Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические исследования функционирования полиморфных вариантов генов цитокиновой сети и биотрансформации ксенобиотиков при онкопатологии

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические исследования функционирования полиморфных вариантов генов цитокиновой сети и биотрансформации ксенобиотиков при онкопатологии"

005013494

"Г

ВАСИЛЬЕВА ЭЛЬВИРА МАНСУРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВОЙ СЕТИ И БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ ПРИ ОНКОПАТОЛОГИИ

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 (,'ідр ті

Уфа-2012

005013494

Работа выполнена в центре молекулярио-генетических исследований при кафедре генетики Башкирского государственного педагогического университета им.М.Акмуллы

Научный руководитель: Горбунова Валентина Юрьевна

Официальные оппоненты:

Ким Александр Иннокентьевич

Бермишева Марипа Алексеевна

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор кафедры генетики МГУ им. М.ВЛомоносова

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения Российской академии наук Института биохимии и генетики УНЦ РАН

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Защита диссертации состоится «£?» 2012 г. в «iff» часов на заседании

Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ni/dissov.htm!,

e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан сре Я 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цитокиновая система относится к центральным регуляторам гомеостаза, так как обладает широким спектром биологических эффектов (Симбирцев, 2008; Баранов, 2010). Одной из важнейших функций цитокинов является обеспечение согласованного действия иммунной, эндокринной и нервной систем (Mosmann 1986; Bclardclli, 1999), при котором происходит модуляция как локальных, так и глобальных механизмов защиты. Образование и высвобождение этих высокоактивных молекул жестко регулируется генетическими механизмами (Симбирцев, 2002; Сенников, 2004). Генетически детерминированная дисрегуляция цитокинов ведет к инициации не только хронических воспалительных процессов, но и к генерализированным нарушениям. Показано, что дисбаланс в продукции белков семейства IL-1 (IL-lß/ILl RA/IL 1RI) влияет на характер протекания воспалительных заболеваний и является одним из пусковых механизмов патологических процессов (Громова, Симбирцев, 2005). В последние десятилетия активно изучается роль цитокинов в регуляции состояний, связанных с развитием иммунопатологии: острых и хронических воспалительных процессов инфекционной природы, аутоиммунных реакций и различных проявлений аллергии (Карунас, Хуснутдинова, 2007). Особый интерес вызывает вопрос о влиянии цитокинов на процесс неопластической трансформации клеток. Имеется достаточно подтверждений тому, что хроническое воспаление является фактором риска развития опухоли, ее прогрессирования и метастазирования (Coussens, 2002; Tan, 2007; Porta, 2007; Lee et al., 2008; Fidler, 2008; Mantovani, 2008). Согласно современным исследованиям, наиболее перспективными в качестве маркеров опухолевого роста и прогностических факторов при злокачественных новообразованиях являются такие цитокины, как IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, a-TNF и др. Для ряда онкологических заболеваний показана взаимосвязь между концентрацией цитокинов в сыворотке крови и агрессивностью течения, метастатическим потенциалом и риском развития рецидивов (Sivaparvathi et al., 1995; Glas et al., 2004).

На функционирование системы цитокинов могут влиять ксенобиотики, образующие реактивные метаболиты в ходе биотрансформации, которые могут выступать в роли аутоантигенов, вызывающих клеточный или гуморальный иммунный ответ (Ляхоаич и др., 2000).

В настоящее время, для определения степени напряженности регуляторных механизмов иммунного ответа в клинической практике проводится оценка концентрации цитокинов в сыворотке крови, что лишь констатирует сам факт её повышения или понижения у данного индивида, без учета его генетической конституции. В связи с этим, возрастает необходимость исследования индивидуального генетического профиля, соответствующего его иммунному статусу, что определит направление превентивной и предиктивной корректировки образа жизни каждого человека. Поэтому имеется настоятельная необходимость изучения функционирования полиморфных вариантов генов цитокинового каскада не только семейства интерлейкина-!, но и других цитокинов про- и противовоспалительного ряда, а также генов, регулирующих систему биотрансформации ксенобиотиков в норме и при патологических состояниях.

Цель настоящего исследования заключается в комплексном анализе содержания цитокинов в сыворотке крови при различных сочетаниях аллелей генов цитокинового каскада и системы биотрансформации ксенобиотиков в норме и онкопатологии.

Задачи исследования.

1. Изучить содержание цитокинов IL-lß, IL1RA, IL2, IL4, IL-6, ILIO, a-TNF, и CRP в сыворотке крови у здоровых индивидов и онкобольных.

2. Провести генетический анализ наследования аллелей генов семейства интерлейкин-1, локализованных на 2 хромосоме и аллелей генов микросомалыюй эпоксидгидролазы-1 и интерлейкина-10, локализованных на хромосоме 1.

3. Изучить динамику изменения показателей цитокинового профиля при: активации клеток цельной крови митогеном ex vivo и действии иммуномодулятора растительного происхождения «Эхинацея» у здоровых индивидов с различной генетической конституцией.

4. Проанализировать распределение полиморфных вариантов генов цитокинового профиля (IL-lß (rsll43634, 39530Т), IL1RA(VNTR во 2 интроне), IL1 RI(rs2287047, -976Т>С), IL4(VNTR в 3 интроне), IL6 (rsl800796, -572G>C), ILIO (rs1800872, -6270A), a-TNF (rsl800629, -308G>A)) и биотрансфорации ксенобиотиков (CYP1A1 (rs!048943, 4889A>G¿ CYP2E1 Ins 96 bp., EPHX1 (ra 1051740, 337T>C и rs2234922,4156A>G); NQOl (rs1800566, 6090T; rsl 131341, 4650T)) у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией.

5. Проанализировать распределение частот сочетаний генотипов и оценить роль межгенных взаимодействий полиморфных локусов в изученных генах.

6. Выявить особенности функционирования генов цитокинового ряда и биотрансформации ксенобиотиков у онкологических больных, носителей «рисковых» аллелей в гене онкосупрессора ТР53.

Научная новизна исследования. Установлена взаимосвязь полиморфных локусов генов цитокинового профиля с показателями спонтанной продукции цитокинов. Выявлены сочетания генотипов семейства интерлейкин-1, имеющих функциональную и адаптивную значимость. Выявлены межгенные взаимодействия полиморфных локусов в генах (IL-lß (rsll43634), ILlRa (VNTR), IL1RI (rs2287047), влияющие на функционирование генов семейства интерлейкин-1. Показано, что лица, являющиеся носителями сочетаний генотипов семейства интерлейкин-1 (IL-lß (rsl 143634), ILlRa (VNTR), IL1RI (rs2287047): Е1ЕЖПШ, E1E1//I/II/TT, E1E1/MI/CC, E1E2//I/II/TC, более отзывчивы на действие эндогешюго иммуномодулятора, чем индивиды с сочетаниями генотипов Е1Е1//Ш/ТС, E1E1//I/II/TC. Генеалогическим анализом впервые установлено неполное сцепление между генами IL-lß и IL1RA семейства интерлейкин-1, расположенными на 2 хромосоме, генетическое расстояние между которыми составляет 3,3 сМ. Показано, что вследствие кроссинговера образуются новые гаплотипы у потомков. Впервые выявлено что «непротективные» аллели (*Е2/*П/*С) в генах семейства интерлейкина-1 достоверно чаще встречаются у онкологических больных с «рисковыми» аллелями в гене ТР53. Научно-практическая значимость. Основные положения работы включены в лекционный материал к дисциплинам биологического цикла: «Общая генетика», «Биохимия», «Иммунология», «Генетика человека», «Экологическая генетика». Разработан спецкурс «Генетические основы здоровья» и лабораторные практикумы для специальности «Генетика», в рамках которых определяется степень напряженности цитокинового звена иммунитета как прогностического критерия диагностики состояния здоровья студентов. Результаты работы внедрены на кафедре онкологии и хирургии Башкирского государственного медицинского университета и в Республиканском клиническом онкологическом диспансере МЗ РБ при проведении ранней диагностики и организации превентивных мероприятий. В «Центре молекулярио-генетических исследований» кафедры

генетики БГПУ им. М.Акмуллы результаты используются при сравнительном исследовании состояния здоровья студентов и спортсменов. Проводятся совместные мероприятия с кафедрой охраны здоровья и безопасности жизнедеятельности БГПУ им. М.Акмуллы, направленные на развитие осознанного отношения к здоровью и формирование здорового образа жизни молодежи и студентов.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на ежегодных международных конференциях Европейского общества генетиков человека (Амстердам, 2007; Гётеборг, 2010), П Международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), на республиканской молодежной научно-практической конференции «Инновационный потенциал молодежной науки» (Уфа, 2008), V Съезде Вавилонского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС, Москва, 2009), IV Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2009), 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на Дону, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011), на международном Конгрессе нанотехнологий (круглый стол «Нанотехнологии в медицине», (Уфа, 2011); I Международной Школе-конференции молодых учёных «Спорт: медицина, генетика, физиология, биохимия, педагогика, психология и социология» (Уфа, 2011). Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе, 3 в журналах из Перечня ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 143 листах машинописного текста, включает обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 26 рисунками. Список цитируемой литературы включает 247 источников, в том числе - 172 иностранных авторов.

Связь работы с крупными научными программами. Работа поддержана грантами РФФИ «Исследование мобильного генома на примере человека» на 2008-2010 гг.; РГНФ «Молекулярно-генетические и средовые факторы в развитии когнитивных

способностей человека» на 2010-2011 гг.; Грантом Министерства Образования РФ: Тематический план на 2009/2010 и 2010/2011 гг. «Молекулярно-генетическое исследование здоровья и адаптационных возможностей человека»; Грантами БИТУ им. М.Акмуллы по направлению 10.04 «Фундаментальные и прикладные исследования и инновационные образовательные проекты молодых ученых (до 35 лет)». «Изучение нормы реакции организма в зависимости от молекулярно-генетических особенностей и экологических условий среды обитания»; стипендией Президента Республики Башкортостан на 2010-2011 уч. год; Грантом Республики Башкортостан для государственной поддержки молодых ученых и молодежным научным коллективам на 2011 гт. «Технология комплексной оценки состояния здоровья: молекулярно-генетические и физиолого-биохимические аспекты».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. В работе использованы образцы ДНК 1180 человек в возрасте от 18 до 72 лет (медиана 35.57), проживающих в Республике Башкортостан, с их информированного согласия на проведение исследований. Среди них: 1016 здоровых индивидов без отягощенного онкологического анамнеза и 164 онкологических больных, находившихся на стационарном лечении в Республиканском клиническом онкологическом диспансере МЗ Республики Башкортостан. У 88 обследованных обнаружен рак молочной железы (РМЖ), у 76 выявлен рак желудочно-кишечного тракта различной локализации. В исследование включены больные со стадиями, соответственно, клинико-морфологической (TNM) классификации опухолей: TmNojMo- Для выделения ДНК использовали стандартный метод фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984). Анализ изученных полиморфных локусов генов цитокинового профиля и биотрансфорации ксенобиотиков проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на термоциклере (ПЦР) в автоматическом режиме с использованием локус-специфических олигонуклеотидных праймеров.

У здоровых индивидов определяли скорость оседания эритроцитов (СОЭ) по методу Панченкова (Ронин, 1989).

Иммуноферментным методом измеряли концентрацию следующих цитокиноа в сыворотке крови: интерлейкин-1 бета (IL-1P), рецепторного

антогониста интерлейкина-1 (ÍL1RA), интерлейкин-2 (IL2), интерлейкин - 4 (IL4), интерлейкин - 6 (IL-6), интерлейкин - 10 (ILIO), фактор некрЪза опухоли-a (а-TNF), С-реакгивный белок (CRP), с использованием реактивов ЗАО «Вектор-бест» (Новосибирск) у 180 здоровых индивидов и 44 женщин, больных раком молочной железы, стадии T2.3N0-2M0 (сыворотка крови взята до проведения операции по удалению опухоли и через 14 дней после проведения операции). У 28 индивидов проведена стимуляция продукции цитокинов ex vivo посредством митоген-индукции клеток цельной крови, и анализировалась концентрация цитокинов в сыворотке крови после приема иммуномодулятора растительного происхождения «Эхинацея», по схеме 1тх21день.

Проведены генеалогический и генетический анализ наследования аллелей генов семейства интерлейкин-1 и аллелей генов микросомалыгой эпоксидгидролазы-1 и интерлейкина-10 (Курчатов, 2006).

Статистические методы. Математическую обработку полученных данных проводили с использованием критерия Стьюдепта. Различия между параметрами считались статистически достоверными при р<0,05. Для определения статистических параметров использовались программы MS Excel и Statistica 6.0, анализ сцепления 2 LD (Zapata С, 2001), гаплотипный анализ EH (Xiex, 1993). Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) проводили с использованием статистического пакета SPSS (версия 13.0): для сравнения средних значений, сопоставления компонентов дисперсии изучаемой переменной, анализа общей изменчивости переменной, обусловленной различием групп (средних значений), сравнения между собой средних значений каждой выборки и вычисления общего уровня значимости различий (Юнкеров, 2002). При анализе межгенных взаимодействий использовали метод моделирования ген-генных и ген-средовых взаимодействий с помощью непараметрической программы GMDR - Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction (Lou, 2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Иммуиоферментный анализ концентрации цитокинов в сыворотке крови

У обследованных здоровых индивидов (п=180) СОЭ находилась в пределах физиологической нормы, что свидетельствует об отсутствии активного воспалительного процесса на момент забора биологического материала.

При оценке спонтанной продукции цитокилов в группе условно здоровых лиц, проживающих в Республике Башкортостан, выявлены различия по концентрации 1И|3 в сыворотке крови относительно клинической нормы. У части здоровых индивидов выявлено повышение концентраций 1ИР, 1Ь6 и «-ЮТ (табл.1). Причем, высокая концентрация интерлейкнна-ф в сыворотке крови обуславливает высокие уровни других провоспалительных медиаторов - 1Ь6 и а-ЮТ, так как они синергидно участвуют в иммуно-воспалительном ответе (Aggarwal, 1992; Фрсйдлин, 1998).

Анализ содержания основных про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови у больных РМЖ показывает достоверное изменение их уровня по сравнению со здоровыми (табл. 1).

Таблица 1

Показатели цитокинового статуса' у больных РМЖ до операции

и здоровых индивидов

Показатели Больные РМЖ Здоровые Р

п Хтіп Хтах 6 п Хтіп Хтах Х^т 5

1ЫР 44 0,4 8,5 2,5±0,21 1,4 56 0,56 9,97 3,8±0,28 2,1 <0,0001

ІЬІИА 44 101,2 3449,7 1031,43±75,71 502 56 0 767 215±23,8 178 0,01

|Ь2 44 0 6,54 1,26±0,06 0,4 56 0 85,6 9,6*0,6 4,5 <0,0001

1Ь4 44 0 5,51 1,3±0,09 0,6 56 0 6,26 1,8±0,06 0,5 <0,0001

1Ь6 44 0,8 115 25±1,96 13 56 0 8,21 11,3±0,52 3,9 <0,0001

1Ы0 44 0 70 22,8±1,85 12,3 56 0 48 10,3±0,6 4,5 <0,0001

а-ТОТ 44 0 7,5 3,62±0,22 1,5 56 0 7,78 1,86«),09 0,7 <0,0001

СЮ> 44 0,1 1,44 1,2±0,18 0,3 56 0,05 11,09 2,6±0,12 0,9 0,01

--—I—--------'-—-----—■—'--і-1--:-:--і-1—

Примечание: - значение клинической нормы продукции цитокинов приводится в табл. 2

Так, выявлена повышенная продукция 1Ь6 и сниженная а-ЮТ у больных РМЖ. Полученные результаты вполне адекватно согласуются с данными других исследователей (Уаташоїо еі аі, 1995; Сагрі, 2009; Заі^аІеИі еі аі, 2010), показавших ассоциацию этих изменений с ростом и ангиогенезом опухоли.

В послеоперационный период не выявлено динамики концентрации цитокинов в сыворотке крови у больных РМЖ.

2. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров генов со средними значеннями количественных показателей цитокинов (АР^ОУА)

У здоровых индивидов обнаружена ассоциация повышенной концентрации ІЬ-ір с аллелем *Е2 гена И-1р (р=0,001, рис.1) и ассоциация низких значений 1Ь-10 с аллелем ШЛА *1 (р=0,005).

Рис. 1. Ассоциация повышенной концентрации ГЬ- ф с аллелем *Е2 гена /1-7/9

Выявлено также влияние не только соответствующего гена, но и комплекса генов цитокинов близкой или противоположной функциональной направленности на концентрацию цитокинов в сыворотке крови.

3. Анализ наследования аллелей генов, регулирующих цитокиновый каскад

Молекулы гликопротеидов II,-ф, ТЫ ЯЛ, 1ЫМ кодируются генами, локализованными кластерно на хромосоме 2 в локусе я 12-14, что позволяет предположить их сцепленное наследование. Изучение сцепления полиморфных локусов в генах семейства интерлейкин-1 в исследованной выборке практически здоровых индивидов выявило неравновесие по сцеплению. Так, между полиморфными вариантами генов 143634)/1ЫМ (ШТЯ) имеется

значительное сцепление 03-0,99). Коэффициент Б' для генов И-1/} О<*1143634уП]Щп2287047) составил 0,74. Сила сцепления генов 1ЫК4 (тТК)/1ЫШ(г?2287047)

равна 0,46. Итак, полиморфные варианты генов семейства интерлейкин-1, расположенные на одной хромосоме, образуют группу сцепления и совместно передаются потомству, что позволяет проведение гаплотипного анализа для определения типа наследования генов данного семейства. Проанализировано 18 семей, включающих 60 человек. Генеалогический анализ двух семей выявил наличие кроссинговера, при котором меняется комбинация аллелей, приводящая к возникновению новых гаплотипов.

Семья №2 состоит из 6 человек (3 мужчин и 3 женщины). Анализ семьи №2 (рис. 2) начат с анализа третьего поколения. Генотип дочери (111.5) пробанда (П.4) гомозиготен по «протективным» сочетаниям аллелей. Один набор сочетаний аллелей (*Т/*Е1/*Г) унаследован от отца, а другой набор сочетаний аллелей *Т/*Е1/*1 - от матери.

У сына (III. 6) пробанда получение однозначного ответа о типе наследования аллелей от родителей, как в случае с дочерью, невозможно. Если предположить, что аллели *С/*Е1/*П сцепленно унаследованы от отца, то сочетание аллелей *Т/*Е1/*П - от матери. В этом случае, у пробанда (И.4) в профазе мейоза I произошел кроссинговер, и аллели сцепленной группы разобщились и этот кроссоверный участок унаследовал сын. У II.4 возможны 4 варианта сочетания аллелей в гаплотипах: *Т/*Е1/*1, *С/*Е2/*1, *С/*Е2/*П*, Т/*Е1/*П. Последний гаплотип наследуется индивидом III. 6.

Анализ наследования состава гаплотипа, образованного из аллелей генов семейства иитерлейкина-1 в 18 семьях у 60 человек позволяет рассчитать расстояние между генами IL-lß и IL1RA, расположенными на 2 хромосоме. Генетический анализ показывает, что расстояние между ними равняется 3,3 сМ.

В семье №2, помимо ДНК-типироваиия, были определены концентрации цитокинов методом ИФА, в котором измерены спонтанная выработка цитокинов, митоген-индуцированная продукция цитокинов клетками цельной крови и в сыворотке после приема иммуномодулятора растительного происхождения «Эхинацея».

Индивид 11.3 (63 года) - носитель сочетаний генотипов (Е1Е1//1/П//ТС) по полиморфным вариантам генов семейства интерлейкин-1 {11-1$ (гя1143634), ИШа (ШТШ), 1ЫШ (га2287047). Выявлено повышение концентрации интерлейкина-1(3 (Д.-1)3) в сыворотке крови относительно нормы в 3 раза (в норме концентрация не превышает 11 пг/мл, рис.3). В ответ на индукцию митогеном наблюдается прирост цитокина, что говорит о высокой индуцибилыюсти иммунекомпетентных клеток к

Рис. 2. Наследование генов семейства IL-1 в семье №2

секреции IL-1(3. Прием кммуномодулятора не повлиял на концентрацию IL-lf3 в сыворотке крови.

140 Г.........— ............... ..........................................Рис.3. Уровни спонтанной, митоген-

120 4...................................--Т.......................................

100 ! ЙЙ^ т Спонтанная ИНДуЦИрОВаННОИ ПрОДуКЦЙИ ЦИГОКИНЭ

so f.............................|Hpi -..................- IL-lp клетками цельной крови и в

10 ..............................-..................- „ сыворотке после приема

~ индуцированная ИММуПОМОДуЛЯТОра у ИНДИВИДа П.З, —. к Послелт ри ома В пг/мл

и ммук о дулягтор з

E1E1//I/1I//TC

Индивид II.4 (62 года). Носитель сочетаний генотипов (E1E2//I/II//TC) по изученным полиморфным вариантам генов семейства интерлейкин-1 (IL-Ip/1L1RA/1L1IU). Отмечается повышенная концентрация IL-1 (3 в сыворотке крови относительно нормы в 7 раз (рис.4). Митоген-индукция показывает, что у индивида II .4 прирост IL-ip не значителен, что может свидетельствовать о напряжении иммунокомпетентных клеток по выработке данного цитокина, который находится практически на пределе своего максимума.

Прием иммуномодулятора повлиял на выработку IL-ip, снижая его концентрацию до нормы. Исходя из литературных данных, полисахариды, входящие в состав растений рода Echinacea Moench активируют секреторную активность моноцитов человека, повышая продукцию интерлейкинов IL-1, IL6, IL10, a-TNF (Luettig, 1989, Burger, 1997). Исходя из этого, при приеме иммуномодулятора могло произойти изменение баланса IL-ip/ILlRA в сторону большей выработки IL-ip, вследствие чего ингерлейкин-1Р получил возможность связаться с клеточным рецептором и запустить цитокиновый каскад.

120 -г--------------------------------------------------—-----------

,„ I т * Спонтанная „

100 :..........-.....................jmfflp..........................................................................Уровни спонтанной,

§Ш§ митоген-индуцированной

40 : ..................-........— *ММив" продукции цитокина IL-ip

20 \ ^ " ивдуаирянмя» клетками цельной крови и в

г............................ ! к поак прием сыворотке после приема

F1Е 7ММ/ПС иннунодулягора иммуномодулятора у индивида

II.4, в пг/мл

Индивид III.5 (33 года) является носителем сочетаний благоприятных генотипов (E1E1//I/I//TT) по изученным полиморфным вариантам генов семейства интерлейкин-1 (IL - lp/IL 1RA/IL IRI). У индивида III.6 (рис. 5) отмечена физиологическая концентрация IL-ip в сыворотке крови. Митоген-индукция

показала значительный прирост, что позволяет оценить потенциальную способность к секреции данного цитокина как высокую.

Рис.5. Уровни спонтанной, митоген-индуцированной продукции цитокина IL-lß клетками цельной крови и в сыворотке после приема иммуномодулятора у индивида П.4, в пг/мл

Также были проведены генеалогический и генетический анализ наследования аллелей генов микросомальной эпоксидгидролазы-1 и интерлейкина-10, локализованых на 1 хромосоме в бендах lq42 и lq31 -q32 соответственно. Анализ сцепления полиморфных локусов в данных генах показал полное сцепление между полиморфными вариантами EPHXl{rs2234922) и ILIO (rsl800872), где коэффициент D' составил 1, а между ЕРНХ1 (rs!05I740) и ILIO (rs/800872) - D-0,99. В изученных семьях кроссинговер выявлен не был.

4. Анализ сочетаний генотипов по генам семейства IL-1 и их влияние на концентрацию цитокинов в сыворотке крови

Для понимания закономерностей функционирования цитокиновой системы,

в качестве контроля были взяты индивиды, являющиеся носителями «протективных» генотипов E1E1//I/I//TT полиморфных вариантов генов семейства интерлейкин-1 (IL-lß (rsl143634), ILlRa (VNTR), IL1RI (rs2287047). У данных индивидов цитокины и белок острой фазы-С-реактивный белок (CRP) в сыворотке крови находятся в пределе физиологической нормы (табл. 2) и определяют гармоничное функционирование иммунной системы.

Показано, что при ряде других сочетаний генотипов у здоровых индивидов наблюдается повышение концентраций провоспалительных цитокинов (IL-lß, IL6, a-TNF) в сыворотке крови в несколько раз. Например, при сочетании генотипов Е1Е1/Ш//ТС, имеющих два «непротективных» аллеля (высокопродуцирующий аллель IL1RA4I рецепторного антагониста интерлейкина-1 и аллель *С в гене рецептора интерлейкина-1, приводящий к изменениям в конформации белка рецептора) выявлены высокие значения провоспалительных цитокинов в крови (IL-lß, IL6, a-TNF). Значения противовоспалительных цитокинов (IL4, ILIO) были значительно ниже.

Е1Е1//1///ГТ

S? Спонтанная

Митоген-итедзгцир ов анная X После приема иммунодулятора

Таблица 2

Концентрации про- и противовоспалительных цитокинов и беЛка острой фазы -

CRP в сыворотке крови у носителей различных сочетаний генотипов, в пг/мл

А 3 1 Значения в норме, пг/мл EJEl/M/ЛТ Еттиггс E1E2//J/II//TC

и а о н е 6 8 Х±т 5

IL-lß 0-Ц 8,71±2,56 5,73 45,07*6,53 14,58 48,82±9^ 23,79

ILIRA 50-1000 443,72±111,42 248,47 479,82±123 275,69 526,52±93,5 231

IL2 0-10 3,31±1 2,23 6,31 ±2,1 5,52 2,54±0,7 1,78

IL4 0-4 1,16±0,43 0,97 1,08±0,2 0,46 1,16±0,23 0,52

IL6 0-10 1,57*0,47 1,05 343,27±118 286,2 338,13±40,9 91,4

ILIO 0-20 5,86±1,8 4,07 7,97±3,13 7 9,3±1,3 3

a-TNF 0-6 0,89±0,21 0,48 24,8±1^1 2,93 29,25±5,7 17,2

CRP 0-5 1,32±0,8 1,84 0,35±0,1 0,24 1,32±0,3 0,77

У носителей трех «непротекгивных» аллелей E1E2//I/II//TC также отмечается повышение концентраций провоспалительных цитокинов (IL-ip, IL6, a-TNF) в сыворотке крови в несколько раз. Носительство одного или нескольких «непротекгивных» аллелей любого из изученных генов приводит к изменению фоновых концентраций IL-ip и других провоспалительных цитокинов (IL6, а-TNF).

При анализе сочетаний генотипов трех изученных генов семейства интерлейкин-1 {IL-lp (rs1143634), ILIRa (VNTR), IL1R1 (rs2287047) в группе онкологических больных выявлен 21 вариант из 27 возможных, а у здоровых индивидов - 13 сочетаний. В группе онкобольных наблюдается достоверное повышение частоты сочетаний генотипов E1E1//II/II//TC (х2=3,76, р=0,05). А в группе здоровых индивидов частота сочетания «протективных» генотипов E1E1//I/I//TTдостоверна выше (х2=3,43, р=0,06).

5. Продукция цитокинов у практически здоровых людей па фоне стимуляции клеток крови митогеном ex vivo и после приема иммуиомодулятора

Исследование способности лимфоцитов к продукции цитокинов при

митоген-индукции клеток цельной крови ex vivo выявило схожую реакцию

повышения концентрации IL-1J3 у всех обследованных лиц вне зависимости от

генетической конституции (среднее значение -116,74±7,15 пг/мл). Это доказывает,

что у обследуемых индивидов имеется достаточно высокий потенциал

возможности реагирования на воздействие ксенобиотиков и является

положительной характеристикой функционирования иммунной системы, тогда

как, снижение продукции цитокшюв при индукции митогсном ex vivo служит одним из признаков иммунодефицитного состояния (Тотолян, 2000).

Показано, также что носители следующих сочетаний генотипов E1E1//I/I//TT, E1E1//I/II/TT, E1E1//I/II/CC, E1E2//I/II/TC семейства интерлейкин-1 {IL-lß (rsl143634), ILIRa (VNTR), IL1RI (rs2287047)) более отзывчивы на действие эндогенного иммуномодулятора, чем индивиды с сочетаниями генотипов E1E1//I/I//TC, E1E1//I/II/TC.

6. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов иитокиновой системы у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией

При сравнении здоровых индивидов без отягощенного онкологического анамнеза и больными мы не акцентировали внимание на видах рака, его стадии и локализации, так как рассматривали группу лиц с онкопатологией как вариант срыва адаптационного механизма. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу rsll43634 в гене IL-lß выявил достоверное повышение частоты гомозиготного генотипа Е2Е2 (р=0,05, х2=3,81) и аллеля *Е2 (р=0,006, %2=7,65) в ipynne онкоболышх.

При типировании по минисателлиту в гене рецепторного анатагоииста интерлейкина-1 (1L1RA), у онкологических больных достоверно чаще встречается генотип IL-IRA *II/*II с частотой 24,39% (р=0,0005, х2=36,24) и аллель IL-IRA *II с частотой 51,83% (р=0,0005, /2=22,36). Согласно литературным данным, по аллелю IL IRA *II отмечается увеличение продукции ILIRA in vitro и in vivo (Hurme, 1998, Daly, 2002) и кроме этого, наличие аллеля IL1RA *П ассоциируют с повышением продукции IL-lß in vitro (Santtila, 1998). Некоторые авторы рассматривают носительство аллеля IL1RA*II как генетическую детерминанту в развитии онкологических заболеваний, в частности, рака шейки матки (Mustea, Sehouli et al, 2003), рака яичников (Sehouli, Mustea, 2003) и рака молочной железы (Grimm, 2009).

Также выявлены статистически значимые различия между группой здоровых индивидов и онкобольными по полиморфному локусу rsl800796 в промоторной области гена интерлейкина-6 (1L6). Генотип GC встречается достоверно чаще в группе онкобольных (р=0,0005, -/2=30,25). Исходя из литературных данных, носители аллелл *С гена IL6 обладают белее высокой

15

продукцией провоспалительного интерлейкина-6 (Brull et.aL, 2001). В свою очередь, IL-6, являясь мощным ростовым и дифференцировочным фактором В-клеток (Snick, 1990), обладает также и ангиогенным действием«, играет важную роль не только в росте опухолевых клеток при различных онкопатологиях (Kawano et al„ 1988; Yoshizaki, 1989; Hoosein, 1995; Drachenberg, 1999; Capri et al„ 2009), но и усиливает метастазирование опухолевых клеток (Lu, 1997; Телетаева, 2007; Бережная, 2009).

7. Анализ межгеиных взаимодействий Анализ ассоциации отдельных полиморфных вариантов генов, вовлеченных в контроль многофакторных заболеваний, не дает достаточно полного представления о механизмах формировании наследственной предрасположенности. Поэтому было проведено моделирование ген-генных взаимодействий для трех полиморфных локусов в генах семейства IL-1 (IL-lfi (rsl143634), ILIRa (VNTR), IL1R1 (rs2287047) с помощью непараметрической программы GMDR. Обнаружены статистически значимые двух- и трехлокусные модели (рис. 6). В двухлокусной модели (IL-l[j (rsl143634), ILIRa (VNTR)) в группе онкобояьных достоверно чаще встречаются следующие сочетания генотипов: E1E1/II II (х2=Ю,68, р=0,0019); E1E2/II II (Х2=6,72, р=0,01); E2E2/I II 82, p=0,0098j. В трехлокусной модели (IL-1/3 (rsl 143634), ILIRa (VNTR), IL1R1 (rs2287047)) в группе онкобольных выявлено достоверное повышение частоты сочетания генотипов E1E1//II/II//TC (^=6,84, р=0,0097).

......

* -

■г 1

.«..-л i

. ■ „______ -М" лд

IMfrifr-

ШЩ..........яМИиШ жк..........JkMi.........' 12щ......................!...........|

Ш

■повышенный риск ВМ - пониженный риск

Рис. 6. Комбинации генотипов полиморфных локусов генов (1Е-//? (г$1143634), 111Ка (ШТЯ), ПЛИ (гя2287047), 1-й столбик в квадрате - оикобольные, 2-й столбик -группа здоровых индивидов.

Полученные данные свидетельствуют о важной роли генов цитокинового каскада, в частности генов семейства интерлейкин-1, так как именно интерлейкин-1

16

является ключевым цитокином как в регуляции воспалительного проце-сса, так и при пролиферации и апоптозе (Фрейдлин, 1999; Тотолян, 2000).

8. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией

Исследование полиморфных локусов rsl800566 и rsll31341 в гене ЫАО(Р)Н-хиноноксидоредуктазы (NQOl) в выборке онкобольных и контроле показало статистически значимые различия в распределении частот генотипов и аллелей. У здоровых индивидов отмечена повышенная частота гомозиготного генотипа СС (rsl 131341, р=0,001, х2=12,98), тогда как гомозиготный генотип, несущий «непротективные» аллели 7Т(р=0,001, %2= 12,23) встречался достоверно чаще в группе онкобольных. Кроме того, у онкобольных, в сравнении с контролем, отмечено повышение частоты «непротективного» аялеля *Т (р=0,001, %2=12,23). Согласно данным литературы, NQ01 кодирует фермент, метаболизирующий многие ксенобиотики, а также предотвращает образование свободных радикалов, защищая клетку от окислительного стресса (Pérou, 2000; Pineda-Molina, 2001). Носительство аллеля NQO!*T (rsl800566) характеризуется практически полным отсутствием ферментативной активности, а аллеля NQ01*T {rsl 131341) -снижением активности фермента на 25 % (Moran, 1999). В результате снижения ферментативной активности происходит накопление метаболитов, проявляющих себя в качестве аутоантигенов.

Исходя из этого, нами проанализированы сочетания аллелей генов семейства интерлейкин-1 {ll-l¡i {rsl143634), ILIRa (VNTR), IL1RI (rs2287047)) в группе больных РМЖ, являющихся носителями «непротективных» генотипов по полиморфным вариантам {rsl800566; rsl 131341) rem NQOl (рис. 7).

E2E2/1U-12Эй

It в * *ч»г*

\ziEii: arc !4°л

Е1ТЕ2/1 Л'С.С

тлтптсс вгвгишсс

1Ш

У носителей генотипа ТТ У носителей генотттп ТТ

Чл1М0Г>66 } | г*1131341 >

Рис. 7. Распределение частот генотипов по локусам 1Ь-1р (га 1143634), 1ЬШа (УШИ), 1Ь1Ш {г$2287047) у носителей «непротективных» аллелей гена N<201, в %

Таким образом, выявлено, что у оикобольных в генотипе сочетаются

*

«непротективные» аллели не только в гене NQ01, но и в изученных генах семейства интерлейкин-1.

9. Анализ сочетаний генотипов полиморфных локусов в генах семейства интерлейкин-1 и ТР53

В лаборатории молекулярно-генетических исследований кафедры генетики БГПУ им. М.Акмуллы были изучены три полиморфных варианта (rsl042522, rs!625895, Inslôbp) гена-онкосупрессора ТР53 и было показано, что у оикобольных достоверно чаще, чем у здоровых, встречаются «рисковые» аллели гена ТР53, что согласуется с литературными данными (Kinzler, 1996; Weinberg, 1996; Денисов, 2008,2009; Галикеева и соавт., 2009).

В популяциях активность белка р53 в значительной степени модифицирована генетическим полиморфизмом. Наиболее значимыми и хорошо изученными являются три полиморфных варианта (rsl042522, rsl625895, lnslôbp) гена ТР53: точечная замена гуанина на цитозин в 72-м кодоне 4-го экзона (rsl042522, Arg72Pro), в зависимости от того, какой аминокислотный остаток находится в положении 72 полипептидной цепи белка р53, меняется способность р53 запускать апоптоз (Thomas et al., 1999). Белок р53 с остатком Arg в положении 72 более эффективно вызывает индукцию апоптоза, чем белок, содержащий остаток Pro (Dumont et al., 2003; Bourdon, 2005); полиморфный локус в 6-м интроне (rsl625895) и инсерция/делеция 16 п.н. в 3-м интроне изменяют «дозу» гена, таким образом, влияя на активность белка р53 (Whiblcy et al., 2009).

Исходя из этого, мы проанализировали характер распределения частот генотипов трех изученных генов семейства интерлейкин-1 (IL-lfi (rsl143634), ILIRa (VNTR), IL1R1 (rs2287047)) в группе больных РМЖ, являющихся носителями генотипа Pro/Pro гена ТР53 (rsl042522, Arg72Pro). Было обнаружено 7 сочетаний из 27 возможных (рис. 8). На долю сочетания генотипов E1E2//I/II//TC приходилось 25%, сочетания генотипов E1E1//I/II//TC, Е1Е1//ШШС, и E1E2//I/I//TC встречались с частотой 16,6% каждый и с частотой по 9% - сочетания E1E1//I/II//CC, E1E1//II/II//TT и E2E2//H/II//TC.

15

20

0

<ХЩИШУ(.J?

•S gl -""t Гс - ., г

ШТтн-с

xeœzif'hTï'

Рис. 8. Распределение частот сочетаний генотипов IL-lfi/ILlRA/ILlRI у носителей генотипа Pro/Pro по гену ТР53 у онкобольных, в %

Из ipynnbi онкобольных были выделены индивиды, которые являются носителями «рисковых» аллелей по полиморфным локусам (*Pro {rs1042522), *m (rs1625895), *196 (Ins 16bp) гена TP53 (n=164). В группу сравнения вошли здоровые индивиды без онкологического анамнеза, являющиеся носителями нормальных аллелей (*Arg (rsl042522), *w (rsl625895), *I80 {Ins 16bp)) по гену TP53 (n=180). Группа контроля формировалась, таким образом, не случайно, так как доказано, что «рисковые» аллели гена ТР53 обнаруживаются с частотой от 50 до 86% при различных онкопатологиях (Olivier, Hainaut, 2001; Dimitrakakis et al., 2002; Feki, Irminger-Finger, 2004; Olivier, 2004; Petitjean et al., 2007; Brosh, Rotter, 2009; Денисов, 2009).

Анализ распределения частот гаплотипов по аллелям генов IL-lß, IL1RA, IL1RI (рис. 9) в группе практически здоровых индивидов и онкобольных выявил достоверное повышение частоты гаплотипа (р=0,004, у2=8,71), несущего «благоприятные» сочетания аллелей *E1/*I/*T у практически здоровых индивидов. Гаплотип *Е2/*1/*Т, в состав которого входит один аллель с измененной функцией (IL-lß*E2), который ассоциирован с высокой выработкой интерлейкина-1, в группе онкобольных встречается достоверно чаще, чем у здоровых индивидов (р=0,02, %2=4,73). У онкобольных - гаплотип, несущий три «непротективных» аллеля *Е2/*Н/*С встречается достоверно чаще (р=0,0034, Х2=9,14) чем у здоровых индивидов. В наших исследованиях выявлено, что у лиц с данным сочетанием аллелей отмечаются наиболее высокие показатели продукции интерлейкина-lß и антагониста в сыворотке крови. Согласно Hurme M. et al., (1998), подобное соотношение цитокинов может проявлять себя в качестве фактора дифференцировки клеток.

10. Анализ ассоциаций гаплотипов

Рис. 9. Сравнительный анализ распределение частот гаплотипов на основе анализа локусов IL-Iß (rsl 143634), ILlRa (VNTR), IL1RI (rs2287047) в группах онкобольных и здоровых индивидов, в %.

Гены микросомальной эпоксидшдролазы-1 (ЕРНХ1) и интерлейкина-10 (ILIO) локализованы на 1 хромосоме (lq42 и Iq31-q32 соответственно) и наследуются сцеплено. Анализ распределения частот гаплотипов по маркерам (rsl051740 и rs2234922) в гене ЕРНХ1 и (rslS00872) в гене ILIO в группе онкобольных и здоровых индивидов не выявил статистически значимых различий. Гаплотип EPHX1*A/EPHX1*T/IL10*C, несущий все «протективные» аллели с одинаковой частотой встречается в изученных группах. Для оценки роли данного гаплотипа при онкопатологии отобрали больных только гомозиготных носителей по данному гаплотипу. У данных индивидов были проанализированы данные ДНК-типирования по другим изученным полиморфным локусам (системы биотрансформации ксенобиотиков, генов цитокинового каскада). Нами было установлено, что онкобольные являются носителями от 6 до 10 непротеюгивных аллелей в изученных полиморфных локусах (*G - rsl048943;*T - rsl800566, rsl 131341; *E2 - rsl143634; * II-VNTR (IL1RA); *C - rs2287047; *B2 - VNTR (IL4); *A - rsl800629; *m - rsl042522; *Pro - rsl625895)). У всех онкобольных отмечено наличие «непротективных» аллелей сразу в двух полиморфных локусах гена NQOI.

Полученные результаты позволяют говорить о том, что в ряде случаев, иммунологические механизмы в качестве посредников включены в патогенетическую связь между наследственной предрасположенностью к злокачественным новообразованиям и их клинической манифестацией, происходящих вследствие нарушения межклеточных взаимосвязей, регулируемых цитокинами. Показано, что патофизиологическую роль в возникновении и метастазировании опухоли играет высокая продукция рецепторного антагониста интерлейкина-1, и, несомненно, сам рецептор, при мутации в гене которого

изменяется конформяция рецспторного домена и вследствие чего происходит нарушение сигнальной трансдукции интерлейкина-1, что в итоге приводит к нарушению функционирования цнтокиновой регуляторной сети. Эти изменения, в тандеме с носительством «рисковых» аллелей в гене ТР53 и NQ01 могут еще больше усугубить течение заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что у больных РМЖ в до- и послеоперационном периоде достоверно понижено содержание противовоспалительного цитокина IL4 (р<0,0001), достоверно повышен уровень IL1RA (р=0,01) и IL6 (р<0,000!) в сыворотке крови. •

2. Обнаружено полное сцепление между генами IL-lß и 1L1RI, расположенными на длинном плече второй хромосомы. Сцепление межу генами IL1RA и IL-lß нарушается кроссипговером и генетическое расстояние между ними составляет 3,3cM.

3. На основании сравнительного анализа спонтанной продукции цитокинов в сыворотке крови показано, что нормальный цитокиновый профиль наблюдается только у гомозигот Е1Е1//1/1//ТТпо аллелям генов семейства интерлейкина 1: IL-Jß {rsl143634), ILlRa (VNTR 2 нитрона), IL1RI (rs2287047).

4. Установлена высокая иммуномодулирующая эффективность препарата «Эхинацея» для носителей следующих сочетаний аллелей генов семейства интерлейкин-1 (IL-lß (rsll43634), ILlRa (VNTR), lL]RI(rs2287047))-EIE 1//I/1//TT, E1E1//I/II/TT, E1E1//I/II/CC, E1E2//I/II/TC.

5. Выявлено две модели межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов семейства интерлейкина-1: двухлокусная {IL-lß (rsll43634)/IL!Ra (VNTR) -El El/II II (p=0,0019), E1E2/II II (p=0,01J, E2E2/I П (p=0,0098) и трехлокусная -{IL-1 ß{rsll43634)/ILlRa(VNTR)/ILlRI{rs2287047) -E1E1//II/II//TC (p=0,0097).

6. Установлено, что у онкобольных сочетаются в генотипе от 6 до 10 (*G -rsl048943;*T - rsl800566, rsll31341; *E2 - rsll43634; *II-VNTR (IL1RA); *C -rs2287047; *B2 - VNTR (IL4); *A - rsl800629; *m - rsl042522; *Pro - rsl625895)) «непротективных» аллелей в генах цнтокинового каскада и биотрансформации ксенобиотиков, в том числе, у всех онкобольных встречаются «непротективные» аллели сразу по двум полиморфным локусам в гене NQ01.

7. Выявлено, что гомозиготные генотипы по «протективным» аллелям

-*Е1/*1/*Тгенов семейства интерлейкин-l: IL-lß (rsl143634), ILlRa (VNTR), IL1RI

(rs2287047) встречаются только у здоровых индивидов с «протективными»

21

аллелями (*Arg (rsl042522% (rsi625895), *180 (Ins I6bp)) а гене TP53.

\

Сочетание «непротекгивных» аллелей (*E2/*II/*C) в генах семейства интерлейкина-1 достоверно чаще (р=0,0034) встречаются у онкологических больных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Анализ пяти полиморфных локусов трех генов системы биотрансформации ксенобиотиков (СУР2Е1, ЕРНХ1, NQ01) в республике Башкортостан // Вестник ОГУ. Т. 3. 2009. С. 429-431.

2. Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Каюмова Л.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Анализ полиморфных вариантов генов биотрансформации ксенобиотиков GSTM1 и ТР53 у больных раком молочной железы // Вестник ОГУ. Т.4.2009. С.659-661.

3. Васильева Э.М., Гумерова Г.Р., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Генетический мониторинг населения: изучение полиморфных вариантов генов цитохромоксидазной системы и цитокинового комплекса // Аграрная Россия. 2009. Специальный выпуск. С-118.

4. Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование полиморфных вариантов генов цитохромоксидазной системы и генов цитокинового комплекса в Республике Башкортостан // Материалы съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров). Т. 2. Москва: 2009. С. 151.

5. Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Гумерова Г.Р., Каюмова Л.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование распределения частот генотипов и аллелей гена-супрессора опухолевого роста ТР53 в Республике Башкортостан // Материалы съезда генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров). Т. 2. Москва: 2009. С. 156.

6. Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Тимкова A.B., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование распределения частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов гена - онкосупрессора ТР53 И Материалы Международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов». 2009. с. 61-63.

7. Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование полиморфных вариантов генов, участвующих в инактиваций ксенобиотиков // Труды Всероссийской конференции, посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им.М.Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем». 2009. с. 159-165.

8. Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Каюмова Л.Р., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Изучение генетических маркеров устойчивости к генотоксическим эффектам среды обитания человека // Современный

педагогический универсшет как центр интеграции науки и образования. Материалы внутривузовской научно-практической конференции, проводимой в рамках Дней науки БГПУ им.М.Акмуллы.2009. С.25-28.

9. Васильева Э.М., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Молекулярло-генетическое изучение маркеров чувствительности организма человека к генотоксическим факторам среды // Материалы Международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов». Уфа. 2009. с. 49-52.

10. Галикеева Г. Ф., Васильева Э.М., Николаев И.В., Кильдиярова И.Ф., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Анализ полиморфных вариантов гена ТР53 в группах лиц, проживающих в условиях с различной экологической нагрузкой // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования». Уфа. 2010. С. 157-161

11. Vasilyeva Е. М., Vorobjeva Е. V., Gorbunova V. Y. Molecular genetics study of polymorphic variations in genes within the cascade of reactions detoxifcation of xenobiotics with aromatic structure // European Conference of Human Genetics, Sweden,. 2010. Abst. P.01.11 .P. 45.

12. Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Воробьева E.B., Горбунова В.Ю. Молекулярно-генетическое исследование генов антиоксиданпюй защиты при онкопатологии // Материалы 14 Путинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. 2010. С. 124. П.Васильева Э.М., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Изучение полиморфных локусов в генах системы биотрансформации ксенобиотиков // Медицинская генетика 2010.. Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. С.ЗЗ.

М.Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Имельбаева Э.А., Батретдинова Р.Т., Горбунова В.Ю. Исследование корреляционной зависимости между продукцией цитокинов и генами цитокинового каскада у здоровых индивидов // Материалы II Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Биомика - наука XXI века». Уфа. 2011. С.23-24.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

РМЖ рак молочной железы IL4 интерлейкин-4

CYP1A1 цитохром Р-450 1А1 IL6 интерлейкин-б

CYP2E1 цитохром Р-450 2Е1 IL10 интерлейкин-10

CRP С-реактивный белок NQ01 ЫАО(Р)Н-хиноноксидоредуктаза-1

ЕРНХ1 микросомальная VNTR варьирующее число тандемных

IL-ip эпоксидгидролаза-1 повторов

интерлейкин-1 бета a-TNF фактор некроза опухолей альфа

IL1RA антагонист рецептора х2 критерий значимости различий

IL1RI шггерлейкина-1 популяций по распределениям

рецептор интерлейкина-1 первого частот генотипов

IL2 типа Р вероятность

интерлейкин-2 г коэффициент корреляции

Лиц. на издат. деят. Б848421 от 03.11.2000 г. Подписано в печать 24.02. Формат 60X84/16. Компьютерный набор. Гарнитура Times. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. - 2,8. Уч.-изд. л. - 2,6. Тираж 150 экз. Заказ № 345. уРЗД

ИПК БГПУ 450000, г.Уфа, ул. Октябрьской революции, За

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильева, Эльвира Мансуровна, Уфа

61 12-3/795

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный педагогический университет

им. М. Акмуллы»

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА ЭЛЬВИРА МАНСУРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВОЙ СЕТИ И БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ ПРИ ОНКОПАТОЛОГИИ

Специальность 03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.Ю.Горбунова

Уфа 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль цитокинов в регуляции межклеточного гомеостаза 10

1.1.1. Классификация цитокинов иммунной системы: структурно-молекулярная, биофункциональная, рецепторная 12

1.2. Молекулярно-генетические аспекты гуморального и клеточного иммунного ответа 15

1.2.1. Исследование роли генов, кодирующих цитокины противовоспалительного ряда (IL-1, IL6, a-TNF) 18

1.2.2. Исследование роли генов, кодирующих цитокины противовоспалительного ряда (IL4, ILIO) 26

1.3. Определение содержания цитокинов в биологических жидкостях человека как метод оценки иммунного статуса 28

1.4. Молекулярно-генетические и биохимические аспекты изучения системы биотрансформации ксенобиотиков 30

1.4.1. Гены подсемейства СУР1А1 35

1.4.2. Гены подсемейства СУР2Е1 37

1.4.3. Гены микросомальной эпоксидгидролазы-1 39

1.4.4. ]ЧАО(Р)Н-хиноноксидоредуктаза-1 39

1.5. Основные положения генетического механизма иммунного ответа на ксенобиотики 42

1.6. Влияние иммунокорегирующих препаратов на показатели иммунного статуса 43

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Объект исследования 46

2.2. Материалы исследования 46

2.3. Методы исследования

2.3.1. Генетические методы 49

2.3.1.1. Семейный анализ 50

2.3.2. Молекулярные методы

2.3.2.1. Выделение геномной ДНК методом фенольно-хлорофомной экстракции 51

2.3.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 51

2.3.2.3. Электрофорез в полиакриламидном геле 51

2.3.2.4. ПДРФ-анализ 56

2.3.3. Определение продукции цитокинов клетками цельной крови ех vivo и на фоне приема иммуномодулятора in vivo 57

2.3.4. Определение концентрации цитокинов в сыворотке крови иммуноферментным методом 58

2.3.4.1. Определение содержания IL-lß, IL6, ILIO и a-TNF 58

2.3.4.2 Определение содержания IL1RA 60

2.3.4.3 Определение содержания IL2, IL4 61

2.3.5. Методы лабораторных исследований 62

2.3.5.1. Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ). Метод Панченкова 63

2.5. Методы статистического анализа результатов исследования 64

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Определение концентрации цитокинов в сыворотке крови иммуноферментным методом 66

3.1.1. Корреляционные взаимосвязи между показателями цитокинов у здоровых индивидов и онкологических больных 71

3.1.2. Анализ корреляционной взаимосвязи между продукцией цитокинов и аллельным состоянием полиморфных маркеров генов цитокинового каскада у здоровых индивидов 73

3.2. Анализ наследование аллелей генов, регулирующих цитокиновый каскад. Семейный анализ 76

3.3. Анализ сочетаний генотипов генов семейства /1-7 и их влияния на концентрацию цитокинов в сыворотке крови 84

3.4. Анализ продукции цитокинов у практически здоровых людей в сыворотке крови на фоне стимуляции клеток крови митогеном и после приема иммуномодулятора 86

3.5. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов цитокиновой системы у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией 89

3.6. Исследование роли межгенных взаимодействий 93

3.7. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией 95

3.7.1. Анализ сочетаний генотипов полиморфных локусов в генах семейства интерлейкин-1 с геном биотрансформации ксенобиотиков НАБ(Р)Н-хиноноксидоредуктаза-1 у онкобольных 104

3.8. Анализ сочетаний генотипов полиморфных локусов в генах семейства интерлейкин-1 и гене клеточного цикла TP53 107

3.8.1. Анализ ассоциаций гаплотипов 112

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 117

ВЫВОДЫ 118

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 120

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИИ

РМЖ

CYP1A1

CYP2E1

CRP

ЕРНХ1

IL-1J3

IL IRA

IL1RI

IL2

IL4

IL6

IL10

NQOl

VNTR

a-TNF

x2

P r

- рак молочной железы

- цитохром Р-450 1А1

- цитохром Р-450 2Е1

- С-реактивный белок

- микросомальная эпоксидгидролаза-1

- интерлейкин-1 бета

- антагонист рецептора интерлейкина-1

- рецептор интерлейкина-1 первого типа

- интерлейкин-2

- интерлейкин-4

- интерлейкин-6

- интерлейкин-10

- МАБ(Р)Н-хиноноксидоредуктаза-1

- (variable number tandem repeats) - варьирующее число тандемных повторов

- фактор некроза опухолей альфа

- критерий значимости различий популяций по распределениям частот генотипов

- вероятность

- коэффициент корреляции

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Цитокиновая система относится к

центральным регуляторам гомеостаза, так как обладает широким спектром

биологических эффектов (Симбирцев, 2008; Баранов, 2010). Одной из

важнейших функций цитокинов является обеспечение согласованного

действия иммунной, эндокринной и нервной систем (Mosmann, 1986;

Belardelli, 1999), при котором происходит модуляция как локальных, так и

глобальных механизмов защиты. Образование и высвобождение этих

высокоактивных молекул жестко регулируется генетическими механизмами

(Симбирцев, 2002; Сенников, 2004). Генетически детерминированная

дисрегуляция цитокинов ведет к инициации не только хронических

воспалительных процессов, но и к генерализированным нарушениям.

Показано, что дисбаланс в продукции белков семейства IL-1 (IL-

lß/ILl RA/IL 1RI) влияет на характер протекания воспалительных

заболеваний и является одним из пусковых механизмов патологических

процессов (Громова, Симбирцев, 2005). В последние десятилетия активно

изучается роль цитокинов в регуляции состояний, связанных с развитием

иммунопатологии: острых и хронических воспалительных процессов

инфекционной природы, аутоиммунных реакций и различных проявлений

аллергии (Карунас, Хуснутдинова, 2007). Особый интерес вызывает вопрос о

влиянии цитокинов на процесс неопластической трансформации клеток.

Имеется достаточно подтверждений тому, что хроническое воспаление

является фактором риска развития опухоли, ее прогрессирования и

метастазирования (Coussens, 2002; Tan, 2007; Porta, 2007; Lee et al., 2008;

Fidler, 2008; Mantovani, 2008). Согласно современным исследованиям,

наиболее перспективными в качестве маркеров опухолевого роста и

прогностических факторов при злокачественных новообразованиях являются

такие цитокины, как IL-lß, IL-2, IL-4, IL-6, a-TNF и др. Для ряда

онкологических заболеваний показана взаимосвязь между концентрацией

цитокинов в сыворотке крови и агрессивностью течения, метастатическим

5

потенциалом и риском развития рецидивов (Sivaparvathi et al., 1995; Glas et al., 2004).

На функционирование системы цитокинов могут влиять ксенобиотики, образующие реактивные метаболиты в ходе биотрансформации, которые могут выступать в роли аутоантигенов, вызывающих клеточный или гуморальный иммунный ответ (Ляхович и др., 2000).

В настоящее время, для определения степени напряженности регуляторных механизмов иммунного ответа в клинической практике проводится оценка концентрации цитокинов в сыворотке крови, что лишь констатирует сам факт её повышения или понижения у данного индивида, без учета его генетической конституции. В связи с этим, возрастает необходимость исследования индивидуального генетического профиля, соответствующего его иммунному статусу, что определит направление превентивной и предиктивной корректировки образа жизни каждого человека. Поэтому имеется настоятельная необходимость изучения функционирования полиморфных вариантов генов цитокинового каскада не только семейства интерлеикина-1, но и других цитокинов про- и противовоспалительного ряда, а также генов, регулирующих систему биотрансформации ксенобиотиков в норме и при патологических состояниях.

Цель настоящего исследования заключается в комплексном анализе содержания цитокинов в сыворотке крови при различных сочетаниях аллелей генов цитокинового каскада и системы биотрансформации ксенобиотиков в норме и онкопатологии.

Задачи исследования.

1. Изучить содержание цитокинов IL-ip, IL IRA, IL2, IL4, IL-6, IL 10, a-TNF и CRP в сыворотке крови y здоровых индивидов и онкобольных.

2. Провести генетический анализ наследования аллелей генов семейства интерлейкин-1, локализованных на 2 хромосоме и аллелей генов микросомальной эпоксидгидролазы-1 и интерлейкина-10, локализованных на хромосоме 1.

3. Изучить динамику изменения показателей цитокинового профиля при активации клеток цельной крови митогеном ex vivo и действии иммуномодулятора растительного происхождения «Эхинацея» у здоровых индивидов с различной генетической конституцией.

4. Проанализировать распределение полиморфных вариантов генов цитокинового профиля (IL-lß (rs1143634, 39530Т), IL1RA(VNTR во 2 интроне), IL1R1 (rs2287047, -976Т>С), IL4{VNTR в 3 интроне), IL6 (rs 1800796, -572G>C), ILIO 0rsl800872, -6270А), a-TNF (;1800629, -308G>A)) и биотрансфорации ксенобиотиков (CYP1A1 (rsl048943, 4889A>GJ, CYP2E1 Ins 96 bp., EPHX1 (rs1051740, 337T>C и rs2234922, 4156A>G); NQOl (rs1800566, 6090T; rs1131341, 465C>T)) у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией.

5. Проанализировать распределение частот сочетаний генотипов и оценить роль межгенных взаимодействий полиморфных локусов в изученных генах.

6. Выявить особенности функционирования генов цитокинового ряда и биотрансформации ксенобиотиков у онкологических больных, носителей «рисковых» аллелей в гене онкосупрессора ТР53.

Научная новизна исследования. Установлена взаимосвязь

полиморфных локусов генов цитокинового профиля с показателями

спонтанной продукции цитокинов. Выявлены сочетания генотипов семейства

интерлейкин-1, имеющих функциональную и адаптивную значимость.

Выявлены межгенные взаимодействия полиморфных локусов в генах (IL-lß

(rs1143634), ILIRa (VNTR), IL1RI (rs2287047), влияющие на

функционирование генов семейства интерлейкин-1. Показано, что лица,

являющиеся носителями сочетаний генотипов семейства интерлейкин-1 (IL-

lß (rsl 143634), ILIRa (VNTR), IL1RI (rs2287047): E1E1//I/I//TT, E1E1//I/II/TT,

E1E1//I/II/CC, E1E2//I/II/TC, более отзывчивы на действие эндогенного

иммуномодулятора, чем индивиды с сочетаниями генотипов E1E1//I/I//TC,

E1E1//I/II/TC. Генеалогическим анализом впервые установлено неполное

7

сцепление между генами 1Ь-1/5 и 1ЫЯА семейства интерлейкин-1, расположенными на 2 хромосоме, генетическое расстояние между которыми составляет 3,3 сМ. Показано, что вследствие кроссинговера образуются новые гаплотипы у потомков. Впервые выявлено что «непротективные» аллели (*Е2/*П/*С) в генах семейства интерлейкина-1 достоверно чаще встречаются у онкологических больных с «рисковыми» аллелями в гене ТР53.

Научно-практическая значимость. Основные положения работы включены в лекционный материал к дисциплинам биологического цикла: «Общая генетика», «Биохимия», «Иммунология», «Генетика человека», «Экологическая генетика». Разработан спецкурс «Генетические основы здоровья» и лабораторные практикумы для специальности «Генетика», в рамках которых определяется степень напряженности цитокинового звена иммунитета как прогностического критерия диагностики состояния здоровья студентов. Результаты работы внедрены на кафедре онкологии и хирургии Башкирского государственного медицинского университета и в Республиканском клиническом онкологическом диспансере Министерства здравоохранения Республики Башкортостан при проведении ранней диагностики и организации превентивных мероприятий. В «Центре молекулярно-генетических исследований» кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы результаты используются при сравнительном исследовании состояния здоровья студентов и спортсменов. Проводятся совместные мероприятия с кафедрой охраны здоровья и безопасности жизнедеятельности БГПУ им. М. Акмуллы, направленные на развитие осознанного отношения к здоровью и формирование здорового образа жизни молодежи и студентов.

Благодарности

Работа выполнена в центре молекулярно-генетических исследований кафедры генетики при Башкирском государственном педагогическом университете им. М. Акмуллы.

Выражаю свое глубочайшее уважение и признательность научному руководителю д-ру биол. наук, проф. Горбуновой Валентине Юрьевне за неоценимую помощь в организации исследования и интерпретации результатов. Заведующему кафедрой генетики БГПУ им. М. Акмуллы, д-ру биол. наук, проф. Вахитову Венеру Абсаттаровичу за поддержку и ценные рекомендации. Заведующему бактериологической лаборатории ГКБ № 22 г. Уфы Батретдиновой Рамиле Талгатовне и д-ру биол. наук, проф. Имельбаевой Эльвире Аркамовне за помощь в проведении иммуноферментного анализа. Сотрудникам кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы Воробьевой Е.В., Галикеевой Г.Ф., Гумеровой О.В. за участие в обсуждении результатов и помощь в оформлении работы. Отдельная благодарность моей семье за понимание и терпение.

ГЛАВА 1. ОБЗОР НАУЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль цитокинов в регуляции межклеточного гомеостаза

На сегодняшний день известно, что межклеточные взаимодействия играют ключевую роль в регуляции клеточного гомеостаза и определяют направление пролиферации и дифференцировки, а также осуществление многих эффекторных клеточных функций (Иванов, 2005). Регуляция этих процессов осуществляется путем прямых и обратных связей при участии различных дистантных и локальных механизмов, результатом реализации которых является модификация функциональной активности различных типов клеток (Ярилин, 1999). Существенную роль в становлении и стабилизации контактов между взаимодействующими клетками принадлежит цитокиновой сети (Симбирцев, 2002).

В настоящее время сформированы и теоретически обоснованы принципы ее функционирования, согласно которым цитокины представляют собой универсальную полиморфную регуляторную сеть медиаторов, предназначенных для контроля процессов клеточного гомеостаза кроветворной, иммунной и других систем организма (Иванов, 2005; Сенников, 2004). Для ее правильного функционирования необходимо строгое соблюдение баланса как самих цитокинов, так и их рецепторов, содержание которых подвергается существенным изменениям в зависимости от состояния участвующих во взаимодействиях клеток.

Важно отметить, что экспрессия генов цитокинов является

индуцибельным процессом, т.е. большинство цитокинов не синтезируется

клетками вне воспалительной реакции и иммунного ответа. При

физиологическом состоянии, принятым за норму, спектр детектируемых

мРНК цитокинов узок и уровень экспрессии соответствующих генов

невысок. При повреждении тканей, воспалении, опухолеобразовании и во

многих других физиологических и патологических ситуациях спектр

экспрессирующихся генов цитокинов, обладающих как местной, так и

дистантной активностью, значительно расширяется, а уровень экспрессии

10

генов, обладающих базальной активностью, многократно возрастает (RoseJohn, Schooltink, 2007).

Цитокины синтезируются в ответ на стимуляцию продуцирующих их клеток через короткий промежуток времени. Синтез прекращается в результате действия отрицательных обратных связей, опосредуемых простагландинами, кортикостероидными гормонами и другими факторами, а также за счет механизмов саморегуляции. В основе «выключения» синтеза лежат, как правило, события, ведущие к блокаде транскрипции или/и сокращению времени жизни мРНК. Действие цитокинов инициируется в результате их взаимодействия со специфическими клеточными рецепторными комплексами на поверхностях клеток-мишеней. Количество рецепторов для разных медиаторов значительно варьирует (от 100 до 100 000) (Fischereder, 2007). Рецепторные комплексы связывают свои лиганды-цитокины с очень высокой аффинностью, причем отдельные цитокины способны использовать общие субъединицы рецепторов (Allen et al., 2007; Alves et al., 2007).

Нормальная работа цитокиновой сети во многом базируется на механизмах, лежащих в основе регуляции экспрессии генов цитокинов. Однако эти механизмы изучены далеко не достаточно, что существенно затрудняет понимание закономерностей взаимодействия клеток различных типов, отдельных систем организма и формирования его реакций (Бережная, 2000). Иными словами, многие общие и частные проблемы физиологии, иммунологии и других биологических дисциплин требуют исследования механизмов регуляции экспрессии генов цитокинов. Вместе с тем вызываемые разными причинами нарушения в процессе синтеза цитокинов (гипо- или гиперсинтез, продукция неполноценных форм, нарушения клеточной рецепции и др.) могут быть причиной патологических симптомов и даже причиной заболевания.

1.1.1. Классификация цитокииов иммунной системы:

структурно-молекулярная, биофункциональная, рецепторная

В настоящее время классификация цитокинов в основном проводится по их биологическ