного мозга, выделенные стерильно из бедренной кости, перемешивали до получения одноклеточной взвеси. Далее, 2x104 клеток костного мозга культивировали в 6-ти луночных платах в 3 мл полной питательной среды (cIMDM, Gibco-BRL) в присутствии гемопоэтических ростовых факторов, стимулирующих гранулоцитарный тип дифференцировки (100 нг/мл SCF, 30 нг/мл IL-3, 50нг/мл IL-6, 50 нг/мл G-CSF). Культуру вели при 37°С в течение 3-х педель. Клетки костного мозга культивировали в полной питательной среде RPMI (RPMI 1640, Life Technologies, Grand Island) в присутствии ростовых факторов IL-3 (5 нг/мл) и SCF (50 нг/мл) (Peprotech, Rocky Hill, NJ) в течение 37 недель для получения тучных клеток in vitro. В некоторых случаях в культуру добавляли ФНО (0.001-10 нг/мл) (Peprotech, Rocky Hill, NJ).

Метод экзогенных селезеночных колоний.

Для определения концентрации колониеобразующих единиц в селезенке (КОЕ-с) использовали метод Тилла и МакКаллока (Till et al. 1964). Этот метод экзогенных селезеночных колоний определяет ту часть популяции СКК, которая при внутривенном введении попадает в селезенку и может меняться в зависимости от трансплантируемых клеток и в результате различных воздействий на них. Такой анализ позволяет количественно установить различия между популяциями СКК контрольной и исследуемых групп при условии, что обе группы анализируют параллельно.

Мышей С57В1/6 облучали максимально переносимой дозой (9.5 Гр), при которой число эндогенных колоний не превышало 0.2 на селезенку. Клетки костного мозга вводили внутривенно через 2 часа после облучения животных в дозах 3-6x104 нефракционированных клеток/мышь или 1x103 ЫппеБсКИр058са1р05 клеток/мышь. При этом число колоний составляло 5-20 па селезенку, а количество мышей в группе не менее 6. Мышей забивали на 12-й день, извлекали селезенку и помещали в фиксирующий раствор (87% этанола, 4% ледяной уксусной кислоты, 9% формалина). Подсчет колоний кроветворных клеток в селезенке облученных реципиентов проводили под бинокулярной лупой.

Культуры клеток-предшественников гранулоцитов и макрофагов и полипотснтных мислоидных клеток-предшсственников.

Для определения концентрации колониеобразующих единиц гранулоцитарно-макрофагальных (КОЕ-гм) и общего количества клеток-предшественников миелоидного типа, в том числе полипотентных (КОЕ-к), образующих смешанные колонии, клетки костного мозга культивировали в полужидкой питательной среде в присутствии факторов, стимулирующих гранулоцитарно-макрофагальный тип дифференцировки и миелоидный тип дифференцировки. Для этого культивировали 5x104 нефракционированных клеток костного мозга или 3x1031лппеЕсКкр0!!8са1р015 клеток в полную питательную среду (с1МЭМ, 01Ьсо-В11Ь), содержащую 0.3% агарозы (БеаПаяие, РМС ВюРгос^ав), и добавляли гемопоэтические ростовые факторы из расчета 50 нг/мл вМ-СБР или 100 нг/мл БСР и 30 нг/мл IL-3 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) для оценки КОЕ-гм и КОЕ-к, соответственно. Клетки культивировали в 1 мл полужидкой среды в 35 мм чашках Петри. Культуру вели во влажном инкубаторе при 37°С, 5% СОг. Подсчет колоний проводили на 7-й день.

Культуры эритроидпых клеток-предшественников.

Для определения концентрации «бурстобразующих единиц эритроидпых» (БОЕ-э) 8x104 клеток костного мозга культивировали в 1 мл полужидкой питательной среды (IMDM, Gibco-BRL), содержащей 0.8% метилцеллюлозы, 25% эмбриональной телячьей сыворотки, 5x10"5 М ß-меркаптоэтанола и антибиотики, в присутствии гемопоэтических ростовых факторов из расчета 6 ед/мл эритропоэтина, 100 нг/мл SCF и 30 иг/мл IL-3 (Peprotech, Rocky Hill, NJ). Культуру вели в 35 мм чашках Петри во влажном инкубаторе при 37°С, 5% СОг. Подсчет колоний проводили на 7-й день.

Получение костномозговых химер для опыта но конкурентной рснопуляции.

В опытах по конкурентной репопуляции в качестве реципиентов использовали конгенпых мышей, отличающихся от классических мышей линии С57В1/6 лишь экспрессией Ly5.2 маркера вместо маркера Ly5.1 на поверхности большинства клеток организма, что позволило получить и в дальнейшем различать три группы костномозговых химер. Мышей облучали на установке с источником радиации 137Cs суммарной дозой 9.5 Гр. Такие условия облучения являются наиболее оптимальными для восстановления кроветворной системы при переносе донорского костного мозга и для выживания облученных животных. Первая группа (контрольная) после облучения была восстановлена смесью клеток костного мозга ДТ, полученного от двух конгенных доноров в соотношении Ly5.2 (ДТ) / Ly5.1 (ДТ) = 10/1 (1х106 и 1х105 клеток костного мозга, соответственно). Второю и третью группу мышей восстанавливали смесью клеток костного мозга мышей ДТ (Ly5.2) и нокаутиых мышей Ly5.1 (ФНО/ЛТа/ЛТр-/- и ФНО-/-, соответственно) в том же соотношении: Ly5.2 (ДТ) / Ly5.1 (КО) = 10/1.

Способность СКК, полученных из нокаутных мышей, репопулировать костный мозг облученных реципиентов оценивали через 4-6 месяцев после трансплантации. Для этого мышей забивали и извлекали костный мозг и селезенку. Полученные клеточные взвеси инкубировали с aHTH-CD16/CD32 антителами (Fc-block, BD Pharmingen) для блокирования песпецифического связывания. Затем клетки отмывали и окрашивали флуоресцентными антителами, мечеными РЕ, к поверхностным маркерам дифференцированных клеток (Macl - макрофагальный, Grl - гранулоцитарный, CD3 -Т-клеточный, В220 - В-клеточный, Terl 19 - эритроидный, BD Pharmingen) и антителами к Ly5.1 маркеру (CD45.2-FITC, BD Pharmingen), экспрессировапных на поверхности клеток костного мозга нокаутных мышей и мышей контрольной группы. Анализ конкурентной репопуляции проводили с помощью проточной цитофлуориметрии и сравнивали экспрессию Ly5.1 миелоидными клетками (Gr-1+ клетки) и В-лимфоцитами (В220+ клетки) в костном мозге и Т-лимфоцитами (CD3e+ клетки) в селезенке мышей в трех группах.

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов проводили по t-критерию Стыодепта при помощи программы GraphPad Software (www.graphpad.com/quickcalcs). российская государств »шля

БИБЛИОТЕК >5

Результаты и обсуждение.

Целью данной работы было выявление возможной роли фактора некроза опухолей и лимфотоксина а (ЛТа) в кроветворении у мышей. В качестве объекта исследований использовали мышей, дефицитных по ФНО (Kuprash et al. 2005, Marino et al. 1997, Pasparakis et al. 1997), а также мышей дефицитных по ЛТа (Liepinsh et al, 2006) и мышей с комбинированной ииактивацией, дефицитных по продуктам всех трех генов ФНО локуса (ФНО, ЛТа и ЛТР), созданных ранее в нашей лаборатории (Kuprash et al. 2002). В ходе работы были проведены исследования in vitro на культурах кроветворных клеток, и in vivo - на животных. Использованные методы позволили оценить динамику кроветворения у нокаутных животных и проследить различия на уровне как самых примитивных кроветворных клеток-предшественников - стволовых кроветворных клеток (СКК), способных к длительной репопуляции костного мозга облученных реципиентов, так и более зрелых предшественников, способных формировать колонии в селезенке облученных реципиентов in vivo или колонии в культуре in vitro. Изучение этих параметров позволило нам оценить роль сигнала, передаваемого ФНО и ЛТ через ФНО рецепторы в регуляции кроветворных клеток-предшественников, находящихся на разных уровнях в иерархии кроветворной системы.

ФНО как ингибитор мислопоэза in vitro.

Физиологическая роль ФНО в процессах связанных с гемопоэзом носит многосторонний характер. Многочисленные данные о возможной роли ФНО в регуляции гемопоэза основываются преимущественно на проведенных in vitro исследованиях с использованием рекомбинантного ФНО. Известно, что ФНО может оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее воздействие на гемопоэтические клетки in vitro в зависимости от наличия других ростовых факторов в культуре, а также от количественного содержания самого ФНО (Jacobsen et al. 1995, Snoeck et al. 1996, Rusten et al. 1995, Dybedal et al. 2001 и др.). В связи с этим нам представлялось важным исследовать физиологическую роль ФНО в регуляции кроветворных клеток-предшественников in vitro. Для этого мы изучали гемопоэз на модели длительной культуры костного мозга (ДККМ) нокаутных мышей, что позволило получить новые сведения о роли ФНО в развитии кроветворной ткани и охарактеризовать динамику пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток с изначально нарушенным сигнальным каскадом, опосредованным ФНО. Мы установили, что в ФНО-дефицитных культурах происходит двукратное увеличение клеточной продукции по сравнению с культурами дикого типа (ДТ) (Друцкая и др. 2001, Drutskaya et al. 2005). Добавление рекомбинантного ФНО (10 нг/мл) в ДККМ, полученных из ФНО-дефицитных мышей, приводило к снижению общего числа клеток в культуре до уровня ДТ (Рис.7А).

50 дт

-ФНО ко

ФНО КО + ФНОа В 3

УО о

3456789 10 11 недель в культуре в

120 100 ф

О 40

1т ДТ

Я ФНО ко

О 5 7 9 11 недель в культуре

Рисунок 7. Увеличение общего числа клеток и кроветворных клеток-предшественников в длительных культурах костного мозга ФНО-дефицитных мышей. А. Повышенная продукция клеток в ДККМ ФНО-дефицитных мышей. Добавление рекомбинантного ФНОа (10 нг/мл) к ФНО-дефицитным ДККМ приводит к снижению клеточной продукции до уровня ДТ. В. Нормальное содержание кроветворных клеток-предшественников, образующих колонии в агаровых культурах в присутствии тБСР (100нг/мл) и ш1Ь-3 (ЗОнг/мл) (КОЕ-к), в костном мозге ФНО-дефицитных мышей (0) и повышенное содержание КОЕ-к в ДККМ, полученных из ФНО-дефицитных мышей.

Интересно, что достоверных отличий в количестве кроветворных клеток-предшественников, образующих смешанные колонии миелоидного типа в агаровых культурах (КОЕ-к) при стимуляции 8СР(100 нг/мл) и 1Ь-3 (30 нг/мл), в костном мозге мышей контрольной и исследуемой групп выявлено не было (день 0) (Рис.7В). Однако анализ количественного содержания КОЕ-к в длительных культурах костного мозга (ДККМ) показал, что в культурах, полученных из костного мозга нокаутных мышей, постепенно возрастало количество КОЕ-к в сравнении с ДТ (Рис.7В). При культивировании клеток костного мозга без стромы в присутствии гемопоэтических ростовых факторов, стимулирующих пролиферацию и дифференцировку кроветворных клеток-предшественников миелоидного направления, мы также наблюдали увеличение клеточной продукции в ФНО-дефицитных культурах при сравнении с ДТ (Рис.8).

Рисунок 8. Повышенная пролиферация клеток костного мозга, полученного из двух линий ФНО-дефицитных мышей, в отсутствии стромы при стимуляции тБСР (100нг/мл), ш1Ь-3 (ЗОнг/мл), ЫЬ-6 (50нг/мл), ЬО-СБР (50нг/мл). А. При добавлении рекомбинантного ФНОа (Юнг/мл) к ДККМ ФНО-дефицитных мышей, полученных с использованием технологии, основанной на системе ЬохР-Сге (КиргаэЬ е1 а1. 2005) наблюдается снижение клеточной продукции до уровня ДТ. Р < 0.0001 при сравнении ФНО КО с ДТ или с ФНО КО + ФНОа, на 9, 14 и 21 день культивирования. В. При добавлении рекомбинантного ФНОа (Юнг/мл) к ДККМ ФНО-дефицитных мышей, полученных с помощью «обычной» технологии (РаэрагаЫБ е1 а1. 1997) наблюдается снижение клеточной продукции до уровня ДТ. Р < 0.002 при сравнении ФНО КО с ДТ или с ФНО КО + ФНОа, на 14 и 21-й день культивирования.

Эти результаты позволили предположить, что различия в характере кроветворения в культурах костного мозга, полученного из ФНО-дефицитных мышей и мышей ДТ, обусловлены ингибирующим воздействием ФНО на пролиферацию кроветворных клеток-предшественников в процессе миелопоэза in vitro.

Помимо повышенной пролиферативной активности в ДККМ, полученных из ФНО-дефицитных мышей, мы наблюдали и другие эффекты, свидетельствующие об участии ФНО в дифференцировке кроветворных клеток-предшественников в культуре. Так, морфологический анализ окрашенных Giemsa клеток в культуре костного мозга нокаутных мышей выявил повышенное содержание примитивных недифференцированных форм (миелобласты, промиелоциты) и уменьшение числа зрелых клеток, находящихся на терминальной стадии дифференцировки (сегментированные нейтрофилы) по сравнению с ДТ (Таблица 1).

Таблица 1. Дифференцнровка нсйтрофилов в длительных культурах костного мозга.

Миелобласты и промиелоциты Миелоциты Метамиелоциты Нейтрофилы

ДТ 7.3 ± 2.4 13.7 ±4.8 25.3 ±5.1 49.7 ±2.1

ФНО~'~ 16.9 ±3.1* 14.5 ±3.9 48.1 ±6.5** 17.6± 5.2***

Процентное содержание клеток в ДККМ оценивали на 10-й неделе культивирования. *Р < 0.02 при сравнении миелобластов/промиелоцитов; **Р < 0.01 при сравнении метамиелоцитов; ***Р < 0.001 при сравнении нейтрофилов в ФНО-дефицитных ДККМ с ДТ.

Эти данные указывают на то, что недостаток экспрессии ФНО может приводить к задержке в дифференцировке клеток-предшественников. Ранее сообщалось, что у мышей, дефицитных по ФНО, наблюдается пониженная экспрессия ГМ-КСФ, необходимого для дифференцировки гранулоцитов и макрофагов (Marino et al, 1997), однако это наблюдение не было соотнесено с возможными дефектами в гемопоэзе.

Роль ФНО в регуляции пролиферации и дифференцировке тучных клеток.

ФНО принимает участие в регуляции пролиферации и дифференцировки тучных клеток in vitro (Wright et al. 2006), предположительно образующихся из общего с гранулоцитами и макрофагами миелоидпого предшественника (Akashi et al., 2006). Оказалось, что ФНО оказывает стимулирующее воздействие на пролиферацию и дифференцировку предшественников тучных клеток. При культивировании клеток костного мозга, полученных из ФНО-дефицитных мышей, в присутствии цитокинов, стимулирующих дифференцировку тучных клеток in vitro, наблюдается значительное снижение количества клеток в культуре по сравнению с ДТ. При этом наиболее заметные различия наблюдаются после второй недели культивирования (Рис.9А), вероятно потому, что к этому моменту в культуре истощается популяция гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников и культура становится более гомогенной. По всей видимости, ФНО участвует в регуляции миелопоэза на уровне именно тех кроветворных клеток-предшественников, которые способны дифференцироваться как в гранулоцитарно-макрофагальном направлении, так и в направлении предшественников тучных клеток. ФНО является положительным регулятором популяции предшественников тучных клеток и, наоборот, ингибирует миелопоэз на уровне гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников. Отметим, что у мышей, дефицитных по ФНО, снижено количество перитонеальных тучных клеток (Рис.9В), по увеличено общее количество гранулоцитарных клеток в крови (Таблица 3) и костном мозге (Таблица 2), а также гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников в костном мозге (Рис.12С), что корелирует с данными, полученными in vitro. во о 60 х X е о 40 5 X

WT 1

-о- WT + TNF«

TNF КО КО + TNF« J /Г —•

7 14 21 28 дней в культуре 3J В

ФНОКО

Рисунок 9. В отсутствии ФНО наблюдается снижение числа тучных клеток in vitro и in v/vo. А. При культивировании клеток костного мозга, полученных от ФНО-дефицитных мышей, в присутствии IL-3 (5 нг/мл) и SCF (50 нг/мл), стимулирующих диффереицировку тучных клеток in vitro, наблюдается значительное снижение количества клеток в культуре по сравнению с ДТ. При добавлении рекомбинантного ФНОа (1 иг/мл) к культурам костного мозга, полученного от ФНО-дефицитных мышей, наблюдается увеличение числа клеток в культуре до уровня ДТ. Р < 0.05. В. У мышей, дефицитных по ФНО, значительно снижено количество перитонеальных тучных клеток в брюшной полости. Для этого перитонеальные тучные клетки выделяли из брюшной полости, окрашивали флуоресцентными антителами к FcsRl и c-K.it и с помощью проточной цитофлуориметрии оценивали процентное содержание перитонеальных тучных клеток (IgERposc-Kitpos клетки).

Минимальные аномалии в кроветворении у ФНО-дефицитных мышей.

На следующем этапе работы, мы попытались установить возможные нарушения в характере кроветворения у мышей, дефицитных по ФНО. Для этого мы оценивали как общую клеточность в костном мозге, так и количественное и процентное содержание зрелых клеток миелоидного, эритроидного и лимфоидного типа дифференцировки. Мы установили, что у мышей, дефицитных по ФНО, в костном мозге несколько увеличено количество клеток, экспрессирующих маркеры нейтрофилов и макрофагов (Таблица 2), что корелировало с повышенным содержанием нейтрофилов в крови по сравнению с мышами ДТ (Таблица 3). Аналогичные результаты были получены при анализе клеточного состава в крови мышей, дефицитных по одному из рецепторов ФНОР1 (Rebel * et al., 1999).

Таблица 2. Общая клеточность и экспрессия миелоидных, лнмфоидных и эритроидных маркеров в костном мозге.

Миелоидные В-клетки, Т-клетки, Эритроидные Общая клеточность в клетки, % % % клетки, % костном мозге,

Мас-1+/Сг-1+) (В220+) (СБЗб+) (Тег119+/С071+) х106/бедро

ДТ 38 ±4 34 ±3 9±1 20 ±3 22 ±6

ФНО"/ 50 ±3* 29 ±3 6±2 16 ±2 19 ±4

Клетки костного мозга были выделены из бедренной кости, окрашены флуоресцентными антителами к поверхностным маркерам и проанализированы на цитофлуориметре. *Р < 0.001 при сравнении экспрессии Мас-1+/Ог-1+с ДТ

Таблица 3. Количественный анализ клеток крови у двух линий ФНО-дефицитных мышей.

Эритроциты Лейкоциты Лимфоциты Нейтрофилы (106/цл) (103/цл) (103/цл) (103/цл)

ДТ 9.0 ± 1.0 9.0 ± 1.4 6.6 ± 1.1 1.5 ±0.3

ФНО -/

Kuprash et al., 2005 ФНО -/Marino et al., 1997

10.3 ±0.4 11.3 ±3.0 7.8 ±1.6 2.8 ±1.7*

7.5 ±1.8 16.0 ±2.0** 10.3 ±0.5 4.9 ±1.8**

Р < 0.02 при сравнении количества нейтрофилов с ДТ

Р < 0.0001 при сравнении количества нейтрофилов, а также общего числа лейкоцитов с ДТ

Содержание кроветворных клеток-предшественников, образующих колонии в селезенке облученных реципиентов (КОЕ-с), и более зрелых миелоидных кроветворных клеток-предшественников (КОЕ-к), образующих преимущественно смешанные колонии в агаровых культурах при стимуляции 5СР(100 нг/мл) и 1Ь-3 (30 иг/мл), а также коммитированных гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников (КОЕ-гм) и эритроидных - образующих бурсты в метилцеллюлозе (БОЕ-э), не отличалось у ФНО-дефицитных мышей и мышей ДТ (Рис.10). Эти данные могли быть интерпретированы либо как указание на незначительный вклад ФНО в регуляцию гемопоэза, в кажущемся противоречии с яркими эффектами ФНО in vitro, либо как свидетельство существования в организме альтернативных сигнальных каскадов, способных компенсировать отсутствие ФНО in vivo. Напомним, что единственный известный цитокин, способный передавать сигнал через рецепторы ФНО, но не являющийся ФНО, это - JITa.

ДТ

ФНО-/о с; о О с; о

КОЕ-с КОЕ-к КОЕ-гм БОЕ-э

Рисунок 10. Нормальное количество кроветворных клеток-предшественников в костном мозге ФНО-дефицитных мышей. Для определения числа КОЕ-с летально облученным реципиентам внутривенно вводили 3x104 клеток костного мозга, а через 12 дней подсчитывали количество колоний в селезенке. Для КОЕ-к и КОЕ-гм - 2.5-5x104 клеток КМ выращивали в 1мл агаровых культур в присутствии 8СБ(100 нг/мл) + 1Ь-3 (30 нг/мл) или ОМ-СБР (50 нг/мл), соответственно. Для БОЕ-э - 8x104 клеток КМ культивировали в метилцеллюлозе в присутствии Еро (6 Ед/мл), БСБ (100 нг/мл) и 1Ь-3 (30 нг/мл). Число КОЕ-гм и БОЕ-э оценивали на 7-ой день культивирования.

ФНО - ингибитор ранних (КОЕ-с) и коммитированных кроветворных клеток-предшественников (КОЕ-гм) ш vivo.

Итак, нами были получены данные, свидетельствующие, с одной стороны, о нормальном количестве кроветворных клеток-предшественников в костном мозге нокаутных мышей, с другой - о значительном увеличении количества этих клеток в ФНО-дефицитных длительных культурах костного мозга. Для более детального исследования динамики кроветворения и возможного участия ФНО в регуляции кроветворных клеток-предшественников in vivo из костного мозга ФНО-дефицитных мышей и мышей ДТ методом препаративной проточной цитофлуориметрии была выделена LinnegcKitposScalneg фракция клеток костного мозга, содержащая преимущественно коммитированные кроветворные клетки-предшественники, и LinnegcKitposScalpos фракция клеток костного мозга, обогащенная ранними кроветворными клетками-предшественниками, в том числе стволовыми кроветворными клетками (Рис.11 А). Количество 1лппеесКкр058са1р05 клеток, полученных из костного мозга ФНО-дефицитных мышей, не отличалось от ДТ (11В). Для количественной оценки ранних (КОЕ-с) и коммитированных гранулоцитарно-макрофагальных (КОЕ-гм) кроветворных клеток-предшественников, содержащихся в этих двух популяциях, очищенные клетки вводили внутривенно летально облученным реципиентам или выращивали в агаровых культурах в присутствии ГМ-КСФ, соответственно.

Рисунок 11 (начало). Количественный анализ Linne8cKitposScalpos клеток костного мозга, полученных из ФНО-дефицитных мышей. А. Для выделения LinneÊcKitposScalpos клеточной популяции сначала производили деплецию клеток, экспрессирующих маркеры дифференцировки с помощью магнитных шариков. Далее, Linnee фракцию клеток костного мозга (R1) инкубировали с флуоресцентными антителами к поверхностным маркерам стволовых кроветворных клеток и кроветворных клеток предшественников - Sca-1 (антиген стволовых клеток) и c-K.it (рецептор фактора стволовых клеток) и методом препаративной проточной цитофлуориметрии выделяли две фракции клеток: LinnegcKitposScalpos (R3) и Lin"eBcKitposScal',ei! (R2), обогащенных ранними кроветворными предшественниками, в том числе стволовыми кроветворными клетками, и более поздними кроветворными клетками-предшественниками, соответственно. В. Нормальное количество LinnegcKitposScalpos клеток в костном мозге мышей, дефицитных по ФНО.

Оказалось, что во фракции LinnegcKitposScalpos клеток количество ранних предшественников (КОЕ-с), а также размер самих колоний, образованных ФНО-дефицитпыми предшественниками костного мозга в селезенке облученных реципиентов, был значительно больше, чем в контрольной группе (Рис.11С и 11D). Интересно, что аналогичные данные были получены и при анализе LinnegcKitposScalpos фракции клеток, выделенных из костного мозга мышей, дефицитных по двум рецепторам ФИО (р55 и р75). Более того, количество КОЕ-с и размер самих колоний превосходили те, что были получены при трансплантации клеток костного мозга из ФНО-дефицитных мышей. Эти результаты могли косвенно свидетельствовать о том, что не только ФИО, но и родственный ему цитокип ЛТа, участвует в регуляции ранних кроветворных предшественников, передавая сигнал через ФНОР1 (р55) и ФНОР2 (р75). Помимо этого, количество коммитированных гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (КОЕ-гм) как в LinnegcKitposScalneg, так и в LinnegcKitposScalpos фракциях клеток костного мозга, полученного из ФНО-дефицитных мышей, было значительно больше, чем в ДТ (Рис.11Е). Эти результаты согласуются с ранее опубликованными данными о том, что у мышей, дефицитных по ФНОР1(р55), наблюдается увеличение количества коммитированных клеток-предшественников миелоидного типа в костном мозге (Rebel et al. 1999). В совокупности, полученные данные свидетельствуют о том, что ФНО оказывает ипгибирующее воздействие как на ранние (КОЕ-с), так и на коммитированные гранулоцитарно-макрофагальные кроветворные клетки-предшествеппики (КОЕ-гм) in vivo. Однако стоит отметить, что в выделенных фракциях LinncecKitposScalnee и LinnegcKitposScalpos, обогащенных преимущественно коммитированными кроветворными клетками-предшественниками и более примитивными кроветворными предшественниками, в том числе стволовыми кроветворными клетками, соответственно, отсутствуют клетки лимфоидного происхождения, экспрессирующие ЛТа и ЛТр. Таким образом, эти данные могут косвенно указывать на «вспомогательную» роль JIT в регуляции гемопоэза и объяснить отсутствие разницы в КОЕ-с и КОЕ-гм в опытах, использующих нефракционированные клетки костного мозга (Рис.10). D

ЦТ

ФИСг' р55~'р75 Е

Рисунок 11 (продолжение). Повышенное содержание числа ранних и коммитированных предшественников в ЫппеесКкро58са1р05 фракции клеток костного мозга, полученного из ФНО-дефицитных мышей. С. Очищенные при помощи проточной цитофлуоримегрии Ь1ппеесКИр058са1р05 клетки костного мозга мышей вводили внутривенно летально облученным реципиентам (1x103 клеток/мышь). Через 12 дней подсчитывали число КОЕ-с. Б. Макроскопические колонии на селезенке после фиксации. Е. Очищенные при помощи проточной цитофлуориметрии ЬтпеёсКир058са1р05 и 1лппе8сКкро;:8са1пее клетки выращивали в агаровых культурах (3x103 клеток/мл) в присутствии ОМ-С8Р (50нг/мл), через 7 дней подсчитывали КОЕ-гм.

Анализ этой клеточной популяции, обогащенной стволовыми кроветворными клетками и ранними клетками-предшественниками, выявил двукратное увеличение числа Ыппе8сКкр058са1р05 клеток у ЛТа-дефицитных мышей (Рис. 120).

Нарушенная динамика гемоноэза у мышей с комбинированным ФНО/JIT дефицитом.

Анализ клеток костного мозга мышей с комбинированной инактивацией ФНО/ЛТа/ЛТр выявил ряд существенных нарушений в динамике кроветворения по нескольким параметрам, по сравнению как с мышами ДТ, так и ФНО-дефицитпыми мышами. У этих мышей, так же как и у описанных ранее мышей, дефицитных по ФНОР1 (Zhang et al. 1995, Rebel et al. 1999), наблюдается значительное увеличение количества LinnegcKitposScalpos клеток в костном мозге (Рис.12А). Более того, в костном мозге мышей с комбинированным ФНО/ЛТ дефицитом увеличена популяция LinnegIL-7Rnegc-KitposScalposFcyRposCD34pos клеток, содержащая преимущественно полипотентные миелоидные клетки-предшественники (Рис.12С). При этом было увеличено количество кроветворных клеток-предшественников миелоидного типа (КОЕ-к), образующих преимущественно смешанные колонии в агаровых культурах при стимуляции SCF (100нг/мл) и IL-3 (ЗОнг/мл), и ранних кроветворных клеток-предшественников, образующих колонии в селезенке облученных реципиентов (КОЕ-с) (Рис. 12В). Далее, мы обнаружили, что у мышей с комбинированным ФНО/ЛТа/ЛТр дефицитом количество гранулоцитарно-макрофагальных кроветворных клеток-предшественников (КОЕ-гм) снижено по сравнению с ДТ, а количество эритроидных кроветворных клеток-предшественников (БОЕ-э) не изменено (Рис. 12В), что может свидетельствовать об участии сигнала, передаваемого как ФИО, так и ЛТ через ФИО рецепторы, в количественной регуляции миелопоэза in vivo на уровне гранулоцитарно-макрофагальных кроветворных клеток-предшественников.

Рисунок 12 (начало). Анализ ранних клеточных популяций в костном мозге мышей с комбинированным ФНО/ЛТ дефицитом. А. Увеличение числа LinnegcKitposScalpos клеток в костном мозге нокаутных мышей. Клетки костного мозга окрашивали флуоресцентными антителами к поверхностным маркерам дифференцировки гранулоцитов (Gr-1), макрофагов (Мас-1), эритроцитов (Terl 19) и лимфоцитов (В220 и CD3s), а также c-Kit и Sca-1. Далее оценивали количество недифференцированных клеток (Linneg), экспрессирующих c-Kit (рецептор фактора стволовых клеток) и Sca-1 (антиген стволовых клеток).

В. Количественная оценка популяций кроветворных клеток-предшественников в костном мозге мышей с тройной инактивацией генов ФНО/ЛТ локуса. Для определения числа КОЕ-с летально облученным реципиентам внутривенно вводили 3x104 клеток костного мозга, а через 12 дней подсчитывали количество колоний в селезенке. Для КОЕ-к и КОЕ-гм -2.5-5x104 клеток КМ выращивали в 1мл агаровых культур в присутствии 8СР(100нг/мл) + 1Ь-3 (ЗОнг/мл) или ОМ-С8Р (50нг/мл), соответственно. Для БОЕ-э - 8x104 клеток КМ культивировали в 1 мл метилцеллюлозы в присутствии Еро (6 Ед/мл), 8СБ (100 нг/мл) и 1Ь-3 (30 нг/мл). Колонии в культурах подсчитывали на 7-ой день культивирования. А

5817.016

С Kit

50 45 40 ,х 35 1 30 ° 25 о 5 20 s т 15 10 5 □ ДТ □ ФНО/ЛТ-É !

КОЕ-с КОЕ-к КОЕ-гм БОЕ-э

ДТ: 0.371 0.03

КО: 0.48 ± 0.01 D в.3% дт

VfPf^ • '4'

-г- i4*!»

Gr-1 Мас-1 Тег113 ь В220 СОЗе * Ь.

FSC

Рисунок 12 (продолжение).

С. Увеличение числа Lin"68 IL-7Rnegc-KitposScal posFcyRposCD34pos в костном мозге нокаутных мышей Анализ популяции, обогащенной гранулоцитарно-макрофагальными и миелоидными клетками-предшественниками, проводили с помощью проточной цитофлуориметрии как описано в оригинальной статье (Akashi et al. 2000). Для цитофлуориметрического анализа использовали очищенную фракцию недифференцированных (Linneg) клеток костного мозга.

D. Увеличение числа LinnegcKitposScalpos клеток в костном ЛТа мозге нокаутных мышей. Клетки костного мозга окрашивали флуоресцентными антителами к поверхностным маркерам дифференцировки гранулоцитов (Gr-1), макрофагов (Мас-1), эритроцитов (Terl 19) и лимфоцитов (В220 и CD3e), а также c-Kit и Sca-1. Далее оценивали количество недифференцированных клеток (Linneg), экспрессирующих c-Kit (рецептор фактора стволовых клеток) и Sea-1 (антиген стволовых клеток).

Известно, что количественная регуляция гемопоэза, обусловленная запросом на зрелые клетки, осуществляется при участии различных ростовых факторов, способных индуцировать дифференцировку и пролиферацию коммитированных клеток-предшественников, утративших способность к длительному поддержанию и полипотентность. Анализ экспрессии маркеров дифференцировки выявил повышенное содержание макрофагов и гранулоцитов, а также Т-лимфоцитов в костном мозге мышей, дефицитных по ФНО/ЛТа/ЛТР (Рис.1 ЗА). Более того, в крови мышей с комбинированной • инактивацией ФНО и ЛТ во много раз увеличено количество абсолютно всех клеток миелоидного типа дифференцировки (нейтрофилы, моноциты, эозинофилы, базофилы) (Рис. 1ЗВ), а также лимфоцитов (Рис. 1ЗС).

40 о 30

20 с ж

10 ДТ ФНО/ЛТа/ЛТр-/i

CD3e В220 Mac1/Gr1 Ter119/CD71

Рисунок 13. Нарушенное соотношение зрелых клеточных популяций в костном мозге и крови мышей, дефицитных по ФНО/ЛТа/ЛТр. А. Повышенное содержание макрофагов и гранулоцитов, а также Т-лимфоцитов в костном мозге мышей, дефицитных по ФНО/ЛТа/ЛТр. Клетки костного мозга были выделены из бедренной кости, окрашены флуоресцентными антителами к поверхностным маркерам зрелых клеток и проанализированы на цитофлуориметре. CD3e соответствует популяции Т-лимфоцитов, В220 - В-лимфоцитам, Gr-1/ Мас-1 -нейтрофилам, а Тег 119/CD71 -эритроидным клеткам. Клеточный состав в крови анализировали на специальном приборе (CDC Hemavet blood counter), откалиброванному для грызунов, и оценивали количественное содержание миелоидных (В) и лимфоидных (С) клеток. в о тX

40 с; *

2 30

ЭЙ

О Н 4) С

5С

О X в

В отличие от регуляции коммитированных клеток-предшественников, утративших способность к длительному поддержанию и полипотентность, регуляция СКК носит локальных характер и осуществляется на принципиально другом уровне под строгим контролем стромального микроокружения. Строма кроветворных органов имеет довольно сложный состав и включает эндотелиальные, жировые, гладкомышечные или ретикулярные клетки, фиброблаеты, остеобласты и внеклеточный матрикс, представленный преимущественно коллагеновыми волокнами, протеогликанами и гликопротеидами. Стромальные и гемопоэтические клетки находятся в тесном взаимодействии друг с другом, которое осуществляется за счет молекул адгезии. Помимо молекул адгезии важную роль в этих взаимодействиях играют рецепторы цитокинов и хемокинов, с которыми связываются либо растворимые лиганды внеклеточного матрикса, либо мембранно-связанные. При этом стромальные клетки формируют микроокружение, которое, в свою очередь, влияет па гемопоэз, а от качества гемопоэза зависит функционирование стромы. В последние годы удалось на молекулярном уровне охарактеризовать специализированные гемопоэтические ниши костного мозга и прояснить многие аспекты регуляции СКК кроветворным микроокружением (Wilson and Trumpp, 2006).

Несмотря на то, что общая клеточность костного мозга у мышей с комбинированным ФНО/JIT дефицитом не отличается от ДТ (25.6 ± 5.4 и 24.4 ± 4.6 хЮ6 клеток/бедро, соответственно) распределение клеток в костном мозге носит иной характер. Интересно, что у мышей с комбинированной инактивацией генов ФНО/ЛТ локуса наблюдается гиперпролиферация клеток в области метафиза в костном мозге, а жировые кластеры, состоящие из адипоцитов - неотъемлемого компонента кроветворного микроокружения - практически отсутствуют (Рис.14). Недавно было показано, что именно в этой части костного мозга благодаря губчатому строению кости локализовано наибольшее количество СКК, находящихся в тесном взаимодействии с остеобластами и другими клетками кроветворного микроокружения (Calvi et al. 2003, Zhang et al. 2003, Adams et al. 2005).

Рисунок 14. Измененная структура костно-мозговой ткани у мышей с комбинированным ФНО/ЛТ дефицитом. А. Схема строения длинной кости. Эндост -соединительная ткань, выстилающая полость кости. Диафиз - средняя часть трубчатой кости. Граница между эпифизом и метафизом - зона активного роста кости. Трубчатая кость в области метафиза имеет губчатое строение. В. Измененная структура костно-мозговой ткани у мышей с комбинированным ФНО/ЛТ дефицитом выражается в повышенном содержании клеток в полости, отсутствии жировых кластеров («белые пятна» в ДТ, образующиеся при вымывании жировой ткани во время фиксации) и истощенном слое соединительной ткани, прилегающей к остеокластам (верхняя часть) - зона активной резорбции кости. Продольный срез большой берцовой кости, метафиз при увеличении в 100 и 400 раз. Окрашивание гематоксилином и эозином. хюо

Х400

Эпифиз Метафиз

Губчатая кость

Диафиз

ФНО/ЛТа/ЛТр-/

У мышей с комбинированным ФНО/ЛТ дефицитом значительно повышено количество СКК в костном мозге.

Проведенные ранее исследования показали, что у мышей, дефицитных по ФНОР1, наблюдается значительное увеличение в количестве ЬтпеёсКл1рп58са1клеток по сравнению с контрольной группой и мышами, дефицитными по ФНОР2 (Zhang et al. 1995). Более того, у стареющих мышей (>6 мес.), дефицитных по ФНОР1, происходит увеличение как общего количества клеток костного мозга, так и количества коммитированных клеток-предшественников миелоидного типа дифференцировки и зрелых клеток в крови. При этом у таких стареющих мышей количество стволовых кроветворных клеток костного мозга значительно меньше, чем у мышей ДТ (Rebel et al. 1999). Основываясь на этих двух исследованиях можно было предположить, что передача сигнала через ФНОР1 играет важную роль в регуляции отдела стволовых кроветворных клеток костного мозга. Более того, отсутствие этого сигнала нарушает строгий баланс между процессами пролиферации (самообновлением) и дифференцировки СКК, в результате чего происходит ускоренное истощение популяции СКК и увеличение количества коммитированных клеток-предшественников. Следует отметить, что приведенные могут лишь косвенно свидетельствовать об участии ФНО в регуляции СКК in vivo, т.к. известно, что помимо ФНО передачу сигнала через ФНОР1 осуществляет родственный ему цитокин, JITa. Именно поэтому изучение динамики кроветворения и регуляции стволовых кроветворных клеток у мышей, дефицитных как по ФНО, так и по ФНО/ЛТа/ЛТр, представлял особый интерес.

Следующий этап исследования физиологии кроветворения у мышей, дефицитных по ФНО, а также у мышей с комбинированной инактивацией генов ФНО/ЛТ локуса, заключался в анализе самых примитивных кроветворных клеток-предшественников -стволовых кроветворных клеток. Для этого оценивали способность СКК, полученных из костного мозга нокаутиых мышей, репопулировать костный мозг облученных реципиентов наряду с СКК, полученных из костного мозга мышей ДТ (Рис.15). В условиях конкурентной репопуляции, когда летально облученному реципиенту трансплантируют дифференциально маркированную смесь кроветворных клеток из двух источников: нормальных гемопоэтических клеток и клеток, полученных из ФНО или ФНО/ЛТа/ЛТр-дефицитных мышей, можно судить о конкурентной способности примитивных стволовых кроветворных клеток покаутных мышей репопулировать костный мозг наравне с СКК мышей ДТ, т.е. оценивать физиологические потенции этих клеток. Популяцию СКК различают по способности к кратковременной (через 2 месяца) и длительной (через 4-6 месяцев) репопуляции костного мозга облученных реципиентов. В наших экспериментах в качестве реципиентов использовали конгенных мышей, отличающихся от мышей линии С57В1/6 лишь экспрессией Ьу5.2 маркера вместо Ьу5.1 па поверхности большинства клеток организма, что позволило получить и различать три группы костномозговых химер. Первая группа (контрольная) после облучения была восстановлена смесью клеток костного мозга ДТ, полученного от двух конгенных доноров в соотношении Ьу5.2 (ДТ) / Ьу5.1 (ДТ) =10/1. Второю и третью группу мышей восстанавливали смесью клеток костного мозга мышей ДТ (Ьу5.2) и нокаутных мышей Ьу5.1 (ФНО/ЛТа/ЛТР-/- и ФНО-/-, соответственно) в том же соотношении: Ьу5.2 (ДТ) / Ьу5.1 (КО) = 10/1. Способность СКК, полученных из нокаутных мышей, репопулировать костный мозг облученных реципиентов оценивали через 4-6 месяцев после трансплантации. Для этого сравнивали экспрессию Ьу5.1 миелоидными клетками (Ог-1+ клетки) и В-лимфоцитами (В220+ клетки) в костном мозге и Т-лимфоцитами (СОЗе+ клетки) в селезенке мышей в трех группах. смесь клеток КМ | через 4-6 мес.| Л V анализ экспрессии 1у5.1 маркера в костном мозге и селезенке реципиента ДТ

ФНО/ЛТа/ЛТр-/

В220 костный мозг

Рисунок 15. Повышенная способность СКК костного мозга мышей с тройной инактивацией генов ФИО локуса репопулировать костный мозг летально облученных реципиентов.

Неожиданные результаты были получены в обеих исследуемых группах. С одной стороны, клетки костного мозга, полученные из мышей, дефицитных по ФНО/ЛТа/ЛТр, репопулируют костный мозг облученных реципиентов с большей эффективностью, чем клетки-предшественники костного мозга мышей ДТ. С другой - способность клеток костного мозга ФНО-дефицитных мышей к длительной репопуляции костного мозга несколько снижена по сравнению с контрольной группой. Как уже обсуждалось, у мышей с тройным нокаутом увеличена популяция 1лппевсКкро58са1ро5 клеток в костном мозге (Рис.12А). По всей видимости, это происходит за счет увеличения как мультипотентных кроветворных клеток предшественников, образующих колонии в селезенке облученных реципиентов (КОЕ-с; Рис. 12В), так и за счет увеличения популяции самых ранних кроветворных клеток-предшественников - СКК, способных к длительной репопуляции костного мозга облученных реципиентов.

Заключение

В данной работе показано, что ФНО и ЛТ, играющие важную роль в иммунном ответе и воспалении, важны таюке для регуляции кроветворной системы через сложную систему сигналов, регулирующих пролиферацию, апоптоз и взаимодействие со стромальным микроокружением. Дальнейшее изучение роли этих цитокинов в кроветворении и установление тонких молекулярных механизмов передачи сигнала, в частности, разграничение функций ФНО и ЛТа, может открыть новые перспективы в понимании регуляции гемопоэза на молекулярном уровне, а также в более глубоком понимании возможностей и ограничений при терапии заболеваний с применением цитокинов или их блокаторов. На основе наших данных можно считать, что при терапевтическом блокировании ФНО для подавления воспалительного процесса при лечении аутоиммунных заболеваний и других патологий человека не стоит ожидать сильных побочных эффектов, связанных с нарушением в регуляции кроветворения.

Выводы.

1. Установлено, что ФНО является мощным ингибитором миелопоэза in vitro, участвует в регуляции пролиферации и последующей дифференцировке гранулоцитарно-макрофагальных кроветворных клеток-предшественников, а также предшественников тучных клеток.

2. Установлено, что у мышей, дефицитных по ФНО, увеличено количество коммитированных гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественников и ранних мультипотептных кроветворных клеток-предшественников в костном мозге.

3. Обнаружено, что у мышей с комбинированной инактивацией генов ФНО/JIT локуса нарушена количественная регуляция гемопоэза: многократно повышено количество зрелых клеток в крови и нарушено их соотношение в костном мозге, при этом снижено количество коммитированных кроветворных клеток-предшествеипиков миелоидного типа, увеличена популяции ранних кроветворных клеток-предшествешшков, в том числе стволовых кроветворных клеток.

4. Установлено, что стволовые кроветворные клетки, полученные от мышей с комбинированной инактивацией генов ФНО/ЛТ локуса, репопулируют костный облученных реципиентов с большей эффективностью, чем ДТ. Эти данные могут быть объяснены вырожденностью сигналов от ФНО и ЛТ и свидетельствуют об ингибирующем воздействии ФНО/ЛТ на СКК in vivo.

Список литературы:

Дризе Н.И., Друцкая М.С., Герасимова Л.П., Манакова Т.Е., Чертков И.Л., Турецкая Р.Л., Купраш Д.В., Недоспасов С.А. 2000. Особенности изменений в кроветворной системе у мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли или лимфотоксину-а. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 130, 676-679.

Дризе Н.И. 1990. Кроветворные клетки-предшественники в длительной культуре костного мозга. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук.

Друцкая М.С., Купраш Д.В., Недоспасов С.А., Чертков И.Л., Дризе Н.И. 2001.

Кроветворение у мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли: аномалии, выявляемые в длительной культуре костного мозга. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 131,184-187.

Недоспасов С.А. 2003. Фактор некроза опухолей и лимфотоксин: молекулярная генетика, регуляция и физиологическая роль. Генетика. 39,207-214.

Нифонтова И.Н., Эршлер М.А., Дризе Н.И. 2002. Аномалии, выявляемые в длительной культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли: индукция апоптоза и клеточная пролиферация. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 133,445-447.

Нифонтова И.Н., Эршлер М.А., Дризе Н.И. 2003. Динамика состава клеток-предшественников в культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 135,330-333.

Эршлер М.А., Нифонтова И.Н., Ольшанская Ю.В., Тодрия Т.В., Чертков И.Л.,

Н.И.Дризе. 2002. Длительное самоподдержание кроветворных предшественников в культуре костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли, не является следствием неопластической трансформации. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 133, 537-540.

Abe, К., Yarovinsky, F. О., Murakami, T., Shakhov, A. N., Tumanov, A. V., Ito, D., Drutskaya, L. N., Pfeffer, K., Kuprash, D. V., Komschlies, K. L., and Nedospasov, S. A. 2003. Distinct contributions of TNF and LT cytokines to the development of dendritic cells in vitro and their recruitment in vivo. Blood 101,1477-1483.

Aggarwal, В. B. 2003. Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. Nat.Rev.Immunol. 3, 745-756.

Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., and Weissman, I. L. 2000. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature 404,193-197.

Algood, H. M., Chan, J., and Flynn, J. L. 2003. Chemokines and tuberculosis. Cytokine Growth Factor Rev. 14,467-477.

Arinobu, Y., Iwasaki, H., Gurish, M. F., Mizuno, S., Shigematsu, H., Ozawa, H., Tenen, D. G., Austen, K. F., and Akashi, K. 2005. Developmental checkpoints of the basophil/mast cell lineages in adult murine hematopoiesis. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102, 18105-18110.

Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., and Kudo, A. 2000. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. J.Biol.Chem. 275,48584864.

Baert, F. J., D'Haens, G. R., Peeters, M., Hiele, M. I., Schaible, T. F., Shealy, D., Geboes, K., and Rutgeerts, P. J. 1999. Tumor necrosis factor alpha antibody (infliximab) therapy profoundly down-regulates the inflammation in Crohn's ileocolitis. Gastroenterology 116, 22-28.

Bedi, A. and Sharkis, S. J. 1995. Mechanisms of cell commitment in myeloid cell differentiation. Curr.Opin.Hematol. 2,12-21.

Beutler, B. 2001. Autoimmunity and apoptosis: the Crohn's connection. Immunity 15, 5-14.

Beyne-Rauzy, O., Prade-Houdellier, N., Demur, C., Recher, C., Ayel, J., Laurent, G., and

Mansat-De Mas, V. 2005. Tumor necrosis factor-{alpha} inhibits hTERT gene expression in human myeloid normal and leukemic cells. Blood 106,3200-3205.

Braun, J., Brandt, J., Listing, J., Rudwaleit, M., and Sieper, J. 2003. Biologic therapies in the spondylarthritis: new opportunities, new challenges. Curr.Opin.Rheumatol. 15, 394-407.

Broussais, F., Kawashima, M., Marotte, H., and Miossec, P. 2005. Chronic myeloid leukaemia and tuberculosis in a patient with rheumatoid arthritis treated with infliximab. Ann.Rheum.Dis. 64, 509-510.

Brown, S. L., Greene, M. H., Gershon, S. K., Edwards, E. T., and Braun, M. M. 2002. Tumor necrosis factor antagonist therapy and lymphoma development: twenty-six cases reported to the Food and Drug Administration. Arthritis Rheum. 46, 3151-3158.

Browning, J. L. and French, L. E. 2002. Visualization of Lymphotoxin-beta and Lymphotoxin-beta Receptor Expression in Mouse Embryos. The Journal of Immunology 168, 50795087.

Bruno, L., Hoffmann, R., McBlane, F., Brown, J., Gupta, R., Joshi, C., Pearson, S., Seidl, T.,

Heyworth, C., and Enver, T. 2004. Molecular signatures of self-renewal, differentiation, and lineage choice in multipotential hemopoietic progenitor cells in vitro. Mol.Cell Biol. 24, 741-756.

Calvi, L. M., Adams, G. B., Weibrecht, K. W., Weber, J. M., Olson, D. P., Knight, M. C.,

Martin, R. P., Schipani, E., Divieti, P., Bringhurst, F. R., Milner, L. A., Kronenberg, H. M., and Scadden, D. T. 2003. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature 425, 841-846.

Carswell, E. A., Old, L. J., Kassel, R. L., Green, S., Fiore, N., and Williamson, B. 1975. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc Natl AcadSci USA 72, 3666-3670.

Caux, C., Favre, C., Saeland, S., Duvert, V., Durand, I., Mannoni, P., and Banchereau, J. 1991. Potentiation of early hematopoiesis by tumor necrosis factor-alpha is followed by inhibition of granulopoietic differentiation and proliferation. Blood 78, 635-644.

Caux, C., Saeland, S., Favre, C., Duvert, V., Mannoni, P., and Banchereau, J. 1990. Tumor necrosis factor-alpha strongly potentiates interleukin-3 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-induced proliferation of human CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood 15,2292-2298.

Coley W.B. The treatment of malignant tumors with toxins of erysipelas: with a report of ten original cases. 1893. Am. J. Med. Sci. 105,487-511.

Crowe, P. D., VanArsdale, T. L., Walter, B. N., Ware, C. F., Hession, C., Ehrenfels, B.,

Browning, J. L., Din, W. S., Goodwin, R. G., and Smith, C. A. 1994. A lymphotoxin-beta-specific receptor. Science 264, 707-710.

Cuturi, M. C., Murphy, M., Costa-Giomi, M. P., Weinmann, R., Perussia, B., and Trinchieri, G. 1987. Independent regulation of tumor necrosis factor and lymphotoxin production by human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med 165, 1581-1594.

Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., and Finch, C. A. 1976. Neutrophil kinetics in man. J.Clin.Invest 58, 705-715.

Deeg, H. J., Gotlib, J., Beckham, C., Dugan, K., Holmberg, L., Schubert, M., Appelbaum, F., and Greenberg, P. 2002. Soluble TNF receptor fusion protein (etanercept) for the treatment of myelodysplastic syndrome: a pilot study. Leukemia. 16, 162-164.

Deeg, H. J., Jiang, P. Y., Holmberg, L. A., Scott, B., Petersdorf, E. W., and Appelbaum, F. R.

2004. Hematologic responses of patients with MDS to antithymocyte globulin plus etanercept correlate with improved flow scores of marrow cells. LeuhRes. 28, 1177-1180.

Dexter, T. M., Allen, T. D., and Lajtha, L. G. 1977. Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro. J.Cell Physiol 91, 335-344.

Drize, N. J., Keller, J. R., and Chertkov, J. L. 1996. Local clonal analysis of the hematopoietic system shows that multiple small short-living clones maintain life-long hematopoiesis in reconstituted mice. Blood. 88,2927-2938.

Drize, N. J., Olshanskaya, Y. V., Gerasimova, L. P., Manakova, T. E., Samoylina, N. L., Todria, T. V., and Chertkov, J. L. 2001. Lifelong hematopoiesis in both reconstituted and sublethally irradiated mice is provided by multiple sequentially recruited stem cells. Exp.Hematol. 29, 786-794.

Drutskaya, M. S., Ortiz, M., Liepinsh, D. J., Kuprash, D. V., Nedospasov, S. A., and Keller, J. R.

2005. Inhibitory effects of tumor necrosis factor on hematopoiesis seen in vitro are translated to increased numbers of both committed and multipotent progenitors in TNF-deficient mice. Exp.Hematol. 33, 1348-1356.

Dybedal, I., Bryder, D., Fossum, A., Rusten, L. S., and Jacobsen, S. E. 2001. Tumor necrosis factor (TNF)-mediated activation of the p55 TNF receptor negatively regulates maintenance of cycling reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood 98, 17821791.

Ehlers, S. 2005. Tumor necrosis factor and its blockade in granulomatous infections: differential modes of action of infliximab and etanercept? Clin.Infect.Dis. 41 Suppl 3, S199-S203.

Elbaz, O., Budel, L. M., Hoogerbrugge, H., Touw, I. P., Delwel, R., Mahmoud, L. A., and Lowenberg, B. 1991. Tumor necrosis factor regulates the expression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3 receptors on human acute myeloid leukemia cells. Blood 77, 989-995.

Ema, H., Takano, H., Sudo, K., and Nakauchi, H. 2000. In vitro self-renewal division of hematopoietic stem cells. J.Exp.Med. 192, 1281-1288.

Engelmann, H., Holtmann, H., Brakebusch, C., Avni, Y. S., Sarov, I., Nophar, Y., Hadas, E.,

Leitner, O., and Wallach, D. 1990. Antibodies to a soluble form of a tumor necrosis factor (TNF) receptor have TNF-like activity. J Biol Chem 265, 14497-14504.

Enver, T., Heyworth, C. M., and Dexter, T. M. 1998. Do stem cells play dice? Blood 92,348351.

Erickson, S. L., de Sauvage, F. J., Kikly, K., Carver-Moore, K., Pitts-Meek, S., Gillett, N.,

Sheehan, K. C„ Schreiber, R. D., Goeddel, D. V., and Moore, M. W. 1994. Decreased sensitivity to tumour-necrosis factor but normal T- cell development in TNF receptors-deficient mice. Nature 372, 560-563.

Erslev A. J., Williams W.J., Beutler E., Lichtman M.A. Production of erythrocytes. New York, NY, McGraw-Hill, 1983, p.365.

Espevik, T., Brockhaus, M., Loetscher, H., Nonstad, U., and Shalaby, R. 1990. Characterization of binding and biological effects of monoclonal antibodies against a human tumor necrosis factor receptor. J.Exp.Med. 171, 415-426.

Fahlman, C., Jacobsen, F. W., Veiby, O. P., McNiece, I. K., Blomhoff, H. K., and Jacobsen, S. E. 1994. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) potently enhances in vitro macrophage production from primitive murine hematopoietic progenitor cells in combination with stem cell factor and interleukin-7: novel stimulatory role of p55 TNF receptors. Blood 84, 1528-1533.

Feldmann, M. and Maini, R. N. 2001. Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis: what have we learned? Annu.Rev.Immunol. 19, 163-196.

Fleischmann, R. 2003. Safety and efficacy of disease-modifying antirheumatic agents in rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis. Expert. Opin.Drug Saf2, 347-365.

Fogg, D. K., Sibon, C., Miled, C., Jung, S., Aucouturier, P., Littman, D. R., Cumano, A., and

Geissmann, F. 2006. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science 311, 83-87.

Fu, Y. X. and Chaplin, D. D. 1999. Development and maturation of secondary lymphoid tissues. Annu Rev Immunol 17, 399-433.

Fuchs, E., Tumbar, T., and Guasch, G. 2004. Socializing with the neighbors: stem cells and their niche. Cell 116,769-778.

Gerstenfeld, L. C., Cho, T. J., Kon, T., Aizawa, T., Cruceta, J., Graves, B. D., and Einhorn, T. A. 2001. Impaired intramembranous bone formation during bone repair in the absence of tumor necrosis factor-alpha signaling. Cells Tissues. Organs 169, 285-294.

Gersuk, G. M., Beckham, C., Loken, M. R., Kiener, P., Anderson, J. E., Farrand, A., Troutt, A. В., Ledbetter, J. A., and Deeg, H. J. 1998. A role for tumour necrosis factor-alpha, Fas and Fas-Ligand in marrow failure associated with myelodysplastic syndrome. Br. J.Haematol. 103, 176-188.

Gomez-Reino, J. J., Carmona, L., Valverde, V. R., Mola, E. M., and Montero, M. D. 2003.

Treatment of rheumatoid arthritis with tumor necrosis factor inhibitors may predispose to significant increase in tuberculosis risk: a multicenter active-surveillance report. Arthritis Rheum. 48,2122-2127.

Grell, M., Becke, F. M., Wajant, H., Mannel, D. N., and Scheurich, P. 1998a. TNF receptor type 2 mediates thymocyte proliferation independently of TNF receptor type 1. Eur J Immunol 28, 257-263.

Grell, M., Douni, E., Wajant, H., Lohden, M., Clauss, M., Maxeiner, В., Georgopoulos, S.,

Lesslauer, W., Kollias, G., and Pfizenmaier, K. 1995. The transmembrane form of tumor necrosis factor is the prime activating ligand of the 80 kDa tumor necrosis factor receptor. Cell 83, 793-802.

Grell, M., Wajant, H., Zimmermann, G., and Scheurich, P. 1998b. The type 1 receptor (CD 120a) is the high-affinity receptor for soluble tumor necrosis factor. Proc Natl Acad Sci USA 95, 570-575.

Grivennikov S.I., Kuprash D.V., Liu Z.G., Nedospasov S.A. 2006. Intracellular signals and events activated by cytokines of the TNF superfamily: from simple paradigms to complex mechanisms, (в печати).

Hahne, M., Jager, U., Isenmann, S., Hallmann, R., and Vestweber, D. 1993. Five tumor necrosis factor-inducible cell adhesion mechanisms on the surface of mouse endothelioma cells mediate the binding of leukocytes. J.Cell Biol. 121, 655-664.

Нага, H. and Ogawa, M. 1978. Murine hemopoietic colonies in culture containing normoblasts, macrophages, and megakaryocytes. Am.J.Hematol. 4,23-34.

Haraoui, B. 2005. The anti-tumor necrosis factor agents are a major advance in the treatment of rheumatoid arthritis. J.Rheumatol.Suppl 72, 46-47.

Harrison, D. E. 1993. Competitive repopulation in unirradiated normal recipients. Blood 81, 2473-2474.

Hochberg, M. C., Tracy, J. K., Hawkins-Holt, M., and Flores, R. H. 2003. Comparison of the efficacy of the tumour necrosis factor alpha blocking agents adalimumab, etanercept, and infliximab when added to methotrexate in patients with active rheumatoid arthritis. Ann.Rheum.Dis. 62 Suppl 2, iil3-iil6.

Hodgson, G. S. and Bradley, T. R. 1979. Properties of haematopoietic stem cells surviving 5-fluorouracil treatment: evidence for a pre-CFU-S cell? Nature 281, 381-382.

Jacobsen, F. W., Dubois, С. M., Rusten, L. S., Veiby, O. P., and Jacobsen, S. E. 1995. Inhibition of stem cell factor-induced proliferation of primitive murine hematopoietic progenitor cells signaled through the 75-kilodalton tumor necrosis factor receptor. Regulation of c-kit and p53 expression. J.Immunol. 154, 3732-3741.

Jacobsen, S. E., Jacobsen, F. W., Fahlman, C., and Rusten, L. S. 1994. TNF-alpha, the great imitator: role of p55 and p75 TNF receptors in hematopoiesis. Stem Cells 12 Suppl 1, 111-126.

Jacobsen, S. E., Ruscetti, F. W., Dubois, C. M., and Keller, J. R. 1992. Tumor necrosis factor alpha directly and indirectly regulates hematopoietic progenitor cell proliferation: role of colony-stimulating factor receptor modulation. J Exp Med 175, 1759-1772.

Jordan, C. T. and Lemischka, I. R. 1990. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes Dev. 4, 220-232.

Karin, M. and Lin, A. 2002. NF-kappaB at the crossroads of life and death. Nat Immunol 3,221227.

Kavanaugh, A., St Clair, E. W., McCune, W. J., Braakman, T., and Lipsky, P. 2000. Chimeric anti-tumor necrosis factor-alpha monoclonal antibody treatment of patients with rheumatoid arthritis receiving methotrexate therapy. J.Rheumatol. 27, 841-850.

Kelker, H. C., Oppenheim, J. D., Stone-Wolff, D., Henriksen-DeStefano, D., Aggarwal, B. B., Stevenson, H. C., and Vilcek, J. 1985. Characterization of human tumor necrosis factor produced by peripheral blood monocytes and its separation from lymphotoxin. Int.J.Cancer 36, 69-73.

Keller, G. and Snodgrass, R. 1990. Life span of multipotential hematopoietic stem cells in vivo. J. Exp. Med. 171, 1407-1418.

Khoury, E., Andre, C., Pontvert-Delucq, S., Drenou, B., Baillou, C., Guigon, M., Najman, A., and Lemoine, F. M. 1994. Tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) downregulates c-kit proto-oncogene product expression in normal and acute myeloid leukemia CD34+ cells via p55 TNF alpha receptors. Blood 84, 2506-2514.

Khoury, E., Lemoine, F. M., Baillou, C., Kobari, L., Deloux, J., Guigon, M., and Najman, A. 1992. Tumor necrosis factor alpha in human long-term bone marrow cultures: distinct effects on nonadherent and adherent progenitors. Exp.Hematol. 20, 991-997.

Kinkhabwala, M., Sehajpal, P., Skolnik, E., Smith, D., Sharma, V. K., Vlassara, H., Cerami, A., and Suthanthiran, M. 1990. A novel addition to the T cell repertory. Cell surface expression of tumor necrosis factor/cachectin by activated normal human T cells. J.Exp Med. 171,941-946.

Klein, G. 1995. The extracellular matrix of the hematopoietic microenvironment. Experientia 51, 914-926.

Kolb, W. P. and Granger, G. A. 1968. Lymphocyte in vitro cytotoxicity: characterization of human lymphotoxin. Proc Natl Acad Sci USA 61, 1250-1255.

Kondo, M., Weissman, I. L., and Akashi, K. 1997. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell 91,661-672.

Krause, D. S., Theise, N. D., Collector, M. I., Henegariu, O., Hwang, S., Gardner, R., Neutzel, S., and Sharkis, S. J. 2001. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell 105, 369-377.

Kuprash, D. V., Alimzhanov, M. B., Tumanov, A. V., Grivennikov, S. I., Shakhov, A. N., Drutskaya, L. N., Marino, M. W., Turetskaya, R. L., Anderson, A. O., Rajewsky, K., Pfeffer, K., and Nedospasov, S. A. 2002. Redundancy in Tumor Necrosis Factor (TNF) and Lymphotoxin (LT) Signaling In Vivo: Mice with Inactivation of the Entire TNF/LT Locus versus Single-Knockout Mice. Mol.Cell Biol. 22, 8626-8634.

Kuprash, D. V., Tumanov, A. V., Liepinsh, D. J., Koroleva, E. P., Drutskaya, M. S., Kruglov, A. A., Shakhov, A. N., Southon, E., Murphy, W. J., Tessarollo, L., Grivennikov, S. I., and Nedospasov, S. A. 2005. Novel tumor necrosis factor-knockout mice that lack Peyer's patches. Eur. J.Immunol. 35, 1592-1600.

Lardon, F., Snoeck, H. W., Berneman, Z. N., Van Tendeloo, V. F., Nijs, G., Lenjou, M.,

Henckaerts, E., Boeckxtaens, C. J., Vandenabeele, P., Kestens, L. L., Van Bockstaele, D. R., and Vanham, G. L. 1997. Generation of dendritic cells from bone marrow progenitors using GM-CSF, TNF-alpha, and additional cytokines: antagonistic effects of IL-4 and IFN-gamma and selective involvement of TNF-alpha receptor-1. Immunology 91, 553559.

Lemischka, I. R. 1992. What we have learned from retroviral marking of hematopoietic stem cells. Curr.Top.Microbiol.Immunol. 177, 59-71.

Lemischka, I. R. and Moore, K. A. 2003. Stem cells: interactive niches. Nature 425,778-779.

Liepinsh, D.J., Grivennikov, S.I., Lagarkova, M.A., Drutskaya, M.S., Klarmann, K.D., Lockett, S.J., McAuliffe, M., Tessarollo, L., Keller, J.R., Kuprash, D.V. and Nedospasov, S.A. Novel Lymphotoxin a knockout mice with unperturbed TNF expression: reassessing LTa biological functions. 2006. Mol. Cell. Biol. 26, 541-550.

Locksley, R. M., Killeen, N., and Lenardo, M. J. 2001. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. Cell 104, 487-501.

Maciejewski, J. P., Risitano, A. M., Sloand, E. M., Wisch, L., Geller, N., Barrett, J. A., and Young, N. S. 2002. A pilot study of the recombinant soluble human tumour necrosis factor receptor (p75)-Fc fusion protein in patients with myelodysplastic syndrome. Br J.Haematol. 117, 119-126.

Mangi, M. H. and Mufti, G. J. 1992. Primary myelodysplastic syndromes: diagnostic and prognostic significance of immunohistochemical assessment of bone marrow biopsies. Blood 79, 198-205.

Marino, M. W., Dunn, A., Grail, D., Inglese, M., Noguchi, Y., Richards, E., Jungbluth, A., Wada, H., Moore, M., Williamson, B., Basu, S., and Old, L. J. 1997. Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 94, 8093-8098.

Means, T. K., Jones, B. W., Schramm, A. B., Shurtleff, B. A., Smith, J. A., Keane, J.,

Golenbock, D. T., Vogel, S. N., and Fenton, M. J. 2001. Differential effects of a Toll-like receptor antagonist on Mycobacterium tuberculosis-induced macrophage responses. The Journal of Immunology 166,4074-4082.

Mease, P. and Goffe, B. S. 2005. Diagnosis and treatment of psoriatic arthritis. J.Am.Acad.Dermatol. 52, 1-19.

Metcalf, D. 1998. Lineage commitment and maturation in hematopoietic cells: the case for extrinsic regulation. Blood 92, 345-347.

Micheau, O. and Tschopp, J. 2003. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes. Cell 114,181-190.

Molldrem, J. J., Leifer, E., Bahceci, E., Saunthararajah, Y., Rivera, M., Dunbar, C., Liu, J., Nakamura, R., Young, N. S., and Barrett, A. J. 2002. Antithymocyte globulin for treatment of the bone marrow failure associated with myelodysplastic syndromes. Ann.lntern.Med. 137, 156-163.

Morrison, S. J., Uchida, N., and Weissman, I. L. 1995. The biology of hematopoietic stem cells. Annu.Rev.CellDev.Biol. 11, 35-71.

Morrison, S. J. and Weissman, I. L. 1994. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity 1, 661-673.

Muller-Sieburg, C. E., Cho, R. H., Thoman, M., Adkins, B., and Sieburg, H. B. 2002.

Deterministic regulation of hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation. Blood 100, 1302-1309.

Muller-Sieburg, C. E. and Deryugina, E. 1995. The stromal cells' guide to the stem cell universe. Stem Cells 13,477-486.

Mundle, S. D., Ali, A., Cartlidge, J. D., Reza, S., Alvi, S., Showel, M. M., Mativi, B. Y., Shetty, V. T., Venugopal, P., Gregory, S. A., and Raza, A. 1999a. Evidence for involvement of tumor necrosis factor-alpha in apoptotic death of bone marrow cells in myelodysplastic syndromes. Am. J.Hematol. 60, 36-47.

Mundle, S. D., Reza, S., Ali, A., Mativi, Y., Shetty, V., Venugopal, P., Gregory, S. A., and Raza, A. 1999b. Correlation of tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) with high Caspase 3-like activity in myelodysplastic syndromes. Cancer Lett. 140, 201-207.

Murphy, M., Walter, B. N., Pike-Nobile, L., Fanger, N. A., Guyre, P. M., Browning, J. L., Ware, C. F., and Epstein, L. B. 1998. Expression of the lymphotoxin beta receptor on follicular stromal cells in human lymphoid tissues. Cell Death.Differ. 5, 497-505.

Nedospasov, S. A., Grivennikov, S. I., and Kuprash, D. V. 2003. Physiologic roles of members of the TNF and TNF receptor families as revealed by knockout models. In Cytokine knockouts (G. Fantuzzi, Ed.), pp. 439-460. Humana Press, Totowa, NJ.

Nedospasov, S. A., Hirt, B., Shakhov, A. N., Dobrynin, V. N., Kawashima, E., Accolla, R. S., and Jongeneel, C. V. 1986. The genes for tumor necrosis factor (TNF-alpha) and lymphotoxin (TNF-beta) are tandemly arranged on chromosome 17 of the mouse. Nucleic.Acids.Res. 14, 7713-7725.

Ogawa, M. 1993. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood 81, 28442853.

Ogawa, M. 1994. Hematopoiesis. J.Allergy Clin.Immunol. 94, 645-650.

Ogawa, M, 1999. Stochastic model revisited. Int.J.Hematol. 69, 2-5.

Old, L. J. 1988. Tumor necrosis factor. Sci.Am. 258, 59-60, 69-75.

Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., and Nakauchi, H. 1996. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science 273, 242245.

Papadaki, H. A., Kritikos, H. D., Gemetzi, C., Koutala, H., Marsh, J. C., Boumpas, D. T., and Eliopoulos, G. D. 2002. Bone marrow progenitor cell reserve and function and stromal cell function are defective in rheumatoid arthritis: evidence for a tumor necrosis factor alpha-mediated effect. Blood 99, 1610-1619.

Pasparakis, M., Alexopoulou, L., Episkopou, V., and Kollias, G. 1996. Immune and inflammatory responses in TNF alpha-deficient mice: a critical requirement for TNF alpha in the formation of primary B cell follicles, follicular dendritic cell networks and germinal centers, and in the maturation of the humoral immune response. J Exp Med 184, 1397-1411.

Pasparakis, M., Kousteni, S., Peschon, J., and Kollias, G. 2000. Tumor necrosis factor and the p55TNF receptor are required for optimal development of the marginal sinus and for migration of follicular dendritic cell precursors into splenic follicles. Cell Immunol 201, 33-41.

Pennica, D., Nedwin, G. E., Hayflick, J. S., Seeburg, P. H., Derynck, R., Palladino, M. A., Kohr, W. J., Aggarwal, B. B., and Goeddel, D. V. 1984. Human tumour necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin. Nature 312, 724-729.

Pfeffer, K. 2003. Biological functions of tumor necrosis factor cytokines and their receptors. Cytokine Growth Factor Rev. 14, 185-191.

Pfeffer, K., Matsuyama, T., Kundig, T. M., Wakeham, A., Kishihara, K., Shahinian, A.,

Wiegmann, K., Ohashi, P. S., Kronke, M., and Mak, T. W. 1993. Mice deficient for the 55 kd tumor necrosis factor receptor are resistant to endotoxic shock, yet succumb to L. monocytogenes infection. Cell 13,457-467.

Raza, A., Mundle, S., Shetty, V., Alvi, S., Chopra, H., Span, L., Parcharidou, A., Dar, S.,

Venugopal, P., Borok, R., Gezer, S., Showel, J., Loew, J., Robin, E., Rifkin, S., Alston, D., Hernandez, B., Shah, R., Kaizer, H., Gregory, S., and Preisler, H. 1996. A paradigm shift in myelodysplastic syndromes. Leukemia. 10, 1648-1652.

Rebel, V. I., Hartnett, S., Hill, G. R., Lazo-Kallanian, S. B., Ferrara, J. L., and Sieff, C. A. 1999. Essential Role for the p55 Tumor Necrosis Factor Receptor in Regulating Hematopoiesis at a Stem Cell Level. J Exp Med 190, 1493-1504.

Rogers, J. A. and Berman, J. W. 1993. A tumor necrosis factor-responsive long-term-culture-initiating cell is associated with the stromal layer of mouse long-term bone marrow cultures. Proc Natl Acad Sci USA 90, 5777-5780.

Rogers, J. A. and Berman, J. W. 1994. TNF-alpha inhibits the further development of committed progenitors while stimulating multipotential progenitors in mouse long-term bone marrow cultures. J.Immunol. 153, 4694-4703.

Ruddle, N. H. and Waksman, B. H. 1967. Cytotoxic effect of lymphocyte-antigen interaction in delayed hypersensitivity. Science 157,1060-1062.

Rusten, L. S., Jacobsen, F. W., Lesslauer, W., Loetscher, H., Smeland, E. B., and Jacobsen, S. E. 1994a. Bifunctional effects of tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) on the growth of mature and primitive human hematopoietic progenitor cells: involvement of p55 and p75 TNF receptors. Blood 83, 3152-3159.

Rusten, L. S. and Jacobsen, S. E. 1995. Tumor necrosis factor (TNF)-alpha directly inhibits human erythropoiesis in vitro: role of p55 and p75 TNF receptors. Blood 85,989-996.

Rusten, L. S., Smeland, E. B., Jacobsen, F. W., Lien, E., Lesslauer, W., Loetscher, H., Dubois, C. M., and Jacobsen, S. E. 1994b. Tumor necrosis factor-alpha inhibits stem cell factor-induced proliferation of human bone marrow progenitor cells in vitro. Role of p55 and p75 tumor necrosis factor receptors. J.Clin.Invest 94, 165-172.

Scallon, B., Cai, A., Solowski, N., Rosenberg, A., Song, X. Y., Shealy, D., and Wagner, C. 2002. Binding and functional comparisons of two types of tumor necrosis factor antagonists. J. Pharmacol.Exp. Ther. 301, 418-426.

Scott, K. A., Moore, R. J., Arnott, C. H., East, N., Thompson, R. G., Scallon, B. J., Shealy, D. J., and Balkwill, F. R. 2003. An anti-tumor necrosis factor-alpha antibody inhibits the development of experimental skin tumors. Mol. Cancer Ther. 2, 445-451.

Shaulian, E. and Karin, M. 2002. AP-1 as a regulator of cell life and death. Nat Cell Biol 4, E131-E136.

Smith, L. G., Weissman, I. L., and Heimfeld, S. 1991. Clonal analysis of hematopoietic stem-cell differentiation in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 88, 2788-2792.

Snoeck, H. W., Weekx, S., Moulijn, A., Lardón, F., Lenjou, M., Nys, G., Van Ranst, P. C., Van Bockstaele, D. R., and Berneman, Z. N. 1996. Tumor necrosis factor alpha is a potent synergistic factor for the proliferation of primitive human hematopoietic progenitor cells and induces resistance to transforming growth factor beta but not to interferon gamma. J.Exp.Med. 183, 705-710.

Spangrude, G. J., Brooks, D. M., and Turnas, D. B. 1995. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: in vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood 85, 1006-1016.

Spangrude, G. J. and Johnson, G. R. 1990. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 87, 7433-7437.

Steensma, D. P., Dispenzieri, A., Moore, S. B., Schroeder, G., and Tefferi, A. 2003.

Antithymocyte globulin has limited efficacy and substantial toxicity in unselected anemic patients with myelodysplastic syndrome. Blood 101,2156-2158.

Szlosarek, P., Charles, K. A., and Balkwill, F. R. 2006. Tumour necrosis factor-alpha as a tumour promoter. Eur. J. Cancer.

Tartaglia, L. A., Goeddel, D. V., Reynolds, C., Figari, I. S., Weber, R. F., Fendly, B. M., and Palladino, M. A., Jr. 1993a. Stimulation of human T-cell proliferation by specific activation of the 75-kDa tumor necrosis factor receptor. The Journal of Immunology 151, 4637-4641.

Tartaglia, L. A., Pennica, D., and Goeddel, D. V. 1993b. Ligand passing: the 75-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor recruits TNF for signaling by the 55-kDa TNF receptor. J.Biol.Chem. 268, 18542-18548.

Tessier, P. A., Naccache, P. H., Clark-Lewis, I., Gladue, R. P., Neote, K. S., and McColl, S. R. 1997. Chemokine networks in vivo: involvement of C-X-C and C-C chemokines in neutrophil extravasation in vivo in response to TNF-alpha. J.Immunol. 159, 3595-3602.

Tessier, P. A., Naccache, P. H., Diener, K. R., Gladue, R. P., Neote, K. S., Clark-Lewis, I., and McColl, S. R. 1998. Induction of acute inflammation in vivo by staphylococcal superantigens. II. Critical role for chemokines, ICAM-1, and TNF-alpha. The Journal of Immunology 161, 1204-1211.

Till, J. E., McCulloch, E. A., and Siminovitch, L. 1964. A stochastic model of stem cell proliferation, based on the growth of spleen colony-forming cells. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 51,29-36.

Tumanov, A. V., Kuprash, D. V., and Nedospasov, S. A. 2003. The role of lymphotoxin in development and maintenance of secondary lymphoid tissues. Cytokine Growth Factor Rev. 14, 275-288.

Vandenabeele, P., Declercq, W., Vercammen, D., Van de, C. M., Grooten, J., Loetscher, H., Brockhaus, M., Lesslauer, W., and Fiers, W. 1992. Functional characterization of the human tumor necrosis factor receptor p75 in a transfected rat/mouse T cell hybridoma. J.Exp.Med. \16, 1015-1024.

VandenBerg, E., Reid, M. D., Edwards, J. D., and Davis, H. W. 2004. The role of the cytoskeleton in cellular adhesion molecule expression in tumor necrosis factor-stimulated endothelial cells. J.Cell Biochem. 91, 926-937.

Wallach, D., Varfolomeev, E. E., Malinin, N. L., Goltsev, Y. V., Kovalenko, A. V., and Boldin, M. P. 1999. Tumor necrosis factor receptor and Fas signaling mechanisms. Annu Rev Immunol 17, 331-367.

Wallis, R. S., Broder, M. S., Wong, J. Y., Hanson, M. E., and Beenhouwer, D. O. 2004.

Granulomatous infectious diseases associated with tumor necrosis factor antagonists. Clin.Infect.Dis. 38, 1261-1265.

Wang, A. M., Creasey, A. A., Ladner, M. B., Lin, L. S., Strickler, J., Van Arsdell, J. N.,

Yamamoto, R., and Mark, D. F. 1985. Molecular cloning of the complementary DNA for human tumor necrosis factor. Science 228, 149-154.

Ware, C. F., Crowe, P. D., Grayson, M. H., Androlewicz, M. J., and Browning, J. L. 1992. Expression of surface lymphotoxin and tumor necrosis factor on activated T, B, and natural killer cells. The Journal of Immunology 149, 3881-3888.

Ware, C. F., VanArsdale, T. L., Crowe, P. D., and Browning, J. L. 1995. The ligands and receptors of the lymphotoxin system. Curr. Top.Microbiol.Immunol. 198, 175-218.

Watt, F. M. and Hogan, B. L. 2000. Out of Eden: stem cells and their niches. Science 287, 14271430.

Weiss, T., Grell, M., Hessabi, B., Bourteele, S., Muller, G., Scheurich, P., and Wajant, H. 1997. Enhancement of TNF receptor p60-mediated cytotoxicity by TNF receptor p80: requirement of the TNF receptor-associated factor-2 binding site. J. Immunol. 158, 23982404.

Wilson, A. and Trumpp, A. 2006. Bone-marrow haematopoietic-stem-cell niches. A'at.Rev.Immunol. 6, 93-106.

Witsell, A. L. and Schook, L. B. 1993. Tumor necrosis factor alpha is an autocrine growth regulator during macrophage differentiation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 90, 4763.

Wolfe, F., Michaud, K., Anderson, J., and Urbansky, K. 2004. Tuberculosis infection in patients with rheumatoid arthritis and the effect of infliximab therapy. Arthritis Rheum. 50, 372379.

Wright, H. V., Bailey, D., Kashyap, M., Kepley, C. L., Drutskaya, M. S., Nedospasov, S. A., and Ryan, J. J. 2006. IL-3-mediated TNF production is necessary for mast cell development. J. Immunol. 176,2114-2121.

Zang, D. Y., Goodwin, R. G., Loken, M. R., Bryant, E., and Deeg, H. J. 2001. Expression of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, Apo2L, and its receptors in myelodysplastic syndrome: effects on in vitro hemopoiesis. Blood 98, 3058-3065.

Zhang, J., Niu, C., Ye, L., Huang, H., He, X., Tong, W. G., Ross, J., Haug, J., Johnson, T., Feng, J. Q., Harris, S., Wiedemann, L. M., Mishina, Y., and Li, L. 2003. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature 425, 836-841.

Zhang, Y., Harada, A., Bluethmann, H., Wang, J. B., Nakao, S., Mukaida, N., and Matsushima, K. 1995. Tumor necrosis factor (TNF) is a physiologic regulator of hematopoietic progenitor cells: increase of early hematopoietic progenitor cells in TNF receptor p55-deflcient mice in vivo and potent inhibition of progenitor cell proliferation by TNF alpha in vitro. Blood 86, 2930-2937.

Zhang, Y. H., Heulsmann, A., Tondravi, M. M., Mukherjee, A., and Abu-Amer, Y. 2001. Tumor necrosis factor-alpha (TNF) stimulates RANKL-induced osteoclastogenesis via coupling of TNF type 1 receptor and RANK signaling pathways. J Biol Chem 276, 563-568.

Zheng, L., Fisher, G., Miller, R. E., Peschon, J., Lynch, D. H., and Lenardo, M. J. 1995.

Induction of apoptosis in mature T cells by tumour necrosis factor. Nature 377, 348-351.

Благодарности:

В первую очередь, я бы хотела поблагодарить своих замечательных научных руководителей Дмитрия Владимировича Купраша и Джонатана Келлера, которые принимали активное участие в постановке научной задачи, организации экспериментов, обсуждении результатов и критической оценке проделанной работы. Дмитрию Владимировичу выражаю отдельную благодарность за существенную помощь в оформлении полученных данных, научных презентаций, а также за внимательное и критическое прочтение текста диссертации.

Я также хочу поблагодарить Сергея Артуровича Недоспасова, вдохновившего меня па участие в этом интересном проекте, за всестороннюю помощь и поддержку в организации экспериментальной части работы, критическом обсуждении результатов исследования, оформлении и внимательном прочтении текста диссертации

Выражаю искреннюю признательность Нине Иосифовне Дризе и Иосифу Львовичу Черткову за неотъемлемый вклад в развитие этих исследований, бесценную помощь в освоении большинства методов, использованных в ходе работы, ценные советы и наставления.

Я не могу не отметить других важных участников этой работы и выразить им свою искреннюю благодарность:

• Дмитрию Лиепиньшу и Сергею Гривенникову за обсуждение полученных результатов, критические замечания и участие в некоторых важных экспериментах.

• Ивану Андреевичу Воробьеву за помощь в проведении цитофлуориметрического анализа.

• Алексею Владимировичу Терских за обсуждение и участие в некоторых важных экспериментах, предоставление уникальной линии мышей для дальнейших исследований.

• Людмиле Николаевне Друцкой за экспертную техническую и организационную помощь в выполнении работы.

• Анне Говардовпе Халатовой за помощь в решении некоторых технических вопросов.

• Рафаелу Шаэповичу Казаряну и Тахмине Истамовне Ачельдиевой за безупречное решение многих организационных и административных вопросов.

• Бывших и нынешних сотрудников нашей лаборатории, студентов и аспирантов за участие в обсуждении научных работ и всестороннюю помощь.

И, наконец, хочу от всей души поблагодарить своих родных и близких сердцу людей за бесконечную поддержку и всеобщее понимание.

Информация о работе

Друцкая, Марина Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Роль фактора некроза опухолей в поддержании гемопоэза у мышей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Роль фактора некроза опухолей в поддержании гемопоэза у мышей ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль фактора некроза опухолей в поддержании гемопоэза у мышей"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Друцкая, Марина Сергеевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль фактора некроза опухолей в поддержании гемопоэза у мышей"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль фактора некроза опухолей в поддержании гемопоэза у мышей
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология