Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование метода гомологичного иммуноферментного анализа для изучения и количественного определения олигомерных форм цитокинов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование метода гомологичного иммуноферментного анализа для изучения и количественного определения олигомерных форм цитокинов"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ л п ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

од

2 3 НОА

УДК 612.017.1: 612.014.3

Петёвка Наталья Васильевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ГОМОЛОГИЧНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОЛИГОМЕРНЫХ ФОРМ ЦИТОКИНОВ

03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Минск, 1998

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте гематологии и переливания крови Министерства здравоохранения Республики Беларусь, г.Минск

Научный руководитель: доктор медицинских наук Войтенок II.H.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Метелица Д.И.

доктор медицинских наук Владыко A.C.

Оппонирующая организация: Государственный научно-исследовательский

Институт особо чистых биопрепаратов Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится "Z6 " H&jßjuj 199 fr. в "/¿7 " часов на заседании Совета по защите диссертаций Д 01.21.01 в Институте биоорганической химии HAH Беларуси по адресу: 220141, г. Минск, ул. В.Ф. Купревича 5/2, тел. учёного секретаря 264-85-53.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии HAH Беларуси. , Автореферат разослан "¿6" 1998г.

Учёный секретарь

Совета по защите диссертаций,

кандидат химических наук

Н.М. Литвинко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Актуальность изучения таких важнейших регуляторных белков иммунной системы как цитокины, в том числе фактора некроза опухолей альфа человека особенно возросла в последнее десятилетие в связи с поиском новых эффективных методов диагностики и лечения многих заболеваний, таких как СПИД, рак, различные аутоиммунные заболевания и нарушения иммунитета. В нашей республике актуальность исследований в области иммунологии обусловлена также ситуацией, сложившейся после аварии на Чернобыльской АЭС. Анализ белков с помощью моноклональных антител (МКА), и, в том числе, иммуноферментного метода, в научной работе и в практическом здравоохранении применяется повсеместно. Однако тест-системы по определению цитокинов производят исключительно за рубежом, они очень дороги и поэтому малодоступны для широкого круга исследователей Беларуси.

Связь работы с научными программами, темами. Работа выполнена в рамках темя: "Разработать современные биотехнологические подходы для исследования медиаторов иммунитета и кроветворения", № гос. регистрации 01.9.10018156, являющейся частью республиканской научно-технической программы "Здоровье" (1991-1995г.). Работа была также поддержана финансированием Фонда Фундаментальных исследований Республики Беларусь, в 1994-95г. Часть исследований проводилась в рамках темы: "Создать тест-системы для определения растворимого рецептора Р-55 фактора некроза опухолей и провести их клинико-эксперименгальную апробацию при инфекционной патологии", № гос. регистрации 1997287/27.01.1997г.

Цель и задачи исследования: характеристика свойств гомологичного твердофазного иммуноферментного анализа, условий его применения для изучения и измерения олигомерных цитокинов - фактора некроза опухолей альфа (ФНб) и интерлейкина-8 (ИЛ-8), а также адаптация метода для измерения низких (физиологических) концентраций олигомерного ФИО в биологических жидкостях. .

Необходимо было решить следующие конкретные задачи:

- определить наиболее важные физико-химические свойства антител, влияющие на чувствительность метода гомологичного ИФА (Гм-ИФА);

- изучить влияние неионного детергента Твин-20 на чувствительность Гм-ИФА;

- оптимизировать условия измерения природного олигомерного ФНО в биологических жидкостях методом Гм-ИФА;

- изучить возможность регистрации молекулярных комплексов ФНО с растворимым рецептором Р-55 методом гомологичного ИФА.

Объект исследования. Объектом исследования являются важнейшие регуляторные белки иммунной системы - фактор нефоза опухолей альфа человека и интерлейкин-8, а также комплекс фактора некроза опухолей с растворимым Р-55 рецептором.

Методология и методы проведенного исследования. Применяемые в работе методы основаны на использовании перспективных продуктов современной биотехнологии - моноклональных антител. В работе использованы современные методы иммунохимии: аффинная очистка н биотинилирование моноклональных антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализ, этггопный анализ, иммуноблотгинг.

Научная новизна работы. Известно, что биологическая акгавносп ФНО связана с сохранением четвертичной структуры цитокина /Smith апс Baglioni, 1987/. Однако, до проведения настоящего исследования не существовало достаточно чувствительного метода определения олигомерог природных цитокинов в физиологических концентрациях. Метод гомологичного ИФА ФНО впервые адаптирован для количественной: определения олигомерного ФНО в физиологически значимых концентрация? в плазме и сыворотке крови человека. Предложенный вариант анализе превосходит по чувствительности наилучший из известных в 50 раз. Впервые разработан вариант иммунофер-ментного определения олигомерногс шггерлейкина-8 человека. Впервые обнаружено значительное уменыпенш чувствительности гомологичного ИФА в присутствии 0,05% детергента Твин 20, причиной которого является диссоциация олигомерного белка дс мономеров, происходящая в процессе анализа. Определены наиболее важньк физико-химические свойства антител, используемых в методе гомологичноп ИФА. Впервые показана возможность выявления комплексов ФНО < растворимым рецептором Р-55 с помощью ИФА. Научная значимосп полученных результатов заключается в возможности создан® чувствительного гомологичного ИФА, единственного метода, позволяющей оценивать олигомерное состояние природных белков в биологическо! жидкости в пикомолярных концентрациях. Разработанные и описанные ] данной работе варианты иммуноферментного определения ФНС использовались в научных исследованиях фундаментального и прикладной характера /Чалый и др., 1996; 2,3/.

Практическая значимость полученных результатов. Изученные : данной работе закономерности и разработанные вариант! иммуноферментного определения цитокинов могут стать основой дл создания и производства коммерческих тест-систем и широкого применени их в исследовательской практике.

Основные положения диссертации, выносимые на защту.

1. Разработка сэндвич-варианта иммуноферментного анализа ФНС основанного на использовании одних моноклональных антител, чт

позволяет доказать возможность Гм-ИФА определять олигомерный ФНО с высокой чувствительностью в диапазоне концентраций 15-2000 пг/мл.

2. Разработка гомологичного варианта ИФА интерлейкина-8, что позволит установить существование олигомерной формы ИЛ-8 в диапазоне концентраций 1-10 нг/мл.

3. Определение аффинности, нейтрализующей способности ir эпигопной специфичности моноклональных антител против ФНО, что позволит установить зависимость между чувствительностью гомологичного ИФА ФНО и свойствами используемых при проведении анализа антител.

4. Оценка влияния неионного детергента Твин-20 в концентрации 0,05%, на чувствительность разработанных вариантов гомологичного и гетерологичного ИФА ФНО и ИЛ-8, что показывает возможность применения данных методов для регистрации изменений четвертичной структуры белков в низкой концентраций и в присутствии других биомолекул.

5. Адаптация вариантов гомологичного ИФА для определения природного олигомера ФНО в пикомолярных физиологически значимых концентрациях в биологической жидкости и для регистрации его комплекса с растворимым Р-55 рецептором, что позволит получить ранее недоступные сведения о содержании и соотношении различных форм антигена в биологической жидкости в норме и при патологии.

Личный вклад соискателя. Представленные в работе результаты исследования получены и проанализированы лично автором.

Апробация результатов диссертации. Результаты научных исследований докладывались: на международном симпозиуме "Structure & Function of Regulatoiy Polypeptides", Москва, 1992; на 8 Международном конгрессе по иммунологии, Будапешт 1992г.; на совместном заседании 8-го Международного рабочего совещания по лимфокинам и 4-го Международного рабочего совещания по цитокинам, г. Осака, Япония, 1993г.; на Ш Центрально-европейской летней школе по иммунологии, г. Кошице, Словакия, 1994г.; HS IV Центрально-европейской летней школе по иммунологии, г. Прага, 1995г., где работа заняла ИГ место в конкурсе стендовых докладов; яа Ш съезде Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов "Актуальные проблемы иммунологии и аллергологии" - Гродно, 1995г.; на Ш Международной летней школе им. Дж. Хамфри, г. Пущино, Россия, 1996г и на IV Международной летней программе по иммунологии им. Дж. Хамфри, г. Пущино, Россия, 1998г.

Опубликованность результатов. Результаты, вошедшие в данный труд, опубликованы в трёх статьях в научных журналах, трёх статьях в сборниках, одном авторском свидетельстве, 10 тезисах конференций и симпозиумов, что в сумме составляет 44 страницы.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 94 стр. и

состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, списка литературы и приложения. Список цитируемой литературы содержит 122 источника. Диссертация содержит 18 рисунков, 5 таблиц и 1 Приложение.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использован рекомбинантный ФНО (рФНО) человека (НПО "Фермент", Вильнюс, Литва). Рекомбинантный ИЛ-8 и кроличьи поликлональные антитела против ИЛ-8 любезно предоставлены профессором КМацушима (Cancer Research Institute, Kanazawa University, Japan). Природный растворимый P-55 рецептор ФНО любезно предоставлен д-ром Д. Валлахом (Weizmann Institute of Science, Israel). Исходные растворы P-55, рФНО и ИЛ-8 хранились при -70° С в концентрации 100 нг/мл в фосфатно-солевом буфере с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (ФСБ-БСА). Стандарты рФНО и ИЛ-8 были любезно предоставлены д-ром А.Мигером (NIBSC, South Mimms, UK). Все монокло-нальные антитела, использованные в данном исследовании, были получены в лаборатории, на базе которой выполнена данная работа, коллективом исследователей под руководством д.м.н. Войтенка H.H. и предоставлены им.

МКА очищали из культуральных супернатантов гибридом на колонке с протеин А-сефарозой (Beckman) в соответствии с инструкцией фирмы производителя. Очищенные антитела бисгганилировали, используя N-гидроксисукцинимидобиотин (Calbiochem) /Tijssen, 1970/. Специфичность очищенных и биотинилированных антител к антигену проверяли в прямом ИФА. Антиген адсорбировали в 96-луночной планшете (100 мкл/лунку, 0,5 мкг/мл 0,IM карбонатного буфера, pH 9,6) в течение ночи при +4°С. В качестве отрицательного контроля адсорбировали бычий сывороточный . альбумин (БСА) в той же концентрации. После отмывки планшета образцы очищенных или биотинилированных МКА в ФСБ-БСА вносили и инкубировали 1 час. Антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена в разведении 1:2000 (Bio-Rad) или стрепгавидинпероксидазу (Bio-Rad) в разведении 1:2000, вносили и инкубировали аналогично предыдущему шагу. Субстратный буфер (0,1М цитратный буфер pH 4,7, 0,4 мг/мл ортофенилендиамина (Sigma), и 0,01% Н2О2) вносили по 100 мкл/лунку. Цветную реакцию останавливали добавлением 100 мкл 5%-ой серной кислоты. Оптическую плотность регистрировали при 492 нм многоканальным спектрофотометром Reader Microelisa system (Organon Teknika).

Метод гомологичного твердофазного ИФА основан на использовании одних и тех же МКА в качестве нижних (иммобилизованных на носителе) и в качестве верхних (биотинилированных) антител /4/. В гетерологичном ИФА

ФНО одни МКА использовали в качестве нижних, а другие, биотинилированные МКА, использовали в качестве верхних антител. В Гт-ИФА ИЛ-8 в качестве верхних использовали кроличьи поликлоналыше антитела (ПКА) против ИЛ-8 в концентрации 1 мкг/мл. На следующем этапе инкубировали ПКА козы против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (Bio-Rad).

Эпитопный анализ проводили, используя прямой конкурентный иммуноферментный анализ /Hirai et al., 1987/.

Иммуноблоттинг ФНО. Лизат клеток Е. coli, продуцирующих мутантный рФНО, разделяли методом электрофореза в ПААГ в редуцирующих условиях с додецилсульфатом Na по Лэммли. Разделённые белки переносили на нигроцеллюлозную бумагу (Bio-Rad) с. помощью ячейки для электропереноса фирмы LKB в соответствии с инструкцией к прибору. Далее нигроцеллюлозную бумагу инкубировали 1 час в 3% желатине, растворенном в трис-HCl буфере, pH 7,4 при 37°С. Далее последовательно инкубировали по 1 часу при встряхивании в растворе: а) МКА; б) ПКА козы против иммуноглобулинов мыши, конъюгированных со щелочной фосфатазой (BioRad); в) субстратной смеси, содержащей NBT-BCIP в качестве хромофора (Amersham). Растворителем на стадиях а) и б) служил трис-HCl буфер pH 7,4, содержащий 0,1% Твина-20 и 0,5 М хлорида натрия.

Нейтрализующую активность антител определяли в цитотоксическом тесте с использованием клеточной линии L-929 /Fisch et al., 1986/. Образцы разведенных в культуральной среде очищенных МКА смешивали с рФНО (0,5 нг/мл), инкубировали в течение часа и вносили в 96-луночный микропланшет на монослой клеток L929 в присутствии 1 мкг/мл актиномицина D (Sigma).

Определение кинетических констант реакции антиген-антитело проводили методом твердофазного РИА /4/. Константы скорости ассоциации и диссоциации определяли, как описано /Steward, 1986/.

Для индукции синтеза природного ФНО и ИЛ-8 человека суспензию убитого нагреванием St. aureus Cowan 1 (конечная концентрация 0,001% по объему) добавляли к моноцитам, выделенным фракционированием на непрерывном градиенте Перколла при +4°С /Osipovich et al.,1993/, или в дельную кровь нормального донора и инкубировали 3 часа при 37°С /Misuno staL, 1990/.

Для выявления комплексов ФНО с растворимым P-55-рецептором, эФНО и природный Р-55 рецептор смешивали в молярном соотношении 1:10 зоответственно в различных концентрациях в ФСБ-БСА с добавлением слорида натрия до 0,ЗМ и инкубировали при встряхивании в течение 1 часа три комнатной температуре. Затем смесь вносили в лунки микропланшета, юкрытые предварительно иммобилизованными МКА против рецептора Р-55 I инкубировали 1,5 ч. Биотинилированные МКА против рецептора Р-55 или

ФНО и стрептавидин-пероксидазу инкубировали, как описано выше Графический анализ и статистическая обработка данных проведены с помощью компьютерной программы Microcal Origin (ver. 3.5)

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ИФА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ

МКА очищали из кулыуральной жидкости габрвдом. Степень очистки контролировалась с помощью электрофореза в лолиакриламидном геле по Лэммли. Образцы содержали не менее 95% нужного белка. Иммунореаюгивность очищенных и меченых биотином антител проверена в прямом ИФА. Меченые биотином МКА в условиях анализа давали оптическую плотность 1 единица и выше в разведении 1:8000.

Была исследована эффективность МКА в гомологичном "савдвич"-вариан-те ИФА ФНО. Чувствительность анализа определяли как разведение ФНО, дающее оптическую плотность большую трех среднестатистических ошибок по сравнению с фоном. Калибровочные кривые для рФНО позволяют разделить MICA условно на три группы. К первой группе следует отнести МКА 5N, использование которых в Гм-ИФА позволило достичь наибольшей чувствительности определения рФНО равной 15-30 пг/мл (рис. 1). К другой группе следует отнести антитела, использование которых в Гм-ИФА привело к более низкой чувствительности определения рФНО (более 1 нг/мл). Калибровочные кривые для антител этой группы находились в интервале между кривыми для МКА 1G и ЗС (см. рис. 1). Антитела ЮН не распознавали рФНО в Гм-ЙФА вплоть до концентрации 64 нг/мл (см. рис. 1). При сравнении различных вариантов гетерологичного "сандвич"- ИФА вариант с использованием пары МКА ЮН и 5N показал наибольшую чувствительность определения рФНО, равную 15-30 пг/мл.

ФНО, нг/мл

Рис.1. Титровочные кривые Гм-ИФА ФНО с использованием МКА: 1С (А), ЗС (•), 5К (о), и ЮН (В). Каждая представленная точка является средним значением триплета.

Чтобы выяснить, какие свойства моноклональных антител, используемых в Гм-ИФА, влияют на его чувствительность, была изучена эпитопная .специфичность и нейтрализующая активность антител. Для наиболее эффективных в Гм-ИФА МКА 5N и 1G и неэффективных в Гм-ИФА МКА, ЮН определены кинетические константы взаимодействия антиген-антитело в условиях твердофазного иммуноанализа и аффинность антител.

Эпитопную специфичность МКА определяли в конкурентном ИФА, оценивая способность немеченого антитела подавлять связывание с адсорбированным на подложке рФНО другого, меченого биотином антитела. На рисунке 2А представлены результаты анализа, как % связывания биотинилированных МКА в присутствии 10 мкг/мл немеченых антител. За 100% принято связывание биотинилированных антител в присутствии 10 мкг/мл нормальных мышиных иммуноглобулинов. Модель относительного распределения эпитопов на молекуле рФНО, основанная на данных конкурентного ИФА, представлена на рис. 2 Б.

При связывании различных МКА с антигеном, иммобилизованным на подложке, для довольно крупных молекул антител могут наблюдаться стерические препятствия. Отличить перекрывающиеся эпитопы от близко расположенных таким методом невозможно. Поэтому было исследовано связывание антител в иммуноблотганге с мутеинами рФНО, любезно предоставленными д.х.н. Коробко В.Г. (Институт биоорганической химии им. Шемякина-Овчинникова АН РФ, г. Москва).

А 100% связывания Б

ис. 2. А - конкурентный анализ моноклональных антител против ФНО. иотиннлированные МКА обозначены как МКА . Б - схематическое распределение титопов, распознаваемых MICA на молекуле рФНО, иммобилизованного на осителе.

Все МКА взаимодействовали с мономерной формой нормального тгокина в иммуноблотганге. Мутанты ФНО-М1 и ФНО-М2 имели делеции ) Arg 6 - Leu 29 и Ile 155 - Leu 157 аминокислотам, соответственно. N-конец /теина ФНО-Тим был слит с тимозином. Точка соединения для химерных

мутеинов ФНО-лимфотоксин (ФНО-ЛТ) и ЛТ-ФНО соответствовала 126/12 аминокислотным остаткам.

Установлено, что антитела 5Ы не взаимодействуют с мутеинам имеющими делении как на С-конце, так и у И-конца молекулы (табл. 1 Подобным образом взаимодействуют антитела Ю, ЗС и 14. Все четыр антитела связываются с мутеином ФНО-Тим и, по-видимому, распознав перекрывающиеся эпитопы, условно обозначенные нами как эпитопы групп А. Благодаря проведенному анализу стало ясно, что антитела 9 распознав эпитоп, отличный от эпитопов группы А, так как взаимодействуют мутеинами подобно МКА ЮН, а конкуренцию в конкурентном анализе МКА группы А (см. рис. 2) следует объяснить стерическими препятствиям возникающими в условиях анализа. Эпитопы, распознаваемые МКА 9 и 101 различны, однако полученные данные не позволяют однозначно ответить н вопрос, являются ли они частично перекрывающимися или только близк расположенными.

Таблица 1

Связывание МКА с мутеинами рФНО в иммуноблоггинге

Мутеин МКА

ш зс 4А 9 14 10Н

рФНО +++ +++ +++ +++ ++ +++ +

ФНО-М1 + + +++ -н- + +

ФНО-М2 - +-Н- - + + +

ФНО-ЛТ - - - - + - н.и.

ЛТ-ФНО - - ++ - + + н.и.

ФНО-Тим +-Н- +++ - +++ - +-Н- -

Примечания:

1."+++" - сильное связывание.

2. "++" - более слабое взаимодействие.

3. "+" - очень слабое взаимодействие.

4. "-" - нет связывания.

5. "н.и." - не исследовалось.

Кинетика взаимодействия рФНО с иммобилизованными в лунка микропланшета МКА 51М, Ш и ЮН изучена с использование! радиоактивного антигена. РФНО был помечен Ш1 по методу Болтона Хантера до удельной активности 49 мкО/мкг. Результаты анализ; представлены в табл. 2.

В результате проведенных исследований вычислены констанп аффинности (К,) антител Ш, 5Ы и ЮН. Результаты вычислена представлены в таблице 3.

Исследована способность очищенных МКА нейтрализован циготоксическую активность рФНО против клеток линии Ь929. Антитело

обладало высокой нейтрализующей активностью. Нейтрализующая способность этих МКА наиболее близка к эквимолярвому соотношению (табл. 3). МКА Ю, ЗС, и 14 на несколько порядков менее эффективно подавляли цитотоксическую активность рФНО по сравнению с МКА 5Н При молярном соотношении рФНО:МКА 1:43000 МКА ЮН нейтрализовали рФНО только на 20%. Очень слабая нейтрализация наблюдалась и для МКА 9,

Таблица 2.

Константы скорости ассоциации 1251 - ФНО и МКА и диссоциации их иммунных комплексов

МКА кь М"1 с 'хЮ5 к.ь с"1 х10"5

ш 5,2 ± 0,2 10,7 ± 0,1

5И 14 ±1 2,41 + 0,05

юн . 5,7 ± 0,3 2,1 ± 0,05

Таблица 3.

Характеристика моноклональных антител против ФНО

МКА Эпи- Аффин- Субкласс Нейтрализация (молярное

топ ность, Кд соотношение ФНО:МКА)

(м-1) 50% 100%

Ш А 4,9 х109 в2а 1:30 1:708

ЗС А 1,2 хЮ9 С1 1:2100 1:14200

5И А 5,7x10'° 02а 1:1,4 1:5,7

9 Б (В) н.и. в1 1:7000 -

14 А н.и. 1:1700 -

юн В 2,7x10'° й2а Не нейтрализует

Примечание:

Аффинность антител ЗС определялась в твердофазном ИФА (ВеаПу й а!., 1987).

Описанные ранее другими авторами варианты гомологичного ИФА, выявляющие олигомерныйФНО, показывали низкую чувствительность по сравнению с гетерологичным ИФА. В данном исследовании показано, что чувствительность гомологичного варианта ИФА зависит от моноклональных антител, используемых в процессе анализа. Наибольшая чувствительность определения (15 пкг/мл) рекомбинантного ФНО получена при использовании моноклональных антител 5]\[. Изучение свойств МКА против ФНО показало, что аффинность обоих, как высокоэффективного в Гм-ИФА МКА 5Ы, так и совершенно неэффективного антитела ЮН, была одного порядка (5,7хЮ10 М" 1 и 2,7x1010 М"1, соответственно) и отличалась не более чем в два раза, что не может быть причиной такого различия свойств. Цитотоксическая активность

ФНО нейтрализовалась антителами 5N в эквимолярном соотношении, тогда как МКА ЮН не обладали нейтрализующей способностью. МКА 5N и ЮН не конкурировали друг с другом при связывании с ФНО, по-разному распознавали мутантные аналоги ФНО, следовательно, они распознают различные не перекрывающиеся эпитопы на молекуле ФНО. Эпитоп. распознаваемый МКА 5N, по-видимому, комплексный, т.к. данное антителе одинаково не взаимодействовало как с мутеином, лишённым трёх аминокислот с С- конца молекулы, так и с мутеином, лишённым 22 аминокислот вблизи N-конца. Учитывая высокую нейтрализующую способность 5N антител, логично предположить, что эпитоп, распознаваемые данными антителами расположен вблизи участка связывания ФНО с рецептором. Напротив, МКА ЮН взаимодействуют с ФНО в Гт-ИФА, но ж выявляют олигомерный ФНО в Гм-ИФА, значит для них доступен только один эпитоп как на мономерной, так и на гримерной молекуле ФНО Способность антител связывать олигомерный белок определяется главные образом их эпитопной специфичностью.

Антитела IG, ЗС и 14, показавшие более низкую эффективность в Гм-ИФА, взаимодействовали с мутеинами ФНО аналогично антителам 5N конкурировали с ними и друг с другом за связывание с ФНО в конкурентно?» анализе и, по-видимому, распознают один и тот же эпитоп. Более низкук чувствительность 1G/1G- и ЗС/ЗС-вариантов Гм-ИФА (варианты, где i качестве верхних и нижних используются МКА 1G или ЗС) по сравнению < 5N/5N-BapHaHTOM можно объяснить меньшей аффинностью этих антител Однако МКА ЗС, близкие по аффинности к антителам 1G, но с более чем н; порядок меньшей по сравнению с ними нейтрализующей активностью, бьш в 4-5 раз более эффективными в Гм-ИФА. Очевидно, что нет однозначно! корреляции между эффективностью МКА в Гм-ИФА и аффинностью шп нейтрализующей активностью антител, несмотря на то, что наиболе< эффективное в Гм-ИФА МКА 5N обладало наибольшей аффинностью i наибольшей нейтрализующей способностью.

ВЛИЯНИЕ НЕИОННОГО ДЕТЕРГЕНТА ТВИН-20 НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ

ГОМОЛОГИЧНОГО И ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО ИФА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ И ИНТЕРЛЕЙКИ ИА-8

Неионный детергент Твин-20 широко используется в ИФА белков i биологических жидкостях для уменьшения неспецифических белок-белковьп взаимодействий. При добавлении 0.05% Твин-20 в инкубационный буфер н всех этапах 5N/5N-BapHaHTa Гм-ИФА ни рекомбинантный, ни природные ФНО не определялся вплоть до концентрации 2 нг/мл (рис. 3 А, Б). РФНО : концентрации более 2 нг/мл регистрировался вариантом 5N/5N Гм-ИФА присутствии Твина-20. Аналогичное воздействие Твина-20 обнаружено и дл.

других вариантов Гм-ИФА ФНО - 1G/1G и ЗС/ЗС (Рис. 4.). Напротив, для гетеролотичных комбинаций МКА 5N и ЮН в ИФА присутствие Твина-20 не оказывало значительного влияния на чувствительность определения ФНО (см. рис. 4). Показано, что диметилсульфоксид, а также Х-100 приводят к диссоциации ФНО до мономеров (Smith and Baglioni, 1987; Corti et al., 1992).

рФНО, нг/мл Разведение хультурального супернатанта

Рис. 3. Кривые титрования рекомбинаитного (А) и природного (Б) ФНО человека в присутствии (•) и отсутствии (о) 0,05% Твина-20. Каждая представленная точка является средним значением триплета.

2 нг/мл 8 нг/мл 8 нг/мл 2 нг/мл 0.3нг/мл

Рис. 4. Влияние Твина-20 на определение рФНО различными вариантами Гм- и Гт-ИФА.

Различное влияние Твина-20 на гомологичный и гетерологичный ИФА можно объяснить только преимущественной реализацией процесса диссоциации олигомерного антигена до мономерных субъединиц, происходящего под воздействием Твина-20. Чтобы это доказать, был поставлен следующий эксперимент. РФНО в концентрациях 10, 5, 2 нг/мл инкубировали 40 мин. в ФСБ-БСА или в ФСБ-БСА с добавлением 0,05% Твина-20, затем развели в 10 раз ФСБ-БСА и анализировали с помощью 5№5Ы Гм-ИФА в отсутствие Твина-20. На рис. 5. представлены результаты эксперимента.

1 0,8 g 0,6 d 0,4 0,2 0

В после ФСБ-БСА

инкубации О после ФС6-БСА-Твин-20 инкубации

1 нг/мл 0.S нг/мл 0.2 нг/мл

рФНО

Рис. 5. Влияние прекнкубации рФНО в растворе ФСБ-БСА, содержащем 0,05% Твин-20 на определение олигомерного ФНО 5N/5N-BapHaiiTOM Гм-ИФА.

Видно, что рФНО, преинкубированный в 0,05% Твине-20, менее эффективно определяется 5Ы/5Ы-вариантом ИФА, хотя и эффективнее, чем при использовании 0,05% Твина-20 на этапах анализа (см. рис. 3 А). Очевидно 0,05% Твин-20 сдвигает равновесие между тримером и мономером рФНО в сторону диссоциации тримера. В процессе анализа часть диссоциировавшего рФНО восстанавливает свою олигомерную структуру. Тем не менее, делая этот анализ достаточно быстро, можно наблюдать диссоциирующее воздействие Твина-20. Примечательно, что Гм-ИФА способен выявить этот эффект при низких концентрациях, антигена и в присутствии других белков.

В описанных ранее вариантах Гм-ИФА ФНО (Corti et al., 1992, De Gxoote et al., 1993; McLaughlin et al., 1990) авторы использовали-Твин-20 в процессе анализа. Возможно, отчасти и этим объясняется низкая чувствительность (110 нг/мл) приведенных вариантов Гм-ИФА, и, как следствие, невозможность определения олигомерного ФНО в биологической жидкости, где концентрации ФНО редко превышают 1 нг/мл даже при патологии.

Методом ковалентной сшивки белков в 1994 году было также показано, что рекомбинантный интерлейкин-8 человека (Мв 8 кДа) образует димеры (Schnitzel et al., 1994). Физиологическая роль олигомеризации ИЛ-8 еще не ясна (Rajarathnam et al., 1994). Чтобы проверить, является ли диссоциирующее воздействие Твина-20 на молекулу белка общим или исключительным для ФНО явлением, мы использовали данный детергент в Гм- и Гт-ИФА ИЛ-8; На рис. 6А и Б видно, что методом гомологичного ИФА можно количественно определять димер интерлейкина-8 в диапазоне концентраций 1-10 нг/мл. Более того, благодаря использованию гомологичного ИФА показано, что интерлейкин-8 существует в олигомерной форме в приведенном диапазоне концентраций. '

Влияние Твина-20 на определение рекомбинантного и природного ИЛ-8 гомологичным ИФА аналогично наблюдаемому нами для ФНО. Напротив, чувствительность Гт-ИФА, где в качестве иммобилизованных на подложке использовались те же, что и в Гм-ИФА МКА WS-4 /Ко et al., 1992/, даже

ИЛ-8, нг/мл Разведение культурального супернатанта

ИЛ-8, нг/мл

Рис. 6. Влияние Твина-20 на определение ИЛ-8. Кривые титрования рекомбинантного (А, В) и природного (Б) ИЛ-8 гомологичным (А, Б) и гетерологичным (В) ИФА в присутствии (•) и отсутствии (о) 0,05% Твина-20.

увеличилась в присутствии 0,05% Твина-20 (рис. 6 В). Исследования ещё раз подтвердили, что использование Твина-20 приводит к падению чувствительности именно гомологичного варианта ИФА.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГОМОЛОГИЧНОГО ИФА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАКТОРА

НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ И ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ ЕГО НЕКОВАЛЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ С РАСТВОРИМЫМ

РЕЦЕПТОРОМ

Чувствительность 51М/5К-варианта Гм-ИФА позволяет применить его для определения олигомерного ФНО в биологической жидкости. Плазму и сыворотку крови здоровых доноров проверили в цитотоксическом тесте на клеточной линии Ь929. Не содержащие природный ФНО (или содержащие менее 25 пг/мл, т.е. менее 1 единицы биологической активности) образцы плазмы и сыворотки тестировали с помощью 5Ы/5>1-вариа1Гга Гм-ИФА. При использовании ФСБ-БСА на всех стадиях ИФА наблюдалось большое количество ложноположительных результатов. Принимая во внимание, что неионные детергенты нежелательно использовать в Гм-ИФА, для устранения неспецифических взаимодействий были использованы буферные растворы

различной концентрации хлорида натрия. Увеличение концентрации №С1 до 0,ЗМ в растворе ФСБ-БСА, используемом на всех стадиях инкубации, снимало ложноположительную реакцию. Дальнейшее увеличение концентрации ЫаС1 до 0,5 М не оказывало влияния на результаты анализа. Проведен ряд экспериментов по оптимизации условий анализа. В результате подобраны условия /4/, при которых кривые титрования образцов биологических жидкостей, содержащих природный ФИО, и .стандарта имели одинаковые значения наклона их линейных участков. Коэффициент вариации в среднем был 1,2-4,5% и 5,5-7,9%, соответственно, для одной и той же и для разных серий опытов. Коэффициент корреляции во всех случаях >0,94. На рисунке 7 видно, что результаты определения природного ФНО методом Гм-ИФА хорошо согласуются с результатами цитотоксического тестирования.

Рис, 7. Корреляция определения ФНО методом Гм-ИФА (0,3M NaCl) и L929 цитотоксическим анализом в супернатантах культуры моноцитов (квадрат) я плазме крови (кружок). Коэффициент корреляции (г) =0,98.

Известно, что в биологической жидкости могут присутствовать не только мономеры и олигомеры ФНО, но и комплексы ФНО с растворимыми рецепторами /Engelbert et al., 1991/. МКА В5 и All, используемые для определения растворимого Р-55 рецептора ФНО с чувствительностью 60 пг/мл в гетерологичном "сэндвич'-варианте ИФА (рис. 8 А), применялись в Гм-ИФА рецептора в растворе ФБ-БСА-0,ЗМ NaCl и рецептора в присутствии рФНО, предварительно проинкубированных в таком же буфере. Оба МКА совершенно не выявляли рецептор в отсутствие ФНО в Гм-ИФА (рис. 8 А).

В присутствии в 10 раз меньшего по сравнению с рецептором молярного количества ФНО А11/А11-варианг Гм-ИФА по-прежнему не обнаруживал рецептор, тогда как вариант Гм-ИФА, основанный на использовании МКА В5, определял рецептор в диапазоне концентраций 1-20 иг/мл (рис. 8Б). Эти данные однозначно указывают на существование комплекса ФНО с рецептором, в составе которого находится более одной молекулы рецептора. Данные количества и молярное соотношение ФНО.рецептор соответствуют содержанию этих природных белков в плазме и сыворотке крови при

различной патологии.

<ч

Щ 1.6-

с

о 1.20.80.40.06.0 6.5 i.O 1.5 2.0 ' о 10 20 ' Р-55, нг/мл Р-55, нг/мл

Рис. 8. А- Титровочные кривые определения растворимого Р-55 рецептора ФНО методом Гт-ИФА с помощью иммобилизованных на твёрдой фазе МКА В5 и биотинилированных МКА All (В5/А11) и методом Гм-ИФА в отсутствие Твина-20 с помощью тех же МКА (В5/В5 и All/All). Б- определение Р-55 рецептора ФНО в присутствии рФНО гомологичным В5/В5 и AI 1/А11 ИФА.

В результате проведенных исследований, найдены условия проведения гомологичного ИФА природного олигомера ФНО в биологической жидкости без использования неионных детергентов в буфере для анализа. Использование вместо детергентов 0,ЗМ хлорида натрия позволило сохранить чувствительность метода, полученную ранее в опытах с рекомбинантным ФНО. Впервые разработанный вариант Гм-ИФА может быть применён для определения биологически активного природного ФНО в плазме и сыворотке крови человека при различной патологии. Использование метода гомологичного ИФА вместе с обычным двухцентровым (гетерологичным) ИФА позволяет обнаружить различные формы ФНО, в том числе и его комплексы с растворимым рецептором Р-55. С помощью несложного по исполнению метода Гм-ИФА можно получить дополнительную информацию об эпитопной специфичности используемых антител и, таким образом, более полно охарактеризовать их.

Диссоциация/олигомеризация ФНО - динамичный равновесный процесс, на который могут влиять растворимые рецепторы, лекарства, детергенты и пр., что может иметь биологическое значение в норме и при патологии. Не исключено, что именно комплексное измерение общего содержания ФНО- мономеров, олигомеров, растворимых рецепторов и их комплексов с ФНО может прояснить роль различных форм ФНО при патологии. Гм-ИФА - один из наиболее простых и удобных методов для обнаружения олигомерных форм растворимых цитокинов в физиологических жидкостях при низких, но биологически значимых концентрациях.

—■—В5/А11 -0-В5/В5 —А—А11/А11

см 1.2

у=0.049х+0.061 r=0.9S6, SD=0.061

рФНО, нг/мл 0.5 1

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Гомологичный вариант ИФА является чувствительным методом регистрации и определения олигомерных форм цитокинов. Показано, что методом гомологичного ИФА можно определять олигомерный ФНО в диапазоне концентраций 15-2000 пг/мл. Предложенный вариант гомологичного ИФА ФНО, основанный на использовании моноклоналышх антител 5Н превосходит по чувствительности наилучший из известных в 50 раз и не уступает гетерологичному варианту ИФА, основанному на использовании МКА 5N и ЮН /2,3,4, 5, 9, 14,15/.

2. Использование метода гомологичного ИФА позволило установить, что интерлейкин-8 человека существует в олигомерной форме в диапазоне концентраций 1-10 нг/мл/4, 5, 15/.

3. Показано отсутствие однозначной корреляции между чувствительностью Гм-ИФА и аффинностью или нейтрализующей активностью используемых моноклоналышх антител. Способность антител связывать олигомерный белок определяется главным образом их эпитопной специфичностью. Чувствительность определения олигомерного белка в гомологичном "сэндвич"-варианте ИФА может быть наряду с другими новым свойством (характеристикой) моноклоналышх антител и их эпитопной специфичности /1,4,7, 8,10,11,12,13,17/.

4. Показано, что неионный детергент Твин-20 в концентрации 0,05% значительно снижает чувствительность гомологичного ИФА фактора некроза опухолей альфа и интерлейкина-8 в отличие от гетерологичного. Данный эффект обусловлен сдвигом равновесия процессов диссоциации олигомерных молекул и ассоциации субъединиц цитокинов в сторону диссоциации, происходящего под воздействием Твина-20. Метод гомологичного ИФА в комплексе с гетерологичным ИФА может быть использован для оценки влияния различных агентов на изменение четвертичной структуры белков при низких концентрациях олигомерных белков и в присутствии других биомолекул /4, 5,14,15/.

5. Методом гомологичного ИФА можно определять как рекомбинантный, так и природный биологически активный олигомер ФНО в пикомолярных физиологически значимых концентрациях в плазме и сыворотке крови человека и культуральном супернатанте клеток. Метод чувствительного гомологичного ИФА может быть использован для регистрации нековалентных комплексов цитокинов с другими белками (растворимыми рецепторами). Применение метода гомологичного ИФА позволит получить ранее недоступные сведения о содержании и соотношении различных форм антигена в биологической жидкости в норме и при патологии/4, 5,6,14, 15,16/.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.А.В.Панютич, Н.В.Петевка, Л.А.Лях, Е.А.И1идаовская. Эпитопная характеристика рекомбинантного фактора некроза опухолей альфа с помощью моноклональных антител /Теор. и прикл. аспекты мол. биологии,-Москва, 1990,- с.23-32. Деп. в ВИНИТИ 13.02.90, №816-В90.

2. В.К.Оганезов, А.В.Майоров, А.В.Панютич, Н.В.Петевка, ЛА.Лях, Б.В.Пинегин, Ю.А.Порошина. Продукция фактора некроза опухолей альфа при тяжелом атопическом синдроме // Иммунология, 1991,- N 6. - с. 75-76.

3. Д.И.Габрилович, В.К.Оганезов, Г.К.Шепелева, Л.А.Авдеева, Л.В.Серебровская, В.В.Хабарова, А.В.Панютич, Л.А.Лях, Н.В.Петевка,

B.В.Покровский, Б.В.Пинегин. Гиперпродукция фактора некроза опухолей -альфа при ВИЧ-инфекции // Иммунология, 1992. - N4,- с. 10-12.

4. N. Petyovka, L: Lyakh, and N.N. Voitenok. Homologous ELISA for detection of oligomeric human TNF: properties of the assay // J. Immunol. Meth., 1995. - vol. 186,- p. 161-170.

5. N.Petyovka, L.Lyakh, N. Voitenok. Homologous ELISA for quantification of oligomeric forms of human TNF and IL-8 // Environment Protection. International Regional Seminar. - Uzhgorod, 1997. -vol.2, p. 251-255.

6. Н.В.Петевка, Н.Н.Нашкевич, И.И.Тихонов, Т.С.Колесникова, С.Т.Коледа,

C.С.Бутенко, Т.М.Дорошенко, Н.Н.Войтенок. Иммуноферментный метод определения растворимого Р55 рецептора ФНО человека // Клиническая аллергология и иммунология. Иммунодиагностика и иммунореабилитация. Сб. трудов 2-й Международной конференции и 1 съезда БААКИ. / Минск-Витебск, 1998,- с. 193-195.

7. Л.А.Лях, А.В.Панютич, Е.А.Шидловская, Н.ВЛетевка, Т.О.Гаврилина. Нейтрализующие свойства моноклональных антител к фактору некроза опухолей альфа человека // Тез. докл. 1 иммунол. съезда Белоруссии. -Минск, 1990, - с.36.

8. A.V.Panyutich, L.AXyach, N.V.Petevka, E.AShydlovskaya. The interaction between human tumor necrosis factor-a and monoclonal antibodies //Molecular Factors of Hematopoiesis and Stem. Cell. Abstracts of Symp.-M., 1990,-p.29.

9.А.В.Панютич, Л.А.Лях, , Н.В.Петевка, Г.Л.Идельсон, Е.А.Панютич, Н.Н.Войтенок. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения фактора некроза опухолей-альфа человека / В сб. "Современные направления создания медицинских диагностикумов". - Москва, 1990. с. 35.

10. АВ.Панкшга, Н.В.Петевка, Л.А.Лях, Е.А.Шидловская, Н.Н.Войтенок. Оптимизация иммуноферментного определения фактора некроза опухолей-? человека на основе анализа эшггопной специфичности моноклональных антител. // 3-й Всес. съезд гематологов и трансфузиологов (октябрь 1991 г., г.Киров). Тез. докл. -М., 1991,-т.И. -с.371.

11. L.A.Ly2kh, N.V.Petyovka, A.V.Panyutich, Е. A.Shydlovskaya & N.N.Voitenok. Chaiacterizaticn of epitope specificity and neutralizing capacity of monoclonal

antibodies against a human tumour necrosis factor-a // Med. Biotechnology Immunization & AIDS. Abst. Intern. Conf. - Leningrad, 1991. - P5-13.

12. N.V.Petyovka, L.A.Lyakh, A.V.Panyutich, L.N.Shyngarova, V.G.Korobkc Structure-function analysis of human TNF-a // Structure & Function of Regulatoi Polypeptides. Abst. of Symp. - Moscow, 1992. - N1. - p.61.

13. Lyudmila Lyakh, Natalia Petyovka, Alexander Panyutich, Elena Shydlovskayi Nikolai Voitenok. Monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor alphi properties and application for immimoassays //Abst. of 8 International Congress с Immunology. - Budapest, 1992. - p.150.

14. N. Petyovka, L. Lyakh, and N. Voitenok, Sensitive Homologous ELISA fc Detection of Oligomeric Recombinant And Natural Human TNF // Limphokine an Citokine Reseach, 1993. -vol.12, 5. -p.369. - Abst.

15. Petyovka N.V., Lyakh L.A., and Voitenok N.N. Demonstration of oligomeri structure of human TNF and IL-8 at physiological concentration by homologou ELISA // AIDS, Cancer and Related Problems. Abst. 4-th International Conference - St.Petersburg, 1996. - p.94.

16. N. Nashkevich, S.Koleda and N.Petyovka. Detection of TNF-alpha\soluble TNI receptor (P55) complex by homologous ELISA //Abst. of Fourth John Humphre; Advanced Summer Programme in Immunology. - Pushchino, 1998. - p.52.

17. A.c. 1747484 СССР, МКИ С 12 N 5/00, С 12 P 21/08. Штамм гибридньг культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для получение моноклональных антител к рекомбинантному а-фактору некроза опухолей человека. /Б.А.Шидловская, А.В.Панютич, Л.А.Лях, Н.В.Петевка Н.Н.Войтенок, Н.И.Мисуно, Т.С.Колесникова,- Опубл. в Б.И., 1992, N 26.

РЕЗЮМЕ

Петёвка Наталья Васильевна «ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ГОМОЛОГИЧНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ I КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОЛИГОМЕРНЫХ ФОРМ ЦИТОКИНОВ»

Ключевые слова: гомологичный иммуноферментпый анализ, факто[ некроза опухолей, ннтерлейкин-8, комплекс ФНО-рецептор моноклональные антитела, эгоггопный анализ, иммупоблотгинг.

Предметом исследования является метод твердофазного "сэндвич"-варианта иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на использован!» как в качестве иммобилизованных на носителе, так и в качестве мечены> одних и тех же моноклональных антител, распознающих единственные эпитоп на субъединице белка (гомологичный ИФА). Цель работы характеристика свойств гомологичного ИФА, условий его применения щи изучения и измерения олигомерных цитокинов: фактора некроза опухолек альфа (ФНО) и интерлейкина-8, а также адаптация метода для измерения

низких (физиологических) концентраций биологически активного олигомерного ФНО в физиологических жидкостях. В работе использованы методы твердофазного иммуноферментного и радиоиммунного анализа, электорфореза белков и иммуноблоттинга, цитотоксический тест на клеточной линии L929. Использованы приборы вертикального электрофореза и электропереноса белков фирмы LKB, спектрофотометры UVcord (LKB) и Reader Microelisa system (Organon Teknika), гамма-счётчик Behring Gamma Counter 1612 (Behring).

Показано, что методом гомологичного ИФА можно определять олигомерный биологически активный ФНО в диапазоне концентраций 152000 пг/мл. Предложенный вариант гомологичного ИФА ФНО, основанный на использовании моноклональных антител 5N, превосходит по чувствительности наилучший из описанных ранее в 50 раз. Методом гомологичного ИФА можно количественно определять димер интерлейкина-8 в диапазоне концентраций 1-10 нг/мл. Обнаружено значительное уменьшение чувствительности гомологичного ИФА в присутствии 0,05% детергента Твин-20, причиной которого является диссоциация олигомерного белка до мономеров, происходящая в процессе анализа. Определены наиболее важные физико-химические свойства антител, используемых в гомологичном ИФА. Впервые показана возможность регистрации нековалентных комплексов ФНО с растворимой формой его рецептора Р-55 с помощью ИФА. Вариант гомологичного ИФА адаптирован для количественного определения олигомерного ФНО в физиологически значимых концентрациях в плазме и сыворотке крови человека. Использование разработанных вариантов ИФА позволит получить ранее недоступные сведения о содержании и соотношении различных форм антигена в биологической жидкости в норме и при патологии.

РЭЗГОМЭ

Пядёука Наталля Васшеуна «ВЫКАРЫСТАННЕ МЕТАДУ ГАМАЛАГ1ЧНАГА 1МУНАФЕРМЕНТНАГА АНАЛВУ ДЛЯ ВЫВУЧЭННЯ I КОЛЬКАСНАГА ВЫЗПАЧЭННЯ АЛ1ГАМЕР11ЫХ ФОРМ ЦЫТАКШАУ»

Ключаеыя словы: гамалапчиы ¡мунаферментны анал1з, фактар некрозу пухлш, ¡нтерлейкш-8, комплекс ФНП-рэцэптар, манакланальныя антыцелы, эттопны анал1з, ¡мунаблоцшг.

Прадмэтам даследавання з'яуляецца метад цвёрдафазнага «сэндв1ч»-варыянту ьчунаферментнага анализу (1ФА), ям заснаваны на выкарыстоуванш як у якасщ ¡мабшзаваных на носьбще, так i у якасщ мечаных адных i тых жа манакланальных антыцелау, яюя распознают. адзшы эттоп на субадзпщы бялку (гамалапчны 1ФА). Мэта работы: характарыстыка уласщвасцяу

гамалапчнага 1ФА, умовау яго выкарыстоування для вывучэння i вымярэння ашгамерных цытакшау: факгару некрозу пухлш альфа (ФНП) i штерлешану-8, а таксам а адаптация метаду для вымярэння шзюх канцентрацый бшлапчна актывнага ашгамернага ФНП у фiзiялariчныx вадкасцях. У рабоце выкарыстаны метады цвёрдафазнага i радьшмуннага аналву, электрафарезу бялкоу, i ¿мунаблоцшгу, цытатакачны тест на лнш L929. Выкарыстаны прыборы вертыкальнага электрафарезу i электрапераносу бялкоу (LKB), спекграфатометры Uvcord (LKB) i Reader Microelisa system (Organon Teknika), Behring Gamma Counter 1612 (Behring).

Выявлена, што метадам гамалапчнага 1ФА можна вызначаць ал1гамерны ФНП у дыяпазоне канцентрацый 15-2000 пг/мл. Прапанаваны варыянт гамалапчнага 1ФА ФНП, заснаваны на выкарыстанш манакланальных антыцелау 5N, перавышае па адчувальнасщ найлешлы сярод атсаных раней у 50 разоу. Метадам гамалапчнага 1ФА магчыма колькасна вызначаць дымер штерлейкшу-8 у дыяпазоне канцэнтрацый 1-10 нг/мл. Выявлена вялкае паменьшэнне адчувальнасщ гамалапчнага 1ФА у прысутнасщ 0,05% дэтэргента Твш-20, прычынай якога з'являецца дысацыяцыя алиамернага бялку да манамерау, якая адбываецца у працэсе анагазу. Вызначаны найбольш адметныя ф1зыка-х1м1чныя уласщвысщ антыцелау, што бьш выкарыстаны у гамалалчным 1ФА. Упершыню паказана магчымасць рэпстрацьп некавалентных комплексау ФНП з растваральным рэцэптарам Р-55 з дапамогай 1ФА. Варыянт гамалаг1чнага 1ФА адаптаваны дзеля колькаснага вызначэння ал^гамернага ФНП у ф1'з1ялапчна значных канчэнтрацыях у плазме i сыворатцы крыв1 чалавека. Выкарыстаинс распрацаваных варыянтау 1ФА дазволщь атрымаць раней недастушшя вести аб утрыманш i суадносшах розных формау антыгену у б^ялалчных вадкасцях у норме i пры паталоrii.

ABSTRACT

Petyovka Natalia "USING THE HOMOLOGOUS ENZYME-IMMUNOASSAY FOR STUDY AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF OLIGOMERIC FORMS OF CYTOKINES"

Key words: homologous ELISA, tumor necrosis factor; interIeukin-8, oligomeric forms, complex TNF-receptor, monoclonal antibodies, epitope analysis, immunoblotting.

The present study was undertaken to develop a sensitive homologous enzyme-linked immunosorbent assay (Hm-ELISA) for the detection of oligomeric TNF, to characterise the properties of the assay system and to solve the problems related to the plasma human tumor necrosis factor-a (TNF) measurement.

In order to quantify oligomeric TNF, we developed a sensitive homologous ELISA consisting of the same monoclonal antibody (MoAb) for both solid and liquid phase. Different anti- TNF MoAb have been compared in terms of their effectiveness in Hm-ELISA, affinity, neutralisation capacity and epitope specificity. The data suggest, that effectiveness in the Hm- ELISA may represent a novel characteristic of MoAb. Among MoAbs tested, 5N was capable of recognising oligomeric TNF in the Hm- ELISA with a detection limit of 15 pg/ml. Furthermore, using Hm-ELISA against human TNF and interleukin-8 (EL-8) we have demonstrated that these cytokines, oligomeric in physiological solutions, were converted into monomelic forms in the presence of non-ionic detergent Tween-20. High salt buffer was employed to abrogate a non-specific false positive reaction in the Hm-ELISA found in nearly half plasma and serum for healthy subjects. Finally, a good correlation between the Hm-ELISA and the L929 bioassay was observed for natural and recombinant TNF measured in human plasma. We have demonstrated a detection of complex TNF with P-55-receptor by sandwich-ELISA.

ПЕТЁВКА Наталья Васильевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ГОМОЛОГИЧНОГО ИММУНОФЕШЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОЛИГОМЕРНЫХ ФОРМ

ЦИТОКИНОВ

Специальность 03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано к печати «19» октября 1998 г. Формат 60 х 90 1/16 Бумага типографская. Печать офсетная. Бесплатно Объём 1,5 п.л. 06 уч.-иэд. лит. Тираж 100 экз. Заказ № 1М

Лицензия ЛП № 20 от 20 августа 1997 года

Институт физики им. Б.И. Степанова Национальной АН Беларуси

220072, г.Минск, пр-т Скорины, 70

Отпечатано на резографе Института физики им. Б.И. Степанова НАНБ