Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение, характеристика и экспериментальное использование моноклональных и поликлональных антител к препарату рекомбинатного интерлейкина-2 и к факторам некроза опухолей человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение, характеристика и экспериментальное использование моноклональных и поликлональных антител к препарату рекомбинатного интерлейкина-2 и к факторам некроза опухолей человека"

ТАРТУСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

а

'г ""**

На правах рукописи

ПАНЮТИЧ Александр Васильевич

УДК 610-097+57961 : 016-078

Получение, характеристика и экспериментальное использование моноклональных и поликлональных антител к препарату рекомбинантного интерлейкина-2 и к факторам некроза опухолей человека

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тарту 1988

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови МЗ БССР.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Н. Н. Войтенок.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АН Эстонской ССР, доктор биологических наук Р. Л.-Э. Виллемс

кандидат медицинских наук, ст. н. с. Л. Н. Леменева.

Ведущая организация — Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР.

Защита диссертации состоится « » .Н^.^ЧА^ 1988 г.

в ...'... . часов на заседании специализированного совета К- 069.02.07. при Тартуском государственном университете по адресу: 202400, Тарту, ЮЛИКООЛИ 18, Тартуский государственный университет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тартуского государственного университета.

Автореферат разослан « . »

Ученый секретарь специализированного совета,I кандидат медицинских наук

с!.

Л. С. Уускюла

*j ■'./ • l. : 'f ■ •

'•'■Г

• i -...

^^ / ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

- 'АктУй.пьиость проблемы. Интерлейкин-2 и факторы некроза опухолей -альфа и бета являются одними из важнейших медиаторов иммунитета и воспаления, принимающими участие во многих регуляторных взаимодействиях как клеток иммунной системы, так и клеток, принадлежащих к различным органам и тканям. Получение этих медиаторов в достаточных количествах методами генной инженерии создает предпосылки для их использования в качестве иммуномодулирующих средств нового поколения.

Моноклоналыше и поликлоналышо антитела необходимы для дальнейшего изучения структурно-функциональных свойств интсрлейкина-2 и факторов некроза опухолей, создания чувствительных и технологичных способов их контроля, без чего невозможно использование рекомбинантных цитокинов как лечебных препаратов.

Интерлейкин-2 (Ш1-2) или фактор роста Т-лимфоцитов представляет собой гликозилированный в третьем положении по треонину белок с молекулярной массой 15 тысяч дальтон. ИЛ-2 синтезируется стимулированными Т-пимфоцитами, некоторыми Т-лимфобластоиднши линиями и Т-Т гибридомами. Ген ИЛ-2 клонирован ( Taniguchi et al. ,1983), получен рекомбинант-1шй препарат, не отличающийся по биологической активности от лимфоцитарного ИЛ-2. Связывание ИЛ-2 со специфическим рецептором приводит к пролиферации активированных Т-лимфоцитов, повышению продукции /-интерферона, усилению активности естествешшх киллеров ( Robb , 1985), делению л дафференцировкв В-лимфоцитов ( Jelinek et al. , 1906). Нарушение регуляторних механизмов, связанных с ИЛ-2, может наблюдаться при системной красной волчанке, ревматоидном артрите, трансплантациях аллогенного костного мозга, синдроме приобретенного иммунодефицита, опухолевых заболеваниях ( Ieakov et al. , 1985). ИЛ-2 способен индуцировать так называемые лимфскинактивированные киллеры. Ре-коыбинантный ИЛ-2 (рИЛ-2) и лимфскшактивированныо киллеры начали применяться для иммунотерапии опухолей ( Hoaenberg et al. , 198?).

Известны два фактора некроза опухолей человека. Фактор некроза опухолей-л (ФНО-^ ) является неглякозилирован-нш.; белком с молекулярной массой 17 тысяч.дальтон и син -тезируется, главным образом, макрофагами. Фактор некроза

опухолей-^« (ФНО-ji) синтезируется лимфоцитами, содержит 18 дополнительных N -концевых аминокислот, гликозилирован. Несмотря на различия, оба медиатора связываются с одним рецептором и имеют выраженную гомологию на уровне нуклеотидной и аминокислотной последовательности ( Maury, 1986). Гены ФНО- и ФИО-ß клонированы и зкспрессированы в клетках Е. coli , получены очищенные рекомбинантныо препараты лим-фокинов ( Shirai et al. ,1985, Gray et al., 1984). Факторы некроза опухолей обладают широким спектром биологической активности: вызывают геморрагический некроз некоторых опухолей in vivo , оказывают цитостатическое действие на многие опухолевые линии in vitro , усиливают прокоагулянтное действие эндотелия, стимулируют деление фибробластов, влияют на некоторые обменные процессы, являются иммуномодулятора-ми ( Maury, 1986). Биологические эффекты ®HO-«¿ и ФКО-уЗ в большинстве случаов совпадают, но могут быть выражены в разной степени или различаться ( Maury et al., 1988). Ге-комбинантный ФНО-л. рассматривается как потенциальное противоопухолевое средство ( Beuler and Ceramy,1986).

Получение гибридом, секретирущих моноклоналыше антитела (МКА) заданной специфичности, зависит от совокупности ряда факторов: адекватной схемы иммунизации животных, эффективной методики слияния клоток, чувствительной системы скрининга положительных гибридом, их клонирования, наращивания, хранения, пассирования in vivo . Одним из критических моментов, во многом определяющим получение гибридом к слабоиммуногенным антигенам, к которым относятся лимфокины, является выбор полиэтиленгликоля и методики гибридизации клеток, обеспечивающих высокую эффективность слияния.

Настоящая работа посвящена получению, характеристике и экспериментальному использованию моноклональных и поля-клональкых антител к препарату рИЛ-2 и к факторам некроза опухолей человека.

Диссертация выполнена в рзмках исследований, проводимых согласно межведомственной программы сотрудничества, утверзденной первым заместителем Министра медицинской и микробиологической промышленности СССР и заместителем Министра здравоохранения CCCF 22 апреля 1986 г.; координационного плана по теме О.Ц.043.01 "Разработать

способы получения и организовать производство продуктов на основе генной инженерии, ценных для медицины и сельского хозяйства на 1986-1990 г.г." и темы НИР проблемной лаборатории клеточного иммунитета Белорусского НИИ переливания крови Ш БССР "Изучение свойств и закономерностей синтеза интер-лейкинов и других медиаторов человека, участвующих в ре: у-ляшш иммунитета и кроветворения" ('S государственной регистрации 01.86.0 009500).

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось научное обоснование и разработка технологии получения моио-клональных и поликлоналышх .антител к рекомбинантннм ин-терлейкину-2 и факторам некроза опухолей -альфа и бета для исследования их антигенных и функциональных свойств, качественного и количественного определения.

В соответствии с целью были поставлены задачи:

- оптимизировать условия получения мытных В-гибридом на основе сравнения сливающих способностей растворов ряда полиэтиленгликолей и выбора лучшего образца;

- получить монокленалыше и поликлональныа антитела к препарату рИЛ-2 человека;

- определить пригодность МКА против рИЛ-2 для его оценки методам ИМ и иммуноблоттинга, а также для исследования ентигенной структуры и функциональной активности Ш1-2;

- исследовать возможность использования МКА против антигенов е. coli для оценки чистоты препарата рИЛ-2;

- получить моноклоначьные и политональные антитела к рекомбинантннм факторам некроза опухолей человека;

- исследовать возможность их применения для определения ФИО- А. и ФНО-ß и изучения их функциональной активности.

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

Впервые в СССР получены моиоклоналшые антитела, пригодные для экспериментальных исследований и определения в условиях производства рИЛ-2, ФНО- и. и ФНО- ß.

Впервые получены моноклональные антитела для определения антигенов Б. coli в препарате рИЛ-2.

Для связывания рИЛ-2 с лунками полистирольяых планшетов •яри проведении ИФА впервые применено высушивание антигена, показана возможность фиксации рИЛ-2 в таком режиме из растворов, содержащих додецллсульфат натрия, бычий сывороточный альбумин, антигены Е. coli.

Показано, что ыоноклоналыше антитела к рШ-2 распознают три частично перекрывалциесл, некопформациокше антигенные детерминанты, не связвшше с биологической активностью молекулы.

Установлено, что нейтрализация мэноклональными антителами ФИО— л в кондиционных средах приводит к повышению колочиестимулирующей активности, продуцируемой макрофагами.

Практическая значимость и пути реализации работ».

Получено 18 штаммов гибридом, продуцирующих монокло-нальныо антитела к рИЛ-2, мембранным белкам К. coli с молекулярной массой 4 и 45 тысяч дальтон, линололисахариду Е. coll , рекомбинантным ФНО-л и ФНО-у* • Десять штаммов вместе с паспортами депонированы во Всесоюзной коллекции перевиваемых клеточных культур Института цитологии Ali СССР.

Моноклональные антитела, специфичаски взаимодействующие с лимфокинами, имеют важное значение при их исследованиях. МКА необходимы для качественного и количественного определения медиаторов иммунитета и гемопоэза, их иммуно-аффкнного выделения, вместе с наборами нуклиотищшх зондов МКА позволяют идентифицировать лшлфокшш при изучении их физиологической роли и биологического значения.

Моноклональные антитела могут использоваться на разных стадиях получения рекомбшшнтных белкии: для выявления клонов-продуцентов, иммунохикаческой очистки, исследования степени гомогенности препарата, его количественной оценки. ?,!КА могут применяться и для контроля за концентрацией введённого препарата в крови больных.

Результаты исследований внедрены в лаборатории биохимической генетики Биологического ¡Ш ЛГУ, лаборатории генной технологии и отлзле молекулярной биологии Института органического синтеза АН Латвийской ССР, 4-й клинической больнице г. Минска. Использование доступных в препаративных количествах поликлональных и моноклоналышх антител в системе »1ФА и иммуноблоттинга ускорило получение дрожжевых итвммов-продуценгов plUi-2, разработку лабораторной методики получения препарата рШ1-2, существенно облегчило масштабирование этого процесса. Использование моноклоналышх антител, нейтрализующих ФИО-л. , позволило провести идентификация монокина в сиьорогке крови больных инфарктом миокарда.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторство с Н. Н. Войтенком в проблемной лаборатории клеточного иммунитета Белорусского НИИ переливания крови МЗ БССР. Исследование антигенной структуры рИЛ-2 и разработка метода его ишуноферментного определения на основе высушивания антигена проиедены совместно с Е. А. Шидловской. Изучение нейтрализации моноклокалышма антителами макрофа-гальнсго и рекомбинаншого ФНС-^ в тест-системах мышиных клеток L -929 и колониеобразующих клеток в агаровых культурах проведено совместно с М. Е. Комаровской, Л. В. Карка-ница, С. И. Невмерхицкой.

Апробация работ». Результаты исследований бшга доложены на пленуме Правления Всесоюзного научного общества иммунологов (Минск,'198? г.), на заседании Минского городского отделения Белорусского научного общества иммунологов (Минск, I2QB г.), на 22 конгрессе международного общества гематологов (Милан, 1988 г.), на пленуме Правления Белорусского научного общества иммунологов (Витебск, 1988 г.).

Публикация результатов исследований. Материалы исследований огранены е 6 заявках на изобретения, на которые выданы положительные решения, опубликованы в 4 печатных работах.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 9Я страница* машинописного текста, включает 9 рисунков, 8 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы ( источник*? ).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Эффективность образования мышиных В-гибоидом при использовании некоторых полиэтилзнгликолей., Для слияния клеток могут быть использованы ПЭГ с мол. массой от 200 до 20000 дальтон ( Fasakaa de St Groth end Scheidagger , 1980). Наибольшее распространение получили полимеры с мол. массой 1000-4000 дальтон, так как низкомо-лекуляр:ше ПЭГ облада.от выраженной цитотоксичностьи, а растворы высокомолекулярных ПЭГ отличаются высокой еяз-костьи. Описанные мотодикп слияния клеток, проводимые е суспензии ялп монослое, различаются по множеству параметров, в частности, ло составу сливающего раствора ПЭГ,

. температур^ проведения гибридизации, времени инкубации клеток в сливающем растворе, по порядку последующего разбавления суспензии клеток средой. Мы сравнили эффективность образования мышиных B-гибридом при использовании 10 образцов ПЭГ в методике слияния клеток в суспензии, описанной Lane et el. , 1984.

Мышей-самок Balt/c с возрастом 12-16 недель иммунизировали ¡í-цепями человека, выделенными в нашей лаборатории, и фитогемагглгатшшном Р (ФГА). Двухнедельная схема иммунизации состояла иэ двух введений антигена в смеси с равным объёмом полного адьюванта Фрейнда (ЛФ) с интервалом в одну неделю и трех инъекций антигена без Л5 внутрибрюшиньо и внутривенно в течение 3 дней перед слиянием ( Cianfriglia et al. Д984). Злокачественный партнер гибридизации - не-секретирущая мкелсма x63-Ag8-653 к моменту слияния находилась в логарифмической фазе роста. Для гибридизации, к осадку клеток в течение минуты добавляли 50$ раствор ПЭГ, содержавший % диметилсульфоксида, и через 90 секунд медленно разбавляли суспензию клеток бессывороточной средой. После отмывки клетки взвешивали в минимальной среде Дуль-бекко, модифицированной lokove (ИМДЮ, содержавшей гипо-ксантин, аминоатерин, тимидин.и раскапывали в 96-луночные платы. В состав полной питательной среда включали 105? эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Образец ЭТС отбирали из нескольких серий. Критерием отбора служила величина включения %-тимиднна в клетки гибридом при их культивировании с низкой начальной плотностью на посеве. Способность сыворотки поддерживать высокий синтез ДНК в метках гибридом при их низкой начальной плотности и её клоногошшо свойства, поданным Viestarwoudt (1983),коррелируют. Число клонов гибридом учитывали на 6-7 сутки.

Эффективность гибридизации в двух независимых слияниях колебалась в пределах 0,17 - 3,63 гибридо>.ы на 2хЮ^ спленоцитов при иммунизации мышей -цепями и 0,3 - 2,9 гибридош на 2x10^ спленоцитов при иммунизации еиеотннх ФГА (табл. I). Лучшие результаты были получены при использовании ПЭГ 4000 ( Loba Chemical , I серия) и ПЭГ 1500 ( Loba Chemical , I серия). При гибридизации меток растворами ПЭГ 1300-1600 (Signa ) и ПЭГ 1500 (boba Chemical, 2 серия) эффективность слияния не была стабильной. Низка;;

Таблица I

Дефективность образования мышиных В-гибридом при использовании некоторых полиэтиленгликолей

Полиэтиленгликоль

Опыт I Клоны гибридом

Опыт 2

Клоны гибридом

t. 111 к Всего в :На 2x10 :Число по- Всего в :На 2x10 :Число по-

48 лунках:сплено- :ложитель- 48 лунках:сплено- :ложитель*шх

:цитов :ных лунок :цитов :лунок

I. Sigma 1300-1600 5 0,17 3 33 1,10 5

2. Merk 1500 54 1,80 4 56 1,87 5

3. Loba Chemical 1500, I серия 68 2,27 4 80 2,67 8

4. Loba Chemical 1500, 2 серия 33 1,10 3 д 0,30 ж

5. Loba Chemical 3000 29 0,97 0 62 2,07 2

6. Sigm3 3350 66 2,20 I 50 1,67 2

7. Serva 4000 33 1,10 I 56 1,87 3

8. Jler* 4000 64 2,13 I 70 2,33 0

9. Loba Chemical 4000, I серия 109 3,63 9 87 2,90 -

10. Loba Chemical 4000, 2 серия 32 1,07 2 64 2,13 -

- иммунизация ju--цепями; - иммунизация фитогемагглютининпм Р

- в -

эффективность гибридизации в отдельных случаях применения указанных ПЭГ не была связана с их цитотоксичностьш. Положительные р ИФА с соответствующими антигенами лунки, содержавшие специфические гибридомы, выявлялись хотя бы в одном опыте при слиянии клеток всеми изученными образцами ПЭГ.

Полиэтиленгликоль с мол. массой 4000 фирмы ЬоЪа Chemical, I серия, был использован в последующих опытах по получении МКА к препарату pHJi-2 и к факторам некроза опухолей человека.

Моноклональные антитела к; препарату рИЛ-2 человека.

Использованный для иммунизации »квотных полуочищенный препарат pIIJl-2 (Экспериментальный завод ИОС Ali Латвийской ССР), по данным электрофореза в полиакркламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСИ-ПАГЭ), содержал 80$ рИЛ-2 и низкомолекулярные микробные примеси. Мышам лилии Balb/c трехкратно вводили I500Q международных единиц внмг рИЛ-2 с интервалами в две недели. Гибридизацию xOö клеток селезенки иммунных мышей и ЗхЮ^ клегок мисломы x63-Ag8-653 проводили, как описано на стр. 6. Отбор положительных популяций гибридом для последующего клонирования осуществляли через 10-12 суток методом ИФА.. После анализа специфичности МКА в иммуноблоттинге, гибридомы клонировали два раза методом лимитирующих разведений.

Для гибридизации были использованы спленоциты одной из иммунизированных мышей с титром сывороточных антител в ИФА с частично очищенным рИЛ-2 1:3200. Па иммуноблотишге препарата рИЛ-2 с этой сывороткой наиболее выраженная реакция была в низкомолекулярной зоне - 4-7 тысяч дальтон, проявлялась такие чёткая полоса мол. массы 45 тысяч дальтон в редуцирующих условиях и 40 тысяч дальтон в норедуциру®-щих условиях. Слабая реакция в области мономера рШ1-2 была видна дук:ь на нитроцеллюлозний реплике после электрофореза рИД-2 в нередуцирующих условиях. Примесные антигены к.соН, составлявько около 20% препарата, были гораздо иммунноген-нее, чем pIlfi-2, и вызывали сильный гуморальный иммунный ответ, намного кревыиавший ответ на рШ1-2, хотя последний и составлял примерно 80;? препарата, использованного для иммунизации.

Среди 57S тестированных в ПОД культур гибридом, 36 взаимодействовали с препаратом р!1Л-2. Учитывая данные hij-

муноблоттингэ с поликлоналъкой мышиной сывороткой, зоны нит-роцеллвдозкых реплик (HP), соответствовавших белкам с мол. массой 14-15 тысяч дальтон (область мономера рИЛ-2) и 4-7 тысяч дальтон,были выбраны для оценки специфичности положительно реагировавших в ИФА культур гибридом. Локализация рИЛ-2 в зоне, соответствовавшей белкам с мол. массой 14-15 тысяч дальтон, подтверждалась данными бяотеста на клеточной линии, зависимой от ИЛ-2, с элюатавд» отдельных фракций геля после ДСН-ПАГЭ рИЛ-2.

МКА к белку Е. coli мол. массы в редуцирующих условиях 45 тысяч дальтон были получены ранее при иммунизации животных частично очищенным рИЛ-2.

Супернатанты 12 неклонированных гибридом содержали антитела, связывающиеся с антигеном в области 14-15 тыс. дальтон с разной интенсивностью, 12 гибридом продуцировали МКА к антигенам с меньшей мол. массой.

Супернатанты, полученные от клонированных стабильных гибридом, были использоваш для иммуноблоттинга с HP, соот-ветствовавпими целым дорожкам геля после ДСН-ПАГЭ частично очищенного рИЛ-2 и лизата клеток Е. coli. МКА 1Б.1, 2Б.1, 13Б.1, 26Б распознавали мономеры и мультимеры рШГ-2 (рис. I). После ДСН-ПАГЭ в редуцирующих условиях мономер и диме-ры рИЛ-2 сос~авляли доминантные полосы, после ДСН-ПАГЭ в нередуциругащгос условиях были отчетливо выражены зоны диме-ра, тетрамера и высокомолекулярных агрегатов рШ1-2.

Локализация полос и интенсивность связывания с антигеном МКА 20Б.1 и ЗЗБ.1 позволяла предположить об их специфичности к липополисахариду (ЛПС) е. coli .

МКА штаммов гибридом 8Б.1, 23Б.1 и 29Б.1 на иммуно-блоттинге выявляли антиген, диффузно распределявшийся в пределах мол. массы 4-7 тыс. дальтон. МКА IAI.2 и 22AI.2 связывались с бактериальным антигеном мол. массы в редуцирующих условиях 45 тысяч дальтон. По данным ИФА с мембранными и внутриклеточными белками E._coli , МКА 29Б.1 и 22AI.2 распознавали антигены, связанные с мембранной фракцией бактерий.

Для подтверждения липсполисахаридной природы антигена, узнаваемого МКА ЗЗБ.1, частично очищенный рИЛ-2 и мембранная фракция Е. coli были обработаны протеиназой К. Данный способ используется для экспресс-выделения и анализа мето-

I

fc—~

f

> | | '

j, |. . . | I j ; ,J_, . S

juc^ jlE.1 j ¡2ел [l3e.l'; {26б ' se.i, 2ж.1; 29б.1 ш 1^1-2 ¡га.1.2,

Рис. I. Иммуноблот тинг частично очищенного рИЛ-2 с супернатантами клонированных гибридом. Полосы I, 2, 3 соответствуют ДСН-ПАГЭ препарата рИЛ-2 в редуцирующих, нередуцирущих условиях и ДСН-ПАГЭ лизата е. coli. Стрелками отмечено положение маркёра - цитохрома С. Обозначены номера штаммов гибридом и моноклональные антитела J-5AC003, специфичные к ИЛ-2 ( Celltech).

дом иммуноблоттинга ЛИС грамотрицательных бактерий ( Hitchcock et al., 1983). Мы применили его в сочетании с ИФА (табл.2). Все антигены были высушены в лунках микроплат, в качестве источника МКА использовали культуральные суперна-танты гибридом. Обработка протеиназой К практически не изменяла связывание МКА ЗЗБ.1 с антигенами. Исследование специфичности антител показало, что МКА ЗЗБЛ не взаимодействовали с дрожжевой тРНК и ЛНС Е. coli 011ЬВ4 , распознавая, вероятно, видоспецифическую антигенную детерминанту ЛПС £. coli штамма K-12RR1 . МКА МАС003, 22AI.2, 29Б.1, 13Б.1 и 26Б не связывались с депротеинизированными антигенами.

Б таблице 3 суммированы результаты определения специфичности части МКА к препарату рИЛ-2 методами иммуноблоттинга и иммуноферметного анализа, приведены их изотипы, определенные в ИФА при помощи набора фирмы Calblochem и указаны константы аффинности МКА. Для расчета констант аффинности супернатанты штаммов гибридом с известным содержанием антител титровали в ИФА с различавшимися вдвое концентрациями антигенов ( Beatty et al. ,1987 ).

Таблице 2

Связывание моноклональных антител к препарату рИЛ-2 с антигенами, иммобилизированными на пластике после обработки протеиназой К

Оптическая плотность 492 нм х 1С?

Антигены МАС-003 ЗЗБЛ 22AI.2 29Б.1

I. рШ1-2 1186 1920 1204 1476

2. рИЛ-2 + протеиназа К 101 1812 329 417

3. Мембранная фракция coli 125 1761 1341 1603

4. Мембранная фракция е. coli

+ протеиназа К 89 1682 468 449

5. ЛПС Е. coli 0111:В4 67 180 121 324

6. Дрожжевая т-РНК 72 571 281 364

7. Протеиназа К 75 569 325 399

8. БСА 62 503 292 243

Таблица 3

Моноклоналыше антитела к препарату рекомбинантного интерлейкина-2 человека

Штамм 1 Специфичность МКА |Изотип ;Константа аф-

гибридомы : МКА :финности МКА ! ( M -л-1)

I. 1Б.1 рИЛ-2 G2b 6,2 x 10° 6,8 x 10® 9,0 x 10® 3,4 x 10® 9,7 x 10®

2. 2Б.1 рИЛ-2 G2a

ЗЛОБ Л рИЛ-2 G1

4.13БЛ рИЛ-2 G2b

5.26Б рИЛ-2 Q1

6.30Б.1 рИЯ-2 G1 2,3 x 10®

7.22AI.2 мембранный белок Б. coli мол. ызссы 45000 G2b 1,4 x IO9 6,8 x IO8

8.29Б.1 мембранный белок E.coli мол. массы 4000 G2b

9.33Б.1 липополисахарид е. coli G2b 6,0 x IO8

Эпитопная специфичность МКА к рИЛ-2.

Для получения асцитов предварительно обработанным приставом мышам Balb/c вводили 5 х Ю гибридных клеток. МКА из асцитов ила из супернатантов культур гибридом выделяли на колонке с протеином A St. aureus Cowan 1. Концентрацию белков определяли по методу Лоури.

Мечение МКА биотипом осуществляли после диализа очищенных антител против 0,1М раствора бикарбоната натрия ( Jackaon et al., 1982).

Детерминантную специфичность МКА. к рИЛ-2 человека определяли методом конкурентного ИФА. Связывание меченных биоти-ном МКА с рМ-2, высушенным в лунках микроилат, проводили в присутствии избытка^еченных антител. Результаты представлены на ряс. 2.

МКА I3E.I в концентрации 10мкг/мл тормозили связывание !ЖА 2Б.1, 26Б и 13Б.1 с антигеном более чем на 85%. МКА 26Б и 2БЛ конкурировали подобно МКА 13Б.1. Антитела 1Б.1 к 30Б.1 схожим образом влияли на связывание биотинилировашшх МКА 2БЛ, 13БЛ и 26Б. Ни одно антитело, кроме самих МКА 30Б.1, но конкурировало с меченными МКА ЗОБЛ. Таким обра-

80

40

2Б.1 ^^о

26Б ^-»о 30Б.1

80

40

ОД I 10 100 0,1 I 10 100 Немечегшое антитело (шсг/ыл) А - 1Б.Х о - 13Б.1 а - 30Б.1

Рис. 2 Эпитопная специфичность МКА к рИЛ-2 человека, определяемая яшуноферментным методом. МКА 2Б.1 и 26Б конкурировали подобно МКА 13Б.1 и на рисунке не приведены.

зом, моноклональные антитела 2Б.I, 13Б.1 и 26Б, вероятно, распознавали идентичные или близкорасположенные эпитопы рИЛ-2. Участки связывания f.'ICA 1Б.1 и ЗОБЛ, скорее всего, достаточно близко располагаются с эпитопами МКА 2БЛ, 13БЛ и 26Б, но не перекрывают друг друга.

Полученные нами МКА против рИЛ-2 человека распознавали три антигенные детерминанты в молекуле рекомбинантного лш-фокина. Эти детерминанты не являлись конформационннми, так как все MJCA взаимодействовали с рИЛ-2 в мономерной и олиго-мерной формах после ДСН-ПЛГЭ и переноса на нитроцеллюлозу.

Поликлокалънне антчтела к препарату рИЛ-2.

Кролика иммунизировали 100 мкг частично очищенного рИЛ-2 в полном АФ в подушечки задних лап и внутрикожно. Реичмуниза-цию проводили через 3-4 недели тем же количеством антигена г неполном АФ в подколенные лимфоузлы задних лап. Поликлональ-ную сыворотку получали через 8-10 дней после реиммунизации. Титр антител в сыворотке, определённой кок разведение, при котором связывание антител с антигеном в ИФА составляло 50% от максимального, был равен 1:25000 - 1:50000. В иммуноблот-тинге поликлональные антитела распознавали мономеры и мульти-меры рИЛ-2 в редуцирующих и нередуцирутацих условиях и бактериальные антигены.

Способность поликлональных антител нейтрализовать биоактивность рИЛ-2 и Ш-2, синтезированноь'о лимфоцитами (лИЛ~2), проверяли в тесте на мышиной линии оты, , зависимой от ИЛ-2. Препараты антител для внесения е культуру выделяли из антисыворотки на протеин А -сефароэе, диализовали против 0,22$ бикарбоната и доводили до изотоничности десятикратным концентратом среды RPMI-1640 (Войтенок, 1976).

Поликлональные антитела к рИЛ-2 в концентрации 50 мкг/мл аффективно нейтрализовали рИЛ-2 человека, слабее - лШГ-2 человека и ле влияли на активность мышиного и крысиного ИЛ-2. Разная степень нейтрализации рИЛ-2 и л»'Л-2 поликлональными антителами могла быть связана с тем, что в случае рИЛ-2 нейтрализация биоактивности была обусловлена не только взаимодействием антител с активным центром молекулы, но и преципитацией лш.фокина (антигенное различие рекомбинантного п лш?юцитарного ИЛ-2 описано Cousin et al., 1985). Кроме тох'о, препарат лШ1-2 может содержать другие лигдрокины, в

частности, ИЛ-4, активные в с™» -тесте (ЗеуегАпзоп et а1., 1987).

МКА к рИЛ-2 в диапазоне концентраций 0,1 - 100 мкг/мл не обладали способностью нейтрализовать биологическую активность ИЛ-2.

ИммуноФеомектное определение рекомбинантного

интерлейтсина-2 человека.

Использование ИЛ-2 в экспериментальной и клинической работе требует его количественного определения в различных биологических образцах. С этой целью наиболее часто применяется титрование по биологической активности на ИЛ-2 - зависимых клеточных линиях. На основе полученных в последнее время поликлональных и моноклональных антител к ИЛ-2 разработаны иммунохимические способы его определения, среди которых наибольшей чувствительностью характеризуется сэндвич-вариант ИФА ( Реггиа ег а1.,1987).

Нами показана возможность иммуноферментного определения рИЛ-2 после высушивания антигенов в микроплатах. Для работы использовали МКА против рИЛ-2, продуцируемые штаммом гкбри-домы 13Б.1, и поликлоналыше кроличьи антитела к рИЛ-2. Антитела для ИФА выделяли на протеин А - сефарсзе.

При сравнении трёх вариантов ИфА: сэндвич, сорбция и высушивание антигена - вариант сэндвича, как и ожидалось, оказался наиболее чувствительным и позволял определить I нг/мл рИЛ-2. Чувствительность ЙФА при высушивании и сорбции рИЛ-2 составляла 10 нг/мл, однако абсолютные значения оптической плотности при высушивании и сорбции одинаковых количеств рКЛ-2 были выше в первом случае, что отражало, соответственно, большее связывание антигена с пластиком. При высушивании можно было определять рИЛ-2 в присутствии 1% ДСП и 1% БСА. Наличие в образце рИЛ-2 0,0]$ неионного детергента и 0,4 БСА полностью отменяло сорбцию ИЛ-2.

Таким образом, связывание рИЛ-2 с пластиком путём высушивания образцов в лунках микроплат представляет собой простой способ иммобилизации антигена в присутствии детергента и посторонних белков и не требует специальной обработки исходного раствора ( Пгех1ег ег а1.,198С). Вариант ИМ с высушиванием может быть использован для отбора клонов-продуцентов лим^оккнов среди неочищенных лизатоэ клонов.

Получение моноклональных: антител к рекомбинантному ФНО-с£ Рекомбинантный ФНО~л, (рФНО-^с ) был получен, в результате экспрессии гена лимфокина в е. сои и очищен хроматогра-фически Шедоспасов и др., 1985). По данным ДСН-ПАГЭ, чистота препарата превышала 95$.

Мышей линии Ва1Ъ/с иммунизировали по двухнедельной схеме ( С1ап1'^11а ег а1., 1984). Слияние 1,2 х 10 клеток селезенки иммунных мышей и 4 х Ю7 клеток шеломы мыши Х&3-Аз8-653 проводили, как описано на стр. 6. Для культивирования и селекции гибридом использовали среду ИМДМ с добавлением 10% ЭТО, гипоксантина, аминоптерина и тимидина. Гибриды-продуценты клонировали два раза методом лимитирующих разведений, высевая по одной клетке в лунку, содержавшую 4 х Ю4 клеток селезёнки в качестве фидера.

После гибридизации клетки были раскапаны в 4 микроплаты, через 7 суток рост клонов гибридом наблюдался во всех лунках. Отбор положительных гибридом проводили на II сутки в ИФА, используя в качестве антигена рФНО- <А. , сорбированный из 0,1М бикарбонатного буфера, рН 9,6, по 500 нг/лунку. Было выявлено II гибридом, продуцировавших МКА, способные специфически связываться с'рФНО-л , 5 из них - клонированы. Только одна из гибридом, ЗС7Ы , синтезировала МКА, способные нейтрализовать рФНО- л. в культуре клеток ь-929 ( табл. 4). Для оценки нейтрализующей способности МКА использовали тест-систему мышиных фибросаркомных клеток, чувствительных к факторам некроза опухолей ( Р1во1г et а1.Д983).

Таблица 4

Взаимодействие моноклональных антител с рФНО-я в иммуноферментном анализе и в тесте на клетках ь-929.

Штамм ; ИФА (А 492 нм х Ю3)* : Нейтрализация

гибридомы : рФНО-ос : ЬО'А ": рФНО-*- {%)

ЗС7П 2747 87 109

1401 67 4

13ДЮ 1968 118 8

7Е8 1626 60 5

15ЕЗ 1219 58 6

- в качестве препарата МКА для ИФА и для нейтрализации оФНО-^. использовали супернатанты гибридом с содержанием антител 6-30 мкг/мл; **- концентрация рФНО-^ составляла 0,0

Получение моиоклональных антител к рФНО-.д.

Рекомбиначтный ФНО-.л для иммунизации животных, ИФА и иммуноблоттинга, зкспрессированный в клетках е. coli , был элшрован из геля после препаративного ДСН-ПАГЭ.

Мишей Balb/c трёхкратно иммунизировали внутрибргажн-ным введением 50 мкг рФНО-./ с интервалом в 14 дней. Через 3 дня после реиммузизации проводили гибридизацию 6 х Ю7 сплоноцитов и 1,2 х Ю миеломы x63-Ag8-653.

В результате проверки в ИФА с антигеном - рФН0-/< , высушенным в микроплатах по 200 нг/лунку, из 192 исследованных гибридом било отобрано 8, среди которых лишь для одной специфичность к рФНО-./) была подтверждена методом иммуноблоттинга с HP, соответствовавшей рФНО-у3 . МКА против рФН0->з , продуцируемые штаммом ЛТДЭ, специфически связывались в ИФА с рФНО--^, но не с рФНО-^, и распознавали рФН0-_/ в иммуноблоттинге.

В таблице 5 приведены данные, суммирующие некоторые характеристики МКА к факторам некроза' опухолей. Изотипы МКА и константы их аффинностей определяли в ИФА, как и ,для МКА к препарату рИЛ-2 человека. Гибридома 701 продуцировала МКА изо-типа С2Ь , не описанного среди МКА к ФН0-<^ ( Liang et ai., 1986; liirai et al., 1937). Константа аффинности МКА 13Д10 -2,9 x 10^к -л-1 превышала приводимые в литературе значения констант аффинности моноклоналышх антител к рекомбинантному фактору нокроза опухолей-х ( Liang ot al.,I986).

Таблица 5

Мсноклональнне антитела к факторам некроза

опухолей человека.

Штамм :Специфичность МКА ¡Изотип : Константа аффинности гибрлдомы :__: МКА : МКА ( ц.л"*) _

1. 3C7Ü ФНО-л G1 7,5 X lü"

2. 7Е8 ?Н0----G1 3,3 х Ю8

3. 7С1 ФИО- ~ С2Ъ 4,8 х Ю8

4. 13Д10 ФИО-^ G1 2,9 хЮ9

5. ЛТДЭ G2b 1,5 х Ю8

Нейтрализация ФНО-^ моноклона льнпш пн.'ителаг.нгЗС"-.'. Дли изучения биологической активности л а;изцо,тог::ч';око?. роли медиаторов иммунитета и гемояозза необходимо cocrü'i'jT/

1Д1 А

0,1,

РФНО—(

ыакр.

цитотоксин

3 5 7 9

Разведение образца

-logg

р ФНО-ч \ \ макр.

цитотоксин

2 4 6 8

1/50 -log, Разведение асцита <L

Рис. 3. Нейтрализация рФНО-^и макрофагалыюго цитогоксина МКА ЗС7И . Циютоксическая активность образцов без антител (А) и в присутствии МКА ЗС7Н (Б).

проявление того или иного биологического эффекта с наличием в тест-системе определённого медиатора. Одним из возможных путей решения проблемы является применение МКА для идентификации лимфокинов методом ИФА или нейтрализации их активности в биотесте. Последний подход позволяет сочетать специфичность МКА и высокую чувствительность биотеста.

На рис. 3 представлены данные по нейтрализации антителами ЗС7К рФНО>«& к макрофагального цитотоксина. В качестве источника клеточного ФН0—£ была использована кулътуральг-ная среда макрофагов, активированных ЛПС. Рекомбинантный и макрофагальшй цитотоксины были уравнены по исходной актив-

ности и титрованы по цитотоксическому эффекту в культуре клеток ь-929 (рис. ЗА). Кривые зависимости цитотоксической активности от разведений исследуемых образцов различались мало. Степень нейтрализации макрофагального цитотоксинэ была несколько выше, чем рФНО-<■£ (рис. ЗБ), что отличало МКА 3C7N от описанных ранее антител против ФНО- -с , которые лучше нейтрализовали либо рФНО- , либо нейтрализовал!! макрофагальный и рекомбинантный цитотоксины в равной степени.

МКА зста использовали для нейтрализации ФНО-^. в условиях длительной культуры (11-14 суток) при определении ко-лониестимулирующей кроветворной активности в супернатантах культур макрофагов и изучении подавления колониеобразования рФ!Ю-°< и макрофагальным супернатантом. ШСА полностью отменяли ингибирувдее действие рФН0-*£. на рост кроветворных колоний и снижали ингибирующее действие макрофагалькых супер-натонтов. Остаточная ингибиругадая активность культуральккх сред макрофагов, которая не снималась МКА ЭСЪ. , могла быть связана с присутствием в них других ингибиторов пролиферации кроветворных клеток ( Murphy et alJ988).

Получение поликлональных антител к рексмбинантному ФНО-/9

Кроликг иммунизировали рекомбинантшм ФНО-^ä (рФНО-J>), выделенным из геля после препаративного ДСН-ПАГЭ. Сыворотку получали через 7-10 дней после реиммтаизации, титр её в ИФА составлял 1:6400 - 1:12800. На икмуноблоттинге с препаратами рФПО-уЗ разной степени очистки и Ж0~у3 , синтезированным лимробластоидной линией, иолшиюнальние антитела взаимодействовали с белком, чья мол. масса - 20000, соответствовала молекулярной массе ФНО-у» (iiaury, I98S). Антисыворотка нейтрализовала pfflO-vä , синтезированный Ii, coli и эукариотичес-кг.м продуцентом, в тесто на ¡слетках l-929 при разведениях 1:20 - 1:40.

ВЫВОД Ы.

1. Эффективность образования мышиных B-гибридом различается при использовании ряда образцов полиэтилен^---¡колей, предварительный выбор лучшего сливающего раствора полизтиленгликоля позволяет оптимизировать схему гибридизации клеток.

2. Получени штаммы гибридом, продуцирующие !/КА к р7Л-2 человека и возмогли примесям в препарате рН-2: иеиЗрашгсау

белку E. coli мол. массы 45 тысяч дальтон; мембранному оел-ку Е. coli мол. массы 4 тысячи дальток; липополисахариду Е. coli.

3. Моноклональные антитела к рШ1-2 распознают 3 частично перекрывающиеся, ноконформационные антигешше детерминанты, ие связанные с биологической активностью молекулы, и взаимодействуют в иммуноблоттинге с мономером, димером и олиго-мерными агрегатами рИл-2.

4. Кроличья антисыворотка, полученная при иммунизации рИЛ-2, нейтрализует его в большей степени, чем лимфоцитарннй НЯ-2 человек". Отсутствие нейтрализации поликлональными ати-телами крысиного и мышиного ¡!Л-2 свидетельствует об антигенном различии их активных центров и активного центра рИЛ-2.

5. Фиксация рИЛ-2 высушиванием в лунках микроплат позволяет проводить его определение методо.и иммупоферментного анализа в образцах, содержащих додецилсульфат натрия и посторонние белки.

6. Получены гибридомные линии, продуцирующие !<1КА против рекомбинанпшх ФНи ОИО-^з.

7. Моноклональные а.чтитела ЗС7Н нейтрализуют рФНО-л" и макрофагальный цитотоксин, в краткосрочном тесте на мышиных фкбросаркомных клетках L -929 и в длительном тесте при определении колонияетимулирующей кроветворной активности.

8. Поликлональная антисыворотка к рФНО- /> , очищенному методом препаративного электрофореза в денатурирующих условиях, пригодна для его определения методами ИФА и имму-ноблоттинга и обладает слабой нейтрализующей активностью.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ.

1. Панютич A.B. Моноклональные антитела, реагирующие с иммуноглобулином О человека // Сборник научных трудов -Минск, 1984. - С. 112—115.

2. Панютич A.B. Пути повышения количества образующихся гибридом к растворимым антигенам // Тез. докл. Третьего Респ. съезда врачей-лаборантов БССР - Минск, 1986. - С.218-219.

3. Панютич A.B., Войтенок H.H., Циманис А.Ю.-, Бундулис Ю.П., Скривелис В.А. Штамм гибридных культивируемых клеток животных 13Б1.2 ВСКК(П) J« 108Д, используемый для получения моно-клональных антител к интерлейкину-2 человека // Заявка

/6 4228367/28-13(060229) от 13.04.87 г., положит, реш. от 29.10.87 г.

4. Панютич A.B., Войтенок H.H., Циманис А.Ю., Бундулис Ю.П., Скривелис В.А. Штамм гибридных культивируемых клеток животных 29Б1.2 ВСКК(П) № ПОД, используемый для получения моноклональных антител к мембранному пептиду ь. coli

в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека // Заявка № 4251939/23-13(086442) от 28.05.87 г., положит, реш. от 27.11.87 г.

5. Панютич A.B., Войтенок H.H., Циманис А.Ю., Бундулис Ю.П., Скривелис В.А. Штамм гибридных культивируемых клеток животных 33EI.2 ВСКК(П) й II1Д, используемый для получения моноклональных антител к липополисахариду к. coli // Заявка № 4251938/28-13(086443) от 28.05.87 г., положит, реш. от 26.02.88 г.

6. Панютич А.З., Войтенок H.H., Осипович O.A., Циманис А.Ю. Птамм гибридных культивируемых клеток животных 22AI.2 ВСКК(П) В П2Д, используемый для получения моноклональных антител к мембранному белку е. coli в препарате рекомбинантного интерлейкина-2 человека // Заявка й 4242063/28--13(076880) от 12.05.87 г., положит, реи. от 27.11.87 г.

7. Панютич A.B., Войтенок H.H., Турецкая Р.Л., Шахов А.Н., Недоспасоэ С.А., Чувпило С.А., Шингарова Л.Н., Добрынин В.П., Коробко В.Г. Штакл гибридных культивируемых клеток животных 13Д10 BCKK(II) И 173Д - продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей - альфа человека // Заявка

№ 4352632/28-13(193972) от 29.12.87 г., положит, реш. ст 28.06.88 г.

8. Панютич А.В., Войтенок Н.Н., Турецкая Р.Л., Шахов А.Н., Недоспасов С.А., Чумаков A.M., Добрынин В.Н., Коробко В.Г. Штамм гибридных культивируемых клеток животных ЛТД9 ВСКК(П) № 171Д - продуцент моноклонального антитела к рекомбинантно-му фактору некроза опухолей - бета человека // Заявка

№ 4352636/28-13(193978) от 29.12.87 г., положит, реш. от 28.06.88 г.

9. Войтенок Н.Н., Комаро^ская М.Е., Карканица Л.В., Невмер-жицкая С.И., Панютич А.В. Подавление активности колоние-стимулирующих факторов, синтезируемых in vitro макрофагами одновременно с фактором некроза опухолей // Тез. докл. Всесоюзной конференции с международным участием "Стволовая кроветворная клетка в норме и при патологии". - Томск, 1988. - С. 31-32.

10. Voitenok N.N., Komarovskaya К.Е., Karkanitea l.V., Hevnerzhitskaya S.I., Panyutich A.V. Interference of tumor necrosi3 factor with human colony - stimulating factor bioassay // Abstracts of the XXIX Congress of the international society of hematology, Milan, 1988. - P. 105.