Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный анализ гена BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы и яичника в Санкт-Петербурге

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный анализ гена BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы и яичника в Санкт-Петербурге"

На правах рукописи

Тихомирова Оксана Сергеевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНА ВПСЛ1 У БОЛЬНЫХ СЕМЕЙНЫМИ ФОРМАМИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ЯИЧНИКА В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□ОЗОБ172Б

Санкт-Петербург 2007

003061726

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Васильев Вадим Борисович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич, руководитель лаборатории общей патологии Отдела общей патологии и патофизиологии ГУ НИИЭМ РАМН

доктор биологических наук Иващенко Татьяна Эдуардовна

ведущий научный сотрудник лаборатории пренатальной диагностики Научно-исследовательского Института акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский Государственный Университет

Защита диссертации состоится «21» сентября 2007г. в «13» часов на заседании диссертационного совета Д001.022.03 при ГУ Научно-исследовательский институт РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Среди онкологических заболеваний рак молочной железы (РМЖ) является второй по частоте причиной смертности в развитых странах мира, в том числе и в России. Женщины в возрасте 40-59 лет чаще умирают от РМЖ, чем от других злокачественных новообразований. В нашей стране наблюдается тенденция к росту распространенности рака молочной железы из года в год и к снижению возраста, в котором возникает заболевание. Санкт-Петербург является "неблагополучным" районом России по уровню заболеваемости и смертности от данной формы онкопатологии (Аксель, Давыдов, 2002). За последние 25 лет заболеваемость РМЖ в Санкт-Петербурге возросла примерно на 150%.

От 5 до 10% всех случаев РМЖ составляют семейные формы, из которых лучше всего охарактеризованы и наиболее часто встречаются случаи, когда прослеживается связь заболевания с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. Несмотря на то, что частота встречаемости патологических мутаций в гене BRCA1 оценивается как 1:800 - 1:2000 (Баранов и др., 2000), эти случаи привлекают внимание онкологов как высокопенетрантные заболевания, приводящие к гибели пациентов в существенно более раннем (часто в детородном) возрасте, нежели формы рака без сильно выраженной семейной предрасположенности. Поскольку эффективность терапии и хирургии определяется в значительной степени тем, насколько рано выявлено заболевание, идентификация носителей мутаций в гене BRCA1 и последующее диспансерное наблюдение за этими лицами позволяет спасти им жизнь. Проведенные в США исследования на группе из 251 здоровых женщин с типированными мутациями в генах семейства BRCA в течение немногим более двух лет показали эффективность полугодичных осмотров для максимально раннего выявления и удаления опухолей (Scheuer et al., 2002).

В настоящее время в мире известно более 1200 мутаций в гене BRCA1 (Breast Cancer Information Core, BIC). Встречаемость вариантов последовательности гена BRCA1 сильно отличается между разными популяциями и этническими группами, и в каждом регионе есть свои наборы мажорных и минорных мутаций, предрасполагающих к заболеванию. Поэтому только знание национальных и

этнических особенностей спектров мутаций может позволить наладить ДНК-диагностику для выявления группы высокого риска развития рака молочной железы. Эффективность лечения рака молочной железы во многом зависит от своевременной диагностики. ДНК-диагностика позволяет выявить предрасположенность к РМЖ и осуществить постановку на учет к онкологу еще до возникновения клинических проявлений заболевания. В связи с постоянным ростом заболеваемости РМЖ проблема ранней диагностики приобретает чрезвычайную актуальность. Цель работы

Целью работы было изучение спектра мутаций гена ВЯСА1 у больных семейными формами РМЖ и РЯ из числа жителей Санкт-Петербурга. Задачи

1. Осуществить поиск мутаций в 5-м, 11-м, 13-м, 19-м и 24-м экзонах гена ВЯСА1 пациентов с .семейными формами РМЖ и рака яичников (РЯ) методами гетеродуплексного анализа и анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (БЗСР-анализа);

2. Изучить встречаемость мутации 5382т5С в 20-м экзоне гена ВЛСА! у пациентов с раком яичника.

3. Идентифицировать обнаруженные мутации методом секвенирования ДНК.

4. Разработать быстрые методы детекции обнаруженных мутаций. Научная новизна

У больных с семейными формами рака молочной железы и яичника в Санкт-Петербурге идентифицировано четыре мутации в гене ВЯСА1'. 5382тзС, 2761 с1е1А, 4146с1е13 и А622У. Мутация 5382т$С выявлена более чем у трети обследованных больных с раком яичника. Две мутации 2761с1с1А и 4146с1е13, обнаруженные в настоящей работе, являются новыми, никем ранее в мире не описанными. Их идентификация свидетельствует о том, что значительная доля мутаций гена ВИСА1 в России придется на неизвестные в мире мутации. Впервые в России обнаружена миссенс-мутация С?356Г1 и показано, что она является редким полиморфным вариантом, не ассоциированным с заболеванием. В Санкт-Петербурге впервые выявлены два сцепленных друг с другом полиморфизма (814368, Р871Ь), ранее известных во многих странах мира, и определена частота аллелей этих полиморфных маркеров.

Теоретическое и практическое значение работы.

В результате работы выявлены новые мутации в гене В11СА1, характерные только для Санкт-Петербурга, а также показано, что миссенс-мутация ()3561^ является редким полиморфным вариантом, не ассоциированным с заболеванием. Эти данные следует учитывать при проведении ДНК - диагностики для выявления групп высокого риска развития рака молочной железы и рака яичника. Для всех обнаруженных нами мутаций разработаны методы экспресс-диагностики, которые могут быть использованы для генетического консультирования в семьях больных семейными формами РМЖ, а также для выявления предрасположенности к этому заболеванию в популяционных исследованиях. Теоретическим выводом из работы является установленная специфика спектра мутации гена ВЯСА1 на Северо-Западе России.

Положения, выносимые на защиту.

1. В Санкт-Петербургской популяции в гене ВКСА1 распространены как известные в других популяциях мира мутации, так и специфичные для России.

2. Значительная доля семейных случаев рака яичника в Санкт-Петербургской популяции может быть связана с носительством мутации 5382in.sC в 20-м экзоне гена ВКСА1.

3. Из числа идентифицированных изменений последовательности гена ВЛСА! некоторые, такие как 276Ые1А, 4146с1е13, являются вероятной причиной предрасположенности к РМЖ, а другие варианты, такие как <335611, Р871Ь и 814368, не ассоциированы с повышенным риском развития заболевания.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ в отечественных журналах, а также в сборниках по материалам конференций. Материалы работы докладывались на следующих конференциях: 7-ая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2004), юбилейная научная конференция молодых ученых СевероЗападного региона, посвященная 60-летию Российской академии медицинских наук (Санкт-Петербург, 2004), Петровские чтения-2005, 2006 "Конференция по фундаментальной онкологии" (Санкт-Петербург, 2005, 2006), "Молекулярная генетика онкологических заболеваний" (Новосибирск, 2007). В полном объеме

диссертация заслушана на семинаре Отдела молекулярной генетики ГУ НИИЭМ РАМН.

Личный вклад диссертанта.

Диссертантом лично выполнены все исследования, описанные в работе, за исключением секвенирования нескольких образцов, которое проводилось в фирме «Helix».

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждений, выводов, списка литературы. Текст диссертации иллюстрирован 26 рисунками и 9 таблицами. Список литературы включает 119 источников, из них 13 отечественных и 106 зарубежных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В качестве материала использовали коллекцию ДНК пациентов с семейными формами рака молочной железы и рака яичника, состоящую из 50 образцов. Отбор пациентов проводила врач-генетик Т.В. Брежнева в НИИ онкологии им. проф H.H. Петрова МЗ РФ. Пациенты были разбиты на группы:

1) пациенты с семейными формами рака молочной железы (43 пробанда)

2) пациенты с семейными формами рака яичника (7 пробандов).

ДНК выделяли из лейкоцитов периферической венозной крови пациентов по методу Кюнкеля с соавт. в модификации Белла (Kunkel et al., 1977; Bell et al., 1981). Ген BRCA1 содержит 24 экзона. Наиболее протяженный 11 экзон гена разбит на перекрывающиеся фрагменты, пронумерованные буквами латинского алфавита (11А-11Р). Для поиска мутаций были выбраны ранее не исследованные двенадцать фрагментов 11 экзона, а также 5, 13, 19, 20 и 24 экзоны гена BRCA1. Данные фрагменты гена BRCA1 были выбраны исходя из частоты и количества мутаций, описанных в этих экзонах по данным BIC. Исследуемые участки амплифицировали методом полимеразной цепной реакции, используя праймеры, предложенные Фридман и соавт. (Friedman et al., 1994). Для поиска изменений нуклеотидной последовательности в гене BRCA1 использовали анализ конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP-анализ) и гетеродуплексный

анализ. Первоначально в нашей работе SSCP-анализ проводили в 12% полиакриламидном геле с окрашиванием однонитевых конформеров серебром, в дальнейшем - на секвенаторе ALFexpress II («Amersham Biosciences», Великобритания) с использованием Су5-меченных праймеров («Синтол», Москва). Обработку и последующий анализ осуществляли с использованием прилагаемого программного обеспечения ALFwin Fragment Analyser.

Клонирование амплифицированных фрагментов осуществляли с использованием набора фирмы «Медиген» (Новосибирск). Выделение плазмид проводили по стандартной методике (Маниатис и др., 1984).

Идентификацию мутаций проводили с помощью секвенирования продуктов амплификации по методу Сэнджера (Sanger F. et al., 1977) на приборе ALFexpress II («Amersham Biosciences», Великобритания), согласно протоколу фирмы-производителя с использованием реактивов из стандартных наборов. Обработку и анализ полученных последовательностей проводили с использованием прилагаемого программного обеспечения ALFwin Sequence Analyser. Несколько образцов были отправлены на секвенирование в фирму «Helix» пользователям прибора DNA Sequencer 377 (ABI 377, Applied Biosystems).

Все обнаруженные варианты последовательности, приводящие к изменению рестрикционной карты, подтверждали рестрикционным анализом. Ферментативный гидролиз амплификатов проводили в соответствии с условиями, рекомендованными фирмой-производителем («СибЭнзим», Новосибирск).

Статистическую обработку данных проводили с использованием критериев Стыодента и Фишера.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

В результате проведенной работы идентифицировано четыре мутации и три полиморфизма в 11, 13 и 20 экзонах гена BRCA1. В 5, 19 и 24 экзонах не было обнаружено ни одного изменения нуклеотидной последовательности гена BRCA1.

3.1 Мутация с. 2761deIA.

Мутация была обнаружена у пациентки № 2291 с семейными формами рака молочной железы при проведении SSCP-анализа амплифицированного фрагмента 11 12. Электрофореграмма представлена на рисунке 1.

Рис. 1. Идентификация мутации 2761delA в "" . экзоне 1112 гена BRCA1 с помощью анализа

',....,--' - конформационного полиморфизма однонитевых

фрагментов ДНК. Дорожки:

1 - образцы с нормальной последовательностью, 1 2 2 - образец с мутацией.

Стрелкой указана дополнительная зона однонитевых конформеров у образца с мутацией по сравнению с нормой.

Для разделения нормального и мутантного аллелей было произведено клонирование образца с мутацией. Секвенирование отобранного клона со вставкой мутантного аллеля по методу Сэнджера выявило делецию одного нуклеотида в положении 2761 по кДНК (рис. 2). Согласно международной номенклатуре она была названа 2761delA (c.2761delA). Эта делеция является новой, нигде ранее не описанной.

Рис. 2. Результаты автоматического секвенирования клонированного фрагмента гена BRCA1 с мутацией 2761 delA.

А - измененная последовательность гена BRCAI Б - каноническая последовательность гена BRCA1 Звездочкой (*) в канонической последовательности показан нуклеотид, отсутствующий в секвенированном мутантном аллеле.

При обнаружении новой мутации важно определить ее связь с развитием заболевания. Эта мутация приводит к сдвигу рамки считывания и образованию в

I S I {

' Ч I л Г

,/ fin'

t !' !

f ! I

I! i A ! > H

h И П I

' h

s i

I

N i

A aagaggatgtg

Б aagaggaa'tgtg

положении 892 терминирующего кодона. В результате этого события исчезает большая часть белка, а именно:

1) С-концевой участок белка BRCA1, который отвечает за взаимодействие с такими белками, как р53, RB, HDAC1/HDAC2, BRCA2;

2) большинство сайтов фосфорилирования;

3) область взаимодействия с RAD51 и часть ДНК-связывающего домена.

Это должно приводить к потере многие функции белка BRCA1, ассоциированных к С-концом полипептида: репарации ДНК, активации транскрипции, регуляции клеточного цикла, взаимодействия с другими белками, необходимыми для нормального функционирования клеток.

В мире описано несколько мутаций, приводящих к возникновению стоп-кодона в этой же части гена. Эти мутации связаны с повышенным риском развития злокачественных опухолей, и поэтому мы сделали вывод о том, что и мутация 2761delA предрасполагает к развитию рака молочной железы и яичника.

Данное изменение последовательности гена BRCA1 не приводит к возникновению или исчезновению сайта рестрикции ни для одной из известных эндонуклеаз, поэтому метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов не пригоден для тестирования на наличие данной мутации. Обнаруженная нами делеция 2761delA хорошо идентифицируется методом SSCP-анализа, который может быть использован для быстрого выявления этой мутации.

3.2 Мутация 4146del3 (с. 4146-4148delGAT)

Мутация 4146del3 была идентифицирована у пациентки № 2281 с раком молочной железы и раком яичника при проведении SSCP - анализа амплифицированного фрагмента 11Р гена BRCA1 (рис. 3).

Зоны гомо- и 1 гетеродуплексов

Рис. 3. Идентификация мутации 4I46del3 в экзоне IIP гена BRCA1 с помощью анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК.

Дорожки:

1 - образец с мутацией,

2,3 - образцы с нормальной последовательностью. В правой части рисунка, в виде отдельных иллюстраций, даны увеличенные участки с однонитевыми конформерами. Стрелками указаны дополнительные зоны однонитевых конформеров у образца с мутацией по сравнению с нормой.

Появление гетеродуплексов свидетельствует, как правило, о наличии делеции или инсерции в нуклеотидной последовательности ДНК. Для разделения нормального и мутантного аллеля амплифицированный фрагмент клонировали. Отобранный клон со вставкой мутантного аллеля секвенировали (рис. 4). При анализе последовательности была обнаружена делеция трех нуклеотидов. Согласно международной номенклатуре она была названа 4146del3 (c.4146-4148deIGAT). Поскольку делеция тринуклеотида GAT удаляет из мРНК гена BRCA1 кодон для аспарагиновой кислоты в 1343 положении, эта мутация может быть также названа D1343del.

; 5 Рис. 4. Результаты автоматического секвенирования

1' :

, / | д клонированного фрагмента гена ВИСА! с мутацией

4146-4148(1еЮАТ (4146(1е13, 01343(1е1).

Ц\ /д \/1(|

. ; • ! А - измененная последовательность гена ВЯСА!

I М \ \ к | { | | Б - каноническая последовательность гена ВКСА1

' •.'*,.■. 1 ;-„- Подчеркиванием в канонической последовательности

д ; • I.....с д q д.....т......q.....д.....д" выделен тринуклеотид GAT, отсутствующий в

Б т т т с а ват. g а т g а а секвенированном мутантном аллеле.

В результате данной делеции не происходит сдвига рамки считывания, а исчезает остаток аспарагиновой кислоты в последовательности белка. Изменение аминокислотной последовательности белка может изменить его пространственную укладку и привести к утрате функциональной активности. Подобные делеции, не нарушающие рамки считывания, приводят к не менее тяжелому фенотипу, чем мутации, обрывающие синтез белка, и известны как причина развития многих наследственных заболеваний (муковисцидоза - deltaF508 в гене CFTR (Горбунова, Баранов, 1997), семейной гиперхолестеринемии — G197del в гене рецептора липопротеинов низкой плотности (Mandelshtam et al., 1998) и др.)

Данная мутация не приводит к появлению нового или исчезновению существовавшего сайта ни для одной из известных эндонуклеаз, что делает невозможным использование ПДРФ-анализа в качестве экспресс-метода для ее идентификации. Для диагностики этой мутации может быть применен метод гетеродуплексного анализа с использованием в качестве положительного контроля продукта амплификации ДНК фрагмента IIP носителя мутации.

3.3 Мутация 5382insC (c.5381-5382insC)

Данная мутация была обнаружена у трех пробандов (№№ 5011,5021, 5031) из семи с раком яичника. При анализе продуктов амплификации 20 экзона с помощью электрофореза в образцах ДНК были обнаружены гетеродуплексы, идентичные гетеродуплексу, образующемуся при амплификации ДНК контрольного образца с секвенированной мутацией 5382insC (рис. 5), что свидетельствует о наличии у изученных пациенток той же самой мутации.

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов амплификации 20 экзона гена ВПСА1 в 8% ПААГ. Дорожки:

1 - контрольный образец ДНК с секвенированой мутацией 5382тхС,

2 - образец без мутации,

3-5 - образцы №№ 5011, 5021, 5031 с мутацией 5382ивС.

Ранее в наших исследованиях мутация 53821пбС была обнаружена у 9.3% пробандов с семейными формами рака молочной железы (4/43). Частота встречаемости этой инсерции у пациентов с раком яичника в нашей выборке составил 43% (3/7). Оценивая эти данные можно сказать, что мутация 5382п«С чаще встречается у пациентов с раком яичника, чем с раком молочной железы. Об этом говорит и тот факт, что в группе больных раком яичника из Москвы, исследованных Гейзером и соавторами (Оау1Ьег и др. 1997) частота мутации 5382таС составила 47%.

Мутация 5382т5С, по информации базы данных В1С, является второй по распространенности после 185(1е1АО мутацией, приводящей к сдвигу рамки считывания (536 случаев). Она обнаружена практически во всех исследованных популяциях мира, за исключением афро-американцев. Перрен-Видоз и соавторы (Регпп-У1(1ог с! а1.,2002) показали, что данная мутация не вызывает деградации мРНК, а приводит к синтезу укороченного белка. Вследствие этой мутации в аминокислотной последовательности белка в позиции 1829 образуется стоп-кодон. Интересно, что эта мутация вызывает утрату всего порядка 70 аминокислот на С-конце белка, но, как было показано (81гис\л'^ е1 а1., 1997), является довольно частой причиной заболевания. Таким образом, частично утрачиваются важные для функциональной активности белка повторы В11СТ находящиеся с 1640 по 1863 аминокислоту. Действительно, ВЯСТ-повторы участвуют во взаимодействии с белком ВЯСА2, РНК-геликазой А, белком р53 и 01Р, поэтому их утрата может привести к нарушению процессов репарации ДНК и регуляции клеточного цикла. Кроме того, можно сделать предположение, что любые нонсенс-мутации и мутации, вызывающие сдвиг рамки считывания, приводящие к утрате ВИСТ-повторов, могут стать причиной наследственной предрасположенности к раку молочной железы.

1 2 3 4 5

Для тестирования пациентов на наличие мутации 5382insC наиболее оптимальным является метод гетеродуплексного анализа. Наличие образцов с данной мутацией позволяет использовать этот метод в качестве метода первичного поиска мутации 5382insC в семьях, отягощенных по раку молочной железы и яичника.

3.4 Мутация A622V (с. 1984 A/G)

Миссенс-мутация A622V была обнаружена у пациентки №2321 с семейными формами рака молочной железы при проведении автоматического флуоресцентного SSCP-анализа амплифицированного фрагмента 11Е2 (Рис. 6).

Рис. 6. Идентификация мутации A622V в экзоне 11Е2 гена BRCA1 с помощью автоматизированного флуоресцентного

SSCP-анализа.

Дорожки: 26, 27, 29 - разделение однонитевых конформеров образцов без мутации (норма); 28 - разделение однонитевых конформеров образца с мутацией в гетерозиготном состоянии. Стрелками указано появление пика (полосы) на дорожке 28.

А - разделение однонитевых конформеров в геле (компьютерное представление) Б - компьютерная обработка данных на приборе "ALFExpress"

Прямое секвенирование гетерозиготы показало замену одного нуклеотида в положении 1984 (Рис. 7). В результате мутации кодон GCG для аланииа меняется на триплет GTG, кодирующий валин. Миссенс-мутация A622V была обнаружена при исследовании ДНК больных с семейными формами рака молочной железы у одного пробанда из 50 и не была идентифицирована в группе контроля, состоящей из 100 человек. Замена A622V является известной, имеется пять сообщений о данном

26 27 28 29

.л-^J .........

26

27

28 29

изменении последовательности гена BRCAh причем оно было выявлено только в США и только группой исследователей Myriad Genetics.

['не.7 Результаты автоматического секвйннровпния фрагмента IIE2 гена BRCA1 с Гетерозиготнйй мутацией A622V (обратная нить V-S"),

А -- («метенная иосиедавзтедькоегъ гена &RCA ! Ь каноническая последовательность гена BRGÀ /

В результате дайной мутации в последовательности ДНК исчезает сайт лля эндопуклеазы рестрикции H ha I. Результаты рестрикцио иного анализа, ^пользованного для верификации варианте, представлены щ рисунке 8. Этот ПДРФ-тест может быть использован для Экспресс-диаг ностики носительства мутации A622V.

Рас. 8. Результаты рсстрикниоиного анализа фрагмента 11Е2 гена BRCAI е помощью эндонуклеазы IJha /.

Дорожки: I продукты ферментативного гидролиза амплифпцированпой ДНК пациента гетерозиготного но мутации A622V; 2 - продукты гидролиза образца ДНК без мутации; 3 образец ДНК, не оодаергйутый гидролизу; 4 мзркер молекулярного веса с шатом 100 п.н. Цифрами слева и справа от рисунка указаны размеры фрагментов » п.н. Видно, что в образце с мутацией (дорожка f ) из-за исчезновения сайга узнавания для рестрикгазы ¡íhai сохраняется фрагмент соответствующий полноразмерному продукту амплификации экзона 1IF2 (410 п.н).

A G Т Г с G Т/С G Т А С Т Т EGTTCGCGTAGTT

В настоящее время нет прямых доказательств функциональной значимости такой замены для развития рака. Мы можем только предположить, как повлияет эта замена на функции белка. Влияние миссенс-мутаций, вызывающих аминокислотные замены, зависит от расположения данных замен в последовательности белка. Если аминокислотная замена произошла в функционально важном домене белка, она может привести к утрате его функции, и, как следствие, к развитию заболевания. В нашем случае замена происходит в области взаимодействия белка BRCA1 с белковым комплексом BASC (BRCAl-associated genome-surveillance complex), который служит в качестве сенсора поврежденной ДНК и играет важную роль в репарации ДНК, регуляции транскрипции и контроле прохождения клеточного цикла. Потеря любой из описанных выше функций может быть критической для нормальной жизнедеятельности клетки.

Полиморфизмы P871L (с.2731 ОТ) и S1436S (с. 4427 Т>С)

Два полиморфизма P871L и S1436S были идентифицированы в 11-ом и 13-ом экзонах гена BRCA1 при проведении автоматического флуоресцентного SSCP-анализа. Полиморфизм P871L (с. 2731 ОТ) приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности гена BRCA1, так как кодон CCG кодирует аминокислоту пролин (Pro), a CTG, кодируют лейцин (Leu). Полиморфизм S1436S (с. 4427 Т>С) не приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности гена BRCA1 , так как оба кодона, ТСТ и ТСС, кодируют серии (Ser).

Два описанных выше полиморфизма гена BRCA1, ранее встречались и в других популяциях. База данных Breast Cancer Information Core (BIC) рассматривает эти варианты как неассоциированные с заболеванием. Эти два полиморфных маркера встречались у пациентов одинаково часто, что позволяет предполагать, что они тесно генетически сцеплены, как и многие другие маркеры в гене BRCA1 (Карпухин и др., 2002; Durocher et al., 1996).

3.7 Полиморфизм <33561* (сЛ 186 А/С)

Данный полиморфный вариант был обнаружен по различию электрофоретической подвижности однонитевых конформеров продуктов амплификации фрагмента 11В 11 экзона гена IШСА1 при проведении 88СР-анализа у трех пробандов из группы пациентов славян с семейными формами рака молочной железы и у одного пробанда из группы пациентов с раком яичника (рис.9).

Рис. 9. Идентификация полиморфизма в экзоне 11 В гена ВИСА! с помощью автоматизированного флуоресцентного 85СР-анализа. Дорожки:

1, 2- разделение одноцепочечных конформеров образцов гомозиготных по полиморфизму; 3 - разделение одноцепочечных конформеров образца гетерозиготного по полиморфизму. Видно наличие дополнительных пиков (полос) в гетерозиготном образце ДНК у образца на 3 дорожке (показаны стрелками). А - компьютерная обработка данных на приборе "АЬРЕхргезя"

Б - разделение однонитевых конформеров в геле (компьютерное представление)

Так как картина распределения однонитевых конформеров для четырех образцов была идентичной секвенировали только один из них. Прямое секвенирование продукта ПЦР образца от гетерозиготного пациента показало замену А на в в положении 1186 (Рис. 10)

I I

М/Уа 3

Рис. 10. Результаты автоматического ссквенирования фрагмента I I В жзона 11 гена BRCAI.

А - измененная последовательность гена BRCA I Б - каноническая последовательность гена BRCA I

Полиморфизм с, 1186 A>G приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности гена BRCA 1, так как колон CAG кодирует аминокислоту глутамип (Gln), a CGG, кодирует api ннин (Atg).

В результате и у к л еотидн ой замены появляется сайт для эндонуклйазы рестрикции BspAС L Результаты рестрикционного анализа, использованного для верификации варианта, представлены на рисунке t Í.

Рис. П. Результаты реетрикциоииого анализа фрагмента J Ш гена BRCA i с лерошью эндонуклеазы BspACI.

Дорожки: I продукты гидролиза

ам плкфн циро ван ной Д1IK гетерозиготного но полиморфизму Q356R пациента; 2 фрагмент Д1IK, не подвергнутый гидролизу; 3 продукты гидролиза фрагмента ДНК без мутации; 4 - маркер молекулярного веса е тагом 100 п,н. Цифрами слева и справа от рисунка указаны размеры фрагментов в и.к. Видно, что в образце с мутацией (дорожка I) из-за появлений сайта узнавания для реетриктазы BspACI образуются дна дополнительны?; фрагмента 72 и 179 п.н.

В результате <цмены аминокислота глутамип с полярной незаряженной R-групиой меняется на аргиннн с положительно заряженной R-группой. Подобное изменение аминокислотной последовательнее™ белка может серьезно повлиять на его пространственную укладку и функциональную активность. В связи с чтим возник

А ДАТ A A G С G'A G А А А С Б А А ТА A. GCAGAAAC

вопрос, является ли полиморфизм <335611 ассоциированным с заболеванием. В базе данных В1С нет однозначной информации об этом изменении последовательности гена ВЯСА1. Имеются сообщения о том, что полиморфизм (235611 ассоциирован с семейной историей рака яичника (.Гапегю е1 а1., 1999) или РМЖ (Наф'^аууав е1 а1., 2002, 2004), а также указания на то, что он не ассоциирован с повышенным риском РМЖ. При скрининге группы контроля, состоящей из 75 человек, у 7 была обнаружена миссенс-мутация <335611 в гене ВИСА! (табл. 1). Для данного полиморфизма было проведено сравнение частот встречаемости отдельных аллелей в группе больных и группе контроля на основании критерия Фишера и критерия Стьюдента. Было показано, что при уровне значимости р = 0.05 не выявлено достоверных различий по частоте встречаемости отдельных аллелей между группами больных и контроля.

Наши данные свидетельствуют о том, что замена 0)35611 является частым вариантом (полиморфизмом, а не мутацией), и не ассоциирована с заболеванием.

Таблица 1. Частота встречаемости аллелей в группах больных и контроля.

Название полиморфизма Аллель Группа больных с РМЖ и РЯ (п=33) Группа контроля (п=75)

Q356R A 0.94 0.95

G 0.06 0.05

F = 0.09 < Fp = о.о5 = 4.0 (при df, = 1; df2 = 214) t= 1.54 <tp = 0.05 = 1.96 (df > 30)

3.8 Поиск мутаций в 5,19 и 24 экзонах гена BRCA1

В настоящее время по данным BIC известно 44 различных мутаций в 5 экзоне гена BRCA1. Одна из наиболее распространенных мутаций в Польше (C61G) (Gorski et al., 2000; Grzybowska et al., 2000; van der Looij et al., 2000; Perkowska et al., 2003) локализована в пределах именно этого экзона. Также эта мутация была найдена в Латвии с достаточно высокой частотой (8.7%) (Csokay et al., 1999). Ранее в нашей работе скрининг пятого экзона гена BRCA1 был проведен методами гетеродуплексного анализа и SSCP-анализа (разделение в трис-глициновой системе), но не было идентифицировано ни одного изменения последовательности ДНК. Возможно, этот факт свидетельствует об отсутствии мутаций в последовательности 5

экзона гена В11СА1 у больных семейными формами рака молочной железы, но также может быть связано и с недостатками методов, использованных в работе. В связи с этим мы произвели скрининг всех образцов нз коллекции ДНК на наличие мутационных изменений в 5 экзоне с помощью высокочувствительного метода автоматического флуоресцентного ЭЗСР-анализа, но также не обнаружили ни одного случая изменения нуклеотидной последовательности. Этот факт свидетельствует об отсутствии мутаций в последовательности пятого экзона гена ВЯСА1 у больных семейными формами рака молочной железы и яичника в Санкт-Петербурге в нашей выборке. В 19 и 24 экзонах гена ВЯСА1 по данным В1С известно 34 различные мутации. В ходе данного исследования ни одного изменения нуклеотидной последовательности в этих экзонах не обнаружено.

3.9 Заключение.

В результате исследования было проанализировано 17 фрагментов гена ВЯСА1 у 43 больных с семейными формами рака молочной железы и 7 больных с раком яичника, а также в некоторых случаях, у группы контроля и идентифицировано 7 различных вариантов последовательности гена В11СА1. Четыре варианта, исходя из их частоты, мы охарактеризовали как мутации, остальные три являются известными ранее полиморфизмами. Две мутации (2761с1е1А, 4146с1е13) обнаружены впервые в мире и никем ранее не описаны, являются вариантами, предрасполагающими к развитию РМЖ.

В течение нескольких лет работы по изучению спектра мутаций в гене ВЯСА1 у больных с семейными формами рака молочной железы и яичника суммарно было идентифицировано 10 мутаций у 17 пациентов из 50 исследованных (34%). Такой результат сравним с результатами, полученными в других странах Европы и регионах России, где процент семей с функционально значимыми мутациями варьировал от 10 до 42% (Табл. 2). Другой аспект при рассмотрении идентифицированных мутаций -их классификация по типам. Большинство (64%) обнаруженных мутаций приводят к сдвигу рамки считывания и преждевременной терминации трансляции мРНК гена ВЯСА1. Подобные изменения последовательности гена В11СЛ1 связаны с повышенным риском развития рака молочной железы. Остальную часть спектра составили миссенс-мутации и неклассифицированные варианты мутаций. Полученное

на основе наших российских данных распределение совпадает с распределением мутаций по типам в мире по материалам базы данных Breast Cancer Information Core (BIC).

Таблица 2. Доля семей высокого риска развития рака молочной железы с мутациями в ВЕСА- генах.

Популяция Доля семей с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 Ссылка

Бельгия 33% (14/42) Goelen et al., 1999

Западная Швеция 42% (26/62) Einbeigi et al., 2001

Испания 25% (8/32) Osorio et al., 2000

Турция 10% (20/199) Manguoglu et al., 2003

Томск 16% (4/25) Tereshenko et al., 2002

Санкт-Петербург* 34% (17/50) Грудинина и др., 2005 Тихомирова и др., 2007

* в Санкт-Петербурге искали мутации только водном гене - BRCAI.

ВЫВОДЫ.

1. У больных семейными формами рака молочной железы и яичника идентифицированы четыре мутации в гене ВЯСА1: 5382тзС, 2761с1е1А, 4146с1е13 и А622У. Как вероятная причина развития РМЖ рассматриваются делеции 276Ые1А и 4146(1е13, описанные впервые в мире.

2. При семейных формах рака яичника в Санкт-Петербурге мажорной мутацией в гене ВЯСА1 является мутация 5382тзС в 20-м экзоне гена. Встречаемость этой мутации у больных семейными формами рака яичника выше, чем у больных семейными формами рака молочной железы.

3. Миссенс-мутация 0356Я не ассоциирована с повышенным риском заболевания и должна рассматриваться как нейтральный полиморфный вариант, что показано впервые в России.

4. Варианты последовательности Р871Ь и 814368, обнаруженные в этом исследовании, не ассоциированы с повышенным риском развития РМЖ в Санкт-Петербургской популяции, как и в других популяциях мира.

5. Методы гетеродуплексного, рестрикционного и SSCP-анализа являются простыми и удобными для быстрого скрининга мутаций гена BRCA1, идентифицированных в данном исследовании.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. H.A. Грудинина, В.И.Голубков, О.С. Тихомирова, Т.В. Брежнева, К.П. Хансон, В.Б. Васильев, М.Ю.Мандельштам. Преобладание широко распространенных мутаций в гене BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы Санкт-Петербурга.// Генетика. 2005.Т.41 №2. С. 405-410.

2. О.С. Тихомирова, H.A. Грудинина, В.И.Голубков, М.Ю. Мандельштам, В.Б. Васильев. Новые мутации в гене BRCA1 у пациентов с раком молочной железы из Санкт-Петербурга./Генетика, 2007, том 43, № 9. С. 1263-1268.

3. О.С. Тихомирова, H.A. Грудинина, М.Ю. Мандельштам, В.Б. Васильев. Этнические особенности спектров мутаций в гене BRCA1 и их использование для диагностики предрасположенности к раку молочной железы./ Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. Выпуск 11, 2007.

4. H.A. Грудинина, В.И.Голубков, О.С. Тихомирова, Т.В. Брежнева, К.П. Хансон, В.Б. Васильев, М.Ю.Мандельштам. Идентификация мутаций в гене BRCA1 у больных раком молочной железы Санкт-Петербурга.// Вестник Российского научного центра реитгенорадиологии Минздрава России, 2004, №3, http://vestnik.mcrr.ru/

5. Мандельштам М.Ю., Грудинина H.A., Тихомирова О.С., Голубков В.И., Брежнева Т.В., Хансон К.П., Васильев В.Б. Мутации гена BRCA1 у онкологических больных Санкт-Петербурга: преобладают широко распространенные мутации.// Всероссийская научно-практическая конференция «Современные достижения клинической генетики», Тезисы докладов, 2003. - С. 427.

6. Грудинина H.A., Тихомирова О.С. Идентификация мутаций, вызывающих терминацию трансляции мРНК гена BRCA1, у больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге.// 7-ая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье", Тезисы докладов, 2004.-С. 166.

7. Грудинина H.A., Тихомирова О.С., Голубков В.И., Брежнева Т.В., Хансон К.П., Мандельштам М.Ю., Васильев В.Б.. Мутации гена BRCA1, найденные у онкологических больных Санкт-Петербурга, приводят к нарушению трансляции.// Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития ,2004, том II, стр. 81.

8. Тихомирова О.С., Грудинина H.A.. Идентификация делеций в 11 экзоне гена BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы города Санкт-Петербурга.// Юбилейная научная конференция молодых ученых Северо-Западного региона, посвященная 60-летию Российской академии медицинских наук. Тезисы докладов, 2004.

9. Тихомирова О.С., Грудинина H.A.. Идентификация делеций В 11 экзоне гена BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы города Санкт-Петербурга.// Научная конференция молодых ученых, Тезисы докладов, Одесса, 2004.

10. О.С. Тихомирова, H.A. Грудинина, М.Ю. Мандельштам, В.И.Голубков, Т.В. Брежнева, К.П. Хансон, В.Б. Васильев. Разнообразие мутаций в гене BRCAI у

больных семейными форами рака молочной железы Санкт-Петербурга.// Петровские чтения-2005, "Конференция по фундаментальной онкологии", сборник тезисов, 2005.

11. О.С. Тихомирова, H.A. Грудинина, В.И. Голубков, Т.В. Брежнева, В.Б.Васильев, К.П. Хансон, М.Ю. Мандельштам. Мутации гена BRCA1, обнаруженные у больных семейными формами рака молочной железы Санкт-Петербурга.// Медицинская генетика, том 4, №6, 2005.

12. О.С. Тихомирова, H.A. Грудинина, В.И. Голубков, Т.В. Брежнева, М.Ю. Мандельштам, К.П. Хансон, В.Б.Васильев. Анализ спектра мутаций гена BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы города Санкт-Петербурга указывает на эффект основателя.// Биотехнология и онкология, сборник тезисов, 2005.

13. О.С. Тихомирова, H.A. Грудинина, В.И.Голубков, Т.В. Брежнева, К.П. Хансон, В.Б. Васильев, М.Ю. Мандельштам. Тестирование мутаций гена BRCA1 при семейных формах: новые горизонты в молекулярной онкологии./ Петровские чтения-2006, "Конференция по фундаментальной онкологии", сборник тезисов, 2006.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 15.08.2007. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 1828Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: 550-40-14

Тел./факс: 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тихомирова, Оксана Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цель работы

Задачи

Научная новизна

Теоретическая и практическая значение работы

Положения, выносимые на защиту

Апробация работы

Личный вклад диссертанта

Структура и объем диссертации

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Статистика заболеваемости раком молочной железы

1.2 Риск развития рака молочной железы у носительниц мутаций в гене 12 BRCA1 в течение жизни.

1.3 Особенности семейных форм рака молочной железы

1.4 Возможные механизмы развития рака при мутациях в генах 14 опухолевых супрессоров.

1.5 Тканеспецифичность проявления мутаций в гене BRCA

1.6 Другие заболевания, связанные с мутациями в генах BRCA 1 и 18 BRCA

1.7 Роль гена BRCA 1 в развитии рака молочной железы в 19 сопоставлении с другими генами.

1.8 Наследственная предрасположенность к раку молочной железы

1.9 Структура гена и белка BRCA

1.10 BRCA1 и репарация ДНК

1.11 Роль BRCA1 в регуляции транскрипции

1.12 Роль BRCA1 в росте и дифференцировке клеток

1.13 Мутации гена BRCA

1.14 Спектр мутаций в гене BRCA1 в разных популяциях

1.15 Поиск мутаций в гене BRCA 1 в России 41 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47 2.1 Пациенты

2.2.1 Выделение ДНК из свежей и замороженной крови по методу 47 Кюнкеля

Выделение ДНК из свежей крови

Выделение ДНК из замороженной крови

2.2.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.2.3 Полимеразная цепная реакция

2.2.4 Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле

2.2.5 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях

2.2.6 Гетеродуплексный анализ 56 2.2.7. Рестрикционный анализ

2.2.8 Окрашивание образцов ДНК 57 2.2.8.1 Окрашивание бромистым этидием 57 2 2.8.2 Окрашивание нитратом серебра

2.2.9 Клонирование

2.2.9.1 Лигирование

2.2.9.2 Трансформация E.coli

2.2.10 Тестирование трансформантов путём а - комплементации

2.2.11 Идентификация рекомбинантов путем амплификации 63 клонированных последовательностей.

2.2.12 Выделение плазмидной ДНК

2.2.13 SSCP-анализ (разделение в трис-глициновой системе)

2.2.14 Автоматический флуоресцентный SSCP-анализ

2.2.15 Секвенирование ДНК

2.2.16 Компьютерный анализ и статистическая обработка данных 68 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Мутация 2761 del А (с.2761 del А)

3.2 Мутация 4146del3 (с. 4146-4148delGAT)

3.3 Мутация 5382insC (c.5381-5382insC)

3.4 Мутация A622V (с. 1984 A/G)

3.5 Полиморфизм P871L (с.2731 ОТ)

3.6 Полиморфизм S1436S (с.4427Т>С)

3.7 Полиморфизм Q356R (с.1186 A/G)

3.8 Поиск мутаций в 5, 19 и 24 экзонах гена BRCA

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярный анализ гена BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы и яичника в Санкт-Петербурге"

Актуальность проблемы.

Среди онкологических заболеваний рак молочной железы (РМЖ) является второй по частоте причиной смертности в развитых странах мира, в том числе и в России. Женщины в возрасте 40-59 лет чаще умирают от РМЖ, чем от других злокачественных новообразований. В нашей стране наблюдается тенденция к росту распространенности рака молочной железы из года в год и к снижению возраста, в котором возникает заболевание. Санкт-Петербург является "неблагополучным" районом России по уровню заболеваемости и смертности от данной формы онкопатологии (Аксель, Давыдов, 2002). За последние 25 лет заболеваемость РМЖ в Санкт-Петербурге возросла примерно на 150%.

От 5 до 10% всех случаев РМЖ составляют семейные формы, из которых лучше всего охарактеризованы и наиболее часто встречаются случаи, когда прослеживается связь заболевания с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. Несмотря на то, что частота встречаемости патологических мутаций в гене BRCA1 оценивается как 1:800 - 1:2000 (Баранов и др., 2000), эти случаи привлекают внимание онкологов как высокопенетрантные заболевания, приводящие к гибели пациентов в существенно более раннем (часто в детородном) возрасте, нежели формы рака без сильно выраженной семейной предрасположенности. Поскольку эффективность терапии и хирургии определяется в значительной степени тем, насколько рано выявлено заболевание, идентификация носителей мутаций в гене BRCA1 и последующее диспансерное наблюдение за этими лицами позволяет спасти им жизнь. Проведенные в США исследования на группе из 251 здоровых женщин с типированными мутациями в генах семейства BRCA в течение немногим более двух лет показали эффективность полугодичных осмотров для максимально раннего выявления и удаления опухолей (Scheuer et al., 2002).

В настоящее время в мире известно более 1200 мутаций в гене BRCA1 (Breast Cancer Information Core, BIC). Встречаемость вариантов последовательности гена BRCA1 сильно отличается между разными популяциями и этническими группами, и в каждом регионе есть свои наборы мажорных и минорных мутаций, предрасполагающих к заболеванию. Поэтому только знание национальных и этнических особенностей спектров мутаций может позволить наладить ДНК-диагностику для выявления группы высокого риска развития рака молочной железы. Эффективность лечения рака молочной железы во многом зависит от своевременной диагностики. ДНК-диагностика позволяет выявить предрасположенность к РМЖ и осуществить постановку на учет к онкологу еще до возникновения клинических проявлений заболевания. В связи с постоянным ростом заболеваемости РМЖ проблема ранней диагностики приобретает чрезвычайную актуальность.

Цель работы

Целью работы было изучение спектра мутаций гена BRCA1 у больных семейными формами РМЖ и РЯ из числа жителей Санкт-Петербурга.

Задачи

1. Осуществить поиск мутаций в 5-м, 11-м, 13-м, 19-м и 24-м экзонах гена BRCA1 пациентов с семейными формами РМЖ и рака яичников (РЯ) методами гетеродуплексного анализа и анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP-анализа);

2. Изучить встречаемость мутации 5382insC в 20-м экзоне гена BRCA1 у пациентов с раком яичника.

3. Идентифицировать обнаруженные мутации методом секвенирования ДНК.

4. Разработать быстрые методы детекции обнаруженных мутаций.

Научная новизна

У больных с семейными формами рака молочной железы и яичника в Санкт-Петербурге идентифицировано четыре мутации в гене BRCA1: 5382insC, 2761 del A, 4146del3 и A622V. Мутация 5382insC выявлена более чем у трети обследованных больных с раком яичника. Две мутации 2761 del А и 4146del3, обнаруженные в настоящей работе, являются новыми, никем ранее в мире не описанными. Их идентификация свидетельствует о том, что значительная доля мутаций гена BRCA 1 в России придется на неизвестные в мире мутации. Впервые в России обнаружена миссенс-мутация Q356R и показано, что она является редким полиморфным вариантом, не ассоциированным с заболеванием. В Санкт-Петербурге впервые выявлены два сцепленных друг с другом полиморфизма (S1436S, P871L), ранее известных во многих странах мира, и определена частота аллелей этих полиморфных маркеров.

Теоретическая и практическая значение работы.

В результате работы выявлены новые мутации в гене BRCA1, характерные только для Санкт-Петербурга, а также показано, что миссенс-мутация Q356R является редким полиморфным вариантом, не ассоциированным с заболеванием. Эти данные следует учитывать при проведении ДНК - диагностики для выявления групп высокого риска развития рака молочной железы и рака яичника. Для всех обнаруженных нами мутаций разработаны методы экспресс-диагностики, которые могут быть использованы для генетического консультирования в семьях больных семейными формами РМЖ, а также для выявления предрасположенности к этому заболеванию в популяционных исследованиях. Теоретическим выводом из работы является установленная специфика спектра мутаций гена BRCA1 на Северо-Западе России.

Положения, выносимые на защиту.

1. В Санкт-Петербургской популяции в гене BRCA1 распространены как известные в других популяциях мира мутации, так и специфичные для России.

2. Значительная доля семейных случаев рака яичника в Санкт-Петербургской популяции может быть связана с носительством мутации 5382insC в 20-м экзоне гена BRCA1.

3. Из числа идентифицированных изменений последовательности гена BRCA1 некоторые, такие как 2761 del A, 4146del3, являются вероятной причиной предрасположенности к РМЖ, а другие варианты, такие как Q356R, P871L и S1436S, не ассоциированы с повышенным риском развития заболевания.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ в отечественных журналах, а также в сборниках по материалам конференций. Материалы работы докладывались на следующих конференциях: 7-ая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2004), юбилейная научная конференция молодых ученых Северо-Западного региона, посвященная 60-летию Российской академии медицинских наук (Санкт-Петербург, 2004), Петровские чтения-2005, 2006 "Конференция по фундаментальной онкологии" (Санкт-Петербург, 2005, 2006), "Молекулярная генетика онкологических заболеваний" (Новосибирск, 2007). В полном объеме диссертация заслушана на семинаре Отдела молекулярной генетики ГУ НИИЭМ РАМН.

Личный вклад диссертанта.

Диссертантом лично выполнены все исследования, описанные в работе, за исключением секвенирования нескольких образцов, которое проводилось в фирме «Helix».

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждений, выводов, списка литературы. Текст диссертации иллюстрирован 26 рисунками и 9 таблицами. Список литературы включает 119 источников, из них 13 отечественных и 106 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тихомирова, Оксана Сергеевна

выводы.

1. У больных семейными формами рака молочной железы и яичника идентифицированы четыре мутации в гене BRCA1: 5382insC, 2761 del А, 4146del3 и A622V. Как вероятная причина развития РМЖ рассматриваются делеции 2761 del А и 4146del3, описанные впервые в мире.

2. При семейных формах рака яичника в Санкт-Петербурге мажорной мутацией в гене BRCA1 является мутация 5382insC в 20-м экзоне гена. Встречаемость этой мутации у больных семейными формами рака яичника выше, чем у больных семейными формами рака молочной железы.

3. Миссенс-мутация Q356R не ассоциирована с повышенным риском заболевания и должна рассматриваться как нейтральный полиморфный вариант, что показано впервые в России.

4. Варианты последовательности P871L и S1436S, обнаруженные в этом исследовании, не ассоциированы с повышенным риском развития РМЖ в Санкт-Петербургской популяции, как и в других популяциях мира.

5. Методы гетеродуплексного, рестрикционного и SSCP-анализа являются простыми и удобными для быстрого скрининга мутаций гена BRCA1, идентифицированных в данном исследовании.

3.9 Заключение.

В результате исследования было проанализировано 17 фрагментов гена BRCA1 у 43 больных с семейными формами рака молочной железы и 7 больных с раком яичника, а также в некоторых случаях, у группы контроля и идентифицировано 7 различных вариантов последовательности гена BRCA1.

Четыре варианта, исходя из их частоты встречаемости, мы охарактеризовали как мутации, остальные три являются известными ранее полиморфизмами. Две мутации (2761 delA, 4146del3) обнаружены впервые в мире и никем ранее не описаны, являются вариантами, предрасполагающими к развитию РМЖ.

В течение нескольких лет работы по изучению спектра мутаций в гене BRCA1 у больных с семейными формами рака молочной железы и яичника суммарно было идентифицировано 10 мутаций у 17 пациентов из 50 исследованных (34%) (43 пробанда с раком молочной железы и 7 с раком яичника) (Рис.3.17А). Такой результат сравним с результатами, полученными в других странах Европы и регионах России, где процент семей с функционально значимыми мутациями варьировал от 10 до 42% (Табл. 3.3). Другой аспект при рассмотрении идентифицированных мутаций - их классификация по типам (Рис.3.17Б). Большинство (64%) обнаруженных мутаций приводят к сдвигу рамки считывания и преждевременной терминации трансляции мРНК гена BRCA1. Подобные изменения последовательности гена BRCA1 связаны с повышенным риском развития рака молочной железы. Остальную часть спектра составили миссенс-мутации и неклассифицированные варианты мутаций. Полученное на основе наших российских данных распределение совпадает с распределением мутаций по типам в мире по материалам базы данных Breast Cancer Information Core (BIC).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тихомирова, Оксана Сергеевна, Санкт-Петербург

1. ЬАйала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика, (в Зх томах)// (1988) Москва, Мир т.З.

2. Аксель Е.М., Давыдов М И. Статистика заболеваемости и смертности от злокачественных образований в 2000 году.// Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2000 году (2002) 85-106.

3. Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности». (Введение в предиктивную медицину).// (2000) СПб:Интермедика.

4. Баранова А.В., Янковский Н.К. Гены супрессоры опухолевого роста.// Молекулярная Биология (1998) т. 32, № 2. с. 206-218.

5. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний.// Санкт-Петербург: Специальная литература (1997) 286

6. Грудинина Н.А, Голубков В.И.,. Тихомирова О.С. и др. Преобладание широко распространенных мутаций в гене BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы Санкт-Петербурга.// Генетика. (2005) 41(3):405—410.

7. Карпухин А.В., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н. и др. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в гене BRCA1 при наследственно обусловленном раке молочной железы и яичников.// Доклады академии наук (2002) 383(5):706-709.

8. Лакин Г.Ф. Биометрия //(1973) Москва: Высшая школа.

9. Мандельштам М.Ю., Голубков В.И., Ламбер Е.П. и др. Поиск часто встречающихся мутаций в генах предрасположенности к раку молочной железы.// Генетика (2001) 37( 12): 1681 -1686.

10. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.// Москва: Мир (1984) 480 с.

11. П.Остерман JI. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование.// Москва:Наука (1981) с. 131-135.

12. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии.// СПб: Изд-во СПбГТУ (1999) 522 с.

13. Тихомирова О.С., Грудинина Н.А., Голубков В.И., Мандельштам М.Ю., Васильев В.Б. Новые мутации в гене BRCA1 у пациентов с раком молочной железы из Санкт-Петербурга.//Л?«егаика, (2007) 43(9).

14. Anderson S.F., Schlegel В.Р., Nakajima Т., Wolpin E.S., Parvin J.D. BRCA1 protein is linked to the RNA polymerase II holoenzyme complex via RNA helicase.// A. Nat. Genet. (1998) 19:254-256.

15. Antoniou A.C., Gayther S.A., Stratton J.F. et al. Risk models for familial ovarian and breast cancer // Genet. Epidemiol. 2000. - Vol. 18, N 2. - P. 173 — 190.

16. Arason A., Barkardottir R.B., Egilsson V. Linkage analysis of chromosome 17q markers and breast-ovarian cancer in Icelandic families, and possible relationship to prostatic cancer. Am. J. Hum. Genet. (1993) 52: 711-717.

17. Arver В., Quan Du., Chen J. et al., Hereditary breast cancer: a review //Cancer biology, Vol. 10, 2000: pp. 271-288

18. Backe J., Hofferbert S., Skawran В., et al: Frequency of BRCA1 mutation 5382insC in German breast cancer patients.// Gynecol. Oncol. (1999) 72:402406.

19. Balci A., Huusko P., Paakkonen K. et al. Mutation analysis of BRCA1 and BRCA2 in Turkish cancer families: a novel mutation BRCA2 3414deI4 found in male breast cancer.// Eur. J. Cancer (1999) 35(5):707-10.

20. Baudi F., Quaresima В., Grandinetti C. et al. Evidence of a Founder Mutation of BRCA1 in a highly homogeneous population from Southern Italy with breast/ovarian cancer.// Human Mutation:Mutation in Brief #431 (2001) Online.

21. Bell G.I., Karam J.H., Rutter W.J. Polymorphic DNA region adjacent to the 5'-end of the human insulin gene.// Proc. Natl. Acad. Sci. (1981) 78: 57595763.

22. Beller U, Halle D, Catane R et al. High frequency of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Ashkenazi Jewish ovarian cancer patients, regardless of family history.// Gynecol. Oncol. (1997) 67(2):123-126.

23. BIC (Breast Cancer Informational Core): http://www.nhgri.nih.gov/Intramural research/Lab transfer/Bic/

24. Bork P., Hofmann K., Bucher P., Neuwald A.F., Altschul S.F., Koonin E.V. A superfamily of conserved domains in DNA damage-responsive cell cycle checkpoint proteins. UFASEB J. (1997) 11:68-76.

25. Callebaut I., Mornon J.P. From BRCA1 to RAP1: a widespread BRCT module closely associated with DNA repair. IIFEBSLett. (1997) 400:25-30;

26. Chen C.F., Li S., Chen Y., Chen P.L., Sharp Z.D., Lee W.H. The nuclear localization sequences of the BRCA1 protein interact with the importin-a subunit of the nuclear transport signal receptor. HJ. Biol. Chem. (1996(a)) 271:32863-32868.

27. Chen Y., Farmer A.A., Chen C.F., Jones D.C., Chen P.L., Lee W.H. BRCA1 is a 220 kDa nuclear phosphoprotein that is expressed and phosphorylated in a cell cycle dependent manner. I I Cancer Res. (1996(6)) 56:3168-3172.

28. Chen Y., Lee W.-H., Chew H.K. Emerging roles of BRCA1 in transcriptional regulation and DNA repairЛ J. of Cellular Physiology (1999) 181:385-392.

29. Claes K., Machackova E., De Vos M., et. al. Mutation analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in the Belgian patient population and identification of a Belgian founder mutation BRCA1 IVS5 + ЗА > G.// Dis. Markers (1999) 15:69-73.

30. Claus E.B.; Risch N.; Thompson W.D. Genetic analysis of breast cancer in the cancer and steroid hormone study.// Am. J. Hum. Genet. (1991) 48: 232242.

31. Claus E.B., Schildkraut J.M., Thompson W.D., Risch N.J. The genetic attributable risk of breast and ovarian cancer.// Cancer (1996) 77:2318-2324.

32. Csokay В., Tihomirova L., Stengrevics A., Sinicka 0., Olah E. Stron g founder effects in BRCA1 mutation carrier breast cancer patients from Latvia.// Human Mutation:Mutation in Brief #2585 (1999) Online.

33. Dufault M.R., Betz В., Wappenschmidt B. et al. Limited relevance of the СНЕК2 gene in hereditary breast cancer // Int. J. Cancer. 2004. - Vol. 110, N 3.-P. 320-325.

34. Durocher F., Tonin P., Shattuck-Eidens D., Skolnick M., Narod S.A., Simard J. Mutation analysis of the BRCA1 gene in 23 families with cases of cancer of the breast, ovary, and multiple other sites.// J. Med. Genet. (1996) 33(10):814-819.

35. Easton D.F., Bishop D.T., Ford D., Crockford G.P. Genetic linkage analysis in familial breast and ovarion cancer: results from 214 families. The Breast Cancer Linkage Consortium Л Am. J. Hum. Genet. (1993) 52:678-701.

36. Einbeigi Z., Bergman A., Kindblom L.G. et al. A founder mutation of the BRCA1 gene in Western Sweden associated with a high incidence of breast and ovarian cancer Л Eur. J. Cancer. (2001) 37(15):1904-1909.

37. Erkko H., Xia В., Nikkila J. et al. A recurrent mutation in PALB2 in Finnish cancer families.// Nature (2007) 446:316-319

38. Evans D.G., Howell A. Are BRCA1- and BRCA2-related breast cancers associated with increased mortality? // Breast Cancer Res. (2004) 6:8-17.

39. Fan S., Wang J., Yuan R., Ma Y., Meng Q., Erdos M.R., Pestell R.G., Yuan F., Auborn K.J., Goldberg I.D., Rosen E.M. BRCA1 inhibition of estrogen receptor signalling in trsncfected cells Л Science (1999) 284:1354-1356.

40. Fodor F.H., Weston A., Bleiweis I.J. et al. Frequency and carier risk associated with common BRCA1 and BRCA2 mutations in Ashkenazi Jewish breast cancer patients II Am. J. Hum. Genet. (1998) 63:45-51.

41. Friedman L.S., Ostermeyer E.A., Szabo C.I. et al. Confirmation of BRCA1 by analysis of germline mutations linked to breast and ovarian cancer in ten families.// Nature Genet. (1994) 8:399-404.

42. Gayther S.A., Harrington P., Russell P. et al. Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia.// Am. J. Human. Genet. (1997) 5:1239-1242.

43. Gayther S.A., Russell P., Harrington P. et al. The contribution of germline BRCA1 and BRCA2 mutations to familial ovarian cancer: no evidence for other ovarian cancer-susceptibility genes.// Am. J. Hum. Genet. (1999) 65:1021-1029.

44. Goelen G., Teugels E., Bonduelle M. et al. High frequency of BRCA1/2 germline mutations in 42 Belgian families with a small number of symptomatic subjects.// J. Med. Genet. (1999) 36(4):304-308.

45. Gorski В., Byrski Т., Huzarski T.et al. Report founder mutations in the BRCA1 gene in Polish families with breast-ovarian cancer.// Am. J. Hum. Genet. (2000) 66:1963-1968.

46. Gowen L.C., Johnson B.L., Latour A.M. et al. Brcal deficiency results in early embryonic lethality characterized by neuroepithelial abnormalities.// Nature Genet. (1996) 12:191-194.

47. Greenman J., Mohammed S., Ellis D. et. al. Identification of missens and truncating mutations in the BRCA1 gene in sporadic and familial breast and ovarian cancer.// Genes, Chrom. and Cancer (1998) 21:244-249

48. Grzybowska E., Zientek H., Jasinska A. et al. High frequency of recurrent mutations in BRCA1 and BRCA2 genes in Polish families with breast and ovarian cancer // Hum. Mutat. (2000) 16(6):482-490.

49. Hadjisawas A., Adamou A., O'Dowdphanis C. et al. Q356R and S1512I are BRCA1 variants that may be associated with breast cancer in a Cypriot family.// Oncology reports (2002) 9:383-366.

50. Hakem R., de la Pompa J.L., Sirard C. et al. The tumor suppressor gene Brcal is required for embryonic cellular proliferation in the mouse.// Cell (1996)85:1009-1023.

51. Hall J.M., Lee M.K., Newman B. et al. Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21.// Science (1990) 250:1684-1689.

52. Harkin P.D., Bean J.M., Miklos D.et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.// Cell (1999) 97:575-586.

53. Hilakivi-Clarke L. Estrogens, BRCA1, and breast cancer. Cancer Res. (2000) 60(18):4993-5001.

54. Huusko P. Predisposing genes in hereditery breast and ovarian cancer.

55. Oulun Yliopisto, Oulu (1999) Сhttp://herkules.oulu.fi/issn03553221/)

56. Isaacs S.D.; Kiemeney L.A.L.M.; Baffoe-Bonnie A.et al. Risk of cancer in relatives of prostate cancer probands.// J. Nat. Cancer Inst. (1995) 87: 991-996.

57. Janezic S.A, Ziogas A, Krumroy L.M. et al. Germline BRCA1 alterations in a population-based series of ovarian cancer cases.// Hum. Molec. Genet. (1999) 8:889-897.

58. Jasin M. LOH and Mitotic recombination.// DNA Alternations in cancer. Ed. Ehrlich M. (2000) Eaton Publishing:Natick, MA.

59. Jacquemier J, Lidereau R, Birnbaum D. et al. Assessing the risk of BRCAl-associated breast cancer using individual morphological criteria // Histopathol. (2001) 38:378-379.

60. Jasinska A, Krzyzosiak W.J. Prevalence of BRCA1 founder mutations in Western Poland.// Human Mutation:Mutation in Brief #389 (2000) Online.

61. Kauff N.D, Perez-Segura P, Robson M.E. et al. Incidence of non-founder BRCA1 and BRCA2 mutations in high risk Ashkenazi breast and ovarian cancer families.///, of Medical Genet. (2002) 39:611-614.

62. King M.-C, Marks J.H., Mandell J.B, New York Breast Cancer Study Group. Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2 // Science (2003) 302(5645):643-646.

63. Koonin E.V, Altschul S.F, Bork P. BRCA1 protein products: functional motifs.// Nature Genet. (1996) 13:266-267.

64. Krainer M., Silva-Arrieta S, Fitzgerald M.G. et al. Differential contributions of BRCA1 and BRCA2 to early-onset breast cancer.// New Eng. J. Med. (1997) 336:1416-1421.

65. Kunkel L.M, Smith K.D, Boyer S.H. et al. Analyses of human Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74:1245-1249.

66. Lakhani S.R., Jacquemier J., Sloane J.P. et al. Multifactorial analysis of differences between sporadic breast cancers and cancers involving BRCA1 and BRCA2 mutations //J. Natl. Cancer. Inst. (1998) 90(15): 1138-1145.

67. Langston, A. A.; Malone, К. E.; Thompson, J. D. et al. BRCA1 mutations in a population-based sample of young women with breast cancer.// New Eng. J. Med. (1996) 334: 137-142.

68. Levitt N.C., Hickson I.D. Caretaker tumour suppressor genes that defend genome integrity .//TRENDS in Molecular Medicine (2002) 8(4):179-186.

69. Levy-Lahad E., Catane R., Eisenberg Sh. et. al. Found er BRCA1 and BRCA2 mutations in Ashkenazi Jews in Israel: Frequency and differential penetrance in ovarian cancer and in breast-ovarian families.// Am. J. Human. Genet. (1997) 60:1059-1067.

70. Li S., Chen P.L., Subramanian T. et al. Binding of CtIP to the BRCT repeats of BRCA1 involved in transcription regulation of p21 is disrupted upon DNA damage.// J. Biol. Chem. (1999) 274:11334-11338.

71. Liu C.Y., Flesken- Nikitin A., Li S. et al. Inactivation of the mouse Brcal gene leads to failure in the morphogenesis of the egg cylinder in early postimplantation development.// Genes Dev. (1996) 10:1835-1843.

72. Lu M., Conzen S.D., Cole C.N., Arrick A. Characterization of functional messenger RNA splice variants of BRCA1 expressed in nonmalignant and tumor-derived breast cells.// Cancer Res. (1996) 56:4578-4581.

73. Machackova E., Damborsky J., Valik D., Foretova L. Novel germline BRCA1 and BRCA2 mutations in breast and breast/ovarian cancer families from the Czech Republic.// Human Mutation:Mutation in Brief #459 (2001) Online.

74. Machackova E., Navratilova M., Pavlu H. et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 genes in the Czech hereditary forms of breast/ovarian cancer.// Abstract book of 11th international Congress of Human Genetics. Stratsburg, France (2002).

75. Mandelshtam M.Ju., Chakir Kh., Shevtsov S.P. et al. Prevalence of Lithuanian mutation among St.Petersburg Jews with familial hypercholesterolemia // Hum. Mutat. (1998) 12(4):255-258.

76. Manguoglu A.E., Luleci G., Ozcelik T. et al. Germline mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes in Turkish breast/ovarian cancer patients.// Hum. Mutat. (2003) 21(4):444-445.

77. Meijers-Heijboer H., van den Ouweland A., Klijn J. et al. Low-penetrance susceptibility to breast cancer due to CHEK2 * llOOdelC in noncarriers of BRCA1 or BRCA2 mutations.//Ata. Genet. (2002) 31(l):55-59.

78. Miki Y., Swensen J., Shattuck-Eidens D. et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1.// Science (1994) 266:6671.

79. Nadeau G., Boufaied N., Moisan A., et al. BRCA1 can stimulate gene transcription by a unique mechanism Л EMBO Reports. (2000) l(3):260-265.

80. Narod S.A., Foulkes D.W. BRCA1 and BRCA2:1994 and beyond.// Nature Reviews. Cancer. (2004)4:665-676.

81. Nastiuk K.L., Mansukhani M., Terry M.B. et al. Common mutations in BRCA1 and BRCA2 do not contribute to early prostate cancer in Jewish men.// Prostate (1999) 40: 172-177.

82. Neuhausen S., Gilewski Т., Nortron L. et. al. Recurrent BRCA2 6174deIT mutations in Ashkenazi Jewish women affected by breast cancer.// Nature Genet. (1996) 13:126-128.

83. Peelen Т., van Vliet M., Petrij-Bosch A., et al: A high proportion of novel mutations in BRCA1 with strong founder effects among Dutch and Belgian hereditary breast and ovarian cancer families.// Am. J. Hum. Genet. (1997) 60:1041-1049.

84. Perkowska M., Brozek I., Wysocka B.et al. BRCA1 and BRCA2 mutation analysis in breast-ovarian cancer families from Northeastern Poland.// Human Mutation:Mutation in Brief #610 (2003) Online.

85. Petrij-Bosch A., Peelen Т., van Vliet M., et. al. BRCA1 genomic deletions are major founder mutations in Dutch breast cancer patients.// Nat. Genet. (1997) 17:341-345.

86. Phelan C.M., Kwan E., Jack E. et al. A low frequency of non-founder BRCA1 mutations in Ashkenazi Jewish breast-ovarian cancer families.// Human Mutat. (2002) 20(5):352-357.

87. Roa B.B., Boyd A.A., Volcik K., Richards C.S. Ashkenazi Jewish population frequencies for common mutation in BRCA1 and BRCA2.// Nature Genet. (1996) 14:185-187.

88. Robson M.E., Boyd J., Borgen P.I., Cody H.S. Hereditary breast cancer.// Curr. Probl. Surg. (2001) 38:387-480.

89. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1977) 74: 5463-5467.

90. Seen. D., Wu. Y., Chillar R., Vadgama J.V. Missense alterations of BRCA1 gene detected in diverse cancer patients.// Anticancer Res. (2000) 20(2B): 1129-32.

91. Scheuer L., KauffN., Robson M.et al. Outcome of preventive surgery and screening for breast and ovarian cancer in BRCA mutation carriers.// J. Clin. Oncol. (2002) 20(5):1260-1268.

92. Schorge J.O., Muto M.G., Welch W.R.et al. Molecular evidence for multifocal papillary serous carcinoma of the peritoneum in patients with germline BRCA1 mutations.// J. Nat. Cancer Inst. (1998) 90: 841-845.

93. Schutte M., Seal S., Barfoot R. et al. Variants in CHEK2 other than llOOdeIC do not make a major contribution to breast cancer susceptibility.// Am. J. Hum. Genet. (2003) 72(4):1023-1028.

94. Scully R., Chen J.J., Ochs R.L. et al. Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are initiated by DNA damage.// Cell (mi) 90:425-435

95. Shiri-Sverdlov R., Oefner P., Green L. et al. Mutational analyses of BRCA1 and BRCA2 in Ashkenazi and non-Ashkenazi Jewish women with familial breast and ovarian cancer.// Human Mutation (2000) 16, 6:491-501.

96. Smith T.M., Lee M.K., Szabo C.I. et al. Complete genomic sequence and analysis of 117 kb of human DNA containing the gene BRCA1.// Genome Res. (1996) 6(ll):1029-49.

97. Struewing J.P., Hartge P., Wacholder S. et al. The risk of cancer associated with specific mutations of BRCA1 and BRCA2 among ashkenazi jews.// The New England Journal of Medicine (1997) 336(20):1401-1408.

98. Tereshenko I.V., Basham V.M., Ponder B.A.J., Pharoah P.D.P. BRCA1 and BRCA2 mutations in russian familial breast cancer.// Human Mutation:Mutation in Brief #479 (2002) Online.

99. Thompson M.E., Jensen R.A., Obermiller P.S. et al. Decreased expression of BRCA1 accelerates growth and is often present during sporadic breast cancer progression.// Nature Genet. (1995) 9:444-450.

100. Tobias D.H., Eng C., McCurdy L.D. et al. Founder BRCA 1 and 2 mutations among a consecutive series of Ashkenazi Jewish ovarian cancer patients Л Gynecol Oncol. (2000) 78(2): 148-51.

101. Vehmanen P., Friedman L.S., Eerola H. et al. Low proportion of BRCA1 and BRCA2 mutations in Finnish breast cancer families: evidence for additional susceptibility genes Л Hum. Mol. Genet. (1997) 6(13):2309-2315.

102. Venkitaraman A.R. Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2.// Cell (2002) 108:171-182.

103. Wang Q., Zhang H., Kajino K., Greene M.I. BRCA1 binds c-Myc and inhibits its transcriptional and transforming activity in cells.// Oncogene (1998) 17:1939-1948.

104. Wang Y., Cortez D., Yazdi P. et al. BASC, a super complex of BRCA1-associated proteins involved in the recognition and repair of aberrant DNA structures.// Genes Dev. (2000) 14(8):927-939.

105. Wilson C.A., Payton M.N., Elliott G.S. et al. Differential subcellular localization, expression and biological toxicity of BRCA1 and the splice variant BRCAl-Dllb.// Oncogene (1997) 14: 1-16.

106. Wong A.K., Ormonde P.A., Pero R. et al. Characterization of a carboxy-terminal BRCA1 interacting protein.// Oncogene (1998) 17:2279-2285.

107. Wooster R., Bignell G., Lancaster J. et al. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2.// Nature (1995) 378(6559):789-792.

108. Wooster R., Weber B.L. Breast and ovarian cancer.// New Engl. J. Med. (2003) 348(23):2339-2347.

109. Wooster R., Bignell G., Lancaster J. et al. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2Л Nature (1995) 378:789-792.

110. Xu C.-F., Brown M.A., Chambers J.A. et al. Distinct transcription start sites generate two forms of BRCA1 mRNA.// Hum. Mol. Genet. (1995) 4:22592264.

111. Xu C.-F., Chambers J.A., Nicolai H. et al. Mutations and alternative splicing of the BRCA1 gene in UK breast/ovarian cancer families.// Genes Chrom. Cancer (1997) 18:102-110.

112. Yu X., Wu L.C., Bowcock A.M. et al. The C-terminal (BRCT) domains of BRCA1 interact in vivo with CtIP, a protein implicated in the CtBP pathway of transcriptional repression.// J. Biol. Chem. (1998)273:25388-25392.

113. Zheng L., Annab L.A., Afshari C.A. et al. BRCA1 mediates Iigand-independent transcriptional repression of the estrogen receptor.// /W^S^OOl) 98( 17):95 87-9592.