Молекулярно-генетическое исследование генов клеточного цикла (TP53, BRCA1) и системы биотрансформации ксенобиотиков при онкопатологии

Галикеева, Гузель Фанилевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическое исследование генов клеточного цикла (TP53, BRCA1) и системы биотрансформации ксенобиотиков при онкопатологии
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое исследование генов клеточного цикла (TP53, BRCA1) и системы биотрансформации ксенобиотиков при онкопатологии"

На правах рукописи

и«ои43б32 ^

<У

ГАЛИКЕЕВА ГУЗЕЛЬ ФАНИЛЕВНА

/ '

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОВ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА (ТР53,ВЯСА1) И СИСТЕМЫ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ ПРИ ОНКОПАТОЛОГИИ

03.02.07 — генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МАЙ 2012

Уфа-2012

005043632

Работа выполнена в центре молекулярно-генетических исследований при кафедре генетики ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный педагогический университет им. МЛкмуллы»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ким

Александр Иннокентьевич

Бермишева Марина Алексеевна

Ведущая организация:

Горбунова Валентина Юрьевна доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор кафедры генетики Московского государственного университета им. М.В .Ломоносова

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Защита диссертации состоится 29 мая 2012 г. в « if* часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН л

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru/dissov.html,

e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан _

^/¿¿ЛА 2012 г.

Ученый секретарь _ /у Бикбулатова С.М.

диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Основой канцерогенеза, независимо от локализации опухоли, является злокачественная трансформация клетки в результате нарушения клеточного цикла и угнетения апоптоза (Татосян, 2004; Logan et al., 2004). Молекулярный патогенез онкологических заболеваний включает множество генетических и эпигенетических событий, ведущих к активации онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии (Ляхович и др., 2004; Payne, Kemp, 2005; Croce, 2008; Запетаев, 2008; Лихтенштейн, 2009). Одними из ключевых генов-супрессоров опухолевого роста являются гены ТР53 и BRCA1, белковые продукты которых осуществляют реализацию широкого спектра клеточных процессов, регуляцию клеточного цикла, индукцию апоптоза, постоянный надзор за состоянием генома и злокачественной трансформацией клеток (Phillips, 1999; Vousden, Lane, 2007; Когшин, 2008; Желтухин, Чумаков, 2010). Нарушите функциональной активности этих белков может провоцировать генетическую нестабильность, нарушение их транскрипционной, сигнальной и митохондриальной функций (Чумаков, 2007).

В то же время, модифицирующее влияние на функционирование генов онкосупрессоров могут оказывать такие системы, как гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков, ответственные за метаболизм и инактивацию широкого класса эндо- и экзобиотиков, в том числе канцерогенов (Копнин, 2006; Имянитов, Хансон, 2007).

С другой стороны, реализация онкогенеза является результатом совместного действия многих систем организма. В работе R.E. Ellis с соавторами (2002) показано, что при некоторых новообразованиях цитокины способны влиять на рост опухолевых клеток, изменяя экспрессию белков про- и антиапоптотического действия, различных онкогенов и маркеров пролиферативной активности клеток. В частности, нарушение баланса про- и противовоспалительных сывороточных цитокинов способствует развитию патологических процессов, в том числе, злокачественных новообразований (Oppenheim, 1996; Тугуз, 2008; Бережная, 2009).

предрасположенности к онкозаболеваниям, является наиболее перспективным и

актуальным направлением изучения механизмов злокачественной трансформации клетки.

Цель настоящего исследования заключается в анализе взаимодействия различных аллельных состояний генов, регулирующих онкосупрессию, биотрансформацию ксенобиотиков и функционирование цитокиновой системы при онкопатологии.

Задачи исследования:

1. Оценить распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов систем онкосупрессии (rsl042522 (С/С), rsl625895 (G/A), DUPJ6BP гена ТР53; rs80357629 (G/A) и rsl799966 (A/G) гена BRCA1) и биотрансформации ксенобиотиков (large deletion в генах GSTM1 и GS1T1; rs!695 (A/G) гена GSTP1; rs 1001179 (С/Т) гена CAT; rsl800566 (С/Г) и rsl 131341 (С/Т) гена NQOl) у здоровых, а также больных раком молочной железы и индивидов, страдающих злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта.

2. Провести анализ ассоциаций аллельных вариантов генов онкосупрессии (ТР53, BRCA1) с показателями спонтанной продукции цитокинов в сыворотке крови у больных раком молочной железы.

3. Проанализировать распределение частот сочетаний генотипов полиморфных локусов генов (rs80357629 (G/A) и rsl799966 (A/G) гена BRCA1; large deletion в генах GSTM1 и GSTT1; rsl695 (A/G) гена GSTP1; rs 1001179 (С/Т) гена CAT; rsl800566 (С/Г) и rsll31341 (С/Т) гена NQOl) у здоровых индивидов, носителей нормальных аллелей гена ТР53 и больных онкологичекими заболеваниями.

4. Оценить роль межгенных взаимодействий полиморфных локусов генов онкосупрессии и биотрансформации ксенобиотиков в развитии онкопатологии.

5. Провести типирование генов системы онкосупрессии (TP53 и BRCA1) ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови и опухолевой ткани больных раком молочной железы.

6. Провести генетический анализ наследования аллелей генов системы онкосупрессии {TP53 и BRCA1), локализованных на 17 хромосоме.

Научная новизна исследования: впервые обнаружены нуклеотидные замены в генах ТР53 (rsl625895 G/A, DUP16BP) и В RCA! (rs80357629, G/A; rsl799966, A/G), произошедшие в опухолевой ткани у больных раком молочной

железы, причем при реверсии аллеля в опухоли наблюдается мозаицизм в ткани с большим количеством очагов нормальных клеток, что подтверждается гистологическими исследованиями. Установлена взаимосвязь полиморфных локусов генов системы онкосупрессии с показателями спонтанной продукции цитокинов. Выявлен дисбаланс сывороточных цитокинов крови про- и противовоспалительного ряда у больных раком молочной железы. Определены межгенные взаимодействия полиморфных локусов в генах ВЕСА1 (гз80357629, С/А; к¡799966, А/в), в5ТР1 (к1695, А/С), N(¿01 (к 1800566, С/Г; 131341, С/Т), являющихся рисковыми в отношении онкопатологии: у больных со злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта - это сочетание генотипов СА1ЛС/ЛС1СС/СТ, а у больных раком молочной железы -СА/Ав/АС/СС/СТ и СА/АА/АС/СС/СГ по полиморфным локусам пЯОЗ57629 (С/А), ВЯСА1 / п1799966 (А/О, ВЯСА1 / к 1695 (А/С), СБТР1 / п1800566 (С/Т), N001 / 131341 (С/Г), N001, соответственно. При генеалогическом анализе выявлена соматическая мутация в гене ТР53 (п1042522, С/С) у пробанда, которая не идентифицирована ни у ее матери, ни у детей. Установлено, что сочетание генотипов СС/СТ/Ав (г*1800566 (С/Т), N001 / 131341 (С/Г), N001 1 гз1695 (С/Г), СБТР1) является рисковым в отношении возможного развития онкопатологии, даже у носителей протективных гаплотипов аллелей генов ТР53 и ВЯСА1, расположенных на 17 хромосоме.

Научно-практическая значимость. Полученные данные вносят вклад в понимание роли мутаций в генах, определяющих онкогенез и онкосупрессию, мутагенами для которых могут являться продукты неполной эвакуации из организма ксенобиотиков. Это относится к генетическому профилю, приводящему к неэффективной детоксикации ксенобиотиков и цитокинового статуса, включающего в себя более трех-четырех рисковых аллелей. Результаты этой части работы внедрены на кафедре онкологии и хирургии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России при исследовании генетической предрасположенности к развитию возможной онкопатологии. Основные положения работы включены в лекционные курсы дисциплин биологического цикла: общая генетика, биохимия, иммунология, генетика человека, экологическая генетика, генетический контроль клеточного цикла, составляющих учебную программу подготовки специалистов-генетиков и

магистрантов по направлению «Биолог ия», программа «Генетика» на базе ФГБОУ ВГТО «Башкирский государственный педагогический университет им. М.Акмуллы». Материалы диссертации могут быть использованы при проведении лекций для студентов биологических факультетов университетов.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на ежегодной международной конференции Европейского общества генетиков человека (Г'ётеборг, 2010), II Международной школе молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), на республиканской молодежной научно-практической конференции «Инновационный потенциал молодежной науки» (Уфа, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС, Москва, 2009), IV Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2009), 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на Дону, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011), на международном Конгрессе нанотехнологий круглый стол «Нанотехнологии в медицине» (Уфа, 2011), I Международной Школе-конференции молодых учёных «Спорт: медицина, генетика, физиология, биохимия, педагогика, психология и социология» (Уфа, 2011), на Всероссийских молодежных инновационных форумах «Селигер - 2010» и «Селигер - 2011».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе, 3 статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 159 листах машинописного текста, включает обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 29 рисунками. Список цитируемой литературы включает 215 источников.

Связь работы с научными программами. Работа поддержана фантами: РФФИ «Исследование мобильного генома на примере человека и дрозофилы» на 2008-2010 гг.; РГНФ «Молекулярно-генетические и средовые факторы в развитии когнитивных способностей человека» на 2010-2011 гг.; Грантом Министерства образования РФ: Тематический план на 2009/2010, 2010/2011 и 2012/2014 гг.

«Молекулярно-генетическое исследование здоровья и адаптационных возможностей человека»; Грантами БГПУ им. М.Акмуллы: по направлению 10.04 «Фундаментальные и прикладные исследования и инновационные образовательные проекты молодых ученых (до 35 лет)» «Изучение нормы реакции организма в зависимости от молекулярно-генетических особенностей и экологических условий среды обитания» на 2010 г.; по направлению 12.01 Фундаментальные и прикладные исследования в области физико-математических, технических и естественных наук для молодых ученых (до 35 лет) «Молекулярно-генетическое исследование адаптационных механизмов регуляции клеточного цикла при онкопатологии» на 2012 г.; Грантом Республики Башкортостан для государственной поддержки молодых ученых и молодежных научных коллективов «Технология комплексной оценки состояния здоровья: молекулярно-генетические и физиолого-биохимические аспекты» на 2011 г.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования. В работе использованы образцы ДНК 1180 человек в возрасте от 18 до 72 лет (медиана 30.57), проживающих в Республике Башкортостан (РБ). Среди них: 1016 здоровых индивидов без отягощенного онкологического анамнеза и 164 онкологических больных, находившихся на стационарном лечении в Республиканском клиническом онкологическом диспансере МЗ РБ., из них, 88 обследованным поставлен диагноз - рак молочной железы (РМЖ), у 76 выявлены злокачественные новообразования желудочно-кишечного тракта. В исследование включены индивиды с различными стадиями заболевания, соответствующих по клинико-морфологической (TNM) классификации опухолей: T1-3N0.2M0.1. У 15-ти женщин из числа больных РМЖ проведено исследование образцов ДНК опухолевой ткани.

Методы исследования. Выделение ДНК из цельной венозной крови

проводили стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew,

1984). Выделение ДНК из опухолевой ткани проводили с использованием наборов

фирмы «Fermentas». Генотипирование полиморфных локусов исследуемых генов

проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) и

рестрикционным анализом с последующим электрофорезом фрагментов ДНК в 7%

полиакриламидном геле. Окрашивание гелей проводили раствором этидия

бромида (1%), последующую визуализацию с помощью видеогель-

документирующей системы (Gel Imager). Концентрацию цитокпнов в сыворотке крови здоровых индивидов и больных раком молочной железы (стадии T1.3N0.2M0) измеряли иммуноферментным методом с использованием реактивов ЗАО «Вектор-бест» (Новосибирск). Сыворотка крови взята до проведения операции по удалению опухоли и через 14 дней после проведения операции. Проведены генеалогический и генетический анализ наследования аллелей генов онкосупрессоров ТР53 и BRCA1 (Курчанов, 2006). Общая схема эксперимента представлена на рис. 1.

¡Лааляз распределения i частот геввтштов я i аллелен

Анализ г&плотвнгав

Агалю зг(жген1ых взя вмод еЁствааг

Гр?1ша сравнения, n-lSÜ (восвтелн вормадъиых аллелей гена TPS2}

О преледЕнве ко етгвграпян 8 октакнков (в сыворотке igjoss методом И ФА

Злтродые

HtpOJKTBtHHUf

Оккободьвые. п »1«

Больяые

расэамЖЬГЦ

11SÖ B&3HBKIDB(OO 11 ооляморфвым ^)KJtSM

Авали* ассо ива пая ко ггаевтрапжи ивтокквовс sxiKnuBitB» TPS3 BBHCÍÍ

Анализ наследования аиаелш генов TPÍ3 rERCAÍ IS с^.чен» STOM cncti ялкюшвх оро^явзов с овкояато ло гюгчярэолнтеон лоиалнэзцнв

Больные PACRn=8S

Опрелелекве швшпршв

SSBTOEKRSKB сыворотке кроев

методом К ФА* в=44

Анадн» рлслрелелекиг частот ГВВЭТВВОВ Я

аллелея в о одолевай ткввв,п=1£

До бперяпял п=44 Через 14 двев после сверзшш, и=44

Англез гаплотшго в, о врел слеше тняа на ел ел овакня

Авздв«сишшш ко «венгра тга него ютов t аллелям« генов TPJ3 wBRCAl

Рис. 1, Схема эксперимента

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием критерия Стьюдента. Различия между параметрами считались статистически достоверными при р<0,05. Для определения статистических параметров использовались программы MS Excel и Statistica 6.0, анализ сцепления проводили с использованием программы 2 LD (Zapata С, 2001), гаплотигшческий анализ - с помощью программы EH (Xiex, 1993). Однофакториый дисперсионный анализ (ANOVA) проводили с использованием статистического пакета SPSS (версия 13.0) (Юнкеров, 2002). При анализе межгенных взаимодействий использовали метод моделирования ген-генных и ген-средовых взаимодействий с

помощью непараметрической программы M DR - Multifactor-Dimensionality Reduction (Lou, 2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфных локусов исследуемых генов у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией ТР53. Поскольку, сравнительный анализ распределения частот генотипов и аллелей гена ТР53 (rsl042522, G/C; rsl625895, G/A; DUPlôbp) не показал достоверных различий между группами больных РМЖ и раком ЖКТ, они составили одну группу - онкобольные (п=164).

Анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу rsl042522 (G/C) в гене ТР53 выявил достоверное повышение частоты гетерозиготного генотипа GC в группе здоровых индивидов (р=0,005, Х2=8,30), а в группе онкобольных достоверно чаще встречался гомозиготный генотип GG (р=0,023, х2=5,22). Согласно литературным данным, аллель *G кодирует белок с меньшей антистрессовой активностью (Campisi, 2003).

В распределении частот генотипов и аллелей по полиморфному локусу DUP16BP гена ТР53 у здоровых индивидов и онкобольных достоверных различий обнаружено не было (рис. 2).

Рис. 2. Распределение частот генотипов и аллелей по полиморфным локусам гена ТР53 у онкобольных с различной локализацией опухоли и здоровых индивидов

При анализе распределения частот генотипов и аллелей nov полиморфному локусу rs1625895 (G/A) в гене TP53 выявлено, что генотипы wm и mm, а также аллель *т достоверно чаще встречались в группе онкобольных (р=0,0005, Х?=Ю0,03; р=0,0014, %2=11,59; р=0,0005, '£'=95,49 соответственно). Тогда как, в группе здоровых индивидов преобладал генотип ww и аллель *w (р=0,0005, Х'= 1 ! 7,36; р=0,0005, %2-95,49 соответственно). По мнению Wu et al. (2002). полиморфные варианты (rs1625895 (G/A), DUP16BP) в интронных последовательностях гена ТР53 приводят к снижению эффективности экспрессии гена и, как следствие, к снижению и апоптотического индекса ДНК.

Группа сравнения для анализа распределения частот генотипов и аллелей генов BRCA1 (rs803357629, G/A; rsl799966, A/G), GSTMl(large deletion), GSttl (large deletion), GSTP1 (rsl695, A/G), CAT (rs 1001179, С/Г), NQOl (rsl800566, C/T; rs!131341, С/Т) была сформирована из числа здоровых индивидов без семейного онкологического анамнеза и только носителей «нормальных» аллелей гена ТР53 (п=180).

BRCA1. Сравнительный анализ распределения изученных полиморфных локусов (rs803357629, G/A; rsl799966, A/G) в гене BRCA1 у больных с расположением опухоли в разных органах, показал при РМЖ наличие достоверно высок!« значений частот генотипов GA (rs80357629, G/A) и GG (rsl799966, A/G), имеющих аллели с нуклеотидной заменой (рис. 3).

Рис. 3. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных локусов гена ВЯСА1 у онкобольных с различной локализацией опухоли и здоровых индивидов

s 3 а ( м ) с 'g

шагает

1рк

8бо,«е?Ш

ВййышршШ

Выявлено достоверное повышение частоты гомозиготного генотипа GG и аллеля *С в группе здоровых индивидов по сравнению с общей группой онкобольных (р-0,0(Х)5, %2--49,40; р=0,0005, /и2=66,10 соответственно) по полиморфному локусу rs803357629 (G/A) в гене BRCA1. Гомозиготный генотип ЛЛ выявлен только у онкобольных с частотой 32+4% (р=0,0005, х2=66,31 ).

Анализ распределе1шя частот генотипов и аллелей по полиморфному локусу rs1799966 (A/G) в гене BRCA1 выявил достоверно значимые различия между больными и здоровыми индивидами. Так, гомозиготный генотип GG и аллель *G достоверно чаще встречались в группе онкобольных (р=0,0005, х3=96,48; р=0,0005, %2=98,14 соответственно). Тогда как, в группе здоровых индивидов преобладали генотипы АА и AG, а также аллель *А (р-0,0005, х2=75,46; р=0,006, х2=7,85; р=0,0005, х2=98,14 соответственно).

Таким образом, оба полиморфных локуса в гене BRCA1 (rs803357629, G/A; rsl 799966, A/G) могут приводить к злокачественному перерождению клеток в любых тканях, что дает возможность объединить всех онкобольных для проведения сравнительного анализа по данному гену с контрольной выборкой. Это объясняется тем, что продукт гена BRCA1 участвует в регуляции клеточного цикла, нарушение которого приводит к трансформации клетки.

GSTP1. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу rs!695 (A/G) в гене GSTP1 выявил достоверно высокие частоты гомозиготного генотипа GG (р=0,009, %2=6,96) и гетерозиготного генотипа AG (р=0,02, Х2~5>14), а также аллеля *G (р=0,0005, х2=18,36) в группе больных РМЖ. В группе здоровых индивидов гомозиготный генотип АЛ встречался с частотой 39%, а аллель *Л с частотой 65%, что достоверно выше, чем в группе больных РМЖ (р=0,0005, х2=19,96; р=0,0005, х2=18,36 соответственно).

NQOJ. Анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфному локусу гена NQOl (rsl!31341, С/Г) показал достоверные различия между группой здоровых индивидов и больных РМЖ: у здоровых индивидов чаще детектируется гомозиготный генотип СС (р=0,003, х2=9,62) и аллель *С (р=0,006, х2=7,86). У больных - достоверно высокая частота генотипов СТ и 7Т (р=0,009, х2=6,90; р=0,005, х2=8,37 соответственно), а также аллеля *Г(р=0,0008, х2= 14,37).

В распределении частот генотипов и аллелей по полиморфным локусам rs1800566 (С/Т) гена NQOl, rs 1001179 (С/Т) гена CAT, large deletion в генах GSTM1 и GSTT1 у здоровых индивидов и онкобольных достоверных различий не обнаружено.

Таким образом, нарушение работы системы онкосупрессии играет ключевую роль в развитии онкопатологии независимо от локализации опухоли. 3 свою очередь, сбои в системе биотрансформации ксенобиотиков оказывают существенное влияние на развитие РМЖ.

2. Анализ наследования аллелей генов системы онкосупрессии (ТР53, BRCA1)

Белки онкосупрессоры р53 и BRCA1 кодируются генами, локализованными на разных плечах хромосомы 17 (17р13.1 и 17q21 соответственно). Согласно National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov), физическое расстояние между генами составляет 33505449 п.н., что соответствует 33,5 Mb или 33,5 сМ.

Анализ сцепления полиморфных локусов в генах ТР53 (rsl625895, rsl042522, DUP 1бЬр) и BRCA1 (rs80357629rsl799966) выявил высокое сцепление между полиморфными вариантами генов ТР53 (rsl625895) и BRCA1 Сrs80357629) (D'=0,99). Между локусами ТР53 (rsl042522) и BRCA1 (rs80357629) D'-коэффициент составил 0,64. Также определено слабое сцепление между локусами ТР53( rsl625895)/BRCAl(rs1799966) и TP53(DUP

16bp)/BRCAl(rsl799966), D'-коэффициент которых составил 0,35 и 0,34 соответственно. В группе онкобольных выявлено незначительное сцепление между локусами TP53(rsl042522)/BRCAl(rs80357629), TP53(rsl625895У BRCAl(rs1799966) и TP53(DUP16bp)/BRCAI(rsl799966).

Гаплотипический анализ показал, что в группе здоровых индивидов достоверно чаще встречается гаплотип *G/*w/*D/*G (р=0,0005, х2=133,41), сочетающий только протективные аллели. У онкобольных выявлены гаплотипы *G/*m/*D/*G, *C/*w/*D/*A и *C/*m/*D/*A (rsl042522, ТР53 / rsl625895, TP53 / DUP 16BP, TP53 / rs80357629, BRCA1 соответственно;, которые в группе сравнения не обнаружены (рис. 4).

«й ,«. ,9

а А тн»

у? свШК

«5 п/Ш}}1

Рис. 4.

Распределение частот гаплотипов аллелей генов ТР53, ВНСА1 №80357629) у здоровых индивидов и онкобольных, в %

У носителей протективного гаплотипа *С/*ы/*0/*С проведен анализ распределения частот сочетаний генотипов полиморфных локусов генов N001 («1800566, С/Г; п1131341, С/Г) и С5ГР/ (га1695, А/О. Обнаружено, что у онкобольных достоверно чаще встречается сочетание генотипов СС/СТ/АС (р=0,006, /2=7,73), включающее два рисковых аллеля в полиморфных локусах этих двух генов (рис.5). У здоровых индивидов чаще выявляется сочетание генотипов СТ/СС/АА (к1800566 (С/Т) / п1131341 (С/Т) гена N001 / п1695 (А/С) гена СОТ/; р=0,01, %"=5.97), в которое входит только один рисковый аллель. Возможно, генетически обусловленное снижение ферментативной активности двух белков второй фазы биотрансформации ксенобиотиков (КАВ(Р)Н-хиноноксидоредуктазы и глутатион-8-трансферазы). является фактором неблагоприятного прогноза в отношении риска развития онкопатологии.

!к14*т2 кШ5№ 1&р ЯРИ/: (ЗВСЦ»

(У & & & & & & (У б- & & &■ & & ымшеаю

Рис. 5. Распределение частот сочетаний генотипов

полиморфных локусов генов 0577"/ и N001 у носителей протективного гаплотипа генов ТР53 и ВКСЛ1 (га80357629), в %

Анализ распределения частот гаплотипов полиморфных локусов rsl042522, rs1625895, DUP 16bp, гена TP53 и rsl799966 (A/G) гена BRCA1 показал существенные различия между группами (рис. 6). Гаплотип *G/*w/*D/*A, сочетающий нормальные аллели по изученным локусам, в группе здоровых индивидов встречался достоверно чаще (р=0,0005, %2=135,03). В группе онкобольных достоверно выше была частота гаплотипов *G/*m/*D/*A, *G/*m/*D/*G, *C/*w/*D/*G и *C/*mJ*D/*G (rsl042522, TP53 / rsl625895, TP53 / DUP 16bp, TP53 / rsl799966, BRCA1 соответственно), в составе которых входят рисковые аллели.

Рис. б. Распределение

частот гаплотипов

аллели генов ТР53,

^ , , „ ,, , > .. А BRCA1 (rs1799966) у

Jf «е _,£> ЯЧ ,0 -Ç- А> »0 яМЮ J

tf 4 fi ,<J> ,4 ,4 А- здоровых индивидов и

A ,î* »■$ Л* л* J-' {225» онкобольных, в %

.с* .<* & & ,о ,с „о & я

Гаплотипический анализ выявил онкобольных (17%), носителей протективного гаплотипа *G/*w/*D/*A. Поэтому был проведен анализ распределения частот сочетаний генотипов полиморфных локусов генов GSTP1 (rsl695, A/G) и NQOl (rs!800566, С/Т; rsl 131341, С/Т), который показал, что 44% индивидов из данной группы являются носителями сочетания генотипов CC/CT/AG, включающего два рисковых аллеля (рис. 7). При сравнении со здоровыми носителями протективного гаплотипа были обнаружены достоверные различия (р=0,014, %2=6,02). У здоровых индивидов выявлены два сочетания генотипов: СТ/СС/АА и СТ/СТ/АА (rs1800566 (С/Т) / rsl 131341 (С/Т) гена NQOl / rsl695 (A/G) гена GSTP1 соответственно) с частотой 17,6% каждый, тогда как у онкобольных эти сочетания не обнаружены. (р=0,058, х2=3,36; р=0,058, х2=3,56, соответственно; рис, 1).

.-у ,-у ГС X -V СС & & £ ^ ^

Рис. 7. Распределение частот сочетаний генотипов

полиморфных локусов генов и N00/ у носителей протективного гаплогипа генов ТР53 и ВИСА!

О и1й?5 ЙЙР!

" -атаке («.1799966), В

Проведен генеалогический анализ родословных 18 семей, включающих 60 человек. При анализе семьи №5 у индивида 11.6 обнаружена соматическая мутация в локусе 1042522 (О/С) гена ТР53 (рис. 8).

Рис. 8. Наследование генов ТР53 и ВИСА! в семье №5

Возможно, данная нуклеотидная замена произошла в кроветворных органах. Анализ наследования этих генов, проведенный относительно индивида 11.6 дает возможность предположить, что гаметы (яйцеклетки) не содержали мутации, поэтому у дочери пробанда аллель *С в генотипе не выявлен.

3. Типирование полиморфных локусов генов системы онкосупрессии ТР53 и ВЯСА1 в ДНК, выделенной из периферической крови и из опухолевой ткани у больных раком молочной железы При генотипировании полиморфных локусов г,ч1042522, п1625895, ОиР 16Ьр, гена ТР53 и гэ80357629, гх1799966 гена ВЯСА1 в образцах ДНК

лейкоцитов периферической крови и опухолевой ткани у больных РМЖ в семи из пятнадцати биоптатов выявлены изменения генотипов (табл. 1). В образце ткани №2 выявлен гомозиготный генотип ww (rsI625895) в гене TP53. Гистологическое описание опухолевой ткани соответствовало признакам доброкачественности новообразования (Ганцев, Горбунова и др., 2012). Возможно, генетическая конституция wm по гену TP53, предрасполагающая к развитию онкопатологии, способствовала злокачественному перерождению клетки, но реверсия аллеля гена ТР53 (wm—tww) в опухоли определила наличие большого количества островков нормальной ткани.

В двух образцах (№ 3, 4) обнаружены несовпадения генотипов по четырем локусам из пяти. Индивидуальный анализ показал, что данные пациентки имели II стадию заболевания без метастаз (T2NoMo). Гистологические исследования опухоли идентифицировали стадию инфильтрирующей протоковой карциномы (Ганцев, Горбунова и др., 2012).

Таблица 1

Нуклеотидные замены в полиморфных локусах генов ТР53 и ВЯСА1, _обнаруженные в опухолевой ткани больных РМЖ__

Генотипы: кровь —» опухоль

Образец ТР53 ТР53 TP53 BRCA1 BRCA1 Классификация

rsl042522 DVP16BP rs1625895 rs80357629 rsl 799966 TNM

1 D/—> DD T2N,Mo

2 wm —» ww TiNoMo

3 DZ —> DD wm ww AA-'GA AG -> GG T2N0Mo

4 DD —> DI wm —> mm AA—>GA GG-> AG T2N0M0

5 ww —► wm T3N2M0

6 A4—»OA T2N2Mo

7 AA—GA T2N,M0

У пациентки №3 идентифицируются пять рисковых аллелей по генам ТР53 и ВИСА1, способных запустить пролиферацию клеток. Персонифицированный анализ цитокинового профиля показал, что концентрация противовоспалительного цитокина 1Ь-10 была значительно повышена, что свидетельствует о напряженной работе иммунной системы. В пользу такого заключения говорят следующие факты: метастазы не выявлены; два аллеля в гене ТР53 восстановились до «нормального» (табл. 1). Следует учесть, что эти пациентки не подвергались дооперационной химио- и радиотерапии.

4. Исследование роли межгекных взаимодействий в формировании предрасположенности к онкозаболеваниям

В основе генетической предрасположенности к многофакторным заболеваниям лежат сложные взаимосвязи различных генетических систем. С целью выявления особенностей совместной работы генов, было проведено моделирование ген-генных взаимодействий для пяти полиморфных локусов в генах системы онкосупрессии и биотрансформации ксенобиотиков. В результате анализа межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов ВКСА1 (та80357629, п1799966), 08ТР1 (п1695), N001 (п1800566, п1.131341) выявлены достоверные двух-, трех- и пятилокусные модели (табл. 2).

Таблица 2

Модели межгенных взаимодействий при онкопатологии

Группа

больные раком ЖКТ

больные РМЖ

Tr.BaJ. Асс.

Test.Bal. Асс.

Р<Г)

Se.

Sp.

cvc

0,6891

0,9036

NQOl (rsl800566)/NQOl (rsll31341)/GSTPl (rsl695)/BRCAl (rs80357629)/BRCAl (rs1799966)

0,7545

0,6897

0,9166

все больные

0.7070

0,7991

0,9630

NQOl (rsl800566)/NQOl (rsl 131341 )/GSTPl (rs!695)

Pre.

0,6943 [ 0,5920 | 0,0003 (13,14)~T 0.8710 | 05065 ( 10/10 | 0,4154

BRCA1 (rs8Q357629)/BRCAl (rsl 799966)

0,6439 | <0.0001 (24,79) | 0,3878 1 0.9833 | 10/10 j 0,9500

0,7! 16 | <0,000! (46,01) | 0,8519 | 0,9524 | 10/10 | 0,9200"

NQOl (rsl800566)/NQQl (rsll31341)/GSTPl (rs!695)

O6940 j <0,0001 (34,12) | 0,7143 | 0,7922 1 №/10 | 0,7143

BRCA1 (rs80357629)/BRCAl (rsl 799966)

0,6897 1 <0,0001 (20,71) | 0,7126 | 0,6667 | 10/10 | 0,7561

NQOl (rsl800566)/NQ01 (rsl 131341)/GSTP1 (rsl695)/BRCAl (rs80357629)/BRCAl Ш799966)

0,6850 1<0,0001(62,99)| 0,8TO4 | 0,9512 1 10/10 | 0,9592

NQOl (rsl800566)/NQQl (rsl 131341 )/GSTPl (rs!695)

06545 | <0,000i (27,40)7 0,6552 | 0,7532 ' | 10/10 | 0,7500"

BRCA1 (rs80357629)/BRCAl (rsl 799966)

0,7991 j <0,0001 (60,61) | 0,6148 | 0,9833 I 10/10 I 0.9881

NQOl (rsl 800566)/NQ01 (rsl 131341)/GSTP1 (rs!695)/BRCAl (rs80357629)/BRCAl (rsI799966)

0,7963 ) <0,0001 (99,65) 1 0,9259 | TOOOO | 10/10 j i.OQOQ

Примечание: Tr.Bal. Асс. - тренировочная сбалансированная точность, Test.Ba!. Асс. -тестируемая сбалансированная точность. Sign Test (Р) - тест на значимость, х2 - критерий значимости различий популяций по распределению частот генотипов, Se. -чувствительность, Sp. - специфичность, CVC - повторяемость результата, Pre. (Precision) -точность модели.

Анализ пятилокусной модели взаимодействия генов при злокачественных новообразованиях желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) выявил несколько

рисковых комбинаций. У больных со злокачественными новообразованиями ЖКТ рисковым является сочетание генотипов GA (rs80357629, BRCA1) / AG (rsI799966, BRCA1) / AG (rsl695, GSTP1) / CC (rsl800566, NQOl) / CT (rsl 131341, NQOl). Комплементарное усиление неспособности к обезвреживанию активных метаболитов при биотрансформации ксенобиотиков выявлено при взаимодействии генов NQOl (rsl800566) и GSTP1 (rsl695) (12,41%, рис. 9), а при генотипе АА гена BRCA1 (rs80357629, G/A) накопление генотоксических аддуктов из-за снижения ферментативной активности глутатион-8-трансферазы приводит к злокачественной трансформации клетки.

Рис. 9. Графическое отображение результатов анализа

взаимодействий между генами BRCA1, NQOl, GSTP1 при злокачественных

новообразованиях желудочно-кишечного тракта Примечание (здесь и далее на рис. 10) на вершинах многогранника представлена информационная ценность каждого маркера, на ребрах - информационная ценность взаимодействия пары генов

У больных раком молочной железы рисковыми являются сочетания аллелей в следующих генотипах GA (rs80357629, BRCA1) / AG (rsl799966, BRCA1) / AG (rsl695, GSTP1) / CC (rsl800566, NQOl) / CT {rsl 131341, NQOl) и GA (rs80357629, BRCA1) IAA (rsl 799966, BRCA1) / AG (rsl695, GSTP1)/ CC (rsl800566, NQOl) / CT (rsl 131341, NQOl). Выявлено существенное дублирующее взаимодействие между непротективными аллелями генов BRCA1 (rs80357629, G/A) и NQO!(rs1800566, С/Т; rsl 131341, С/Т). При РМЖ, наблюдается усиление непротективного взаимодействия гетерозиготных генотипов по локусам rs80357629 и rsl800566 гена BRCA1 (-12,35%, рис. 10).

nTÏSSÎiSi 6.7В?*

-5.13%

Рис. 10. Графическое отображение результатов анализа взаимодействий между генами ВЕСА 1, N(¿01, С.ЧТР! при раке молочной железы.

5. Анализ ассоциаций аллелей генов онкосупрессии (TPS3 и BRCA1) с показателями концентраций цитокинов в сыворотке крови

Анализ содержания основных про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови у больных РМЖ показывает достоверное изменение их уровня по сравнению со здоровыми индивидами (табл. 3).

Выявлено достоверное понижение провоспалительного цитокина IL-2 у больных раком молочной железы. Известно, что IL-2 является индуктором ano птоза (Кадагидзе, 2003).

Таблица 3

Цитокиновый статус у больных РМЖ до операции

и здоровых индивидов, пг/мл (CRP-мг/л)__

Показатели n Больные РМЖ n Здоровые P

5 5

IL-lp(O-ll) 44 2,5+0,21 1,4 56 3,8+0,28 2,1 <0,0001

IL1 RA (50-1000) 44 1031,43+75,71 502 56 215+23,8 178 0,01

IL2 (0-10) 44 1,26+0,06 0,4 56 9,6±0,6 4,5 <0,0001

IL4 (0-4) 44 1,3 ±0,09 0,6 56 1,8+0,06 0,5 <0,0001

IL6 (0-10) 44 25±1,96 13 56 11,3+0,52 3,9 <0,0001

IL10 (0-20) 44 22,8± 1,85 12,3 56 10,3±0,6 4,5 <0,0001

a-TNF (0-6) 44 3,62±0,22 1,5 56 1,86+0,09 0,7 <0,0001

CRP (0-5) 44 1,2±0,18 0,3 56 2,6+0,12 0,9 0,01

Примечание; в скобках приведены значения клинической нормы, n-количество индивидов

У больных РМЖ обнаружено повышение продукции провоспалительного цитокина 1Ь-6. Установлено, что 1Ь-6 обладает большим влиянием на рефляцию иммунного ответа: он стимулирует пролиферацию и дифференцировку В-клеток,

усиливает образование антител, участвует в продукции мультипотентных колониеобразующих факторов и мегакариоцитов, может подавлять апоптоз нейтрофилов (Кадагидзе, 2003). Помимо этого, IL-6 выступает в качестве триггера канцерогенеза, включающего самоподдерживающуюся цепь, обуславливающую инициацию и поддержание злокачественного состояния в клетках молочной железы (Rokavec et al., 2012). Некоторые авторы относят II-6 к цитокинам, ингибирующим апоптоз, что способствует росту и ангиогенезу опухоли (Yamamoto et al, 1995; Carpi, 2009; Sangaletti et al, 2010).

Концентрации других провоспалительных цитокинов находились на уровне минимальных, значений физиологической нормы (табл. 3), что может объясняться слабой иммунореактивностью.

Иммуноферментный анализ содержания цитокинов в сыворотке крови больных РМЖ, проведенный в послеоперационный период не выявил изменений концентраций цитокинов про- и противовоспалительного ряда.

У здоровых индивидов концентрации про- и противовоспалительных цитокинов находились в физиологичном соотношении согласно их функциональным взаимосвязям.

Однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA) у больных раком молочной железы выявлена ассоциация пониженной концентрации IL-2 с аллелем *т (rsl625895) гена ТР53 (р<0,001) и ассоциация низких значений IL-10 с аллелем BRCA1 *А ( rs80357629, р=0,038; рис. 11).

Рис. 11. Ассоциация аллелей генов ТР53 и BRCA1 со средними концентрациями цитокинов 1L-2 и II.-10

Следовательно, нарушение работы генов клеточного цикла совместно с дисбалансом соотношений сывороточных цитокинов, принимающих участие в иидукции апоптоза, является фактором неблагоприятного прогноза в отношении развития РМЖ.

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о ключевой роли аллельного состояния генов системы онкосупрессии (ТР53 и BRCA1) и биотрансформации ксенобиотиков (GSTP1 и NQ01) в формировании риска злокачественной трансформации клетки. В патогенетическую связь между наследственной предрасположенностью к злокачественным новообразованиям и их клинической манифестацией включены цитокины, осуществляющие регуляцию межклеточных взаимосвязей. Показано, что патофизиологическую роль в возникновении опухоли играет как высокая продукция интерлейкина-6, рецепторного антагониста интерлейкина-113 и интерлейкина-10, так и низкая продукция интерлейкина-2, что в итоге приводит к дисбалансу цитокиновой регуляторной сети, который, в свою очередь, инпибирует апоптоз и угнетает иммунный ответ. Изменения функционирования цитокиновой регуляции в тандеме с носительством рисковых аллелей генов ТР53, BRCA1, GSTP1 и NQ01 являются факторами, обуславливающими развитие онкологического заболевания.

ВЫВОДЫ:

1. У онкобольных выявлено достоверное повышение частоты генотипов GG (rsl042522), wm, mm и аллеля *т (rsl625895) гена ТР53 и гомозиготных генотипов АА (rs80357629) и GG (rsl79996) гена BRCA1, являющихся онкосупрессорами.

2. Показано, что протективными являются гаплотипы, сочетающие только нормальные аллели генов-онкосупрессоров ТР53 и BRCA1, расположенных на 17 хромосоме. Рисковые: *G/*m/*D/*G, *C/*w/*D/*A, *C/*m/*D/*A [rsl042522 (G/C) / rsl625895 (G/A) / DUP16BP гена TP53 / rs80357629 (G/A) гена BRCA1], *G/*m/*D/*A, *G/*m/*D/*G, *C/*w/*D/*G и *C/*m/*D*G [rsI042522 (G/C) / rsl625895 (G/A) / DUP16BP гена TP53 / rsl799966 (A/G) гена В RCA 1].

3. Установлено, что сочетание генотипов CC/CT/AG [rsl800566 (С/Т) / rsl 131341 (СП') гена NQOl / rsl695 (A/G) гена GSTP1] является рисковым в

отношении развития онкоиатологии, даже у носителей протективных аллелей в гаплотип&к генов-онкосупрессоров ТР53 и BRCA1.

4. Обнаружены ассоциации аллеля *т (rsl625895) гена ТР53 с пониженной концентрацией IL2 и аллея *А (rs80357629) гена BRCA1 с пониженной концентрацией IL-10, являющихся индукторами апоптоза

5. Генеалогический анализ родословной семьи выявил носителя нуклеотидной замены в полиморфном локусе rsl042522 (G/C) гена ТР53, произошедшей в онтогенезе.

6. Установлены достоверные двух-, трех- и пятилокусные модели межгенных взаимодействий, детерминирующие развитие онкологических заболеваний. У больных со злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта рисковыми являются сочетания генотипов GAJAG/AG/CC/CT, а у больных раком молочной железы - G А/А G/A G/CC/CT и GA/AÀ/AG/CC/CT [rs80357629 (G/A), BRCA1 1 rsl799966 (A/G), BRCA1 / rsl695 (A/G), GSTP1 / rsl800566 (C/T), NQOl I rsl 131341 (C/T), NQOl, соответственно].

7. Обнаружены несовпадения генотипов в полиморфных локусах генов ТР53 (rsl625895, G/A; DUP16BP) и BRCA1 (rs80357629,G/A; rsl799966, A/G) в образцах ДНК опухолевой ткани больных РМЖ по сравнению с их образцами ДНК лейкоцитов периферической крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Каюмова Л.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Анализ полиморфных вариантов генов биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1 и ТР53) у больных раком молочной железы // Вестник Оренбургского государственного университета. 2009, № 10. С. 252-258.

2. Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Анализ пяти полиморфных локусов трех генов системы биотрансформации ксенобиотиков (СУР2Е1, ЕРНХ1, NQOl) в республике Башкортостан // Вестник Оренбургского государственного университета.. 2009, № 10. С. 429-431.

3. Васильева Э.М., Гумерова Г.Р., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Генетический мониторинг населения: изучение полиморфных вариантов генов цитохромоксидазной системы и цитокинового комплекса // Аграрная Россия. 2009, Специальный выпуск. С. 118.

4. Ганцев Ш.Х., Горбунова В.Ю., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Васильева Э.М., Рустамханов P.A. Функционирование генов онкосупрессии (ТР53, BRCA1) и их взаимодействие с цитокинами при раке молочной железы. // Креативная онкология и хирургия. Электронный научно-практический журнал. 2012. url:http:/eoncosurg.com/?p=2273.

5. Галикеева Г.Ф,, Николаев И.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Молекулярно-генетическое исследование полиморфных вариантов в гене ТР53 и Alu-элементов подсемейства AluYa при онкологических заболеваниях // Медицинская генетика. 2010,

Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. С. 43.

6. Галнкеева Г.Ф., Васильева Э.М., Каюмова Л.Р., Гумерова Г.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Распределение частот генотипоз и аллелей генов регуляторов ферментных систем первой фазы биотрансформации ксенобиотиков CYP1A1, CYP2E1 // Эмбриология, генетика и биотехнология. - Материалы II международной школы молодых ученых Уфа, 2007. С. 35-37.

7. Васильева Э.М., Галнкеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Каюмова Л.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е. В., Горбунова В. Ю. Изучение полиморфизма генов I фазы биогрансформации ксенобиотиков цитохрома Р-450: СУР1А1 и СУР2Е1 в группах людей, различающихся по экологическим условиям проживания // Инновационный потенциал молодежной науки: материалы республиканской научно-практической конференции. Т.1. Уфа, 2008. С. 16-20.

8. Галнкеева Г. Ф., Васильева Э.М., Гумерова Г.Р., Каюмова Л.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Распределение частот генотипов и аллелей «генов внешней среды» IL-IRa и IL-1B и гена-супрессора опухолевого роста ТР53 // Инновационный потенциал молодежной науки: материалы республиканской научно-практической конференции. Т.1. Уфа, 2008. С. 26-30.

9. Васильева Э.М., Галнкеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование полиморфных вариантов генов цитохромоксидазной системы и генов цитокинового комплекса в Республике Башкортостан // Материалы съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров). Т. 2. Москва, 2009. С. 151.

10. Галнкеева Г.Ф., Васильева Э.М., Гумерова Г.Р., Каюмова Л.Р., Гумерова О.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование распределения частот генотипов и аллелей гена-супрессора опухолевого роста ТР53 в Республике Башкортостан // Материалы съезда генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина (V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров). Т. 2. Москва, 2009. С. 156.

11. Васильева Э.М., Галнкеева Г.Ф., Гумерова Г.Р., Каюмова Л.Р., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Изучение генетических маркеров устойчивости к генотоксическим эффектам среды обитания человека // Современный педагогический университет как центр интеграции науки и образования. Материалы внутривузовской научно-практической конференции, проводимой в рамках Дней науки БГПУ им. М. Акмуллы. Уфа, 2009. С.25-28.

12. Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование полиморфных вариантов генов, участвующих в инактивации ксенобиотиков // Труды Всероссийской конференции, посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М.Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям «Инновационные и молекулярно-генетические исследования живых систем». Уфа, 2009. С. 159-165.

13. Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Тимкова А.В., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Исследование распределения частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов гена-онкосупрессора TP53II Материалы международной научно-практической конференции «Роль классических университетов в формировании инновационной среды регионов». Уфа. 2009. С. 61-64.

14. Галикеева Г.Ф.. Васильева Э.М., Николаев И.В., Кильдиярова И.Ф., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Анализ полиморфных вариантов гена ТР53 в группах лиц, проживающих в условиях с различной экологической нагрузкой // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования». Т.Н. Уфа, 2010. С. 157-161.

15. Галикеева Г.Ф. Молекулярно-генетическое исследование генов системы биотрансформации ксенобиотиков у жителей республики Башкортостан // Материалы всероссийской конференции «Ломоносов - 2010». Москва, 2010. С. 81.

16. Галикеева Г.Ф., Васильева Э.М., Воробьева Е.В., Горбунова В.Ю. Молекулярно-генетическое исследование генов антиоксидакгной защиты при онкопатологии // Сборник тезисов. Биология - наука XXI века: 14-я Путинское международная школа-конференция

молодых ученых. Пущино, 2010. С. 124. v

17. Galikeeva G., Vasilyeva E., Vorobyeva E., Gorbunova V. Molecular genetic study of genes biotransformation of xenobiotics И European Human Genetics Conference. Gothenburg, 2010. KbsX. P08.I3.P. 203-204.

18. Васильева Э.М., Галикеева Г.Ф., Воробьева E.B., Имельбаева Э.А., Батретдинова Р.Т., Горбунова В.Ю. Исследование корреляционной зависимости между продукцией цитокинов и генами щггокинового каскада у здоровых индивидов // Материалы II Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Биомика - наука XXI века». Уфа, 2011. С.23-24.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РМЖ рак молочной железы IL-10 интерлейкин-1 бета

жкт желудочно-кишечный тракт IL1RA антагонист рецептора

BRCA1 brest cancer 1 интерлейкина-1

CAT каталаза ТР53 Tumor protein

GSTT1 глутатион S-трансфераза тета 1 a-TNF фактор некроза опухоли альфа

GSTM1 глутатион S-трансфераза мю 1 i критерий значимости различий популяций по распределению

GSTP1 глутатион S-трансфераза пи 1 частот генотипов

CRP С-реактивный белок Р вероятность

Лиц. на издат. деят. Б848421 от 03.П.2000 г. Подписано в печать 27.04.2012. Формат 60X84/16. Компьютерный набор. Гарнитура Times. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. - 2,8. Уч.-изд. л. - 2,6. Тираж 150 экз. Заказ № 342.

ИПК БГПУ 450000, г.Уфа, ул. Октябрьской революции, За

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Галикеева, Гузель Фанилевна, Уфа

61 12-3/977

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный педагогический университет

им. М. Акмуллы»

ГАЛИКЕЕВА ГУЗЕЛЬ ФАНИЛЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОВ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА (ТР53, ВЛСА!) И СИСТЕМЫ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ

ПРИ ОНКОПАТОЛОГИИ

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. профессор

Горбунова В.Ю.

На правах рукописи

Уфа-2012

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. Генетическая регуляция клеточного цикла (обзор 10 научной литературы)

1.1. Роль гена ВЯСА1 в обеспечении целостности генома и контроле 19 клеточного цикла

1.2. Роль гена ТР53 в регуляции клеточного цикла и инициации 28 клеточной смерти

1.3. Роль генов II фазы системы биотрансформации ксенобиотиков 40 (бЗТМ/, ООТ7, САТ, Щ201) в регуляции клеточного цикла

ГЛАВА 2. Материалы, методы и объем исследования 54

2.1. Объект исследования 54

2.2. Материалы исследования 55

2.3. Методы исследования 57

2.3.1. Генетические методы. Семейный анализ 57

2.3.2. Методы исследования ДНК 58

2.3.2.1. Выделение геномной ДНК 58

2.3.2.2. Амплификация полиморфных участков ДНК 60

2.3.2.3. Электрофорез в полиакриламидном геле 66

2.3.3. Определение содержания цитокинов 67 2.3.3.1. Определение концентраций 1Е-1 (3, Ш>, 1Ь10 и а-ШР 67

2.3.3.2 Определение концентрации 1Ь111А 70

2.3.3.3 Определение концентрации 1Ь2,1Ь4 71

2.3.4. Статистический анализ результатов 72

ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 74

3.1. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов исследуемых генов 74 с риском развития онкопатологии

3.1.1. Исследование распределения частот генотипов и аллелей 74 полиморфных вариантов генов системы онкосупрессии (ТР53 и ВЯСА1) у здоровых индивидов и в группе онкопатологией

3.1.2. Исследование распределения; частот аллелей и генотипов 88 полиморфных вариантов генов системы биотрансформации

ксенобиотиков (GSTM1, GSTT1, GSTP1, CAT, NQOl) у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией

3.2. Анализ сочетаний генотипов пяти полиморфных локусов 97 изученных генов и исследование роли межгенных взаимодействий

у здоровых индивидов и больных онкопатологией

3.3. Анализ наследования аллелей генов TP 53 и BRCA1 115

3.4. Типирование полиморфных локусов генов TP53 и BRCA1 в ДНК 121 периферической крови и опухолевой ткани у больных раком молочной железы

3.5. Иммуноферментный анализ концентрации цитокинов в 125 сыворотке крови у больных РМЖ

3.6. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров генов со средними 126 значениями количественных показателей цитокинов (ANOYA) у больных РМЖ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 129

ВЫВОДЫ

131

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 133

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

жкт желудочно-кишечный тракт

РМЖ рак молочной железы

BRCA1 brest cancer 1

CAT каталаза

CRP С-реактивный белок

GST глутатион-8-трансфераза;

GSTT1 глутатион-8-трансфераза тета 1;

GSTM1 глутатион-8-трансфераза мю 1;

GSTP1 глутатион-8-трансфераза пи 1;

IL-ip интерлейкин-1 бета

IL1RA антагонист рецептора интерлейкина-1

IL2 интерлейкин-2

IL4 интерлейкин-4

IL6 интерлейкин-6

IL10 интерлейкин-10

LD linkage disequilibrium (неравновесие по сцеплению)

NQOl НАБ(Р)Н-хиноноксидоредуктаза-1

P вероятность

TP53 tumor protein

a-TNF фактор некроза опухолей альфа

x2 критерий значимости различий популяций по распределениям частот генотипов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Основой канцерогенеза, независимо от локализации опухоли, является злокачественная трансформация клетки в результате нарушения клеточного цикла и угнетения апоптоза (Татосян, 2004; Logan et al., 2004). Молекулярный патогенез онкологических заболеваний включает множество генетических и эпигенетических событий, ведущих к активации онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии (Ляхович и др., 2004; Payne, Kemp, 2005; Croce, 2008; Залетаев, 2008; Лихтенштейн, 2009). Одними из ключевых генов-супрессоров опухолевого роста являются гены TP 53 и BRCA1, белковые продукты которых осуществляют ^реализацию- широкого спектра клеточных процессов, регуляцию клеточного цикла, индукцию апоптоза, постоянный надзор за состоянием генома и злокачественной трансформацией клеток (Phillips, 1999; Vousden, Lane, 2007; Копнин, 2008; Желтухин, Чумаков, 2010). Нарушение функциональной активности этих белков может провоцировать генетическую нестабильность, нарушение их транскрипционной, сигнальной и митохондриальной функций (Чумаков, 2007).

С другой стороны, реализация онкогенеза является результатом

совместного действия многих систем организма. В работе R.E. Ellis с

соавторами (2002) показано, что при некоторых новообразованиях

цитокины способны влиять на рост опухолевых клеток, изменяя

экспрессию белков про- и антиапоптотического действия, различных

онкогенов и маркеров пролиферативной активности клеток. В частности,

нарушение баланса про- и противовоспалительных сывороточных

цитокинов способствует развитию патологических процессов, в том числе, злокачественных новообразований (Oppenheim, 1996; Тугуз, 2008; Бережная, 2009).

В связи с этим, комплексный подход, включающий: проведение молекулярно-генетического анализа генов клеточного цикла и генов инактивации ксенобиотиков, а также оценку цитокинового статуса при выявлении предрасположенности к онкозаболеваниям, является наиболее перспективным и актуальным направлением изучения механизмов злокачественной трансформации клетки.

Задачи исследования:

1. Оценить распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов систем онкосупрессии {rsl042522 (G/C), rsl625895 (G/A), DUP16BP гена ТР53; rs80357629 (G/A) и rsl799966 (A/G) гена BRCA1) и биотрансформации ксенобиотиков {Jorge deletion в генах GSTM1 и GSTT1; rsl695 (A/G) гена GSTP1; rs 1001179 (С/Т) гена С AT; rsl800566 (С/Т) и rsl 131341 (С/Т) гена NQOl) у здоровых, а также больных раком молочной железы и индивидов, страдающих злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта.

3. Проанализировать распределение частот сочетаний генотипов полиморфных локусов генов {rs80357629 (G/A) и rs1799966 (A/G) гена BRCAT, large deletion в генах GSTM1 и GSTT1; rsl695 (A/G) гена GSTP1; rs 1001179 (С/Т) гена С AT; rsl800566 (С/Т) и rsl 131341 (С/Т) гена NQOl) у

здоровых индивидов, носителей нормальных аллелей гена ТР53 и больных онкологическими заболеваниями.

5. Провести типирование генов системы онкосупрессии (ТР53 и BRCA1) ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови и опухолевой ткани больных раком молочной железы.

6. Провести генетический анализ наследования аллелей генов системы

онкосупрессии (ТР53 и BRCA1), локализованных на 17 хромосоме.

Научная новизна исследования: впервые обнаружены нуклеотидные

замены в генах ТР53 (j1625895 G/A, DUP16BP) и BRCA1 {rs80357629,

G/A; rsl 799966, A/G), произошедшие в опухолевой ткани у больных раком

молочной железы, причем при реверсии аллеля в опухоли наблюдается

мозаицизм в ткани с большим количеством очагов нормальных клеток, что

подтверждается гистологическими исследованиями. Установлена

взаимосвязь полиморфных локусов генов системы онкосупрессии с

показателями спонтанной продукции цитокинов. Выявлен дисбаланс

сывороточных цитокинов крови про- и противовоспалительного ряда у

больных раком молочной железы. Определены межгенные взаимодействия

полиморфных локусов в генах BRCA1 (rs80357629, G/A; rs1799966, A/G),

GSTP1 (rsl695, A/G), NQOl {rs1800566, C/T; rsl 131341, С/Т), являющихся

рисковыми в отношении онкопатологии: у больных со злокачественными

новообразованиями желудочно-кишечного тракта - это сочетание

генотипов GA/AG/AG/CC/CT, а у больных раком молочной железы -

G А/А G/A G/CC/CT и GA/AA/AG/CC/CT по полиморфным локусам

rs80357629 (G/A), BRCA1 /rsl799966 (A/G), BRCAl/rsl695 (A/G), GSTP1 /

rs1800566 (C/T), NQOl / rsll31341 (C/T), NQOl, соответственно. При

генеалогическом анализе выявлена соматическая мутация в гене ТР53

(rsl042522, G/C) у пробанда, которая не идентифицирована ни у ее матери,

ни у детей. Установлено, что сочетание генотипов СС/СТ/АС (га1800566 (С/Т), Щ01 / гя1131341 (С/Т), И()01 / г$1695 (С/Т), вБТР!) является рисковым в отношении возможного развития онкопатологии, даже у носителей протективных гаплотипов аллелей генов ТР53 и ВЯСА1, расположенных на 17 хромосоме.

Благодарности

Работа выполнена в центре молекулярно-генетических исследований кафедры генетики при Башкирском государственном педагогическом университете им. М. Акмуллы.

Выражаю свое глубочайшее уважение и признательность научному руководителю д.б.н., проф. Горбуновой Валентине Юрьевне за неоценимую помощь в организации исследования и интерпретации результатов. Зав. каф. генетики БГПУ им. М.Акмуллы, д.б.н., проф. Вахитову Венеру Абсаттаровичу. Зав. кафедрой хирургии и онкологии с курсами онкологии и патологической анатомии БГМУ, проф. Ганцеву Шамилю Ханафиевичу и ординатору Республиканского клинического онкологического диспансера МЗ РФ, Рустамханову Расулу Айдаровичу. Зав. Бактериологической лаборатории ГКБ №22 г.Уфы Батретдиновой Р.Т. и д.б.н., проф. Имельбаевой Эльвире Аркамовне за помощь в проведении иммуноферментного анализа. • - Младшему научному сотруднику лаборатории селекции и семеноводства зернобобовых культур Башкирского НИИ сельского хозяйства, Гайнуллиной К.П. за помощь в выделении ДНК из образцов опухолевой ткани. Сотрудникам кафедры генетики БГПУ им. М.Акмуллы Воробьевой Е.В., Васильевой Э.М., Гумеровой О.В., Каюмовой Л.Р., Николаеву И.В. за участие в обсуждении результатов и помощь в оформлении работы. Отдельная благодарность моей семье за любовь, понимание, терпение и участие.

ГЛАВА 1. Генетическая регуляция клеточного цикла (обзор научной

литературы)

Клеточный цикл - это период жизни клетки от одного деления до другого деления или до смерти. Клеточный цикл и процесс деления соматической клетки (митоз) находятся под строгим контролем системы регуляции, представляющей собой сложную цепь взаимодействий различных генов и их продуктов. Вступление клетки в жизненный цикл контролируется внешними (клеточное окружение, сигнальные молекулы) и внутренними факторами, такими как генетическая конституция и синхронизация метаболических путей.-т л -

Клеточный цикл состоит из четырех основных стадий: Gl, где клетка растет и готовится к синтезу ДНК; S, где осуществляется репликация ДНК; G2, где происходит подготовка к делению и, собственно, митоз (Льюин, 2011). -

Для обеспечения определенного порядка протекания процессов клеточного цикла, в клетке действует специальная система наблюдения или точки контроля. Контрольные точки выполняют две важные функции: одна из них состоит в том, чтобы не допустить начала следующего процесса, если успешно не завершился предыдущий, а другая - вступление клетки в цикл в зависимости от клеточного окружения.

Точки контроля клеточного цикла содержат три компонента (рис. 1; Льюин, 2011):

1. Сенсор, функцию которого выполняют белки, непосредственно распознающие дефекты в структуре ДНК и активирующие сигнальные белки. Основными представителями данного компонента контрольной точки являются белки ATM, ATR, Rad 17, Rad9, Radi, Husl;

2. Сигнальный модуль обеспечивает передачу сигнала о наличии повреждений белкам системы репарации и комплексам циклин-зависимых

киназ с циклинами, выполняющих роль переключателей фаз клеточного цикла. К сигнальным белкам можно отнести р53, В11СА1, р21 и др.;

3. Мишень представляет собой белковые комплексы циклин-зависимых киназ с циклинами, которые останавливают клеточный цикл до тех пор, пока повреждения не будут репарированы (Льюин, 2011).

ОШИБКА

Повреждение в ДНК

Блокирование входа в митоз

: ж

Рис. 1. Основной принцип функционирования контрольной точки (Льюин, 2011)

Существуют три основные самостоятельные точки контроля: между GIh S фазами, внутри S-периода и на границе S-G2 фаз клеточного цикла (Nurse et al., 1998).

Регуляция функционирования точек контроля определяется работой взаимодействующих между собой генов, обеспечивающих целостность генома путем как непосредственного участия в процессах репарации, так и, активируя транскрипцию генов, продукты которых осуществляют исправление дефектов ДНК и остановку клеточного цикла. Нарушение функционирования систем этих генов ведет к накоплению в геноме мутаций и злокачественной трансформации клетки. Поэтому гены, продукты которых, по большей части, работают в составе сенсорного блока, принято называть антионкогенами или онкосупрессорами. Основные антионкогены и разнообразие выполняемых ими функций представлены в таблице 1.

Таблица 1

Антионкогены и их роль в регуляции клеточного цикла (Горбунова,

Имянитов, 2007)

Ген, локализация Белок, функция

Антионкогены, участвующие в контроле клеточного цикла

ТР53 (17р13) р53; транскрипционный фактор; регуляция перехода контрольных точек 61-8, 02-М, арест продвижения клетки по циклу в ответ на повреждение ДНК; апоптоз; ангиогенез

Rb{ 13ql4) ядерный белок; контроль 01-8 перехода

pl6/INK4A / CDKN2A / MTS1 (9p21) р16/ШК4А и р14/р19АКГ; контроль клеточного цикла в фазах 01 и в2 посредством ингибирования супрессорных путей, опосредуемых Шз и р53

AT M (Ilq22-q23) Р13-киназа, активирующая р53 и ВКСА1, медиатор сигнальной трансдукции, участвующий в регуляции длины теломеры, прохождения в 1-8 и С2-М фаз клеточного цикла, апоптоза, репарации двунитевых разрывов ДНК

Антионкогены, участвующие в контроле репарации ДНК

MSH2 (2р16) мутаза 82; репарация ДНК

MLH1 (3p23-P21.3) мутаза Ь1; репарация ДНК

BRCA1 (17q21) В11СА1; ядерный белок, участвующий в контроле репарации двунитевых разрывов ДНК

BRCA2 (13ql2-ql3) ВЯСА2; репарация двунитевых разрывов ДНК

Антионкогены, участвующие в контроле клеточной адгезии

APC (5q21-q22) рАРС; негативный регулятор активности р-катенина, участвующий в регуляции адгезии и контроле клеточного цикла

РТСН/ BCNS (9q22:3) РТСН; трансмембранный белок, участвующий в регуляции TGF(3- и Wnt-опосредуемой сигнальной трансдукции

PTEN/ ММАС1 (10q23) PTEN; ингибитор Р13К/ Akt-сигнального пути, участвующий в регуляции инвазии и метастазирования

Точки контроля являются критическими точками клеточного цикла, так как именно в этот момент проверяется целостность генетического материала клетки и принимается решение о возможности перехода в следующую фазу цикла. Это необходимо для того, чтобы исключить возможность деления мутантных клеток и сохранить генетическую

информацию в ряду поколений. При обнаружении мутаций в геноме, происходит блокирование клеточного цикла для исправления повреждений (Новик, 2004).

Существует специальная точка контроля, осуществляющая надзор над репликацией в S-фазе клеточного цикла. Образование участков с неправильной структурой (локальные одноцепочечные участки, двунитевые разрывы) приводит к активации транскрипции генов протеинкиназ ATR и ATM, которые являются медиаторами точек контроля. Киназа ATM, как правило, непосредственно связывается с ДНК на концах двунитевых разрывов, a ATR киназа преимущественно взаимодействует с УФ-индуцированными дефектами ДНК. Связывание с поврежденными участками ДНК приводит к увеличению актив

Информация о работе

Галикеева, Гузель Фанилевна
кандидата биологических наук
Уфа, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Молекулярно-генетическое исследование генов клеточного цикла (TP53, BRCA1) и системы биотрансформации ксенобиотиков при онкопатологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы