Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Митохондриальная креатинкиназа: некоторые свойства в растворе и в митохондриях

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Митохондриальная креатинкиназа: некоторые свойства в растворе и в митохондриях"

РГ6 од

МаСК(ЖСКИЙсОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВМЭЦИИ Й ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ 'ОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА.

Биологический факультет

На правах рукописи

РЫТИКОВА НАТАЛИЯ СТАНИСЛАВОВНА

УДК 576.311.347:577.153.36.

ЭТОХОНДРИАЛЬНАЯ КРЕАТИНКИНАЗА: НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА В РАСТВОРЕ И В МИТОХОНДРИЯХ.

03.00.04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского Государственного Университета им.М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: ст.н.с., д.б.н. Т.Ю. Липская Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник В.И. Муронец

2. Доктор химических наук, "

ведущий научный сотрудник Л.М.Гинодыан

Ведущая организация - Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН.

Защита состоится " /У 1996 г

час_мин на

заседании Специализированного -Совета Д.053.05.32. при Московском Государственном. Университете им.М.ВЛомоносова по адресу: 1-17219, г. Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического

у

факльтета МГУ.

Автореферат разослан "9 " 996 г.

Ученый секретарь Специализированного . Совета Д.053.05.32,

канд.биол.наук М.В. Иванов

в

Характеристика работы.

Актуальность проблемы. Креатинкиназная система, включающая митохондриальный и цитоплазматические изоферменты креатинкиназы, принимает участие в энергетическом обеспечении клеток. Было показано, что в скелетных мышцах и сердце система креатин-креатинфосфат выполняет роль не только депо энергии, но и роль переносчика энергии (Meyer et al, 1984). Установлено, что в митохондриях сердца максимальная скорость синтеза креатинфосфата не превышает максимальную активность окислительного фосфорилирования (Vial et al 1972, Jacobus, Leninger 1973, Saks et al 1975). В связи с этим кажется вероятным, что эффективность процесса передачи энергии в мышечной ткани зависит от того, насколько эффективно осуществляет свою функцию . митохондриальная креатинкиназа (ми-КК). В настоящее время нет ясности в вопросе о том, какие механизмы обеспечивают высокую каталитическую эффективность ми-КК. Одни авторы связывают эффективность работы этого фермента с созданием в области активного центра локальных концентраций адениловых нуклеотидов (Erickson-Viitanen el al 1982, Saks et al 1985, Jacobus, 1985), другие - с возможностью обратимого связывания ми-КК с мембранами митохондрий и взаимного перехода олигомерных форм фермента (Lipskaya et al 1989, Schlegel et al 1990, Wyss et al 1992). В связи с важностью той роли, которую выполняет ми-КК в энергетическом метаболизме возбудимых тканей, изучение свойств этого фермента и путей регуляции его активности является актуальной задачей.

Цел& работы. Ранее в нашей лаборатории был проведен ряд X

исследований, посвященных изучению свойств олигомерных форм ми-КК в растворе и при связывании с мембранами митопластов. В связи со

сказанным выше, целью настоящей работы было: продолжить изучение свойств олигомерных форм ми-КК, а также исследовать возможности регуляции активности этого фермента в нативных митохондриях. Исследование было выполнено на ми-КК из сердца быка и крысы, а также из красных скелетных мышц голубя. В процессе работы в наши задачи входило: 1) изучение четвертичной структуры ми-КК; 2) определение кинетических параметров обратной креатинкиназной реакции в растворе и в митохондриях сердца быка; 3) совершенствование метода выделения ми-КК из митохондрий грудной мышцы голубя; 4) посадка димера ми-КК на мембраны митохондрий грудной мышцы голубя; 5) исследование возможности диссоциации октаыера ми-КК на димеры в нативных митохондриях.

Научная новизна работы. Октамерное строение высокомолекулярного олигомера ми-КК доказано с помощью сшивания его субъединиц диыетилсуберимидатоы (ДМСИ).' С .помощью сшивающих .-бифунк- . цнональных реагентов, а также метода электронной микроскопии установлено, что октаыер имеет квазисферическую структуру.

При определении температурной зависимости кинетических параметров обратной креатинкиназной реакции для фермента в растворе и в митохондриях установлено, что Км для АДФ для очищенной ми-КК и для ми-КК в митохондриях равны и не изменяются с температурой в отличие от Кы для КрФ, температурная зависимость которых Быражается различающимися кривыми с минимумом в области 23-25°С. На основании полученных экспериментальных данных сделан вывод, что во время определения кинетических параметров ми-КК была связана с мембранами митохондрий в условиях наших экспериментов.

Проведена модификация метода выделения ми-КК из митохондрии грудной мышцы голубя, позволившая увеличить выход и удельную активность фермента.

Разработан метод быстрого анализа олигомерных форм ми-КК в растворе с использованием ультрафильтрации на мембране YM-100.

В опытах с посадкой димера ми-КК на мембраны митохондрий, которые были предварительно лишены креатинкиназной активности, показано, что не только октамер может связываться с мембранами митохондрий, но и димер, который при связывании ассоциирует до октамера. Полученные данные говорят о том, что равновесие на мембране между димером и октамером сильно смещено в сторону октамера.

Проведено исследование .возможности диссоциации октамера ми-КК на димеры в нативных митохондриях. Впервые показано, что в присутствии физиологических концентраций АТФ и Кр, обеспечивающих протекание прямой креатинкиназной реакции, и при физиологических " значениях ионной ' силы ми-КК частично диссоциирует до • димера. Разработан метод анализа олигомерных форм ми-КК, присутствующих в нативных митохондриях, позволяющий проследить за кинетикой диссоциации октамера на димеры в митохондриях. На основании полученных экспериментальных данных делается вывод, что взаимные переходы олигомерных форм могут происходить не только в растворе, но и в нативных митохондриях с неразрушенной наружной мембраной; эти переходы могут выступать в качестве регулятора активности ми-КК in vivo.

Практическое значение. Креатинкиназная система играет важную роль в энергетическом • обмене тканей, в частности, миокарда. Изучение свойств мн-КК, исследование возможных путей регуляции ее активности позволяет понять принципы функционирования фермента в нормальных условиях, а также при различных патологиях, и на их основе разрабатывать новые методы диагностики и лечения заболеваний,

3

связанных с энергетической недостаточностью (ишемия миокарда, мышечная дистрофия). Практическое значение имеют подобранные в работе условия ввделения митохондрий из грудной мышцы голубя, сшивания субъединиц, фермента в присутствии ДМСИ, анализа олигомерных форм ми-КК в растворе с использованием ультрафильтрации на мембране УМ-100, которые могут быть использованы в работе других научно-исследовательских лабораторий. ' %

Апробация работы. Результаты исследования были доложены на семинаре кафедры биохимии МГУ, на 6-ой Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси,1989), на 2-ом Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991).

Публикации. Результаты исследования изложены в 4 публикациях. Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (238 источников). Работа изложена стр. машинописного текста и включает 17 таблиц и 27

рис.

Экспериментальная часть.

Результаты исследования и их обсуждение.

Олигомерный состав и четвертичная структура ми-КК из митохондрий сердца быка. К началу нашего исследования не было единого мнения о степени олигомерности ыи-КК, точных данных о пространственной структуре этого фермента. Особенно были противоречивы сведения, касающиеся ми-КК из сердца быка. Так, одни авторы считали, что это-октамер (Jacobs, Graham 1978), другие - гексаыер (Farreli et al 1972, Hall et al 1979). Для уточнения числя субъединиц в высокомолекулярном олкгомере ми-КК из сердца быка мы сшивали субъединицы в молекуле фермента с помощью ДМСИ в течение 5-90 мин. Реакцию останавливали добавлением гидроксиламнна (pH 8,5) и затем проводили электрофорез в присутствии ДСН. Условия сшивания подобрали так, чтобы оно проходило достаточно глубоко. При электрофорезе были

обнаружены 8 белковых полос, причем увеличение времени сшивания приводило к исчезновению низкомолекулярных полос и к накоплению белка в 7-ой и 8-ой полосах (рис.1). Для доказательства того, что все 8

Рис.1. Результаты электрофореза в 5% ПААГ в присутствии ДСН олигомера ми-КК после сшивания 20 мМ ДМСИ. а,б - стандартные белки: I - карб-ангидраза (30000), П - лактат-дегидрогеназа (36000), 111 - оваль-бумин (43000), IV - каталаза (60000), V - альбумин (67000), VI - фосфорилаза Б (94000), VII -ферритин (220000), VIII - тирео-глобулин (330000); в,г.д.е - ми-КК; время сшивания: в - 10 мин, г - 20 мин. д - 30 мин; 1-8 - сшитые олигомерные формы ми-КК; е -контроль без сшивания. Температура сшивания 30"С.

белковых полос образуются в результате сшивания только внутри-олигомерных контактов, мы поставили опыт, в котором ми-КК сшивали ДМСИ, а затем проводили ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Фермент после сшивания 'имел такую же константу седиментации (12S), как и несшитый олигомер. Кроме того, при электрофорезе фермента, взятого из области пика сшитого олигомера на электрофореграмме обнаружились 7 белковых полос, расположение которых соответствовало расположению со 2-ой по 8-ую белковых полос предыдущих опытов. • Учитывая, что обнаруженные полосы могли образовываться только за счет сшивания внутриолигомерных контактов и что общее число полос равно 8, мы заключили, что высокомолекулярный олигомер ми-КК из сердца быка является октамером. Впоследствии было

а б в г Д е

.8

VIII-VII - - а т i i i i i

VI- ш -2

V-IV- - ш

III- в -i : В

II-

I-

показано, что высокомолекулярный олнгомер ми-КК из других источников также представляет собой октамер (Font et al 1987, Schlegel, Wyss et al 1988, Schlegel, Zurbriggen et al 1988). Вероятно, октамерное строение является отличительным признаком ми-КК.

Также мы использовали метод сшивания бифункциональными реагентами для выяснения пространственного расположения субъединиц в октамере ми-КК из сердца быка (Lipskaya et al 1989). Октамеры различных белков могут иметь плоскую или квазисферическую (кубическую) форму. Планарные октамеры бывают полностью гетерологическими или полностью изологическими, тогда как квазисферические формы состоят из двух четырехчленных гетерологических колец с "заслоненной" (куб) или "шахматной" упаковкой. Полностью гетерологический октамер содержит только один тип контактов между субъединицами, а полностью изоло-гический - два типа контактов (Фридрих 1986). Структурной единицей октамера ми-КК является димер,- поэтому в случае пленарной упаковки субъединиц октамер должен быть полностью изологическим, т.е. должен обладать двумя типами областей контакта между субъединицами: внутридимерными и междимерными. В этом случае при электрофорезе интенсивность четных белковых полос должна была бы превосходить интенсивность нечетных белковых полос, т.к. при сшивании субъединиц разные области контакта, вероятно, будут сшиваться с разной скоростью (Фридрих 1986). Сшивание субъединиц ми-КК из сердца быка проводили тремя бифункциональными реагентами, образующими гомологичный ряд: ДМСИ, диметилпимелимидат (ДМПИ), диметиладипимидат (ДМАИ). Мы ■установили, что при сшивании субъединиц ми-КК с помощью ДМСИ в течение разных промежутков времени число и интенсивность белковых полос, выявленных при электрофорезе в присутствии ДСН, изменяются во

времени равномерно, что больше соответствует гетерологической планарной упаковке, которая для ми-КК невозможна. При сшивании субъединиц ми-КК с помощью ДМПИ и ДМАИ число обнаруживаемых белковых полос составляло'6 и 4 соответственно, причем повышение концентрации этих веществ и удлинение времени инкубации не изменяло картины. Полученные результаты говорят о том, что сшивание ми-КК разными бифункциональными реагентами проходит не до конца. Накопление 8-ой полосы наблюдалось только в случае ДМСИ. Между тем, -если бы ми-КК была.полностью изологическим планарным октамером, то при. сшивании различными бифункциональными реагентами обнаружились бы 8 полос, если число сшитых субъединиц превысило две, т.к. в случае планарной упаковки число различных областей контактов не больше двух.

При сшивании межпротомерных контактов -в димерах ми-КК мы установили, что тогда как ДМСИ и ДМАИ сшивают внутридимерные контакты, хотя и с разной скоростью, ДМПИ ке сшивает их. Следовательно, в случае планарной структуры октамера сшивание в присутствии ДМПИ должно было бы давать только мономеры или мономеры и димеры. Таким образом, из этой части нашей работы мы сделали вывод, что октамер ми-КК обладает квазнсфернческой конфигурацией. Этот вывод был подтвержден с помощью метода электронной микроскопии. Совместно с сотрудником Института кристаллографии В.Я. Стельмашуком мы сделали электронную микроскопию очищенного препарата ми-КК. Электронномикроскопическая картина, по всей зидимости, соответствует квазисферической структуре с "шахматной" упаковкой, построенной их двух планаркых тетргмеров, субъединицы которых смещены одна относительно другой. Найденная паки структура с расположением субъединиц в двз слоя является типичной для изученных к настоящему

. времени октамерных белков (Фридрих 1986). Аналогичные данные одновременно с нами получили другие авторы, сделавшие электронные микрофотографии ми-КК из сердца и мозга цыпленка (Schlegel, Zurbriggen et а! 1988, Schnyder et al 1988, Schlegel, Wyss et al 1988). По данным

авторов, октамер ми-КК из обоих источников *-представляет собой

>

перфорированный куб с центральной полостью, образованной тремя взаимоперпендикулярными каналами, проходящими через центры параллельных граней. Вывод о кубическом строении октамера был основан на том, что на электронных микрофотографиях отсутствовали боковые проекции. Таким образом, вероятно, в пределах октамеркой структуры в креатинкиназах из. разных источников возможны некоторые различия в расположении субъединиц. ^

Определение кинетических параметров обратной креатинкиназной реакции в растворе и в митохондриях сердца быка. Ранее в нашей лаборатории были получены экспериментальные доказательства- кинети-4 ческой неоднородности субъединиц ми-КК, связанной с мембранами митохондрий: было найдено, что в прямой креатинкиназной реакции фермент имеет две константы Михаэлиса для MgAT<t> (Молокова 1985). Так как кинетика обратной креатинкиназной реакции в тех же условиях подчинялась закону Млхаэлиса-Ментен, то в связи с этим оставалось неясным - вызывают ли субстраты обратной реакции солюбилнзацию ми-КК с мембран митохондрий, или во время протекания обратной реакции ми-КК остается связанной с мембранами, но эта связь с мембраной не влияет на кинетические свойства фермента. Чтобы различить эти 'две возможности/ мы исследовали температурную зависимость обратной реакции для очищенного фермента и для ми-КК в свежевыделенных митохондриях. Метод определения температурной зависимости кине-

тнческих. параметров позволяет найти незначительные различия. Для исследования температурной зависимости активности ми-КК пробы помещали в прибор для создания градиента температур - термоград. Градиент температур в опытах охватывал интервал от 13 до 40 °С, причем различия между двумя соседними точками составляли 1-2°С. Время инкубации проб составляло 0,5-5 мин, реакцию останавливали добавлением к пробам раствора п-ХМБ. Активность КК определяли по количеству образовавшегося Кр. На рис.2 представлена температурная зависимость обратной креатинкиназной реакции при постоянных концентрациях АДФ и КрФ. Видно, что все кривые имеют перегиб, причем для ми-КК в растворе он лежит в области 23-25°С, а для ми-КК, связанной с мембранами митохондрий - в области ЗЗ'С. Учитывая возможность, что существование перегибов связано с изменением с температурой констант Михаэли са для субстратов реакции, мы определили кинетические параметры обратной креатинкиназной реакции при нескольких температурах. Мы. нашли, что К„ для М^АДФ у очищенной ми-КК и ми-КК в митохондриях колеблются вокруг одной и той же средней величины и не обнаруживают явной тенденции к изменению с температурой. В то же время температурная зависимость Км для КрФ выражается различающимися кривыми с минимумом в области 23-25°С (рис.3). Различия в константах Михаэлиса для КрФ у ми-КК в растворе и в митохондриях особенно заметны при температуре выше 30"С, причем для ми-КК в растворе К„ для КрФ растет быстрее, чем для ын-КК в митохондриях. Мы установили, что появление перегиба' на графиках температурной •зависимости связано именно с изменением Км для КрФ с ростом температуры, т.к. увеличение концентрации КрФ устраняло перегибы. Подтверждением правильности нашего вывода служит также линейный

1п уд. акт.

6-

2-

о-

-2

Рис. 2. Температурная зависимость . , обратной креатинкиназной реакции при фиксированных концентрациях АДФ и КрФ; 1 - очищенная ЮС, 2 - экстракт из митохондрии, 3 - митохондрии. Среда инкубации содержала 10 мМ имидазол-НС! (рН 7,4), 3,3 мМ М^г, 0,25.М сахарозу, 10 иМ ка, 0.2 иМ ДГГ, 4,5 мМ КрФ, 1 мМ АДФ, а также 10^М ротенон, 50 мкМ АР5А, 2 мкг олиго/мг белка митохондрии, если в среду инкубации добавля-| ли экстракт из митохондрий или

суспензию митохондрии.

1400

1000'

600-

33

24

15 с*

(мкМ)

10-

20

30

■«мЛДФ

(мкМ)

80 60 40

20

©

10

20

•40

Рис.3. Зависимость констант Михаэлиса для субстратов

обратной креатинкиназной реакции от температуры; • - очищенная ми-КК, © - ми-КК в митохондриях.

> 6,0. п

3,0

-2-

Рис.4. Температурная зависимость максимальной скорости обратной креатинкиназной реакции

1 - очищенная ми-КК

2 - тяжелые митохондрии

3,3 3,4 3.5'Ü/flxlO3

характер зависимости lnVMaKC от обратной температуры (рис.4). Смещение точки перегиба для ми-КК митохондрий Ъ область более высоких температур (рис.2), вероятно, связано с тем, что К„ для КрФ для ми-КК в митохондриях увеличиваются с температурой менее резко, чем для ми-КК в растворе- (рис.3). - -

Используя уравнение Аррениуса, из наклона кривых, приведенных на рис.4, мы рассчитали энергию активации обратной креатинкиназной реакции. Мы нашли, что энергия активации для- очищенной ми-КК и ми-КК в митохондриях совпадают и приблизительно равны' 100 кДж/моль. Найденные энергии активации превосходят величину энергии активации, известную по литературным источникам для цитоплазматических форм креатинкиназы (40-65 кДж/ноль) и значительно ниже энергии активации для ми-КК из скелетных мышц и сердца человека (130-140 кДж/моль) (Hall et al 1977, Stein et al 1982). Отсутствие разницы в величинах энергии активации для ми-КК в растворе и в митохондриях подтверждает правильность сделанного ранее в нашей лаборатории вывода о том, что

0

связывание с мембранами деэнергизованных митохондрий не влияет на величину Умакс крелтинкиназной реакции (Липская 1989).

Из всей совокупности полученных данных мы сделали вывод; что во время определения кинетических параметров обратной креатинкиназной реакции ми-КК была связана с мембранами митохондрий в условиях наших экспериментов. Об этом свидетельствует смещение точки перегиба на графиках, полученных для ми-КК в митохондриях, а также небольшие различия в характере температурной зависимости Км для КрФ для ми-КК в митохондриях и в растворе. В то же время полученные результаты свидетельствуют о незначительном изменении кинетических параметров. В связи с этим встает вопрос - с чем связано различие в кинетике прямой и обратной реакций для ми-КК, связанной с мембранами митохондрий? Если допустить возможность того, что во взаимодействии с мембранами митохондрий принимают участие субъединицы только одного планарного тетрамера, то это может нарушить исходную симметрию и равноценность субъединиц в октамере и привести к появлению кинетических различий между субъединицами, связанными и не связанными с мембраной. Возможно, что неэквивалентность субъединиц приводит к меньшим различиям в кинетических параметрах для обратной реакции шш к такому их сочетанию, что эти различия не удается выявить с помощью кинетического анализа. Другое возможное объяснение заключается в том, что субстраты прямой и обратной реакций по-разному изменяют свойства внутренней мембраны митохондрий и это отражается в различном харак-1 тере изменений кинетических параметров для прямой и обратной реакций.

Модификация метода выделения ми-КК из грудной мышцы голубя. Метод выделения и очистки ми-КК из митохондрий грудной мышцы голубя, разработанный ранее в нашей лаборатории, включал гипотоническую

А280.. усл.ед.

Акт., усл.ед.

Агво, усл.ед. 40-

20-

Акт., усл.ед. ■ 200'

обработку митохондрий, экстракцию ми-КК 0,25 М KCl, концентрирование экстракта на колонке с фосфатом целлюлозы и последующую очистку методом гель-фильтрации на колонке- с сефа-крилом S-300 (рис.5а) (Рыбина 1986). Однако на последней стадии очистки при элюции с колонки с сефакрилом S-300 сразу за пиком ми-КК следовал

пик примесного белка, который

/

загрязнял наш фермент (рис.5а). Сделав три модификации первоначального-метода выделения: 1)-замену второй гипотонической обработки с помощью 0,25 мМ ДТТ на экстракцию 30 мМ трие-.на р'н 7,4, 0,25 мМ ДТТ; 2) введение дополнительной стадии центрифугирования до нанесения на ионо-обыенную колонку; 3) введение ступенчатого градиента ионной силы: 0,12 и 0,25 М KCl при элюции ми-ЮС с колонки с фосфатом целлюлозы, мы в значительной степени освободились от примесных белков, следующих до и после ми-КК при элюции с гель-фильтрационной колонки (рис.56). Все указанные усовершенствования метода выделения привели к повышению в 2,5 раза

15

35 55

№№ фракций

Рис. 5. Профили элюции ми-КК с колонки с сефакрилом Б-ЗОО.

а) первоначальный метод

б) модифицированный метод -

-белок,— ахтнзность КК

ЕЯ - часть пика белка, использованного в качестве препарата очищенной ми-КК /

степени очистки и удельной активности выделяемого фермента. Активность фермента определяли по начальной скорости реакции рН-метрически при +30°С. Метод в его последнем варианте позволь " получать ми-КК с удельной активностью 289 ед/мг белка и с выходом 18% от активности в экстракте из митохондрий в 0,25 М KCl. Полученный нами фермент был гомогенен согласно данным электрофореза в присутствии ДСН при нанесет и на гель до 35 ыкг белка ми-КК. Сопоставление разработанного нами метода с другими известными в настоящее время методами выделения ми-КК из других источников (Roberts, Grace 1980, Blum et al 1983, Schlegel et al 1988) показывает, что особенностью нашего метода является доступность использованного оборудования, малое число стадий, отсутствие денатурирующих воздействий в процессе выделения, а также высокая удельная активность и высокий выход фермента.

Посадка димера ми-КК на мембраны митохондрий грудной мышцы голубя. Следующая часть нашей работы была-посвящена поискам ответа на вопрос: может ли димер ми-КК связываться с мембранами митохондрий и претерпевает ли он превращение в другие олигомерные формы после связывания с мембранами митохондрий. К моменту начала нашего исследования в лаборатории Виала было показано Марциллатом и Куеменером с соавт. (Marcillat et al 1987, Quemenetir et al 1989), что если добавить к предварительно лишенным креатинкиназы митохондриям с разрушенной наружной мембраной (из сердца свиньи или кролика) смесь димера и октамера ми-КК, то с мембранами связывается только октамер. Отсюда был сделан вывод, что октамер - это единственная олигомерная форма, которая может быть связана с мембранами митохондрий. Однако

примененные в указанной работе методические подходы дали нам основание сомневаться в достоверности полученных результатов.

Посадку ми-КК мы могли осуществить только в среде с низкой ионной силой. Ранее в нашей группе было показано, что октамер ми-КК из митохондрий грудной мышцы голубя может диссоциировать на димеры в среде с низкой ионной силой (Липская 1989). Поэтому опыты с посадкой ми-КК на мембраны митохондрий с разрушенной гипотонической обработкой наружной мебраной были проведены на димере очищенной ми-КК из грудной мышцы голубя. Для получения димеров за 18 ч до опыта исходный раствор очищенной ми-КК разводили 10 мМ МЕС (рН 7,4), 0,25 мМ ДТТ до конечной концентрации КК 50 мкг/мл.

На первом этапе нашей работы в опытах по посадке димера ми-КК на мембраны митохондрий грудной мышцы голубя,' предварительно лишенных ми-КК, мы установили, что димер обладает способностью связываться с мембранами митохондрий в сахарозной среде. Следующей нашей задачей -было определение насыщающей мембраны концентрации ми-КК. Для этого к предварительно лишенным этого фермента митохондриям добавляли разные объемы раствора с одинаковой концентрацией димера (50 мкг/мл). После, осаждения митохондрий центрифугированием в супернатантах определяли активность ми-КК. Активность ми-КК определяли рН-метрически. На рис.6 видно, что димер может связываться с мембранами и что мембраны связывают около 0,5 нмоль димера на 1 иг белка митохондрий (приблизительно 40 мкг на 1мг белка митохондрий). В исходных митохондриях до солюбилизации ми-КК с мембран митохондрий содержание.ми-КК было 45 мкг на 1 мг белка митохондрий (0,52 нмоль'. цимера). Далее мы исследовали возможные превращения димера на мембранах митохондрий. С этой целью мы провели анализ олигомерных

Рис. 6. Связывание димера ми-КК х мембранами митохондрий. 2.5 мг белка митохондрш после гипотонической об работки инкубировали i ' разными объемами раст вора димера ми-КК в ОД] мМ МЕС (pH 7,4). 0,2: ыМ ДТТ при кондентраци: белка 50 мкг/мл. Врем инкубации - 15. мин пр 4*С.

форм, "полученных в результате экстракции 0,25 M хлористым калие] митохондрий, на которые был посажен димер ми-КК. Анализ олигомерны

у

форм с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотност сахарозы показал, что после экстракции 85% мн-КК находится в форм октамера, причем превращение в лктамер происходит за время проведени эксперимента - 15 мин. Мы пришли к заключению, что равновесие н мембране между димером и октамером сильно смещено в сторон октамера.

Результаты, аналогичные нашим, одновременно с нами, но помощью другого метода анализа олигомерных форм были получен Шлегелем и соавт. (Schlegel et al 1990). Правда, в их опытах перехс димера в октамер был менее значительным, так как после экстракци только 50% ми-КК находились в форме октамера. Вероятно, эта разни! связана с тем, что при .экстракции Шлегель и соавт. использовали буфер .. pH 8,8, .тогда как в наших опытах pH был равен 7,4. Известно, 41 увеличение pH усиливает диссоциацию октамера и поэтому во в рек проведения эксперимента возможна частичная диссоциация октамера.

Ï 0.6- '

«

добавленная ми-КК,

нмоль димера/мг белка митохондрии

Итак, опыты по посадке димера на мембраны митохондрий грудной лшцы голубя показали, что димер может связываться с мембранами и ■о равновесие на мембране между димером и октамером сильно смещено сторону октамера.

Исследование возможности диссоциации октамера ми-КК на димеры митохондриях. В следующей части нашей работы мы исследовали )зможность взаимных превращений олигомерных форм ми-КК в целых итохондриях с неразрушенной наружной мембраной под влиянием акторов, которые, как известно, могут влиять на положение равновесие ежду олигомерными формами в растворе: рН, ионной силы, субстратов. 1ы исследовали также влияние энергизации внутренней мембраны итохондрий на распределение олигомерных форм ми-КК. В этих опытах итоховдрии инкубировали в средах разного состава в течение 5 мин, атем немедленно подвергали ультразвуковой обработке в течение 15 сек в реде'' с высокой ионной силой,' при этом практически вся - ми-КК ереходила в раствор. Фрагменты мембран митохондрий осаждали ентрифугнрованием, а супернатант подвергали ультрафильтрации на ембране УМ-100 в подобранных нами условиях, когда не происходило вязывания олигомерных форм с фильтром. Мембрана УМ-100 пропускает олько белки с молекулярной массой меньше 100000 Да. Долю димера и ктамера в экстракте из митохондрий находили, измеряя активность ми-КК исходном экстракте и в фильтрате. Для предотвращения возможных заимных переходов олигомерных форм а экстракте из митохондрий во ре.мя центрифугирования в присутствии субстратов креатинкиназной «акции к экстракту сразу после ультразвуковой обработки добавляли [збыток ЭДТА, связывающий ионы М^2+.

Полученные нами результаты (табл.1) свидетельствуют о том, чтс состояние внутренней мембраны митохондрий (энергизованное во врем? окислительного фосфорилирования или деэнергизованное в присутствш ингибиторов дыхания и окислительного фосфорилирования) не влияет распределение олигомерных форм ми-КК в митохондриях. В то же время

Таблица I. Исследование олигомерного состава ми-КК в митохондриях в разных экспериментальных условиях

№ Добавки в среду или рН %диыера ми-КК в супернатанте

опыта среды* после ультразвуковой обработки

во время в отсутствие**

окислительного окислительного

фосфорилирован. фосфорилирован.

1 рН 6,0 11 10

2 • рН 7,4 7 8

3 рН 8,0 10 И

4 60 мМ Кр 7 7

5 3 мМ АТФ 7 7

6 3 мМ АТФ, 40 мМ Кр 30 30

-7 0,5 мМ АДФ, 60 мМ Кр 30 30

8 0,5 мМ АДФ, 10 мМ КрФ 11 10

9 0,5 мМ АДФ, 30 мМ КрФ И 10

10 0,25 М. сахароза вместо 0,125 М КС1, 0,5 мМ АТФ, 25 мМ Кр 8 8

* Среда инкубации: 0.125 М KCl, 4 ыМ MgCi2, 25 мМ ХЕПЕС pH 7,4, 0,5 wi ЭДТА, 6 мМ ыалат, 4 мМ глутамат, 5 мМ К-фосфат, 0.3 мМ ДТТ.

"В среду инкубации были добавлены 6 м кг/мл олигомицина, I мкМ ротенш 100 мкМ АР5А.

мы установили, что активное состояние ми-КК (при протекании прямо]

креатинкиназной реакции или при образовании аналога комплекс,

переходного состояния) приводит к диссоциации части октамера н,

димеры (табл.1, опыты 6,7). В этих опытах активность димера составлял;

18

30 % от активности ми-КК в митохондриях. Диссоциация не происходила в присутствии лишь одного из субстратов прямой реакции (табл.1.опыты 4.5). Диссоциация под влиянием субстратов была возможна только в среде с высокой ионной силой. При замене 0,125 М КС1 в среде инкубации на сахарозу, в присутствии АТФ и Кр (табл.1, опыт 10) ми-КК присутствовала преимущественно в форме октамера. Учитывая, что Км октамера ми-КК для Кр равен 5-7 мМ, снижение доли димера , вероятно, было связано в первую очередь со снижением ионной силы. В присутствии АДФ замена'Кр на'КрФ ингибировала образование димера (табл.1, опыт 9). Изменение рН от 6,0 до 8,0 не оказывало влияния на распределение олигомерных форм фермента в нативных митохондриях (табл.1, опыты 1,2,3). Следует отметить, что результаты, полученные в этой части работы, носят приоритетный характер. Впервые были получены прямые доказательства образования димера ми-КК в нативных митохондриях и исследованы условия, приводящие к образованию димера.

Ранее в нашей лаборатории в опытах на митохондриях с разрушенной наружной мембраной было показано, что адениловые нуклеотиды солюбилизируют ми-КК в низкой концентрации (до 10 мМ) (Липская 1983). Повышенная чувствительность' к действию адениловых нуклеотидов указывает на специфический характер их влияния, вероятно, благодаря их связыванию в активном центре фермента. Аналогичная тенденция, хотя и менее выраженная, наблюдалась в нативных митохондриях: в опытах с пришиванием ми-КК к мембранам митохондрий с помощью глутарового альдегида было показано, что при добавлении 3 мМ М^АТФ солюбилизировалось примерно 50% активности ми-КК, хотя общая ионная сила среды в этом опыте была даже несколько ниже, чем в опыте с 0,125 М КСГ, когда солюбилизировалось только 16 % ми-КК

(Lipskaya, TroGmova 1989). На препарате очищенной ми-КК также было показано, что субстраты реакции, взятые в отдельности, не вызывают диссоциации октамера (Липская 1985). В полном соответствии с этим наблюдением мы нашли, что в присутствии 0,125 М КС1 и 3 мМ МдАТФ или 60 мМ Кр доля димера в нативных митохондриях равна только 7% (табл.1, опыты 4,5). В опытах по пришиванию ми-КК к мебранам митохондрий с помощью глутарового альдегида было установлено, что фермент в активном состоянии диссоциирует с мембран на 38-47% (Lipskaya,'Trofimova 1989).' С учетом этих данных, можно рассчитать, что 65-80% солюбилизированного в присутствии субстратов октамера диссоциируют до димера. Избыток КрФ полностью ингибировал солюбилизацию ми-КК с мембран митохондрий в опытах с пришиванием (Lipskaya, Trofimova 1989). О связи ми-КК с мембранами митохондрий в присутствии КрФ говорят и наши опыты с определением кинетических параметров ми-КК в обратной реакции. Известно, что КрФ является конкурентным ингибитором ми-КК по отношению к АТФ и Кр (Morrison et al 1965). Вероятно, именно с этим связано ингибирующее действие КрФ на солюбилизацию ми-КК с мембран митохондрий и на диссоциацию октамера. Совокупность полученных результатов позволяет предположить, что связывание адениловых нуклеотидов в активном центре ми-КК таким образом изменяет конформацию фермента, что он легко солюбилизируется с мембран митохондрий. Однако для того, чтобы произошла диссоциация солюбилизированного октамера на димеры, необходимо присутствие второго субстрата, Кр, позволяющего полностью сформировать комплекс (или аналог комплекса) переходного состояния.

Проведенный ранее в нашей лаборатории анализ показал, что под влиянием субстратов диссоциация октамера на димеры происходит гораздо

ютрее, чем под влиянием других факторов (Липская 1987). Полученные ми результаты также указывают на достаточно быстрые превращения игомерных форм в митохондриях (время инкубации проб в наших ытах было равно 5 мин).

Полученные нами, а также в предыдущих исследованиях нашей уппы результаты можно обобщить следующим образом: связанная с ¡мбранами митохондрий ми-КК присутствует в виде октамера (по айней мере 90%); функциональное состояние внутренней мембраны, а кже изменение рН в интервале от 6,0 до 8,0 не изменяют долю

ц

язаного с мембранами октамера ми-КК, но влияют на кинетические раметры октамера в прямой креатинкиназной реакции; в присутствии [зиологических концентраций АТФ и Кр, обеспечивающих протекание ямой креатинкиназной реакции, ми-КК частично сходит с мембран в жмебранное пространство и диссоциирует там до димера; доля язанной • с мембранами "и доля диссоциированной на димеры ми-КК висит от соотношения концентраций Кр и КрФ. Все сказанное можно едставить в виде схемы (рис.7).

Итак, мы убедились, что переходы олигомерных форм ми-КК в тивных митохондриях, действительно, могут осуществляться. Каков же [зиологический смысл этого процесса? Активность этих двух форм в створе, также как активность связанного с мембранами октамера, в зной степени чувствительна к изменениям рН и к функциональному стоянию митохондрий (Липская 1989, Трофимова 1989). Вероятно, реходы олигомерных форм ми-КК в митохондриях позволяют .одерживать активность этого фермента на высоком уровне в широком апазоне физиологических условий. Кроме того, способность октамера к ратимой диссоциации может быть важна для выполнения

' \ г

креатинкиназой предполагаемой структурной функции в местах контак поверхностных мембран митохондрий (\Vyss 1992).

НМ МП ВМ

0,25 М сахароза

0,25 М сахароза

+ М^АТФ

энергизаоия

ВМ 0,125 М КС1

вместо сахарозы

нм оо°0°~&

° Ч\ //

МП

ВМ I

избыток КрФ

а и

+ М^АТФ

$ И ®

+Кр

- НЛ' МП ' ВМ

нм

МП ВМ

нм МП

ВМ

о о ОО __ ^

оооо^Ф нм

МП

^ВМ

избыток Кр<3

Рис.7. Схема возможных превращений олигомерных форм ми-КК в ыитохондриях. Кинетически различные формы ми-КК;

ЩИ© - октамеры, о - димеры;

ыи - наружная мембрана -митохондрии. вм - внутренняя мембрана митохондрии, мп - ыежмембранное пространство. На схеме не указаны димеры, возможно, связанные с внутренней ыебранон митохондрий в небольшом количестве (не более 10% активности ми-КК).

Выводы.

1. Получены доказательства октамерного строения высокомоле-:ярного олнгомера митохондриальной креатинкиназы.

2. При определении температурной зависимости кинетических >аметров обратной креатинкиназной реакции для фермента в растворе и итохондриях установлено, что К„ для МцАДФ у очищенной КК и КК в гохоцдриях равны между собой и не изменяются с температурой, в [ичие от К„ для КрФ, температурная зависимость которых выражается яичающимися кривыми с минимумом в области 23-25°С.

3. Усовершенствован метод выделения и очистки КК из грудной шцы голубя.

4. Установлено, что димер ми-КК связывается с мембранами гохондрий и что равновесие между связанными с мембранами димером 1Ктамером ми-КК сильно смещено в сторону октамера.

5. Разработан метод быстрого анализа олигомерных форм ми-КК в :творе с помощью ультрафильтрации на мембране УМ-100.

6. Установлено, что в присутствии адениловых нухлеотидоз и Кр, ■да возможно протекание прямой креатинкиназной реакции или разование аналога комплекса переходного состояния, октамер :сощшрует частично на дныеры в митохондриях с неразрушенной ружной мембраной. КрФ оказывает ингибирующее действие на ссоциацию 01ггдмера.

Список печатных работ по теме диссертации.

1. Lipskaya T.Yu, Moiseeva N.S., Trofimova M.E. / The quatern structure of bovine heart mitochondrial creatine kinase.//Biochemi: International. - 1989. - V.18. - N.6. - p.l 161-1171.

2. lipskaya T.Yu., Trofimova M.E., Moiseeva N.S./Kinetic propertie: the octemeric and dimeric forms of mitichondrial creatine kinase physiological role of the enzyme.//Biochemistry International. - 1989. - V. - N.3. - p.603-613.

3. Липская Т.Ю., Моисеева H.C., Трофимова M.E. " Четвертич; структура митохондриальной креатинкиназы". 6-ая Всесоюзная конфер ция по биохимии мышц, г. Тбилиси, 1989, с.79-80.

4. Моисеева Н.С., Трофимова М.Е., Липская Т.Ю. "Четвертич! структура и кинетические свойства октамера и димера митохондриалы креатинкиназы". 2-ой * "Всесоюзный " симпозиум "Теоретические прикладные аспекты молекулярной биологии", г. Самарканд, 1991, с.134