Структурно-функциональные особенности белковых комплексов митохондриальных контактных сайтов

Высоких, Михаил Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные особенности белковых комплексов митохондриальных контактных сайтов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные особенности белковых комплексов митохондриальных контактных сайтов"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ВЫСОКИХ

Михаил Юрьевич

•1 5 да

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ КОНТАКТНЫХ САЙТОВ.

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000.

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ.

Научный руководитель: доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Д.Б.Зоров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.Б. Гусев

Ведущая организация: Россиийский Кардиологический НПК Минздрава РФ

Защита состоится "24" апреля 2000 года в_часов

на заседании диссертационного совета Д.053.05.32 по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_ "_2000 г.

доктор биологических наук,

профессор

В.П.Зинченко

Ученый секретарь диссертационного совета: кандидат биологических наук

М.В. Медведева

Ео$9 М. Ш-Ч, О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной, если не главной, функцией митохондрии в клетке является сопряжение работы протонных генераторов трансмембранного потенциала с окислительным фосфорилированием, реализуемое специализироваными группами белков внутренней мембраны этой органеллы. Результатом является синтез митохондриями АТФ, расходуемый в клетке в соответствии с ее энергозатратами (Mitchell, 1965).

Гликолитический путь образования АТФ в клетках эукариот естественным образом сопряжен с генерацией АТФ в митохондриях через окислительное фосфорилирование посредством функционирования другой группы белков, косвенно участвующих в обоих энергообразующих процессах. Данная группа локализована в участках сближения митохондриальных мембран, так называемых контактных сайтах, с морфологической точки зрения представляющих собой четко компартмектализованные зоны (Hackenbrock, 1968, Brdiczka, 1978).

В состав этой группы белков входит гексокиназа - цитоплазматический фермент, катализирующий одну из ключевых реакций гликолиза, фосфорилирование глюкозы, и способный к обратимому связыванию с интегральным белком внешней митохондриальной мембраны, порином - потенциал-зависимым, слабоселективным по анионам белковым каналом (Dorbani et al, 1987). Связывание гексокиназы с порином и кинетические параметры фермента определяются химической природой взаимодействия этих белков, что свидетельствует о наличии высокоспецифичных конформационных перестроек гексокиназы (Wilson, 1985). Преимущественное использование гексокиназой ассоциированого с пориновым каналом АТФ митохондриального происхождения (Bessman, 1984), позволило предположить наличие функциональной связи поринового канала с интегральным белком внутренней мембраны митохондрии, АТФ/АДФ антипортером, и их локализацию в участках контактных сайтов.

Присутствие в митохондриальном контактном сайте креатинкиназы (Kottke et al, 1988) и функциональная связь фермента с порином и АТФ/АДФ антипортером дали возможность предположить наличие структурных взаимоотношений между вышеперечисленными белками. Существование белковых комплексов

митохондриальных контактных сайтов было показано выделением последних методом ионообменной хроматографии (Beutner et al, 1996).

Таким образом, контактные сайты митохондрий представляют собой не просто группу белков, формально определяемую общей локализацией, но динамично существующие многофункциональные комплексы интегральных белков митохондрии и периферических киназ, осуществляющие прямое сопряжение гликолитического и митохондриального энергообразующих процессов и обладающие регуляторными функциями применительно ко всей клетке.

В связи с этим небезынтересным представляется рассмотрение феномена так называемой неспецифической проницаемости внутренней митохондриальной мембраны, когда она теряет свои барьерные функции и становится проницаемой для молекул с молекулярной массой до 1,5 кДа (Leninger et al, 1967, Haworth and Hunter, 1979, Cromptonet al, 19S8).

Недавно на реконструированной системе была показана связь между возникновением неспецифической проницаемости и функционированием комплексов периферических киназ с порином и транслокатором (Beutner G, 1996).

В последнее время проблема неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий привлекает интерес исследователей в связи с открытием участия митохондрий в процессе программируемой клеточной смерти (апоптозе) (Zamzami et al, 1995). На данный момент считается, что для запуска парциальных реакций апоптоза необходим выход из митохондрии активаторов каспаз, в основе которого, видимо, лежит индукция в митохондриях неспецифической митохондриальной поры, и становится ясным, что без понимания механизма индукции поры и ее характеристик невозможно и понимание механизма апоптоза.

Целью настоящей работы было выделение, очистка и характеристика белкового состава различных комплексов периферических киназ и интегральных белков митохондриальных мембран. Предполагалось показать методом реконструкции в протеолипосомах тождественность данных комплексов структурам, ответственным за неспецифическую пору в митохондриях. Одновременно была поставлена задача исследовать влияние ряда соединений, эффекторов компонентов исследуемых белковых комплексов (ингибиторов АТФ/АДФ антипортера, поринового канала и неслецифической проницаемости и лиганда митохондриального

бензодиазепинового рецептора) на функционирование белковых комплексов как целостной сопряженной системы.

Предполагалось исследовать канальную активность порина в составе различных комплексов в сравнении с таковой после очистки белка по стандартному протоколу (De Pinto et al, 1987) и из состава выделенных комплексов.

Научная новизна работы. Белковые комплексы контактных сайтов митохондрий из различных тканей были выделены и очищены до гомогенного состояния с постоянным соотношением между индивидуальными компонентами в составе комплексов. Стехиометрическое соотношение для комплексов гексокиназы и креатанкиназы с порином, АТФ/АДФ антипортером и циклофилином было определено в пересчете на одну полипептидную цепь для каждого белка. Было показано, что связывание креатанкиназы с интегральными белками митохондрий определяется изозимным составом АТФ/АДФ антипортера, следствием чего является формирование двух различных типов комплексов этого фермента, локализованных в различных компартментах митохондрий - контактных сайтах и кристах, где в последнем случае отсутствует интегральный белок наружной митохондриальной мембраны, порин и белок матрикса, циклофилин Д. Определено стехиометрическое соотношение для компонентов комплекса креатанкиназы с АТФ/АДФ антипортером в кристах митохондрии, которое отличалось от такового для комплекса креатанкиназы с АТФ/АДФ антипортером и порином в контактных сайтах. Выделен и охарактеризован также комплекс большего размера, включающий в себя как гексо-, так и креатинкиназу наряду с мембранными белками и показано наличие функционального сопряжения между двумя ферментами, опосредованное каналом порина. Определена стехиометрия и кинетические параметры данного комплекса, исследовано влияние ряда соединений на функционирование комплекса как сопряженной системы. Для всех комплексов определены молекулярные массы и исследовано поведение при реконструкции в липосомах. Показана тождественность поведения реконструированных комплексов гексокиназы и креатанкиназы контактных сайтов, но не креатикиназы крист, процессу проявления неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий.

Практическое значение работы. Настоящее исследование позволяет расширить представления о механизме белок-белкового взаимодействия,

регулирующего пропорциональный вклад окислительного и анаэробного метаболизма для сохранения адекватного клеточного энергообеспечения. Результаты создают предпосылки для выяснения механизма возникновения в митохондриях неспецифической проницаемости. Понимание механизма этого явления может помочь в разработке стратегии управления клеточной гибелью с целью предотвращения нежелательной гибели в системах с ограниченной степенью пролиферации (мозг, сердце) и активации гибели трансформированных клеток.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на совместном заседании отдела биоэнергетики НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ и кафедры биохимии Биологического факультета МГУ (1999,2000). Результаты также были представлены на 10-ой Европейской Биоэнергетической конференциях (Швеция

1998), на съездах Биофизического общества (Канзас-сити, 1998, Балтимор 1999), на 33 Международном съезде Физиологического Общества (Санкт-Петербург 1998) на 2-ом Биохимическом Съезде РАН (Москва 1997), 2-ом биофизическом съезде (Москва

1999), на 2-ом коллоквиуме по митохондриям и миопатиям (Халле, Германия, 2000).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 14 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Митохондрии из мозга крыс выделяли методом дифференциального центрифугирования: ткань промывали средой выделения при 2°С, содержащей 0,25 М сахарозы, 10 мМ НЕРЕЭ-ИаОН, 0,2 мМ ЭДТА, 0,01 мМ феназинметасульфат, рН 7,6. Промытую ткань мозга измельчали в гомогенизаторе Поттера 1-2 минуты в 10 кратном объеме среды выделения и центрифугировали при 4°С 10 минут при 600%, а супернатант 10 минут при 9000g с последующим переосаждением при тех же условиях. Для освобождения от синаптосом осадок митохондрий наносили на колонку с сефадексом 0-25, элюировали тем же буфером и митохондрии в элюате осаждали при 9000 g.

Степень сопряженности митохондрий оценивали по данным полярографии в стандартной среде инкубации и измерения: - 250 мМ сахароза, 10 мМ HEPES-NaOH, 5 мМ малаг калия, 5 мМ глутамат калия, 2 мМ фосфат калия, 1 мхМ ротенон, 2,5 мМ хлорид магния, рН 7,4. Концентрация белка митохондрий определяли по методу Горналла (Gomall et al., 1949).

Для получения белковых комплексов митохондриальных контактных сайтов митохоидриальную суспензию с конечной концентрацией белка 120 мг/м.ч солюбилизировали 0,5% Тритоном Х-100 и инкубировали 1 час при 4°С с последующим центрифугированием при 40000g. Супернатант диализовали и концентрировали сухим полиэтиленгликолем.

Экстракт разделяли электрофоретически в полиакриламидиом геле при неденатурирующих условиях. Положение. на электрофореграмме белковых комплексов, содержащих гексокииазу и/или креатшшшазу, определялось после окрашивания отдельных дорожек геля на специфическую ферментативную активность. Идентифицированные полосы, соответствующие различным комплексам кииаз и интегральных белков митохондрий были экстрагированы из геля. Состав выделенных комплексов был проанализирован методом электрофореза по Лэммли.

. Определение ферментативной активности гексокиназы и креатанкиназы проводили по методу Бюхера (Bûcher et al, 1964), Определение активности циклофилина Д проводили по методу Шутковски (Schutkowski et al., 1995) Определение кинетических параметров проводили по методу Лайнуивера-Берка и Диксона. Определение константы Михаэлиса для смеси свободной и мембрансвязанной форм гексокиназы проводили по методу Рейнера.

Для изучения сопряжения креатинкиназной и гексокиназной реакции в белковом комплексе скорость гексокиназной реакции определяли в присутствии креатинфосфата и АДФ вместо АТФ, Скорость образования ппокозо-6-фосфата определяли спектрофотометрически в сопряженной системе с дегидрогеназой глюкозо-6-фосфата.

Канальная активность изолированного порина и выделенных белковых комплексов исследовалась методом реконструкции в бислойные липидные мембраны, сформированные по модифицированному методу Монталла-Мюллера (Mueller et al., 1963) и ДеПинто (DePinto et al., 1992) с помощью техники пэтч-кламп. Данные

регистрировались, оцифровывались и анализировались при помощи программы, сходной с программой "РС1атр6". Порин был выделен н очшцен либо по методу ДеПинто феРкЛо а1., 1987), либо диссоциацией исследуемых комплексов в среде выделения, содержащей 1М КС1 с последующим пропусканием солюбшшзата через колонку с сефадексом С-50. Фракции, соответствующие по молекулярному весу порину (от 30 до 35 кД), подвергали электрофорегическому анализу на чистоту препарата. Данные, полученные при регистрации канальной активности с помощью вышеуказанной программы, были использованы для расчета параметров каналоформера: интегральной проводимости и проводимости отдельного канала, вероятности открытого состояния и его потенциалзависимости, в сравнении для всех трех случаев.

Белковые комплексы митохондриальных контактных сайтов также были разделены методом ионообменной хроматографии, предложенным Бойтнер (ВеиШег е1 а1, 1996) с разработанной автором модификацией: сорбция тритонового экстракта митохондриальных мембран на ДЕАЕ целлюлозе проводилась при рН 9,0 в 50 мМ глициновом - КаОН буфере, содержавшем 1 мМ дитиотреитол, в течение 1 часа при комнатной температуре и соотношении 4 единицы ферментативной активности креатинкиназы на 1 грамм сорбента. Элюировали градиентом 0,2-0,5 М КС1 при том же значении рН буфером нанесения. Активности ферментов определяли как описано выше. Состав разделенных комплексов анализировался электрофоретически и методом Вестерн блот с применением высокоспецифичных антител против всех предполагаемых участников формирования исследуемых комплексов. Для идентификации АТФ/АДФ антипортера в составе комплексов использовали моноклональные антитела против двух изоформ белка - АНТ1 и АНТ2, не имеющих взаимной перекрестной реактивности.

Для точной идентификации компонентов комплексов применяли метод масс-спектрометрии. Для этого полученные после разделения на ДЕАЕ-целлюлозе фракции, разделяли элеюрофоретически методом двумерного электрофореза по Банта (Вавда й а!., 1978). Белки идентифицировали с помощью специфичных антител, затем экстрагировали из геля и готовили образцы для масс-спекрометрического анализа по методу Шевченко и соавт. (ЗЬеУсЬепко й а!., 1996).

Функциональное состояние мембранных белков в составе комплексов с креатинкиназой исследовали методом встраивания в мультислойные липосомы по Бойтнер и соавт. (Beutner et al., 1997). Исследовали специфический транспорт АТФ, нагруженного в везикулы, в обмен на добавленный АДФ и влияние ингибитора АТФ/АДФ антипортера, атрактилозида, на скорость переноса нуклеотидов по методу Крэмера (Kramer et al.,1979) О наличии в мембране мегаканала судили по выходу малата (не являющегося субстратом транслокатора) из нагруженных липосом с реконструированными комплексами креатинкиназы при добавлении в среду инкубации ионов Саг+ , и влиянию ингибитора митохондриальной неспецифической поры, циклоспорина А, на параметры переноса трикарбоксилата.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.Выделение митохондрий. Выделенные митохондрии из мозга крысы имели дыхательный контроль 3,2 ±0,2 на глутамате с малатом и' содержали следовые значения активности лактатдегидрогеназы как маркера цитозоля и синаптосом.

2. Разделение и анализ комплексов методом электрофореза в нативных условиях и в присутствии додецилсульфата натрия. Солюбилюированные белки мембран митохондрий и ассоциированные с ними периферические киназы были разделены электрофоретически при вышеописанных условиях и окрашены на активности гексокиназы и креатинкиназы (Рис.1). По результатам окрашивания и измерения активностей в экстрактах геля выявлены 4 полосы, соответствующие различным комплексам киназ и мембранных белков. Анализ распределения специфических активностей показал, что гексокиназа присутствует в первых трех полосах и отсутствует в четвертой, в то время как креатинкиназа присутствует в 1 и 4 и отсутствует во 2 и 3 полосах. Анализ показал, что полоса 1 содержит почти 50% общей и удельной гексокиназной и более 60% креатинкиназной активности. Данные представлены в Таблице 1.

Рнс.1. Электрофореграмма разделения белков экстракта мембран контактных сайтов тритоном X-100 в неденатурирующих условиях, а и б, соответственно - окраска на активность гексокяназы и креатинкиназы;в - окраска кумасси 11-250 голубым.

Таблица 1. Распределение активностей гексокиназы и креатинкиназы (в мкМ/мин) на электрофореграмме экстракта митохондриальных мембран.

Общая активность % от суммарной активности дорожки Активность дорожки Удельн. активность дорожки Удельная активность в полосе

Гексокиназа 1 18бО±91 42,6 2,657±0,21

в полосах 2 1120±57 25,6 4010±184 0,245±0,02 1,123±0,14

1-4 3 1040±61 23,8 0,52±0,02

4 - - -

Креатинкиназа 1 1250±72 65,б I,39i0,ll

в полосах 2 - - 1510±82 0,094±0,01 -

1-4 3 - - -

4 - 17,3 0,25±0,09

Молекулярный вес белковых комплексов идентифицированных полос был проанализирован методом гель-фияьтрации и скоростного аналитического ультрацентрифугирования и среднее значение по данным 5 опытов составило: 1 полоса - 880,2 - 560, 3 - 460, 4 - 540 хДа В дальнейшем методом изофокусирования было показано, что аномальное поведение комплекса полосы 4 объясняется наличием у него при данных условиях фракционирования существенно большего суммарного

положительного заряда, что определяется качественно иным составом и другой стехиометрией компонентов.

Белковый состав отдельных полос был проанализирован методом электрофореза в денатурирующих условиях. Электрофореграмма после окрашивания кумасси голубым представлена на Рис.2. По результатам анализа были идентифицированы белки с

Рис.2. Электрофореграмма белков, экстрагированных из геля, представленного на Рис.1 и разделенных в полиакриламидном геле по Лэммли. Номера 1-4 соответствуют номерам полос на Рис.1. Гель окрашен кумасси голубым.

молекулярной массой 18, 22, 29, 30, 45, 50, 52, 62, 68, 70, 82, 102 Кда. Совокупность данных ферментативной активности компонентов комплекса и иммуноблотгингу с антителами позволяет сделать заключение о присутствии в составе комплексов: циклофилина - 18 кДа (ферментативная активность), порина - 30-32 кДа (иммуноблоттинг), креатинкиназы - 45 кДа (ферментативная активность), гексокиназы - 102-108 кДа (ферментативная активность), а также предположить возможность соответствия 18 кДа полосы - бензодиазепинсвязывающему белку, 22 кДа полосы - продуктам деградации порина (DePinto et al., 1987), а полосам 62, 68, 70 и 82 кДа - олигомерам транслокатора или порина (Guo et al., 1995, Palmierí, 1994, Fritz-

Wolf et al., 1996). Полоса 50 кДа идентифицирована нами методом Вестерн блот как соответствующая С-кокцевому домену гексокиназы.

3. Определение кинетических параметров гексокиназной реакции в составе комплексов с митохондриальными мембранными белками.

При измерении активности гексокиназы спектрофотометрически в экстрактах полос, выявленных по специфическому окрашиванию нативного геля, было обнаружено, что только в экстракте полосы 1 присутствует активность фермента при замене АТФ на АДФ и креатинфосфат. Очевидно, что креатинкиназа, идентифицированная в экстракте полосы 1, фосфорилирует АДФ за счет креатинфосфата, и образованный АТФ используется гексокиназой для фосфоршшрования глюкозы. В то же время, при внесении в среду измерения, дополнительно к уже присутствующей креатинкиназе, того же количества фермента из скелетных мыпщ кролика, не происходит значительного увеличения скорости гексокиназной реакции. Лишь при внесении фермента в количестве, на порядок превышающем количество эндогенной креатинкиназы наблюдается двукратное увеличение скорости фосфорилирования глюкозы. Преинкубируя перед внесением в кювету пробы с ! М KCl (условия диссоциации белкового комплекса) в течение 10 минут при комнатной температуре и постоянном перемешивании, удалось показать, что в этом случае добавление креатинкиназы из мышц кролика в количестве, равном уже присутствующему ферменту, приводит к достижению максимальной скорости гексокиназной реакции. Таким образом, в экстракте полосы 1 ферменты представляют собой компартментализованную систему туннельного типа. Вследствие этого, АТФ, являющийся продуктом креатинкиназной реакции добавленной креатинкиназы (при внесении в пробу в качестве стартовых субстратов АДФ и креатинфосфата), как субстрат частично недоступен для гексокиназы, компарментализованной в составе белкового комплекса с креатинкиназой эндогенного происхождения. В то же время, в экспериментах по исследованию зависимости скорости гексокиназной реакции от концентрации АТФ, в данном случае расматриваемого как интермедиат туннельного переноса фосфорила с креатинфосфата на глюкозу, наблюдалось увеличение скорости

продукции глюкозо-б-фосфата. Данные по измерению скорости образования глюкозо-б-фосфата при осуществлении реакции с АДФ/креатикфосфатом, АТФ или АТФ/АДФ/креатинфосфатом для экстракта полосы 1 представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Удельная активность гексокиназы в комплексе с креатинкиназой, транслокатором адениновых нуклеогидов и порином. (мкМ/мин*мг белка.)

1 мМ АДФ, 5 мМ креатинфосфат 1мМ АТФ 1 мМ АДФ, 5 мМ креатинфосфат, 1 мМАТФ

2,657±0.21 0,894+0,095 3,196+0,107

Участие АТФ/АДФ антипортера в осуществлении донирования нуклеотидов во внутренний компартмент, образованный креатинкиназой и мембранными белками, исследовалось при помощи карбоксиатрактилозида - высоко специфичного ингибитора переноса нуклеотидов транслокатором. Полученные данные о зависимости скорости гексокиназной реакции, поддерживаемой АТФ, образованным креатинкиназой, от концентрации ингибитора АТФ/АДФ антипортера карбоксиатрактилозида представлены на Рис.3. Как видно из Рис.3, кривая зависимости скорости гексокиназной реакции от концентрации ингибитора

Рис.З. Зависимость скорости фосфорилирования глюкозы гексокиназой в составе белкового комплекса от концентрации ингибитора транслокагора

адениновых нуклеотидов,

карбоксиатрактилата.

2 4 6

Карбоксиатрактилат, рМ

антипортера носит двухфазный характер. Первая фаза, соответствующая почти полному ингибированию гексокиназной реакции, согласуется с нашими предположениями о компартментализации киназ и мембранных белков, когда

ингибирование наиболее медленно работающего компонента, транслокатора, одновременно ингибирует всю систему переноса от креатинфосфата до глкжозо-6-фосфата. Последующая реактивация может быть объяснена тем, что сайт связывания карбоксиатрактилозида расположен на обращенной в межмебранное пространство стороне транслокатора. В выделенном комплексе при отсутствии мембран, вследствие симметричности структуры переносчика, карбоксиатрактилозид может также взаимодействовать с обоими сайтами связывания (в том числе в норме обращенными в митохондриальный матрикс). Подобное взаимодействие приводит к диссоциации транслокатора от комплекса и разрушению всей системы компартментализации и, соответственно, снятию ограничений для доступа АТФ в активный центр гексокиназы. Для проверки этой гипотезы были определены К„ по MgATO и K¡ по й^АДФ для гексокиназы при 100 нм (ингибирование) и 8 мкМ (реактивация). Полученные данные свидетельствуют о полной диссоциации белкового комплекса при увеличении концентрации ингибитора и приобретении гексокиназой кинетических параметров, характерных для свободного фермента (Таблица 3).

Таблица 3. Кинетические параметры гексокиназы при различных условиях эксперимента и по литературным данным.

по Mg АТФ Kj по МдАДФ

Wilson, 1985 Ассоц. с митохондр.40 мкМ Своб. фермент - 400 мкМ —

100 нМ карбоксиатрактилозид 11,0 ±1,7 мкМ 20,0 ± 1,9 мкМ

8 мкМ карбоксиатрактилозид 370 + 26 мкМ 200 ± 32 мкМ

В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что помимо поступления нуклеотидов к активному центру креатинкиназы через АТФ/АДФ антипортер, реализуется также другая возможность обеспечения фермента субстратом, разрешенная структурой октамерамитохондриальной креатинкиназы (Fritz-Wolf et al., 1996). В зоне контакта димеров, формирующих октамер, находится канал с

внутренним диаметром 1,8 нм, также ведущий к активному центру фермента. Мы предполагаем, что диффузия субстратов по этому каналу дает возможность комплексу белков контактного сайга поддерживать соотношение АТФ/АДФ в клетке в экстремальных условиях - при гипоксии, падении мембранного потенциала митохондрий, голодании и др., поскольку, как уже упоминалось выше, гексокиназа в составе данного комплекса имеет низкое значение К„ по МдАТФ и может поддерживать гликолиз даже в случае резкого падения уровня АТФ в цитоплазме. Вторая возможность реализации механизма защиты клетки в условиях недостатка субстратов дыхания состоит в том, что белковый комплекс контактного сайта может обеспечить векторный транспорт АТФ в митохондрию при фосфорилировании цитозольного АДФ за счет креатинфосфата, вследствие чего частично или полностью может быть восстановлен мембранный потенциал митохондрии, блокирована неспецифическая митохондриальная пора и предотвращено переключение клетки на выполнение каскада алоптотических реакций.

4. Канальная активность порина в составе белкового комплекса с гексокиназой.

Были исследованы величины проводимости бислойных фосфолипидных мембран со встроенным белковым комплексом полосы 1 и порином, выделенным либо из состава комплексов, либо по стандартной методике (см. Методы). Данные сравнительного анализа представлены в Таблице 4.

Таблица 4. Параметры канальной активности белкового комплекса из полосы 1 в сравнении со свойствами изолированного порина.

Порин, экстр. 2% тритон Х-100. Порин, экстр, из комплексов. Белковый комплекс полосы 1

Проводимость в 1 М КС1, нС. 4,3±0,3 4,6+0,3 0,46+0,03

Количество подуровней 3-5 2-4 1-3

Полученные данные позволяют предположить наличие существенных различий некоторых параметров поведения каналоформера в свободном ввде и в составе комплекса - падение уровня проводимости в 10 раз и уменьшение числа подсостояний. Вместе с тем, предположение об ингибировании транспорта ионов гексокиназой и креатинкиназой представляется нам маловероятным, что было под тверждено также в расчетах потенциалзависимости проводимости канала. Данные, представленные на Рис. 4, свидетельствуют о сохранении порином (как в составе

G/G0

/ O.S.

0.4-

0.2- «з

-40 -20 0 20 40 Ц мв

Рнс.4. Зависимость величины проводимости поринового канала (G), нормированная на проводимость мембраны в стационарном состоянии (G„) . За единицу ординат принята величина данного отношения в открытом состоянии канала 1 - препарат порина, выделенного по стандартной методике, 2 - порин, полученный методом диссоциации комплексов, 3 - порин в составе белкового комплекса.

комплексов, так и в свободном виде) сходной зависимости проводимости в открытом состоянии от приложенного потенциала, определяемой нативностью белка. В то же время, смещение кривых в сторону отрицательного потенциала для порина, находящегося в составе комплекса по сравнению с порином, диссоциированным из комплекса, подтверждает имеющиеся данные о катионселективном состоянии канала в комплексе с гексокиназой (Benz et al., 1990). Мы предполагаем, что полученные результаты позволяют найти объяснение факту ограниченной проницаемости поринового канала внешней мембраны митохондрий при адсорбции на нем периферических киназ и возможности регуляции транспорта метаболитов в участках контактных сайтов в целом. Данные, полученные при исследовании зависимости

скорости гексокиназной реакции от концентрации модулятора поринового канала (не представлены) подтверждают это предположение. Также было показано, что связывание лиганда митохондриального бензодиазепинового рецептора, ассоциированного с пориновым каналом (МсЕпегу е1 а1., 1992) обуславливает наблюдающееся падение скорости гексокиназной реакции, идущей за счет АТФ, синтезированого креатинкиназой в составе комплекса, очевидно вызванного модуляцией поринового канала в составе комплекса. Сходное действие на протекание гексокиназной реакции при аналогичных условиях и том же концентрационном интервале оказывает циклоспорин А-ингибятор митохондриальной неспецифической поры, специфически связывающийся с циклофиллином Д. Полученные данные прямо свидетельствуют о присутствии беязодиазепинсвязывающего белка и циклофилина в составе выделенного комплекса, подтверждают ранее полученные данные о существовании в митохондриях мультибелкового бензодиазепинового рецептора и описании неспецифической проницаемости митохондрий в целом как проявлении одного из функциональных состояний этого рецептора (КтпаПу е1:.а1,1993).

5. Изозим-специфнческое распределение АТФ/АДФ анткпортера в митохондриях мозга и почек в составе комплексов с креатинкиназой я гексокиназой.

При фракционировании белковых комплексов митохондриальных контактных сайтов методом ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе было показано, что распределение активности митохондриальной креатинкиназы имеет два пика при элюции ферментного комплекса пологим градиентом ионной силы (Рис.5). При этом оказалось, что активность митохондриального цкклофилина Д целиком сосредоточена во фракциях, соответствующих первому пику креатинкиназной активности. Определение молекулярной массы белков во фракциях с ДЕАЕ целлюлозы методом гель-фильтрации на ВЭЖХ колонке с носителем "Биозил" показало, что как креагинкиназная, так и ротамазная активности соответствуют белковому ассоциату с массой 440+20 кД. Изозимный электрофорез был использован для идентификации

10 15 20 2 5 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

Номер фракции

Рис.5. Распределение активности креатинкиназы (черные треугольники) и циклофилина (белые квадраты) по фракциям в элюате с ДЕАЕ-целлюлозы пологам градиентом (0-0,5 М) КС1 (черные круги).

Гом. 1 2

Старт

вв-кк

Мт-КК

Рис.6. Изоэнзимный электрофорез пиковых фракций активности креатинкиназы, элюированной с ДЕАЕ-целлюлозы (1 соответствует 51-54 фракции, 2 соответствует 61-64 фракции на рис.5). В качестве контроля (Гом) нанесен гомогенат мозговой ткани после осаждения ядерной фракции. После разделения при 200 В, 5 мА в течение 45 минут в 0,05 М веронал буфере, рН 8,0 при комнатной температуре ацетатная мембрана была окрашена на активность креатинкиназы. ВВ-КК и Мт-ЮС - цитоплазматическая и митохондриальная изоформы соответственно.

октамерной формы креатинкиназы в составе исследуемых комплексов. Данные специфической окраски на ферментативную активность представлены на Рис.6. Состав полученных белковых комплексов был исследован методом двумерного

электрофореза по О'Фаррелу (О'РахтеН, 1975): изофокуеированяе в диапазоне рН 7 -11 в первом направлении и электрофорез по Лэммли во втором направлении. Полученные данные позволили идентифицировать белки по двум параметрам -изоэлектрической точке и молекулярной массе. Последний параметр был также определен методом время-пролетной масс-спекгрометрии пептидов, экстрагированных из геля после его обработки в соответствии с методом, изложенным выше. Характеристики белков, идентифицированные по данным двумерного электрофореза и масс-спектрометрического анализа пептидов, представлены в Таблице 5. Методом иммуноблотпшга компоненты комплексов, соответствующие пиковым по ферментативной активности фракциям с ДЕАЕ-колонки были идентифицированы с применением высокоспецифичных моноклональных антител: для порина (Рис.7), для двух изоформ транслокатора адениновых нуклеотидов, АНТ1 и АНТ2 (Рис.8) и цитохрома с (данные не

Таблица 5. Значения молекулярных масс и изоэлекгрических точек белков, идентифицированных в составе комплексов креатинкиназы с порином и транслокатором.

Креатинкиназа Порин Транслокатор адениновых нуклеотидов (изозим 1) Циклофилин Цит.с

р1, ед. рН 7,29 9,05 9,81 9,3 10

Мол. масса, кД 42,2 34 32,9 18 13,6

не представлены). Было показано, что порин, цитохром с и АНТ1 присутствуют лишь во фракциях первого пика креатинкиназной активности, тогда как в состав второго типа комплексов помимо креатинкиназы входит АНТ 2. Поскольку порин является маркерным белком внешней мембраны митохондрии, то комплекс, содержащий этот белок, может быть определен как локализованный в контактном сайте, в то время

как второй тип комплексов, содержащий только креатинкиназу и интегральный белок внутренней мембраны АТФ/АДФ ангипортер, имеет кристовое происхождение. Полученные данные подтверждают имеющиеся наблюдения о локализации креатинкиназы в кристах митохондрий (ЕррепЬе^ег-ЕЬегЬагск е[ а!., 1991,

Номер фракции

48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 61 63 65

• ........I''—ГмГТШГ" '

34 кДа—:г1? ■ Анти-порин

11|Щ§11

Рис.7. Иммунологическая идентификация порина во фракциях с ДЕАЕ целлюлозы в соответствии с рис.5. Для выявления порина были использованы высокоспецифичные антитела, выработанные на 25 аминокислотный ^концевой фрагмент рекомбинантного белка. Вторичные антитела конъгированы с щелочной фосфатазой.

Номер фракции

30 кДа —► -

51 52 53 54 61 62 63 64 ______ ' ^ Анти-АНТ 2

30 кДа —► ~~ Анти-АНТ 1

Рис.8. Иммунологическая идентификация транслокатора адениновых нуклеотид'ов во фракциях с ДЕАЕ целлюлозы в соответствии с рис.5. Для выявления изоформ (АНТ1 и АНТ2) были использованы высокоспецифичные моноклональные антитела против 10 аминокислотных Ы-концевых фрагментов, не имеющие перекрестной реактивности.

Койке е! а!., 1994, \¥аШталя й а1., 1998). Строгое соответствие распределения порина и циклофилина Д распределению нзозима транслокатора АНТ1 дает основание считать подобное распределение не случайным. В соответствии- с вышеизложенными данными об адекватности белковых комплексов контактных

сайтов структурному образованию, отвечающему за реализацию в митохондрии неспецифической проницаемости, мы предполагаем наличие различных функций для двух комплексов креатинкиназы с интегральными белками. Соответственно, креатиюсиназный комплекс, содержащий компоненты внешней мембраны и циклофилин Д помимо энергосопрягающей, несет функцию регулируемой системы образования митохондриальной поры, в то время как кристовый комплекс креатинкиназы и АНТ2 выполняет роль поддержания энергетического потенциала клетки. Для исследования этой гипотезы выделенные комплексы были реконструированы в липосомы, нагружены малатом и исследована кинетика выхода трикарбоксилата из липосом при добавлении к последним ионов Са2\ В согласии с предложенной моделью, липосомы с реконструированным комплексом контактных сайтов демонстрировали сигмоидальную зависимость концентрации малата, вышедшего из липосом в ответ на ионы кальция от концентрации последних и процесс выхода малата был заблокирован специфическим ингибитором митохондриальной поры, циклоспорином А (Рис.9). В то же время, кристовый

¡Саг*], рМ

Рис.9. Исследование выхода малата из нагруженных липосом с реконструированным периферическим белковым комплексом контактных сайтов, содержащем креатинкиназу, порин и изоформу 1 транслокагора адениновых нуклеотидов (см. Рис.8) в зависимости от добавленного Са2> без циклоспорина А (черные кружки) и с 50 нМ циклоспорина (белые кружки).

комплекс гексокиназы и АНТ2 демонстрировал отсутствие подобной зависимости в физиологических пределах концентрации ионов Са2*, добавленных к липосомам, и выход малата из липосом наблюдался при достижении субмиллимолярных концентраций кальция. Выход малата в этом случае не зависел также от присутствия циклоспорина А (Рис. 10). Соотношение индивидуальных белков в различных комплексах креатинкиназы было рассчитано по результатам количественного определения зависимости интенсивности окраски иммунохимическим методом от количества белка-антигена. Для этого компоненты комплексов были разделены

[Са"), рМ

Рис.10. Исследование выхода малата из нагруженных липосом с реконструированным белковым комплексом из митохондриальных крисг, содержащим изоформу 2 транслокатора адениновых нуклеотидов (см. Рис.8) в зависимости от добавленного Са2* без циклоспорина А (черные квадраты) и с 50 нМ циклоспорином А (белые квадраты).

электрофоретически по Лэммли, белки были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану и идентифицированы с помощью специфичных антител; окраска была вызвана реакцией восстановления тетразолия нитросинего. По окончании развития

окраски, проявленные полосы были вырезаны и промыты в трихлорметане, который был впоследствии выпарен, а преципитат растворен в этаноле. В растворе была определена оптическая плотность при 450 нм и результаты были нанесены на калибровочную кривую зависимости оптической плотности от количества нанесенного в качестве стандарта на исходный гель индивидуального исследуемого белка. По результатам измерений было определено следующее соотношение для комплекса контактных сайтов - 2:8:2:2 (1) соответственно для полилептадных цепей порина: креатинкиназы: транслокатора: циклофилина Д и (цитохрома с). Для кристового комплекса соотношение транслокатор: креатинкиназа составило 4: 8.

ВЫВОДЫ

1. Выделение и очистка различными методами комплексов гексокиназы и креатинкиназы с интегральными белками митохондриальных мембран: порином, транслокатором, диазепиновым рецептором и белком матрикса митохондрии циклофиллином подтвердили возможность получения стабильного препарата с постоянным соотношением компонентов и сохранением их функциональных особенностей.

2. Креатинкиназа формирует с интегральными белками митохондрий два различных комплекса, отличающихся как по составу компонентов (порин, циклофилин и транслокатор адениновых нуклеотидов), так и по локализации в митохондриях (один находится в контактных сайтах, а второй в митохондриальных кристах).

3. Изозим 1 транслокатора адениновых нуклеотидов располагается в комплексах контакных сайтов, а изозим 2 - в белковом комплексе митохондриальных крист.

4. Ионоканальная активность порина в составе поринсодержащих комплексов гексокиназы и креатинкиназы в 10 раз ниже таковой для свободного порина и составляет 0,43 нС.

5. Гексокиназа в составе комплексов имеет в 10-40 раз меньшее значение величины константы Михаэлиса чем свободный фермент и составляет 11 мкМ. Константа

ингибирования для для фермента в составе комплекса в 10 раз ниже, чем для

свободной формы и составляет около 20 мкМ.

6. Гексокиназа и креатинкиназа в составе комплекса функционируют в сопряженной системе переноса фосфоритного остатка между креатинфосфатом/креатином и АДФ/АТФ при участии мембранных белков порина и транслокатора без выхода промежуточных продуктов из внутреннего пространства сформированного компартмента.

7. Белковые комплексы гексокиназы или креатинкиназы, содержащие циклофиллин, при реконструкции в липосомы обладают способностью к образованию мегаканала, чувствительного к ингибитору неспецифической проницаемости, циклоспорину А.

Список раб от, опубликованных до теме диссертации.

1. Зоров, Д.Б., Высоких, М.Ю., Зорова, Л.Д., Исаев, Н.К., Красников, Б.Ф., Кузьминова, А.Е., Меликов, К.М., Самсонов, К.Ч., Стельмашук, Е.В. (1997) Структура и функция мигохондриальной поры. 2-й съезд биохимического общества РАН. Пущино, с. 378-379.

2. Zorov, D.B., Krasnikov, B.F., Kuzminova, А.Е., Visokikh, M.Yu., Zorova, L.D. (1997) Mitochondria revisited. Alternative fractions of mitochondria. Bioscience Reports, v.17, N 6, p.507-520.

3. Vyssokikh, M.Yu., Samsonov, A.V., Melikov, K.N., Yusipovitch, A.I., Krasnikov, B.F., Zorov, D,B.(1997). Mitochondrial protein complexes from contact sites. ХХХП1 international congress of physiological sciences. St Petersburg.

4. Kuzminova, A.E., Zhuravlyova, A.V., Krasnikov, B.F., Vyssokikh, M.Yu., Zorov, D.B. (1998) The oxygen and calcium synergism in permeability transition pore. EBEC Short Reports, BBA, v.10., p.166.

5. Kuzminova, A.E., Zhuravlyova, A.V., Vyssokikh, M.Yu., Zorova, L.D., Krasnikov, B.F., Zorov, D.B. (1998) The permeability transition pore induced under anaerobic conditions in mitochondria energized with ATP. FEBS Letters, v. 434, N3, p.313-316.

6. Vyssokikh, M.Yu., Goncharova, N.Yu., Kxasnikov, B.F., Melik-Nubarov, N.S., Zhuravleva, A.A., Samsonov, A.V., Melikov, K.Ch., Zorov, D.B. (1998) Mitochondrial intermembrane proteinous supercomplex is a benzodiazepine receptor? Biophysical Journal, v.74, N.2, p.19.

7. Высоких М.Ю., Гончарова Н.Ю., Журавлева A.A., Зорова Л.Д., Красников Б.Ф., Кузьминова А.Е., Меликов К.Ч., Мелик-Нубаров Н.С., Самсонов A.B., Белоусов В.В., Прищепова А.Е., Зоров Д.Б. (1999) Белковые комплексы митохондриальных контактных сайтов. Биохимия, т.64, № 4, с.390-398.

8. Зоров Д.Б., Высоких М.Ю., Добров E.H., Журавлева A.B., Зорова Л.Д., Исаев

H.К., Красников Б.Ф., Кузьминова А.Е., Мелик-Нубаров Н.С., Полякова И.А., Прищепова А.Е. (1999) Взаимодействие полианионов с митохондриями. Второй Съезд Биофизиков России, т.1, с.237.

9. Kuzminova, А.Е., Krasnikov, B.F., Melik-Nubarov, N.S., Zhuravlyova, A.V., Zorova, L.D., Isaev, N.K., Prishepova, A.E., Vyssokikh, M.Yu., Zorov, D.B. (1999) Interplay between polyanions and cytochrome с in mitochondria. Biophysical. Journal, v.76, N 1, part 2, p. A270.

10. Zorova, L.D., Kuzminova, A.E., Prishepova, A.E., Vyssokikh, M.Yu., Dobrov, E.N., Zorov, D.B., Krasnikov, B.F. (1999) Viral RNA induces a permeability transition and a concomitant release of cytochrome с from mitochondria. Biophysical Journal, v. 76, N

I,part2, p.A229

11. Rück, A., Biihler, S., Vyssokikh, M., Zorov, D., Pizybylski, M., Brdiczka, D. (2000) Complex-formation between the Adenine Nucleotide Translocator (ANT) and porin by induction of mitochondrial contact-sites.2nd Colloquium on Mitochondria and Myopathies in Halle.

12. Brdiczka, D., Rück, A., Vyssokikh, M., Dörner, A. (2000) Structure and function of mitochondrial contact sites: regulation of energy metabolism and permeability transition. 2nd Colloquium on Mitochondria and Myopathies in Halle

13. Vyssokikh, M., Katz, A„ Rück, A., Doerner, A., Zorov, D., Brdiczka, D. (2000) Adenine nucleotide translocator isotype 1 is exclusively located in the peripheral inner

membrane of brain mitochondria and has a higher affinity to cyclophilin. 2nd Colloquium on Mitochondria and Myopathies in Halle.

14. Vyssokikh, M.Yu., Katz, A., Rueck, A., Wuensch, C., Doerner, A., Zorov, D.B., Brdiczka, D. Adenine nucleotide translocator isotype 1 is located in the peripheral inner membrane of brain mitochondria and has a higher affinity to cyclophilin J.Biol.Chem. (сдана в печать)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Высоких, Михаил Юрьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гексокиназа.

1.1. Гексокиназная реакция и ее роль в клеточном метаболизме.

1.2.Изозимы гексокиназы тканей млекопитающих.

1.3. Внутриклеточная локализация гексокиназы.

1.4. Связывание гексокиназы с порином.

1.5. Особенности изучения адсорбционного поведения гексокиназы.

2. Митохондриальный порин.

2.1. Идентификация порина как белка потенциал-зависимого комплекса.

2.2. Выделение, очистка и состав митохондриального порина.

2.3. Методы функциональной реконструкции и изучения активности митохондриального порина.

2.4. Диаметр водной поры, потенциал-зависимость проводимости и ионная селективность поринового канала.

2.4.1. Диаметр водной поры.

2.4.2. Механизм потенциал-зависимости и селективный фильтр поринового канала.

2.5. Порин-ферментные комплексы.

2.6. Биогенез и строение митохондриального порина.

2.7. Порин и митохондриальный бензодиазепиновый рецептор.

2.8. Проблемы, возникающие при исследовании митохондриального порина.

3. Транслокатор адениновых нуклеотидов.

3.1. Локализация и свойства АНТ.

3.2. Цикл переноса нуклеотидов.

3.3. Регуляция переноса нуклеотидов мембранным потенциалом.

3.4. Модели, описывающие механизм трансмембранного переноса.

3.5. Ингибиторы переноса нуклеотидов транслокатором.30.

3.6. Структура транслокатора адениновых нуклеотидов.

4.Креатинкиназ а.32.

Материалы и методы.

1. Выделение митохондрий.

2. Исследование функционального состояния митохондрий.

3. Определение концентрации белка.

4. Определение энзиматической активности.

5. Выделение порина методом одноступенчатой адсорбционной хроматографии.

6. Очистка белковых комплексов митохондриальных контактных сайтов и исследование кинетического поведения гексокиназы и креатинкиназы в составе комплексов.

7. Исследование канальной активности порина в составе выделенных комплексов и для индивидуального белка. 47.

8. Разделение белковых комплексов контактных сайтов методом ионообменной хроматографии.

9. Получение поликлональных антител на атрактилозид-связывающий участок транслокатора.

10. Очистка транслокатора контактных сайтов методом хроматографии на иммуносорбенте.

11. Определение молекулярного веса выделенных белковых комплексов контактных сайтов.

12. Идентификация компонентов выделенных белковых комплексов контактных сайтов.

13. Определение М-концевой последовательности транслокатора, выделенного методом иммуносорбции из различных комплексов с креатинкиназой.

14. Фракционирование мембран митохондрий почек крысы и очистка креатинкиназы из различных компартментов митохондрии.

15. Определение стехиометрии комплексов периферических киназ и мембранных белков митохондрии для различных комплексов из разных тканей.

16. Определение содержания липидов в составе исследуемых белковых комплексов.

17. Применение сшивающих реагентов для выделения комплексов периферических киназ и мембранных белков митохондрии.

18. Изоэнзимэлектрофорез креатинкиназы в полученных пробах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Фракционирование митохондрий почек и исследование распределения активности креатинкиназы в различных компартментах.

2. Очистка креатинкиназы методом анионообменной хроматографии.

3. Исследование белкового состава фракций элюата с ДЕАЕ целлюлозы, обладающих активностью креатинкиназы.

4. Исследование липидного состава фракций с ДЕАЕ цллюлозы, содержащих креатинкиназу и мембранные белки.

5. Фракционирование креатинкиназы митохондрий мозга на ДЕАЕ целлюлозе.

6. Определение относительной молекулярной массы предполагаемых комплексов креатинкиназы и мембранных белков.

7. Идентификация изоформ транслокатора в составе исследуемых белковых ассоциатов.

8. Использование сшивающего реагента при получении исследуемых препаратов креатинкиназы митохондрий мозга.

9. Определение стехиометрии компонентов фракционируемых комплексов.

10. Определение стехиометрии липидов в составе исследуемых комплексов.

11. Выделение и анализ комплексов методом электрофореза в нативных условиях и в присутствии додецилсульфата натрия.

12. Определение кинетических параметров гексокиназной реакции в составе комплекса фермента с митохондриальными мембранными белками.

13. Канальная активность порина в составе белкового комплекса с гексокиназой.

14. Изозим-специфическое распределение АТФ/АДФ антипортера в митохондриях мозга и почек в составе комплексов с креатинкиназой и гексокиназой.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные особенности белковых комплексов митохондриальных контактных сайтов"

В современной биохимии считается постулатом, что субклеточные структуры, называемые митохондриями (или митохондриальным ретикулумом) в клетке выполняют функцию окисления субстратов, в результате чего создается электрохимический потенциал протонов и затем синтезируется АТФ. Генерация протонного потенциала и последующая трансформация этого потенциала для фосфорилирования АДФ является функцией внутренней мембраны, что определяется наличием существенных различий двух мембран митохондрии как по содержанию различных ферментов и их ансамблей, так и по свойствам проницаемости для различных низкомолекулярных соединений. Митчел постулировал, что внутренняя мембрана митохондрии непроницаема даже для таких ионов, как Н+ и ОН" ; иначе происходило бы рассеивание протонного потенциала без синтеза АТФ (Mitchell and Moyle, 1965) В отличие от внутренней, внешняя мембрана митохондрии проницаема для большинства метаболитов клетки и субстратов реакций, локализованных в матриксе митохондрии (Colombini, 1979).

В связи с этим возникает вопрос о механизме обмена метаболитами между митохондриальным матриксом и цитоплазмой клетки.

В 1979 году La Noue и соавт. (LaNoue and Schoolwerth, 1979) методом введения радиактивной метки в соединения, трансмембранный перенос которых предполагался, было показано, что внутренняя мембрана митохондрии не является непреодолимым препятствием для обмена между цитозолем и матриксом. Через 10 лет стало известно о существование одиннадцати транспортных систем во внутренней митохондриальной мембране (Kramer and Palmieri, 1989). Подобное достижение стало возможным после обнаружения в 1984 году высокоэффективного метода разделения белков-переносчиков путем адсорбционной хроматографии на смеси целита и гидроксилапатита и последующей реконструкции исследования системы переноса в липосомах (Kramer and Heberger, 1986), (Nalecz et al., 1986), (Bisaccia et al., 1988) (Stipani and Palmieri, 1983) (Kaplan and Pedersen, 1985), (Bisaccia et al., 1988).

Параллельно продолжалось изучение проницаемости внешней мембраны митохондрии. Было обнаружено, что наружная мембрана проницаема для гидрофильных веществ с молекулярной массой до 3 кДа (Holden and Colombini, 1988). Выдвигавшаяся в то время гипотеза о липидной природе транспортных систем не получила экспериментального подтверждения. Тогда же методом электронной микроскопии и дифракции рентгеновских лучей было показано существование в наружной мембране митохондрии растений порообразных структур белковой природы диаметром около 3 нм. Холден и Коломбини (Holden and Colombini, 1988) и соавт., исследуя пассивную диффузию через БЛМ, вызываемую компонентами наружней мембраны, обнаружили наличие слабо селективных анионных каналов с выраженной потенциал-зависимостью проводимости. Белок, являющийся компонентом наружной митохондриальной мембраны и при встраивании в липосомы и БЛМ образующий каналы (поры) диаметром 2 нм, получил название «порин» по аналогии с уже известным белком бактериальной природы со схожими функциями.

На основании этих данных было предположено, что диффузия метаболитов через наружную мембрану выделенных митохондрии не является ограничивающим фактором для скоростей окислительных реакций в матриксе. В то же время Brdiczka и соавт. (Brdiczka and Kolb, 1978) исследовали кинетику обмена метаболитами между цитоплазмой и митохондрией и показали, что наружная мембрана заметно ограничивает проникновение субстратов к ферментам межмембранного пространства.

Впоследствии было установлено (Mannella and Wang, 1989) , что канал, образуемый порином при встраивании в БЛМ, непроницаем для некоторых катионов с молекулярной массой около 400 Да при сохранении высокой проницаемости для других веществ с массой до 3 кДа. Таким образом, в конце 80-х годов сформировалось представление о сочетании для наружной мембраны митохондрии свойств высокой проницаемости для одних соединений и избирательности в отношении других: наружная мембрана не является пассивным молекулярным ситом, а представляет собой регулируемую систему транспорта метаболитов, реализуя в условиях клетки поток веществ и информации между митохондрией и цитоплазмой.

Изложенное выше представление имеет право на существование при условии четкой компартментализации внутренней и внешней мембран, поскольку при их контакте может произойти диссипирование потенциала на внутренней мембране, что с точки зрения мембранной энергетики, сделает ее бессмысленной для синтеза АТФ.

В то же время известно, что подобные контакты существуют и носят название contact-sites (Hackenbrock, 1968) (Brdiczka and Kolb, 1978). Хакенброк исследовал тонкие срезы фиксированных митохондрий методом электронной микроскопии и определил, что число межмембранных контактов достигает 120 на митохондрию среднего размера около 1мкм и зона контакта имеет диаметр до 200 А. Оказалось, что внутренняя мембрана неоднородна и состоит из связующей мембраны (inner boundary membrane), контактирующей с наружной мембраной, и мембраны крист (crystae-membrane), не контактирующей с внешней мембраной. По одной модели предполагается, что взаимодействие связующей и наружной мембран происходит через образование триламинарной структуры - сливаются внешний монослой внутренней и внутренний монослой наружной мембран (Van Venetie and Verkleij, 1982). Однако, данные рентгеноструктурного анализа порина не подтверждают этого и большинство склоняются к более обоснованной со структурной точки зрения концепции Брдички и соавторов о возможном, но не обязательном контакте мембран и превалировании роли белок-белковых взаимодействий компонентов контактного сайта, стабилизирующих участок контакта двух мембран (Ohlendieck et al., 1986) (Kottke et al., 1988) (Brdiczka, 1994) (Beutneret al., 1996).

Согласно Дорбани и соавторам (Dorbani et al., 1987) в наружной мембране митохондрии существует две популяции порина: каналоформер свободных участков мембраны и порин, входящий в состав контактных сайтов.

С другой стороны, Хакенброк еще в 1968 выдвинул предположение, что во-первых: обмен метаболитами между матриксом митохондрии и цитоплазмой происходит в области контакта двух митохондриальных мембран; во-вторых: транслокатор адениловых нуклеотидов локализован во внутренней мембране в том месте, где она контактирует с внешней мембраной; в-третьих: некоторые киназы активно функционируют в области этих контактов(НаскепЬгоск, 1968). Работы Дорбани и соавторов свидетельствуют о правильности предположения Хакенброка относительно взаимодействия киназ и порина - с каналоформером свободных участков взаимодействует глютатионтрансфераза, а гексокиназа и глицеролкиназа связываются с порином контактных сайтов, причем с одним и тем же участком, что позволило предположить возможность регуляции метаболизма углеводов посредством этого взаимоисключающего связывания (Kaneko et al., 1985). Фельгнером и соавторами было показано существование в наружной митохондриальной мембране ЗОкДа белка, связывающего гексокиназу (Feigner et al., 1979). Впоследствии Линден и Фиек с соавторами показали тождественность этого белка порину контактных сайтов (Linden et al., 1984а) (Fiek et al., 1982).

Обнаружение связывания гексокиназы с порином контактных сайтов митохондрий позволило предположить и впоследствии Брдичкой (Ohlendieck et al., 1986) было экспериментально подтверждено, что глюкоза фосфорилируется за счет АТФ, выходящего из митохондрий через пориновый канал, а не цитоплазматического АТФ. Это, в свою очередь, позволило предположить возможность функциональной и структурной связи поринового канала с транслокатором адениновых нуклеотидов, что и было подтверждено Линден и соавторами (Linden et al., 1989).

Начиная с этого момента, выдвигавшееся ранее предположение о существовании механизма сопряжения гликолиза и окислительного фосфорилирования посредством взаимодействия митохондрий и ферментов гликолитического пути, локализованных в цитоплазме, интенсивно разрабатывается и получает экспериментальное подтверждение в работах группы Брдички (Brdiczka, 1991) (Brdiczka, 1994) и Вилсона (Wilson, 1985) (Wilson, 1989)

Группой Брдички показано взаимодействие с пориновым каналом еще одного фермента, креатинкиназы. Причем из двух форм - цитоплазматической и митохондриальной, в образовании комплекса с порином принимает участие только митохондриальная, что объясняется особенностью олигомерного строения последней (oKTaMep)(Brdiczka et al., 1994).

Таким образом, к настоящему моменту уже известна целая группа белков, пространственно и функционально связанных с участком взамодействия двух мембран митохондрии, составляя белковую основу контактного сайта и, вероятно, функционирующих в составе единого мультибелкового комплекса. Подробная характеристика компонентов этой системы белков с транспортными, синтетическими и регуляторными функциями дана в следующем разделе.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гексокиназа.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Высоких, Михаил Юрьевич

выводы

5. Гексокиназа в составе комплексов имеет в 10-40 раз меньшее значение величины константы Михаэлиса чем свободный фермент и составляет 11 мкМ. Константа ингибирования для МдАйР для фермента в составе комплекса в 10 раз ниже, чем для свободной формы и составляет около 20 мкМ.

6. Гексокиназа и креатинкиназа в составе комплекса функционируют в сопряженной системе переноса фосфорильного остатка между креатинфосфатом/креатином и АДФ/АТФ при участии мембранных белков порина и транслокатора без выхода промежуточных продуктов из внутреннего пространства сформированного компартмента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Высоких, Михаил Юрьевич, Москва

1. Adams,V., Bosch,W., Schlegel.J., Wallimann,T., and Brdiczka.D. (1989). Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. Biochim. Biophys. Acta 981, 213-225.

2. Aquila.H., Misra,D., Eulitz.M., and Klingenberg.M. (1982). Complete amino acid sequence of the ADP/ATP carrier from beef heart mitochondria. Hoppe Seylers Z Physiol Chem 363, 345-349.

3. Ardail.D., Privat.J.P., Egret-Charlier,M., Levrat,C., Lerme.F., and Louisot,P. (1990). Mitochondrial contact sites. Lipid composition and dynamics. J. Biol. Chem 265, 18797-18802.

4. Arora,K.K., Parry.D.M., and Pedersen.P.L. (1992). Hexokinase receptors: preferential enzyme binding in normal cells to nonmitochondrial sites and in transformed cells to mitochondrial sites. J. Bioenerg. Biomembr. 24, 47-53.

5. Asryants.R.A., Duszenkova.l.V., and Nagradova.N.K. (1985). Determination of Sepharose-bound protein with Coomassie brilliant blue G-250. Anal. Biochem. 151, 571-574.

6. Banga.J.P., Anderton,B.H., and Roitt.l.M. (1978). Separation of membrane proteins in an undenatured form by isoelectric focusing. Anal. Biochem. 89, 348354.

7. Belousova.LA/., Fedosov.S.N., Orlova.E.V., and Stel'mashchuk.V.Y. (1991). The structural features of beef heart mitochondrial creatine kinase. Biochem. Int. 24, 51-58.

8. Belousova.L.V., Lipskaya.T.Y., Temple,V.D., and Rostovtsev.A.P. (1982). ATP-creatine phosphotransferase from beef heart mitochondria. Purification and properties. Adv. Myocardiol. 3, 585-595.

9. BeltrandelRio,H. and Wilson,J.E. (1992). Interaction of mitochondrially bound rat brain hexokinase with intramitochondrial compartments of ATP generated by oxidative phosphorylation and creatine kinase. Arch. Biochem. Biophys. 299, 116-124.

10. Benz,R. (1985). Porin from bacterial and mitochondrial outer membranes. CRC Crit Rev. Biochem. 19, 145-190.

11. Benz,R., Kottke,M., and Brdiczka.D. (1990). The cationically selective state of the mitochondrial outer membrane pore: a study with intact mitochondria and reconstituted mitochondrial porin. Biochim. Biophys. Acta 1022, 311-318.

12. Bessman,S.P. and Carpenter,C.L. (1985). The creatine-creatine phosphate energy shuttle. Annu. Rev. Biochem. 54, 831-862.

13. Bessman,S.P. and Geiger,P.J. (1981). Transport of energy in muscle: the phosphorylcreatine shuttle. Science 211, 448-452.

14. Beutner,G., Ruck,A., Riede.B., Welte.W., and Brdiczka,D. (1996). Complexes between kinases, mitochondrial porin and adenylate translocator in rat brain resemble the permeability transition pore. FEBS Lett. 396, 189-195.

15. Beyer,K. and Klingenberg,M. (1985). ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry 24, 3821-3826.

16. Bisaccia,F., Indiveri.C., and Palmieri,F. (1988). Purification and reconstitution of two anion carriers from rat liver mitochondria: the dicarboxylate and the 2-oxoglutarate carrier. Biochim. Biophys. Acta 933, 229-240.

17. Block, M.R., Lauquin,G.J„ and Vignais.P.V. (1983). Use of 3-0-naphthoyladenosine 5'-diphosphate to probe distinct conformational states ofmembrane-bound adenosine 5'- diphosphate/adenosine 5'-triphosphate carrier. Biochemistry 22, 2202-2208.

18. Bowen,K.A., Tam,K., and Colombini.M. (1985). Evidence for titratable gating charges controlling the voltage dependence of the outer mitochondrial membrane channel, VDAC. J. Membr. Bioi. 86, 51-59.

19. Brdiczka,D. (1991). Contact sites between mitochondrial envelope membranes. Structure and function in en. Biochim. Biophys. Acta 1071, 291-312.

20. Brdiczka,D. (1994). Function of the outer mitochondrial compartment in regulation of energy metabolism. Biochim. Biophys. Acta 1187, 264-269.

21. Brdiczka,D., Kaldis.P., and Wallimann.T. (1994). In vitro complex formation between the octamer of mitochondrial creatine kinase and porin. J. Biol. Chem. 269, 27640-27644.

22. Brdiczka, D. and Kolb, V. Reduction of ADP/ATP exchange rates after dissociation of the contact sites between the two boundary membranes in rat liver mitochondria. Hoppe Seylers Z Physiol Chem 359, 1063-1071. 1978. Ref Type: Journal (Full)

23. Brustovetsky,N. and Klingenberg,M. (1996). Mitochondrial ADP/ATP carrier can be reversibly converted into a large channel by Ca2+. Biochemistry 35, 84838488.

24. Bucher,K. (1964). Particularities of the heart as a pump. Z Naturwiss. Med. Grundlagenforsch. 2, 119-131.

25. Chance,B., Leigh,J.S., Smith,D.S., Nioka,S., and Clark,B.J. (1986). Phosphorus magnetic resonance spectroscopy studies of the role of mitochondria in the disease process. Ann. N. Y. Acad. Sci. 488, 140-153.

26. Cheneval,D., Carafoli.E., Powell,G.L., and Marsh,D. (1989). A spin-label electron spin resonance study of the binding of mitochondrial creatine kinase to cardiolipin. Eur. J. Biochem. 186, 415-419.

27. Collings,T.A., Braid,H.L., Greene,W.B., and Wheeler,D.D. (1986). Morphometry and autoradiographic analysis of crude synaptosomal preparations from rat cerebral cortex. Neurochem. Res. 11, 707-721.

28. Colombini,M. (1979). A candidate for the permeability pathway of the outer mitochondrial membrane. Nature 279, 643-645.

29. Colombini,M. (1980). Structure and mode of action of a voltage dependent anion-selective channel (VDAC) located in the outer mitochondrial membrane. Ann. N. Y. Acad. Sci. 341, 552-563.

30. Colombini,M. (1983). Purification of VDAC (voltage-dependent anion-selective channel) from rat liver mitochondria. J. Membr. Biol. 74, 115-121.

31. Colombini,M., Yeung,C.L., Tung,J., and Konig,T. (1987). The mitochondrial outer membrane channel, VDAC, is regulated by a synthetic polyanion. Biochim. Biophys. Acta 905, 279-286.

32. Crompton,M., Ellinger,H., and Costi,A. (1988). Inhibition by cyclosporin A of a Ca2+-dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress. Biochem. J. 255, 357-360.

33. De Pinto,V.D. and Palmieri,F. (1992). Transmembrane arrangement of mitochondrial porin or voltage-dependent anion channel (VDAC). J. Bioenerg. Biomembr. 24, 21-26.

34. De,P., V, Prezioso.G., and Palmieri.F. (1987). A simple and rapid method for the purification of the mitochondrial porin from mammalian tissues. Biochim. Biophys. Acta 905, 499-502.

35. Doring, C. and Colmbini, M. On the nature of the molecular mechanism underlying the voltage dependence of the channel-forminf protein, voltage-dependent anion-selective channel (VDAC). Biophys.J. 45, 44-46. 1984. Ref Type: Journal (Full)

36. Doring,C. and Colombini.M. (1985). The mitochondrial voltage-dependent channel, VDAC, is modified asymmetrically by succinic anhydride. J. Membr. Biol. 83, 87-94.

37. Dornan,J., Page, A. P., Taylor,P., Wu,S., Winter,A.D., Husi,H., and Walkinshaw.M.D. (1999). Biochemical and structural characterization of a divergent loop cyclophilin from Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem 274, 34877-34883.

38. Ellington,W.R. (1989). Phosphocreatine represents a thermodynamic and functional improvement over other muscle phosphagens. J. Exp. Biol. 143, 177194.

39. Eppenberger,H.M., Dawson,D.M., and Kaplan,N.O. (1967). The comparative enzymology of creatine kinases. I. Isolation and characterization from chicken and rabbit tissues. J. Biol. Chem 242, 204-209.

40. Erdelt,H., Weidemann,M.J., Buchholz,M., and Klingenberg,M. (1972). Some principle effects of bongkrekic acid on the binding of adenine nucleotides to mitochondrial membranes. Eur. J. Biochem. 30, 107-122.

41. Erickson-Viitanen.S., Geiger,P., Yang.W.C., and Bessman.S.P. (1982). The creatine-creatine phosphate shuttle for energy transport- compartmentation of creatine Phosphokinase in muscle. Adv. Exp. Med. Biol. 151, 115-125.

42. Feigner,P.L., Messer,J.L., and Wilson,J.E. (1979). Purification of a hexokinase-binding protein from the outer mitochondrial membrane. J. Biol. Chem. 254, 4946-4949.

43. Feigner,P.L. and Wilson,J.E. (1977). Effect of neutral salts on the interaction of rat brain hexokinase with the outer mitochrondrial membrane. Arch. Biochem. Biophys. 182, 282-294.

44. Fiek,C., Benz.R., Roos.N., and Brdiczka.D. (1982). Evidence for identity between the hexokinase-binding protein and the mitochondrial porin in the outer membrane of rat liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 688, 429-440.

45. Font,B., Vial.C., Goldschmidt,D., Eichenberger.D., and Gautheron,D.C. (1981). Heart mitochondrial creatine kinase solubilization. Effect of mitochondrial swelling and SH group reagents. Arch. Biochem. Biophys. 212, 195-203.

46. Freitag,H., Neupert,W., and Benz.R. (1982). Purification and characterisation of a pore protein of the outer mitochondrial membrane from Neurospora crassa. Eur. J. Biochem. 123, 629-636.

47. Fritz-Wolf,K., Schnyder.T., Wallimann,T., and Kabsch,W. (1996). Structure of mitochondrial creatine kinase see comments. Nature 381, 341-345.

48. Gellerich,F.N., Schlame,M., Bohnensack,R., and Kunz,W. (1987). Dynamic compartmentation of adenine nucleotides in the mitochondrial intermembrane space of rat-heart mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 890, 117-126.

49. Guo,X.W., Smith,P.R., Cognon.B., D'Arcangelis,D., Dolginova.E., and Mannella,C.A. (1995). Molecular design of the voltage-dependent, anion-selective channel in the mitochondrial outer membrane. J. Struct. Biol. 114, 4159.

50. Hackenberg,H. and Klingenberg,M. (1980). Molecular weight and hydrodynamic parameters of the adenosine 5'- diphosphate-adenosine 5'-triphosphate carrier in Triton X-100. Biochemistry 19, 548-555.

51. Hackenbrock,C.R. (1968). Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 61, 598-605.

52. Harris,R.A., Farmer,B., and Ozawa,T. (1972). Inhibition of the mitochondrial adenine nucleotide transport system by oleyl CoA. Arch. Biochem. Biophys. 150, 199-209.

53. Heidt,H.W. (1972). Energy metabolism in mitochondria. Angew. Chem Int. Ed Engl. 11, 792-798.

54. Holden,M.J. and Colombini,M. (1988). The mitochondrial outer membrane channel, VDAC, is modulated by a soluble protein. FEBS Lett. 241, 105-109.

55. Hovius,R., Lambrechts,H., Nicolay,K., and de Kruijff,B. (1990). Improved methods to isolate and subfractionate rat liver mitochondria. Lipid composition of the inner and outer membrane. Biochim. Biophys. Acta 1021, 217-226.

56. Huizing,M., DePinto,V., Ruitenbeek,W., Trijbels,F.J., van den Heuvel.L.P., and Wendel,U. (1996). Importance of mitochondrial transmembrane processes in human mitochondriopathies. J. Bioenerg. Biomembr. 28 , 109-114.

57. Iyengar,M.R. (1984). Creatine kinase as an intracellular regulator. J. Muscle Res. Cell Motil. 5, 527-534.

58. Jacobs,H., Heldt,H.W., and Klingenberg,M. (1964). High activity of creatine kinase in mitochondria from muscle and brain and evidence for a separate mitochondrial isoenzyme of creatine kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 16, 516-521.

59. Jennings,R.B. (1981). Myocardial ischemia: introduction. Am. J. Pathol. 102, 239-240.

60. Kammermeier,H. (1987). Interrelationship between the free energy change of ATP-hydrolysis, cytosolic inorganic phosphate and cardiac performance during hypoxia and reoxygenation. Biomed. Biochim. Acta 46, S499-S504.

61. Kaneko,M., Kurokawa.M., and lshibashi,S. (1985). Binding and function of mitochondrial glycerol kinase in comparison with those of mitochondrial hexokinase. Arch. Biochem. Biophys. 237, 135-141.

62. Kaplan,R.S. and Pedersen.P.L. (1985). Isolation and reconstitution of the n-butylmalonate-sensitive dicarboxylate transporter from rat liver mitochondria. J. Biol. Chem. 260, 10293-10298.

63. Kinnally,K.W., Zorov.D.B., Antonenko,Y.N., Snyder,S.H., McEnery,M.W., and Tedeschi.H. (1993). Mitochondrial benzodiazepine receptor linked to inner membrane ion channels by nanomolar actions of ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 90, 1374-1378.

64. Klingenberg,M. (1989). Molecular aspects of the adenine nucleotide carrier from mitochondria. Arch. Biochem. Biophys. 270, 1-14.

65. Klingenberg.M., Aquila.H., and Riccio.P. (1979). Isolation of functional membrane proteins related to or identical with the ADP, ATP carrier of mitochondria. Methods Enzymol. 56, 407-414.

66. Knoll,G. and Brdiczka.D. (1983). Changes in freeze-fractured mitochondrial membranes correlated to their energetic state. Dynamic interactions of the boundary membranes. Biochim. Biophys. Acta 733, 102-110.

67. Kottke,M„ Adams,V., Wallimann.T., Nalam.V.K., and Brdiczka,D. (1991). Location and regulation of octameric mitochondrial creatine kinase in the contact sites. Biochim. Biophys. Acta 1061, 215-225.

68. Kottke,M., Wallimann.T., and Brdiczka,D. (1994). Dual electron microscopic localization of mitochondrial creatine kinase in brain mitochondria. Biochem. Med. Metab Biol. 51, 105-117.

69. Kramer,R. and Heberger,C. (1986). Functional reconstitution of carrier proteins by removal of detergent with a hydrophobic ion exchange column. Biochim. Biophys. Acta 863, 289-296.

70. Kramer,R. and Klingenberg,M. (1982). Electrophoretic control of reconstituted adenine nucleotide translocation. Biochemistry 21, 1082-1089.

71. Kramer,R. and Palmieri.F. (1989). Molecular aspects of isolated and reconstituted carrier proteins from animal mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 974, 1-23.

72. Kuby,S.A., Noda,L., and Lardy,H.A. (1954). Adenosinetriphosphate-creatine transphorylase. I. Isolation of crystalline evzyme from rabbit muscle. J. Biol. Chem 209, 191-201.

73. Laemmli,U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

74. LaNoue,K.F. and Schoolwerth,A.C. (1979). Metabolite transport in mitochondria. Annu. Rev. Biochem. 48, 871-922.

75. Lauquin,G.J. and Vignais.P.V. (1976). Interaction of (3H) bongkrekic acid with the mitochondrial adenine nucleotide translocator. Biochemistry 15, 2316-2322.

76. Lawson,J.W. and Veech,R.L. (1979). Effects of pH and free Mg2+ on the Keq of the creatine kinase reaction and other phosphate hydrolyses and phosphate transfer reactions. J. Biol. Chem 254, 6528-6537.

77. Lazo,P.A., Sols,A., and Wilson,J.E. (1980). Brain hexokinase has two spatially discrete sites for binding of glucose-6-phosphate. J. Biol. Chem. 255, 7548-7551.

78. Lehninger,A.L. (1982). Proton and electric charge translocation in mitochondrial energy transduction. Adv. Exp. Med. Biol. 148, 171-186.

79. Levin,R.M., Longhurst,P.A., Levin,S.S., Haugaard,N., and Wein.A.J. (1990). Creatine kinase activity of urinary bladder and skeletal muscle from control and streptozotocin-diabetic rats. Mol. Cell Biochem. 97, 153-159.

80. Levitsky,D.O., Levchenko,T.S., Saks,V.A., Sharov,V.G., and Smirnov,V.N. (1978). The role of creatine phosphokinase in supplying energy for the calcium pump system of heart sarcoplasmic reticulum. Membr. Biochem. 2, 81-96.

81. Linden,M., Andersson.G., Gellerfors.P., and Nelson,B.D. (1984a). Subcellular distribution of rat liver porin. Biochim. Biophys. Acta 770, 93-96.

82. Linden,M., Andersson,G., Gellerfors.P., and Nelson,B.D. (1984b). Subcellular distribution of rat liver porin. Biochim. Biophys. Acta 770, 93-96.

83. Linden,M., Gellerfors.P., and Nelson,B.D. (1982). Pore protein and the hexokinase-binding protein from the outer membrane of rat liver mitochondria are identical. FEBS Lett. 141, 189-192.

84. Linden,M., Nelson,B.D., Loncar.D., and Leterrier,J.F. (1989). Studies on the interaction between mitochondria and the cytoskeleton. J. Bioenerg. Biomembr. 21, 507-518.

85. Lohman,K. (1934). Uber die enzymatische Aufspaltung der Kreatinphosphorsaure; zugleich ein Beitrag zum Chemismus der Muskelkontraktion. Biochem. Z 271, 264-277.

86. Mannella,C.A. (1981). Structure of the outer mitochondrial membrane: analysis of X-ray diffraction from the plant membrane. Biochim. Biophys. Acta 645, 33-40.

87. Mannella,C.A., Colombini,M., and Frank,J. (1983). Structural and functional evidence for multiple channel complexes in the outer membrane of Neurospora crassa mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 80, 2243-2247.

88. Mannella,C.A., Forte,M., and Colombini.M. (1992). Toward the molecular structure of the mitochondrial channel, VDAC. J. Bioenerg. Biomembr. 24, 7-19.

89. Mannella.C.A. and Wang,Q. (1989). Permeability of the mitochondrial outer membrane to organic cations. Biochim. Biophys. Acta 981, 363-366.

90. McCabe.E.R. (1994). Microcompartmentation of energy metabolism at the outer mitochondrial membrane: role in diabetes mellitus and other diseases. J. Bioenerg. Biomembr. 26, 317-325.

91. Minajeva,A., Ventura-Clapier,R., and Veksler,V. (1996). Ca2+ uptake by cardiac sarcoplasmic reticulum ATPase in situ strongly depends on bound creatine kinase. Pflugers Arch. 432, 904-912.

92. Mirzabekov,T.A. and Ermishkin,L.N. (1989). The gate of mitochondrial porin channel is controlled by a number of negative and positive charges. FEBS Lett. 249, 375-378.

93. Mitchell,P. and Moyle,J. (1965). Stoichiometry of proton translocation through the respiratory chain and adenosine triphosphatase systems of rat liver mitochondria. Nature 208, 147-151.

94. Mommaerts,W.F. and Wallner,A. (1967). The break-down of adenosine triphosphate in the contraction cycle of the frog sartorius muscle. J. Physiol (Lond) 193, 343-357.

95. Montal,M. and Mueller,P. (1972). Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 69, 3561-3566.

96. Morel,F., Lauquin,G., Lunardi,J., Duszynski.J., and Vignais.P.V. (1974). An appraisal of the functional significance of the inhibitory effect of long chain acyl-CoAs on mitochondrial transports. FEBS Lett. 39, 133-138.

97. Morrison,J.F. and White,A. (1967). Isotope exchange studies of the reaction catalyzed by ATP: creatine phosphotransferase. Eur. J. Biochem. 3, 145-152.

98. Muller,M., Moser,R., Cheneval,D., and Carafoli.E. (1985). Cardiolipin is the membrane receptor for mitochondrial creatine Phosphokinase. J. Biol. Chem 260, 3839-3843.

99. Nakashima,R.A. (1989). Hexokinase-binding properties of the mitochondrial VDAC protein: inhibition by DCCD and location of putative DCCD-binding sites. J. Bioenerg. Biomembr. 21, 461-470.

100. Nalecz,K.A., Bolli.R., Wojtczak.L., and Azzi.A. (1986). The monocarboxylate carrier from bovine heart mitochondria: partial purification and its substrate-transporting properties in a reconstituted system. Biochim. Biophys. Acta 851, 29-37.

101. Needels.D.L. and Wilson,J.E. (1983). The identity of hexokinase activities from mitochondrial and cytoplasmic fractions of rat brain homogenates. J. Neurochem. 40, 1134-1143.

102. Ohlendieck.K., Riesinger,!., Adams,V., Krause,J., and Brdiczka.D. (1986). Enrichment and biochemical characterization of boundary membrane contact sites from rat-liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 860, 672-689.

103. Parola.A.L., Stump,D.G., Pepperl.D.J., Krueger,K.E., Regan,J.W., and Laird,H.E. (1991). Cloning and expression of a pharmacologically unique bovine peripheral- type benzodiazepine receptor isoquinoline binding protein. J. Biol. Chem. 266, 14082-14087.

104. Peng,S„ Blachly-Dyson,E., Colombini,M., and Forte,M. (1992). Determination of the number of polypeptide subunits in a functional VDAC channel from Saccharomyces cerevisiae. J. Bioenerg. Biomembr. 24, 27-31.

105. Pfaff,E. and Klingenberg,M. (1968). Adenine nucleotide translocation of mitochondria. 1. Specificity and control. Eur. J. Biochem. 6, 66-79.

106. Rojo,M., Hovius,R., Demel,R., Wallimann,T., Eppenberger,H.M., and Nicolay,K. (1991a). Interaction of mitochondrial creatine kinase with model membranes. A monolayer study. FEBS Lett. 281, 123-129.

107. Rojo,M., Hovius,R., Demel,R.A„ Nicolay,K., and Wallimann.T. (1991b). Mitochondrial creatine kinase mediates contact formation between mitochondrial membranes. J. Biol. Chem 266, 20290-20295.

108. Roos,N„ Benz.R., and Brdiczka.D. (1982). Identification and characterization of the pore-forming protein in the outer membrane of rat liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 686, 204-214.

109. Rose,I.A. and Warms,J.V. (1967). Mitochondrial hexokinase. Release, rebinding, and location. J. Biol. Chem. 242, 1635-1645.

110. Rossi,A.M., Zaccaro,L., Rosselli,F., and Quattrone,C. (1988). Clastogenic effects induced in mice and rats by 1,4-bis2-(3,5- dichloropyridyloxy).-benzene, a phenobarbital-like enzyme inducer and liver tumour promoter. Carcinogenesis 9, 1147-1151.

111. Schein,S.J., Colombini.M., and Finkelstein.A. (1976). Reconstitution in planar lipid bilayers of a voltage-dependent anion- selective channel obtained from Paramecium mitochondria. J. Membr. Biol. 30, 99-120.

112. Schlame,M. and Augustin,W. (1985). Association of creatine kinase with rat heart mitochondria: high and low affinity binding sites and the involvement of phospholipids. Biomed. Biochim. Acta 44, 1083-1088.

113. Schlattner,U., Forstner,M., Eder,M., Stachowiak.O., Fritz-Wolf,K., and Wallimann.T. (1998). Functional aspects of the X-ray structure of mitochondrial creatine kinase: a molecular physiology approach. Mol. Cell Biochem. 184, 125140.

114. Schnaitman.C. and Greenawalt.J.W. (1968). Enzymatic properties of the inner and outer membranes of rat liver mitochondria. J. Cell Biol. 38, 158-175.

115. Schnyder.T., Rojo.M., Furter.R., and Wallimann.T. (1994). The structure of mitochondrial creatine kinase and its membrane binding properties. Mol. Cell Biochem. 133-134, 115-123.

116. Schnyder.T., Sargent,D.F., Richmond,T. J., Eppenberger,H.M., and Wallimann,T. (1990). Crystallization and preliminary X-ray analysis of two different forms of mitochondrial creatine kinase from chicken cardiac muscle. J. Mol. Biol. 216, 809-812.

117. Schutkowski,M., Wollner,S., and Fischer,G. (1995). Inhibition of peptidyl-prolyl cis/trans isomerase activity by substrate analog structures: thioxo tetrapeptide-4-nitroanilides. Biochemistry 34, 13016-13026.

118. Skowronski.R., Fanestil,D.D., and Beaumont,K. (1988). Photoaffinity labeling of peripheral-type benzodiazepine receptors in rat kidney mitochondria with 3H.PK 14105. Eur. J. Pharmacol. 148, 187-193.

119. Smith,A.D. and Wilson,J.E. (1991). Disposition of mitochondrially bound hexokinase at the membrane surface, deduced from reactivity with monoclonal antibodies recognizing epitopes of defined location. Arch. Biochem. Biophys. 287, 359-366.

120. Soboll,S„ Brdiczka,D., Jahnke,D., Schmidt,A„ Schlattner,U„ Wendt,S., Wyss,M., and Wallimann.T. (1999). Octamer-dimer transitions of mitochondrial creatine kinase in heart disease. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 857-866.

121. Souverijn.J.H., Huisman,L.A., Rosing,J., and Kemp,A., Jr. (1973). Comparison of ADP and ATP as substrates for the adenine nucleotide translocator in rat-liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 305, 185-198.

122. Stachowiak,0., Dolder,M., and Wallimann,T. (1996). Membrane-binding and lipid vesicle cross-linking kinetics of the mitochondrial creatine kinase octamer. Biochemistry 35, 15522-15528.

123. Stachowiak.O., Schlattner, U., Dolder,M., and Wallimann,T. (1998). Oligomeric state and membrane binding behaviour of creatine kinase isoenzymes: implications for cellular function and mitochondrial structure. Mol. Cell Biochem. 184, 141-151.

124. Stipani.l. and Palmieri.F. (1983). Purification of the active mitochondrial tricarboxylate carrier by hydroxylapatite chromatography. FEBS Lett. 161, 269274.

125. Tikhonova.l.M., Andreyev, A. Y., Antonenko,Y., Kaulen,A.D., Komrakov.A.Y., and Skulachev.V.P. (1994). Ion permeability induced in artificial membranes by the ATP/ADP antiporter. FEBS Lett. 337, 231-234.

126. Trezeguet,V., Le Saux,A., David,C., Gourdet.C., Fiore,C., Dianoux.A., Brandolin,G., and Lauquin,G.J. (2000). A covalent tandem dimer of the mitochondrial ADP/ATP carrier is functional in vivo. Biochim. Biophys. Acta 1457, 81-93.

127. Turner,D.C., Wallimann,T., and Eppenberger,H.M. (1973). A protein that binds specifically to the M-line of skeletal muscle is identified as the muscle form of creatine kinase. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 70, 702-705.

128. Van Venetie.R. and Verkleij,A.J. (1982). Possible role of non-bilayer lipids in the structure of mitochondria. A freeze-fracture electron microscopy study. Biochim. Biophys. Acta 692, 397-405.

129. Vignais,P.V. and Lunardi,J. (1985). Chemical probes of the mitochondrial ATP synthesis and translocation. Annu. Rev. Biochem. 54, 977-1014.

130. Viitanen.P.V., Geiger,P.J., Erickson-Viitanen,S., and Bessman.S.P. (1984). Evidence for functional hexokinase compartmentation in rat skeletal muscle mitochondria. J. Biol. Chem 259, 9679-9686.

131. Voronova.L.A. and Parshin.A.N. (1976). Isoforms of human and animal tumor hexokinase. Vopr. Onkol. 22, 41-45.

132. Wallimann.T., Turner,D.C., and Eppenberger.H.M. (1977). Localization of creatine kinase isoenzymes in myofibrils. I. Chicken skeletal muscle. J. Cell Biol. 75, 297-317.

133. Wanders,R.J., Van Roermund.C.W., and Meijer,A.J. (1984). Analysis of the control of citrulline synthesis in isolated rat-liver mitochondria. Eur. J. Biochem. 142, 247-254.

134. Watts,D.C. and KumudavalliJ. (1970). Further evidence for the role of the essential thiol groups in adenosine triphosphate-creatine phosphotransferase from a comparison of the human and rabbit enzymes. Biochem. J. 118, 22P-23P.

135. Weiler.U., Riesinger,!., Knoll,G., and Brdiczka.D. (1985). The regulation of mitochondrial-bound hexokinases in the liver. Biochem. Med. 33, 223-235.

136. White,T.K. and Wilson,J.E. (1987). Rat brain hexokinase: location of the allosteric regulatory site in a structural domain at the N-terminus of the enzyme. Arch. Biochem. Biophys. 259, 402-411.

137. Wilson,J. (1985). Regulation of mammalian hexokinase activity. In Regulation in carbohydrate metabolism., R.Beither, ed. Boca Raton), pp. 45-85.

138. Wilson,J.E. (1989). Rapid purification of mitochondrial hexokinase from rat brain by a single affinity chromatography step on Affi-Gel blue. Prep. Biochem. 19, 13-21.

139. Wirz,T., Brandle,U., Soldati,T„ Hossle,J.P., and Perriard,J.C. (1990). A unique chicken B-creatine kinase gene gives rise to two B-creatine kinase isoproteins with distinct N termini by alternative splicing. J. Biol. Chem 265, 11656-11666.

140. Yoshizaki.K., Watari,H., and Radda.G.K. (1990). Role of phosphocreatine in energy transport in skeletal muscle of bullfrog studied by 31P-NMR. Biochim. Biophys. Acta 1051, 144-150.

Информация о работе

Высоких, Михаил Юрьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Структурно-функциональные особенности белковых комплексов митохондриальных контактных сайтов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы