Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболическая регуляция клеточного дыхания в сердце: роль внешней мембраны митохондрий и митохондриальной креатинкиназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболическая регуляция клеточного дыхания в сердце: роль внешней мембраны митохондрий и митохондриальной креатинкиназы"

кардиологичкскии научный центр рамн

На правах рукописи

РГГ) од

васильева Клена Викторовна

метаболическая регуляция клеточного дыхания в сердце:

роль внешней мембраны митохондрии

и митохондриальнои кркатинкиназм 03.00.04 - "Биохимия"

Автореферат диссертации на соискание ученой стелет« кандидата биологических наук

Москва 1994

Диссертационная работа выполнена в отделе биохимш Кардиологического научного центра РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.А.Сакс

Официальные оппоненты: доктор биологических наук О.И.Писаренко кандидат биологических наук Т.П.Клквних

Ввдуцое учреждение; НИИ физико-химической биологии ии. А.Н.Белозерского, МГУ.

Завита состоится 1994 г. вн;

заседании специализироёйннсгго совета К 001.22.0i I

Кардиологическом научном центре РАМН (121552, г. Москва, Э-! Черепковская ул., д. 15-а).

С диссертацией можно ознакомиться Кардиологического научного центра РАМН.

в научной библиотек'

Автореферат разослан <5"

1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, /\

кандидат биологических наук / у Т.И.Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблему Регуляция клеточного дыхания, отражающего энергетический метаболизм сердца, является фундаментальной и интенсивно исследуемой проблемой биоэнергетики. Однако, ни одна иэ существующих на сегодняшний день гипотез не способна в полной мере объяснить систему контроля окислительного метаболизма, существование которой вытекает из того, что снабжение ткани кислородом всегда равно его потреблению, а потребление строго коррелирует с нагрузкой (работой). Исходя из классических работ Чанса и Вильямса (Chance, Williams, 1956), описывающих контроль окислительного фосфорилирования (ОФ) в изолированных митохондриях,' невозможно полностью объяснить регуляцию скорости дыхания в сердце, поскольку в клетке присутствуют дополнительные факторы, вклад которых необходимо учитывать. В частности, недавно показано, что внутри

кардиоыиоцитов диффузия АДР - субстрата Оф - существенно и специфически затруднена (Saks et al, 1991). Поэтому современная тенденция в изучении проблемы заключается в проведении исследования на более высоком клеточном уровне.

Хорошо известно, что в энергетическом метаболизме миокарда важную роль играет креатинкиназная система и ее нарушения сопровождают некоторые сердечные патологии, в частности, кардиомиопатии. Поэтому изучение вклада внутриклеточных факторов в процесс регуляции дыхания в клетках сердца в норма и при патологии является весьма актуальной и важноп задачей.

Ц&аь работц, Целью работы было исследование причин эамедленной диффузии АДР в кардиомк<">цитах и выяснение роли внеш-

ней мембраны митохондрий и китохондриального изофермента креатинкинаэы (ККмит) в регуляции дыхания в клетках сердца. Метаболическая регуляция дыхания исследовалась на уровне мульти-ферментных комплексов и сопряженных реакций с общим метаболитом и не рассматривалась гормональная регуляция и регуляция, обусловленная биосинтетическими реакциями. Были поставлены следующие задачи: 1) изучить возможность промежуточного связывания экзогенного АДР элементами сократительного аппарата хардиомиоцигов и определить основную причину диффузионных затруднения для АДР в клетках сердца; 2) провести кинетический анализ прямой креатинкиназной реакции в митохондриях сердца в условиях когда ККмит связана с внутренней митохондриальноя мембраной и когда фермент находится в свободном состоянии в межмембранном пространстве; 3) исследовать причину нарушения связывания ККмит с внутренней мембраной митохондрий при изменении конфигурации мембраны; 4) изучить особенности регуляции дыхания в клетках сердца сирийских хомяков линии CHF-146, страдающих наследственной хардиомиопатиея.

Научная нокигчна работы. Впервые прямо показано, что основным препятствием на пути АДР к системе окислительного фосфорилиров-ания (ОФ) в клетхах сердца является внепняя мембрана митохондрий. Эти диффузионные затруднения для АДР преодолеваются в хардиомиоцитах с помощью ККмит. Получены новые данные о том, что перемещение ККмит с внутренней мембраны митохондрий в межмембранное пространство приводит к существенному снижения эффективности аэробного синтеза фосфокреатина. Обнаружено, чтс этот эффект реализуется как на уровне изолированных органелл (митохондрии in vitro), так и на клеточном уровне (скинированные

сапонином волокна сердечной ткани). Показано, что дефицит

митохондриальной креатинкиназы вызывает снижение эффективности регуляции дыхания при наследственной кардиомиопатии у экспериментальных животных.

Теоретическая и практическая ценность рдботы. Полученные результаты представляют интерес как для экспериментальных, так и для теоретических исследования, направленных на создание теории регуляции дыхания в сердце. Полученные данные детализируют информацию о клеточной компартментализации адениновых нуклеотидов и о функциональной важности креатинкиназной системы в интеграции мышечного энергетического метаболизма. Результаты проделанной работы указывают на возможные пути дальнейших исследовании, в частности, в направлении поиска факторов, определяющих низкую проницаемость внешней мембраны митохондрия для адениннуклеотидов in vivo.

Апгсобяиия работы и публикации. Результаты диссертации были представлены на 10 Международном коллоквиуме по функциям митохондрий в Магдебурге (ГДР). в 1988 г. , на 4 Международном Симпозиуме "Креатинкиназа и транспорт метаболитов" в Вене в 1992г., на 5 Международной конференции по Биотермокинетике в Бордо (Франция) в 1992г., на 14 Симпозиуме Европейской секции Международного общества по изучению сердца в Иерусалиме (Израиль) в 1993г.; они также обсуждались на межлабораторном семинаре НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (МГУ) и на межлабораторном семинаре института Экспериментальной Кардиологии РАМН. Основные результаты работы отражены в 7 публикациях.

СТРУКТУРА И ряботы. Диссертационная работа состоит из

введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, изложенных в трех главах, их обсуждения и выводов. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая 6 таблиц и 27 рисунков. В заключении приведен список цитируемой литературы ( названий).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭкспвримвнтальНИИ млтяриал. В экспериментах использовали крыс линии Вистар весом 200-250г., сирийских и золотистых хомячков 175-200-дневного возраста и собах весом около 5 кг. Сердца извлекали у наркотизированных животных.

Методы пыпелрнид препаратов Митохондрии выделяли из сердца по методу Сакса (Saks et al, 1974). Митопласты получали путем дигитониновоя обработки митохондрий (Shnaltman, Greenwalt, 1968). Скинированные сапонином волокна сердца получали по методу Векслера (Veksler et al, 1987). Использование в качестве объекта исследований скинированных волокон дает несколько преимуществ -во-первых, митохондрии в этих препаратах находятся в своем естественном окружении, во-вторых, можно искусственно контролировать внутриклеточную среду и при этом наблюдения будут производится на всей популяции митохондрий, а не на 10-15 X от их общего количества в клетке, как в случае препарата выделенных митохондрия. Кардиомиоциты выделяли из сердец хомяков при перфузии их холлагеназой как описано в работе (Sake et el, 1991).

Для получения скинированных волокон использовали среды, содержащие 10 тМ Са-ЭГТА буфер (концентрация свободного Са++ 0,1 мкМ). Раствор "А", в котором с целью перфорации сарколеммы волокна обрабатывали сапонином, содержал помимо Са-ЭГТА буфера

9,5 мМ MgCl2. 20 мМ таурин, 0,5 мМ ДТТ, 20 мМ имидазол, 5,3 мМ АТР, 15 мМ фосфокреатин. 50 мМ K-MES (рН 7,1). Дыхание измеряли в растворе "Б", содержадем Са-ЭГТА буфер, 4,3 мМ MgCl2> 20 мМ таурин, 0,5 мМ ДТТ, 80 мМ K-MES, 20 мМ имидазол, 5 шМ глутамат, 2 тМ малат, 3 пМ фосфат и БСА (2 иг/ил) (рН 7,1). Дыхательные параметры сканированных волокон и митохондрий измеряли при 22°С и 30°С, соответственно, в среде "Б" и в стандартной среде для оксиметрии, содержащей 0,125 М КС1 или 0,25 М сахарозу, 20 шМ HEPES-Na (рН 7,4), 4 пМ глутамат, 2 шМ малат, 3 тМ ацетат магния, 5 тМ КН2Р04, 0,4 nil ЭГТА, 0,3 шМ ДТТ. Физиологическим солевой раствор (ФСР) содержал 120 мМ K-MES, 10 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, рН 7,2, 20 мМ таурин, 15 мМ креатин, 15 мМ Иа2-фосфокреатин, 5 мМ Na2ATP, 8 мМ MgCl2, 5 wM К2НР04, 3 мМ глутамат, 3 мМ малат, 0,5 мМ ДТТ и 10 иг/мл БСА.

Методы анализа. Скорость потребления кислорода препаратами измеряли с помощью кислородного электрода Кларка на оксиграфе Yellow Springs Instruments (США). Кинетический анализ прямой креатинкиназной реакции в митохондриях в присутствии и отсутствии окислительного фосфорилирования проводили как описано (Jacobus, Saks, 1982).

Концентрации АГР, АДР и фосфокреатина определяли энзиматически по методу Lamprecht 1975.

Определение концентрации белка в препарате митохондрий проводили биуретовым методом в присутствии 16 % дезоксихолата калия (Saks et al, 1975), содержание белка в скинированных волокнах и экстрагирующегося из волокон при сапонировании и экстракции, измеряли по методу (Bradford, 1976). Скорость дыхания

скинированных волокон нормировали на мг. сухого веса используемого материала.

Электронно-микроскопический анализ проводили стандартным методом (Sake et al, 1991) на микроскопе Jeol 100-СХ.

Спин-меченые препараты митопластов получали добавлением к суспензии митопластов (5 мг/мл) спиртового раствора спинового зонда (5-доксилстеарат и метилированные производные: метил-5-доксилстеарат и ыетил-16-дохсилстеарат) до конечной концентрации 10~4 Н. Спектры ЭПР регистрировались при температуре 27 ° С на спектрометре Verlan Е-109.

Иэоферменты креатинкиназы экстрагировали из гомогенизированной сердечной ткани в растворе содержащем 100 мМ KgHPO^, 1 мМ ЭГТА, 15 мМ п-ацетилцистеин, 0,5 X тритон Х-100 (pH 9,0). Электрофоретическое разделение изоферментов проводили как описано (Khuchua et al, 1989).

Обопботкя пянных Статистическую обработку полученных результатов производили в программных пакетах SigmaPlot 4.0, SuperCalc 5.1. Обработку кинетических данных производили в двойных обратных координатах по методу Лайнуоера-Берха с использованием программы EnzfItter (метод линейной регрессии).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I .Княтняя мембрана митохонприя ,идк лидфулионный барьер ИДЯ. ME а клятках г;ердця. £сдь митохонприяльного ИАОфАРИеНТа КРеаТИНКИНаЭЫ

а преодолении пиадгэионинх затруднений .идя АДР.

Ранее в исследованиях, выполненных на кардиомиоцитах с пермэабилизованиой сапонинаи сарколеммой и скинированных волокнах из сердца крысы было показано, что диффузия экзогенного АДР

внутри клетки существенно затруднена. Анализ зависимости скорости дыхания скинированных волокон от концентрации АДР в среде показал, что кажущаяся константа Михаэлиса (Ky*®*) для АДР составляет около 0,3 ыМ, в то время как та же величина, измеренная для изолированных митохондрий, составляет около 17 мкМ (Saks et al, 1991). Предполагали, что причиной специфических диффузионных затруднения для . АДР внутри клетки является промежуточное связывание элементами сократительного аппарата, в частности, миозиновой АТР-аэой.

Для проверки этого предположения скицированные волокна сердца крысы в течение 30 мин при _+4°С обрабатывали гиперосмотическим раствором, содержащим 0,8 К КС1; 50 mM HEPES-К; 10 шМ МаС12; Ю mM MgATP; 0,5 лМ ДТТ; 20 шМ таурин ( рН 7,0) (метод, описанный в работе Kakol et al, 1987), вызывающим экстракцию из миофибрилл толстых миозиновых нитей, тропомиозина и тропонина. Электронно-микроскопический анализ ' полученных "теневых" волокон показал, что после такой обработки толстые нити саркомера полностью растворялись, а структура Z-линии и тонких нитей сохранялась. Сильное гиперосмотическое воздействие не оказывало значительного влияния на функции митохондрий: дыхательный контроль, определяемый для скицированных волокон по отношению скорости максимального АДР-стимулированного поглощения кислорода к скорости базалыюго дыхания составлял для контрольной серии 4,8,±0,3, а для "теневых" волокон 5,9±0,5. Измеренная на препарате "теневых" волокон К,,*8* для АДР оставалась высокой (349±24 мкМ) (табл.1). Следовательно, промежуточное связывание с миозиновои АТР-аэои не является причиной диффузионных затруднений для АДР внутри клетки.

После исключения предполагаемого вклада миозина в диффузионные ограничения для ЛОР была проведена серия экспериментов, в которых методом осмотического шоха разрушали внешнюю мембрану митохондрий в составе скинироваиных волокон. Для этого волокна инкубировали 30 мин при температуре +4°С в растворе с осмолярностыо 40 мОсМ. (БЪопег, Б1гак, 1969). Степень повреждения мембран митохондрии контролировали морфологически (электронная микроскопия) и с помощью цитохромного теста: дыхание волокон измеряли в среде, содержащей 125 мМ КС1, в которой, цитохром а (цит.д) диссоциировал от внутренней мембраны митохондрий в межмембранное пространство. Добавление экзогенного цит.£ на фоне максимальной концентрации АДР не оказывало влияния на скорость дыхания в контроле, следовательно, внешняя мембрана оставалась целой. После осмотического пока максимальная скорость дыхания существенно снижалась, так как эндогенный цит.£ диффундировал в раствор через разрывы внешней мембраны, но полностью восстанавливалась после добавления экзогенного цит.£. Интактность внутренней мембраны контролировали по ингибированию дыхания ингибитором транслокатора адениновых нуклеотидов' карбоксиатрахтилозидом (КАТ).

Результаты оксиграфических измерений представлены на рис.1. Они показывают, что после осмотического шока в составе схинированных волокон имелись две популяции митохондрий - одна с интактными и другая с разрушенными внешними мембранами. Оценка степени стимуляции дыхания цитохромом д дала основания полагать, что , популяция митохондрий с поврежденной внешней мембраной составляла около половины от общей.

Рис.1. Оксиграфи-ческие записи дыхания скицированных волокон сердца до (1) и после (2) инкубации в гипотоническом 40 мОсМ растворе. Измерения проводились в среде, содержащей 125 мМ KCl, 20 mM HEPES-Na (pH 7,4), 4 тМ глу-тамат, 2 шМ малат, 3 шМ ацетат магния, 5 тМ КН2Р04, 0,4 тМ ЭГТА, 0,3 тМ ДТТ.

Анализ представленных на рис.2 зависимостей скорости дыхания подвергнутых осмотическому шоку волокон от концентрации АДР в двойных обратных координатах выявил существование двух типов процессов: первый характеризовался высоким значением кажущейся Ку для АДР, совпадающим с Кцкаж для контрольных волокон, а второй -низким значением Кмка* для АДР, равным 32,3±5,0 мкМ, т.е. близким

к Кмкаж для изолированных митохондрия.

Рис.2 А. Зависимость скоростей дыхания скицированных волокон сердца до (1) и после (2) осмотического шока от концентрации АДР. Измерения проводились в среде дыхания, содержащей 125 мМ КС1, 20 шМ НЕРЕЭ-На (рН 7,4), 4 иН глутамат, 2 тМ малат, 3 тМ ацетат магния, 5 шМ КН0РО4, 0,4 шМ ЭГТА, 0,3 шМ ДТТ в присутствии 8 мкМ цитохрома д. Скорость дыхания рассчитана на мг. сухого веса волокон. Б. Линеаризация зависимостей в двойных обратных координатах: 1 - контроль; 2 - после обработки в 40 мосМ растворе.

Контрольные эксперименты с изолированными митохондриями, обработанными аналогичным образом, показали, что в двойных обратных координатах линейная зависимость обратной величины скорости дыхания от обратного значения концентрации экзогенного АДР сохраняется, а значение Кмкаж для АДР остается низким. Полученные данные показывают, что проницаемость внешней мембраны выделенных митохондрий для АДР очень высока, и, следовательно, в процессе выделения внеоняя мембрана теряет свою способность осуществлять барьерную функцию в отношении АДР.

Таблица 1. Значения кажущейся Км для экзогенного АБР в процессе дыхания, полученные для разных препаратов из сердца крысы.

К„каж АБР, мкМ

Препарат без креатина +креатин, 25 мМ

1. Скинированные волокна 297±35 85±5 "

2. Изолированные митохондрии 17,6±1,0. 13,в±4,4

3. "Теневые" волокна (без миозина) 349±24 -

4. Скинированные волокна после осмотического пока I II 315±23; 32,3±5,0 -

5. Скинированные волокна после трипсиновой обработки 109±17 -

Приведены средние значения и стандартные отклонения для 4-5 экспериментов.

В настоящее время во многих лабораториях проводятся интенсивные исследования митохондриальных поринов - потенциал-зависимых анион-селективных каналов внешней митохондриальной мембраны. Большинство экспериментальных работ выполнено на модельных

системах (липосомах и фосфолипидных бислоях) или на выделенных митохондриях. На основании полученных данных и с учетом имеющихся в литературе сведений можно предположить, что существует фактор, по всей видимости белковой природы, присутствующий в клетках 1п vivo. Он способен модулировать проницаемость пориновых каналов внешней мембраны митохондрий, ограничивая проникновение через нее адениннуклеотидов. Нами была предпринята попытка разрушить этот белок. Для этого скинированные волокна .инкубировали 15 минут с трипсином (0,1 иг/ил), после чего добавляли ингибитор трипсина (0,28 мг/мл). После обработки Кмка* для АДР снизилась примерно в 3 раза до 109±17 мкМ. Дыхательный контроль при этом не уменьшился и был равен 6,0±2,0. Эти данные говорят в пользу предположения о белковой природе модулятора активности пориновых каналов. Однако, было получено не десятикратное, как в случае митохондрия, а лишь трехкратное снижение Ки для АДР. Возможно, обработка другими протеазами позволит разрушить белковый модулятор более полно.

Полученные результаты проэволяют предположить, что передвижение АДР в клетке контролируется тремя процессами: 1) диффузией через неперемешивающиеся слои и возможным связыванием с актином; 2) пориновыми каналами во внешней мембране, проницаемость которых модулируется внутриклеточным белковым фактором (или несколькими факторами); 3) переносом ADP в метрике транслокатором адениновых нуклёотидов (АНТ). Схематически эти процессы представлены на рис.3

Когда дыхание скинированных волокон измеряли в присутствии 25 мМ креатина, наблюдалось примерно четырехкратное снижение ^каж для ддр (табл.1), что согласуется с полученными ранее

Рис.3 Схематическое представление диффузионных ограничений для АДР внутри клеток сердца (Т - транслокатор адениннуклеотидов).

данными (БаЗш еЬ &1, 1991). Это происходит вследствии работы митохондриального изофермента креатинкиназы, функционально сопряженного с окислительным фосфорилированием (04) в митохондриях. На рис.4 схематически представлено, как сопряженные креатинкинаэные системы в митохондриях и миофибриллах контролируют перемещение АДР и преодолевают диффузионные ограничения для АДР на уровне внешней ыигохондриальной мембраны. В миофибриллах АДР рефосфорилируется за счет фосфокреатина и креатин диффундирует в митохондрии по концентрационному градиенту . АДР, образующийся в цитоплаэматической креатинкинаэной. реакции по равновесному механизму, поступает к митохондриям в качестве сигнала обратной связи от миофибрилл при их сокращении. В митохондриях сопряженная мультиферментная система ККмит-АНТ при участии селективных каналов внепнел мембраны работает как регуляторныя механизм, усиливающий слабый сигнал АДР, поступающий

через внешнюю мембран/. Таким образом креатин осуществляет акцепторный контроль окислительного фосфорилирования. Этот механизм может быть центральным в регуляции дыхания в сердечных клетках. "

Рис.4. Механизмы снижения диффузионных ограничений для АДР в сердечных клетках. " *. ~ . (КР

креатин, ФКр - фосфокреатин, КК - митохондриальная креатинкинаэа, Т - транслокатор адениннуклеотидов).

2-Мнтпхонприяльняя кряятиикинячя как РАГУЛЯТОР ОКИСЛИТЕЛЬНОГО

фосфорилирования. Эа»Ьякт нярудания функционального сопряжения

кряятинкинязной реакции с пттлитяяьнни «Ьосдстрилиропанием, ■

В сердце конечный продуктом окислительного фосфорилирования можно считать не АТР, а фосфокреатин, синтез которого осуществляется с помощью митохондриального иэофермента креатинк-иназы, функционально сопряженного с OS через транслокатор аден-. иинуклеотидов (АНТ). Как известно, креатинкинаэа катализирует обратимую реакцию фосфорилирования креатина с использованием Mg-

АТР в качестве субстрата:

" ~........ %

AjA TP'

d- 4

' ' tM

jujpr* >< 1

i

o-t'0'

I

0"

tk*

13

Это двухсубстратная реакция, идущая по квазиравновесному В1-В1 механизму с неупорядоченным связыванием субстратов. Реакция протекает с образованием тройного фермент-субстратного комплекса. Кинетическая схема реакции приведена на рис.5.

Рис.5. Кинетическая схема креатинкиназной реакции, где К1 -константы диссоциации двойных комплексов с ферментом МйАТР, Кр, МеАДР и ФКр соответственно. Константы Ка, К^, Кр и - константы диссоциации тройного фермент-субстратного комплекса до комплекса фермента с одним из субстратов. К1 и К_1 - константы скорости прямой и обратной реакции. Е-МйАДР-Кр и Е-МйАТР'ФКр теоретически возможные тройные комплексы.

Термодинамически более выгодна реакция в обратном направлении и именно она катализируется цитоплазматическими и миофибриллярными изоферментаыи креатинкиназы. В митохондриях реакция идет в прямом направлении вследствие эффективного функционального сопряжения ККмит с АНТ, который улавливает образовавшийся АДР и переносит его в митохондриальный матрикс, сдвигая равновесие реакции в сторону образования фосфокреатина. В литературе имеется точка зрения, согласно которой решающую роль в сопряжении ККмит и ОФ играет внешняя мембрана митохондрий, механически удерживающая фермент в межмембранном пространстве. Если считать эту точку зрения верной, то сопряжение должно быть одинаковым в том случае, если ККмит связана с внутренней мембраной митохондрий (в сахарозной среде) и в том случае, если она находится в свободном состоянии в межмембранном пространстве

(в среде содержащей 125 мМ KCl, вызывающей диссоциацию ККмит от внутренней мембраны), поскольку наружная мембрана в рассматриваемых условиях остается целой.

С целью выяснения этого предположения в двух средах был проведен анализ начальных скоростей прямой креатинкиназной реакции в митохондриях в присутствии соответствующей сопряженной ферментативной системы, улавливающей продукт реакции АДР, - либо фосфоенолпируват-пируваткиназной, либо системы окислительного фо-сфорилирования. В экспериментах использовали интактные митохондрии из сердца собаки с хорошо сохранившейся наружной мембраной, . функциональные параметры которых представлены в таблице 2.

Таблица2. Параметры" дыхания препаратов митохондрия и митопластов, выделенных из сердца собаки.

Препарат

Скорость дыхания, нг.ат.О/мин'мг белка

Дыхательный контроль

Активность ККмит., ME/иг белка

Митохондрии

в сахарозной

среде 450±65

Митохондрии в среде с KCl

Митопласты в сахарозной среде

■440+90

380+60

8,0±1,7

11,0±3,0

3,8±0,6

4,1±0,6

3,6±0,9

3,9±0,5

Приведены средние значения и стандартные отклонения для 9 экспериментов. Измерения проводились при 30°С в присутствии 3 мМ Mg++ (состав сред описан в разделе "Методы анализа").

В табл.3 представлены результаты проведенного анализа. Когда субстрат ККмит - АТР производился в процесс 0$, значение константы диссоциации (Ка) для MgATP от тройного комплекса ККмит'MgATP'Kp уменьшалось на порядок из-за увеличения оборота

ATP в сопряженной системе. В меньшей степени уменьшалась что согласуется с полученными ранее данными (Jacobus, Saks, 1982). В среде, содержащей KCl, не наблюдалось зависимости Ка- от источника АТР и ее значение было одинаково высоким в присутствии и в отсутствие Оф (ОФ ингибировали 10 мкМ ротеноном и олигомици-ном (5 мкг/мг белка)). Наличие высокой концентрации С1~ в среде несколько ингибирует фермент, судя по уменьшению величины VMaKC> что также согласуется с литературными данными.

Таблица 3. Значения кинетических констант для креатиикинаэной реакции в митохондриях сердца собаки в сахарозной и KCl средах.

Константа - СЫисл. фосф. ♦ Окисл.Фосф.

KCl-среда

Kia (MgATP), мМ 1,28±0,10 I,10i0,10

Ка (MgATP), uM 0.16±0,016 0,21±0,04

Kib (Cr), uM 52,9±4,2 39,5±15,6

Kb (Kp), мМ 7,0±0,6 6,5±1,7

V^, мкмоль/мг*мин 0,6±0,2 1,1±0,3

Сахарозная среда

Kia (MgATP), mM 1,11±0,10 0,30±0,06

Ka (MgATP), mM 0,22±0,03 0,020±0,004

Kib (Kp), mM 51,1+11,4 30,3±0,8

Kb (Kp), mM 9,1±1,0 4,9±1,2

V^, мкмоль/мг*мин 1,3±0,5 1,2±0,25

Средние значения и стандартные ошибки приведены для пяти экспериментов.

Таким образом можно сделать вывод, что при перемещении ККмит в межмембранное пространство креатинкиназная реакция не способна осуществлять эффективный акцепторный контроль окислительного фосфорилирования а митохондриях.

Представлялось интересным проверить описанный эффект на клеточном уровне. Для этого скорость дыхания скинированных волокон измеряли в среде "Б", в которой ККмит (как и в сахарозной среде) ассоциирована с внутренней митохондриальной мембраной. В присутствии креатина происходит значительное уменьшение величины кажущейся Км для АДР в процессе дыхания при постоянной Уиакс (рис.6 А). Однахо стимулирующего действия креатина на клеточное дыхание не наблюдалось, когда в среде присутствовал 125 мМ хлорид калия (рис в В). Если в среде "Б" К,,113* составляла 297±35 мкМ без креатина и 85±5 мкМ в присутствии 25 мМ креатина, то в среде с КС1 - 292±49 мкМ без Кр и 369+11 в присутствии креатина. Следовательно, эффект наруиения сопряженной работы креатинкина-зноя реакции и ОФ реализуется также и на клеточном уровне.

Г..... 140 А ©

11 30

5 >

1.0 » 1 ...1-1— •

0.2 04 о.е

[АИЭ.тМ

Об

10

02 0.4 ОД 04 10

[ADfj. ГГ)М

Рис.6. Зависимость скорости дыхания скинированных волокон от концентрации АДР в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривая 2) 25 мМ креатина: (А) - в среде "Б", (Б) - в среде, содержащей 125 мМ KCl.

Последовательность "разобщения" креатинкиназноЯ реакции с

ОФ в среде, содержащей KCl, путем перемещения фермента с

поверхности внутренней мембраны в межмембранное пространство

указывает на возможные механизмы регуляции скорости поглощения

кислорода в условиях, приближенных к ситуации in vivo, где фо-

сфокреатин присутствует в высоких концентрациях. Рисунок 7

илюстрирует влияние фосфокрзатина на креатин-стимулированное

дыхание в присутствии 0,12 мИ MgATP. Перемещение фермента с

мембраны в межмембранноо пространство вызывает значительное

увеличение чувствительности сопряженных процессов аэробного

продуктом реакции.

Рис.7. Зависимость креатин-стимулирова-ниого дыхания митохондрий в процентах от максимального дыхания в состоянии 3 от концентрации фос-Фокреатина в среде. Дыхание измеряли в присутствии 35 мМ креатина и 0,12 мМ MgATP в стандартных средах оксиметрии, содержащих в качестве основного компонента KCl или сахарозу (состав сред описан в разделе методов)

Влияние иона Cl-, содержащегося в среда в концентрации 125 мМ и также осмолярности среды на физико-химические параметры внутренней митохондриальной мембраны были исследованы с помощью метода ЭПР. Известно (Saks et al, 1986), что если митопласты (митохондрии, лишенные внешней мембраны, МП) прединкубировать в сахарозных средах понижающейся осмолярности, то при последующей инкубации в изоосмотическоя сахарозной среде с низкой ионной

силой ККмит остается на мембране, а о физиологическом солевом растворе (ФСР), ионная сила которого составляет около 250 мМ, фермент диссоциирует в зависимости от степени набухания МП (в среде с KCl, обладающей высокой ионной силой, он диссоциирует сразу). На рис.8 представлены зависимости времени вращательной

SfJ

корреляции t- парамагнитного фрагмента зонда метил-5-доксилстеарата, встроенного в мембрану МП, в средах разного ионного состава, от осмолярности сахарозной среды прединкубации МП. рассчитывали из ЭПР спектров.

Рис.8. Зависимость времени корреляции парамагнитного фрагмента метил-5-докси-лстеарата, встроенного в мембрану МП в растворах с KCl, ФСР и сахарозном от осмолярности среды прединкубации. Пунктирная линия - зависимость оптической плотности суспензии МП от осмолярности среды (уменьвение оптической плотности суспензии происходит в результате просветления матрйкса МП при набухании).

Десятиминутная прединкубация в сахарозной среде повышающейся осмолярности и последующая инкубация в изоосмотическом сахарозном растворе или ФСР сопровождалась увеличением V , что Указывает на ограничение подвижности метки в результате упорядочения молекул фосфолипидов внутри бислоя. В противоположность этому, в среде.

30 100 200 300

ыОсМ

содержащей KCl,

било снижено. При низкой осмолярности среды

прединкубации параметр совпадал для всех трех сред. Таким

образом, гипоосмотичесжов воздействие изменяет подвижность фо-

сфолипидов в мембранном бислое, а высокая концентрация ионов С1~ усиливает этот эффект. Из этого следует, что для связи ККмит с мембраной митопластов важна сохранность нативноя конфигурации мембраны и упорядоченность фосфолипидного бислоя. Кроме того, следует сделать вывод о неправомерности использоания сред с высоким содержанием иона С1~ для имитации физиологической среды при изучении ККмит.

3. Регуляция дыхания а условияу пяд>имита ККмит лш няследственноп карпиомиопатии X сириятих хомяков линии СНГ-146.

При некоторых видах патологии, в частности, при кардиомиопатии, тонкий механизм сопряжения ККмит с системой окислительного фосфорилирования в сердце может нарушаться. Ранее было показано, что тканевое содержание ККмит в сердце сирийских хомяков снижено (КЪисЬиа еЬ а1, 1989), а стимулирующий эффект креатина на скорость дыхания волокн из сердец сирийских хомяков менее выражен (Уека1ег еЬ а1, 1988). Исходя из этого можно предположить, что нарушается регуляторная функция ККмит, состоящая в усилении сигнала АДР для системы ОФ.

В связи с этим нами были исследованы зависимости скорости дыхания от концентрации АДР для скинированных кардиомиоцитов и волокон из золотистых (контроль) и сирийских хомяков линии С1П?-146. Изоферментный спектр креатинкиназ в сердечной ткани контролировали электрофоретичесхи.

Содержание ККмит во всех образцах из миопатических сердец уменьшалось примерно в 2 раза по сравнению с контролем, а содержание ВВ формы креатинкиназы возрастало, что согласуется с литературными данными. В контрольных экспериментах на здоровых

животных К^*®* для АДР в окислительном фосфорилировании в случае скинированных волокон и кардиомиоцитов составляла 133±20 мкМ и 161±56 мкМ, соответственно (табл.4). Добавление креатина в среду измерения снижало эту величину до 1Э,5±1,4 и 20±4 мкМ, соответственно. Таким образом, на скинированных волокнах и миоцитах были получены сходные результаты. Следовательно, межклеточные контакты в условиях перфорированной сапонином сарколеммы не являются препятствием для движения АДР.

ТАБЛИЦА 4. Кинетические параметры дыхания скинированных волокон и кардиомиоцитов из сердец сирийских (кардиомиопатия) и золотистых (контроль) хомяков.

Контроль" Кардиомиопатия

Параметр - Кр + Кр - Кр + Кр

1.Кардиомиоциты «м- мкМ V "макс' , нг ат О/мг мин 161±56 44±3 19,5±1,4 34±9

2.Скинир. волокна !(„, мкМ 133±20 20±4 120±16 81±13

^макс» , нг ат О/мг мин 31±7 28±6 29±8 « 26±5

Приведены средние значения и стандартные отклонения как минимум для 3 экспериментов. В случае кардиомиоцитов скорости нормировали на мг белка, в случае волохон - на иг. сухого веса.

В скинированных волокнах из миопатических сердец значение Км для АДР в отсутствие креатина было близко к контролю. Эффект креатина был более слабым, и Кмкаж снижалась только до 61 мкМ (табл.4). Отсуствие разницы в дыхательных характеристиках между скинированныыи кардиомиоцитами и скинированными волокнами в контрольных. экспериментах свидетельствует об адекватности результатов, полученных на скинированных волокнах. Таким образом, пониженное содержание ККмит в митохондриях сердца сирийских

хомяков сочеталось с нарушением эффективности регуляции дыхания, что подтверждает важную регуляторную роль этого изофермента в сердце.

ВЫВОДЫ

1. В клетках сердца основным препятствием на пути АДР к системе окислительного фосфорилирования в митохондриях является внешняя митохондриальная мембрана. Низкая проницаемость этой мембраны in vivo обусловлена неизвестным фактором, по-видимому, белковой природы.

2. Представляется наиболее вероятным, что в клетках сердца незначительные изменения в малых компартментах АДР могут служить ключевым сигналом регуляции дыхания в результате их многократного усиления в сопряженных креатинкиназных системах.

3. Митохондриальныя изофермент креатинкиназы способен эффективно регулировать окислительное фосфорилирование в митохондриях сердца в том случае, когда он локализован на внутренней мембране; при перемещении фермента в межмембранное пространство креатин теряет способность осуществлять акцепторный контроль окислительного фосфорилирования.

4. Нарушение связывания митохондриальной креатинкиназы с внутренней мембраной митохондрий при их набухании вызвано снижением уровня структурной организации фосфолипидов в мембране.

5. Дефицит митохондриальной креатинкиназы вызывает снижение эффективности метаболической регуляции дыхания при наследственной хардиомиопатии у сирийских хомяков линии CHF-146.

Спиаод публикация по хама пигтчтячм^

1. Kuznetsov A.V., Khuchua Z.A., Vassilieva E.V., Medvedeva N.V., Saks V.A. Heart mitochondrial creatine kinase revisited: the outer membrane ia not important for coupling of phosphocrea-tlne production to oxidative phosphorylation.// Arch. Biochem. and Byophys. 19B9. V. 268. No 1. P. 176-190.

2. Khuchua Z., Vaaallieva E.V.,Clark J., Korchazhkina O.V., Bra-niehte Т., Kapelko V.l., Kuznetsov A.V., Ventura-Clapier R. , .Steinschneider A.la., Lakomkin V.L., Ruuge E.K., Sake V.A. The creatine kinase system and cardiomyopathy.// The Am. Journal of Cardiovascular Pathology. 1992. V.4. Ho 3. P. 223-234.

3. Sake V.A. , Vassilieva E.V., Belikova "Уи.О. , Kuznetsov A.V. , Lyaplna S., Petrova L., Perov N.A. Retarded diffusion of ADP in cardiomyocyteo: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation.// Biochim. et Biophys. Acta. 1993. V.1144. P. 134-148.

•4. Васильева E.B., Беликова Ю.О., Лялина С.А., Петрова Л., Кузнецов A.B., Перов H.A., Кларк Дж. , Сакс В.А. О возможной роли внешнее мембраны митохондрия в регуляции окислительного фо-сфорилирования в клетках in vivo.// Биохимия. 1993. Т.58. Вып. 11. Стр. 1742-1754.

5. Belikova TTu.O., Vassilieva E.V., Khuchua Z.A., Saks V.A. Analysis of cellular mechanism of retarded diffueion of ADP in cardiomyocytes.// Abstracts of 5th BioThermoKinetics Meeting (ВТК). P.7. France. 1992.

6. Saks V.A., Belikova Yu.O., Vassilieva E.V., Khuchua Z.A. ADP pompartmentation in normal and myopathic cardiomyocytes. // J.

Mol. Cell. Cardiology. 1993. V. 25 (Supplement 1). P. 12.

7. Saks V.A., Belikova Yu.O., Vaasilieva E.V., Khuchua 2.A. , Kuznetaov A.V. Cardiac energetics: compartmentation phenomena, in normal and diseased myocardium.// Absracta of the 32-nd Congress of the international Union of Physiological Sciences. P.53. Glasgow 1993.

8. Saks V.A., Khuchua Z.A., Vassilieva E.V., Belikova Yu.O., Kuznetaov A.V. Metabolic compartmentation and substrate channeling in muscle cells. Role of coupled creatine kinases in in vivo regulation of cellular respiration - a synthesis. // In: Cardiac bioenergetics. Eole of coupled creatine kinase reactions. (Eds. V.Saks, R. Ventura-Clapier). Klüver Publishers, Boston, USA. In press (1994).