Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль кислорода и полианионов в индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль кислорода и полианионов в индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий"

РУ6 ой

. . .. г. • г"1

2 3 - 1

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

КУЗЬМИНОВА

Алевтина Евгеньевна

РОЛЬ КИСЛОРОДА И ПОЛИАНИОНОВ В ИНДУКЦИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена в отделе биоэнергетики . НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ.

Научный руководитель: доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Д.Б.Зоров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р.А.Звягильская

доктор биологических наук,

профессор

Н.Н.Чернов

Ведущая организация: Институт проблем передачи информации РАН.

Защита состоится 1998 года в часов

на заседании диссертационного совета Д.053.05.32 по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "¿¡¡Ь Окт?<Г/к>3 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В процессе дыхания в митохондриях энергия окислительно-зосстановительных реакций превращается s разность электрохимических ютенциалов ионов водорода на энерго-преобразующей мембране. Необходимым требованием сохранения трансмембранного потенциала ионов водорода является низкая проницаемость внутренней митохондриальной мембраны для ионов. Если это требование не сохраняется, митохондрии теряют дыхательный контроль и не :пособны к образованию АТФ. В этом смысле достаточно парадоксальным является эбнаружение во внутренней митохондриальной мембране ионных каналов, значение которых до сих пор остается загадочным (Sorgato et at, 1987, Kinnally et at, 1992, Zorov et al. 1992). Есть лишь предположение, что работа ионных каналов во внутренней мембране обеспечивает сохранение ионного баланса, постоянно нарушающегося из-за утечки ионов по направлению электрического поля на чембране.

Другим парадоксальным с точки зрения исследователя феноменом является знезапное изменение проницаемости внутренней мембраны, в результате чего она теряет барьерные функции и через нее свободно могут проходить как ионы, так и молекулы с массой до 1,5 кД (Leninger et al, 1967, Haworth and Hunter, 1979, Crompton et al, 1988). Это явление находится в фокусе исследователей уже около 30 пет, но до сих пор нет четкого понимания ни смысла этого явления, ни механизма ее возникновения. Есть несколько ключевых моментов, которые являются атрибутами митохондриальной неспецифической проницаемости. Во-первых, обязательными для этого процесса являются ионы кальция. Несмотря на то, что полный список возможных индукторов неспецифической проницаемости может занять несколько страниц, ни один из них не проявляет своих индуцирующих свойств без ионов кальция. Во-вторых, открытие такой неспецифической поры конечно приводит к устранению трансмембранного потенциала ионов водорода и уравновешиванию всех ионных градиентов. Последний момент является причиной для высокоамплитудного набухания митохондрий вследствие того, что концентрация белка в митохондриях выше чем во внемитохондриальной среде. Онкотическое давление белков матрикса определяет поступление воды в матрикс. Высокоамплитудное набухание является третьим атрибутом митохондриальной поры. Четвертым атрибутом, позволяющим отличить этот процесс от других,

является полная его блокада иммунодепрессантом, циклоспорином А (Вгоектеюг е( а1.1989, №удогос/оу а(. 1989).

Открытым остается вопрос о роли свободных радикалов в индукции митохондриальной поры. Вопрос этот обсуждается уже давно и последнее время приобрел большую актуальность. Эта актуальность прежде всего вызвана пересмотром роли кислородных радикалов в функционировании клетки (ЭЫасЬеу, 1996, Скулачев, 1994). Есть утверждение, что без кислорода вообще невозможна индукция неспецифической проницаемости (СаэШЬо е( а!, 1996, Kowaltowski е1 а1, 1996).

Последние три года прошли под флагом возрождения интересов, касающихся функционирования митохондрий. Это было вызвано открытием участия митохондрий в процессе программируемой клеточной смерти (апоптозе) (¿атгат е( а1, 1995). На данный момент считается, что для запуска одной из парциальных реакций апоптоза необходимо участие белкового фактора, находящегося в межмембранном пространстве митохондрий (МагсИеШ е1 а1, 1996, К1иск е1 а1, 1997, Уапд е{ а1, 1997). Этот фактор может освобождаться из митохондрий лишь при разрыве внешней мембраны, что происходит при высокоамплитудном набухании митохондрий. Считая первопричиной такого набухания возникновение во внутренней мембране митохондрий неспецифической митохондриальной поры, становится ясным, что без понимания механизма индукции поры и ее характеристик невозможно и понимание всего процесса апоптоза.

Некоторое время назад было постулировано, что митохондрии осуществляют транспорт нуклеиновых кислот внутрь митохондрий и осуществляют экспорт олигонуклеотидов во внемитохондриальную среду (Зоров, 1996). Ключевую роль в процессе транспорта нуклеиновых кислот отводили митохондриальному бензодиазепиновому рецептору. Существует доказательство того, что митохондриальная пора является функциональным состоянием митохондриального бензодиазепинового рецептора («¡ппаПу е1 а!, 1993). Таким образом предполагается, что митохондриальная пора функционально может быть связана с транспортом нуклеиновых кислот. Более того постулируется непосредственное участие нуклеиновых кислот в регуляции неспецифической проницаемости митохондрий.

Целью настоящей работы было изучение роли различных факторов в индукции и регуляции неспецифической проницаемости митохондрий, а также изучение динамики развития этого явления. В ходе исследования предполагалось изучать роль кислорода в возникновении митохондриальной поры. Была поставлена

задача имитации клеточных условий гипоксии, о которых известно, что митохондрии ;охраняют мембранный потенциал даже при полной блокаде переноса электронов в цыхательной цепи митохондрий (О^эа е! а), 1995).

Кроме этого, была поставлена цель изучить влияние ряда молекул, моделирующих нуклеиновые кислоты по величине и заряду (синтетические полианионы) на функционирование митохондриальной поры. Ранее было известно, что такие молекулы могут взаимодействовать с белком внешних митохондриальных мембран, порином (Коеп/д е1 а1. 1977).

Предполагалось определить последовательность процессов, протекающих при возкникновении неспецифической проницаемости.

Научная новизна работы. Показано, что в анаэробных условиях при сохранении мембранного потенциала митохондрии становятся более чувствительными к повреждающему действию ионов кальция. В работе для поддержания мембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий в условиях гипоксии митохондрии энергизовались сукцинатом в присутствии либо искусственного акцептора электронов феррицианида либо АТФ. Разбирались две модели гипоксии - физическая гипоксия (отсутствие кислорода) и химическая гипоксия (блокада дыхания цианидом). Показано, что в обоих условиях происходит активация ионами кальция неспецифической проницаемости митохондрий. Таким образом роль кислорода в индукции поры является проблематичной.

Показано, что синтезированный нами полианион, являющийся сополимером акриловой кислоты, стирола и малеинового ангидрида индуцирует в митохондриях из печени крыс ингибируемую циклоспорином А неспецифическую проницаемость с быстрым выходом из митохондрий цитохрома с, известного не только своей способностью участвовать в процессе переноса электронов в дыхательной цепи митохондрий, но и являющегося кофактором апоптоза.

Определена последовательность парциальных реакций, реализуемых при активации митохондриальной поры. Для этого был проведен анализ данных измерений в многоканальной ячейке, позволяющей регистрировать четыре параметра митохондриальной активности - дыхание, трансмембранный потенциал , потоки ионов кальция и осмотическую активность митохондрий одновременно.

Практическое значение работы. Полученные результаты позволяют ответить на вопрос о влиянии гипоксии на функционирование митохондрий в условиях кальциевой нагрузки. Данные настоящей работы могут изменить стратегию в решении вопроса об управлении процессом программируемой клеточной гибели

клетки. При соответствующей доработке они могут быть использованы в клинических условиях для предотвращения клеточных повреждений при реперфузии и реоксигенации. Результаты создают предпосылки для решения фундаментальных проблем по роли митохондриального генома в функционировании клетки.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ Физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (Москва 199?, 1998). Результаты также были представлены на 9-ой и 10-ой Европейской Биоэнергетической конференциях (Лувен-ла-Нев, Бельгия 1996,1998), на конференциях "Горизонты митохондриальных исследований" (Олбани, США, 1996, 1998), на Биофизическом конгрессе (Новый Орлеан, США, 1997), на 2-ом Биохимическом Съезде РАН (Москва, 1997).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 13 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Митохондрии печени выделяли методом дифференциального центрифугирования (Johnson & Lardy, 1967). Среда выделения митохондрий содержала 0.3 М перекристализованную сахарозу, 5 mM HEPES, 500 дМ ЭДТА, pH 7,4. Последнюю отмывку митохондрий проводили в среде, содержащей те же компоненты без ЭДТА.

Четыре митохондриальных параметра регистрировались одновременно в специальной многоканальной ячейке с обьёмом 1,7 мл: регистрацию потребления кислорода митохондриями осуществляли полярографическим методом при помощи закрытого кислородного электрода типа Кларка и полярографа LP-7e (Чехословакия); содержание ионов кальция в ячейке измеряли лотенциометрическим методом при помощи кальцийселективного электрода; регистрацию мембранного потенциала митохондрий осуществляли также потенциометрически по распределению проникающего катиона тетрафенилфосфония (ТФФ*) через мембранный фильтр с диаметром пор 5 цт, пропитанный раствором азолектина в декане (100 мг/мл); изменение объёма

митохондрий регистрировали по изменению светопропускания суспензии митохондрий при длине волны 660 нм. Перемешивание среды инкубации и суспензии митохондрий производили при помощи магнитной мешалки.

Состояние гипоксии достигали насыщением среды инкубации N2, в результате чего уровень кислорода в среде инкубации снижался с 480 до 50 нг атомов/мл. Остатки кислорода удалялись либо за счет митохондриального дыхания в герметично закрытой ячейке, либо в некоторых случаях добавкой глюкозы/глюкозоксидазы (5 тМ и 300 ед/мл соответственно). Для удаления супероксидных радикалов добавлялась супероксиддисмутаза (500 ед/мл). После достижения анаэробного состояния, митохондрии энергизоаались: а) феррицианидом калия (500 цМ), б) АТФ (500 цМ), в) смесью фосфоенолпируват (5 тМ)/ пируват киназа (2 ед)/ АДФ (20 цМ).

Окислительно-восстановительное состояние цитохрома с и a+as регистрировалось на спектрофотометре SLM - Amiпсо DW2000 как разность поглощения при 550/575 нм и 605/630 нм соответственно. Расчет количества цитохромов проводили, используя подход, предложенный Евтодиенко и Моховой (1967).

Концентрацию белка определяли биуретовым методом, используя БСА в качестве стандарта. Концентрация белка в экспериментах составляла в среднем 0,5 мг/мл.

Стандартная среда инкубации митохондрий содержала: 250 мМ сахарозы, 10 мМ HEPES, 5 мМ сукцината, 2 мМ К2НРО4, 1 цМ ротенона, 3 цМ тетрафенилфосфония, pH 7.4 доводили при помощи трис-ОН. Эксперименты проводились при 20°С.

Полианион, представляющий собой сополимер стирола, малеинового ангидрида и метакриловой кислоты, был синтезирован по методике Т. Konig и соавт. (1979) и любезно предоставлен H.H. Мелик-Нубаровым. Взаимодействие полианиона с цитохромом с оценивали по гашению флуоресцении меченого флуоресцеином полимера.

Все параметры, регистрируемые в многоканальной ячейке, записывались на два двухканальных самописца, затем сканировались, оцифровывались программой "Windig", и обрабатывались в "SigmaPlot" в виде отдельных графиков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Одновременная регистрация нескольких параметров как подход к изучению механизма неспецифической проницаемости митохондрий.

Для многостороннего изучения митохондризльной неспецифической проницаемости была создана специальная установка, позволяющая в малом объеме (1,7 мл) изучать несколько параметров. Считая наиболее важными в индукции митохондриальной поры слежение за потреблением кислорода, величиной трансмембранного потенциала, потоками Са2* и объемом митохондрий, данные параметры измерялись и анализировались. На рис.1 дан пример такой одновременной записи четырех параметров при индукции поры различными

концентрациями ионов кальция.

мх

мх

С <

Рис.1. Влияние различных концентраций Са2*

(соответствуют цифрам у кривых 8 ¡лМ) на кальциевую ёмкость митохондрий печени крыс, А.лотребление кислорода; Б: изменение мембранного потенциала; В; изменение внемитохондриального Са2"; Г: изменение объёма митохондрий. Условия -см. "Материалы и методы".

Очевидна развивающаяся во времени активация дыхания, увеличение светорассеяния суспензии митохондрий, двухфазная кинетика падения трансмембранного потенциала и выход из митохондрий накопленного Са2+.

2. Влияние гипоксии на индукцию неспецифической проницаемости в митохондриях печени крысы. Энергизация сукцинатом в присутствии феррицианида как акцептора электронов.

Хотя митохондриальная неспецифическая проницаемость исследуется уже в течение нескольких декад, как ее механизм, так и физиологическая ее значимость остаются далеко не ясными. Однако есть достаточно много убедительных доказательств того, что митохондриальная пора вовлечена в клеточный ответ на окислительный стресс (Carbonera and Azzone, 1988, Crompton et al., 1987, Niemenen et al, 1995). При индукции поры гидроперекисями или SH-реагентами, ловушки свободных радикалов (Novgorodov et al., 1987) или каталаза (Valle et al., 1993) эффективно ее предотвращают. Ранее высказывалось разумное предположение, что радикалы, образуемые при окислительном стрессе или в условиях, его имитирующих, взаимодействуют с компонентами внутренней мембраны митохондрий, ответственными за индукцию неспецифической проницаемости. Активная роль в этом механизме отводилась процессам перекисного окисления. Естественно, эти процессы предполагали неспосредственное участие молекулярного кислорода в общем каскаде реакций, протекающих при индукции неспецифической проницаемости. 8 работах из группы Vercesi кислороду отводилась если не главенствующая, то по крайней мере обязательная роль, без которой по мнению авторов процесс возникновения митохондриальной поры не является возможным (Kowaltowski et al. 1996). По мнению Скулачева Са2*-зависимая пора возникает в митохондриях в ответ на суперпродукцию кислородных радикалов в основном самими митохондриями (Скулачев, 1994).

Надо отметить, что на фоне общей проблемы соответствия результатов, получаемых на изолированных митохондриях реальным процессам, протекающим в клетке, зачастую теряется малая проблема необходимости изучения влияния одного фактора без затрагивания других компонентов. Это имеет отношение к проблеме влияния гипоксии на ряд биологических систем, когда механическое истощение Ог в среде, окружающей биологический объект, рассматривается как инструмент исследования влияния одного лишь кислорода и ничего более. Надо заметить, что в выделенных митохондриях, не способных к утилизации кислорода, достаточно

быстро происходит падение трансмембранного потенциала ионов водорода. Этого не происходит в клетке, где трансмембранный потенциал поддерживается некоторое время в условиях гипоксии за счет обращения реакции образования АТР (DiLisa et al„ 1995). Видимо постоянство трансмембранного потенциала в митохондриях является очень важным моментом для клетки. Это налагает на исследователя требование соблюдать постоянство потенциала в митохондриях при изучении влияния гипоксии на функционирование митохондрий.

В данной работе использовались разные способы энергизации митохондрий. Феррицианид является хорошим акцептором, способным принять электроны в различных участках дыхательной цепи, поэтому он и использовался в этом исследовании.

В условиях, когда содержание кислорода в среде инкубации митохондрий снижается настолько, что дыхание останавливается, энергизация митохондрий возможна от окисления сукцината с последующим восстановлением феррицианида. Другой моделью изучения влияния гипоксии на митохондриальную активность была выбрана так называемая "химическая гипоксия" , когда в среде имеется избыток кислорода, но дыхание заблокировано, в данном случае 1 мМ KCN. В этих условиях также возможно поддержание трансмембранного потенциала за счет окисления сукцината в митохондриях в присутствии феррицианида.

Из рис.2 следует, что события, характерные для развития в митохондриях неспецифической проницаемости при добавлении к ним Са2* в присутствии неорганического фосфата, имеют место и при истощении из среды кислорода как за счет одного дыхания, так и при дальнейшем снижении его концентрации добавлением к анаэробным митохондриям смеси глюкозы с глюкозоксидазой. Внесение в среду супероксиддисмутазы не влияло на развитие эффекта. Более того отмечается, что при физической гипоксии отмечается более выраженные изменения, характеризующие увеличение повреждающего воздействия Са2* митохондрий.

На рис.3 видно, что все изменения митохондрий, наблюдаемые при добавлении Са2> в условиях гипоксии, можно приписать возникновению неспецифической проницаемости, так как они полностью устраняются циклоспорином А. Одновременно отметим нечувствительность индукции поры к ловушке свободных радикалов, ионолу, что исключает возможность участия свободных радикалов в индукции митохондриальной поры в условиях гипоксии.

Рис.2. Эффект 3 цМ Саг* на функционирование митохондрий печени крыс в условиях нормоксии (а), в условиях нормоксии в присутствии 1 тМ КСЫ (б) и в анаэробных условиях (в). А: потребление кислорода; Б: изменение мембранного потенциала; В: изменение внемитохондриального Св2*; Г: изменение объёма митохондрий. Добавки: 5 тМ глюкозы, 300 ед./мл глюкозоксидазы (ГО), 500 едУмл супероксиддис-мутазы (СОД), 500 ¿¿М КзЯе^СЛ/;«. В Б, В и Г глюкоза и супероксиддисмутаза были добавлены перед глюкозоксидазой (не показано).

мх

K/e(CN),

[ТФФ'], мМ

Рис.3. Влияние ионола (И) на кальциевую ёмкость

митохондрий печени крыс в нормоксичных и анаэробных условиях (см. "Материалы и методы"). А: нормоксия; Б: анаэробные условия. Добавки: 50 ¡лМ ионола (И), 4,5 /лМ Са2*, 5 тМ глюкозы, 300 ед./мл

глюкозоксидазы (ГО), 500 е& 1мл супероксиддисмутазы (СОД),

500 мМ К3 Fe(CN)s, циклоспорин А (цсА).

5 х 10" М

Данный эффект индукции поры является Са2*-зависимым и усиливается при увеличении концентрации Са2+, что следует из рис.4.

Рис.4. Изменения в распределении ионов Са2* между митохондриями печени крысы (МХ) и средой инкубации

регистрируемые Са2*-селективным электродом. А: контрольные условия нормоксии;

Б: контрольные условия нормоксии с добавкой 1 тМ КСЫ; В: анаэробные условия (см. "Материалы и методы")- Цифры у кривых соответствуют концентрации Са2* (цМ). Добавки: 5 тМ глюкозы, 300 ед./мл глюкозоксидазы (ГО), 500 ед./мл супероксиддисмутазы (СОД), 500 ММ К3Ре(СЫ)е.

3. Влияние гипоксии на индукцию неспецифической проницаемости в митохондриях печени крысы. Энергизация от АТФ или АДФ с пируват/пируваткиназой.

Добавление 500 цМ АТФ к суспензии анаэробных митохондрий приводит к сохранению их мембранного потенциала. В условиях энергизации митохондрии сохраняют способность к ийдукции неспецифической проницаемости в отсутствии кислорода (Рис.5).

MX

Рис.5. Влияние Са2* на анаэробные митохондрии печени крыс, энергизованные АТФ (500рМ). А:изменение объёма митохондрий; Б: изменение вне-митохондриального Са2*. Кривые а и б -одинарная добавка 100 рМ и

последовательные добавки 50 рМ Са2* соответственно. Rot - ротенон. Условия - см. "Материалы и методы".

Несмотря на то, что скорее всего в клетке энергизация митохондрий в гипоксии обеспечивается именно за счет клеточного АТФ, использование этого нуклеотида при исследовании митохондриальной поры в изолированных митохондриях требует обязательного учета его ингибирующего действия (Le Quoc and Le QuocK, 1988). Для устранения вклада еще одного регулятора неспецифической проницаемости а данной работе использовалась третья система энергизации митохондрий, которая сохраняет низкую стационарную концентрацию адениновых нуклеотидов. Эта система включает в себя АДФ в низкой концентрации (20 цМ) и смесь пирувата с пируваткиназой, обеспечивающую постоянный поток образованного АТФ, необходимого для поддержания мембранного потенциала. И в этом -случае в анаэробных условиях ионы Са2" индуцировали в митохондриях

п

неспецифическую проницаемость (Рис.6). Таким образом при трех возможных способах энергизации митохондрий в анаэробных условиях ионы С а2* индуцируют митохондриальную пору.

ГТФФ*], цМ о 0.72,5 5 —1

1Са!*1.нМ Ко1 0.5-

АДФ ФЕПI

Рис.6. Са -индуцированные изменения мембранного потенциала (А),

внемитохондриальнозо Са2* (Б) и митохондриального объёма (С) в митохондриях (МХ), знергизованных

20 рМ АДФ в системе фосфоенолпируват (ФЕП 5 тМ)/ пируваткиназа (ПК 2 ед.) в анаэробных условиях. СаС12 (50 ММ (а) и 100 рМ (6)) добавлен как показано. Но? -ротенон. Условия - см. "Материалы и методы".

4. Влияние степени восстановленноети дыхательных переносчиков на индукцию Саг+-зависимой поры.

Так как основной целью этой работы являлась оценка роли кислорода в индукции неспецифической проницаемости митохондрий, по возможности устраняя опосредованное влияние вторичных факторов, проводилась оценка влияния степени окисления компонентов дыхательной цепи на эффективность индукции митохондриальной поры в анаэробных условиях. Известно, что степень

восстановленное™ дыхательных переносчиков является фактором, провоцирующим неспецифическую проницаемость митохондрий (Beatrice et al, 1980).

Измерение степени восстановленное™ цитохромов а+а3 и с в анаэробных условиях при знергизации различными способами показало, что в то время как при энергизации феррицианидом происходит сильное окисление цитохромов, при знергизации от АТФ степень восстановленное™ их не меняется (Рис.7, 8). Последнее относилось как к энергизации от 500 цМ АТФ, так и от 20 цМ АДФ в регенерирующей системе. Учитывая то, что в обоих случаях отмечалось Са2*-зависимое образование митохондриальной поры, качественно отсутствие эффекта кислорода на индукцию неспецифической проницаемости в митохондриях можно считать доказанным. Разница в величине эффектов при разных способах энергизации может быть объяснена вкладом тормозящего действия адениновых нуклеотидов при энергизации АТФ и активирующего действия окисленного состояния дыхательных переносчиков при энергизации феррицианидом.

5. Влияние полианионов на индукцию неспецифической проницаемости митохондрий.

Кроме оценки влияния гипоксии на индукцию митохондриальной поры в данной работе осуществлялась попытка поиска эндогенных регуляторов неспецифической проницаемости. Отдавая отчет в том, что эти возможные регуляторы могут в принципе быть и регуляторами апоптоза, их поиск соредотачивался среди молекул, способных в частности осуществлять выход молекул цитохрома с из митохондрий. К этим молекулам-регуляторам могут быть предъявлены два требования -либо порознь, либо вместе в зависимости от механизма освобождения цитохрома с из митохондрий. Если освобождение цитохрома с из митохондрий является простым результатом набухания митохондрий и разрыва внешней мембраны вследствие индукции неспецифической проницаемости, то регулятором может быть любой индуктор поры. Если же для освобождения молекулы цитохрома с необходимо влияние на структурные связи этой молекулы с белками внутренних мембран, то регулятор должен непосредственно взаимодействовать с молекулой цитохрома с. Анализ показал, что в принципе такими регуляторами могут служить макромолекулы нуклеиновых кислот. В этом анализе учитывался постулат взаимодействия нуклеиновых кислот с митохондриальным бензодиазепиновым рецептором (Зоров, 1996) и доказательство того, что митохондриальная пора является функциональным состоянием бензодиазепинового рецептора (Kinnally et al., 1993).

lipttMJI.MHtl

Время, мин

Цремя, мин

Рис.7. Изменение дифференциального спектра цитохромов a + a3 (А) и с + с, (Б) при наступлении анаэробиоза в митохондриях печени крыс и последующей энергизации феррицианидом калия. 1 цМ ротенона (Rot), 300 ед./мл глюкозоксидазы (ГО), 500 /иМ K3Fe(CN)s добавлены как показано стрелками. 5 тМ глюкозы и 500 ед./мл супероксиддисмутазы добавлены в среду инкубации.

Рис.8. Изменение дифференциального спектра цитохрома с при наступлении анаэробиоза. (А) АТФ (500 цМ) и (Б) АДФ (20 ^М) с фосфоеноппирува-том 5 (тМ) + пируваткиназой (2 ед.) добавлены как показано стрелками. Феррицианид (500 цМ) был добавлен для демонстрации степени

восстановленности цитохрома с.

В данной работе использовался сополимер акриловой кислоты, стирола и малеинового ангидрида, являющийся продуктом синтеза. Эта макромолекула несет большое количество отрицательных зарядов и может рассматриваться как модель негидролизуемого аналога нуклеиновых кислот.

На рис.9 продемонстрирован эффект полианиона (ПА) на функциональные параметры митохондрий. Очевидно, что ПА вызывает изменения, характерные для индукции неспецифической проницаемости за исключением наличия развивающейся во времен и активации дыхания, быстро наступающее угнетение дыхания видимо определяется утратой митохондриями цитохрома с, ибо добавка его значительно восстанавливает дыхание. Отметим, что наступление торможения дыхания коррелирует с почти максимальным увеличением митохондриального объема. Все эти процессы чувствительны к циклоспорину А, что позволяет их отнести к атрибутам неспецифической проницаемости митохондрий.

мх мх

5.0-

а

А

крысы (а). То же с циклоспорином А (б).

полианиона (ПА) на дыхание (А), мембранный потенциал (Б) и объём (В) митохондрий печени

Рис.9. Действие

мх1

2 мим

3

В

Добавки: 50 м кг/мл полианион (ПА), 5 х 10'7 М циклоспорин А (цсА), 5,5 цМ цитохром с. Условия - см. "Материалы и методы".

ЧСА ПА

О том, что митохондрии действительно теряют цитохром с, свидетельствует рис.10, на котором представлены результаты спекгрофотометрического измерения его содержания в самих митохондриях и во внемитохондриальной среде при добавлении к среде ПА.

0.005 ед.опт.пп.

Рис.10. Спектры поглощения цитохрома с в митохондриях (б, г) и в среде инкубации митохондрий (а,в) после действия полианиона 50 мкг/мл (а,6} и полианиона с циклоспорином А (5 х 10'7 М) (в,г). Стандартная среда инкубации содержала 2x10"5 М ротенона, Ю'е М антимицина А и 0,5 тМ ЫАОН. Добавки: 3 тМ аскорбата, 10 /лМ ТМФД, 2 тМ КСЫ.

¡во к им

Эффект ПА наблюдался не только при окислении сукцината, но и ТМФД+аскорбата. Рис.11 является демонстрацией, во-первых, того, что ПА угнетает дыхание в присутствии разобщителя и, во-вторых, того, что степень реактивации дыхания экзогенным цитохромом с зависит от концентрации ПА в среде. Совокупность фактов говорит о том, что ПА инактивирует цитохром с, в результате чего теряется его способность взаимодействовать с компонентами дыхательной цепи. Эффект ПА был более выражен при работе с митопластами, то есть с митохондриями, обедненными внешними мембранами. В последнем случае ингибирование дыхания наступало сразу после добавления ПА.

Рис. 11. Влияние полианиона на разобщенное дыхание митохондрий печени крысы, (а, б и в - 50, 75 и 100 мкг/мл полианиона). Карбонилцианид-хлорофенилгидразон (СССР, 10'7 М) и цитохром с (5,5 рМ) добавлены как

показано. Цифры на кривых - скорости дыхания в относительных единицах.

следования in vitro показали, что молекулы ПА непосредственно взаимодействует с молекулами цитохрома с. Таким образом совокупность данных свидетельствует о том, что ПА обладает двояким действием - с одной стороны индуцирует в митохондриях неспецифическую проницаемость, а с другой, связывается с молекулами цитохрома с и освобождает последние из мембран. В индукции поры, вызванной ПА, вполне могут участвовать ионы Саг*, связанные с молекулой полимера.

В лаборатории структуры и функции митохондрий Института им. А.Н.Белозерского кроме синтетического полимера был исследован ряд полианионов природного происхождения. Двухцепочечные ДНК из спермы лосося и митохондриальная ДНК не оказывали заметного влияния на функционирование митохондрий, в то время как РНК из вируса табачной мозаики индуцировала в митохондриях изменения, аналогичные наблюдаемым при действии ПА.

6. Последовательности событий при активации неспецифической проницаемости

Митоходриальные параметры, измеряемые в каждом опыте по активации неспецифической проницаемости, были использованы для анализа организации

17

а

последовательности процессов каждого из исследуемых факторов, а именно: скорости дыхания, транспорта С а2' , трансмембранного потенциала и митохондриального объема.

Б работе исходили из того, что постоянные времени ответа всех датчиков, регистрирующих митохондриальные параметры, близки и составляют порядка секунды. Для анализа каждая из измеряемых кинетик была оцифрована и представлена в виде функции, которая была дифференцирована.

1 2 3

Время, мин

Рис.12. Сравнение четырёх кинетик развития митохондриальной поры. За 100% взята точка через 3 минуты после добавки Са2*. а - транспорт ионов кальция, б - мембранный потенциал, в - потребление кислорода, г - набухание.

На рис. 12 представлены первые производные от изменений в значениях всех четырех параметров. Видно, что при индукции неспецифической проницаемости ионами Саг* характернее процессы укладываются в следующую последовательность: сначала происходят изменения транспорта Са2+, затем меняется трансмембранный потенциал, далее следуют изменения скорости дыхания и замыкают цепь последовательностей изменения в объеме митохондрий.

выводы

1. Показано, что неспецифическая проницаемость митохондрий индуцируется онами Ca2* в анаэробных условиях при энергизации феррицианидом. При этом аблюдается повышение чувствительности процесса индукции к ионами Ca2*. [ыхательные переносчики в условиях энергизации становятся максимально кисленными.

2. При энергизации 500 цМ АТФ или 20 цМ АДФ, в присутствии сопряженной истемы, генерирующей АТФ, также наблюдается образование Са2*-зависимой 1итохондриальной поры при отсутствии кислорода в среде. Окислительно-осстановительное состояние дыхательных переносчиков при такого типа нергизации не изменяется.

3. Полианионы могут рассматриваться как агенты, способные участвовать в роцессе индуцированного неспецифической проницаемостью апоптоза, ибо пецифически взаимодействуют с цитохромом с и приводят к освобождению его из (итохондрий.

4. Сопоставление ряда процессов, происходящих при Са2*-индуцированной еспецифической проницаемости, позволяет организовать их активацию в ледующей последовательности: сначала происходят изменения потоков Ca2* в мтохондриях, э результате чего меняется трансмембранный потенциал ионов одорода, за этими изменениями следует активация дыхания, приводящие в онечном счете к изменениям митохондриального объема.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Kuzminova А.Е., Krasnikov B.F., Zorov D.B. The mitochondrial premeability •ansition pore induced under anaerobic conditions. Bioch. Bioph. Acta, EBEC Short teports, 1996, Vol.9, p. 122.

2. Zorov D.B., Krasnikov B.F., Kuzminova A.E., Dobrov E.N., Zorova L.D. The jnctions of the permeability transition pore. Frontiers of Mitochondrial Research. The 996 Albany Conference, Rensselaerville, abstract. 19.

3. Kuzminova A.E., Krasnikov B.F., Zorov D.B. Hypoxia makes mitochondria more ensitive to permeability transition pore opening. Biophys. J., 1997, Vol.72(2), p.A39.

4. Zorova L.D., Kuzminova A.E., Dobrov E.N., Krasnikov B.F., Zorov D.B. Viral-iduced permeability transition pore in miutochondria. Biophys. J., 1997, Vol.72(2), p.A39.

5 Зоров Д.Б., Высоких М.Ю., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Красников Б.Ф., Кузьминова А.Е., Меликов К.Ч., Самсонов А.К., Стельмашук Е.В.. Структура и функции митохондриальной поры. Второй Биохимический Съезд РАН, 1997, с.378.

6. Krasnikov B.F., Kuzminova А.Е., Zorov D.B.. The Ca^-induced pore opening in mitochondria energized by succinate-ferrycyanide electron transport. FEBS Letters, 1997, Vol.419, p. 137-140.

7. Zorov D.B., Krasnikov B.F., Kuzminova A.E., Visokikh M.Yu., Zorova L.D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports, 1997, Vol.17, No.6, 507-520.

8. Kuzminova A.E., Zhuravlyova A.V., Krasnikov B.F., Vyssokikh M.Yu., Zorov D.B. The oxygen and calcium synergism in permeability transition pore. EBEC Short Reports, BBA, 1998, vol.10., p. 166.

9. Kuzminova A.E., Zhuravlyova A.V., Vyssokikh M.Yu., Zorova L.D., Krasnikov B.F., Zorov D.B. The permeability transition pore induced under anaerobic conditions in mitochondria energized with ATP. FEBS Letters, 1998, Vol.434, p.313-316.

10. Zorova L.D., Krasnikov B.F., Kuzminova A.E., Dobrov E.N., Zorov D.B Viral-induced premebility transition pore in mitochondria. FEBS Letters, 1998, (in press).

11. Высоких М.Ю., Гончарова Н.Ю., Журавлева A.A., Зорова Л .Д., Красников Б.Ф., Кузьминова А.Е., Меликов К.Ч., Мелик-Нубаров Н.С., Самсонов А.В., Белоусов В.В., Прищепова А.Е., Зоров Д.Б. Белковые комплексы митохондриальных контактных сайтов. Биохимия, 1999, (в печати).

12. Kuzminova А.Е., Krasnikov B.F., Melik-Nubarov N.S., Zhuravlyova A.V., Zorova L.D., Isaev N.K., Prishepova A.E., Vyssokikh M.Yu., Zorov D.B. interplay between polyanions and cytochrom с in mitochondria. Biophys. J., 1999, Vol.76, N2, Part 2 (in press).

13. Zorova L.D., Kuzminova A.E., Prishepova A.E., Vyssokikh M.Yu., Dobrov E.N., Zorov D.B., Krasnikov B.F. Viral RNA induces a permeability transition and a concomitant release of cytochrome с from mitochondria. Biophys. J., 1999, Vol.76, N2, Part 2 (in press).