Молекулярно-генетический анализ моногенных форм атеросклероза и рака молочной железы у жителей Санкт-Петербурга

Мандельштам, Михаил Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ моногенных форм атеросклероза и рака молочной железы у жителей Санкт-Петербурга
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ моногенных форм атеросклероза и рака молочной железы у жителей Санкт-Петербурга"

На правах рукописи

МАНДЕЛЬШТАМ Михаил Юрьевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МОНОГЕННЫХ ФОРМ АТЕРОСКЛЕРОЗА И РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У ЖИТЕЛЕЙ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Научные консультанты:

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, профессор, доктор медицинских наук {Владимир Соломонович 1 айцхоки"}

доктор медицинских наук Вадим Борисович Васильев

член-корреспондент РАМН, профессор, доктор медицинских наук Владислав Сергеевич Баранов

доктор биологических наук, профессор Андрей Петрович Перевозчиков

доктор биологических наук Владимир Иванович Евтушенко

Ведущая организация

ГУ Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского научного центра СО РАМН

Защита состоится_ 22 ыг^Ъз 200 ¿"г. в часов на заседании диссертационного'совета Д.601.022.03 при ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12.

Автореферат разослан 200^г.

Ученый секретарь -

диссертационного совета Д.001.022.03 ГШ//^иУ1

доктор биологических наук, профессор {¿/Щ'* / д. В. Пучкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Сердечно-сосудистые и онкологические заболевания являются ведущей причиной смертности в развитых странах мира, в том числе и в России. По статистике, приведенной в "Государственном докладе о состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2002 году" (доклад опубликован в 2004 году), в стране за двенадцать месяцев от сердечнососудистых заболеваний умерло 1,3 миллиона человек, из них - 47,2% или более 600 тысяч человек от ишемической болезни сердца (ИБС). В соответствии с тем же официальным документом, рак молочной железы регистрировался как самая часто встречающаяся онкопатология у женщин. В 2002 году по стране в целом заболеваемость раком молочной железы составила 39,2 случая на 100 тысяч женщин. В абсолютном значении приведенная цифра означает, что за год появилось более 30 тысяч пациенток с этой формой злокачественных новообразований. Имеется устойчивая тенденция к росту распространенности ИБС и рака молочной железы в стране из года в год и к снижению возраста, в котором проявляются эти заболевания.

В Санкт-Петербурге отмечается один из самых высоких в России уровней заболеваемости как сердечно-сосудистыми, так и онкологическими заболеваниями (Государственный доклад, 2004). Распространенность сердечно-сосудистых заболеваний в городе в 1,6 раза выше, чем в целом по стране. Санкт-Петербург является "неблагополучным" районом России также и в отношении собственно рака молочной железы. В России максимальные показатели заболеваемости раком молочной железы (43,2 на 100 тыс. населения) и смертности от него (20,3 на 100 тыс. человек) зарегистрированы именно в Северо-Западном регионе (Аксель, Двойрин, 1992; Бармина, Трапезников, 1997; Трапезников, Аксель, 1997).

Сердечно-сосудистая и онкологическая патологии в целом относятся к мультифакториальным заболеваниям, в генезе которых имеют значение как наследственный компонент, так и факторы среды. Однако ряд достаточно широко распространенных форм этих заболеваний может быть объяснен преимущественно дефектами в одном гене. К таким формам относятся семейная гиперхолестеринемия (СГ)> вызванная мутациями в гене рецептора липопротеинов низкой плотности (ЛНП), и семейные формы рака молочной железы, обусловленные дефектами в гене ВЯСА1. Эти формы рассматриваются в диссертации как моногенные по причине наличия ведущего генетического фактора риска развития ИБС у пациентов с СГ или рака у носителей мутаций гена ВЛСА1. Модифицирующее влияние на риск развития и тяжесть проявления этих заболеваний оказывают другие факторы, как генетические, так и средовые. Тем не

менее, эти патологии, характеризующиеся ранней манифестацией и тяжелым течением, наследуются как аутосомно-доминантные признаки (Пузырев, 2003). Дисфункция рецептора ЛНП при СГ вследствие мутаций в одноименном гене приводит к снижению скорости удаления липопротеинов из кровотока, развитию атеросклероза и существенному повышению риска ИБС. Наследуемые дефекты в гене опухолевого супрессора BRCA1 многократно увеличивают вероятность инактивации его второго аллеля в клетках молочной железы из-за соматических мутаций или гиперметилирования, что ведет к нарушению репарации ДНК и канцерогенезу. Знание мутаций, вызывающих заболевания, позволяет оценить их роль для структуры и функции белков и осуществлять ДНК-диагностику обсуждаемых патологий.

СГ среди людей белой расы встречается с частотой 1 случай на 500 обследованных (Goldstein et al., 2001). Более чем у 80% мужчин с этим наследственным недугом в возрасте до 60 лет развивается инфаркт миокарда (Slack, 1969). Еще более существенно, что СГ повышает в 100 раз риск гибели от ИБС мужчин в возрасте между 20 и 39 годами (Scientific Steering Committee, 1991).

По разным оценкам одна женщина из 800 является носительницей мутации в гене BRCA1 (Antoniou et al., 2000; Баранов и др., 2000). Вероятность развития рака молочной железы или яичника у женщин, имеющих наследуемые мутации гена BRCA1, достигает более 80% в течение их жизни (King et al., 2003). При этом у них в возрасте до 50 лет заболеваемость данной онкопатологией оказывается в 8-10 раз выше, чем в общей популяции (Struewing et al., 1997).

Представляется актуальным изучение мутаций в гене рецептора ЛНП и в гене BRCA1, поскольку они приводят к рано проявляющимся, тяжелым и одновременно с этим часто встречающимся формам сердечнососудистых и онкологических заболеваний. Особенно важно то, что раннее выявление носителей мутаций как в гене рецептора ЛНП, так и в гене BRCA1 обеспечивает своевременное начало лечения пациентов с наследственными заболеваниями и существенно продлевает им жизнь. Спектры мутаций обсуждаемых локусов сильно различаются между отдельными странами и этническими группами. Этим обусловлена необходимость провести отдельное исследование гена рецептора ЛНП и гена BRCA1 в российской популяции.

Цель исследования:

На основе данных о спектре мутаций гена рецептора ЛНП у больных СГ и гена BRCA1 у больных раком молочной железы в Санкт-Петербурге разработать подходы к ДНК-диагностике социально значимых моногенных форм атеросклероза и рака молочной железы.

Задачи работы:

1. Изучить спектр мутаций гена рецептора ЛНП у больных СГ и спектр мутаций гена ВЯСА1 у больных семейными формами рака молочной железы из числа жителей Санкт-Петербурга;

2. Определить наличие преобладающих и повторно встречающихся мутаций в гене рецептора ЛНП и в гене ВЯСА1;

3. Провести сравнение спектра мутаций в гене рецептора ЛНП и в гене ВЯСА1 у жителей Санкт-Петербурга и стран Европы;

4. На основании экспериментальных и литературных данных обосновать роль обнаруженных мутаций в генах рецептора ЛНП и ВИСА1 для развития пгаерхолестеринемии и рака молочной железы.

5. Оценить частоту встречаемости мутации 113500(3 в гене АРОВ, вызывающей первичную гиперхолестеринемию, у пациентов с СГ -жителей Санкт-Петербурга;

6. Разработать быстрые и эффективные методы идентификации обнаруженных мутаций для диагностики в семьях пробандов и дальнейшего проведения скрининговых исследований.

Научная новизна результатов.

В результате исследования впервые в России охарактеризовано 33 мутации гена рецептора ЛНП, из которых 18 были обнаружены впервые в мире. Продемонстрирована большая вариабельность гена рецептора ЛНП и практически полное отсутствие эффекта основателя применительно к мутациям этого гена в популяции Санкт-Петербурга, за исключением субпопуляции евреев-ашкенази. Показано, что мутация Я3500<3 в гене АРОВ не представлена у больных первичной гиперхолестеринемией из Санкт-Петербурга. У пациентов с семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге идентифицировано 8 мутаций в гене ВЯСА1, из них 6 - являются новыми для России, а одна была ранее не известна в мире. Показано наличие преобладающей мутации 5382шбС в гене ВЯСА1 в Российской популяции, что существенно облегчает ДНК-диагностику заболевания. При сравнении спектров мутаций гена рецептора ЛНП и гена ВЯСА1 в Санкт-Петербурге, в России и в странах Европы сделаны обобщения, которые могут иметь значение при изучении мутационных спектров новых локусов, ответственных за моногенные патологии.

Научно-практическое значение работы.

Определен спектр мутаций гена рецептора ЛНП и гена ВЯСА1 в ранее не изучавшейся популяции Санкт-Петербурга, что представляет интерес для сравнительной популяционной генетики. Показано, что в отношении спектра мутаций гена рецептора ЛНП российская популяция занимает свое, достаточно обособленное место среди других изученных популяций. В то же время продемонстрировано, что у онкологических

больных Санкт-Петербурга преобладают широко распространенные в Европе мутации гена ВЯСА1. На основании оригинальных экспериментальных данных сделано теоретически важное обобщение, что в пределах одной популяции эффект основателя может быть выражен применительно к одним генам и отсутствовать применительно к другим. Обосновано, что из числа 33 идентифицированных мутаций гена рецептора ЛНП 30 могут вести к развитию СГ, а из числа 8 мутаций гена ВВ.СА1 - 1 являются вероятной причиной развития рака молочной железы. Разработаны быстрые методы обнаружения охарактеризованных мутаций гена рецептора ЛНП и гена ВЯСА1, которые могут быть внедрены в практическое здравоохранение. Непосредственно осуществлена ДНК-диагностика СГ в семьях 41 пробанда, включая 69 кровных родственников, а также в семьях 11 пробандов с мутациями в гене ВЯСА1. Показано отсутствие вклада мутаций гена АРОВ в развитие первичных гиперхолестеринемий в Санкт-Петербурге. Выявлена наиболее распространенная мутация гена ВКСА1 5382тзС, тестирование которой в первую очередь должно быть рекомендовано родственникам больных с семейными формами рака молочной железы или яичника.

Положения, выносимые на защиту:

1. Спектр мутаций гена рецептора ЛНП у больных СГ Санкт-Петербурга существенно отличается от такового в сопредельных странах Европы и в других регионах России.

2. В популяции Санкт-Петербурга отсутствуют мажорные мутации гена рецептора ЛНП. Исключение составляет субпопуляция евреев-ашкенази, в которой распространена мажорная мутация 0197<1е1.

3. Среди мутаций гена ВКСА1, идентифицированных у Санкт-Петербургских пациентов с раком молочной железы и семейной историей заболевания, преимущественно встречаются варианты последовательности, уже известные в странах Восточной Европы.

4. Мажорной мутацией в гене ВЯСА1 в Санкт-Петербурге, и, по-видимому, во всей России в силу эффекта основателя или других причин является инсерция 5382тзС.

5. Абсолютное большинство идентифицированных мутаций гена рецептора ЛНП и гена ВЯСА1 является причиной семейной гиперхолестеринемии и семейной предрасположенности к раку молочной железы соответственно.

6. Мутация 113500(3 гена АРОВ, являющаяся частой причиной первичной гиперхолестеринемии в Европе, крайне редко встречается или отсутствует в Санкт-Петербурге.

7. Учитывая характер преобладающих мутаций в гене ВЯСА1 (инсерции и делеции), можно рекомендовать гетеродуплексный анализ для их эффективного выявления и обнаружения новых мутаций. Для поиска

мутаций в гене рецептора ЛНП из-за преобладания в нем нуклеотидных замен предпочтительно применение других методов.

Личный вклад автора.

Автором создана коллекция ДНК больных СГ и семейными формами рака молочной железы, лично проведены все опыты по клонированию мутантных аллелей в плазмидных векторах, выполнено большинство опытов по первичной идентификации мутаций и секвенированию ДНК, осуществлен анализ наследования мутаций в семьях пробандов. Часть работы проделана совместно с Ф. М. Захаровой, Ю. А. Татищевой, Н. А. Грудининой и В. И. Голубковым. Несколько опытов по секвенированию ДНК произведено X. Шакиром и С. П. Шевцовым в лаборатории профессора Е. И. Шварца (Санкт-Петербургский Институт ядерной физики РАН), что оговорено в соответствующих местах текста. Сотрудниками лаборатории профессора Е. И. Шварца также определены генотипы локуса АРОЕ у пациентов с мутацией deltaG197. Отбор пациентов для исследования гена рецептора ЛНП выполнен профессором Б. М. Липовецким (НИИЭМ АМН СССР, Институт мозга РАН) и профессором В. О. Константиновым (НИИЭМ РАМН), а для исследования гена BRCA1 - осуществлен врачом-генетиком Т. В. Брежневой (НИИ онкологии имени профессора H. Н. Петрова). При создании автором Интернет-ресурса по СГ и раку молочной железы на сайте ГУ НИИЭМ РАМН компьютерный дизайн обеспечила А. А. Дзенискевич (Научная библиотека ГУ НИИЭМ РАМН).

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на 36 международных, всероссийских и региональных конференциях и опубликованы в 50 тезисах материалов конференций. Из числа важнейших форумов, на которых были представлены материалы диссертации, следует назвать: Первый /третий/ Российский съезд медицинских генетиков, Москва (14 - 16 декабря 1994 г.), Симпозиум, посвященный 110-летию со дня рождения академика H. Н. Аничкова, Санкт-Петербург (21-23 ноября 1995 г.), 66-th European Atherosclerosis Society Congress, Флоренция, Италия (13-17 июля 1996 г.), Региональное научное совещание "Генофонд населения Санкт-Петербурга и прогнозирование его динамики", Санкт-Петербург (3-4 декабря 1996 г.), Второй съезд Биохимического общества Российской Академии Наук, Москва (19 - 23 мая 1997 г.), Международный симпозиум "Protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical Aspects", Москва (22 - 26 июня 1998 г.), Международную конференцию "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино (21 - 25 сентября 1998 г.), Восьмую научно-практическую конференцию врачей "Актуальные вопросы современной медицины", Новосибирск (1998 г.),

II Международный семинар РФФИ "Результаты фундаментальных исследований в медицине и биотехнологии для инвестиций" Москва (1-3 декабря 1998 г.), 71-st Congress of the European Atherosclerosis Society, Афины, Греция (26 - 29 мая 1999 г.), Международный научный форум "Онкология на рубеже XXI века. Возможности и перспективы", Москва (19-22 октября 1999 г.), 1-ую Всероссийскую конференцию по проблемам атеросклероза, посвященную 100-летию со дня рождения A. JI. Мясникова, Москва (8-9 июня 1999 г.), Юбилейную научно-практическую конференцию, посвященную 10-летию Государственного Новосибирского областного диагностического центра и 30-летию Медико-генетической службы Новосибирской области, Новосибирск (1999 г.), П съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Санкт-Петербург (1 -5 февраля 2000 г.), Второй (четвертый) Российский съезд медицинских генетиков, Курск (17-19 мая 2000 г.), Симпозиум "Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза", Москва (1 июня 2000 г.), Итоговую конференцию "Геном человека - 2000", Черноголовка (18 - 21 декабря 2000 г.), Научную конференцию, посвященную 110-летию Института экспериментальной медицины "Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины", Санкт-Петербург (18-20 декабря 2000 г.), V Всероссийскую научно-практическую конференцию "Современные методы диагностики заболеваний сердечно-сосудистой системы", Новосибирск (28 - 29 мая 2001 г.), VI Международную конференцию РФФИ "Результаты фундаментальных исследований для инвестиций", Пущино (12 - 14 сентября 2001 г.), Научно-практический симпозиум "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в рамках Международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины", Москва (20 - 21 июня 2002 г.), Третий съезд биохимического общества, Санкт-Петербург (20 июня -1 июля 2002 г.), Всероссийскую научно-практическую конференцию "Современные достижения клинической генетики", Москва (25 - 27 ноября 2003 г.), Третий съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития", Москва (6-12 июня 2004 г.), V съезд Российского общества медицинских генетиков, Уфа (24 - 27 мая 2005 г.), Российскую конференцию по фундаментальной онкологии "Петровские чтения - 2005", Санкт-Петербург (15 апреля 2005 г.), I Российско-американскую конференцию "Биотехнология и онкология", Санкт-Петербург (29 — 31 мая 2005 г.).

В более полном виде материалы диссертации были заслушаны на научных семинарах Института экспериментальной медицины РАМН (Санкт-ПетербурГ), Института медицинской генетики ТНЦ РАН (Томск), Российского кардиологического научно-производственного комплекса РАМН (Москва), Тартусского университета (Эстония).

По теме диссертации, помимо тезисов конференций, опубликовано 22 статьи. Из числа 22 статей четыре опубликованы в зарубежных рецензируемых журналах, 18 - в отечественных, преимущественно реферируемых, журналах и сборниках. Из числа опубликованных статей 15 (четыре зарубежных и И в изданиях, выпускаемых в Российской Федерации) напечатаны в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 241 странице машинописного текста, содержит 37 таблиц и 37 рисунков. Диссертация содержит разделы "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Заключение" и "Выводы". Список литературы включает 301 источник, из них 40 работ на русском языке, 261 - на иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы н методы.

Пациенты. Пациентов вовлекали в исследование после получения информированного согласия (informed consent) на его проведение. Формирование группы пробандов с семейной гиперхолестеринемией осуществлено профессором Б. М. Липовецким (Институт мозга РАН) и профессором В. О. Константиновым (ГУ НИИЭМ РАМН). Отбор пациентов с первичным раком молочной железы и семейной историей заболевания проведен врачом-генетиком НИИ онкологии имени Н. Н. Петрова МЗ РФ Т. В. Брежневой.

Критерии для постановки клинического диагноза СГ были следующими: 1) у пациента обнаружена гиперлипидемия типа Па или Иб, характеризующаяся повышенным уровнем общего холестерина и холестерина ЛНП; 2) у нескольких членов семьи пробанда отмечена гиперхолестеринемия или зарегистрированы инфаркты миокарда в раннем возрасте; 3) у больного присутствовали ксантомы сухожилий и/или липоидные дуги роговицы. Лишь пациенты, удовлетворяющие двум или всем трем из перечисленных критериев, отбирались для исследования.

Онкологические пациенты с первичным раком молочной железы, послужившие источником ДНК для данной работы, преимущественно имели семейную историю заболевания. Критерии принадлежности пробандов к родословным с семейной историей предусматривали наличие случаев рака молочной железы и/или рака яичника, по крайней мере, у двух родственниц пробанда со степенью родства не менее 25% (мать, дочь, бабушка, родные сестры). Поскольку не во всех случаях имелись надежные указания на место первичной локализации опухоли у родственниц пробандов, дополнительным критерием для отбора в группу исследуемых служили свидетельства о возникновении онкопатолопга

специфической локализации (молочная железа, яичник) в возрасте до 50 лет.

Пациенты, не удовлетворявшие сформулированным критериям принадлежности к группе СГ или не имевшие выраженной семейной истории рака молочной железы, рассматривались как пациенты с гиперлипидемией (но не с СГ) или со спорадическими случаями рака соответственно. Эти пациенты служили в исследовании контрольной группой для определения характера найденных изменений в ДНК и идентификации ДНК полиморфизмов.

Общая численность пробандов с надежно установленным клиническим диагнозом СГ составила 74 человека, а с семейными формами рака молочной железы - 43 пациентки.

Всех пациентов интервьюировали для сбора семейного анамнеза, а также, по возможности, для выяснения этнической принадлежности. В частности, пациентов опрашивали на предмет принадлежности к группе евреев-ашкенази. Необходимость данного опроса диктовалась высокой частотой специфических мутаций гена рецептора ЛНП и гена BRCA1 именно в этой этнической группе. После обнаружения мутаций у пробандов, исследование на наличие генетических дефектов предлагали пройти и их родственникам. Определение уровня холестерина, триглицеридов и холестерина ЛВП осуществляли сотрудники отдела биохимии НИИЭМ РАМН (зав. - профессор А. Д. Денисенко) на аппарате "Техникон-АА2".

Экспериментальные методы. ДНК выделяли из лейкоцитов периферической венозной крови пациентов. Для удаления белков из препаратов применяли протеиназу К и фенольные экстракции (Kunkel et al., 1977; Bell et al., 1981). Для амплификации всех экзонов гена рецептора ЛНП использовали традиционный набор праймеров (Hobbs et al., 1992), а для поиска мутаций в гене BRCA1 - набор олигонуклеотидов, синтезированных на основе последовательностей, опубликованных в статье JI. Фридман и соавторов (Friedman et al., 1994). Для детекции мутации R3500Q (с. 10658 G>A; CGG>CAG) в гене АРОВ был использован метод сайт-направленного мутагенеза, создающего искусственно в процессе ПЦР сайт для эндонуклазы рестрикции Msp I в случае нормального, но не мутантного аллеля (Hansen et al., 1991). Образцы амплифицированной ДНК изучали на наличие мутаций с помощью модификации SSCP-анализа (Marieoff et al., 1997) в 8-10% полиакриламидном геле в зависимости от размера ампликона с окрашиванием однонитевых конформеров серебром. В ряде случаев использовали автоматизированный флуоресцентный SSCP-анализ, выполненный на секвенаторе ДНК. Идентификацию часто встречающихся мутаций 5382insC и 185delAG в гене BRCA1 проводили путем сравнения

подвижности гетеродуплексов в изучаемых пробах с контрольными образцами ДНК, полученными от доктора Эфрата Леви-Лахада (Dr. Ephrat Levy-Lahad) (Иерусалим, Израиль). Процедуры молекулярного клонирования амплифицированных фрагментов ДНК в плазмидных векторах вьптолняли в основном как описано в широко известном лабораторном руководстве (Sambrook et al., 1989). Для изоляции мутантных аллелей применяли набор "ТАКЛОН" фирмы "Медиген" (Новосибирск), содержащий линеаризованную плазмиду для прямого лигирования ПЦР-продуктов. Идентификацию мутаций осуществляли с помощью секвенирования ДНК по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977). На разных стадиях исследования применяли ручное и автоматическое секвенирование. Ручное секвенирование ДНК выполняли на аппарате "Macrophor" (LKB-Pharmacia), а автоматическое - преимущественно на секвенаторе ALFExpress П (Amersham Biosciences). В некоторых случаях последовательность нуклеотидов ДНК устанавливали с помощью прибора DNA Sequencer 377 (ABI 377) фирмы Applied Biosystems. Новые мутации секвенировали по двум нитям ДНК. Все обнаруженные варианты последовательности, приводящие к изменению рестршсционной карты, подтверждали рестрикционным анализом. Этот же метод наряду с гетеродуплексным анализом был применен для определения мутаций у родственников пробандов.

Для расчета положения сайтов рестрикции применяли программу "PC GENE". Статистическая обработка полученных результатов выполнена с использованием программного пакета (SPSS, 11.0.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение мутаций в гене рецептора ЛНП.

При исследовании 74 пробандов с клиническим диагнозом СГ в гене рецептора ЛНП было идентифицировано 33 мутации (Табл. 1) и 8 часто встречающихся вариантов последовательности, рассматриваемых как полиморфизмы ДНК (Табл. 2). Пример идентификации мутации в гене рецептора ЛНП с помощью ручного секвенирования гетерозиготного образца ДНК приведен на Рис. 1, а один из анализов наследования мутации в семье пробанда, проведенный с помощью рестрикционного теста, показан на Рис. 2.

Из числа обнаруженных мутаций 18 были новыми, не известными из других изученных популяций мира (Табл. 1). Двадцать три мутации оказались нуклеотидными заменами, в том числе 13 приводили к замене аминокислотного остатка в рецепторе ЛНП, то есть представляли собой миссенс-мутации. Две нуклеотидные замены изменяли консенсусные

Таблица 1. Характеристика мутаций гена рецептора ЛНП у жителей Санкт-Петербурга.

Название мутации Изменение в ДНК Локализация Быстрый метод тестирования Число семей (пациентов) с мутацией

Q12X C.97 C>T экзон2 Новый сайт Мае I 1(2)

С74Х С.285 С>А экзон 3 Новый сайт Dde I 1(1)

delta5kb* Делеция экзоны 3-5 Саузерн-блот 1(2)

IVS3+1G>A c.313+lG>A интрон 3 SSCP-анализ 2(3)

347delGCC* с. 347-349del экзон 4А Гетеродуплексы 1(1)

C127W*# с. 444 T>G экзон 4А Новый сайт Mva I KD

G128G, A130P* С.451 G>C экзон 4А Утрата сайта Сас 81 1(1)

C139G* с. 478 T>G экзон 4А Новый сайт Msp I 2(5)

C146R* с. 499 Т>С экзон 4А Новый сайт Apa I КЗ)

C188Y* с. 626 G>A экзон 4В Новый сайт Rsa I 1(3)

dG197 c.651-653del экзон 4В Гетеродуплексы 2(2)

G197del с. 652-654del экзон 4В Гетеродуплексы 7(14)

FsK202: S206X* c.670-671insG экзон 4В Гетеродуплексы 1(2)

E207X С.682 G>T экзон 4В Новый сайт Мае I 1(2)

H229H* с. 750 ОТ экзон 5 Утрата сайта Neo I 1(1)

C249X* с. 810 С>А экзон 5 Новый сайт Dde I 1(1)

FsE287: V348X c.925-931del7 экзон 6 Гетеродуплексы 1(1)

FsE291: N309X* c.936-940del5 экзон 6 Гетеродуплексы 1(1)

C308Y C.985 G>A экзон 7 Новый сайт Fbl I 2(2)

L380H с. 1202 T>A экзон9 Утрата сайта МпП КО

E397X* с. 1252 G>T экзон 9 Новый сайт Alu I 1(7)

FsV409: S423X* c.l291del41 экзон 9 Гетеродуплексы 1(3)

FsE414: M429X c.l302delG экзон 9 Гетеродуплексы Ю)

W422X* c.1328 G>A экзон 9 Новый сайт Мае I 2(2)

IVS9+1G>A C.1358+1G>A интрон 9 Утрата сайта AsuHPI 1(1)

P518P* C.1617 0T экзон11 Нет 1(1)

Таблица 1. Характеристика мутаций гена рецептора ЛНП у жителей Санкт-Петербурга.

Название мутации Изменение в ДНК Локализация Быстрый метод тестирования Число семей (пациентов) с мутацией

G571E с. 1775 G>A экзон 12 ББСР-анализ 1(1)

FsV597: А622Х* c.l855insA экзон 13 Нет 1(1)

D601N* с. 1864 G>A экзон 13 Утрата сайта ЕсоЯУ 1(2)

C646S* с. 1999 Т>А экзон 14 ББСР-анализ KD

T705I с.2177 С>Т экзон 15 Нет 2(2)

V776M с.2389 G>A экзон 16 вБСР-анализ 1(2)

V806I с.2479 G>A экзон 17 Нет 1(1)

Примечания: * - новые мутации; # - мутация охарактеризована без нашего участия.

Таблица 2. Характеристика экзонных полиморфизмов и нейтральных мутаций в гене рецептора ЛНП, найденных у больных СГ - жителей Санкт-Петербурга.

Название полиморфизма Изменение в ДНК Локализация Быстрый метод тестирования

с.81 Т/С С6С* TGT>TGC экзон 2 Нет

с. 117 С/Т С18С TGC>TGT экзон 2 Утрата сайта SfaNI

с. 1171G/A А370Т GCOACC экзон 8 Утрата сайта StuI

с. 1413 G/A R450R AGG>AGA экзон 10А SSCP-анализ

с. 1545 С/Т N494N AAOAAT экзон 10В SSCP-анализ

с. 1773 Т/С N570N AAT>AAC экзон 12 Новый сайт HincII

с. 1959 СЛГ V632V GTOGTT экзон 13 Утрата сайта Avail

с. 2231 G/A R730R CGG>CGA экзон 15 Утрата сайта Mspl

Примечания: * - новые варианты последовательности ДНК.

N/N N/A130P, G128G

G AT CGATC

Рис. 1. Радиоавтограф геля с продуктами реакции секвенирования образца ДНК с двойной мутацией G128G , А130Р [с. 447 Т>С; с. 451 G>C] (GGT>GGC; GCOCCC) в гене рецептора ЛНП (N/A130P,G128G) и гена нормальной последовательности (N/N).

интронные последовательности в донорных сайтах сплайсинга, шесть являлись нонсенс-мутациями, две оставшиеся из-за вырожденности генетического кода не приводили к заменам аминокислот. Девять случаев СГ вызваны короткими делениями или инсерциями, а один - ранее охарактеризованной крупномасштабной перестройкой локуса.

Из числа 33 идентифицированных мутаций мы рассматриваем лишь три варианта как не вносящие вклад в развитие заболевания, а именно: T705I, Р518Р и Н229Н. Два из этих вариантов не приводят к замене аминокислоты, а аллель 7051, как следует из наших данных и исследований в Европе (Lombardi et al., 1997), не ассоциирован с гиперхолестеринемией. В отношении остальных 30 мутаций имеются основания считать их причиной развития гиперхолестеринемии. Из числа этих мутаций для 14 ранее в других странах мира были проведены тесты на функциональную

активность рецептора, или же накоплены данные по семейному анализу и эпидемиологические свидетельства их функциональной значимости. Поэтому особо следует остановиться на обосновании функциональной значимости для развития заболевания тех 16 мутаций гена рецептора ЛНП, которые были идентифицированы нами впервые. Семь новых мутаций должны приводить к обрыву синтеза полипептидной цепи рецептора ЛНП либо вследствие непосредственного возникновения нонсенс-кодона в результате нуклеотидных замен (С249Х, W422X, Е397Х), либо из-за сдвига рамки считывания, также вызывающего преждевременную

12-1.

12-2 Г 112-3

ЪщОО-

В*

183 129

хс мг/дл 281

164

Рис. 2. Анализ наследования мутации С>12Х (с.97 ОТ; САО>ТАО) в гене рецептора ЛНП с применением рестрикционной эндонуклеазы Мае I. При транзиции с. 97 С>Т появляется сайт для рестриктазы Мае I. Дорожки: 1, 2 - ДНК пациентов с мутацией (212Х; 3 - 5 - ДНК родственников без мутации.

терминацию трансляции (c.670-671insG, c.936-940del5, c.l291-1331del41, c.l291-1331del41). В таблице 1 указаны позиции, в которых возникают терминирующие кодоны при всех охарактеризованных делециях и инсерциях, не кратных трем нуклеотидам. Новая делеция 347delGCC не вызывает сдвига рамки считывания, однако, мы предсказываем ее существенное влияние на фолдинг и функцию рецепторного белка. Действительно, другие трехнуклеотидные делеции в том же четвертом экзоне гена рецептора ЛНП 651-653del3 и 652-654del3 являются причиной развития заболевания. Показано, что делеция 652-654del3 приводит к образованию нуль-аллеля, не продуцирующего функционального рецептора из-за дефекта его внутриклеточного транспорта (Hobbs et al., 1990), что определяется мисфолдингом повтора LR5 (Blacklow and Kim, 1996). Значение делеции 5 kb на развитие СГ подробно обсуждалось ранее (Mandelshtam et al., 1993; Мандельштам и др., 1995). Четыре новых миссенс-мутации (C127W, C139G, C146R, C188Y) меняют цистеиновые остатки лигандсвязывающего домена, критические для поддержания его трехмерной структуры (Blacklow and Kim, 1996) на другие аминокислоты. Для трех мутаций (C139G, C146R, C188Y) в родословных пробандов показана косегрегация высокого уровня холестерина с генетическим дефектом. Наконец, мутация C139G была найдена в четырех неродственных российских семьях с семейной пгаерхолестеринемией -двух в Санкт-Петербурге (Chakir et al., 1998а; Мандельштам, Масленников, 2001), одной - в Новосибирске (Мандельштам, Масленников, 2001) и еще одной - в Москве (Мешков и др., 2004). Двойная мутация [с. 447 Т>С; с. 451 G>C, А130Р, G128G] приводит одновременно к изменению кодонов для глицина (GGT>GGC) и аланина (GCOCCC). Однако из-за вырожденности генетического кода, лишь одна из нуклеотидных замен приводит к изменению смысла кодона (А130Р). Появление в белковой цепи молекулы нового остатка пролина, меняющего валентный угол в его полипептидном скелете, может иметь существенные последствия для фолдинга и функционирования рецептора. Мутация D601N в семье пробанда косегрегировала с гиперхолестеринемией. Последняя из числа новых мутаций C646S изменяет функционально важный цистеиновый остаток в белковой цепи рецептора. В отношении мутации C646S мы не располагаем убедительными данными по семейному анализу, свидетельствующими в пользу ее функциональной значимости. Однако все известные мутации, затрагивающие цистеиновые остатки в рецепторе ЛНП, ведут к развитию заболевания (http://www.ucl.ac.uk/fh/muttab.html).

Для тестирования активности аллелей рецептора ЛНП с мутациями неясного функционального значения уже давно (Kingsley and Krieger, 1984) разработана система экспрессии с использованием Ш1А клеток

китайского хомячка. В этих мутантных клетках собственный рецептор не обнаруживается, что позволяет количественно оценить степень дисфункции изучаемого человеческого аллеля после трансформации клеток экспрессионной конструкцией с мутантным вариантом к ДНК рецептора ЛНП человека. В отличие от культивируемых фибробластов гетерозиготных пациентов с СГ клетки IdlA СНО дают возможность точно оценить активность индивидуального аллеля, а не совокупную работу аллелей компаунда. Получение стабильной экспрессии каждого мутантного аллеля в этой системе связано с большими затратами труда. Поэтому актуальной представлялась разработка других методов оценок функциональной значимости мутаций. Одна из интересных работ (Blacklow and Kim, 1996) пыталась связать эффект отдельных мутаций на фолдинг лигандсвязывающего повтора LR5 с фенотипическим проявлением СГ. Мы получили рекомбинантный лигандсвязывающий домен рецептора ЛНП в культивируемых клетках Escherichia coli (Голубков и др., 1997; Рунова и др., 1997) с тем, чтобы впоследствии оценивать эффект вводимых в кДНК лигандсвязывающего домена природных мутаций на фолдинг и ЛНП-связывающую активность рекомбинантного белка. Спустя два месяца после наших публикаций функциональный рекомбинантный ЛНП-связывающий фрагмент рецептора в клетках Е. coli был получен и другими авторами (Simmons et al., 1997). Однако в экспериментах эти системы оказались неудобны, поскольку для получения функционально активного белка требовался его рефолдинг in vitro. Проведенные в самое последнее время работы по экспрессии фрагмента кДНК рецептора ЛНП в культивируемых клетках насекомых (Trichoplusia ni) не требовали рефолдинга продуцируемого рекомбинантного белка для приобретения им функциональной активности. В результате этих работ была не только установлена трехмерная структура комплекса первого и второго доменов рецептора (Rudenko et al., 2002; Rudenko, Deisenhofer, 2002), но и открылась реальная возможность определять эффект мутаций на трехмерное строение и функционирование рецептора ЛНП.

Несмотря на то, что мы не определяли функциональное значение мутаций экспериментально, из выше приведенных аргументов представляется доказанным, что 30 из числа 33 обнаруженных нами у больных СГ Санкт-Петербурга мутаций являются причиной заболевания.

В субпопуляции евреев-ашкенази Санкт-Петербурга при СГ с высокой частотой (30% или 7 из 22 случаев) была идентифицирована одна мутация гена рецептора ЛНП G197del, которая не выявлена у русского (славянского) населения города. Из числа 32 обнаруженных в славянской популяции Санкт-Петербурга мутаций гена рецептора ЛНП только пять мутаций, вызывающих СГ (C139G, c.313+lG>A, c.651-653del3, W422X и C308Y), были найдены в двух семьях, а остальные - в единичных семьях.

Из числа 15 мутаций гена рецептора ЛИП, общих для жителей Санкт-Петербурга и других популяций мира, обнаруживаются варианты, происходящие из самых разных регионов мира, включая Среднюю Европу, страны Средиземноморья и даже Азию. Примечательно обнаружение в Санкт-Петербурге нескольких мутаций, определенно скандинавского (313+1G>A) или финского происхождения (L380H, FsE287:V348X). Ранее специфические финские мутации гена рецептора ЛНП за пределами этой этнической группы не находили. То обстоятельство, что мутация 313+1G>A идентифицирована как повторно встречающаяся в Санкт-Петербурге, а в Норвегии она является мажорной, может указывать на ее попадание в популяцию Северо-Запада еще от викингов. При этом в изученной выборке практически отсутствовали мутации, специфичные для славянских популяций Восточной Европы. Действительно, лишь одна мутация C188Y была общей для популяций Санкт-Петербурга и Чехии, и ни одной общей мутации не было найдено с Польшей. При сравнении спектров мутаций гена рецептора ЛНП у жителей Санкт-Петербурга и Москвы, у жителей которой описано 14 типов мутаций, обращает внимание малое сходство наборов мутаций: лишь две C139G и C188Y найдены в двух городах (Табл. 3). Отчасти наблюдаемая пестрота спектров мутаций гена рецептора ЛНП может быть объяснена их недавним

Таблица 3. Сравнение количества и разнообразия мутаций гена рецептора ЛНП, найденных в разных регионах России.

Регион Число видов мутаций/ в том числе общих с Санкт-Петербургом Число специфичных мутаций для региона России / общих с другими странами**

Санкт-Петербург 33/33 17/15

Москва 14/2 11/2

Новосибирск* 2/2 0/1

Примечание: * - в Новосибирске в рамках настоящего исследования осуществлялся поиск только мутаций, охарактеризованных ранее в Санкт-Петербурге; ** - одна мутация С139в является общей для всех трех регионов и найдена только в России, в подсчете числа мутаций в третьей колонке она не учитывалась; соответственно суммарное число мутаций в столбце 3 на одну меньше, чем в столбце 2.

При подсчете общего числа мутаций широко распространенные полиморфизмы нами не учитывались.

происхождением. Прямое определение возраста мутации G197del в одной из наших работ (Durst et al., 2001) показывает, что она могла возникнуть лишь в XIV веке, в то время как для мутации гена BRCA1 185delAG установлено, что она возникла не позже 72 г. н.э. (Bar-Sade et al., 1988; Ostrer, 2001).

Все найденные полиморфизмы ДНК (Табл. 2), за исключением варианта с.81 Т/С (С6С), были ранее описаны из различных популяций мира, и не рассматриваются как ассоциированные с развитием СГ варианты последовательности гена рецептора ЛНП. Частота встречаемости отдельных полиморфных маркеров варьировала между группами пациентов с СГ, со спорадической гиперлипопротеинемией и в группе нормолипидемических пациентов, но в большинстве случаев различия не были статистически значимыми.

Прямая ДНК-диагностика СГ была проведена у 69 родственников пробандов с СГ (Табл. 4). Важнейшим ее результатом стала возможность установить или исключить диагноз СГ у детей пробандов, не достигших 16 лет. К этому возрасту никто из детей, даже несущих мутацию, не имел характерных меток СГ в виде ксантом или липоидных дуг роговицы. Более того, у многих из них уровень липидов был пограничным для их возраста, и он не позволял однозначно установить или исключить диагноз СГ. Для 4 детей анализ ДНК стал решающим для постановки диагноза СГ, а у 10 он однозначно позволил исключить это тяжелое метаболическое заболевание.

Таблица 4. Результаты ДНК-диагностики семейной гиперхолестеринемии в семьях пробандов.

Общее число обследованных родственников Родственники с мутациями Родственники без мутаций# Дети до 16 лет с мутациями Дети до 16 лет без мутации#

69 26 43 6 24

Примечание:

В таблицу включены данные только по кровным родственникам пробандов (в частности, данные по супругам пробандов из нее исключены); # число обследованных родственников без мутаций выше, чем число родственников с мутациями вследствие того, что в анализ включены родственники со стороны не только больного, но и здорового родителя пробанда.

Существенно, что группы пробандов с СГ с идентифицированными мутациями гена рецептора ЛНП по своим клиническим характеристикам не отличались от пробандов, у которых мутаций гена рецептора ЛНП найти не удалось (Табл. 5). Единственным полезным критерием, относительно надежно указывающим на вероятное обнаружение у пробанда с гиперхолестеринемией мутации гена рецептора ЛНП, являлось наличие ксантом сухожилий или липоидных дуг роговицы.

Изучение пробандов с однотипными мутациями гена рецептора ЛНП позволяет понять механизмы формирования различных клинических фенотипов у больных. Проведенное нами совместно с сотрудниками лаборатории профессора Е. И. Шварца определение генотипов аполипопротеина Е у 14 пациентов-ашкенази с однотипной мутацией 0197с1е1 (Табл. 6) указывает на значение генотипа Е2/Е2 для повышения уровня триглицеридов плазмы крови, которое может рассматриваться как дополнительный и независимый фактор риска атеросклероза. Несмотря на невозможность проведения статистической обработки, обращает внимание, что носитель генотипа Е2/Е2 из всей отобранной группы характеризовался наиболее тяжелым течением ИБС, которое осложнилось острым инфарктом миокарда.

Полная информация о мутациях и полиморфизмах гена рецептора ЛНП, найденных в Санкт-Петербурге и России в целом, доступна на созданном в процессе работы информационном Интернет-сайте по СГ. Его загрузочная страница имеет адрес

http://www.iemrams.spb.ru/russian/molgenru/fh/fh-main.htm.

Изучение встречаемости широко распространенной мутации Ю500<2 в гене АРОВ у больных семейной гиперхолестеринемией Санкт-Петербурга.

Все 74 пробанда с СГ были исследованы на наличие мутации Ю500<3 в гене АРОВ, приводящей к образованию дефектного по связыванию аполипопротеина В-100. Ни один из пациентов не имел мутации Ю500<3, являющейся единственным широко распространенным и часто встречающимся в мире генетическим дефектом, ведущим к семейному дефекту по связыванию аполипопротеина В-100 (РОВ) и первичной гиперхолестеринемии. Этот результат, показавший отсутствие или крайне низкую частоту встречаемости мутации Ю500(3 среди пациентов с первичной шперхолестеринемией Санкт-Петербурга, чрезвычайно важен для планирования ДНК-диагностики. Заболевание БОВ по клиническим характеристикам и показателям липидов плазмы крови пациентов не отличимо от СГ. Таким образом, мутации гена рецептора ЛНП, а не мутация гена АРОВ являются основной причиной наследуемой гиперхолестеринемии в Санкт-Петербурге. Этот результат не тривиален,

Таблица 5. Сравнение клинических характеристик пробандов с СГ с идентифицированными мутациями гена рецептора ЛНП и пробандов, у которых мутации гена рецептора ЛНП не были обнаружены.

Параметр Пациенты с идентифицированными мутациями в гене рецептора ЛНП (п=41) Пациенты с СГ, у которых мутации гена рецептора ЛНП не обнаружены (п=31) Достоверность различий, критерий

Мужчин/ Женщин 17/24 16/15 X2эксп = 0,381; Р=0,53

Возраст, лет 48,2± 10,98 51,7±12,66 р=0,21 ^-критерий Стьюдента)

Общий холестерин (мг/дл) 402,7±73,39 408,7±112,79 р=0,67 (и-критерий Манна-Уитни)

Триглицери-ды (мг/дл) 161,б±66,80 176,1 ±69,61 р=0,37 ^-критерий Стьюдента)

Холестерин ЛВП (мг/дл) 45,6±11,88 39,1±10,98 *р=0,03 ^-критерий Стьюдента)

Холестерин ЛНП (мг/дл) 323,3±73,03 334,2±111,42 р=0,859 (и-критерий Манна-Уитни)

С ксантомами/ без ксантом# 75% (31/10) 32% (10/21) *у2 =1182- К эксп р=0,001; 011 = 6,5 (95% С12,3-18,4)

ИБС/без ИБС 78% (32/9) 74% (23/8) Х2эксП = 0,9; р=0,34

ИМ/без ИМ 43%(18/41) 54%(17/14) У.2эксп = 1,34; р=0,25

Примечание: В таблицу внесены данные лишь о пробандах, по которым

имелась полная клиническая информация, поэтому их количество

составляет 72, а не 74 человека. Пробанды с мутациями Н229Н и Т7051 в

гене рецептора ЛНП, которые не вызывают заболевание, отнесены к

группе пациентов без мутаций гена рецептора ЛНП.

♦Различия с р<0,05 считаются статистически достоверными.

# учтены пациенты с любыми метками ИБС, включая и сухожильные

ксатомы, и липоидные дуги роговицы.

ИБС - ишемическая болезнь сердца, ИМ - инфаркт миокарда.

Таблица 6. Содержание липидов в плазме крови у пациентов-аппсенази Санкт-Петербурга с однотипной мутацией 0197<1е1 в гене рецептора ЛНП (данные получены вместе с сотрудниками лаборатории профессора Е. И. Шварца).

Пациент Возраст, лет Пол Общий холестерин, мг/дл Триглицериды, мг/дл Генотип АРОЕ ИМ

FH61-1 47 M 265 312 2/2 +

FH64-1 56 Ж 492 105 3/3 -

FH62-1 46 M 508 270 3/3 -

FH62-6 59 ж 368 125 3/3 -

FH62-7 37 M 362 188 3/3 -

FH 63-1 44 M 408 85 3/3 -

FH63-3 44 ж 260 158 3/3 -

FH63-4 19 M 286 134 3/3 -

FH59-I 50 ж 429 122 3/3 -

FH 59-2 22 ж 335 66 3/3 -

FH 59-3 33 ж 319 103 2/3 -

FH 58-1 44 M 500 285 2/3 -

FH58-2 27 ж 325 143 3/3 -

FH60-1 38 M 408 85 2/3 -

Примечацие: ИМ - инфаркт миокарда.

поскольку в некоторых популяциях Европы, как Германия и Австрия, частота заболеваний СГ и FDB практически одинакова. Наш результат согласуется и с публикациями других исследователей. В частности, С. П. Шевцов (1996) до нас показал исключительную консервативность последовательностей гена АРОВ, кодирующих рецептор-связывающий участок апопротеина, и отсутствие каких-либо мутаций в нем у доноров Санкт-Петербурга. Несомненным преимуществом нашей работы по сравнению с работой Шевцова (1996), было то, что мы исследовали не просто доноров Санкт-Петербурга, а пациентов с аутосомно-доминантной гиперхолестеринемией. Результат, свидетельствующий о редкости мутации R3500Q в России, был ожидаемым, поскольку ее частота закономерно падает в направлении от центра Европы и, исходя из этих данных, частота встречаемости мутации R3500Q в России оценивалась ранее менее чем 1/1000 (Hansen, 1998; Miserez and Muller, 2000; Horvath and Ganev, 2001). Наши результаты свидетельствуют в пользу того, что она встречается в Санкт-Петербурге еще реже. Действительно, замена R3500Q не была обнаружена среди 74 пациентов с первичной

гиперхолестеринемией, включая 41 пациента с генетически подтвержденным диагнозом СГ. Эти данные позволяют сделать осторожную оценку частоты FDB в Санкт-Петербурге как меньшую, чем 1/20000 (41 х 500 = число пациентов с генетически подтвержденным диагнозом СГ х ожидаемая частота СГ в популяции). Заметим, что мутация R3500Q гена АРОВ была обнаружена в Москве (Pogoda et al., 1998; Крапивнер и др., 2000), но также с очень низкой частотой. В цитируемом исследовании (Крапивнер и др., 2000) она была обнаружена лишь у 2 из 71 пациента с СГ. Отчасти, но не полностью, обнаружение мутации R3500Q в России может быть связано с проживанием в стране этнических немцев. В целом, данные Петербургских исследователей, в том числе и наши (Шевцов, 1996; Zakharova et al., 1995), как и данные московских исследователей (Крапивнер и др., 2001) свидетельствуют о малом участии локуса АРОВ в развитии наследуемых гиперхолестеринемий в России. Вопрос о вкладе других генов, вызывающих моногенные гиперхолестеринемии, как PCSK9, в их генез в Санкт-Петербурге остается неясным. Однако, судя по единичным находкам мутаций этого гена в Северной Европе (Leren et al., 2004), в том числе по полному отсутствию их в балтийской Дании (Damgaard et al., 2004), вряд ли вклад мутаций гена PCSK9 в развитие наследуемых гиперхолестеринемий в Санкт-Петербурге будет велик.

Изучение мутаций в гене BRCA1.

У двенадцати пробандов из 43, вовлеченных в исследование, были найдены мутации гена BRCA1 (Табл. 7). Шесть мутаций были охарактеризованы впервые в России, но лишь одна из восьми охарактеризованных мутаций не была известна ранее из других стран мира.

Пример одновременной идентификации многих мутаций в гене BRCA1 с помощью электрофоретического анализа, выявляющего гетеродуплексы, показан на рисунке 3, а идентификация одной из делеций с помощью автоматического секвенирования ДНК - на рисунке 4. Из числа найденных вариантов 12-нуклеотидная дупликация в двадцатом интроне не ассоциирована с развитием рака молочной железы, а остальные семь вариантов могут рассматриваться как возможная причина предрасположенности к заболеванию.

Действительно, шесть из этих мутаций приводят к преждевременной терминации трансляции и к утрате функционально важных BRCT-повторов на С-конце опухолевого супрессора. Для миссенс-мутации Е1250К показана ее косегрегация с заболеванием в семье пробанда. Из числа мутаций, ведущих к заболеванию, пять представляют короткие

Таблица 7. Характеристика мутаций в гене ВЯСА1, найденных у жителей Санкт-Петербурга с семейными формами рака молочной железы.

Название мутации Изменение в ДНК Локализация Быстрый метод тестирования Число семей (пациентов) с мутацией

2274твА РзЕ720:8725Х с.2274-2275шА ЭК30Н1Ю Гетеродуплекс-ный анализ 1(1)

2963ае110* р8<3948:Ь999Х с.2963-2972<1е110 экзон 1 и Гетеродуплекс-ный анализ 1(3)

Ю203Х ССА>ТСА С.37260Т экзон 110 ввСР-анализ 1(2)

3819ёе15 РБУ1234:Т1242Х с.3819-3823ёе15 экзон 110 Гетеродуплекс-ный анализ 2(2)

Е1250К ОАОААО с.3867 ОА экзон 110 Гетеродуплекс-ный анализ 1(2)

3875с1е14 Рз1Л252:1Л263Х с.3875-3878ёе14 экзон 110 Гетеродуплекс-ный анализ 1(2)

5382твС Рв01756:Е1829Х 5382_5383 твС экзон 20 Гетеродуплекс-ный анализ 4(4)

§.71741тз12п1; 1У820+60тэ12 № ОТАТТССА СТСС интрон20 Гетеродуплекс-ный анализ 1(1)

Примечания: * - новые мутации.

делеции или инсерции, одна нуклеотидная замена приводит к образованию стоп-кодона, и лишь одна является миссенс-мутацией.

При исследовании гена ВЯСА1 у онкологических больных Санкт-Петербурга была обнаружена мажорная мутация 5382тзС (Табл. 8). Эта инсерция найдена приблизительно у 10% пациентов с семейными формами рака молочной железы независимо от этнической принадлежности. Действительно, дефект встречался почти одинаково часто у евреев-ашкенази (1/9) и у славянских пациентов (3/34). Еще большее значение мутация 5382твС может иметь для развития семейных форм рака яичника. Она была обнаружена нами у 3 из 7 пробандов с таким заболеванием в Санкт-Петербурге (Табл. 8). Высокий процент семей, имеющий рак яичника и несущих мутацию 5382тзС, найден и в Москве (СауЛег ег а!., 1997; Карпухин и др., 2002). Таким образом, наличие преобладающей и распространенной в разных регионах России (Москве, Московской

1 2 3 4 5

-< * V*-. ~

Рис. 3. Идентафикация мутаций в гене ВЯСА1 по образованию гетеродуплексов. Дорожки: 1, 5 - ДНК носителей мутации 38Ше15; 3 - образец с мутацией Е1250К; 4 -образец с делецией 3875с1е14; 2 - ДНК ЧщшЛ пациента без мутаций.

^^ ^Щт ШЯ§: ЯИ»

области, Томске) (Карпухин и др., 2002; ТегезЬепко е1 а1., 2002) мутации 5382тзС облегчает ДНК-диагностику предрасположенности к заболеванию и позволяет предложить в качестве первого теста недорогой анализ на эту мутацию.

У жителей Санкт-Петербурга идентифицированы мутации гена ВЯСА1 (5382тзС, 3819<1е15, 3875ёе14), широко распространенные в мире. Эти мутации не характерны для стран Фенноскандии, но максимально часто встречаются в славянских популяциях Восточной Европы (Польше и Чехии). Особенно показательна высокая встречаемость инсерции 5382т$С как в Восточной Европе, так и в популяциях России (Санкт-Петербурге, Москве, Московской области и Томске), что позволяет предположить ее восточноевропейское происхождение. Некоторые мутации, распространенные в Польше и Чехии, как 185ёе1АО и особенно частую в этих странах мутацию С6Ю, при специальных поисках в Санкт-Петербурге мы найти не смогли.

Рис. 4. Идентификация мутации 3819del5 в гене BRCA1 методом автоматического секвенирования ДНК на приборе "ALFExpress-2".

Вверху - результаты секвенирования клонированного мутантного аллеля, внизу - нормального аллеля. Утраченные при делеции нуклеотиды в нормальной последовательности подчеркнуты.

Родственники пациентов из большинства семей с раком молочной железы были недоступны для исследования ДНК. Тем не менее, важным кажется результат обнаружения мутации 2963dell0 гена BRCA1 у дочери пробанда, в возрасте 19 лет не имеющей признаков заболевания. У дочери пациентки с мутацией 3875del4, унаследовавшей мутацию от матери, в возрасте 14 лет была диагностирована дольковая гиперплазия молочной железы и киста правого яичника, которые могут предшествовать возникновению злокачественных новообразований. Таким образом, мы обратили внимание родственниц пробандов с мутациями на необходимость повышенного контроля за состоянием грудной железы.

В гене BRCA1 мы идентифицировали три полиморфизма ДНК (Табл. 9), все из которых были ранее индексированы в базе данных BIC как нейтральные изменения последовательности ДНК. Полиморфные нуклеотиды всех трех изученных вариантов S694S, L771L и E1038G гена BRCA1 находились в одной фазе сцепления, что отмечалось исследователями и ранее (Dimning et al., 1997; Карпухин и др., 2002).

Таблица 8. Доля семей с повторяющимися и уникальными мутациями в гене ВЯСА1 в семьях высокого риска рака молочной железы и яичника из разных популяций.

Популяция Семьи с Семьи с Семьи с Семьи с Всего

мутацией повторно широко уникаль- семей с

5382insC встречаю- распрост- ными для мутациями

щимися раненными популяции в гене

мутациями мутациями мутациями BRCA1

Санкт- 9,3% 14% 23% 2,3% 26%

Петербург (4/43) (6/43) (10/43) (1/43) (11/43)

Санкт- 43%* Нет Нет Нет Нет

Петербург* (3/7) данных данных данных данных

Томск 12% 12% 12% 0% 12%

(3/25) (3/25) (3/25) (0/25) (3/25)

Москва* 47% 63% 79% 0% 79%

(9/19) (12/19) (15/19) (0/19) (15/19)

Северо- 10% 15% 22% 1,6% 23%

восточная (6/60) (9/60) (13/60) (1/60) (14/60)

Полыпа#

♦Данные по семьям с раком яичника.

#Комбинированные данные по семьям с раком яичника и раком молочной железы.

Таблица 9. Характеристика экзонных полиморфизмов и нейтральных мутаций в гене ВЯСА1, найденных у больных СГ Санкт-Петербурга.

Название полиморфизма Изменение в ДНК Локализация Быстрый метод тестирования Доля хромосом с редким аллелем полиморфизма (п=86)

S694S AGC>AGT C.22010T экзон1Ю SSCP-анализ 0,64/0,36

L771L TTG>CTG с.2430 Т>С экзон 11Н SSCP-анализ 0,64/0,36

E1038G GAA>GGA с.3232 A>G экзон 11К2 SSCP-анализ 0,64/0,36

Примечание: п - число изученных хромосом.

Созданный в процессе исследований сайт по семейным формам рака молочной железы, вызванных мутациями в генах ВЯСА1 и ВЛСА2 (Ъйр:/Лу\у\у. ¡етгатБ. spb.ru/russian/molgenru/brca-ru/brca-r 1,1йт) содержит информацию обо всех найденных в России мутациях этих локусов для специалистов-онкологов.

Значение проведенного исследования для диагностики моногенных заболеваний в Санкт-Петербурге и в России.

Суммарно, мутации в гене рецептора ЛНП, вызывающие заболевание, выявлены в 55% (41/74) семей с СГ, а мутации гена ВЯСА1 -в 26% (11/43) семей, отягощенных по раку молочной железы. В гене рецептора ЛНП у пробандов с СГ в силу дизайна стандартных праймеров (НоЬЬб е! а1., 1992) не полностью были проанализированы экзон-интронные стыки, потенциально содержащие значительный процент мутаций (АтвеИет е1 а1., 2002), а в гене ВВСА1 -небольшие экзоны гена, в которых в мире известно лишь малое число мутаций. Несмотря на это, эффективность поиска мутаций в обоих генах в Санкт-Петербурге не уступала европейским исследованиям.

Как следует из предыдущих разделов, диагностика СГ в Санкт-Петербурге и в России в целом осложнена чрезвычайно большим разнообразием мутаций в силу отсутствия выраженного эффекта основателя. На практике, это означает, что для каждой вновь обратившейся за консультацией семьи невозможно будет предсказать, какая мутация будет обнаружена, и, весьма вероятно, она окажется даже ранее неизвестной. Из-за возможной локализации мутации у пробанда, обратившегося за диагностикой, в любом из экзонов гена и при отсутствии преобладающих мутаций, для обнаружения генетического дефекта может потребоваться изучение всего гена высокочувствительным просеивающим методом, таким как флуоресцентный автоматический ББСР-анализ, или прямое секвенирование всей кодирующей области гена и экзон-интроных стыков.

В случае гена ВЯСА1 ситуация для ДНК-диагностики моногенной предрасположенности к раку молочной железы более оптимистичная. В этом гене в Санкт-Петербурге (Табл. 7), как и в целом в мире (Рис. 5) из всех мутаций преобладают делеции и иксерции, эффективно выявляемые рутинным гетеродуплексным анализом. Поэтому этот метод может быть рекомендован для эффективного поиска известных и новых мутаций гена ВЯСА1 перед его секвенированием. Кроме того, в отличие от СГ, при раке молочной железы, связанном с мутациями гена ВЯСА1, большинство мутаций являются общими со странами Европы (Рис. 6), что может сузить поиск генетических дефектов в семьях. Наконец, довольно большой

А)

Короткие инсерции 5,3%

Интронные-мутации 6,2%

Большие перестройки 8,6%

Нонсенс-мутации 11%

Мутации промотора 0,8%

Миссенс-мутации 55%

Короткие делеции 13,1%

Б)

Неклассифицированные варианты миссенс-мутаций 27%

Неклассифицированные варианты мутаций разных типов 11 %

Миссенс-мутации 2%

Мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания 32%

Мутации сайтов сплайсинга 9%

Нонсенс-мутации 11 %

Рис. 5. Сравнение преобладающих классов мутаций в гене рецептора ЛНП и в гене BRCA1.

Несмотря на несколько различающуюся классификацию мутаций по типам в каждом из генов по данным UMD-LDLR Database и BIC, можно видеть, что в гене рецептора ЛНП преобладают функционально значимые миссенс-мутации, а в гене BRCA1 - мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания (обычно короткие делеции и инсерции).

процент повторяющихся мутаций, и особенно наличие мажорной мутации 5382шбС (Табл. 8, Рис. 7), позволяет в первую очередь рекомендовать тестирование в семьях с раком молочной железы и раком яичника именно на этот дефект.

Действительно, на основе наших данных и исследований в Москве, разработаны и сегодня уже вошли в практику российской медицины тесты на часто встречающиеся мутации в гене ВИСА1. Фирма "Литех" в Москве предлагает пациентам и их родственникам не только дорогостоящее секвенирование всего гена ВКСА, но и дешевые тесты на мутации, широко распространенные в восточноевропейских популяциях или в этнической группе аппсенази: 185с1е1АО, Т8Ш, 4143ёе1А и 53821шС. Подобная стратегия исключения широко распространенных в силу эффекта основателя мутаций перед секвенированием всего гена предлагалась для

100% -1--м--

90%---^--

: И И 1

бо% —--—

50%--Н-Н-~ —

40%--Н-^Ж-„ —

30%—■-■-,, —

20% —--. - , —

10% —-^^- —

0% -I—^-1--,-—и—

РАН ВЯСА1

Рис. 6. Доля общих с зарубежными странами и специфичных для России мутаций при моногенных заболеваниях у жителей Санкт-Петербурга. Данные о мутациях локуса фенилаланингидроксилазы (РАН) взяты из работы Барановской и соавторов (1995); ЮЬЯ - ген рецептора ЛНП.

стран, где спектр мутаций достаточно хорошо изучен, например, для Польши (№гоё, РоиПсеэ, 1994; Оогек! еХ а1., 2004). Подобную очередность в тестировании пациентов в первую очередь на мутацию 5382тзС, а затем и на некоторые другие широко представленные в Европе мутации, перед поиском новых вариантов, предложили в это же время и мы для Санкт-Петербурга (Мандельштам и др., 2001; Грудинина и др., 2004, 2005). Подобный подход, кажущийся сегодня очевидным, но потребовавший

■ Общие с Европой

□ Уникальные для России

большого исследования спектра мутаций, проведенного для Санкт-Петербурга в этой работе, реализуется косвенно на основе наших данных, например в НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова, где разработан и используется быстрый и дешевый тест на мутацию 5382insC в гене BRCA1.

Из-за разного эволюционного возраста мутаций гена рецептора ЛНП и гена BRCA1 или по каким-либо другим причинам, ситуация с наличием преобладающих мутаций различна при СГ и моногенных формах рака молочной железы, вызванных мутациями BRCA1. Для целей диагностики, однако, важно знать не абсолютный возраст отдельных мутаций, а возможность определить, какие мутации могут быть распространены в России, исходя из анализа уже изученных спектров мутаций в странах Европы. Страны Европы имеют малое сходство между собой в отношении спектров мутаций гена рецептора ЛНП, и популяция России, как уже показано преимущественно нами, характеризуется высоким своеобразием генетических дефектов при СГ. В отношении мутаций гена BRCA1 наблюдается большее сходство между странами Европы, и спектр наследуемых дефектов этого гена в Санкт-Петербурге и в России в целом напоминает спектр мутаций в сопредельных и этнически близких странах Восточной Европы, а именно: в Польше и Чехии. Полученные результаты и подобные сравнения важны для российских клиницистов. Они смогут решить, какие мутации в первую очередь, уже известные из Европы или преимущественно новые, будут обнаружены при том заболевании, которое они собираются изучать в России и ДНК-диагностику которого они планируют налаживать в стране. Например, еще до начала исследований гена BRCA2 в нашей стране на основании сильных различий в спектрах мутаций между европейскими странами a priori можно предсказать, что набор наследуемых дефектов BRCA2 в России будет менее похожим на имеющийся в Европе, чем в случае гена BRCA1. В подтверждение этого положения приведем результат экспериментальной работы томских генетиков, в которой все три идентифицированные мутации гена BRCA2 в отличие от найденных дефектов гена BRCA1 оказались новыми, специфичными для России (Tereshenko et al., 2002).

Доля семей с А) мутациями в гене рецептора ЛНП, найденными дважды 29%

Доля семей с мутациями в гене рецептора ЛНП,

найденными многократно 0%

Доля семей с уникальными мутациями в гене рецептора ЛНП 71%

Б)

Доля семей с мутациями в гене ВЯСА1, найденными многократно 36%

Доля семей с мутациями в гене ВЙСА1, найденными два>цды 18%

Доля семей с уникальными мутациями в гене ВИСА1 45%

Рис. 7. Доля семей с повторно встречающимися и уникальными мутациями в гене рецептора ЛНП и в гене В11СА1.

Рассмотрены только Санкт-Петербургские семьи славянского происхождения, поскольку в популяции евреев-ашкенази имеются хорошо известные доминирующие мутации в каждом из генов, а их общий вклад в СГ и семейные формы рака молочной железы в Санкт-Петербурге из-за малочисленности ашкенази в городе невелик. За 100% взято число семей с идентифицированными мутациями, способными вызвать заболевание. Можно видеть, что в гене рецептора ЛНП почти все семьи имеют редко встречающиеся мутации, в то время как в гене ВЯСА1 имеется, по крайней мере, одна мажорная мутация 5382твС.

выводы

1. Спектр мутаций гена рецептора ЛНП при семейной гиперхолестеринемии у жителей Санкт-Петербурга очень широк и характеризуется значительным своеобразием. Из 33 найденных в Санкт-Петербурге мутаций 18 оказались новыми, не известными в других популяциях мира. Из числа изученных обнаружены лишь две мутации, общие для Москвы и Санкт-Петербурга.

2. У жителей Санкт-Петербурга, за исключением субпопуляции евреев-ашкенази, отсутствуют мажорные мутации гена рецептора ЛНП. В этнической группе евреев-ашкенази мажорная мутация G197del гена рецептора ЛНП обусловливает до 30% случаев семейной гиперхолестеринемии.

3. В гене BRCA1 у онкологических больных Санкт-Петербурга с семейными формами рака молочной железы преобладают мутации, общие с населением Европы. Из числа 8 обнаруженных мутаций гена BRCA1 лишь одна не была известна в других популяциях мира.

4. Инсерция 5382insC в гене BRCA1 является мажорной мутацией в популяции Санкт-Петербурга и встречается приблизительно в 10% семей, отягощенных по раку молочной железы, независимо от этнической принадлежности. Обнаруженное преобладание указанной мутации в Санкт-Петербурге согласуется с ее распространенностью в Москве и в Томске.

5. Из 33 найденных мутаций гена рецептора ЛНП 30 являются вероятной причиной семейной гиперхолестеринемии, а из 8 охарактеризованных мутаций гена BRCA1 1 вызывают предрасположенность к раку молочной железы.

6. Отсутствие мутации R3500Q в гене АРОВ у 74 больных с семейной гиперхолестеринемией свидетельствует в пользу низкой частоты ее встречаемости в популяции Санкт-Петербурга (оценена как меньшая, чем 1/20000).

7. Преобладание среди мутаций гена BRCA1 коротких делеций и инсерций позволяет рассматривать гетеродуплексный анализ, хорошо выявляющий эти типы мутаций, как наиболее удобный на практике скрининговый метод. Для поиска мутаций в гене рецептора ЛНП из-за преобладания в нем нуклеотидных замен должны быть применены другие методы, например высокочувствительный анализ конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК.

Список статей, опубликованных по теме диссертации:

1. Мандельштам М.Ю., Липовецкий Б.М., Шварцман АЛ., Гайцхоки B.C. Молекулярная гетерогенность семейной гиперхолестеринемии в популяции жителей Санкт-Петербурга// Генетика. - 1995. - Т.31, N 4. -С. 521-527.

2. Липовецкий Б.М., Мандельштам М.Ю., Гайцхоки B.C., Васильева Л.Е. Клинико-генетические аспекты семейной гиперхолестеринемии и их прикладное значение// Терапевтический архив. - 1996. - Т. 68, N1.-С. 24-29.

3. Голубков В.И., Мандельштам М.Ю., Рунова О.Л., Гайцхоки B.C. Получение и характеристика рекомбинантного лиганд-связывающего домена рецептора липопротеинов низкой плотности человека// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1997. - Т. 123, N 2. - С. 184-187.

4. Рунова О.Л., Мандельштам М.Ю., Голубков В.И., Суконина В.Е., Денисенко А.Д., Гайцхоки B.C. Экспрессия фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в клетках Escherichia colill Биохимия. -

1997. - Т.62, N 8. - С. 1037-1044

5. Mandelshtam M.Ju., Chakir Kh., Shevtsov S.P., Golubkov V.I., Skobeleva N.A., Lipovetsky B.M., Konstantinov V.O., Denisenko A.D., Gaitskhoki V.S., Schwartz E.I. Prevalence of Lithuanian mutation among St.Petersburg Jews with familial hypercholesterolemia// Human Mutation.'~ 1998. - Vol. 12, N 4. - P. 255-258.

6. Липовецкий Б.М., Мандельштам М.Ю., Васильева Л.Е., Шакир X., Голубков В.И., Шевцов С.П., Скобелева Н.А., Константинов В.О., Денисенко А.Д., Гайцхоки B.C., Шварц Е.И. О частоте и проявлениях «литовской» мутации среди евреев с гиперлипидемией II типа и их реакции на лечение флувастатином// Кардиология. -

1998. -Т.38, N 5. - С. 39-41.

7. Chakir Kh., Mandelshtam M.Ju., Shevtsov S.P., Golubkov V.I., Skobeleva N.A., Schur Yu.A., Zakharova F.M., Lipovetskyi B.M., Konstantinov V.O., Denisenko A.D., Gaitskhoki V.S., Schwartz E.I. Two novel low density lipoprotein receptor gene mutations (E397X and 347delGCC) in StPetersburg familial hypercholesterolemia// Molecular Genetics and Metabolism. - 1998.-Vol. 65, N4. - P. 311-314.

8. Мандельштам М.Ю., Голубков В.И., Шур Ю.А., Липовецкий Б.М., Гайцхоки B.C.. Новая мутация 347delGCC в гене рецептора липопротеинов низкой плотности человека// Биоорганическая химия. - 1998. - Т.24, N 10. - С. 798-800.

9. Durst R., Colombo R., Shpitzen S., Avi L.B., Friedlander Y., Wexler R., Raal F.J., Marais D.A., Defesche J.C., Mandelshtam M.Y., Kotze M.J., Leitersdorf E., Meiner V. Recent origin and spread of a common

Lithuanian mutation, G197del LDLR, causing familial hypercholesterolemia: positive selection is not always necessary to account for disease incidence among Ashkenazi Jews // American Journal of Human Genetics. -2001. -Vol. 68, N5,- P. 1172-1178.

10. Татищева Ю.А., Мандельштам М.Ю., Голубков В.И., Липовецкий Б.М., Гайцхоки B.C. Четыре новые мутации и полиморфные варианты гена рецептора липопротеинов низкой плотности у пациентов с семейной гиперхолестеринемией Санкт-Петербурга// Генетика. - 2001. - Т.31, N 9. - С. 1290-1295.

11. Захарова Ф.М., Голубков В.И., Мандельштам М.Ю., Липовецкий Б.М., Гайцхоки B.C. Идентификация новой миссенс-мутации G571E, новой молчащей мутации Н229Н, нонсенс мутации С74Х и четырех однонуклеотидных полиморфизмов в гене рецептора липопротеинов низкой плотности у пациентов с семейной гиперхолестеринемией в Санкт-Петербурге// Биоорганическая химия. - 2001. - Т. 27, N 5. -С.393-396.

12. Мандельштам М.Ю., Голубков В.И., Ламбер Е.П., Шапиро И.М., Брежнева Т.В., Семиглазов В.Ф., Липовецкий Б.М., Хансон К.П., Гайцхоки B.C. Поиск часто встречающихся мутаций в генах предрасположенности к раку молочной железы// Генетика. - 2001. -Т. 31,N 12. -С. 1681-1686.

13. Мандельштам М.Ю., Масленников А.Б. Изучение молекулярной генетики семейной гиперхолестеринемии в России // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике (под ред. А. Б. Масленникова). - Новосибирск: Издательский дом "Манускрипт". - 2001. - С. 5S-64.

14. Мандельштам М.Ю., Голубков В.И., Татищева Ю.А., Захарова Ф.М., Шакир X., Шевцов С.П., Скобелева Н.А., Липовецкий Б.М., Константинов В.О., Денисенко А.Д., Масленников А.Б., Гайцхоки

B.C., Шварц Е.И. Молекулярная генетика семейной гиперхолестеринемии: современное состояние вопроса в России / / Тихоокеанский медицинский журнал - 2002. - N 1 (8). - С. 10-11.

15. Мандельштам М.Ю., Голубков В.И., Ламбер Е.П., Брежнева Т.В., Семиглазов В.Ф., Гайцхоки B.C., Хансон К.П. Частая мутация гена BRCA1 у больных с семейными формами рака молочной железы в России// Тихоокеанский медицинский журнал - 2002. - N 1 (8). -

C. 59-60.

16. Мандельштам М.Ю. Что дало изучение семейной гиперхолестеринемии для понимания генетики дислипидемий?// Медицинская генетика. "Литера-2000", Москва. - 2003. - Т.2, N 12. -С. 509-519.

17. Мандельштам М.Ю. Изучение предрасположенности к развитию злокачественных онко, ^й^щЩюйЗШйШР1®' обусловленной

БИБЛИОТЕКА С» Петербург

О* sot «гг

наследуемыми мутациями в генах BRCA1 и BRCA2II "Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике". Под ред. А. Б. Масленникова. - Вып. 3. - Новосибирск, "Альфа Виста". -2004.-С. 92-109.

18. Мандельштам М.Ю., Захарова Ф.М., Голубков В.И., Масленников

A.Б., Татищева Ю.А., Липовецкий Б.М., Константинов В.О., Денисенко А.Д., Васильев В.Б. Диагностика семейной гиперхолестеринемии в России: достижения и проблемы // "Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике". Под ред. А.Б. Масленникова. - Вып. 6. - Новосибирск, "Альфа Виста". - 2004. -С. 9-23.

19. Грудинина Н.А., Голубков В.И., Тихомирова О.С., Брежнева Т.В., Хансон К.П., Васильев В.Б., Мандельштам М.Ю. Идентификация мутаций в гене BRCA1 у больных раком молочной железы Санкт-Петербурга // Вестник рентгенорадиологии. - 2004. -http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v3/papers/grudinv3.htm

20. Грудинина Н.А., Голубков В.И., Тихомирова О.С., Брежнева Т.В., Хансон К.П., Васильев В.Б., Мандельштам М.Ю. Преобладание широко распространенных мутаций в гене BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы Санкт-Петербурга// Генетика. - 2005. - Т. 41, N 3. - С. 405-410.

21. Захарова Ф.М., Голубков В.И., Липовецкий Б.М., Константинов

B.О., Мандельштам М.Ю., Васильев В.Б. Диагностика семейной гиперхолестеринемии у детей в семьях с отягощенной наследственностью// Вопросы современной педиатрии - 2005. - Т. 4., N1.-C. 15-18.

22. Zakharova F.M., Damgaard D., Mandelshtam M.Y., Golubkov V.I., Nissen P.H., Nilson G.G., Stenderup A., Lipovetsky B.M., Konstantinov V.O., Denisenko A.D., Vasilyev V.B., Faergeman O. Familial hypercholesterolemia in StPetersburg: the known and novel mutations found in the low density lipoprotein receptor gene in Russia //BMC Med. Genet. - 2005. - Vol. 6, No. 1. - P. 6 (http://www.biomedcentral.com/1471-2350-6-6"> (всего 10 страниц).

Финансирование исследований, составивших предмет настоящей диссертации, осуществлялось частично из средств Российского Фонда фундаментальных исследований (РФФИ) (проекты N 94-04-12266а, 97-0448887, 98-04-49869, 00-04-4896, 01-04-49627, 05-04-48235), Государственных программ "Геном человека", "Атеросклероз", "Ведущие научные школы России" и гранта фирмы "Merck" (MSGP #S-RUS-01-98-SCH).

Подписано в печать 23.09.2005. Формат 60x84/16 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ N5 1/2309. П. л. 2.25. Уч.-изд. л. 2.25. Т^раж 200 экз.

ЗАО «КопиСервис» Адрес юр.: 194017, Санкт-Петербург, Скобелевский пр., д. 16. Адрес факт.: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 5. тел.: (812) 327 5098

\ •w

»201 13

РНБ Русский фонд

2006-4 18086

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Мандельштам, Михаил Юрьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цель исследования

Задачи работы

Научная новизна

Теоретическое значение работы

Практическое значение работы

Положения, выносимые на защиту

Личный вклад автора

Апробация

Публикации

Структура и объем диссертации

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Семейная гиперхолестеринемия

1.1.1. Общая характеристика заболевания

1.1.2. Риск развития ишемической болезни сердца у носителей 20 мутаций в гене рецептора ЛНП

1.1.3. Место семейной гиперхолестеринемии среди моногенных гиперхолестеринемий

1.1.4. Рецептор липопротеинов низкой плотности - ключевой белок метаболизма холестерина в организме человека. Механизм атеросклероза при семейной гиперхолестеринемии

1.1.5. Диагностика семейной гиперхолестеринемии. Особенности и трудности разных видов диагностики

1.1.6. Структура гена рецептора ЛНП и кодируемого им белка; регуляция работы гена; взаимодействующие с рецептором белки

1.1.7. Спектры мутаций гена рецептора ЛНП в разных этнических группах

1.2. Рак молочной железы, обусловленный мутациями в гене

1.2.1. Особенности семейных форм рака молочной железы

1.2.2. Риск развития рака молочной железы у носительниц мутаций в гене BRCAJ в течение жизни

1.2.3. Структура гена BRCA1 и кодируемого им белка

1.2.4. Белок BRCA1 - ключевой участник репарации двунитевых разрывов в ДНК

1.2.4.1. Механизм развития заболевания при дефектах BRCA

1.2.4.2. Тканеспецифичность возникновения опухолей при мутациях в гене BRCA

1.2.5. Роль гена BRCA1 в развитии рака молочной железы в сопоставлении с другими генами

1.2.6. Современные подходы к клинической диагностике и профилактике семейных форм рака молочной железы

1.2.7. Спектры мутаций гена BRCA1 в разных этнических группах

1.3. Молекулярная диагностика семейной гиперхолестеринемии и семейных форм рака молочной железы: сравнительный аспект 87 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Пациенты

2.2. Выделение ДНК

2.3. Молекулярное клонирование

2.4. Амплификация и анализ ДНК 99 2.4.1. Полимеразная цепная реакция

2.4.2. Идентификация мутации R3500Q (с. 10658 G>A; CGG>CAG) в гене АРОВ с помощью сайт-направленного мутагенеза

2.4.3. Электрофорез продуктов амплификации ДНК в полиакриламидном геле (ПААГ)

2.4.4. Протокол получения и идентификации гетеродуплексов для определения мутаций 185delAG и 5382insC в гене BRCA

2.4.5. Проведение анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP-анализ)

2.4.6. Окрашивание ДНК серебром

2.4.7. Проведение электрофореза в агарозном геле 109 ^ 2.4.8. Секвенирование и анализ последовательностей ДНК

2.5. Компьютерный анализ и статистическая обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Изучение спектра мутаций в гене рецептора ЛНП и в гене BRCA1 в популяции Санкт-Петербурга. Общая стратегия исследования

3.2. Поиск мутаций в гене рецептора ЛНП. Особенности идентификации отдельных мутаций в гене рецептора ЛНП

3.3. Идентификация и изучение частоты встречаемости полиморфных маркеров в гене рецептора ЛНП

3.4. Изучение встречаемости широко распространенной мутации

R3500Q в гене АРОВ у больных семейной гиперхолестеринемией

Санкт-Петербурга

3.5. Поиск часто встречающихся в мире мутаций в гене BRCA1: 185delAG, 5382insC и C61G

3.6. Характеристика мутаций, найденных в одиннадцатом экзоне гена BRCA

3.7. Идентификация и изучение частоты встречаемости полиморфных маркеров в гене BRCA

3.8. Подготовка Интернет-ресурсов по молекулярной генетике семейной гиперхолестеринемии и наследуемых форм рака молочной железы

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Значение мутаций в гене рецептора ЛНП для развития семейной гиперхолестеринемии

4.2. Значение обнаруженных мутаций в гене BRCA1 для развития 154 рака молочной железы

4.3. Особенности спектра мутаций гена рецептора ЛНП и гена

BRCA1 России и Санкт-Петербурга

4.3.1. Сравнение спектра мутаций гена рецептора ЛНП в Санкт-Петербурге и в других популяциях мира

4.3.2. Сравнение спектра мутаций гена BRCA1 в Санкт-Петербурге и в других популяциях мира

4.3.3. Сравнение генетического разнообразия гена рецептора ЛНП и гена BRCA

4.4. Особенности и трудности ДНК-диагностики семейной гиперхолестеринемии и семейных форм рака молочной железы. Практическое значение работы

4.4.1. О наличии преобладающих мутаций в гене рецептора ЛНП и в генqBRCAI

4.4.2. Эффективность ДНК-диагностики

4.4.2.1. Возможный вклад других локусов в развитие моногенных форм гиперхолестеринемий и рака молочной железы у жителей Санкт-Петербурга

4.4.2.2. Проблемы эффективности поиска мутаций внутри генов

4.4.3. Результаты консультирования в семьях пробандов.

Перспективы в диагностике семейной гиперхолестеринемии и семейных форм рака молочной железы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ моногенных форм атеросклероза и рака молочной железы у жителей Санкт-Петербурга"

Актуальность проблемы

В Санкт-Петербурге отмечается один из самых высоких в России уровней заболеваемости как сердечно-сосудистыми, так и онкологическими заболеваниями (Государственный доклад, 2004). Распространенность сердечно-сосудистых заболеваний в городе в 1,6 раза выше, чем в целом по стране. Санкт-Петербург является "неблагополучным" районом России также и в отношении собственно рака молочной железы. В России максимальные показатели заболеваемости раком молочной железы (43,2 на 100 тыс. женщин) и смертности от него (20,3 на 100 тыс. женщин) зарегистрированы именно в Северо-Западном регионе (Аксель, Двойрин, 1992; Бармина, Трапезников, 1997; Трапезников, Аксель, 1997).

Сердечно-сосудистая и онкологическая патологии в целом относятся к мультифакториальным заболеваниям, в генезе которых имеют значение как наследственный компонент, так и факторы среды. Однако ряд достаточно широко распространенных форм этих заболеваний может быть объяснен преимущественно дефектами в одном гене. К таким формам относятся семейная гиперхолестеринемия (СГ), вызванная мутациями в гене рецептора липопротеинов низкой плотности (ЛНП), и семейные формы рака молочной железы, обусловленные дефектами в гене BRCA1. Эти формы рассматриваются в диссертации как моногенные по причине наличия ведущего генетического фактора риска развития ИБС у пациентов с СГ или рака у носителей мутаций гена BRCA1. Модифицирующее влияние на риск развития и тяжесть проявления этих заболеваний оказывают другие факторы, как генетические, так и средовые. Тем не менее, эти патологии, характеризующиеся ранней манифестацией и тяжелым течением, наследуются как аутосомно-доминантные менделевские признаки (Пузырев, 2003).

Дисфункция рецептора ЛНП при СГ вследствие мутаций в одноименном гене приводит к снижению скорости удаления липопротеинов из кровотока, развитию атеросклероза и существенному повышению риска ИБС. Наследуемые дефекты в гене опухолевого супрессора BRCA1 многократно увеличивают вероятность инактивации его второго аллеля в клетках молочной железы из-за соматических мутаций или гиперметилирования, что ведет к нарушению репарации ДНК и канцерогенезу. Знание мутаций, вызывающих заболевания, позволяет оценить их роль для структуры и функции белков и осуществлять ДНК-диагностику обсуждаемых патологий.

Цель исследования:

Задачи работы:

1. Изучить спектр мутаций гена рецептора ЛНП у больных СГ и спектр мутаций гена BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы из числа жителей Санкт-Петербурга;

2. Определить наличие преобладающих и повторно встречающихся мутаций в гене рецептора ЛНП и в гене BRCA1\

3. Провести сравнение спектра мутаций в гене рецептора ЛНП и в гене BRCA1 у жителей Санкт-Петербурга и стран Европы;

4. На основании экспериментальных и литературных данных обосновать роль обнаруженных мутаций в генах рецептора ЛНП и BRCAI для развития гиперхолестеринемии и рака молочной железы.

5. Оценить частоту встречаемости мутации R3500Q в гене АРОВ, вызывающей первичную гиперхолестеринемию, у пациентов с СГ — жителей Санкт-Петербурга;

Научная новизна.

В результате исследования впервые в России охарактеризовано 33 мутации гена рецептора ЛНП, из которых 18 были обнаружены впервые в мире. Продемонстрирована большая вариабельность гена рецептора ЛНП и практически полное отсутствие эффекта основателя применительно к мутациям этого гена в популяции Санкт-Петербурга, за исключением субпопуляции евреев-ашкенази. Показано, что мутация R3500Q в гене АРОВ не представлена у больных первичной гиперхолестеринемией из Санкт-Петербурга. У пациентов с семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге идентифицировано 8 мутаций в гене BRCA1, из них 6 - являются новыми для России, а одна была ранее не известна в мире. Показано наличие преобладающей мутации 5382insC в гене BRCA1 в Российской популяции, что существенно облегчает ДНК-диагностику заболевания. При сравнении спектров мутаций гена рецептора ЛНП и гена BRCA1 в Санкт-Петербурге, в России и в странах Европы сделаны обобщения, которые могут иметь значение при изучении мутационных спектров новых локусов, ответственных за моногенные патологии.

Исследования генетики СГ в России проведены нами впервые (Мандельштам и др., 1988, 1990), а исследования гена BRCA1 в Санкт-Петербурге начали осуществляться (Мандельштам и др., 2001) вскоре после публикации первой совместной работы московских и английских ученых (Gayther et al., 1997). Благодаря этим исследованиям Санкт-Петербург стал регионом России, в котором к настоящему времени охарактеризовано больше видов мутаций в гене рецептора ЛНП и BRCA1, чем где-либо в стране.

Теоретическое значение работы.

Определен спектр мутаций гена рецептора ЛНП и гена BRCA1 в ранее не изучавшейся популяции Санкт-Петербурга, что представляет интерес для сравнительной популяционной генетики. Показано, что в отношении спектра мутаций гена рецептора ЛНП российская популяция занимает свое, достаточно обособленное место среди других изученных популяций. В то же время продемонстрировано, что у онкологических больных Санкт-Петербурга преобладают широко распространенные в

Европе мутации гена BRCA1. На основании оригинальных экспериментальных данных сделано теоретически важное обобщение, что в пределах одной популяции эффект основателя может быть выражен применительно к одним генам и отсутствовать применительно к другим.

Практическое значение работы.

Идентифицировано 33 мутации гена рецептора ЛНП, из числа которых 30 могут вести к развитию СГ, и 8 мутаций гена BRCA1, 7 из которых являются вероятной причиной развития рака молочной железы. Разработаны быстрые методы обнаружения охарактеризованных мутаций гена рецептора ЛНП и гена BRCA1, которые могут быть внедрены в практическое здравоохранение. Непосредственно осуществлена ДНК-диагностика СГ в семьях 41 пробанда, включая 69 кровных родственников, а также в семьях 11 пробандов с мутациями в гене BRCA1. Показано отсутствие вклада мутаций гена АРОВ в развитие первичных гиперхолестеринемий в Санкт-Петербурге. Выявлена наиболее распространенная мутация гена BRCA1 5382insC, тестирование которой в первую очередь должно быть рекомендовано родственникам больных с семейными формами рака молочной железы или яичника.

Положения, выносимые на защиту.

3. Среди мутаций гена BRCA1, идентифицированных у Санкт-Петербургских пациентов с раком молочной железы и семейной историей заболевания, преимущественно встречаются варианты последовательности, уже известные в странах Восточной Европы.

4. Мажорной мутацией в гене BRCA1 в Санкт-Петербурге, и, по-видимому, во всей России в силу эффекта основателя или других причин является инсерция 5382insC.

5. Абсолютное большинство идентифицированных мутаций гена рецептора ЛНП и гена BRCA1 является причиной семейной гиперхолестеринемии и семейной предрасположенности к раку молочной железы.

6. Мутация R3500Q гена АРОВ, являющаяся частой причиной первичной гиперхолестеринемии в Европе, крайне редко встречается или отсутствует в Санкт-Петербурге.

7. Учитывая характер преобладающих мутаций в гене BRCA1 (инсерции и делеции), можно рекомендовать гетеродуплексный анализ для их эффективного выявления и обнаружения новых мутаций. Для поиска мутаций в гене рецептора ЛНП из-за преобладания в нем нуклеотидных замен предпочтительно применение других методов.

Личный вклад автора.

Автором создана коллекция ДНК больных СГ и семейными формами рака молочной железы, лично проведены все опыты по клонированию мутантных аллелей в плазмидных векторах, выполнено большинство опытов по первичной идентификации мутаций и секвенированию ДНК, осуществлен анализ наследования мутаций в семьях пробандов. Часть работы проделана совместно с Ф.М. Захаровой, Ю.А. Татищевой, Н.А. Грудининой и В.И. Голубковым. Несколько опытов по секвенированию ДНК произведено X. Шакиром и С.П. Шевцовым в лаборатории проф. Е.И. Шварца (Санкт-Петербургский Институт ядерной физики РАН), что оговорено в соответствующих местах текста. Сотрудниками лаборатории проф. Е.И.Шварца также определены генотипы локуса АРОЕ у пациентов с мутацией deltaG197. Отбор пациентов для исследования гена рецептора ЛНП выполнен проф. Б.М.Липовецким (НИИЭМ АМН СССР, Институт мозга РАН) и проф. В.О. Константиновым (НИИЭМ РАМН), а для исследования гена BRCA1 осуществлен врачом-генетиком Т.В. Брежневой (НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова). При создании автором Интернет-ресурса по СГ и раку молочной железы на сайте ГУ НИИЭМ РАМН компьютерный дизайн обеспечила А.А.Дзенискевич (Научная библиотека ГУ НИИЭМ РАМН).

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на 36 международных, всероссийских и региональных конференциях. В более полном виде материалы диссертации были заслушаны на научных семинарах Института экспериментальной медицины РАМН (Санкт-Петербург), Института медицинской генетики ТНЦ РАН (Томск), Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ (Москва), Тартусского университета (Эстония).

Публикации.

По теме диссертации после присвоения автору степени кандидата биологических наук опубликовано 72 печатные работы, в том числе 22 статьи и 50 тезисов в материалах конференций. Из числа напечатанных статей 17 являются непосредственно изложением экспериментальных результатов, а пять - обзорами, включающими результаты собственных исследований. Две из пяти обзорных статей по теме диссертации написаны без соавторов. Из числа 22 статей четыре опубликованы в зарубежных рецензируемых журналах, 18 - в отечественных, преимущественно реферируемых, журналах и сборниках. Из числа 17 опубликованных статей с изложением результатов экспериментов, 15 напечатаны в журналах, | рекомендуемых ВАК. По материалам диссертации подготовлено 48 Интернет-страниц на русском и английском языках.

Структура и объем диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мандельштам, Михаил Юрьевич

6. ВЫВОДЫ.

5. Из 33 найденных мутаций гена рецептора ЛНП 30 являются вероятной причиной семейной гиперхолестеринемии, а из 8 охарактеризованных мутаций гена BRCA1 7 вызывают предрасположенность к раку молочной железы.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Выполнение настоящей работы было бы невозможно без руководства и поддержки со стороны члена-корреспондента РАМН

Владимира Соломоновича Гайцхоки| (ГУ НИИИЭМ РАМН), при деятельном участии которого были сформулированы основные направления настоящего исследования. Существенный импульс исследованиям генетики семейной гиперхолестеринемии в Санкт

Петербурге был дан профессором Евгением Иосифовичем Шварцем (ПИЯФ РАН).

Считаю своей приятной обязанностью выразить благодарность всем своим коллегам, с которыми вместе были получены результаты настоящей диссертации.

Финансирование исследований, составивших предмет настоящей диссертации, осуществлялось частично из средств Российского Фонда фундаментальных исследований (РФФИ), а также Государственных программ "Геном человека" и "Атеросклероз". Изучение спектра мутаций гена BRCA1, предрасполагающих к развитию семейных форм рака молочной железы в Санкт-Петербурге было поддержано грантами РФФИ 98-04-49869 и 01-04-49627 (руководитель - М.Ю. Мандельштам). Исследование генетики семейной гиперхолестеринемии финансировалось из средств проектов 94-04-12266а, 97-04-48887, 00-04-48962 (руководитель

В С Гяштуок-и и 05-04-48235 (руководитель М.Ю. Мандельштам). Часть денежных средств на данную работу поступила также от Программы

Ведущие научные школы России" (руководитель З.С. Гайцхоки, впоследствии В.Б. Васильев) и от фирмы "Merck" (руководитель проекта MSGP #S-RUS-01 -98-SCbj Е.И.Шварц

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

На основании анализа литературных данных о больших различиях в спектре мутаций гена рецептора ЛНП между разными странами Европы и отсутствии мажорных мутаций в восточноевропейских популяциях было сделано предположение, что спектр мутаций при СГ в Санкт-Петербурге будет характеризоваться большим своеобразием, и преобладающих дефектов в этом гене в России найти не удастся. Напротив, наличие общих, в том числе одних и тех же мажорных мутаций в гене BRCA1 в Польше, Чехии и некоторых других европейских популяциях давало основание предполагать, что у онкологических больных Санкт-Петербурга будут найдены преимущественно такие же мутации гена BRCA1, что и в популяциях других стран. Наиболее вероятной преобладающей мутацией в гене BRCA1 в Санкт-Петербурге могла оказаться инсерция 5382insC. Изученные нами спектры мутаций гена рецептора ЛНП и гена BRCA1 в Санкт-Петербурге в значительной мере подтвердили это предсказание. Действительно, из 33 мутаций гена рецептора ЛНП, идентифицированных в Санкт-Петербурге, 18 оказались новыми, не описанными в других странах мира. Применительно к гену BRCA1 картина оказалась совершенно другой: из 8 найденных мутаций лишь одна была новой. Таким образом, диагностика СГ и семейных форм рака молочной железы должна быть построена по-разному: ориентироваться в первую очередь на поиск известных вариантов в случае гена BRCA1 и быть готовой к обнаружению преимущественно неизвестных мутаций при изучении гена рецептора ЛНП. Еще один важный для диагностики аспект состоит в выраженности эффекта основателя в Санкт-Петербургской популяции применительно к мутациям гена BRCA1: инсерция 5382insC ответственна за 10% всех случаев семейных и ранних форм рака молочной железы, и ее можно обнаружить приблизительно в 40% семей с раком яичника.

Напротив, в случае гена рецептора ЛНП в изученной санкт-петербургской выборке, за исключением этнической группы литовских евреев-ашкенази, отсутствовали мажорные мутации гена рецептора ЛНП. Из числа 29 обнаруженных в славянской популяции Санкт-Петербурга мутаций гена рецептора ЛНП, вызывающих СГ, только пять мутаций, , - C139G, c.313+lG>A, c.651-653del3, W422X и C308Y были найдены в двух семьях, а остальные - в уникальных семьях. Эти данные определяют различную стратегию ДНК диагностики в случае семейных форм рака молочной железы, когда следует предлагать пациентам в первую очередь тестирование на мажорные и распространенные мутации, и в случае гена рецептора ЛНП, когда необходимо сразу приступать к изучению всей последовательности гена. Полученные в настоящем исследовании данные о мутациях гена рецептора ЛНП и гена BRCA1 могут быть использованы для создания диагностических наборов, а некоторые тесты на мутации, например на инсерцию 5382insC, уже вошли в практику здравоохранения. Из всех мутаций в гене рецептора ЛНП, как в мире, так и в Санкт-Петербурге преобладают нуклеотидные замены, в гене BRCA1 - короткие делеции и инсерции. Это определяет разные методические подходы к поиску новых и известных мутаций в обсуждаемых генах. Гетеродуплексный анализ, особенно эффективно выявляющий короткие делеции и инсерции, будет наилучшим скрининговым методом при семейных формах рака молочной железы. Напротив, для СГ потребуется применять секвенирование всего гена рецептора ЛНП или высокочувствительный автоматизированый SSCP-анализ для идентификации большинства новых мутаций.

При изучении 74 пробандов с клиническим диагнозом СГ - жителей Санкт-Петербурга не было найдено ни одного носителя мутации R3500Q в гене АРОВ, являющейся частой причиной дислипидемии и связанного с ней атеросклероза в Европе. В той же группе пробандов был выявлен 41 носитель мутаций гена рецептора ЛНП, способных вызвать развитие этого заболевания. Это обстоятельство свидетельствует о крайне низкой частоте встречаемости или отсутствии мутации R3500Q в популяции Санкт-Петербурга и позволяет клиницистам при проведении ДНК-диагностики наследуемых гиперхолестеринемий сосредоточить внимание на изучении локуса рецептора ЛНП, а не локуса АРОВ.

Важным обобщением работы следует считать необходимость оценки возможного эффекта основателя в самом начале исследования локусов наследственных заболеваний, ранее не изучавшихся в стране, то есть еще перед началом разработки диагностических алгоритмов. Эта оценка для России отчасти может быть сделана путем сопоставления данных по спектрам мутаций популяций Восточной Европы, но должна быть в каждом случае подтверждена экспериментально. При наличии эффекта основателя, как в случае мутаций гена BRCA1, диагностика моногенного заболевания может упроститься за счет первоочередного тестирования мажорных мутаций. В отсутствие преобладающих мутаций, как в случае гена рецептора ЛНП при СГ, для выявления генных дефектов и проведения ДНК-диагностики потребуется совершенно другой, заметно больший объем предварительных исследований и скрининговых процедур. Возможность различной степени выраженности эффекта основателя в одной и той же популяции, но применительно к разным заболеваниям, следует учитывать клиницистам, задумывающимся о начале исследования новых моногенных патологий в России.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Мандельштам, Михаил Юрьевич, Санкт-Петербург

1. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: В 3-х т. Т 3. Пер. с англ.: М.: Мир, 1988. - 335 с.

2. Аксель Е.М., Двойрин В.В. Статистика злокачественных новообразований: заболеваемость, смертность, тенденции, социально-экономический ущерб, продолжительность жизни. М. 1992.

3. Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности». (Введение в предиктивную медицину). СПб: Интермедика, 2000. - 272 с.

4. Барановская С. С., Шевцов С.П., Максимова С. П. и др. Спектр мутационных повреждений гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией г. Санкт-Петербурга // Докл. АН. 1995. -N340.-C. 709-711.

5. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб.: "Специальная литература", 1997. - 287 с.

6. Государственный доклад о состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2002 году // Здравоохранение Российской Федерации. -2004. -N 1. С. 3-18; N 2. С. 3-23; N 3. С. 3-26.

7. Грудипина Н.А., Голубков В.И., Тихомирова О.С. и др. Идентификация мутаций в гене BRCA1 у больных раком молочной железы Санкт-Петербурга // Вестник РНЦРР МЗ РФ. 2004. - N 3. -http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v3/papers/grudin v3.htm

8. М.Карпухин А.В., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н. и др. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в гене BRCA1 при наследственно обусловленном раке молочной железы и яичников // Доклады академии наук. 2002. - Т. 383, N 5. - С. 706 - 709.

9. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. СПб.: Питер Пресс, 1995. - 304 с.

10. Липовецкий Б.М. Клиническая липидология. СПб.: Наука, 2000119 с.

11. Липовецкий Б.М., Мандельштам М.Ю., Васильева Л.Е. и др. О частоте и проявлениях «литовской» мутации среди евреев с гиперлипидемией II типа и их реакции на лечение флувастатином // Кардиология. 1998. - Т. 38, N 5. - С. 39 - 41.

12. Мандельштам М.Ю., Липовецкий Б.М., Шварцман А.Л., Гайцхоки

13. B. С. Идентификация новой делеции в гене рецептора липопротеинов низкой плотности человека у пациента с семейной гиперхолестеринемией // Биополимеры и клетка. 1991. - Т. 7, N 3.1. C. 38-45.

14. Мандельштам М.Ю., Липовецкий Б.М., Шварцман А.Л., Гайцхоки B.C. Мультиэкзонная делеция в гене рецептора липопротеинов низкой плотности человека как причина семейной гиперхолестеринемии // Генетика. 1995а. - Т. 31, N 2. - С. 259 -263.

15. Мандельштам М.Ю., Липовецкий Б.М., Шварцман А.Л., Гайцхоки В. С. Молекулярная гетерогенность семейной гиперхолестеринемии в популяции жителей Санкт-Петербурга // Генетика. 19956. - Т. 31, N4.-С. 521 -527.

16. Мандельштам М.Ю., Сасина Л.К., Шварцман А.Л. ДНК-диагностика семейной гиперхолестеринемии // Биополимеры и клетка. 1990. -Т. 6,N 1.-С. 56-63.

17. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. М.: Мир, 1984.-480 с.

18. ЪЪ.Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Любченко Л.Н. и др. Гетерогеность семей с наследственной предрасположенностью к раку молочной железы и яичников по встречаемости мутаций BRCA1 // Медицинская генетика. 2003. - Т. 2, N 11. - 459 - 463.

19. Пузырев В.П. Генетика мультифакториальных заболеваний: между прошлым и будущим // Медицинская генетика. 2003. - Т. 2., N 12. -С. 498-508.

20. Рунова О.Л., Мандельштам М.Ю., Голубков В.И. и др. Экспрессия фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в клетках Escherichia coli II Биохимия. 1997. - Т. 62, N 8. - С. 1037 - 1044.

21. Татищева Ю.А., Мандельштам М.Ю., Голубков В.И. и др. Четыре новые мутации и полиморфные варианты гена рецептора липопротеинов низкой плотности у пациентов с семейнойгиперхолестеринемией Санкт-Петербурга // Генетика. 2001. - Т. 31, N9.-С. 1290-1295.

22. Ъ9.Шевцов С.П. Отсутствие ДНК-полиморфизмов на участке гена АРОВ, кодирующем предполагаемый домен связывания белка АроВ-100 с рецептором липопротеидов низкой плотности // Генетика. -1996. Т. 32, N 2. - С. 295 - 297.

23. Al.Amsellem S., Briffaut D., Carrie A. et al. Intronic mutations outside of Alu-repeat-rich domains of the LDL receptor gene are a cause of familial hypercholesterolemia // Hum. Genet. 2002. - Vol. 111. - P. 501 - 510.

24. Antoniou A.C., Gayther S.A., Stratton J.F. et al. Risk models for familial ovarian and breast cancer // Genet. Epidemiol. 2000. - Vol. 18, N 2. -P. 173- 190.

25. Al.Bar-Sade R.B., Kruglikova A., Modan B. et al. The 185delAG BRCA1 mutation originated before the dispersion of Jews in the Diaspora and is not limited to Ashkenazim // Hum. Mol. Genet. 1988. - Vol. 7, N 5. - P. 801 -805.

26. Bassam B.J., Caetano-Anolles G., GresshoffP.M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels //Anal. Biochem. 1991. - Vol. 196, N 1. - P. 80 - 83 (Erratum in: Anal. Biochem. - 1991. -Vol. 198, N 1. - P. 217).

27. A9.Beaumont V.B., Jacotot В., Beaumont J.-L. Ischaemic disease in men and women with familial hypercholesterolaemia and xanthomatosis // Atherosclerosis. 1976. - Vol. 24. - P. 441 - 450.

28. Bergthorsson J.Т., Ejlertsen В., Olsen J.H. et al. BRCA1 and BRCA2 mutation status and cancer family history of Danish women affected with multifocal or bilateral breast cancer at a young age // J. Med. Genet. -2001.-Vol. 38,N6.-P. 361 -368.

29. Bieri S., Djordjevic J.T., Jamshidi N. et al. Expression and disulfide-bond connectivity of the second ligand-binding repeat of the human LDL receptor // FEBS Lett. 1995b. - Vol. 371, N 3. - P. 341 - 344.

30. Bilheimer D. W., Ho Y.K., Brown M.S. et al. Genetics of the low density lipoprotein receptor. Diminished receptor activity in lymphocytes from heterozygotes with familial hypercholesterolemia // J. Clin. Invest. -1978. Vol. 61, N 3. - P. 678 - 696.

31. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids. Res. 1979. -Vol.7, N6.-P. 1513- 1524.

32. Blacklow S.C., Kim P.S. Protein folding and calcium binding defects arising from familial hypercholesterolemia mutations of the LDL receptor // Nat. Struct. Biol. 1996. - Vol. 3, N 9. - P. 758 - 762.

33. Brown M.S., Herz J., Goldstein J.L. Calcium cages, acid baths and recycling receptors // Nature. 1997. - Vol. 388, N 6643. - P. 629-630.

34. ЬА.Випп C.F., Lintott C.J., Scott R.S., George P.M. Comparison of SSCP and DHPLC for the detection of LDLR mutations in a New Zealand cohort // Hum. Mutat. 2002. - Vol. 19. - P. 311.

35. Burke W., Daly M., Garber J. et al. Recommendations for follow-up care of individuals with an inherited predisposition to cancer. II. BRCA1 and BRCA2. Cancer Genetics Studies Consortium // JAMA. 1997. - Vol. 277, N 12.-P. 997-1003.

36. Callebaut I., Mornon J.P. From BRCA1 to RAP1: a widespread BRCT module closely associated with DNA repair // FEBS Lett. 1997. - Vol. 400.-P. 25-30.

37. Ы.Сагтепа R., Roy M., Roederer G. et al. Coexisting dysbetalipoproteinemia and familial hypercholesterolemia. Clinical and laboratory observations // Atherosclerosis. 2000. - Vol. 148, N 1. - P. 113-124.

38. Chakir Kh., Mandelshtam M.Ju., Shevtsov S.P. et al. Two novel low density lipoprotein receptor gene mutations (E397X and 347delGCC) in St.Petersburg familial hypercholesterolemia//Molecular Genet. Metabol. -1998a. Vol. 65, N 4. - P.311 - 314.

39. Couture P., Vohl M.C., Gagne C. et al. Identification of three mutations in the low-density lipoprotein receptor gene causing familial hypercholesterolemia among French Canadians // Hum. Mutat. 1998. -Suppl l.-P. 226-231.

40. Davis C.G., Lehrman M.A., Russell D.W. et al The J.D. mutation in familial hypercholesterolemia: aminoacid substitution in cytoplasmic domain impedes internalisation of LDL receptors // Cell. 1986b. - Vol. 45,N l.-P. 15-24.

41. Dedoussis G.V.Z., Schmidt H., Genschel J. LDL-receptor mutations in Europe // Hum. Mutat. 2004b. - Vol. 24. - P. 443 - 459.

42. Zl.Dufault M.R., Betz В., Wappenschmidt B. et al. Limited relevance of the CHEK2 gene in hereditary breast cancer // Int. J. Cancer. 2004. - Vol. 110, N3.-P. 320-325.

43. Dunning A.M., Chiano M., Smith N.R. et al. Common BRCA1 variants and susceptibility to breast and ovarian cancer in the general population // Hum. Mol. Genet. 1997. - Vol. 6, N 2. - P. 285 - 289.

44. Einbeigi Z., Bergman A., Kindblom L.G. et al. A founder mutation of the BRCA1 gene in Western Sweden associated with a high incidence of breast and ovarian cancer // Eur. J. Cancer. 2001. - Vol. 37, N 15. - P. 1904- 1909.

45. Elledge S.J., Amon A. The BRCA1 suppressor hypothesis: an explanation for the tissue-specific tumor development in BRCA1 patients // Cancer Cell. 2002. - Vol. 1. - P. 129 - 132.

46. Evans D.G., Howell A. Are BRCA1- and BRCA2-related breast cancers associated with increased mortality? // Breast Cancer Res. 2004. - Vol. 6.-R8-R17.

47. Fan J., Ranu R.S., Smith C. et al. DNA sequencing with a-33P. labeled ddNTP terminators: a new approach to DNA sequencing with ThermoSequenaseTM DNA polymerase // BioTechniques. 1996. - Vol. 21, N 6. - P. 1132-1137.

48. Fass D., Blacklow S., Kim P.S., Berger J.M. Molecular basis of familial hypercholesterolemia from structure of LDL receptor module // Nature. 1997. - Vol. 388, N 6643. - P. 691 - 693.

49. Fellin R., Zuliani G., Area M. et al. Clinical and biochemical characterization of patients with autosomal recessive hypercholesterolemia (ARH) // Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 2003. -Vol. 13, N5.-P. 278-286.

50. Fodor F.H., Weston A., Bleiweis I.J. et al. Frequency and carier risk associated with common BRCA1 and BRCA2 mutations in Ashkenazi Jewish breast cancer patients // Am. J. Hum. Genet. 1998. - V. 63. - P. 45-51.

51. Foretova L., Machackova E., Navratilova M. et al. BRCA1 and BRCA2 mutations in women with familial or early-onset breast/ovarian cancer in the Czech Republic // Hum. Mutat. 2004. - Vol.23, N 4. - P. 397 - 398.

52. Fouchier S. W., Defesche J.C., Umans-Eckenhausen M.W., Kastelein J.P. The molecular basis of familial hypercholesterolemia in The Netherlands // Hum. Genet. 2001. - Vol. 109, N 6. - P. 602 - 615.

53. Foulkes W.D., Stefansson I.M., Chappuis P.O. et al. Germline BRCA1 mutations and a basal epithelial phenotype in breast cancer // J. Natl. Cancer Inst. 2003. - Vol. 95, N 19. - P. 1482 - 1485.

54. Frank T.S., Deffenbaugh A.M., Reid J.E. et al Clinical characteristics of individuals with germline mutations in BRCA1 and

55. BRCA2: analysis of 10,000 individuals // J. Clin. Oncol. 2002. - Vol. 20, N6.-P. 1480-1490.

56. Friedman L.S., Ostermeyer E.A., Szabo C.I. et al. Confirmation of BRCA1 by analysis of germline mutations linked to breast and ovarian cancer in ten families //Nat. Genetics. 1994. - Vol. 8. - P. 399 - 404.

57. Gagne C., Moorjani S., Brun D. et al. Heterozygous familial hypercholesterolemia // Atherosclerosis. 1979. - Vol. 34. - P. 13 - 24.

58. Garcia C.K., Wilund K., Area M. et al. Autosomal recessive hypercholesterolemia caused by mutations in a putative LDL receptor adaptor protein // Science. 2001. - Vol. 292. - P. 1394 - 1398.

59. Gayther S.A., Harrington P., Russell P. et al. Rapid detection of regionally clustered germ-line BRCA1 mutations by multiplex heteroduplex analysis // Am. J. Hum. Genet. 1996. - Vol. 58. - P. 451 -456.

60. Gayther S.A., Harrington P., Russell P. et al. Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia // Am. J. Hum. Genet. 1997. - Vol. 60, N 5. - P. 1239 - 1242.

61. Gayther S.A., Russell P., Harrington P. et al. The contribution of germline BRCA1 and BRCA2 mutations to familial ovarian cancer: no evidence for other ovarian cancer-susceptibility genes // Am. J. Hum. Genet. 1999. - Vol. 65. - P. 1021 - 1029.

62. Goelen G„ Teugels E., Bonduelle M. et al. High frequency of BRCA1/2 germline mutations in 42 Belgian families with a small numberof symptomatic subjects // J. Med. Genet. 1999. - Vol. 36, N 4. - P. 304 -308.

63. Goldstein J.L., Basu S.K., Brown M.S. Receptor-mediated endocytosis of low-density lipoprotein in cultured cells // Meth. Enzymol. 1983. - Vol. 98. - P. 241 - 260.

64. Goldstein J.L., Brown M.S. The LDL receptor and the regulation of cellular cholesterol metablism // J. Cell. Sci. 1985. - Suppl. N 3. - P. 131-137.

65. Goldstein J.L., Brown M.S. Molecular medicine. The cholesterol quartet//Science.-2001.-Vol. 292.-P. 1310-1312.

66. Goldstein J.L., Hobbs H.H., Brown M.S. Familial hypercholesterolemia // In: The metabolic and molecular basis of inherited disease. Vol. III. / Eds. C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, D. Valle. N.Y., McGraw Hill. 2001. - P. 2863 - 2914.

67. Gompel A., Somai S., Chaouat M. et al. Hormonal regulation of apoptosis in breast cells and tissues // Steroids. 2000. - Vol. 65, N 10-11.-P. 593-598.

68. Gorski В., Byrski Т., Huzarski T. et al. Report founder mutations in the BRCA1 gene in Polish families with breast-ovarian cancer // Am. J. Hum. Genet. 2000. - Vol. 66. - P. 1963 - 1968.

69. Gorski В., Jakubowska A., Huzarski T. et al. A high proportion of founder BRCA1 mutations in Polish breast cancer families // Int. J. Cancer. 2004. - Vol. 110, N 5. - P. 683 - 686.

70. Gorski В., Kubalska J., Naruszewicz M., Lubinski J. LDL-R and Apo-B-100 gene mutations in Polish familial hypercholesterolemias // Hum. Genet. 1998. - Vol. 102, N 5. - P. 562 - 565.

71. Gowen L.C., Avrutskaya A.V., Latour A.M. et al BRCA1 required for transcription-coupled repair of oxidative DNA damage // Science. -1998. Vol. 281, N 5379. - P. 1009 - 10012.

72. Gowen L.C., Johnson B.L., Latour A.M. et al. BRCA1 deficiency results in early embryonic lethality characterized by neuroepithelial abnormalities//Nat. Genet.-1996.-Vol. 12, N 2.-P. 191 194.

73. Greenman J., Mohammed S., Ellis D. et al. Identification of missense and truncating mutations in the BRCA1 gene in sporadic and familial breast and ovarian cancer // Genes Chromosomes Cancer. 1998. -Vol.21,N3.-P. 244-249.

74. Grzybowska E., Zientek H., Jasinska A. et al. High frequency of recurrent mutations in BRCA1 and BRCA2 genes in Polish families with breast and ovarian cancer // Hum. Mutat. 2000. - Vol. 16, N 6. - P. 482 -490.

75. Gudnason V., Sigurdsson G., Nissen H., Humphries S.E. Common founder mutation in the LDL receptor gene causing familial hypercholesterolemia in the Icelandic population // Hum. Mutat. 1997. -Vol. 10.-P. 36-44.

76. Gyllensten U.B., Erlich H.A. Generation of single-stranded DNA by the polymerase chain reaction and its application to direct sequencing of the HLA-DQA locus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1988. Vol. 85, N 20.-P. 7652-7656.

77. Hall J.M., Lee M.K., Newman B. et al. Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21 // Science. 1990. - Vol. 250.-P. 1684- 1689.

78. Hamalainen Т., Palotie A., Aalto-Setala К et al. Absence of familial defective apolipoprotein B-100 in Finnish patients with elevated serum cholesterol // Atherosclerosis. 1990. - Vol. 82. - P. 177 - 183.

79. Hansen P.S. Familial defective apolipoprotein B-100 // Dan. Med. Bull. 1998. - Vol. 45. - P. 370 - 382.

80. Hansen P. S., Defesche J. C., Kastelein J. J. P. et al. Phenotypic variation in patients heterozygous for familial defective apolipoprotein В (FDB) in three European countries // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. -1997.-Vol. 17.-P. 741 -747.

81. Hansen P.S., Rudiger N., Tybjaerg-Hansen A. et al. Detection of the apoB-3500 mutation (glutamine for arginine) by gene amplification and cleavage with Msp I // J. Lipid Res. 1991. - Vol. 32, N 7. - P. 1229- 1233.

82. HaciaJ.G., Brody L.C., Chee M.S. et al. Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-colour fluorescence analysis // Nat. Genet. 1996. - Vol. 14, N. 4 - P. 441-447.

83. Heath K.E., Humphries S.E., Middleton-Price H., Boxer M. A molecular genetic service for diagnosing individuals with familial hypercholesterolaemia (FH) in the United Kingdom // Eur. J. Hum. Genet.- 2001. Vol. 9, N 4. - P. 244 - 252.

84. Heath K.E., Whittall R.S., Miller G.J., Humphries S.E. 1705 variant in the low density lipoprotein receptor gene has no effect on plasma cholesterol levels // J. Med. Genet. 2000. - Vol. 37, N 9. - P. 713 - 715.

85. Heimdal K., Maehle L., Apold J. et al. The Norwegian founder mutations in BRCA1: high penetrance confirmed in an incident cancer series and differences observed in the risk of ovarian cancer // Eur. J. Cancer. 2003. - Vol. 39, N 15. - P. 2205 - 2213.

86. Hobbs H.H., Brown M.S., Goldstein J.L. Molecular genetics of the LDL receptor gene in familial hypercholesterolemia // Hum. Mutat. -1992.-Vol. l.-P. 445-466.

87. Hobbs H.H., Brown M.S., Russell D.W. et al. Deletion in the gene for the low-density-lipoprotein receptor in a majority of French Canadians with familial hypercholesterolemia // N. Engl. J. Med. 1987a. - Vol. 317,N 12.-P. 734-737.

88. Hobbs H.H., Esser V., Russell D.W. Ava II polymorphism in the human LDL receptor // Nucleic Acids Res. 1987b. - Vol. 15, N 1. - P. 379.

89. Hobbs H.H., Russell D.W., Brown M.S., Goldstein J.L. The LDL receptor locus in familial hypercholesterolemia: mutational analysis of a membrane protein // Annu. Rev. Genet. 1990. - Vol. 24. - P. 133 - 170.

90. Horsthemke В., Dunning A., Humphries S. Identification of deletions in the human low density lipoprotein receptor gene // J. Med. Genet.- 1987.-Vol. 24.-P. 144-147.

91. Horton J.D., Goldstein J.L., Brown M.S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver // J. Clin. Invest. 2002. - Vol. 109, N 9. - P. 1125 - 1131.

92. Horvath A., Ganev V. The mutation АРОВ-100 R3500Q in Eastern Europe // Atherosclerosis. 2001. - Vol. 156. - P. 241 - 242.

93. Horvath A., Savov A., Kirov S. et al. High frequency of the ApoB-100 R3500Q mutation in Bulgarian hypercholesterolaemic subjects // J. Med. Genet. 2001. - Vol. 38. - P. 536 - 540.

94. Hunt S.C., Hopkins P.N., Bulka K. et al. Genetic localization to chromosome lp32 of the third locus for familial hypercholesterolemia in a Utah kindred // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000. - Vol. 20. - P. 1089-1093.

95. Huusko P., Paakkonen K., Launonen V. et al. Evidence of founder mutations in Finnish BRCA1 and BRCA2 families // Am. J. Hum. Genet. 1998. - Vol. 62, N 6. - P. 1544 - 1548.

96. Ikeda N., Miyoshi Y., Yoneda K. et al. Frequency of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese breast cancer families // Int. J. Cancer.-2001.-Vol. 19, N l.-P. 83-88.

97. Innerarity T. L., Mahley R.W., Weisgraber K.H. et al. Familial defective apolipoprotein B-100: a mutation of apolipoprotein В that causes hypercholesterolemia // J. Lipid Res. 1990. - Vol. 31. - P. 1337 - 1349.

98. Innerarity T. L., Weisgraber К. H., Arnold K. S. et al. Familial defective apolipoprotein B-100: low density lipoproteins with abnormal receptor binding // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1987. Vol. 84. - P. 6919-6923.

99. Jacquemier J., Lidereau R., Birnbaum D. et al. Assessing the risk of BRCA1-associated breast cancer using individual morphological criteria // Histopathol. 2001. - Vol. 38. - P. 378 - 379.

100. Jensen U.K. The molecular genetic basis and diagnosis of familial hypercholesterolemia in Denmark // Dan. Med. Bull. 2002. - Vol. 49. -P. 318-345.

101. Jensen U.K., Jensen L., Hansen P.S. et al. A G-l-to-A acceptor splice site LDLR mutant allele leads to reduced relative transcript levels in patients with heterozygous familial hypercholesterolemia // Clin. Genet. 1996a. - Vol. 49. - P. 175 - 179.

102. Jensen H.K., Jensen L.G., Hansen P.S. et al. The Trp23 stop and Тгрбб - gly mutations in the LDL-receptor gene: common causes of familial hypercholesterolemia in Denmark // Atherosclerosis - 1996b. -Vol. 120.-P. 57-65.

103. Jensen J., Blankenhorn D.H., Kornerup V. Coronary disease in familial hypercholesterolemia // Circulation. 1967. - Vol. 36. - P. 77 -82.

104. KauffN.D., Perez-Segura P., Robson M.E. et al. Incidence of non-founder BRCA1 and BRCA2 mutations in high risk Ashkenazi breast and ovarian cancer families // J. Med. Genet. 2002. - Vol. 39. - P. 611 -614.

105. Kiechle M., Gross E., Schwarz-Boeger U. et al. Ten novel BRCA1 and BRCA2 mutations in breast and/or ovarian cancer families from northern Germany // Hum. Mutat. 2000. - Vol. 16, N 6. - P. 529 - 530 (Mutation in Brief #379 (2000) Online).

106. King M.-C., Marks J.H., Mandell J.B., New York Breast Cancer Study Group. Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2 // Science. 2003. - Vol. 302, N 5645. - P. 643 -646.

107. Kingsley D.M., Krieger M. Receptor-mediated endocytosis of low density lipoprotein: Somatic cell mutants define multiple genes required for expression of surface receptor activity// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1984. - Vol. 81, N 17. -P. 5454 - 5458.

108. Kinzler K.W., Vogelstein B. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers // Nature. 1997. - Vol. 386. - P. 761-763.

109. Klitz W., Brautbar C., Schito A.M. et al. Evolution of the CCR5 Delta32 mutation based on haplotype variation in Jewish and Northern European population samples // Hum. Immunol. 2001. - Vol. 62, N 5. -P. 530-538.

110. Knott T.J., Wallis S.C., Powell L.M. et al Complete cDNA and derived protein sequence of human apolipoprotein B-100 // Nucleic Acids Res. 1986. - Vol. 14. - P. 7501 - 7503.

111. Koivisto P. V., Koivisto U.M., Kovanen P.T. et al Deletion of exon 15 of the LDL receptor gene is associated with a mild form of familial hypercholesterolemia. FH-Espoo // Arterioscler. Thromb. 1993. - Vol. 13,N11.-P. 1680- 1688.

112. Koonin E.V., Altschul S.F., Bork P. BRCA1 protein products: functional motifs // Nat. Genet. 1996. - Vol. 13. - P. 266 - 267.

113. Kotze M.J., Retief A.E., Brink P.A., Weich H.F.H. A DNA polymorphism in the human low-density lipoprotein receptor gene // S. Afr. Med. J. 1986. - Vol. 70. - P. 77 - 79.

114. Kotze M.J., Warnich L., Langenhoven E. et al An exon 4 mutation identified in the majority of South African familialhypercholesterolaemics // J. Med. Genet. 1990. - Vol. 27, N 5. - P. 298 -302.

115. Kunkel L.M., Smith K.D., Boyer S.H. et al. Analysis of human Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1977. Vol. 74. - P. 1245 - 1249.

116. Lakhani S.R., Jacquemier J., Sloane J.P. et al. Multifactorial analysis of differences between sporadic breast cancers and cancers involving BRCA1 and BRCA2 mutations // J. Natl. Cancer. Inst. 1998. -Vol. 90, N 15.-P. 1138-1145.

117. Landsberger D., Meiner V., Reshef A. et al. A nonsense mutation in the LDL receptor gene leads to familial hypercholesterolemia in the Druze sect // Am. J. Hum. Genet. 1992. - Vol. 50. - P. 427 - 433.

118. Langlois S., Kastelein J.J.P., Hayden M.R. Characterization of six partial deletions in the low-density-lipoprotein (LDL) receptor gene causing familial hypercholesterolemia (FH) // Am. J. Hum. Genet. 1988. -Vol. 43.-P. 60-68.

119. Law S.W., Grant S.M., Higuchi K. et al. Human liver apolipoprotein B-100 cDNA: complete nucleic acid and derived amino acid sequence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1986. Vol. 83. - P. 8142-8146.

120. Lee W.K., Haddad L., Macleod M.J. et al. Identification of a common low density lipoprotein receptor mutation (C163Y) in the West of Scotland // J. Med. Genet. 1998. - Vol. 35. - P. 573 - 578.

121. Lehrman M.A., Schneider W.J., Brown M.S. et al. The Lebanese allele at the LDL receptor locus: Nonsense mutation produces truncatedreceptor that is retained in endoplasmic reticulum // J. Biol. Chem. -1987.-Vol. 262.-P. 401-410.

122. Leitersdorf E., Tobin E.J., Davignon J., Hobbs H.H. Common low-density lipoprotein receptor mutations in the French Canadian population // J. Clin. Invest. 1990. - Vol. 85, N 4. - P. 1014 -1023.

123. Leitersdorf E., van der Westhuyzen D.R., Coetzee G.A., Hobbs H.H. Two common low density lipoprotein receptor gene mutations cause familial hypercholesterolemia in Afrikaners // J. Clin. Invest. 1989. -Vol. 84, N3.-P. 954-961.

124. Leren T.P. Mutations in the PCSK9 gene in Norwegian subjects with autosomal dominant hypercholesterolemia // Clin. Genet. 2004. -Vol. 65, N5.-P. 419-422.

125. Leren T.P., Tonstad S., Gundersen K.E. et al. Molecular genetics of familial hypercholesterolemia in Norway // J. Intern. Med. 1997. - Vol. 241.-P. 185-194.

126. Lind S., Rystedt E., Eriksson M. et al. Genetic characterization of Swedish patients with familial hypercholesterolemia: a heterogeneous pattern of mutations in the LDL receptor gene // Atherosclerosis. 2002. -Vol. 163.-P. 399-407.

127. Liu X., Barker D.F. Evidence for effective suppression of recombination in the chromosome 17q21 segment spanning RNU2-BRCA1 // Am. J. Hum. Genet. 1999. - Vol. 64, N 5. - P. 1427 - 1439.

128. Lombardi M.P., Redeker E.J., Defesche J.C. et al. Molecular genetic testing for familial hypercholesterolemia: spectrum of LDLreceptor gene mutations in the Netherlands // Clin. Genet. 2000. - Vol. 57.-P. 116-124.

129. Lombardi P., Sijbrands E.J., Kamerling S. et al. The T705I mutation of the low density lipoprotein receptor gene (FH Paris-9) does not cause familial hypercholesterolemia // Hum. Genet. 1997. - Vol. 99, N l.-P. 106-107.

130. Ludwig E.H., McCarthy B.J. Haplotype analysis of the human apolipoprotein В mutation associated with familial defective apolipoprotein В100 // Am. J. Hum. Genet. 1990. - Vol. 47. - P. 712 -720.

131. Ma Y.H., Betard C., Roy M. et al. Identification of a second "French Canadian" LDL receptor gene deletion and development of a rapid method to detect both deletions // Clin. Genet. 1989. - Vol. 36, N 4.-P. 219-228.

132. Mandelshtam M.Ju., Chakir Kh., Shevtsov S.P. etal. Prevalence of Lithuanian mutation among St.Petersburg Jews with familial hypercholesterolemia // Hum. Mutat. 1998. - Vol. 12, N 4. - P. 255 -258.

133. Mandelshtam M.Ju., Lipovetskyi B.M., Schwartzman A.L., Gaitskhoki V.S. A novel deletion in the low density lipoprotein receptor gene in a patient with familial hypercholesterolemia from Petersburg // Hum. Mutat. 1993. - Vol.2, N 4. - P. 256 - 260.

134. Manguoglu A.E., Luleci G., Ozcelik T. et al. Germline mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes in Turkish breast/ovarian cancer patients // Hum. Mutat. 2003. - Vol. 21, N 4. - P. 444 - 445.

135. Mansukhani M.M., Nastiuk K.L., Hibshooh H. et al. Convenient, nonradioactive heteroduplex-based methods for identifying recurrent mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes // Diagnostic Molecular Pathology. 1997. - Vol. 6, N 4. - P. 229 - 237.

136. Marais A.D., Firth J. С., Blom D.J. Familial hypercholesterolemia in South Africa // Semin. Vase. Med. 2004. - Vol. 4, N 1. - P. 93 - 95.

137. Markoff A., Savov A., Vladimirov V. et al. Optimization of single-strand conformational polymorphism analysis in the presence of polyethylene glycol // Clin. Chem. 1997. - Vol. 43. - P. 30 - 33.

138. Maxwell K. N., Breslow J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a lew-density lipoprotein receptor knockout phenotype // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2004. - Vol. 101.-P. 71007105.

139. Meijers-Heijboer H., van den Ouweland A., Klijn J. et al. Low-penetrance susceptibility to breast cancer due to CHEK2(*)1100delC in noncarriers of BRCA1 or BRCA2 mutations // Nat. Genet. 2002. - Vol. 31,N1.-P. 55-59.

140. Meijers-Heijboer H., van Geel В., van Putten W.L. et al. Breast cancer after prophylactic bilateral mastectomy in women with a BRCA1 or BRCA2 mutation // N. Engl. J. Med. 2001. - Vol. 345, N 3. - P. 159 -164.

141. Meiner V., Landsberger D., Berkman N. et al. A common Lithuanian mutation causing familial hypercholesterolemia in Ashkenazi Jews 11 Am. J. Hum. Genet. 1991. - Vol. 49. - P. 443 - 449.

142. Metcalfe K., Lynch H.T., Ghadirian P. et al. Contralateral breast cancer in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers // J. Clin. Oncol. 2004. - Vol. 22, N 12. - P. 2328 - 2335.

143. Miki Y., Swensen J., Shattuck-Eidens D. et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1 // Science. -1994. Vol. 266-P. 66-71.

144. Miltiados G., Cariolou M.A., Elisaf M. HDL cholesterol levels in patients with molecularly defined familial hypercholesterolemia // Annals of Clinical and Laboratory Sciences. 2002. - Vol. 32, N 1. - P. 50 -54.

145. Mincey B.A. Genetics and the management of women at high risk for breast cancer // The Oncologist. 2003. - Vol. 8. - P. 466 - 473.

146. Miserez A.R., Muller P.Y. Familial defective apolipoprotein B-100: a mutation emerged in the mesolithic ancestors of Celtic peoples? // Atherosclerosis. 2000. - Vol. 148. - P. 433 - 436.

147. Miyake Y., Tajima S., Funahashi Т., Yamamoto A. Analysis of a recycling-impaired mutant of low density lipoprotein receptor in familial hypercholesterolemia // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264, N 28. - P. 16584- 16590.

148. Moller P., Heimdal K., Apold J. et al. Genetic epidemiology of BRCA1 mutations in Norway // Eur. J. Cancer. 2001. - Vol. 37, N 18. -P. 2428 - 2434.

149. Monteiro A.N.A. BRCA1: the enigma of tissue-specific tumor development // Trends in Genetics. 2003. - Vol. 19, N 6. - P. 312 - 315.

150. Mozas P., Cenarro A., Civeira F. et al. Mutation analysis in 36 unrelated Spanish subjects with familial hypercholesterolemia: identification of 3 novel mutations in the LDL receptor gene // Hum. Mutat. 2000. - Vol. 15, N 5. - P. 483 - 484.

151. Myant N.B., Forbes S.A., Day I.N.M., Gallaghers J. Estimation of the age of the ancestral arginine3500-to-glutamine mutation in human apoB-100 // Genomics. 1997. - Vol. 45. - P. 78 - 87.

152. NarodS.A., Foulkes D. W. BRCA1 and BRCA2: 1994 and beyond // Nature Reviews. Cancer. 2004. - Vol. 4. - P. 665 - 676.

153. Nauck M.S., Koster W., Dorfer K. et al. Identification of recurrent and novel mutations in the LDL receptor gene in German patients with familial hypercholesterolemia // Hum. Mutat. 2001. - Vol. 18. - P. 165 -166.

154. Nguyen L. В., Shefer S., Salen G. et al. A molecular defect in hepatic cholesterol biosynthesis in sitosterolemia with xanthomatosis // J. Clin. Invest. 1990. - Vol. 86. - P. 923 - 931.

155. Oddoux C., Struewing J.P., Clayton M.C. et al. The carrier frequency of the BRCA2 6174delT mutation among Ashkenazi Jewish individuals is approximately 1% // Nat. Genet. 1996. - Vol. 14, N 2. -P. 188- 190.

156. Oros K.K., Ghadirian P., Greenwood C.M. et al. Significant proportion of breast and/or ovarian cancer families of French Canadiandescent harbor 1 of 5 BRCA1 and BRCA2 mutations // Int. J. Cancer. -2004. Vol. 112, N 3. - P. 411 - 419.

157. Osorio A., Barroso A., Martinez B. et al Molecular analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in 32 breast and/or ovarian cancer Spanish families // Br. J. Cancer. 2000. - Vol. 82, N 7. - P. 1266 - 1270.

158. Ostrer H. A genetic profile of contemporary Jewish populations // Nature Reviews. 2001. - Vol. 2. - P. 891 - 898.

159. Palacios J., Honrado E., Osorio A. et al. Phenotypic characterization of BRCA1 and BRCA2 tumors based in a tissue microarray study with 37 immunohistochemical markers // Breast Cancer Res. Treat. 2005. - Vol. 90, N 1. - P. 5 - 14.

160. Peelen Т., van Vliet M., Petrij-Bosch A. et al. A high proportion of novel mutations in BRCA1 with strong founder effects among Dutch and Belgian hereditary breast and ovarian cancer families // Am. J. Hum. Genet. -1997.-Vol. 60, N5.-P. 1041 -1049.

161. Perkowska M., Brozek I., Wysocka B. et al. BRCA1 and BRCA2 mutation analysis in breast-ovarian cancer families from Northeastern Poland // Hum. Mutat. 2003. - Vol. 21, N 5. - P. 553 - 554 (Mutation in Brief #610 (2003) Online).

162. Perrin-Vidoz L., Sinilnikova O.M., Stoppa-Lyonnet D. et al. The nonsense-mediated mRNA decay pathway triggers degradation of most BRCA1 mRNAs bearing premature termination codons // Hum. Mol. Genet. 2002. - Vol. 11, N 23. - P. 2805 - 2814.

163. Petrij-Bosch A., Peelen Т., van Vliet M. et al. BRCA1 genomic deletions are major founder mutations in Dutch breast cancer patients // Nat. Genet. 1997. - Vol. 17, N 3. - P. 341 - 345 (Erratum in: Nat. Genet. - 1997. - Vol. 17, N 4. - P. 503.).

164. Phelan C.M., Kwan E., Jack E. et al A low frequency of non-founder BRCA1 mutations in Ashkenazi Jewish breast-ovarian cancer families // Hum. Mutat. 2002. - Vol. 20, N 5. - P. 352 - 357.

165. Pogoda Т., Metelskaya V., Perova N., Limborska S. Detection of the apoB-3500 mutation in a Russian family with coronary heart disease // Hum. Hered. 1998. - Vol. 48, N 5. - P. 291 - 292.

166. Promega protocols and applications guide. Promega, 1990. -Madison, USA-P.40-41.

167. Pullinger C.R., Hennessy L.K., Chatterton J.E. et al Familial ligand-defective apolipoprotein B: identification of a new mutation that decreases LDL receptor binding affinity // J. Clin. Invest. 1995. - Vol. 95.-P. 1225-1234.

168. Rafnar Т., Benediktsdottir K.R., Eldon B.J. et al. BRCA2, but not BRCA1, mutations account for familial ovarian cancer in Iceland: a population-based study // Eur. J. Cancer. 2004. - Vol. 40, N 18. - P. 2788-2793.

169. Rauh G., Keller C., Schuster H. et al Familial defective apolipoprotein B-100: a common cause of primary hypercholesterolemia // Clin. Invest. 1992. - Vol. 70, N 1. - P. 77-84.

170. Rebbeck T.R., Lynch H.T., Neuhausen S.L. et al Prophylactic oophorectomy in carriers of BRCA1 or BRCA2 mutations // N. Engl. J. Med. 2002. - Vol. 346, N 21. - P. 1616 - 1622.

171. Reeves M.D., Yawitch T.M., van der Merwe N.C. et al BRCA1 mutations in South African breast and/or ovarian cancer families:evidence of a novel founder mutation in Afrikaner families // Int. J. Cancer. 2004. - Vol. 110, N 5. - P. 677 - 682.

172. Reshef A., Nissen H., Triger L. et al. Molecular genetics of familial hypercholesterolemia in Israel // Hum. Genet. 1996. - Vol. 98. - P. 581 -586.

173. Roa B.B., Boyd A.A., Volcik K, Richards C.S. Ashkenazi Jewish population frequencies for common mutations in BRCA1 and BRCA2 // Nat. Genet.-1996.-Vol. 14,N2.-P. 185 187.

174. Robson M.E., Boyd J., Borgen P.I., Cody H.S. Hereditary breast cancer // Curr. Probl. Surg. 2001. - Vol. 38. - P. 387 - 480.

175. Rodningen O.K., Tonstad S., Medh J.D. et al. Phenotypic consequences of a deletion of exons 2 and 3 of the LDL receptor gene // J. Lipid Res. 1999. - Vol. 40. - P. 213 - 220.

176. Rudenko G., Deisenhofer J. The low-density lipoprotein receptor: ligands, debates and lore // Curr. Opin. Struct. Biol. 2003. - Vol. 13. -P. 683-689.

177. Rudenko G., Henry L., Henderson К et al. Structure of the LDL receptor extracellular domain at endosomal pH // Science. 2002. - Vol. 298.-P. 2353-2358.

178. Russell D. W., Yamamoto Т., Schneider W.J. et al. cDNA cloning of the bovine low density lipoprotein receptor: feedback regulation of a receptor mRNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1983. - Vol. 80, N 24. -P. 7501 -7505.

179. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

180. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1977. Vol. 74. -P.5463 - 5467.

181. Sarantaus L., Huusko P., Eerola H. et al. Multiple founder effects and geographical clustering of BRCA1 and BRCA2 families in Finland // Eur. J. Hum. Genet. 2000. - Vol. 8, N 10. - P. 757 - 763.

182. Scheuer L., Kauff N., Robson M. et al. Outcome of preventive surgery and screening for breast and ovarian cancer in BRCA mutation carriers // J. Clin. Oncol. 2002. - Vol. 20, N 5. - P. 1260 - 1268.

183. Schmidt H., Kostner G.M. Familial hypercholesterolemia in Austria reflects the multi-ethnic origin of our country // Atherosclerosis. 2000. -Vol. 148.-P. 431 -432.

184. Schneider W.J., Beisiegel U., Goldstein J.L., Brown M.S. Purification of the low density lipoprotein receptor, an acidic glycoprotein of 164,000 molecular weight // J. Biol. Chem. 1982. - Vol. 257, N 5. -P. 2664-2673.

185. Schuster H., Luft F.C. Clinical criteria versus DNA diagnosis in heterozygous familial hypercholesterolemia. Is molecular diagnosis superior to clinical diagnosis? // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1998. -Vol. 18.-P. 331 -332.

186. Schutte M., Seal S., Barfoot R. et al. Variants in CHEK2 other than 1 lOOdelC do not make a major contribution to breast cancer susceptibility // Am. J. Hum. Genet. 2003. - Vol. 72, N 4. - P. 1023 - 1028.

187. Scientific Steering Committee on behalf of the Simon Broome Register Group. Risk of fatal coronary heart disease in familial hypercholesterolaemia // Brit. Med. J. 1991.-Vol. 303. - P. 893 - 896.

188. Scientific Steering Committee on behalf of the Simon Broome Register group. Mortality in treated heterozygous familial hypercholesterolaemia: implications for clinical management // Atherosclerosis. 1999. - V. 142. - P. 105 -112.

189. Seftel H.C., Baker S.G., Jenkins Т., Mendelsohn D. Prevalence of familial hypercholesterolemia in Johannesburg Jews // Am. J. Med. Genet. 1989. - Vol. 34. - P. 545 - 547.

190. Seidah N. G., Benjannet S., Wickham L. et al. The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC-1): liver regeneration and neuronal differentiation // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2003. - Vol. 100. - P. 928 - 933.

191. Shiri-Sverdlov R., Oefner P., Green L.et al. Mutational analyses of BRCA1 and BRCA2 in Ashkenazi and non-Ashkenazi Jewish women with familial breast and ovarian cancer // Hum. Mutat. 2000. - Vol. 16, N6.-P. 491-501.

192. Siest G., Bertrand P., Herbeth B. et al. Apolipoprotein E polymorphisms and concentration in chronic diseases and drug responses // Clin. Chem. Lab. Med. 2000. - Vol. 38, N 9. - P. 841 - 852.

193. Simmons Т., Newhouse Y.M., Arnold K.S. et al. Human low density lipoprotein receptor fragment. Successful refolding of a functionallyactive ligand-binding domain produced in Escherichia coli II J. Biol. Chem.- 1997.-Vol. 272, N41.-P. 25531 -25536.

194. Slack J. Risks of ischaemic heart disease in familial hyperlipoproteinaemic states // Lancet. 1969. - ii. - P. 1380-1382.

195. Slack J. Inheritance of familial hypercholesterolemia // Atheroscler. Rev. 1979.-Vol. 5.-P. 35-66.

196. Smith T.M., Lee M.K., Szabo C.I. et al. Complete genomic sequence and analysis of 117 kb of human DNA containing the gene BRCA1 // Genome Res. 1996. - Vol. 6, N 11. - P. 1029 - 1049.

197. Sobczak K., Kozlowski P., Napieralta M. et al. Novel BRCA1 mutations and more frequent intron-20 alteration found among 236 women from western Poland // Oncogene. 1997. - Vol. 15. - P. 1773 -1779.

198. Soria L.F., Ludwig E.H., Clarke H.R. et al. Association between a specific apolipoprotein В mutation and familial defective apolipoprotein B-100 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1989. Vol. 86, N 2. - P. 587 -591.

199. Sorlie Т., Tibshirani R., Parker J.et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2003. Vol. 100, N 14. - P. 8418 - 8423.

200. Soutar A.K, Naoumova R.P, Traub L.M. Genetics, clinical phenotype, and molecular cell biology of autosomal recessive hypercholesterolemia // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003. - Vol. 23, N 11.-P. 1963-1970.

201. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - Vol. 98, N3,-P. 503-517.

202. Starita L., Parvin J.D. The multiple functions of BRCA1: transcription, ubiquitination and DNA repair // Curr. Opin. Cell. Biol. -2003.-Vol. 15.-P. 345-350.

203. Stein E.A. The lipid disorders centre at the Transvaal Memorial Hospital for Children. A review of the first 30 months // S. Afr. Med. J. -1977. Vol. 52, N 14. - P. 573 - 579.

204. Stone N.J., Levy R.I., Fredrickson D.S., Verter J. Coronary artery disease in 116 kindred with familial type II hyperlipoproteinaemia // Circulation. 1974. - Vol. 49. - P. 476 - 488.

205. Struewing J.P., Abeliovich D., Peretz T. et al. The carrier frequency of the BRCA1 185delAG mutation is approximately 1 percent in Ashkenazi Jewish individuals individuals // Nat. Genet. 1995. - Vol. 11, N2.-P. 198-200.

206. Struewing J.P., Hartge P., Wacholder S. et al. The risk of cancer associated with specific mutations of BRCA1 and BRCA2 among Ashkenazi Jews // New Engl. J. Med. 1997.- Vol. 336. - P. 1401-1408.

207. Stidhof T.C., Goldstein J.L., Brown M.S., Russell D.W. The LDL receptor: a mosaic of exons shared with different proteins // Science. -1985. Vol. 228, N 4701. - P. 815 - 822.

208. Syrjakoski K., Vahteristo P., Eerola H.et al. Population-based study of BRCA1 and BRCA2 mutations in 1035 unselected Finnish breast cancer patients // J. Natl. Cancer Institute. 2000. - Vol. 92, N 18. - P. 1529- 1531.

209. Tereschenko J.V., Basham V.M., Ponder B.A., Pharoah P.D. BRCA1 and BRCA2 mutations in Russian familial breast cancer // Hum.

210. Mutat. 2002. - Vol. 19, N 2. - P. 184 (Mutation in Brief #479 (2002) Online).

211. Tonin P.N., Mes-Masson A.M., Futreal P.A. et al. Founder BRCA1 and BRCA2 mutations in French Canadian breast and ovarian cancer families // Am. J. Hum. Genet. 1998. - Vol. 63, N 5. - P. 1341 - 1351.

212. Varret M., Rabes J.-P., Collod-Beroud G. et al. Software and database for the analysis of mutations in the human LDL receptor gene // Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P. 172 - 180.

213. Varret M., Rabes J.-P., Saint-Jore B. et al. A third major locus for autosomal dominant hypercholesterolemia maps to Ip34.1-p32 // Am. J. Hum.Genet. 1999. - Vol. 64. - P. 1378 - 1387.

214. Varret M., Rabes J.-P., Thiart R. et al. LDLR Database (second edition): new additions to the database and the software, and results of the first molecular analysis // Nucleic Acids Res. 1998. - Vol. 26. - P. 248 -252.

215. Vega G.L., Grundy S.M. In vivo evidence for reduced binding of low density lipoproteins to receptors as a cause of primary moderate hypercholesterolemia // J. Clin. Invest. 1986. - Vol. 78, N 5. - P. 1410

216. Vehmanen P., Friedman L.S., Eerola H. et al. Low proportion of BRCA1 and BRCA2 mutations in Finnish breast cancer families: evidence for additional susceptibility genes // Hum. Mol. Genet. 1997. -Vol. 6, N 13. - P. 2309-2315.

217. Verhoog L.C., van den Ouweland A.M., Berns E. et al. H. Large regional differences in the frequency of distinct BRCA1/BRCA2 mutations in 517 Dutch breast and/or ovarian cancer families // Eur. J. Cancer. 2001. - Vol. 37, N 16. - P. 2082 - 2090.

218. Villeger L., Abifadel M., Allard D. et al. The UMD-LDLR Database: additions to the software and 490 new entries to the database // Hum. Mutat. 2002. - Vol. 20. - P. 81 - 87.

219. Vohl M.C., Moorjani S., Roy M. et al. Geographic distribution of French-Canadian low-density lipoprotein receptor gene mutations in the Province of Quebec // Clin. Genet. 1997. - Vol. 52, N 1. - P. 1 - 6.

220. Vuorio A.F., Aalto-Setala K., Koivisto U.-M. et al. Familial hypercholesterolemia in Finland: common, rare and mild mutations of the LDL receptor gene and their clinical consequences. Finnish FH group // Ann. Med. 2001. - Vol. 33. - P. 410 - 421.

221. Vuorio A.F., Turtola H., Piilahti K.M. et al. Familial hypercholesterolemia in the Finnish north Karelia. A molecular, clinical, and genealogical study // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1997b. -Vol. 17, N 11. - P. 3127 -3138.

222. Wagner T.M., Moslinger R.A., Muhr D. et al. BRCA1-related breast cancer in Austrian breast and ovarian cancer families: specific BRCA1mutations and pathological characteristics // Int. J. Cancer. 1998. - Vol. 77, N3.-P. 354-360.

223. Wang C., Lin H. J., Chan T.-K., Salen G. et al. A unique patient with coexisting cerebrotendinous xanthomatosis and beta-sitosterolemia // Am. J.Med. 1981.-Vol. 71.-P. 313-319.

224. Wang Y., Cortez D., Yazdi P. et al. BASC, a super complex of BRCA1-associated proteins involved in the recognition and repair of aberrant DNA structures // Genes Dev. 2000. - Vol. 14, N 8. - P. 927 -939.

225. Wooster R., Bignell G., Lancaster J. et al. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2 // Nature. 1995. - Vol. 378, N 6559.-P. 789-792.

226. Wooster R., Weber B.L. Breast and ovarian cancer // New Engl. J. Med. 2003. - Vol. 348, N 23. - P. 2339 - 2347.

227. Xu X., Wagner K.U., Larson D. et al. Conditional mutation of Brcal in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation // Nat. Genet. 1999. - V. 22. - P. 37-43.

228. Yamamoto Т., Davis C.G., Brown M.S. et al. The human LDL receptor: cysteine-rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA // Cell. 1984. - Vol. 39, N 1. - P. 27 - 38.

229. Yang C.-Y., Chan L., Gotto A.M., Jr. The complete structures of human apolipoprotein B-100 and its messenger RNA // In: Plasma Lipoproteins. A.M. Gotto, Jr., editor. 1987. Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division), Amsterdam, P. 77-93.

230. Yu W., Nohara A., Higashikata T. et al. Molecular genetic analysis of familial hypercholesterolemia: spectrum and regional difference of LDL receptor gene mutations in Japanese population // Atherosclerosis. -2002. Vol. 165. - P. 335 - 342.

231. Zeps N., Bentel J.M., Papadmitriou J.M. et al. Estrogen receptor-negative epithelial cells in mouse mammary gland development and growth // Differentiation. 1998. - Vol. 62. - P. 221 - 226.

Информация о работе

Мандельштам, Михаил Юрьевич
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Молекулярно-генетический анализ моногенных форм атеросклероза и рака молочной железы у жителей Санкт-Петербурга - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы