Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поведенческие и противоопухолевые эффекты полисахаридов. триоловых сапонинов красного женьшеня ( C. A. Meyer) и рекомбинантных цитокинов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Поведенческие и противоопухолевые эффекты полисахаридов. триоловых сапонинов красного женьшеня ( C. A. Meyer) и рекомбинантных цитокинов"

Л 1

'J

.московский государственный университет пи. м. в. лолюносова

• •

биологи чески II факультет

■i4id>iii«iii а I ш «—ihii ц ii ни in и tiinniwi | и I Himw шт i iw ни ииим ^пи nui'i —~т~и>

На правах рукописи

ЛЮБИМОВ »Игорь Иванович

удк: 612.8+612.017.1 +591.513+577.1+615.37

ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ЭФФЕКТЫ ПОЛИСАХАРИДОВ, ТРИОЛОВЫХ САПОНИНОВ КРАСНОГО ЖЕНЬШЕНЯ (С. A. Meyer) И РЕКОМБИНАНТНЫХ ЦИТОКИНОВ

03.00.13 — физиология человека и животных

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

москва — 1995

Работа выполнена в Центре Доклинических Испытании Биопрепаратов Государственного Научного Центра прикладной микробиологии Министерства Здравоохранения и Медицинской Промышленности.

Директор — доктор медицинских наук, профессор Н. Н. Ураков.

Научные р у к о в о д и т е л и:

доктор биологических наук, профессор С. А. Чепурнов; доктор биологических наук В. В. Гусев.

Официальные оппонент ы:

доктор биологических наук, профессор Н. А. Тушмалова; 'кандидат биологических наук, доцент В. Ю. Щебланов.

Ведущее учреждение: НИИ Нормальной Физиологии им. П. К. Анохина Российской Академии Медицинских Наук.

Защита состоится декабря 1995 года в 15.30 на заседании Специализированного Ученого Совета Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова по адресу: 117234 г. Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан « ноября 1995 года.

Ученый секретарь а л—,

Специализированного Совета, А у нС^] кандидат биологических наук /ЧкХ^ / Б. А. Умаропа

В последние годы значительно возрос интерес к проблеме единства регуляции нейроэндокринной и иммунной системы в связи с возможностью нейропептидной коррекции их нарушений. Это прослеживается на примере олигопептидов мозга. раскрыты функциональная роль и нейрохимические особенности их центрального действия в связи с новой концепцией академика И.П.Ашмарина о Физиологическом континууме пептидов (И.П.Ашмарин, М.Ф.Обухова, 1986). Они оказывают многогранное влияние на ЦНС, включая модуляторное и медиаторное, психотропное действие,влияние на цикл "сон-бодрсгвование", болевую чувствительность, поддержание гомеостаза с помощью механизмов саморегуляции, на процессы обучения и памяти (И.П.Ашмарин, 1975, 1977, И.П.Ашмарин, Р.И.Кругликов, 1983; А.Л.Каменский и др., 1980; В.Е.Клуша, 1984; С.А.Чепурнов,H.Е.Чепурнова, 1985; Л.В. Антонова, А.А.Каменский, 1982; С.А.Титов и др.,1987, 0.А.Гомазков,1992).

В последние годы накопились Факты о влиянии олигопептидов не только на ЦНС, но и на иммунную систему (Е.А.Коренева.и др.,1989, 1990,; Р.А.Данилова, И.П.Ашмарин, 1994, В.А.Григорьев,1995). Обнаружено, что иммунокомпетентные клетки продуцируют нейрогормоны и пептиды, а нейроэндокринные клетки продуцируют цитокины. Все эти молекулы составляют единый язык взаимодействия нейроэндокринной и иммунной системы ( Blalock, 1994; Falashi et al., 1994; Le Boeuf, 1994). Установление, что цитокины, кроме ключевой роли в иммунных реакциях в качестве медиаторов, обнаружении в мозге как эндогенные молекулы, основная роль которых сводится, как полагают, к поддержанию гомеостаза в ЦНС в качестве трофических факторов (Mallet & Barclay, 1991; Loetscher et al., 1992; Smith & Bangioni, 1992). Несомненно, что присутствие цитокинов в мозге не ограничивается только трофическим влиянием па нервную ткань, но и изменяет поведение животных - феноменологическое выражение степени активности ЦНС (Bluthe et al., 1994). По-видимому, активация иммунитета, в этой связи, происходит не только в результате прямого воздействия цитокинов на эффекторные звенья иммунной системы, но и, по механизму обратной связи, через влияние на центральную регуляцию иммунитета. В этой связи представляет интерес изучение центральных эффектов цитокинов.

Фактор-некроза опухолей (ФНО-К или ФНО) и лимфотоксин (ФНО-В или ЛТ) относятся к-группе цитокинов. В естественных условиях ФНО экспрессируется в моноцитах, макрофагах, лимфоцитах, естественных киллерах, эндотелиальнык, тучных, глиальных клетках, астроцитах,

Купферовских, гранулезных, гладкомышечных и некоторых опухолевых клетках (Aggarwal,1992; Turetskaya et al.,1992). ЛТ может продуцироваться многими клетками, включая лимфоциты, астроциты, лимфоки-нактивированные киллерные клетки и миеломные клетки (Aggarwal, 1992; Turetskaya et al.,1992). Обладая многочисленными биологическими эффектами, они, в частности, активируют эффекторные звенья иммунитета (Т.Ф.Соловьева, Н.А.Константинова и др., 1989) и таким образом усиливают противоопухолевую эффективность иммуннокомпетентных клеток организма хозяина, несущего опухоль (Paul & Ruddle, 1988; Aggarwal, 1992; Obeid et al.,1993; Heller et al.,1993;Tartaglia et al.,1993).

Созданы искусственные белковые конструкции из цитокинов и иммунных пептидов с вероятностно-прогнозируемым действием. Такими конструкциями в нашей работе являются рекомбинантные гибридные белки тимозин-öa-фактор некроза опухоли-а (Т-ФНО), Фактор некроза опу-холи-й -тимозин-äi (ФНО-Т) и рекомбинантные человеческие: лимфоток-син (ЛТ) модифицированный (лишенный 21 N-концевых аминокислот), Фактор некроза опухоли - а(ФНО) (В.Г.Коробко и др., 1992; В.А.Шмелёв и др., 1994). Центральное действие этих препаратов, особенно на поведение, практически мало исследовано.

Перспективен дальнейший поиск их применения в комбинированной терапии. Одними из возможных кандидатов для комбинированной терапии с модификаторами иммунного ответа могут выступать сапониновые и несапониновые фракции корейского красного женьшеня. Актуальным является изучение взаимодействия продуктов биотехнологии - рекомбинаит-ных цитокинов и биологически активных веществ растительного происхождения - некоторых активных Фракций красного женьшеня на опухолевых моделях, как частной проблемы иммунологии.

Теоретический и практический интерес представляет центральное действие женьшеня (И.И.Брехман, 1957; А.Д.Турова, Э.Н.Сапожникова, 1984; А.А.Филаретов и др., 1986). Актуальность исследования объясняется также возросшим интересом к изучению женьшеня в связи с возможностью его выращивания на искусственных средах (Н.Ф.Писецкая, 1970; Р.Г.Бутенко и др., 1984) с выделением и селективной концентрацией активных фракций, обладающих многосторонним позитивным действием на функциональные системы организма. Гинзенозиды женьшеня обладают ноотропным спектром фармакологической активности (Zhang et al.,1993). Влияние женьшеня на высшую нервную деятельность исследовано достаточно подробно при применении общих экстрактов и Фракций

(Petkov; et а1.,1990; ^еп1ке е! а1.,1991), новые данные указывают на облегчающее действие Ио, ИЫ на память (Ьее et а1., 1992; СЪеригпоу еЬ а1., 1994), но остается спорным вопрос о механизмах его облегчающего действия именно на неповрежденную память (П.Д.Шабанов, У.С.Бородкин,1989). В отношении центрального действия новым этапом в изучении женьшеня является изучение его активных фракций и отдельных гинзенозидов. Данных о влиянии полисахаридов,на поведение в литературе не имеется. Поэтому представляет интерес изучение влияния полисахаридов на формирование целостных поведенческих актов.

Пель работы. Изучение поведенческих и противоопухолевых эффектов полисахаридов и триоловых сапонинов красного женьшеня и реком-бинантных цитокинов, оценка возможности синергизма в терапии экспериментальных опухолей при комбинированном применении полисахаридов и триоловых сапонинов с рекомбинантными цитокинами и гибридными белками, играющими ключевые роли в регуляции противоопухолевого иммунитета.

Для достижения этой нет были ппгтавдетш сдеяупдня задачи:

1. Изучить центральные эффекты полисахаридной фракции красного женьпеня на примере выработки условной реакции активного избегания, изменения ноцицептивного порога, изменения координации движений и работоспособности.

2. Изучить самостоятельную роль рекомбинантных цитокинов и гибридных белков, состоящих из цитокинов и иммунного пептида тимо-зина св качестве противоопухолевых Факторов.

3. Изучить эффективность комбинированного применения полисахаридов и триоловых сапонинов красного женьшеня с рекомбинантными цитокинами и гибридными белками с целью достижения максимального противоопухолевого действия с одновременным снихеккс™ токсических побочных эффектов.

4. Определить характер поведенческих эффектов при системном введении цитокинов, связанных с участием в противоопухолевом иммунитете, что имеет отношение к процессам происходящим в мозге и, отчасти, находит свое выражение в некоторых поведенческих реакциях.

Положения■ саносиние на заяиту.

1. Полисахариды красного женьшеня при системном (в/б) введении облегчают выработку УРАН как в экстремальной ситуации, при коротком межстимульном интервале времени, так и в классическом режиме, когда межстимульный интервал длиннее на порядок; понижают ноцицептивный порог, что проявляется в гиперальгезии.

2. Курсовая премедикация полисахаридами и триоловыми сапонинами из красного женьшеня оказывает ингибирующее действие на процесс посттрансплантационого формирования и роста опухолей (с усилением этого эффекта рекомбинантными цигокинами) и модулирует собственную противоопухолевую активность рекомбинантных цитокинов.

3. Изучаемые в данной работе рекомбинантные цитокины помимо противоопухолевого действия (иммуномодуляторная активность и прямое цитотоксическое и цитостатическое действие на опухолевые клетки) обладают и центральными эффектами, что вполне обосновано с точки зрения современных данных нейроиммунологии.

раучцая новизна. Впервые получены данные об эффективности несапониновой (полисахаридной) фракции женьшеня в процессе выработки условнорефлекторной реакции активного избегания, понижении порога ноцицептивной чувствительности. Б то же время Фракция полисахаридов не влияла на координацию движений и работоспособность.

Впервые доказана способность полисахаридов и триоловых сапонинов при курсовом предтрансплантационном введении усиливать резистентность макроорганизма к дозе опухолевых клеток инициирующей опухолевый рост и модулировать противоопухолевую активность рекомбинантных цитокинов (в том числе модифицированных) и гибридных белков, созданных на их основе. Впервые показано, что изученные в данной работе рекомбинантные белки (особенно гибридный белок: фактор некроза опухоли-К-тимозин-Й!) вызывают целый ряд центральных эффектов.

Научно-практическая ценность. Практическое значение могут иметь полученные в данной работе результаты о способности полисахаридов красного женьшеня вызывать позитивные поведенческие и, в сочетании с рекомбинантными белками Фактором некроза опухоли или лим-Фотоксином, противоопухолевые эффекты, что дополняет представление о биологически активных компонентах красного женьшеня и дает обоснование к расширенному применению гинзенозидов в клинике и созданию на этой базе принципиально новой лекарственной формы женьшеня.

Показано, что рекомбинантные белки цитокиновой природы изменяют функциональное состояние центральной нервной системы, что в свою очередь может помимо поведенческих проявлений отражаться на центральной регуляции иммунного ответа. Центральные эффекты следует учитывать при клиническом применении цитокинов.

Апообания работы. Материалы диссертации доложены на: на IX конференции по проблеме использования цитокинов (1992, Оболенск);

на 5 Международном симпозиуме по биомедицинским исследованиям Корейского красного женьшеня, Тэджон, Корея (сентябрь 1994); симпозиуме "Молекулярные и генетические механизмы, адаптивного поведения"

ч

Санкт-Петербург (декабрь,1994); на II Российском Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (апрель,1995); на научном семинаре Центра Доклинических Испытаний Биопрепаратов Государственного Научного Центра прикладной микробиологии. (Оболенск, июль 1995), заседании Оболенского отделения Физиологического общества при РАН им.И.П.Павлова; на Всероссийской конф. "Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии",(Санкт-Петербург, ноябрь 1995).

на/^?-стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, заключения и выводов. Библиографический указатель со-держитЗ^э отечественных и2/0иностранных работ. Текст содержит 20 таблиц и 13 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И КЕТ ОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на половозрелых мышах, весом от 19 до 25 г. (самцы и самки) линии С57В1/6 в количестве 660 шт., мышах линии BDF1 (самцы и самки) в количестве 220 шт. Опыты по изучению центральных эффектов проведены на белых половозрелых нелинейных крысах и крысах_линии Wistar, весом 220-270 г. (п = 340, самки и самцы и п = 128 только самцы).

Полисахаридная Фракция и суммарная фракция триоловых сапонинов красного женьшеня в виде порошковой субстанции были получены из Корейского Исследовательского Института Женьшеня и Табака, г.Тэджон, (Корейская Республика).

Рекомбинантные человеческие: лимфотоксин (ЛТ) модифицированный (лишенный 21 N-концевых аминокислот) , Фактор некроза опухоли-« (ФИО), гибридные белки тимоэин-с*1-фактор некроза опухоли-й (Т-ФН0) и фактор некроза опухоли-<*-тимозин-<*1 (ФНО-Т) были предоставлении отделом генноинженерных препаратов ГНЦ прикладной микробиологии (Зав. отд. докт.биол. наук. Шмелёв В.А.). Специфическая активность на мг белка, проверенная в цитотоксическом тесте in vitro на линии клеток фибросаркомы мыши L- 929 составляла для ЛТ-1х108 ед., ФИО -4x107 ед., Т-ФНО - 1. Зхт ед. , ФНО-Т - 1.5x106 ед.

Полисахаридную фракцию (ПСФ) растворяли в нескольких каплях 70% этанола, доводили до нужного объёма стерильной дистиллированной

водой, а затем вводили в/б в объёме 0.5 мл за 30 мин. до начала тестирования УРАИ. Диапазон доз для ПСФ составлял от ЮОмкг до 10 мг на животное. При тестировании противоопухолевого действия раствор препарата, состоящего из равных частей полисахаридов и триоло-вых сапонинов красного женьшеня (ТСП), готовили как и ПСФ, и вводили в/б в концентрации 1мг/мышь/0.2мл. Контрольным животным вводили адекватный объем диет, воды с тем же количеством этанола.

Рекомбинантные белки разводили стерильным физиологическим раствором и инъецировали 0.2 мл/мышь с расчётными единицами активности. Диапазон исследуемых доз для ЛТ составлял от 100 до 10.000 ед/мышь, для ФНО , Т-ФНО и ФНО-Т от 100 до 100.000 ед/мышь. В опытах по оценке центрального действия ЛТ и ФНО - т, на крысах исполь- — зованы дозы в мкг/кг. Диапазон доз составлял от 10 до 500 мкг/кг. Препараты вводили подкожно (п/к) и внутривенно (в/в) в объёме 0.5 мл/крысу, либо однократно (острая токсичность), либо в течение 21 дня (хроническая токсичность).

В опытах по оценке противоопухолевого действия препараты ЛТ, ФНО, Т-ФНО, ФНО-Т и ТСП вводили в/б и интратуморальным (и/т) способами на ранней стадии (через 48 часов после трансплантации опухолевых клеток) развития опухолей и на стадии развившейся опухоли (обычно через 7-9 сут. после трансплантации), когда пальпируемая опухоль достигала размеров 5-10мм в диаметре. Курс лечения составлял 1-7 введений препарата.

Для выработки условной реакции активного избегания (УРАИ) в челночной камере использовали установку "Omnitech Electonics Inc., (USA) с полной компьютеризацией эксперимента (Буреш, Бурешова, 1989). Обучение проводили при одностороннем пути избегания крысой электрического раздражения с постоянно меняющимся аверсивным градиентом, что, как известно, затрудняет выработку УРАИ и требует значительного количества повторов для успешного выполнения предложенной задачи.

Применяли два режима предъявлений. В "мягком" режиме (одна серия, п=25) после подачи условного сигнала (УС) - звук продолжительностью 5с.- сразу включался безусловный сигнал (БС) - электрическое раздражение (10 е., 0.5 - 1.0 мй). Интервал между окончанием УС и началом нового БС длился 30-70 с. по случайному выбору. Б дни тестирования каждое животное выполняло 40 таких циклов. В "жестком" режиме (две серии п = 57 и п = 46) цикл предъявлений строился следующим образом: УС (Зс.) - межсигнальный интервал (строго 4с.) - БС

(4с.). Интервал между окончанием БС и началом нового УС (нового цикла) был Зс. В день тестирования каждое животное выполняло 10 таких циклов.

Процедуру выработки УРАИ всегда начинали с 3-5 минутной адаптации животного к челночной камере. Эксперименты включали : 1) обучение, соответственно 12 дней при "мягком" , 2 и 4 дня в "жестких" режимах, 2) курсовое введение ПСФ, 10 и 6 дней, 3) проверку эффекта отмены препарата. При "мягком" режиме выработки УРАИ однократно ин-траназально вводили окситоцин (КОС Латвийской АН,Рига) с учетом его амнестического действия. Обученность оценивали по двум критериям:

I. Латентному времени избавления от аверсивного раздражителя в секундах, II. Количеству условных реакций активного избегания (собственно УРАИ).

Для оценки действия изучаемых препаратов на психоэмоциональное ' состояние использовали "открытое поле" по Холлу (Hall, 1934); на двигательную активность - регистратор спонтанной двигательной активности (Omnltech electronics inc., USA); на выносливость, работоспособность и координацию движений - методику "вращающегося стержня" в режиме ускорения (Dunham and Miya, 1957). Для измерения порога болевой чувствительности применяли тесты "отдергивание хвоста" - "Tail Flick" (Ugo Baaile, Italy) и "горячая пластинка"- "Hot Plate" (Omnitech electronics inc., USA).

В качестве моделей для изучения противоопухолевого действия брали перевиваемые опухоли мышей линии С57В1/6- меланома В-16, фиб-росаркома MC-11, асцитная и солидная формы, и линии мышей BDF1 (C57B1/DBA) - лейкоз Р-388. В качестве реципиентов для меланомы В-16 была использована сингенная линия мышей С57В1/6 , для мс-11 линии мышей CÖ7B1/5 и DEIT1, для ¿гйкоэя Р-388 линия мышей DBF1. Изучение противоопухолевого действия рекомбинантных белков на модели лейкоза Р-388 и частично на модели фибросаркомы МС-11 проводили совместно с сотрудниками Отдела Экспериментальной Химиотерапии опухолей ОНЦ РАМН (Зав. отд. докт. мед. наук Герасимова Г.К.).

Моделирование опухолевого процесса осуществляли по общепринятым методикам. Опухолевые клетки трасплантировали в абдоминальную или подмышечную область мышам-реципиентам. Противоопухолевое действие препаратов оценивали по степени торможения роста (TP) опухолей (в % к контролю), по увеличению продолжительности жизни (УПЖ) животных по сравнению с контролем, по токсическому действию на селезенку, а также по интегративным показателям веса и общего состоя-

ния. Расчёты ТР опухолей производили с использованием двух формул: формулы Шрека (принятой в ОНЦ РАМН) и формулы Сомуры (БоЬтига et а1., 1986).

Достоверность различий между средними оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни или Ц-критерия и ■Ь-критерия Сгьюдента (Лакин, 1990). Статистическую оценку качественных изменений проводили по Фишеру.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ЦЕНТРАЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПОЛИСДХАРИД0ОЙ ФРАКЦИИ КРАСНОГО ЖЕНЬШЕНЯ**

Задачей работы было исследовать центральные эффекты полисаха-ридной Фракции экстракта красного женьшеня при его системном, курсовом введении на примере формирования у крыс условной реакции активного избегания (УРАИ) в челночной камере, а также по изменениям порога болевой чувствительности, координации движений и работоспособности.

При изучении формирования УРАИ были проведены три серии экспериментов : две в "жестком" и одна в "мягком" режимах сочетанных предъявлений условных и безусловных стимулов.

Выбор двух протоколов обучения был обусловлен созданием экстремальной стрессовой ситуации за счет укороченного межстимульного промежутка времени (4с -"жесткий" режим) и выяснением того, как меняется при этом характер поведенческих реакций в сравнении с режимом без повышенной стрессовой нагрузки (30 - 70с - "мягкий" режим). Измеряли латентное время избавления от аверсивного раздражителя в секундах и количество УРАИ. Память оценивали по способности сохранять полученные навыки через несколько суток после отмены курса ПСФ.

До введения препарата опытные и контрольная группа имели одинаковое в среднем время избегания. Длительное системное введение ПСФ при "мягком" режиме выработки УРАИ показало, что при дозе в 1 мг результативность избеганий ухудшалась (Рис.1.-20 день), а дальнейшее улучшение было не достоверным. При дозе в 10 мг значительное

улучшение наблюдали до конца курсового введения (Рис.1- 23). Именно ** _

соруководителем данной части работы является канд. биол. наук В.М.Борзенков

в этой группе достоверные изменения наблюдались и после отмены препарата, и в результате интраназального введения окситоцина (Рис.1.-24) Оценка изменений латентного периода реакции избавления показала, что ПСФ в дозе 1 мг облегчает выработку этого навыка, вызывая сокращение времени реакции на предъявленный аверсивный раздражитель как во время инъекций, так и в первый день отмены препарата (Рис.2). Выявляется также эффект положительного последействия. На второй день отмены в обеих группах (1 мг и 10мг ) обнаруживается повышенная по сравнению с контролем чувствительность к окситоцину, введенному на Фоне продолжающегося изменения, характерного для синдрома отмены ноотропов.

Способность животных к обучению навыку УРАН и избавлению, связанная в основном с возрастными особенностями, типом питания и сезонностью была различной в первом и втором экспериментах в "жестком" режиме. Так, значения латентного времени избавления от авер-сивного раздражителя полученные к последним дням периода обучения достоверно различались между собой при параллельном анализе групп в первом и втором эксперименте. Однако, лучшие показатели по этому критерию (на последний день обучения) были получены во втором эксперименте и подопытным животным потребовалось для этого 2 дня тренировки, в то время как для достижения худших значений этого критерия в первом эксперименте животным потребовалось 4 дня тренировки. Эти обстоятельства несомненно оказывали влияние на групповой характер поведенческих реакций животных в обеих экспериментах до, во время и после курса ПСФ. Выработка УРАЛ в "жестком" режиме первого эксперимента показала, что наибольший эффект ПСФ выявлен в дозе 5мг. При этом обучаемость животных по критерию избавления носит не случайный характер, поскольку наблюдается эффект отмены. При этом достоверно, по сравнению с контролем, происходит увеличение времени избавления. Для остальных групп различий не выявлено.

Во втором эксперименте в "жестком" режиме не выявление достоверных отличий опытных групп от контрольной по критерию избавления. Но все же обращает на себя внимание более выраженная тенденция к укорочению латентного времени в дозе 5 мг (как и в первом эксперименте в" жестком" режиме), хотя и проявившаяся к 1-му дню отмены. Отсутствие же эффекта отмены в этой дозе подтверждает ранее высказанное предположение о различных паттернах поведенческих ответов, зависящих, по-видимому, от возрастных особенностей и исходного Функционального состояния ЦНС.

Дни эксперимента

Рис. 1. Изменение количества избеганий у крыс б тесте УРАИ (в среднем по группе }.

По оси абсцисс: 8-12 - последние дни обучения перед курсовым введением ПСФ, 20-22 - 8 и 10 дни введения ПСФ; 23 - первый день отмены ПСФ; 24 - введение окситоцина в дозе 10 мкг, интраназально. »-достоверное отличие от контроля при Р<0.05(^критерий Стьюдента).

Контроль Юмг/жкв.

^_1_1_[ 1МГ/ЖИ».

2 ' 3 ' 4 ' '

Дни эксперимента

Рис. 2. Изменение латентного времени избавления при выработке УРАИ. "Мягкий" режим изменений межсигнальных интервалов в случайном порядке от 30 до 70 с.

По оси абсцисс: 1 - среднее значение за 10 дней обучения; 2, 3 -8-ой и 10-ый дни курсового введения ПСФ; 4 - первый день отмены препарата; 5 - введение окситоцина в дозе 10 мкг интраназально. Количество животных в группах: в дозе 1 мг/животное - 9, в дозе 10 мг/животное - 9, в контроле - 8. '

♦ -достоверное отличие от контроля при Р<0.05(^критерий Стьюдента).

Контроль 100мкг/жив. 1мг/жив. 5иг/жив.

11/20 11/25 11/30

Див эксперимента

Рис. 3. Влияние интраперитонеального введения ПСФ нп порог но-цицептивной чувствительности в тесте "tail flick".

достоверное отличие от контроля при Р<0.05 (t-критерий Стьюдента)

Показатели УРАЛ, полученные в первом эксперименте " жесткого" режима, показывают факт влияния ПСФ на процесс обучения и памяти в условиях повышенной стрессовой нагрузки. Неслучайный характер в увеличении количества избеганий в опытных группах (дозы ЮОмкг и 1мг) подтверждается эффектом отмены в первые два дня после окончания курса ПСФ. Доза ЮОмкг была наиболее эффективной по действию на процесс сохранения этого навыка (11-й день отмены).

Основанием для постановки экперимента по оценке влияния ПСФ на порог болевой чувствительности послужили предположения о способности сапониновых и несапониновых Фракций красного женьшеня облегчать ацетилхолинэргическую и серотонинэргическую синаптическую передачу, т.е. регулировать взаимодействие ноцицептивной и антиноцицептивной эндогенных систем, формирующих функционально-подвижный порог боли. В настоящих тестах фиксировался специфический перцептуальный компонент, выражавшийся в реакции отдергивания хвоста. Средние результаты времени экспозиции (с) хвоста в фокусе теплового луча до момента его отдергивания не различались между собой перед началом шестидневного курса ПСФ (Рис.3). В последний день в/б введения препарата проявился прямой дозозависимый эффект в снижении порога болевой чувствительности, что выражалось в достоверном уменьшении, по сравнению с контролем, времени экспозиции хвоста в дозах 1 и 5 мг/ж (приблизительно 4 и 20 мг/кг соответственно). Снижение времени экспозиции хвоста отмечалось во всех группах при повторном тестировании (последний день курса ПСФ). Однако в контрольной группе и группе получавшей ЮОмкг этот эффект не был достоверным, в отличие от доз 1 и 5 мг. На 5-й день отмены снижение времени экспозиции продолжалось во всех группах. Этот Феномен можно объяснить адаптивным поведением животных и обучением.

Результаты влияния ПСФ на координацию движений, работоспособность и выносливость показали, что препарат во всех исследованных дозах не оказывал позитивного действия на эти показатели.

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЛИКФОТОКСИНА, ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ, И РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ (Т-ФНО, ФНО-Т) НА МОДЕЛЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ ИШИЕЙ.

Цитокины регулируют баланс эффекторных гуморальных и клеточных воздействий иммунной системы при злокачественном росте (как частном примере иммунной дисфункции). На поздних стадиях последнего насту-

пает туморогенная иммуносупрессия при которой уровень продукции ци-токинов снижен. Используя рекомбинантные цитокины возможна коррекция такого состояния.

Задача настоящей работы состояла в оценке противоопухолевого действия рекомбинантных препаратов на моделях экспериментальных опухолей мышей с целью определения их эффективности и некоторых закономерностей их действия. Сначало нами было изучено собственное противоопухолевое действие рекомбинантных цитокинов, и лишь затем его комбинированное использование.

Характерной чертой в изучении противоопухолевого действия ЛТ на фибросаркоме МС-11 был разброс результатов по его влиянию на рост опухолей: от незначительной стимуляции опухолевого роста до значительного торможения. При этом не всегда наблюдалось дозо-зави-симое действие и отсутствовала корреляция между увеличением продолжительности жизни животных и степенью выраженности торможения роста опухолей. Это подтверждает, что на противоопухолевую активность лимфотоксина оказывают влияние совокупность позитивных и негативных Факторов организма-носителя опухоли, баланс которых трудно прогнозировать к началу курса лечения, так, например, в одном из экспериментов, по изучению противоопухолевого действия ЛТ на стадии развившейся опухоли при схеме пятикратного ежедневного и/т введения в дозе 1000 ед/мьгаь, наблюдалось значительное торможение роста опухолей. У 6 из 9 леченных мышей некроз опухолевой ткани составлял свыше 75% всей поверхности. Торможение роста опухолей к 12 и 15 дню после начала введения ЛТ составляло, у выживших животных, 77% и 86% соответственно. После 18-го дня, когда вся контрольная группа выпала, в этой группе оставались 4 мыши, у которых при объективном осмотре на месте опухолей остались рубцы вследствие отслоения и отторжения опухолевой ткани. Через 5-6 дней после объективного улучшения бил отмечен рецидивный рост опухоли и летальный исход группы к 42 дню. УПЖ составило свыше 60% к контролю. В других опытах показатели противоопухолевого действия были не столь значительны и была часто характерна высокая летальность животных, получавших ЛТ.

Адекватная нейтрализация ЗООО ед. ЛТ антителами к этому белку (Ig G, 37°С в течение 1часа) в системе in vitro и последующее введение такого комплекса in vivo привело к подавлению ингибирующего действия ЛТ на опухоли, в сравнении с действием той же дозы, но без нейтрализации Ig G (рис.4). Реакция нейтрализации подтверждает, что торможение (и стимуляция) роста опухолей связаны с действием ЛТ.

Данные экспериментов по изучению противоопухолевого действия ФНО, Т-ФНО и ФНО-Т свидетельствуют о том, что все препараты в исследованном диапазоне доз не оказали выраженного токсического действия на мьшей с лейкозом Р-388 ни по одному из оцениваемых критериев (преждевременной гибели, уменьшения веса тела и селезенки), и не проявили противоопухолевого эффекта.

Исследования, проведенные на мышах с солидной опухолью фибро-саркома МС-11, представлены в таблице 1. Результаты показывают, что Фибросаркома мышей МС-11 умеренно чувствительна как к ФНО, так и к гибридному белку Т-ФНО. Доза ФНО, вызывающая 50 X торможение роста опухоли ровнялась 104 ед/мышь в режиме пятикратного и 106ед/мышь при однократном в/6 введениях. В группе мышей, получавших ФНО в дозе 10е ед/мыпь, отмечена гибель половины животных, что может быть связано с токсичностью ФНО за счет сенсибилизации на фоне опухолевого процесса. Подобный эффект показан in vivo на моделях карциномы легкого Lewis и саркомы ЕМТ6 (Bartholeyns et al. 1987). Препарат Т-ФНО в дозе 104 ед/мышь в режиме пятикратного в/б введения не проявил противоопухолевого эффекта; при однократном в/б введении Т-ФНО в дозе 106 ед/мышь торможение роста опухоли составило 30-36 %. Однократное и/т введение Т-ФНО в дозе 10s ед/мышь привело к торможению роста опухоли свыше 50 % на 11 сутки (5-й день после начала лечения), а затем последовало медленное снижение показателей.

Препарат ФНО-Т в дозах 5х103 и 10* ед/мышь вызывал незначительное (< 50 %) и кратковременное торможение роста опухоли при в/б способе введения. Однако и/т введение препарата в дозе 5х103ед/мышь приводило к стимуляции роста опухоли. Однократное и/т введение в дозе 10е ед/мышь не было адекватным по эффекту даже 5х103ед/мышь введенным в/б способом в режиме пятидневного курса лечения. При дозе 10вед/мышь торможение роста опухоли превышало 90 % в режиме пятикратного в/б введения и эффект продолжался около двух недель. После однократного введения этой же дозы тем же способом эффект торможения роста опухоли был непродолжительным.

Во всей совокупности данных по противоопухолевой активности ФНО, Т-ФНО, ФНО-Т можно отметить несколько особенностей их действия: (1) дозозависимый характер торможения роста опухоли; (2) в большинстве случаев стимуляция роста опухоли в ранние или поздние сроки после отмены инъекций препаратов, а в случае с ФНО-Т (в режиме пятикратного и/т введения в дозе 5х103ед/мышь) стимуляция роста и во время самого курса; (3) присоединение тимозина к N-концу

\

Таблица 1

Противоопухолевая активность 4>НО и гибридных белков на мыжах BDF1 с фибросаркомой НС-11.

Препа- Доза Режим Путь Торможение (%) роста УПЖ Гибель рат ед/мышь лечения вве- опухоли на сутки (%) животн.

(дни) дения 7 11 17 23 до 23сут

5' •103 2-6 в/б +7 +9 +24 +31 12 0

10* 2-6 в/б 53 14 13 +8 27 0

то 10= г в/б 51 43 26 10 19 0

5' 103 7-11 и/т - 2 + 26 +62 4 0

10» 7 и/т - 16 + 15 + 108 35* (3/6)

5 • ■ 103 2-6 в/б +6 + 1 +9 +52 20 0

10« 2-6 в/б +13 16 8 +37 8 0

Г-ФНО 10= 2 в/б 30 36 24 +35 20 0

5- 103 7-11 и/т - 29 25 5 4 0

10= 7 и/т - 53 47 21 26 0

5' 10= 2-6 в/б 31 31 2 +31 15 0

10« 2-6 в/б 17 26 + 2 + 17 23 0

10* 2-8 в/б 95 91 29 15 27* (2/6)

ФИО-г 10» 2 в/б 59 23 13 +39 12 0

5- 10» 7-11 и/т - +58 +71 +92 14 0

10в 7 и/т - 21 +28 +90 15 0

Примечанием контроле объем опухоли (мм®):

416 2316 7731 12440 26 дней. * - увеличение продолжительности жизни выживших животных.

контроль пт (эооо «ю -*•- лт(зсооадмт -о - лт ¡апооо ад

Рис. 4. Динамика роста опухоли фибросаркома МС-11 после различных схем курсового введения лимфотоксина и в условиях нейтрализации лимфотоксина специфическим Ig G in vitro.

молекулы фактора некроза опухоли - модулирует действие самого ФНО и это проявляется в том, что ФНО и ФНО-Т показали максимальную эффективность по критерию торможения роста опухоли в том случае, когда лечение было начато в ранние сроки (на 2-е сутки) и при в/б способе введения, в то время как Т-ФНО был более эффективен на поздних сроках терапии (на 7-е сутки) и при и/т способе введения; (4) следует отметить, что кроме модулирования действия ФНО препарат Т-ФНО оказался менее токсичным в сравнении с двумя другими препаратами. Вероятно, что если все-таки имеет место факт летальной сенсибилизации мышей-носителей опухоли к ФНО по мере ее роста, как было упомянуто выше на примере других опухолевых моделей (Bartholeyns et al., 1937), то гибридный белок Т-ФНО, введенный в той же дозе, что и ФНО (вызвавший летальный исход 50% мышей к 23 контрольному дню), не обладает таким свойством. Вышеприведенные доводы могут служить гипотезой, что механизмы противоопухолевого действия ФНО и Т-ФНО имеют качественные различия. И если молекулярные механизмы реализации противоопухолевого действия ФНО достаточно подробно изучены, то в отношении Т-ФНО это еще предстоит сделать.

Итак, результаты изучения противоопухолевой активности ЛТ, ФНО, Т-ФНО ФНО-Т показали, что препараты обладают рост-негативными эффектами при воздействии на опухолевые клетки в системе in vivo. Это выражается в торможении роста опухолей в доэозависимой ( ФНО и гибридные белки) и дозонезависимой манере (ЛТ) и увеличении (чаще всего) продолжительности жизни животных.

Далее логично будет посмотреть как на собственную противоопухолевую активность исследованных цитокинов влияет премедикация сапониновыми и несапониновыми (полисахариды) фракциями красного женьшеня, которые обладают собственным антиканцерогенным и противоопухолевым действием.

КОМБИНИРОВАННОЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ ДЕЙСТВИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ И ТРИО-ЛОВЫХ САПОНИНОВ КРАСНОГО ЕЕНЫЛЕНЯ И РЕКОМБИНАНТНЫХ ЛТ, ФНО, Т-ФНО.

В данной части исследований оценивалась адитивность противоопухолевого действия гинзенозидов и полисахаридов красного женьшеня (ТСП) с рекомбинантными цитокинами на меланоме В-16.

Перед началом эксперимента животных разделили на две группы. Опытной группе, состоящей из 32 мышей, ежедневно на протяжении 7

дней до момента трансплантации опухолевой ткани (включая этот день) в/б Вводили ТСП. Контрольная группа оставалась интактной (п = 29). Курс лечения рекомбинантными белками (предварительно каждая большая группа была разделена на 4 подгруппы, состоящие из 7 и 8 животных в каждой) начинался на стадии развившейся опухоли (9-й день после трансплантации) и состоял из 7 дней ежедневных в/б инъекций. Критериями эффективности служили (1) самостоятельное ингибирующее действие ТСП на посгтрансплантационное развитие опухолей и в сочетании с последующим курсом рекомбинантными белками с отсутствием инцидентов возникновения и роста опухолей до конца эксперимента и (2) торможение роста опухолей под воздействием ФНО.ЛТ и Т-ФНО в опытной и контрольной группе.

На культивируемых клетках меланомы В-16 уже изучалось действие гинзенозидов (Odashima et al.,1985) в которых продемонстрирована их противоопухолевая активность. Эксперименты показали, что в группе с премедикацией ТСП увеличивается латентный период формирования пальпируемого опухолевого узла, по сравнению с группой без такой преме-дикации. Можно предположить, что ТСП учавствуют в формировании реакций, направленных на торможение опухолевого роста по пути усиления резистентности к дозе злокачественных клеток его инициирующего. В основе этих событий могут лежать: стероидоподобное действие трио-ловых сапонинов и в следствие этого стимуляция дифференцировки злокачественных клеток (Lee H.et al.,1993); стимуляция иммунного ответа по типу иммунномодулирующего действия (Lee Y. et al.,1993) ; непосредственное цитотоксическое действие на злокачественные клетки (Baek et al.,1993). Подтверждением вышеприведённых процессов является задержка развития опухоли и отсутствие у 12% животных (1мышь из 8 только с премедикацией ТСП) инцидентов возникновения и роста до конца эксперимента. Курсовое введение ФНО, ЛТ и Т-ФНО в качестве лечебных препаратов показало, что в группе животных с премедикацией ТСП произоило усиление последнего эффекта. Лучший результат был достигнут в подгруппе леченной ЛТ- 373» отсутствия инцидентов возникновения и роста опухолей (3 мыши из 8), ФНО-25% и Т-ФНО не показал собственного усиливающего действия. В группе без премедикации ТСП не было зафиксированно ни одного случая с таким исходом под воздействием самих рекомбинантных белков. К 13-му дню после трансплантации клеток количество животных с развившейся опухолью составляло 69% и 100% в опытной (с премедикацией ТСП) и контрольной группах соответственно.

Таблица 2

Торможение роста опухолей (Ж) в динамике эксперимента в группах с премедикацией ТСП и без неё.

Группы Рек. Контрольные дни после начала курса терапии

ж - х белки 5-й 6-й 7-й 9-й 12-й 17-й 21-й

Контр.* 159 187 215 358 493/362 866/649 1237/943

ТСП ФНО 12 + 24 + 14 + 15 +52 +16 18

ЛТ 45 35 33 26 + 14 + 18 + 29

Т-ФНО 42 36 20 31 +9 + 20 + 28

Контр. 301 309 397 520 684 949 1499

без ФНО 33 37 36 31 +34 + 29 + 3

ТСП ЛТ 40 26 36 26 10 8 18

Т-ФНО 11 +21 +8 + 17 +41 +81 + 47

Примечание: * - в контроле представлении средние абсолютные значения веса опухолей (мг) в группе(без учета средней ошибки),относительно которых производились расчеты по определению индекса ингиби-рования в опытных группах. Появление числителя и знаменателя в контрольной группе с премедикацией ТСП отражает процесс Формирования новых опухолей после длительного латентного периода. В связи с этим в числителе представлении средние значения из 5 ранее сформировавшихся опухолей, а в знаменателе из всех пальпируемых опухолей в группе.

Таблица 3.

Показатели локомоторной активности у крыс в "открытом поле" после однократного введения гибридного белка ФИО -Т.

Способ Доза Среднее количество пройденных секторов введения мкг/кг через различные промежутки времени

Фон 2 6 24 час. 14 день

Контроль 55-5 47-7 33-7 32-6 51-45

10 49-9 31-4 17±3** 17±9 29-9

п. к. 50 57±5 33-5 14±2* 32 ±6 52-16

200 57±8 35-5 15-4* 25-6 33±18

500 57-10 52-7 38-11 40-14 42±11

в. в. Контроль 63±21 52-10 61-14 46-10 41-7

500 68±7 55 ±6 38-7 45±9 54 ±9

в.м. Контроль 49-14 40-24 . 38-13 31-14 38-10

500 64-8 56-9 35±13 45-14 40-10

Примечание: * - достоверное отличие от контроля при Р<0.05, - достоверное отличие от фона данной группы при Р<0.05, количество животных в группах п = 12

По критерию торможения роста опухоли ЛТ показал более высокую активность а опытной и контрольной группах, по сравнению с ФНО и Т-ФНО (Таблица 2). Торможение роста опухоли носило лекарственно-зависимый характер, так как уже со второго дня отмены курса рекомби-нантными белками происходило, как правило, ухудшение результатов. Ни один из тестируемых цитокинов не приводил к полной регрессии опухолей как в опытной так и в контрольной группе. Следует отметить, что действие ФИО и Т-ФНО носило инвертированный характер в опытной и контрольной группе. Так, в опытной группе ФНО не показал ингибируюдего действия на опухолевый рост, а в контрольной группе продемонстрировал терапевтически значимые показатели этого критерия (31- 37%) в дни курса и первые дни отмены. Т-ФНО, напротив, имел терапевтически значимую активность ингибирования роста в опытной группе (20-42%) в те же дни, а в контрольной группе продемонстрировал отсутствие такого эффекта (Таблица 2). Этот феномен еще раз подтверждает результаты изложенные в главе 2, что присоединение «1-тимозина с N - конца к ФНО« модулирует действие последнего препарата. Продолжительности жизни в опытной и контрольной группе после курсового введения ФНО и ЛТ, а также подгрупп которым вводился физиологический раствор не различались между собой (минимальная длительность- 39*3 дней, максимальная - 44±4дня).

На основании приведенных результатов можно сделать следующие выводы: (1) курсовая премедикация ТСП привела к задержке посттрансплантационного развития опухоли вплоть до полного блокирования ее роста (12%); (2) курсовое введение ФНО и ЛТ усилило последний эффект до 25% и 37% соответственно; (3) ингибирующее действие на рост меланомы В-16 в опытной и контрольной группе сильнее было выражено у ЛТ, чем у ФНО и Т-ФНО. (4) противоопухолевое действие ФНО и Т-ФНО носило взаимопротивоположный характер в контрольной и опытной группе. Таким образом, механизмы противоопухолевого действия гинзенози-дов и полисахаридов корейского красного женьшеня и рекомбинантных цитокинез, обладающих иммуномодулируюцим действием, по-видимому, пересекаются, что приводит к усилению функций (иммунных), направленных на торможение опухолевого роста.

ЦЕНТРАЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ ФНО-Т, ЛНХФОТОКСИНА и ТИМОЗИНА «г.

Современные исследования позволяют предполагать, что цитокины могут оказывать прямое действие на мозг, вызывая при этом некоторые особенности поведенческого паттерна. Для скрининга этих особенное-

тей были выбраны две поведенческих модели: свободное поведение в методе "открытое поле" и выполнение задачи на удержание на "вращающемся стержне" . В работе В1и-ЬЬе с соавт. было показано, что через 2 и 4 часа после в/б инъекции ФНО индуцировал поведенческие изменения у мышей, что выражалось в снижении социальной исследовательской активности и снижении веса тела (ВХигЬе е! а1., 1994). В нашей работе однократное и курсовое введении ФНО-Т сопровождается поведенческими изменениями у крыс по двум критериям: принюхиванию (с) и локомоторной активности (количество пройденных секторов). После однократного п/к и в/б введения ФНО-Т в дозах 10, 50, 200, 500 мкг/кг отмечено снижение времени принюхивания через 2 и 5 часов. Снижение носит характер тенденции и недостоверно. Однако то, что фоновые значения в принюхивании не отличались в опытных и контрольной группах и выравнивание значений в группах происходит уже через 24 часа, подтверждает неслучайный характер изменений этого поведенческого критерия.

После однократного введения ФНО-Т при всех вышеперечисленных дозах и трех способах введения происходит снижение локомоторной активности (Таблица 3 ). Начинаясь через 2 часа после инъекции и имея характер тенденции, отмеченный и в контрольных группах, снижение локомоторной активности достигает максимальных значений через 5 часов. Однако достоверные изменения по этому критерию отмечены только при п/к способе введения. При двух других способах введения снижение локомоторной активности через 5 часов близко к достоверному, но не является таковым в сравнении с фоновыми значениями (выделено жирным). В параллельных контролях столь выраженной тенденции не отмечено. Интересно отметить, что при всех трех способах введения только доза 500 мкг/кг не оказала выраженного эффекта на локомоторную активность.

Отмеченное влияние ФНО-Т на пассивную и активную составляющие (принюхивание и локомоторная активность соответственно) ориентировочно- исследовательской активности не связано, однако, со снижением способности удерживаться на "вращающемся стержне" в режиме ускорения. Курсовое введение (21 день) ФН0-Г не оказало воздействия ни на поведенческие показатели, ни на время удержания на "вращающемся стержне".

Тимозин Й1, которым модифицировали молекулу ФНО, оказал достоверное воздействие на критерий принюхивания при п/к способе введения и дозе 100 мкг/кг. Достоверное снижение времени принюхивания отмечено через 2 и 24 часа. На 7-е сутки тестирования показатели во

всех группах выравнялись.

Курсовое введение (21 день) ЛТ оказало достоверное воздействие на способность крыс удерживаться на "вращающемся стержне" Опыты с решением задачи на удержание, как правило, характеризуются повышением способности крыс удерживаться на "вращающемся стержне" вследствие адаптивного процесса обучения. Однако из представленных данных видно, что эффективность приобретения навыка удержания в контроле была выше на 7-е сутки курса инъекций, в сравнении с группами животных, получавших различные дозы ЛТ.

Таким образом, можно отметить, что ФНО-Т и тимозин «1. оказывают кратковременное центральное действие (от 2 до 24 часов), которое выражается в угнетающем действии на пассивную и активную составляющий ориентировочно-исследовательского поведения. После 7-го дня курса ЛТ оказал достоверное угнетающее действие на процесс приобретения навыка удержания на "вращающемся стержне", однако в остальные дни тестирований средние показатели в удержании не отличались от контрольных значений.

Центральные эффекты изучаемых цигокинов показываюг, что цито-кины способны оказывать влияния на функциональную активность ЦНС. Учитывая значительную роль ЦНС в регуляции функциональной активности системы иммунитета, можно предположить, что окончательный противоопухолевый эффект цитокинов формируется не только вследствие им-муномостимуляции на уровне собственно иммунной системы, но и в результате позитивных (или негативных) обратных влияний на центральные звенья регуляции иммунных функций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований подтвердили, что биологически активные вещества разной природы могут иметь сходные спектры биологической активности: от центральных эффектов до противоопухолевых. В данном случае "объединяющим началом" может быть влияние фракций женьшеня и цитокинов на стероидный обмен, а через его изменение на центры, ответственные за формироваг.ио определенных Форм поведения и на трансформированные клетки.

Полученные данные позволяют утверждать, что сами полисахариды - активные компоненты суммарного экстракта, они наряду с диоловыми и триоловыми гинзенозидами, обладают центральным действием, проявляющемся в облегчении выработки УРАИ. В основе механизмов такого действия может лежать модификация ионофорных рецепторов, изменяющих ионную проницаемость клеточной мембраны, т.к. обычные ре-

цепторы гликоэилированы и добавление или удаление некоторых Сахаров может изменить характер рецептора и последующие пострецепторные механизмы клеточной активации. Однако молекулярные механизмы центрального действия полисахаридов не изучены в той степени, как это сделано в отношении гинзенозидов.

Возможно, что подобно гинзенозидам и другим растительным ней-ротропинам (например манноэоепецифические лектины Ri и CSL) полисахариды могут оказывать пластическое действие на нейроны, что, как правило, сопровождается улучшением процессов обучения и памяти.

Из представленных выше собственных и данных литературы можно сделать обоснованное заключение, что полисахариды обладают противо--опухолевыми свойствами. Однако, молекулярный механизм модуляции препаратом ТСП противоопухолевой активности рекомбинантных цитоки-нов представляет интерес для дальнейших исследований.

Исследованные нами центральные эффекты рекомбинантных цитоки-нов дополняют картину многообразия их биологической активности не только в качестве медиаторов иммунной системы, но и как факторов, регулирующих гомеостаз ЦНС через тесное функциональное взаимодействие с нейросекреторной системой гипоталамуса. Учитывая значительную роль гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси в модуляции иммунного ответа и то, что многие цитокины, в свою очередь, регулируют активность нейроэндокринной системы можно предположить, что ФИО может регулировать иммунный ответ не только непосредственно взаимодействуя с иммунокомпетентными клетками, но и оказывая центральное действие регулируя секрецию стероидных гормонов и 3-эндорфина.

Последнее обстоятельство может служить объяснением поведенческим эффектам цитокинов. Так, выявлено действие фрагмента-RITLY интерферона (В.Ю.Сулин, 1993); подтверждено, что цитокины проходят гемато-энцефалический барьер (DeKloet et al., 1994). Ранее для ФНО было показано, что он оказывает влияние на степень социального взаимодействия, повышает порог болевой чувствительности, влияет на спонтанную локомоторную активность (Bianchi et al., 1992; Bluthe et al., 1994). Нами также показано, что рекомбинантные цитокины, обладающие основными биологическими свойствами ФНО (за исключением ти-мозина cíi), могут индуцировать поведенческие изменения в методе "открытое поле". Способность ФНО регулировать концентрацию 3-эндорфина в гипофизе крыс (Sacerdote et al., 1994) позволяет предположить этот механизм в этих случаях в качестве основного.

- 23 -ВЫВОДЫ

1. В процессе выработки условнорефлекторного активного избегания (УРАИ) у крыс при системном, курсовом введении полисахариды, наряду с другими компонентами суммарного экстракта женьшеня, оказывают облегчающее действие. При дозах 400 мкг/кг и 4мг/кг улучшалось воспроизведение выработанного навыка УРАИ.

2. Подтверждено действие полисахаридов по ноотропному типу, причем при большей степени стрессирования эффективнее проявляется центральное действия исследуемой фракции женьшеня, как и в случае с отдельными сапонинами.

3. Полисахариды при системном введении снижают порог ноцицеп-тивной чувствительности при дозах, начиная с 4 мг/кг.

4. Генноинженерные препараты: рекомбинантные человеческие лим-фотоксин (лишенный 21 N-концевых аминокислот) и фактор некроза опу-холи-й, а также гибридные белки: тимозин-<*д.-Фактор некроза опухоли-« и Фактор некроза опухоли-й-тинозин-й1 обладают полимодальным росто-регулирующим действием на моделях экспериментальных опухолей фибросаркома МС-11 и меланома В-16 у мышей.

5. Исследованные цитокины, обладающие противоопухолевым эффектом, при их системном введении оказывают тормозное центральное действие, достоверно отмечаемое в тесте "открытое поле", по критерию ориентировочно-исследовательской активности.

6. Препарат состоящий из равных соотношений триоловых сапонинов и полисахаридов модулирует противоопухолевую активность реком-бинантных цитокинов и гибридных белков и ослабляет токсические эффекты последних.

Основные работы по теме диссертации:

1.Любимов И.И..Шарапова М.Н.,Борзенков В.М. Роль некоторых функциональных систем в поддержании гомеостаза подопытных крыс.14-я предытоговая конференция ВНИИ ПМ .январь,1990. С.54.

2.Борзенков В.М.,Гусев В.В.,Любимов И.И..Шмелев В.А.Доклинические исследования гибридного белка фактора некроза опухолей-И-ти-мозина-£*1. Тезисы докл II Всесоюзной конференции по проблеме ис-

пользования цитокинов. Оболенск, 1992., С.21.

3.Любимов И.И.,Борзенков В.М.,Гусев В.В.,Шмелёв В.ft.,Денисов й.А.Сравнительное изучение рекомбинантного человеческого фактора некроза опухолей-K и рекомбинантного человеческого лимфотоксина в эксперименте In vivo. Тезисы докл II Всесоюзной конференции по проблеме использования цитокинов. Оболенск, 1992., С.39.

4.Борзенков В.М..Любимов И.П.,Гусев В.В..Денисов А.А.Изучение эффектов рекомбинантного человеческого лимфотоксина на функциональное состояние состояние животных в остром и хроническом эксперименте. Тезисы докл II Всесоюзной конференции по проблеме использования цитокинов. Оболенск. 1992., С.22.

5. Chepurnov С.A., Cbepurnova N.E.,Park, J.K., Buzinova E.V., Lubimoy I.I., Kabanova N.P., Ham, K.Y. The central effects of saponin components and polysaccharides fraction from korean red ginseng. // Korean J. Ginseng Sei., 1994, Vol. 18, N 3, p. 165 -174

6. Chspurnov C.A., Chepurnova N.E., Park, J.K., Buzinova E.V., Lubimov I.I., Kabanova N.F. The central effects of saponin components and polysaccharides fraction.// Proceed. 5th Life Sei. Sympos. Biomed. Research with Korean Red Giseng., 1994, Sep.8, P.81-108.

7. Любимов И.И., Борзенков В.M.| Чепурнова Н.Е., чепурнов С.А. Влияние полисахаридной Фракции корейского женьшеня на обучение и память у крыс на примере реакции активного избегания. // Физиол. ж., 1995, Т 81, M 8, С. 169-172

8. Любимов И.И., Хомяков Ю.Н., Чепурнов С.А., Гусев В.В. Противоопухолевая эффективность некоторых сапониновых фракций корня красного женьшеня на модели мышиной меланомы В-16. //Матер. 11-го Рос. Нац. Конгресса "Человек и лекарство",10-15 апреля 1995, С.201.

9. Денисов A.A., Любимов И.И., Борзенков В.М., Хомяков Ю.Н. Исследование токсикологических свойств рекомбинантного лимфотоксина человека. // Там же, С.49.

10. Денисов A.A., Любимов И.И., Борзенков В.М. Изучение специфической (фармакологической) активности рекомбинантного лимфотоксина человека. // Там же, С.309.

11. Денисов A.A., Борзенков В.М., Любимов И.И., Гусев В.В. Результаты доклинического изучения отечественного рекомбинантного лимфотоксина человека. // Биотехнология, ев печати).

12. Денисов A.A., Любимов И.И., Николаева О.Г. Противоопухолевая активность модифицированного рекомбинантного лимфотоксина in vivo. //Эксперименательная онкология, о

Благодарности:

Приносим большую благодарность за предоставленные препараты фракций Корейского Красного женьшеня Президенту Корейского Исследовательского Института Женьшеня и Табака

профессору господину ПАРК, Мьенг-Кью.

Благодарим зав. отделом эффективности женьшеня КИИЖТ кандидата биологических наук Парка, Джин-Кью.

Выражаю глубокую благодарность за консультации и помощь в работе доценту кафедры физиологии человека и животных МГУ Н. Е. Чепурновой.

Автор приносит большую благодарность руководителю отдела экспериментальной химиотерапии опухолей доктору медицинских наук Г. К. Герасимовой и сотрудникам отдела за помощь в проведении экспериментов.

Выражаю глубокую благодарность заведующему отделом генноинженериых препаратов ГНЦПМ доктору биол. наук В. А. Шмелеву и ведущему _ научному сотруднику отдела кандидату медицинских науж А. А. Денисову.

Заказ 338Б

Объем 1,5 п. л.

ГП «Малоярослапецкая типография» г. Малоярославец, ул. С. Беляева, 5

Тираж 70 экз.