Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция ионной проницаемости митохондрии в условиях протекания свободнорадикальных реакции

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция ионной проницаемости митохондрии в условиях протекания свободнорадикальных реакции"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имею» М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

Кушнарева Юлия Ефимовна

РЕГУЛЯЦИЯ ИОННОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ ШОХОЩРШ В УСЛОВИЯХ ПРОТЕКАНИЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬШХ РЕАКЦИИ

03.00.01. - радиобиология 03.00.02. - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990 г.

Работа выполнена в лаборатории радиационной биофизики кафедры биофизики Биологического факультета и в секторе биоэнергетики Межфакультетской проблемной научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии имени А.Н.Белозерского МГУ.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Ю.Б.Кудряшов Научный консультант: кандидат биологический наук С.А.Новгородов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В.К.Мазурик

кандидат биологических наук, доцент Ю.Н.Лейкин

Ведущая организация: Институт химической физики АН СССР

* ■ Г- -3 о

Защита состоится "17" С/£ 1990 года в ^ часов

на заседании специализированного совета Д.053.05.74 по адресу:

Москва 119899, Ленинские горы. Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан НОа О Ь^А 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук I ——=0.Р.Колье

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Согласно современным представлениям, помимо традиционно рассматриваемой радиобиологической мишени - ДНК, критическими структурами, ответственными за лучевую гибель клетки являются также биомембраны. Исключительно важное значение имеет изучение свободнорадикальных реакций в липидах биомембран, которые активируются при воздействии на клетку ионизирующего излучения. Интенсивное неконтролируемое развитие липопероксидации вызывает накопление липидных радиотоксинов - продуктов окисления ненасыщенных жирных кислот, включающих радикалы, альдегиды, эпокси-ды, кетоны, гидроперекиси /Балтабардзыс и др., 1966/. Накопление этих веществ приводит к нарушению проницаемости и других функций биомембран, вызывая в конечном итоге гибель клетки. Однако, к настоящему времени недостаточно изучена роль липидных радиотоксинов в развитии пусковых механизмов при лучевом поражении.

Важным аспектом изучения биологической роли свободнорадикальных реакций является выяснение их действия на митохондрии - основную энергообеспечивающую систему клетки. Внутренняя мембрана митохондрий непосредственно участвует в сопряжении процессов* трансформации энергии в клетке при окислительном фосфорилировании. В мембране митохондрий функционирует множество селективных систем транспорта неорганических ионов и метаболитов, которые поддерживают ионный гомеостаз. Имеются также данные о существовании во внутренней мембране митохондрий системы, обеспечивающей неспецифическое перераспределение веществ с Мг < 1500 (неселективная Са2+- зависимая пора) /Crompton,i987; Riley,1985/. Гидроперекиси вызывают активацию поры, что приводит к полной диссипации трансмембранного потенциала (Дф) и выходу ионов и метаболитов из мат-рикса. Открытие поры может являться одним из первичных нарушений, -ызываицих гибель клетки при активации свободнорадикальных про-

- г -

цессов, в том числе и при лучевом поражении.

С другой стороны, стационарные свободнорадикальные процессы в частности, перекисное окисление липидов (ПОЛ), играют сущест венную роль не только в патологических, но и в нормальных метабо лических и регуляторных функциях клетки /Бурлакова,Храпова,1985/ ПОЛ является механизмом разборки и обновления мембран и модифика тором работы мембранных белков /Каган,1981; Бурлакова,1976; Собо лев,1982/. Гидроперекиси необходимы также для синтеза гормонов -простогландинов, лейкотриенов и др. /Будницкая,1986/. Важную рол! играет стационарный уровень перекисных соединений в регуляцш транспорта ионов и метаболитов через мембрану. Имеются данные с том, что функционирование активируемой гидроперекисям! Саг+-зависимой поры может быть физиологически значимым процессом, обеспечивающим обмен низкомолекулярных веществ между матриксоь митохондрий и цитоплазмой. Возможно, функционирование неспецифической поры является одним из этапов реализации гормонального сигнала в клетке /На1еБ1;гар et а1.,198б/.

Факторы, контролирующие ион-транспортирующие системы в условиях протекания свободнорадикальных реакций, остаются к настоящему времени невыясненными. Адекватной моделью для изучения этих процессов является воздействие на митохондрии органических гидроперекисей, которые хорошо имитируют действие липидных гидроперекисей. Липидные гидроперекиси, как было показано Ю.Б.Кудряшовым, обладают радиомиметическими свойствами /Кудряшов,1966/.

Целью настоящей работы является изучение механизма индукции ионной проницаемости внутренней мембраны митохондрий при действии органических гидроперекисей. Исследуются факторы, регулирующие индуцируемую органическими гидроперекисями Са2+-зависимую пору. Изучались следующие вопросы: а), роль свободнорадикальных реакций, б), влияние субстратов и ингибиторов АТФ синтазы, в), роль

|), г), механизм действия циклоспорина А - ингибитора индукции эры, д). роль АТФ/АДФ антипортера.

Научная новизна работы. Обнаружено, что неспецифическая про-щаемость индуцируется в митохондриях лишь в условиях протекания зободнорадикальных реакций. Впервые показано, что индукторами 12+-зависимой поры являются специфические свободные радикалы; ^радикальные продукты ПОЛ не участвуют в активации Са2+- зависи-эй неспецифической проницаемости.

Впервые показано, что действие ингибитора АТФ синтазы олиго-щина, в отличие от субстрата - АДФ, опосредуется не влиянием на зободнорадикальные процессы, а изменением величины Дф. Таким об-эзом выявлен еще один фактор регуляции Са2+-зависимой поры - ве-гшна Аф в митохондриях.

Впервые показано, что циклоспорин А способен не только пред-гвращать индукцию Са -зависимой поры, но и вызывать ее закрыто, т.е. является ингибитором транспорта через пору. Действие жлоспорина зависит от конформационного состояния АДФ/АТФ анти-эртера. Предложена гипотеза о функционировании АДФ/АТФ антипор-зра в качестве неспецифической Са2+-зависимой поры.

Практическое значение работы. Полученные в настоящей работе энные позволяют расширить представления о механизмах первичных эрушений в митохондриях при лучевом поражении и некоторых других этологических процессах (например, окислительном стрессе). Сде-ш вывод о том, что одним из таких нарушений может быть открыва-1е Са2+-зависимой неселективной поры во внутренней мембране соп-эвождающееся деэнергизацией митохондрий. Выявление факторов рефляции Са2+-зависимой поры создает предпосылки для целенаправ-знного поиска средств защиты клетки, препятствующих необратимым звреждениям мембранных структур.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были до-

ложены на теоретическом семинаре сектора биоэнергетики Межфакультетской НМЛ им.А.Н.Белозерского МГУ (Москва 1989, 1990), X объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР (Ташкент, 1989), Всесоюзной конференции "Метаболизм клетки и пути его регуляции" (Пущино, 1988), заседании секции МОИП (Москва, 1988).

Публикации. По материалам исследования опубликовано G работ.

Структура диссертации. Диссертация состой!1 из введения, обзора литературы в двух главах, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов в трех главах, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована ЗС рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение митохондрий из печени белых крыс производили методом диференциального центрифугирования /Мосолова и др., 1975/, Среда выделения: 250 мМ сахароза, 5 мМ HEPES, 500 мкМ ЭДТА, pi 7.4. Условия экспериментов (где не оговорено особо): среда инкубации содержала 10 мМ MES, 10 мМ сукцинат, 10 мМ H-^PO^, 2 мкМ ро-тенон, 400 мкМ KCi; t°=26°c; рН доводилась до 7.4 трисом; тонич-ность среды (300 мОсм) создавали сахарозой. Концентрация митохон-дриального белка определялась биуретовым методом и составляла ; мг/мл (измерение малонового диальдегида), 1 мг/мл (регистрами поглощения кислорода) или 0.5 мг/мл (в остальных случаях).

Дф измерялся по методу проникающих ионов с помощы ТФФ+-чувствительного электрода /Калю et al.,1979/; в среду инку бации добавлялся 2 мкМ ТФФС1. Расчет абсолютных величин Дф проводился по методу Роттенберга /Rottenberg.1984/.

Потоки ионов К+ через митохондриальную мембрану регистрирова лись с помощью стеклянных к+-селективных электродов.

00 изменении объема митохондрий судили по поглощению свет; суспензией при длине волны Х= 66G нм.

Интенсивность протекания перекисных процессов в мембранах митохондрий оценивали методом Асакавы /Asakawa,Matsushita,l980/ по образованию малонового диальдегида.

Скорость дыхания митохондрий измерялась полярографически с помощью электрода Кларка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава I. Роль свободнорадикальных реакций в индукции

гидроперекисью кумола (ГПК) неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий.

Ранее было показано, что освобождение ионов (в том числе к+) из энергизованных митохондрий осуществляется с помощью двух различных механизмов. Один из них - неэлектрогенный к+/н+ обмен -имеет максимум активности в щелочной области рН и активируется увеличением объема митохондрий /Garlid.1982/. Другой связан с возникновением неселективной Оа2+-зависимой поры во внутренней мембране, что приводит также к снижению Аф и высокоамплитудному набуханию митохондрий. Этот механизм выхода к+ индуцируется снижением рН среды инкубации в изотонических условиях и подавляется увеличением объема митохондрий (уменьшением тоничности среды до 120 мОсМ) /Novgorodov,Yaguzhinsky,1985/. Известно также, что митохондрии в клетке имеют увеличений объем, сходный с выделенными митохондриями при тоничности 120 мОсМ.

В настоящей работе мы показали, что в гипотонической среде неспецифическая проницаемость может быть индуцирована активацией свободнорадикальных процессов при добавлении ГПК; это сопровождается активацией выхода к+ в кислой области рН.

При рн 6.7 (рис.1) в отсутствии ГПК наблюдается относительно медленный выход к+, который не сопровождается снижением Лф и обращается электрогенным к+- селективным переносчиком валиномицином (данные не приводятся), что указывает на неэлектрогенный характер

транспорта к+. Внесение ГПК приводит к снижению Дф и одновременно к ускорению выхода к+ из митохондрий.

СиООН

KCl 100 (И М

ст+з ю"7м

MDA

0.5 1

2.05.0

10.020.0

Ь 0.8i

I 0.6

5 «у

s 04

0.2

Рис.1. Влияние ГПК и ионола на выход к+ (а); величину Дф (0) и содержание МДА (в) при рН 6.7. Условия - см. "Материалы и методы"; осмотич-ность 150 мосМ. 1- контроль, 2 - добавка 250 мкМ ГПК , 3 - 50 мкМ ионол и добавка ГПК (СиООН).

0 2 4 6 8 10

Исходя из данных Аццоне /Rizzuto et al.,1987/, можно полагать, что выход к+ в этом случае обусловлен функционированием Са2+-зависимой неселективной поры. Протекающие процессы полностью аналогичны тем, что происходят в присутствии ГПК также и в изотонической среде инкубации. В этих условиях (рис.6) тоже наблюдается деэнергизация и активация выхода к+, а также высокоамплитудное набухание митохондрий. При этом кинетика выхода к+ и набухания полностью совпадает (не приведено). Два последних результата поз-

воляет сделать вывод о том, что ГПК индуцирует во внутренней мембране митохондрий неспецифическую проницаемость /crompton et al.,1987/, которая обуславливает, в частности, выход к+. мх

CI

(иМ

?*1 м

Ш

1

0.5 1.0

2.0

5.0 10.0 20.0

2.0 1.4 1.2 0.8 0.4 0.2

CU00H

Рис.2. Влияние ГПК и ионола на выход к+ (а), величину Дф (б) и содержание МДА (в) при рН 7.9. Условия - см. "Материалы и методы"; осмотич-ность 150 мосМ. 1- контроль, 2 - добавка 250 мкМ ГПК, 3 - 50 мкМ ионол и добавка ГПК (СиООН).

0 2 А 6 8 10 млн

При рН 7.9 выход к происходит с высокой скоростью и в отсутствие ГПК. О неэлектрогенном характере процесса (вероятен к+/н+ обмен) свидетельствует отсутствие снижения Аф во время выхода катиона (рис.2) и обращение выхода к+ валиномицином (не приведено). Снижение Аф и дополнительная фаза выхода к+ происходят лишь по прошествии продолжительного лаг-периода (рис.2, кривые 2).

Индуцируемый гидроперекисями выход к+ может быть связан с

инициацией процесса ПОЛ, продукты которого способны вызывать увеличение проницаемости биологических мембран.

Действительно, параллельно с увеличением выхода к+ происходит накопление продуктов липопероксидации (рис. 1в). Антиоксидант ионол, практически полностью предотвращая индуцируемое ГПК накопление продуктов ПОЛ, подавляет снижение Лф и выход к+. Полученные результаты указывают на то, что индуцируемый ГПК выход к+ связан с протеканием свободнорадикальных реакций и качественно коррелирует с интенсивностью ПОЛ. Активация ПОЛ при внесении ГШ и подавление процесса ионолом не влияют на выход к+ по неэлектроген-ному механизму (при рН 7.9, рис.2).

Для подтверждения вывода о том, что свободнорадикальные реакции необходимы для активации неспецифической проницаемости следует, однако, исключить возможность неспецифического (не связанного с антиоксидантными свойствами) действием ионола на проницаемость митохондриальной мембраны.

Для разрешения этой проблемы мы сопоставили действие антиок-сидантов различной природа на индукцию ГШ (или ионами Са2+) неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий и процесс ПОЛ. В связи с тем, что некоторые антиоксиданты способны увеличивать проводимость бислойных липидных мембран для н+, сначала было изучено влияние ряда антиоксидантов на скорость дыхания митохондрий в состоянии 4 по Чансу. Для дальнейших экспериментов наш были выбраны только ионол, 2,6-дитретбутил-6-оксианизол (БОА), пропилгаллат (ПГ) и 2,2,5,7,8-пентаметилоксихроман (ПМХ), оказывающие лишь незначительное влияние на проводимость митохондриальной мембраны, регистрируемую по скорости дыхания.

Антиокислительную активность этих соединений оценивали по их ингибируюшему действию на процесс ПОЛ, индуцируемый в деэнергизо-ванных митохондриях ГПК. На рис. 3 представлена зависимость нако-

ГПК. МДА0 - МДА в ВДАК - в

12 16 антиоксидант, мкМ

пления продуктов ПОЛ от концентрации антиоксиданта. Видно, что

й Рис.3. Влияние антиоксидантов

на накопление продуктов ПОЛ, индуцированное ГПК в деэнерги-зованных митохондриях. Условия

- см. "Материалы и методы", добавлены 0.5 мМ и 1.5 мкМ С1ССР, сукцинат и ротенон исключены. МДА определяли через 12 мин после добавления 200 мкМ

присутствии, отсутствие антиоксиданта; средние значения ± стандартная ошибка, N=6. 100 % -2.6 ± 0.4 нмоль МДА на мг белка. 1 - ПГ, 2 - ионол; кривая 3

- БОА; кривая 4 - ПМХ.

три используемых соединения являются сильными ингибиторами ПОЛ,

образуя ряд ионол < БОА < 1МХ. В данной системе ПГ проявляет лишь слабое антиокислительное действие. На рис.4 показано влияние антиоксидантов на индукцию неспецифической проницаемости, регистри-б Рис.4. Влияние антиоксидантов

на ускорение дыхания митохондрий под действием ГПК. Условия

- см. "Материалы и методы"; добавлен 0.5 мМ 1%С12. Скорость дыхания определяли в момент достижения максимальной скорости дыхания в контроле. У0 -скорость дыхания в присутствии, ук - в отсутствие антиоксиданта; средние значения ± стандартная ошибка, N=6. 100 % - 71.4 ±5.3 нмоль о2/мин на мг белка.

100 т—

У4 - 10.8 ±

.0 нмоль о2/мин на

анлоксвдант, ккм мг белка. 1 - ПГ, 2 - ПМХ, 3 -БОА; кривая 4 - ионол.

руемую по увеличению скорости дыхания митохондрий под действием

ГШ. Слабый антиоксидант ПГ в концентрации до 50 мкМ не предотвращает стимуляцию дыхания ГПК. В то же время три сильных антиок-сиданта обладают хорошо выраженным ингибирующим действием и образуют ряд эффективности ПМХ = БОА < ионол. В случае индукции неспецифической проницаемости нагрузкой митохондрий ионами Са2+ все антиоксиданты действуют аналогичным образом (не приведено).

На основании того, что три сильных антиоксиданта подавляют увеличение неспецифической проницаемости ГПК или Саг+, а слабый антиоксидант не оказывает такого действия можно исключить возможность неспецифического ингибирования антиоксидантами проницаемости митохондриальной мембраны.

Далее представлялось интересным выяснить более подробно механизм активации не специфической проницаемости свободнорадикальными реакциями. Активаторами этого процесса могут быть либо свободные радикалы, либо нерадикальные продукты ПОЛ, которые, в частности, способны образовывать гидрофильные поры в липидном бислое /Кип:шо1;о et а!.,1981/.

Мы показали, что для предотвращения индукции неспецифической проницаемости требуются существенно большие концентрации антиок-сидантов, чем для подавления ПОЛ (например, ср. рис.3 и 4). Это отчетливо видно на примере мощного антиоксиданта ПМХ, который в концентрации 5 мкМ не вызывает торможения спада Дф, несмотря на значительное подавление накопления продуктов липопероксидацш. Увеличение концентрации ПМХ до 50 мкМ, не вызывая дальнейшего подавления ПОЛ, приводит к резкому возрастанию лаг-периода индукции неспецифической проницаемости (не приведено).

Таким образом, значительные вариации в количестве продуктов ПОЛ нерадикальной природы не оказывают заметного влияния на индукцию неспецифической проницаемости. Следовательно, нерадикальные продукты ПОЛ, по-видимому, не являются активаторами неспецифичес-

кой проницаемости внутренней митохондриальной мембраны, а их накопление лишь отражает усиление различных свободнорадикальных процессов, протекающих в митохондриях. Наблюдаемые в эксперименте различия в эффективности ингибирования антиоксидантами ПОЛ (рис. 3) и неспецифической проницаемости, индуцированной ГШ (рис. 4) или Са2+, а также различные ряды эффективности действия антиокси-дантов на эти два процесса свидетельствует о том, что неселективная проницаемость индуцируется лишь какими-то определенными (специфическими) типами радикалов.

Например, можно предполагать, что антиоксиданты в низких концентрациях, реагируя преимущественно с пероксильными радикалами, подавляют ПОЛ на стадии продолжения цепи. В тоже время, в более высоких концентрациях антиоксиданты способны взаимодействовать и с первичными радикалами на стадии инициации цепи, подавляя тем самым активацию неспецифической проницаемости.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что индукторами Са -зависимой поры являются специфические формы свободных радикалов; нерадикальные продукты ПОЛ не участвуют в активации неспецифической проницаемости.

Глава 2. Влияние функционального состояния АТФ-азы на индукцию неспецифяческой проницаемости внутренней мембраны митохондрий при протекании свободнорадикальных реакций. Роль Дф.

Ранее /МагвЬапБку,Уа^Мпзку,198б/ сообщалось о том, что процесс ПОЛ тесно связан с функционированием системы окислительного фосфорилирования и ионным транспортом в митохондриях. В частности, субстраты АТФ-синтазного комплекса АДФ и фосфат регулируют процесс ПОЛ и ионный транспорт в митохондриях, индуцированные органической гидроперекисью.

Мы продолжили исследование механизма, посредством которого АТФ-азный комплекс может контролировать протекание ПОЛ и связан-

ное с ним развитие электрогенных потоков ионов.

При внесении в среду инкубации АДФ в присутствии регенерирующей системы митохондрии переходят в фосфорилирующее состояние (состояние 3 по Чансу); митохондрии в этом состоянии характеризуются более низким Лф, чем в состоянии дыхательного контроля (4 по Чансу). АДФ подавляет как деэнергизацию митохондрий, так и развитие перекисных процессов (рис.5). Мы показали также, что АДФ оказывает такое действие, проникая в матрикс митохондрий. Действительно, добавление карбоксиатрактилата, ингибитора транспорта АДФ (АТФ), обращает действие АДФ как на индукцию ионных потоков, так и на накопление продуктов ПОЛ (рис.5).

гпк

/тм+/ • ю ~7м 0.5 „

1

2

10 15 20

Щ

таль/кг белкв 1.0

о.г 0,6 о,4 -0,2 -

Рис.5. Подавление АДФ снижения Лф (а) и накопления МДА (б), ин-А- дуцированых ГПК. Условия - см. "Материалы и метода"; добавлена 10 мМ глюкоза, 20 мкг/мл гексокиназа, 40 мкМ 5,5'- диаденозинпента-фосфат и 2 мМ %С12-Через 1.5 мин после митохондрий добавляли 250 мкМ ГПК. 1 - контроль; 2 - 200 мкМ АДФ; 3- АДФ и 2 мкг на мг белка олигомицин; 4 -АДФ и 5 мкМ карбокси-атрактилат.

Б.

6 10 кгн.

Ингибирование ПОЛ в присутствии АДФ может быть связано или с эямым действием нуклеотида на системы, контролирующие образование ш утилизацию продуктов ПОЛ, или с изменением функционального эстояния митохондрий (переход из состояния 4 в состояние 3). В зеледнем случае можно было бы ожидать, что ингибитор АТФ-синтазы яигомицин будет предотвращать действие АДФ на ПОЛ. Это и наблю-алось в эксперименте (рис.5). Можно видеть, что митохондрии в зефорилируицем состоянии (состояние 3) характеризуются более «экой интенсивностью ПОЛ, чем в присутствии АДФ и олигомицина яефосфорилирующее состояние).

Полученные данные указывают на то, что функциональное состоя-ие митохондрий, влияя на интенсивность перекисных процессов, ожет регулировать Са2+-зависимую неселективную пору внутренней ембраны митохондрий.

Из рис. 5 видно также, что ингибитор АТФ-синтазы олигомицин в рисутствии АДФ подавляет развитие неспецифической проницаемости, есмотря на то, что он предотвращает антиоксидантный эффект АДФ. .е. в этом случае Са2+-зависимая пора неактивна и в условиях ротекания свободнорздикальных процессов.

Как видно из рис.6 индукция Оаг+-зависимой поры ГТК подавля-тся олигомицином и в отсутствие АДФ, что выражается в подавлении роцессов деэнергизации митохондрий, выхода к+ и высокоамплитуд-ого набухания. Но наши эксперименты показали, что олигомицин сам о себе практически не влияет на интенсивность ПОЛ (рис.7).

Подавление индукции проницаемости в условиях развития ПОЛ лигомицином (рис.6,7) подтверждает вывод о том, что в условиях ашего эксперимента продукты свободнорадикальных реакций не нэру-ают непосредственно барьерных свойств мембраны. Можно полагать, то происходит активация свободными радикалами эндогенной системы ланспорта ионов - са2+-зависим0й поры.

Рис.6. Подавление олигомицином снижения Аф (а), выхода К+ (б) и высокоамплитудного набухания (в), индуцированных ГПК при рН 7.4. Условия - см. "Материалы и методы"; добавлен 2 мМ МвС12. Добавки: I - митохондрии, II - 250 мкМ ГПК, III - 2 мкг на мг белка олигомицин (кривые 2).

о г 4 6 пая

Далее мы поставили задачу подробно выяснить механизм подавления олигомицином неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий. Можно предположить по крайней мере два механизма действия олигомицина. Во-первых, эффект олигомицина можно объяснить его влиянием на метаболическое состояние митохондрий (перевод их в нефосфорилируюцее состояние). Это объяснение представляется маловероятным, поскольку в нефосфорилирующем состоянии (см.

ш, л

нмоль/мг белка

1,00,8 0.60.4. 0,2

Рис.7. Действие олигомицина и ионола на накопление МДА, индуцированные ГПК. Условия - см.рис.5.1- контроль, 2-4 - добавка ГПК - 250 мкМ. 3-50 мкМ ионол; 4-2 мкг на мг белка олигомицин.

—т

10 мин.

рис.5) неспецифическая проницаемость активируется. Во-вторых, ингибирование индукции Са2+-зависимой поры олигомицином может объясняться его способностью повышать Дф в результате подавления эндогенных утечек н+ через АТФ-синтазныЯ комплекс. Это предположение и было проверено в наших экспериментах.

Действие ГПК усиливается при снижении рН среды инкубации митохондрий (рис.86). При рН 6.7 происходит более быстрая деполяризация мембраны митохондрий и индукция высокоамплитудного набухания, чем при более высоких рН. Во всем диапазоне рН эффект ГПК подавляется олигомицином. Изменение рН и внесение олигомицина влияют на величину исходного Дф (до внесения ГПК, рис.8а). При сдвиге рН от 7.9 до 6.7 происходит постепенное снижение Дф- зависимого накопления ТФФ+ в матриксе, которое соответствует снижению исходного Дф с 197 до 177 мВ. Изменение Дф коррелирует со степенью деэнергизации и высокоамплитудного набухания через 2.5 мин после добавления ГПК (0). Олигомицин предотвращает снижение исхо-

А.

6.7

7,3

7,9 рН

Рис.8. Влияние рН и олигомицина на Дф-зависимое накопление ТФ$+ и высокоамплитудное набухание митохондрий. Условия - см. "Материалы и методы"; добавлен 2 мМ %С12- (а) - содержание ТФФ+ в матриксе до внесения ГПК (через 1 мин после митохондрий). 1 - в присутствии 2 мкг на мг белка олигомицина. (б) - содержание в матриксе ТФФ+ (1,2) и высокоамплитудное набухание (3,4) (через 2.5 мин после ГШ). 1,4 - в присутствии олигомицина. Набухание в % от максимального ответа. 250 мкМ ГПК вносили через 2 мин после митохондрий.

7,9 рН

дного Дф, наблюдаемое при сдвиге рН в кислую область (а). Одновременно исчезает рН-зависимость Дф и высокоамплитудного набухание зарегистрированных через 2.5 минуты после внесения ГПК(б).

Такая корреляция может означать, что активация ГПК неспецифической проницаемости зависит от величины исходного Дф, а олигоми-цин подавляет индукцию проницаемости митохондриальной мембраны, повышая исходный Дф. В этом случае следует ожидать, что деполяризация мембраны митохондрий протонофором (разобщителем) обратит действие олигомицина. Повышение же исходного Дф в отсутствие оли-гомицина должно было бы имитировать его действие.

Действительно, снижение Дф на 10-15 мВ при добавлении небольшого количества протонофора сюср предотвращает подавление олиго-мицином неспецифической проницаемости митохондрий (рис.5). Таким же образом действует и пальмитиновая кислота (не приведено) -вероятный эндогенный разобщитель /Скулачев,Маслов,1960/. В отсутствие ГПК разобщители не приводят к активации высокоамплитудного набухания. Увеличение Дф нигерицином1 сопровождается подавлением как деэнергизации митохондрий, так и высокоамплитудного набухания (рис.9). Известно, что разобщители уменьшают как Дф, так и ДрН. Однако ннгибирумцее действие нигерицина, вызывающего уменьшение Дрн при увеличении Дф, показывает, что компонентом Ард+, вовлеченным в регуляцию проницаемости мембраны митохондрий, является Дф.

Таким образом, установлено, что подавление олигомицином неспецифической проницаемости внутренней митохондриальной мембраны опосредовано его влиянием на Дф. В условиях нашего эксперимента эндогенной системой разобщения, обуславливающей активацию неспе-

1 Нигерицин осуществляет неэлектрогенный к+/н+ обмен, тем самым изменяет соотношение составляющих Др^ - приводит к увеличению Дф за счет уменьшения ДрН.

Рис.9. Влияние нигерицина и С1ССР на индуцируемые ГПК снижение Дф (а,в) и высокоамплитудное набухание митохондрий (б,г). Условия - см. "Материалы и методы"; добавлен 2 мМ МвС12. (а,б) - эффект нигерицина (кривые 1). (в,г) - эффект олигомицина (кривые 1) и олигомицина и С1ССР (кривые 2). Добавки: I - митохондрии, II - 250 мкМ ГПК, III - 30 нМ С1ССР, IV -2 мкг на мг белка олигоми-цин, V - 13 нМ нигерицин.

О ¡5 6 Нин 0 3 в мм

цифической ионной проницаемости, является , по-видимому, не соп-ряженнная с синтезом АТФ проводимость для н+ через АТФ-синтазный комплекс /Р1е<;гоЬоп а!.,1983/. Именно усилением этой утечки, а не прямым влиянием рН объясняется активация неспецифической проницаемости при сдвиге рН в кислую область (рис.8). В пользу этого говорит предотвращение олигомицином снижения исходного Аф при уменьшении рН среды инкубации.

Нам, таким образом, удалось показать, что одним из ключевых

о .

факторов, контролирующих индукцию Са -зависимой поры в митохондриях, является величина трансмембранного потенциала (Дф).

Глава 3. Изучение функционирования с?а2+-зависиной неселективной поры митохондрий с использованием специфического ингибитора поры циклоспорина А.

Исходные барьерные свойства внутренней мембраны могут быть

восстановлены (закрывание поры) добавлением АДФ, ионов Mg2+ юл хелатированием ионов Са2+ ЭГТА. Недавно обнаружен новый эффективный ингибитор индукции Са2+-зависимой поры - циклоспорин А. Показано, что циклоспорин А , взаимодействуя либо с самой порой, либс с регулирующим ее компонентом, предотвращает открытие порь /Crompton et al.,1988; Broekemeier et al.,1989/.

Настоящая глава посвящена исследованию способности циклоспорина А вызывать закрытие неспецифической поры и восстанавливать барьерные свойства внутренней мембраны митохондрий.

Из рис.10 видно, что как циклоспорин А, так и олигомицин полностью предотвращают индукцию ионами Са неспецифической проницаемости. Однако только циклоспорин А способен восстанавливать Дф после практически полной деэнергизации митохондрий. Таким образом, циклоспорин А способен не только предотвращать, но и обращать увеличение неспецифической проницаемости митохондрий. Это хорошо согласуется с мнением Пфейфера и Кромптона /Crompton et al.,1988; Broekemeier et al.,1989/, что действие циклоспорина A направлено прямо на неспецифическую пору, либо на компонент, непосредственно ее регулирующий. Действие же олигомицина опосредуется влиянием на электрогенные утечки Н4 (см.главу 2) и может быть снято протонофором рсср (рис.10).

Отметим также, что блокирование электрогенного переносчика Са2+ рутениевым красным не влияет на обнаруженный нами эффект циклоспорина (не приведено), что исключает возможность механизма ингибирования, связанного с перераспределением индуктора неспецифической проницаемости - Са2+ между различными субпопуляциями митохондрий (ЭГТА-подобный механизм).

Таким образом, мы показали, что циклоспорин А является эффективным ингибитором транспорта через неселективную Са2+-зависимую пору. По предположению Крэмера /Dierks,Kramer,1989/ свойствами

FCCP

3,2 -\

0,5 ■

1,0

1,5. 2,0-

Рис.Ю. Влияние циклоспорина А и олигомицина на индуцируемое ионами Са2+ снижение Дф (а) и высокоамплитудное набухание митохондрий (б). Условия - см. "Материалы и методы". 1 - 0,5 мкМ циклоспорин А, 2 - оли-гомицин (2 мкг/мг белка), 3,4 - контроль. Добавки: Caci2 (30 нмоль на мг белка), CSA - 0,5 мкМ циклоспорин А, оли-гомицин (2 мкг на мг белка) и 2 мкМ рсор.

низкоселективной поры может обладать митохондриальный переносчик адениновых нуклеотидов - АДФ/АТФ антипортер (АНТ). Имеющиеся данные позволяют считать, что факторы стабилизирующие центр связывания нуклеотидов АНТ в т-конформации (матриксной) предотвращают активацию, а факторы, стабилизирующие АНТ в с-конформации (цито-

плазматической) индуцируют неспецифическую проницаемость. Можно предполагать, что АНТ либо непосредственно принимает участие в формировании системы, обеспечивающей неспецифическую проницаемость, либо регулирует ее активность. Недавние исследования, проведенные на протеолипосомах со встроенным АНТ указывают в пользу первого варианта /Dierks,Kramer,1989/. Однако, эта точка зрения не согласуется с данными Фурнье, полученными на митохондриях. Циклоспорин А не оказывает ¡заметного влияния на активность АНТ /Fournier et al.,1987/, хотя и является, как мы показали, ингибитором транспорта через пору.

Мы изучили влияние конформационного состояния АНТ на подавление циклоспорином А неспецифической проницаемости в митохондриях.

Добавление в среду инкубации циклоспорина А полностью предотвращает увеличение неспецифической проницаемости (рис.11), не влияя на способность митохондрий синтезировать АТФ. Как видно из кривой 3, ингибирукщее действие циклоспорина обратимо и снимается при добавлении карбоксиатрактилата, по-видимому, в результате стабилизации АНТ в с-конформации. Полученный результат указывает на то, что действие циклоспорина А связано с конформациойным состоянием антипортера.

Однако, карбоксиатрактилат способен обращать эффект циклоспорина А только в случае, когда митохондрии предварительно были проведены через состояние с повышенной неспецифической проницаемостью (ср.кривые 1 и 3). Следовательно, в присутствии циклоспорина А карбоксиатрактилат индуцирует неспецифическую проницаемость лишь после потери митохондриями какого-то низкомолекулярного фактора. Роль такого фактора мог бы выполнять АДФ,.который выходит из матрикса митохондрий в состоянии неспецифической проницаемости.

АДФ может быть удален из митохондриального матрикса путем

Рис.11. Влияние циклоспорина А и карбоксиатрактилата на индуцируемое ионами Са2+ снижение АФ и окислительное фосфори-лирование. Условия - см. "Материалы и методы". 1,2 - 0,5 мкМ циклоспорин А, 3 - контроль. Добавки СаС12 (20 нмоль на мг белка), csa - циклоспорин А, 250 мкМ АДР, КАТР - 5 мкМ карбоксиат-рактилат.

обмена на пирофосфат (РР.). Обмен АДФ/РРА катализируется АНТ и полностью блокируется карбоксиатрактилатом /Ав1так1в,АргИ1е, 1980/. Как видно из рис.12, в митохондриях, лишенных адениновых нуклеотидов преинкубацией с РР^ карбоксиатрактилат полностью обращает ингибирующий эффект циклоспорина, что проявляется в быстром снижении Дф и активации высокоамплитудного набухания. При подавлении же АДФ/РР^^ обмена внесением карбоксиатрактилата в среду инкубации одновременно с митохондриями, циклоспорин А полностью подавляет индуцируемую ионами Са2+ неспецифическую проницаемость, несмотря на присутсвие карбоксиатрактилата (кривые 4).

Полученные результаты показывают, что действие циклоспорина А зависит от субстрата АНТ АДФ и ингибитора карбоксиатрактилата и, вероятно, связано с его влиянием на АНТ. По данным Крэмера модификация двух БН-групп АНТ, реконструированного в липосомы, приводит к увеличению ионной проницаемости липосомальных мембран. На основании этого мы предположили, что модификация БН-групп антипортера в митохондриях приведет к активации Са2+-зависимой поры.

Р, ] -[

0,2-

, 0,5

1,0-

2,0 -1

ротекон

Рис.12. Влиян» циклоспорина А ; карбоксиатракти лата на индуци руемое ионам!

Са + снижение А1 (а) и высокоамплитудное набухание (0) митохондрий, обеднении: по адениновы! нуклеотидам пре-инкубацией < РР1. Условия ■

см. "Материалы I методы"; исключены сукцинат, фосфат, . ротено! и внесен 5 м! РР^. 1 - контроль; 2 - 4 -0,5 мкМ циклоспорин А. 4 - I мкМ карбоксиат-рактилата. Добавки: СаС12 (2Е

нмоль на мг белка), КАТР - Е мкМ карбоксиат-рактилат, 2 мкЛ ротенон, 10 сукцинат + 5 н! фосфат-трис.

Действительно, сшивка двух БН-групп бифункциональным реагентом фениларсиноксидом приводит к индукции неспецифической проницаемости даже в присутствии циклоспорина (рис.13). Эта модификация происходит в гидрофобной области, поскольку эффект фениларсинок-сида снимается гидрофобным монофункциональным . 5Н-реагентом Л-этилмалеимидом, но не гидрофильным мерсалилом (не приведено).

Таким образом, полученные данные, в совокупности с данными Крэмера, позволили нам выдвинуть гипотезу о том, что сам АНТ способен в определенных условиях образовывать гидрофильную пору,, обеспечивающую проницаемость внутренней мембраны митохондрий дл

I. с,5 •

П^О

Рис.13. Влияние фениларсинок-сида и циклоспорина А на индуцируемое ионами Са снижение Л® (а) и высокоамплитудное набухание митохондрий (б). Условия - см. "Материалы и методы". 1 - контроль, 2 - 1 мкМ циклоспорин А. Добавки СаС12 (30 нмоль/мг белка), РМбО - 15 мкМ фениларсинок-свд.

изкомолекулярных соединений.

ВЫВОДЫ

В настоящей работе изучался механизм индукции ионной проница-мости внутренней мембраны митохондрий при действии органической идроперекиси, имитирующей действие липидных радиотоксинов. Выяв-ены факторы, регулирующие Са -зависимую пору внутренней мембра-ы митохондрий, индуцируемую ГПК.

. Показано, что индуцированная ГПК са2+-зависимая неспецифичес-ая проницаемость внутренней мембраны митохондрий контролируется

протеканием свободнорадикальных реакций. Об этом свидетельствует качественная корреляция между накоплением продуктов ПОЛ и развитием неспецифической проницаемости.

2. Обнаружено, что активаторами Са2+-зависимой поры являются специфические типы свободных радикалов. Нерадикальные продукты ПО! не участвуют в индукции неспецифической проницаемости.

3.а. Установлено, что система, обеспечивающая неспецифическук проницаемость, потенциалзависима. Вещества, увеличивающие ¿4 (олигомицин, нигерицин), подавляют возникновение неспецифической проницаемости. Снижение Дф разобщителями окислительного фосфори-лирования обращает этот эффект.

З.б. Показано, что активация индукции неспецифической проницаемости при низких рН связана со снижением Дф в результате увеличения утечки н+ через АТФ-синтазу.

4. Обнаружено, что ингибитор индукции Са2+-зависимой поры циклоспорин А способен не только предотвращать открытие поры, но и вызывать ее закрытие, практически полностью восстанавливая барьерные свойства мембраны.

5. Показано, что ингибитор АДФ/АТФ антипортера карбоксиатрактилат способен обращать подавление циклоспорином неспецифической проницаемости. Этот эффект проявляется только в митохондриях, обедненных по адениновым нуклеотидам. Сделан вывод о том, что ингибиру-ицее действие циклоспорина зависит от конформационного состояния АДФ/АТФ антипортера и от содержания внутримитохондриальных адени-новых нуклеотидов.

6. Подавление циклоспорином А неспецифической проницаемости обращается реагентами, модифицирующими БН-группы даже без • удаления адениновых нуклеотидов. Эти данные в совокупности с данными литературы позволили выдвинуть гипотезу о функционировании АДФ/АТЗ антипортера в качестве Са2+-зависимой поры, что может быть одним

из начальных этапов развития лучевого поражения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Новгородов С.А., Гудзь Т.И., Мор (Кушнарева) Ю.Е., Гончаранко Е.Н., Ягужинский Л.С. Гидроперекись кумола изменяет тип проводимости митохондриальной мембраны для к+.- Биохимия, 1989, Т.54, N.2, С.206-211.

2. Новгородов С.А., Гудзь Т.И., Мор (Кушнарева) D.E. Трансмембранный потенциал регулирует неспецифическую проницаемость внутренней митохондриальной мембраны.- Биол.мембраны, 1989, Т.6, К.10, С.1053-1062.

3. Novgorodov S.A., Cudz T.I., Mohr (Kuehnareva) Yu.E., Gonoharenko B.N., Yaguzhinsky L.S. ATP-synthaee complex: the mechanism of control of ion fluxes induced by oumene hydroperoxide in mitochondria.- FEBS Lett., 1989, V.247, N.2, P.255-258.

4. Novgorodov S.A., Gudz T.I., Kushnareva Yu.B., Zorov D.B., Kudrjashov Yu.B. Bffeot of cyclosporins A and oligomyoin on nonspecific permeability of the inner mitochondrial membrane.- FEBS Lett., 1990, V.270, N.1,2, P.108-110.

5. Новгородов С.А., Гудзь Т.И., Кушнарева Ю.Е., Рогинский В.А., Кудряшов Г.Б. , Механизм индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий гидроперекисями.- Биол.мембраны, 1990, Т.7, N.9," С.945-955.

6. Кушнарева Ю.Е., Новгородов С.А., Гудзь Т.И., Кудряйов Ю.Б. Контроль АТФ-синтетазой ионного транспорта, индуцированного гидроперекисями.- Тез.Х объединенного симп. биохим. сообществ СССР-ГДР "Механизш регуляции клеточной активности". Москва, 1989. 0.122.-

Отпечатано во ВЕИИметмаш. Зак. 3397 тир. 100

< I

11-

- j

'J