Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и изучение мутаций в гене BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Поиск и изучение мутаций в гене BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге"

На правах рукописи

Грудинина Наталья Андреевна

ПОИСК И ИЗУЧЕНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ БЯСЛ1 У БОЛЬНЫХ СЕМЕЙНЫМИ ФОРМАМИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ.

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2004

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН», Санкт- Петербург

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук Вадим Борисович Васильев

доктор биологических наук Владимир Иванович Евтушенко

доктор биологических на\к Андрей Петрович Перевозчиков

Санкт-Петербургский Государственный Медицинский

университет им. акад. И.П. Павлова, кафедра биохимии

Защита состоится. * 2004 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д.001.022.03 при ГУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН» по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменоостровский пр. д. 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Научно -исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН» по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.001.022.03 доктор биологических наук, профессор

Л. В. Пучкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Достижения молекулярной icntriMKH последних лосяiunciнй приведи к

и.1С11111(|>ик,11ши лесы i кои чысяч lenoB человека ')ю иозиоляе! проводитк

молекулярную днаиюаику стен Monoiennux забодснапий :i онрелечнп.

к'ноические фаюоры риска развиiия pací ipoci раненных болезней человека I)

медицине мояпилась нопая оОласгъ, получившая название мо.чск> лярнои

медицины. основан imii на 1 очном знании молекулярных механизм»»

возникновения наслела пенных заболеваний (Ьаранов и лр. 2000)

Определенные успехи доспи мулы и и изучении механизмов патогене ja iük

называемых мул ь гиф а к i op и a л i>hu х (Горбу и о па и лр. 1997) забодснаний. и

>гиоло1ик> ко юры \ наряду с фат о рам и внешней среды знлчшсльныН вклад

вносяi i eneiнчеекие составляющие.

Рак принадлежи! к группе мулы ифакюриаж.ных заболевании. хен я it

некоюрых случаях предрасположенное! ь к раку наел сд)езся пи mohoiciihomv

типу. Именно так наследуется предрасположенное 1i. к семейным формам рака

молочной железы, вызванным мукишями и iciiax BliCAl и BRCA2.

Рак молочной железы я вляет ея олной и) наиболее чае го ворочающихся

форм злокачеспзеппой опухоли. II развишх странах мири около 10% жепшин

заболенаюг раком молочной железы в icienne жизни Изучение семей е

несколькими случаями рака молочной железы и анамнезе позволило

изолирован специфические гены 11редрасч ю.южеiшос ni к лому заболеванию."

1юл>чиншис название генов BRCA I (Miki el al.. 1994) и В RCA 2 (Wooslcr el

□1.1995) (UKeasl САнсег). При мугации it любом из них юно» высока

перо я г нос J ]> pa знн i и я рака молочной железы. а при мутациях » гене ИКСА I

iioipaciacT нерояшосгь paлшi ия рака яичника. Постели мутаций и чтих (снах

имек>1 риск разшипя заболевания, течение жизни приближающийся к 80%

Ишеисивные исследования вариабельности шкт ИКС. (-семени на

проиолякя во всем мире. Первые популяпиоипые исследования мутаций n icne

ИКСА! были нрочедепы в Канале и 1994 юлу (Simartl ct al. 1994). К пастящему

времени известны около 1200 мутаций и полиморфных вариаш ов tena В RCA!

(UIC), причем набор мутаций и степень раслросфапсиноои каждой из лих

характерен для каждой популяции и инической ipymibi В спизи с ним

невозможно исполкомам, данные, полученные мри изучении мутзинй и

полиморфизмом leuoH tíR(I в одних арапах для проведения ранней ДПК-

лишпоеткн предрасположенности к раку молочной железы 1« других Именно

'но] нил лиагноешкн позволяет выяви п. кош иш сиг женщин е высоким риском

разни 1ия ланит о заболевания до notnnnii?iii4nni кинпшнчт nA-mt->w>niiti h'hiiü

i ЮС, НАЦИОНАЛЫ!АН]

I БИБЛНОТ СКА |

1 ¿"W^í

Предыдущие исследования российской популяции (tiaythcr el al. 1997: Манлелышам и др.. 2001; Tcreschenko el al.. 2002. Карпухин Л В. и др. 20U2) показали как наличие распространенной в IE пропс мутации (5382 т\С). гак с}шествеш1ые различия спектра муптий н míe BRCAI о рамичнмх ра попах (Goyther et al., 1997. Карпухин A.B. и др., 2002: Tereschenko el al.. 2002).

Эффективность лечения рака молочной железы по мпоюм злшепт oí своевременной диагностики. Д11К-диагнос1 ика позвал я« выявим. предрасположенность к раку молочной желе«.! и осуществим. постановку на учет к онкологу еще до возникновения клинических проявлений заболевания. I) евRiii с постоянным увеличением заболевасмости раком молочной желеш проблем а ра иней диа гн ости к и н риобрстает ч ре звыч а И ну ю a ki ) а л ь но еч ь.

Цели и задачи исследования

Основной иелыо работы было изучение спеюра мутаций tena IUiC.ll у больных семейными формами рака молочной желеш □ Санк1-Г1стерб}рк\ Для дост ижения тгой цели были поставлены следующие задачи:

1. Сошпь коллекцию образцов ДНК нацистов с семенными формами рака молочной железы:

2. Осуществить поиск мутаций в 5. II и 20 'ikjoiic raía URCAI -лих пациентов методами reí сродуплешюго анализа и анализа копформацношюго лолимор<|)изма одноньпевыь фрашСнтов ДНК (SSCl'-анализа):

3. Идентифицировать обнаруженные мушшн меюдом секвепнронания ДИК:

4. PaipaSoiarb быстрые методы идентификации обнаруженных м)инпп.

5. Мровестн анализ ДНК родственников нацист он. у коюрых были обнаружены мутации, с целью проведения i eirci ичесын о консулы пронация и семьях больных.

Научная новизна результатов

У больных семейными формами рака молочной железы a Cainci-lleicpGypic идентифицированы семь мутаций » гене DRC.H: 5382insC. 2963de 110. 38l9<iel5. 3875del4. 2274insA. RI203X и Et250K. причем мутация 2963tlell<> мвлястея новой. Из числа выявленных, пяль мутаций (3875<Jcl4. 2274insA. 2963iteH0. R1203X и KI250K) ранее в Российской Федерации обнаружены не были Впервые в Санкт-Петербурге обнаружен ряд сцепленных друг с друюм полиморфизмов (S694S, L77IL и EI038G). ранее описанных во мши и\ стринах мира. Разработаны методы женресс-тесгирования на наличие всех обнаруженных мутаций.

Практическая значимость работы

В данной paôoie охарактеризована вариабельной ь гена 13lit VI / у больных семеИпыми ■ формами рака молочной железы и Сапкт-Тle i срОурiт:. Ршработанчие для обнаруженных нами мутаций м<п оды "жснреоместиро нация могут был. использованы для ДИК-диш носчики предрасположенное! и к раку молочной железы и генетическою консультирования в семьях больных семейными формами рака молочной железы. Ото по то лит ocyuieei ии ть постановку пост елей мугаций на учет к оншшлу и. а случае возникновении опухоли. iia'iaiь лечение на ранних стадиях разви( ия заболевания. Такой подход способствует повышению чффектвности лечения и улучшению про roo ja выживаемое! и больных.

Основные положения, выносимые на тящнту

1. У больных семейными формами рака молочной желоы в Санкт-Петербурге идентифицированы шесть известных в мире му|аиий в »сне ШК'А!\ 5382¡n¡.C. 38l9del5. 3875ttel4, 2274 i ris Д. RI203X и Е1250К. Мутация 2274insA впервые обнаружена в Европе, а мукщии 3875de! 4. R1203X и I-I250K впервые обнаружены в России.

2. Впервые обнаружена новая мутация 2963 de 110. (la основе чет ода гстсролушюксиою анализа разрабш ana методика для жспресс-1е<пирования на наличие л ой мутации вноследова1елыюсги i сна ШК'Л I.

3. Впервые в Санкт-Г1е1ербур|е обнаружен ряд полиморфизмов (S694S. 1.7711. и IÏI038G), ранее описанных но мнших популяциях мира.

4. Для больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге. не характерно наличис'мушшй в 5 зккшс i ена URCA!.

5. Широко распространенная по Mttoi их популяциях мира мул а ни я 5382insC является также наиболее часто встречающейся в трупне больных семейными формами рака молочной железы n Caí m-Петербурге.

Апробация работы

Результат работы были доложены на Пятой Всероссийской медики-биоло! нчсской конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». Санкт-Петербург. 21 апреля 2002 t.: па научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в нра)пическом здравоохранении» ti рамках Международной конференции «Геном и км. при комика и биоипформагика для медицины». Москва 20-21 нюня 2002 г.: tía II 1-м съезде биохимического общества. Сашп-Пстерб>рг. 26 июня 2002-1 июля 2002 г.: на 13-ой Европейской студенческой конференции. Ксрлин (Германия). 29 ок!ября-2 ноября 2002 г.: на Шестая Всероссийской медико-биологическая конференция

молодых исследователей «Человек и его здоровье». Санкт-Петербург. 19 апреля 2003 г.; на конференции «Молодые биолоси Санкт-Петербурга - 300-летию города». Санкт-Петербург. 2003 г.: па Всероссийская научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетешки», Москва. 25-27 ноября 2003г.

Публикации

По теме работы опубликовано 1 статья и 8 тезисов.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 155 .страницах и содержит следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты». «Обсуждение результатов» и «Выводы». Работа содержит 42 рисунка и 14 таблиц. Список литературы содержит 137 названий работ на русском и английском языках.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

Для исследования было отобрано 43 нациста с семейными формами рака молочной железы. Критерием принадлежности пациента к группе больных с наследственной предрасположенностью к лому заболеванию являлось наличие в семье не менее 3 случаев рака данной локализации. Отбор пациентов с первичным раком молочной железы проводился сотрудниками НИИ онкологии им. П. Н. Петрова. Группа пациентов была разбита на две группы: (I) пациенты евреи-ашкепази с семейными формами рака молочной железы: (2) пациенты славяне с семейными формами рака молочной железы.

Для выделения ДНК у нацистов осуществляли забор 5 мл венозной крови. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов крови по методу Кюпксля (в модификации Белла) (Kunkel et ak. 1977; Bell et al.. 1981). Для определения образцов ДНК. пригодных для дальнейшего исследования, проводилась оценка качества и концентрации ДНК с помощью электрофореза в 0.8% агарозном геле. Амплификацию участков гена BRCAI методом полимеразпой цепной реакции (ПЦР) проводили на аппарате «Терцик» с праймерами. предложенными Friedman et al., 1994. изготовленными фирмой «Медигеп» (Новосибирск). Наиболее протяженный II окзон гена BRCA1 был разбит на перекрывающиеся фрагменты, для удобства пронумерованные буквами латинского алфавита (I IA-ПР). Для проверки специфичности реакции и количества продуктов амплификации проводили электрофорез в 8% ПААГ в однократном ТВ К буфере. Размер фрагмента оценивали с помощью маркера молекулярного веса

5 ' • ' ;

от 100 до 1000 через 100 пар нуклеотидов фирмы «Медичи». IJ случае специфичной реакции амплификации, уже на пом пане можно проводин, первичный поиск мутаций методом гегеродуплекспого анализа и выявляй, образцы, в которых из-за наличия нормального • и мутантпого аллелей образуются гстеродуплексы. Затем все образцы проверялись более чувствительным методом анализа копформациоппого полиморфизма одиопитевых фрагментов ДНК (SSCT-анализа) (MarkolT et a!.. 1997). Окрашивание образцов ДНК после проведения электрофореза в ПЛЛГ осуществляли раствором нитрата серебра. В некоторых случаях для разделения нормального и мутантпого аллелей проводили клонирование продуктов амплификации, а,затем секвеиировали мутаптпую нить по методу Сжджсра. Клонирование амплифицироваппых фрагментов осуществляли с использованием системы «Таклоп» фирмы .«Медигеп» (Новосибирск). Клоны штамма /;. Coli. Г)Н5а. содержащие рекомбинашмые плазмилы. отбирали с помощью (х-комплсмептации. Секвснирование проводили па приборе ALl'express И фирмы «Amersham Bioscienccs». Использовали набор реактивов •The Thermo Setjuenase™ Су™ 5 Dye Terminator Kit, разработанный'для использования при секвепировании па приборах ALFcxpress.

Проверку равновесия Харди-Вайпберга для генотипов по изучаемым полиморфизмам .проводили с yf (Лйала и др.. 1988). Для сравнения частот аллелей обнаруженных полиморфизмов гена HRC.ll между группами из разных популяций использовали критерий х2- предложенный Пирсоном н Фишером (Тюрин и др.. 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования являлась коллекция геномной ДНК пациентов с семейными формами первичного рака молочной железы, состоящая из 43 образгюв. В ходе работы была проведена амплификация ДНК всех исследуемых пациентов с праймерами для фрагментов 11 чкзопа. атакже 5 и 20 жзопов. Каждый жзои или его часть исследовались независимо по представленной ниже схеме. После выделения геномной ДНК из крови, проводилась- амплификация исследуемых участков гена методом ПЦР. Иродлкты амплификации были скрипироваиы с помощью гетеродуплекеного анализа и 88СР-анализа. Для уточнения данных, полученных в результате гетеродуплекеного анализа, проводили электрофорез в денатурирующих условиях. Для автомагического секвепировапия в некоторых случаях образцы были клонированы. Па последнем - лапе методами экспресс ДНК-диагностики проводилось исследование последовательности ДНК гена ЬЖС'А

родственников носителей данной мутации для диагностики предрасположенности к раку молочной железы.

В результате исследований, проведенных по описанной выше схеме, было обнаружено 7 мутаций и 3 полиморфизма и 11 и 20 жзопах юна HRC.ll Ниже представлено описание идентификации нсех обнаруженных изменений и последовательное! и.

Мутация 2963с1е110 (с. 2963-2972с1е110) была обнаружена у нацистки № 2041 из второй группы. Диагноз рак молочной железы пациентке был носкшлеп в возрасте 41 года. При анализе продуктов амплификации фрашеша и с помощью электрофореза в 8% ПААГ обнаружены две дополишельные зоны Л и В (рис. 1, дорожка № 2). После проведения электрофореза прод>ктои ПЦР фрагмента Ш в денатурирующих условиях (рис. 2). было выяснено, чт появление дополнительных зон является следе ишем образования гетеродунлекса. часто формирующеюся при наличии мутации в ююровтошоМ состоянии. В случае, когда в качестве мшрииы для специфичной реакции ПЦР выступают как муташный, так и нормальный аллель, после отжига п рснатурации одпопигевых фра1мептов образую 1ся два типа юмодуилексов и два типа гет еродуплексов. отличающихся но электрофоретической подвижности. Кроме тою. по-видимому, появление » денатурирующем электрофорезе зоны Д меньшею молекулярной) веса (рис. 2. дорожка Л» 2) свидетельствует о наличии у данного пробапда двух аллелей, нормальною н мутантпого, содержащего делению нескольких пар пуклеотдов. Иол\ченпые данные позволяют сделать вывод, что нацистка № 2041 является постелем мутации, предположительно, достаточно протяженной делении.

Для выяснения локализации делении в послсдова1слмюсти фрашеша Ш гена BRCAI у пациентки Нч 2041, было необходимо определение пфклеошдной последова1елыюс1И 'мою участка ДНК. Для разделения нормальною п мутапшого аллелей гена BRCAI с целью секвепирования мутаппюй последовательности, было проведено клонирование продутой амплификации фрагмента ПО гена ВЯОД1 этой нацистки в нлазмидном век-юре «Гаклон». Клоп, несущий плазмиду со вставкой мутанпюй Г1ослсдова1елыюсти, был выявлен с помощью гетеродуплексного анализа. Клонирование проводилось дважды, причем повторная трансформация клеток проводилась липфоианпой смесью плазмиды «Таклон» и продукта амплификации плазмидпоп ДНК. выделенной из клона, содержащею илазмиды, несущие вставки как мутаишою. так и нормального аллелей, полученные при первом клонировании. Нчазмпдная ДНК оюбраиных трапсформашов использовалась в качестве мафины для реакции амплификации фра1 мента и. Продукт амплификации плазммдпой ДНК, выделенной из отобранною клопа, был секвенироваи по метод)

1 2 3 'Пг * М __ iss=i м—В д 200 1'нс. 1. ')лск1рофорсгря»ша нродукчон амплификации уча?iка нооня 11.1 киа BRCAI в 8% 11ЛЛГ. Дорожки № 1 - wpajeu ДИК пациентки 6ct мутинн. № 2 - образец ДНК лмшенгки № 20-11 с мучацисИ, Ks 3 - маркер мол<куляриоп> BCCD ог 100 до 1000 с шагом 100 м>клсоп1Д1>в 1 2 Г Д > Гас. 2. ")лектроф»|Кфа\«л|а ирол>ктип амплификации учаока "жшна ll.l ff ни BRCAI н 6% ПААГ <■ дентуркруншшх условиях. Дорожки № 1 - обра юн ДНК tiaiuteiinoi öei мутации. Xü 2 - oöpatcu ДИК нашкмгки № 204t с иутанпеП.

(А) .—. л л АЛ/ . Н » (К) ^ Ш Pur. 4. С<гая наследовании мути ним 2963dcll0 в ммьс наiiiifklkii.Vs 204t. (А) Родословная н (l>) )лек гр(м]юре1 рамма np<u) ктои амилифмкацпн участка ткиша IIJ iciiu ЙЯГЛ/в8%ИЛЛГ. Дорожки Ks 1 - маркер штскулхршчо веса ог 100 ли 1000 с шакш 100 нуклсоишов. К; 2,3,4 - продукт амплификации ДНК (фрагмента t IJ с муншней 2%3dcII0 (oöpajyeica кюролушккс). № 5 - npujt>ki амплификации ДНК фраглкигн Iii Ciei wyiainiM.

.ЛА/vGG---------- .A.\//GG.;'-.GGC "С "AGG". ; Гиг. 3. Графические ля ним с а ii 1 ом u 1 и >1 г г кою сси вс и припаи пн (Л) нослсдоп.ислыюсти фрагмеша IIJ II жиша ictta ISRC.I1. содержащей uyinumo 2%3delIO и (1>) 1кфмап1>п(>Л последовательности Звемочкамп обозначены tiyклал или. ирлсунпвуюнше в нормальном шые.'ю и oicytciByiounic n мугатпом.

С)иджера. В результате анализа последовательности была выявлена деления десяти иуклеотидов:в мутантом аллеле гена BRC.il пациентки № 2041 (рис. 3. (В)). Данная мутация является поной, и в соответствии с международной номенклатурой она была названа нами 2963(М1() (с. 2963-2972(1е110).

Па следующем - этапе исследования- был проведен апали* ДНК родственников пациентки № 204Г, несущей делению 2963(1еИО. Родословная пробанда и электрофореграмма продуктов амплификации ДНК фрашеша Ш ш1а BRCAI пробанда и доступных членов семьи представлена на рис. 4. Как видно из рис. 4 данная мутация, выявляемая по наличию гетеродуплекса. помимо пробанда. была обнаружена у сестры' (рис. 4, дорожка № 4) и дочери (рис. 4. дорожка № 2) нацистки № 2041.

Мутация 5382insC была обнаружена у трех пациенток (№№ 2051. 2151 и 2241) из второй группы и у одной пациентки (Нч. 1013) из первой группы. Диагноз рак молочной железы нацист ке № 2051 был поставлен в возрасте 36 лет, пациет ке № 2151 в возрасте 47 лет. пациентке № 2241 - 50 лет и пациентке № 1013-50 лет. Тестирование ДНК пациентов па наличие мутации 5382твС проводили с использованием продукта амплификации контрольного образца. ДНК которого несет мутацию 53821шС в гаерозиготном состоянии. Ьыл использован- тот факт, что при проведении теродуплекспот аналта продуктов амплификации двух разных образцов ДНК. имеющих одинаковые генетические нарушения, образуются идентичные гетеродуплексы, которые можно выявить при анализе утих продуктов с помощью электрофореза в 11ЛЛГ. При анализе " продуктов амплификации 20 экзона гена 1ШСА1 с прилегающими частями нитронов всех образцов ДНК банка с помощью электрофореза в ПЛЛГ и образцах ДНК четырех пациентов были обнаружены гетеродуплексы. свидетельствующие о наличии у них мутации 5382in.sC.

Исследование ДНК родственников паииеитки № 1013 с помощью гстсродуплексного анализа показало отсутствие мутации 53821тС у дочери п внучки этой пациентки, которые па момент исследования не имели признаков онкологического заболевания. Также было показано отсутствие данной мутации у дочери пациентки № 2241, которая на момент исследования не имела признаков онкологического заболевания. Родственники остальных пациентов не были доступны для анализа.

Мутация J819del5 (c.3819-3823del5) обнаружена у двух пациенток - № 2031 и № 2311 из второй группы методом гетеродуплскеного анализа. ^ Рак молочной железы был диагностирован у пациентки М« 2031 в возрасте 43 лет. у пациентки № 2311 в возрасте 31 года. Идентичность поведения образцов при проведении электрофореза в денатурирующих и исденатурирующих условиях свидетельствует о том, что пациентки № 2031 и № 2311 являются

гетерозиготными носителями одной и 'тй же мутации во фрагменте 1 К) гена BRCAI. В связи с этим все дальнейшие этапы исследования, такие как разделение мутантного и нормального аллелей с помощью клонирования и секвенирование мутаптпой последовательности ДНК. проводились с образцами ДНК пациентки № 2311. После клонирования и секвепирования полученною продукта амплификации ДНК рекомбинаптой плазмиды, содержащей нетавку мутаитной последовательности была выявлена деления пяти пуклеотпдов 3819del5 в мутантиой нити фрагмента 1IO гена BRCAI.

Мутация 3875del4 (с. 3875-3878del4) была обнаружена у пациешки № 2101 из второй группы больных. Первичный рак молочной железы был диагностирован у нее в возрасте 47 лет. При анализе продуктов амплификации фрагмента 110 гена BRCAI с помощью электрофореза в 8% Г1АЛГ был обнаружен гетсродуплекс. При проведении электрофореза продую он амплификации в денатурирующих условиях была обнаружена дополнительная зона, располагающаяся ниже зоны, соответствующей основному продуму амплификации, что позволило предположить наличие делении. Для разделения нормального и мутаитпого аллелей гена BRCAI с целью секвеиирования мутантной последовательности, было проведено клонирование продуктов амплификации фрагмента 110 гена BRCAI пациентки № 2101 в плазмидиом векторе «Таклон». Клон, несущий нлазмиду со вставкой мутантмой последовательности, был выявлен с помощью гегеродуплексного анализа. Продукт амплификации плазмидной ДНК. выделенной из отобранного клопа, был секвенировап по методу Сэиджсра. Секненировапие выявило делению четырех пуклеотидов 3875deI4 в мутантпой нити фрагмента 110 11 экзопа гена BRCAI.

С помощью гетеродуилексного анализа был проведен анализ ДПК родственников пациентки № 210L несущей делению 3875deI4. Родословная и электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента 110 гена BRCAI ДПК пробанда № 2101 и ее родственников представлена па рис 5. Присутствие одинаковых по электрофоре гической подвижности га сроду1 пенсов на электрофореграмме (дорожки № 1.2) свидетельствует о наличии мутации 3875с1е14 у дочери пациешки. не имеющей в данный момент признаков онкологического заболевания. Однако уже в возрасте 14 лет у нее была диагностирована дольковая гиперплазия молочной железы и киста правого яичника.

Мутация 2274insA (с. 2274-2275insA) была обнаружена у пациентки № 2261 из торой группы с помощью гетеродуплекспого анализа. С помощью денатурирующего электрофореза было выяснено, чп- продукты [D/F фрагмеша 11CJ обоих аллелей имеют одинаковый или очень близкий молекулярный вес.

G-т—f 300 200 — — —— < I'iic. S. O tnn MyiHiiuii 3875deM вен ЛГ12101. (Л) Родословная II (1>) wie* |рофорС1 рамма продуктов амплификации участка ткзона НО гена URCA! к 8% НААГ. Дорожка X» 1 - маркер мшшкулярнт и носа о г 100 до 1000 череч 100 нуклео гидов, № 2.3 — продукты ач run гфн каши i франка ira НО Д11К нацменгкн it ее jO'Wpu с мутацией 3&75dcl4 («Ipajycrcu icrcpoayii/'ieitc). № 5 - продует амилнфнквции фра! мента НО ЛИК пациентки 6« мутации о-1-□ (1> <Ь * 1 2 3 (Ь) , ^ Fue. А. Схема наслслоиашш »lyiaiiiin U1203X в семье нацненгя Л| 2351. (А) Родоелоцная И (1>) тскфофор« рамма SSCI'-ananii m продуктов амплификации учасша «-«»на 1 Ю iciia ISRC.t! в 12% ПАЛГ Дорожка № ! - обракн ДНК нанианкн бе-i чучацнн. № 2 - oópaiou ДНК наннегикп № 235 ¡ е .mvtímiiicíí. № 3 -обрами ДНК cccipi.i iiaiiiiCHiMi с мутацией

<А>* (L 1 2 3 <Б) * L- f Рис. 7, Слсч» маежташш мушипн LI250K и семье iiititiicui» JV- 2(111. (А) Родословная к (1>) 1лекчро«|юр|;| раммп SSCP-aiiítmia прод>к1оп амачнфнкашш участка жюна 1 lOieim BRCAi в 12%ПАЛГ. Дорожка Wa 1 -обраleu ДНК пациешки К; 2011 с мутацией, № 2 - обра ¡сц ДНК дочери нацнешкп № 2011 с мугацнеП. № 3 - oopaicu ДНК пациентки Coi мушиш (Л) • "■ (¡ •.' 0 G </ ^TVC (ü) lAMt^é ■■: G V G'-G- . fc/c l'itc. N. Графические ,íuiiiiuo a»ii>tiai>i'iech'ui«eeKiie>itip<)iiiititiii. (At ноедсюнаrc.ii.iu«ш фрагмеша 1 l(i II »к lona tena BRCAI, сакрлашеи иилиморфиш С.22010Т u г с i upo шинном еос ишнш и (l>) нормальной Hoc.(c;k>i<jiu.iiiiKicui содержащей аллель С но.шморфтма с 2201с>1' н юмошгошоч сосюяинн

что свидетельствовало о наличии в мутантом аллеле точечной мутации, испротяжеппой делении, или ипеерции. Клонирование и последующее секвепировапие. проведенное по методу Сшджера. выявило наличие вегавки одного нуклеотида 2274insA в мутантной нити гена BRCA1.

Мутация R1203X (с. 3726ОТ) обнаружена у пациентки № 2351 из второй группы. 1'ак молочной железы у -)гой пациентки был диагностирован в возрасте 46 лет. Мутация была обнаружена при проведении анализа амплифицировапного фрагмента 1 К) методом SSCP. Секвепировапие по методу Слглжера позволило выявить замену С.3726ОТ в гетерозиготном состоянии. Мутация с. 3726ОТ приводит к замене колона CGA, кодирующего аргинин в положении ' 1203 кДНК, па стои-кодон (ТОЛ). I* ходе проверки ДНК родственников пациентки № 2351. мутация R1203X была обнаружена у ее сестры.

На 'хтектрофореграмме SSCP-анализа (рис. 6) дополнительные зоны одпонитевых конформеров Д11К вигшы не только на дорожке № 2 (образец ДНК пациентки № 2351 с мутацией), но и на дорожке Nn 3 (образец ДНК сестры пациентки). Одинаковым образом измененная члектрофоретическая подвижность однонитсвых конформеров ДНК свидетельствует о наличии одной и той же мутации у пациентки № 2351 и у ее сестры.

Мутация Е1250К (с. 3867 G>A) обнаружена у пациентки № 2011 из второй группы. Диагноз рак молочной железы был поставлен ей в возрасте 64 лет. Мутация была выявлена при проверке продуктов амплификации фрагмента I К) методом SSCP-анализа. Выявленный образен с мутацией был секвенировап по методу Сэнджера. ДНК пациентки № 2011 содержала замену с. 3867 С>Л в гетерозиготном состоянии. Эта мутация приводит к замене колона GAG. кодирующего глугамиповую кислоту в положении 1250. па колон AAG. кодирующий лизин. Был проведен анализ ДНК родственников пациента № 2011, несущей мутацию 1-2125ОК. Родословная и -хпектрофореграмма SSCP-аиалпза продуктов амплификации ДНК пациента и родственников представлена на рис. 7. Как видно из рис. 7 данная мутация, помимо пробапда. была обнаружена у дочери пациентки № 2011.

Полиморфизм S694S (с. 2 201 ОТ) был обнаружен но различию •>лектрофоретической подвижности одпонитевых конформеров продуктов амплификации фрагмента 1IG 11 ■ жзопа гена HRCAI при проведении SSCP-анализа. Секвенирование последовательности <>pai мента IIG одною из образцов выявило замену С па Г в положении 2201 по кДНК (рис. 8) в гетерозиготном состоянии. Полиморфизм с. 2201 ОТ не приводит к -замене аминокислотного остатка в последовательности гена HRCAI. так как оба колона AGC И ЛОТ кодируют серии.

Полиморфизм L771L (с. 2430Т>С) также был обнаружен по различию олектрофоретической нолвижносгГи однопитевых кон(|>ормерон продуктов амплификации фрагмента 1111 II 'жзона гена BRCAI при проведении SSCP-ападиза. Секвенировапие последовательности (фрагмента 1111 одного из образцов выявило замену Т на С в положении 2430 по кДПК в гетерозиготном состоянии. Полиморфизм с. 2430Т>С не приводит к замене аминокислотного остатка в последовательности гена BRCAI. так как оба колона TIG и CTG кодируют лейцин.

Полиморфизм E1038G (с. 3232 A>G) был обнаружен при проведении SSCP-анализа продуктов амплификации фрагмента 1IK2 жзона 11 по различию •электрофоретической подвижности однонитевых коиформеров образцов. Секвенирование последовательности фрагмента 1111 одного из образцов выявило замену Л на G в положении 3232 по кДНК в гомозиготном состоянии. Полиморфизм с. 3232 A>G приводит к замене кодона GAA. кодир) юшего глутаминовую кислоту в положении 1038, на ко дон GGA. кодирующий глицин.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Данные о спектре мутаций, характерном для конкретного региона позволяют значительно ускорить процесс ДПК-диапнкгики. Имеющиеся к настоящему времени данные (Скрябин и др., 2000) свидетельствуют о том. что Северо-Западный регион, включающий Санкт-Петербург и Ленинградскую область, является одним из наиболее неблагоприятных районов России по частоте возникновения рака молочной железы. За последние К) лет первичная заболеваемость в Санкт-Петербурге и Ленинградской области увеличилась почти в 3 раза (на 261%). Важно отметить, что в России смертность от рака молочной железы продолжает увеличиваться и составляет 50% от заболеваемости данной формой злокачественной опухоли.

Одним из возможных путей сокращения смертности от этого заболевания является проведение ДНК-диапюстики и постановка па учет к врачам-онкологам женщин - носителей мутаций в генах предрасположенности. Для разработки методов диагностики необходимо знание спектра мутаций, характерных для Саню-Петербурга и Ленишрадекой области. Основной целью работы являлось изучение спектра мутаций гена BRCAI у больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге.

Выбор методов, с помощью которых осуществлялся поиск мутаций, во многом связан со структурой гена BRCAI. Ген BRCAI имеет протяженность приблизительно 80 тысяч пар нуклеотидов. Он состоит из 24 жзоиов. причем 1 и 4 являются некодируюшими. Из 22-х кодирующих жзопов необычно велик П. он занимает более 50% кодирующей части гена. 11рямое секвепировапие

протяженных генов связано с определенными сложностями, тем более, что наиболее часто встречающимися в последовательности гена являются мутации, приводящие к сдвиг")' рамки считывания, для выявления которых необходимо произвести разделение аллелей с помощью клонирования. Полому мы использовали методы первичного поиска мутаций.

В качестве методов первичного поиска использовали методы гетеродуплекспого и 88СР-аиализа. Следует отметить, что метод 88СР-апализа

позволяет выявить, по разным оценкам, от 70% до 90/о мутаций (01ауас е! а1.. 1993). Часто достаточно замены одного основания, чтобы ее можно было детектировать методом 88СР-анализа, полому такой подход целесообразно использовать для выявления миссепс- и иопсепс-мутаций. Наиболее распространенными мутациями в гене ВКСЛ! являются мутации сдвига рамки считывания, то есть делении или инсерции. Гетеродуплексный анализ является высокоэффективным методом для выявления такого типа мутаций (02сеИс е! а1.. 1996). Использование этих методов позволило обнаружить 7 различных мутаций и 3 полиморфизма в 11 и 20 жзонах гена БКСЛ1.

В ходе работы были исследованы 5, II и 20 экзоны гена ВКСЛ1. При обследовании 43 пробандов и 17 родственников были обнаружены 16 случаев мутаций, ведущих к предрасположенности к развитию рака молочной железы. Из них - 2 миссепс-мутации, 2 нонсенс-мутации и 12 мутаций, приводящих к сдвигу рамки считывания.

Мутация 5382insC - одна из наиболее распространенных в мире. Она была обнаружена нами у 4 иробандов. Интересно, что 'уга мутация 'вызывает утрату всего около 70 аминокислот на С-коице белка, по, как было показано ^гаситщ е! а1., 1997), является довольно частой причиной заболевания. Мутация 53821шС. по информации базы данных Б1С. является второй - по распространенности после 185с1е1ЛО мутацией, приводящей к сдвшу рамки считывания (536 случаев). Она обнаружена практически во всех исследованных популяциях мира, за исключением афро-американцев. Рептп-\ЪСо2 и др. в 2002 показали, что данная мутация не вызывает деградации мРПК. а приводит к синтезу укороченного белка. Вследствие тгой мутации полностью изменяется аминокислотная последовательность белка, начиная с 1756 аминокислоты, а в позиции 1829 образуется стоп-кодон. Таким образом, частично утрачиваются важные для функциональной активности белка повторы БЯСТ находящиеся с 1640 по 1863 аминокислоту. Действительно, БЯСТ-повторы участвуют во взаимодействии с белком БЯСА2 , РНК-геликазой Л, белком р53 и СИР. полому их утрата может привести к нарушению процессов репарации ДНК и регуляции клеточного цикла. Кроме того, можно сделать вывод, что любые

поисенс-мукшии и мутации, вызывающие сдвиг рамки счтывапия. приводящие к у1раге ВКСТ-пошоров, Могут стать причиной наследственной предрасположенности к раку молочной железы.

Был проведен анализ ДНК родственнике)» двух нациейюк. пее>ши\ мутацию 53821а8С. и показано отсу1ствие мутации у дочери и инучкм одной из пациепюк. '1акже мутация огсушвовала у дочери друюи панпешки Родственники остальных пациенток не были лоау ппы для анализа.

Оптимизированные условия- разделения ююродуплсксоп пошолякн проводить экспресс-тестирование ДНК на наличие мутации 53821шС Наличие образцов с данной мутацией позволяет использовав ')гог метод в качестве мстода первичною поиска мутации 53821шС в семьях, отощеппых по раку молочной железы

Впервые обнаруженная мутация 2963delЮ. У одною из пробапдов нами была идешифицировапиа новая му1ация в II жзопе ! сна НЕСЛX В соответствии с международной номепклшурои она была названа 2963Пе11() (с. 2963-2972с1е110). Данная мутация вызывает сдвиг рамки считывания и приводи) к изменению аминокислотой последовсиелыюсти белка Начиная с 948 аминокислотою остатка. последова1елыюсть полностью оишчжмея ш нормальной и обрывается на 999 аминокислот. При идешификании повои мутации важно определить ее роль в развитии заболевания. Проверка ф)пкциональной активности белка в случае, когда в резулььие мутации утрачивается существенная часть мультифупкциопальпою белка, чаше всего невозможна. В таких случаях обычно используют косвенные меюды доказательства влияния неизвестной ранее мукщии па развитие заболевания или предрасположенности к нему. Одним из кжих методов являстся сопоставление новой1 мушции с известной мутацией, вызывающей предрасположенность. В мире описано 14 мутаций, приводящих к возникновению стоп-кодона в тй 'же позиции (БГС). из них 13 муитип сдвша рамки считывания и одна иопсепс-мукщия. Вышеназванные мутации приводя! к предрасположенности к развшию «болсвания (В1С). и моному мм следами вывод о том. что данная мутация также вызывае! предрасположенное и, к развшию рака молочной железы и яичника. Анализ ДНК родственников пациешки. несущей делению 2963(Се1Ю показал, чю данная муктия присутствует в последовательности ДИК сестры и дочери пробапда. Таким образом, пациешка, ее сестра и дочь являкмея терошкнпыми постелями мутации 2963сСе1 10 в гене НЕСИ. Скорее всею, данная м\1ация явилась причиной возникновения рака молочной железы у пробапда в 41 ки и рака яичника у ее сестры в 52 юла 19-лстпяя дочь пациешки в данный момеш не имеет признаков заболевания. Резулькиы обследования бьын сообщены

лечащему врачу с мелью рекомендации поскшовки дочери ироблнда на viei к онкологу.

Для жспрссс-лиапюсгики наличия мой мутации у нацистом можо бып. применен теродуплексный анализ с использованием и клчсстс положшелмшго кош роля продукт амплификации ДНК фрагмент 11.1 постели му|аиии. Ova деления не приводит ни к появлению повою, ни к исчезновению с\щсс1вовавшсю сайга ни для одной из извесшыч ждопуклеаз. поэтому метод анализа полиморфизма длин рестрикционныч фрагмешов не подчодиг для 1ес1ирования на наличие данной мутации.

Роль мутаций 3819del5 и 3875del4 в развитии предрасположенности к ^ заболеванию. Myiaunx 3819dcl5 обнаружена у днуч пробандов У одной

плциешки рак молочной железы был диагностирован в возрасте 31юда. у ' | друтй - в Bojpacie 36 лет. В дальнейшем, в возрасте 48 лет, у второй пациентки

; был диагностирован первичный ,рак шорой молочной железы. Мутация

3875dcl4 была обнаружена нами у хиной пациентки с диагнозом рак молочной железы, поставленным в возрас<е 47 лет. Велело вис обеич мукщии образ\кмся стоп-кодопы. в позициях 1262 и 1241. cooiBeicrneiino

В базе данныч BIC сообщения о мукщии 3819с1е15 паречакмея 22 рак» и. таким образом, она занимает 20 место по распространенное!п среди ною inna муитий. Вообще, довольно низкая встречаемость ной мутации может ' сиидетельс1вова1ь о высокой ее iiciic ip aiiriio c iu и сравншельпо раннем

проявлении заболевания. Помимо нашей выборки, данная мутация была найдена в нескольких арапах Гвроны. включая Германию. Данию. Чечню. ' Францию и Польшу, а также в Австралии и США (В1С) Мутация 3874deI5 была

* впервые найдена Castilla и др в 1994 юду при обследовании iруины нацистов

( с семейной историей рака молочной железы и яичника. По данным BIC мукщия

• 3875dcI4 встречается в большинстве европейских популяции (Италия.

Ирландия. Шотландия, Англия, Дания. Чехия. Германия), а также в Азии и Африке. Среди мутаций, приводящих к сдвжу рамки счишвания, па мутация занимает 4 место по раскроет раненное i и. В базе данныч насчишвастся 73 сообщения об обнаружении 'мой мутации у различпыч нацистов

Perrm-Vido/. и др. в 2002 юду показали возможный механизм, приводящий к развшию заболевания у пациентов. пее)шич мукщии 3819с1е15 и 3875с1е14 Близость образующичея в резулышс них мутаций сюп-кодонов к послсдотиелыюстям, участвующим в слиянии жзонов. приводи! к нар) тению процессипга и к быстрой дсфадации мРПК. Таким образом, носители -них му|аций обладаю! лишь одной нормально траислир>емой копией юна BRCA1. чю существенно повышает риск развшия рака молочной железы. Меюдом 1есм!ровапия обеич мутаций явлмося 1С1срод\илекспый анализ, коюрый бьп

применен также и для анализа ДНК родственников иробапдо». К сожалению, в случае мутации 3819del5 родственники не были доступны для анализа. Мутация 3875del4 помимо пробанда. была обнаружена нами у ее дочери. У пациентки диагноз рак молочной железы был поставлен в возрасте 47 лет, а у дочери в 14 лет был поставлен диагноз дольковая гиперплазия молочной железы и киста правого яичника."

Редкая мутация 2274insA. Впервые мутация 2274insA была обнаружена Weber в 1997 году среди белых североамериканцев, больных раком молочной железы и принадлежащих к семьям, отягощенным семейной историей заболевания. Данная- мутация приводит к слешу рамки считывания и образованию терминирующего кодопа (стоп 725) в последовательности гена BRCAI. Из данных, представленных в BIC, следует, что па мутация не являемся широко распространенной в уже охарактеризованных популяциях, так как запись о . ней встречайся только один раз. Связь мутации с предрасположенностью к раку молочной железы была показана, с помощью косвенных методов. Мутация 2274insA была обнаружена нами у пациентки с семейной формой рака молочной железы. Иисерция 2274insA не приводи! к изменению рестрикциопиой карты фрагмента 1IG. поэтому метод анализа полиморфизма. длин рестрикционных фрагментов не применим в качестве метода быстрой детекции данной мутации. К сожалению, родственники данной больной были недоступны для исследования.

Нонсенс-мутация R1203X. Мутация R12O3X была выявлена нами у пациентки с семейной формой рака молочной железы. Заболевание было диагностировано у нее в возрасте 46 лет. Изменение с. 3726ОТ в последовательности ДИК гена BRCAI. обнаруженное у данной больной. 1]риводит к замене кодона CGA, кодирующего аргинин в положении 1203 по кДНК. на стон-колон (TGA). Синтезированная с такой матрицы мРПК транслируется в укороченную белковую цепь, не имеющую многих функционально значимых доменов, в том числе и повтров BRCT, улрата которых приводит к отсутствию взаимодействия BRCAI с белками, участвующими в котроле клеточного цикла. Кроме того, было показано возникновение нарушений в системе репарации ДНК. связанное с муцщией R1203X. Abbot и др. в 1999 году получили культуру клеток, несущих один аллель с данной мутацией, а другой аллель дикого типа. Клетки другой полученной ими культуры несли аллель дикого типа в гомозиютном состоянии. Данные, полученные в результате исследования влияния излучения на пи два типа клеток, позволили предположить, что мутация RI203X приводит к существенным нарушениям в системе репарации двупитевых разрывов ДНК. Данная мугация была обнаружена впервые Friedman и др. в 1994 году при

обследовании пациентов с семейными формами рака молочной железы и яичника, для которых была покачана связь заболевания с локусом 17q2l. 13 настоящее время в базе BIC присутствует 16 записей об обнаружении мутации R12O3X и, таким образом, ей принадлежит 11 но распространенности место среди нопсеис-мутаний, вызывающих предрасположенность к раку молочной железы и яичника. Данная мутация была обнаружена в большинеше западноевро11ейских популяций.

При анализе ДНК родственников пациентки, несущей мутацию RI203X, было обнаружено, что данная мугация присутствует в последовательности ДИК сестры пациентки, которой был поставлен диагноз рак молочной железы в 41 год. Изменения в последовательности ДНК фрагмента ПО не приводят к 1 исчезновению имеющихся или появлению новых сайтов для чндонуклеа!

f рестрикции, поэтому единственным методом быстрой детекции данной мутации

^ ЯВЛЖ1СЯ гетеродуплексный анализ.

Миссенс-мутацня Е1250К - мутация пли полпморфнш? Влияние миссенс-мутаций, вызывающих аминокислотные замены, зависит от расположения этих замен в последовательности белка. Когда связь структуры и

1 функции белка известна не полностью или, как в случае с белком BRCA1, белок

■

многофункционален и сложен по структуре, влияние миссенс-мутаций чаще всего можно оцепить только после статистического сопоставления данных по наличию мутации и наличию заболевания.

Мутация Н1250К была обнаружена у пациентки с семейной формой рака молочной железы, причем диагноз был поставлен в возрасте 64 лет. Изменение иуклеотидной последовательности ДНК с. 3867 0>Л приводит к замене кодоиа | GAG, кодирующего глутаминовую кислоту в положении 1250, па кодон ЛЛ(],

J соответствующий лизину. Мутация Е125ОК расположена вне функциональных

доменов, но замена отрицательно заряженной глутаминовой киелслы на

! положительно заряженный лизин может повлиять на копформацию белка и, как

следствие, привести к снижению функциональной активности. * К сожалению, в настоящее время не имеется данных о функциональной

значимости замены, и в базах данных она характеризуется как неклассифицированный вариант. Имеется всего 8 сообщений о данном изменении последовательности гена BRCA1, причем оно было выявлено 'только в странах западной Европы и только группой исследователей Myriad Genetics. Таким образом, если сравнить число сообщений о замене Е125ОК с распространенностью наиболее часто встречающейся миссенс-мучации R1347G (142 записи в BIC), можно сделать вывод о низкой распространенности данной замены.

Результаты тестирования родственников выявленного нами носителя мутации Е1250К свидетельствуют о се возможной роли в развитии заболевания. У дочери иробанда, являющейся носителем той же мутации, диагноз рак молочной железы был поставлен В" возрасте 39 лет. Экспресс-мечодом тестирования пациентов на наличие мутации с.3867 0>Л, приводящей к аминокислотной замене Е125ОК, является i етеродуачексный анализ продуктов амплификации фрагмента 1 К).

Полиморфизмы E1038G, S694S и L771L. При исследовании 11 'жзопа гена ВКСЛ1 методом SSCP-анализа нами были выявлены 3 известных в мире полиморфизма. Два из них не приводят к замене аминокислот, а полиморфизм E1038G приводит к замене глутаминовой кислоты на глицин. Мы наблюдали ецеаченность трех обнаруженных полиморфизмов:

Полиморфизм Аллели

ЭбЗДЭ С Т

1,771Ь Т С

в 10380 А «

Интересно, что анатогичиую сцеаченность наблюдали Durocher и др. в 1996 году при изучении канадской популяции и Карпухин и др. в 2002 году при изучении больных семейными формами рака молочной железы и яичника Москвы.

Мы провели сравнение частот встречаемости полиморфизмов S694S, L771L и E1038G в группе больных раком молочной железы и яичника Санкт-Петербурга и в аналогичных ipynnax некоторых других популяций, данные но частотам встречаемости аллелей которых были представлены в литературе (табл. 1, 2 и 3). С помощью критерия у}ь\ы показали, что на уровне шачимости I

5% только популяция афро-американцев достоверно отличается по частоте аплслей полиморфизмов L771L и Е10380.

Таблица 1. Сравнение частот аллелей полиморфизма S694S в ipynnax больных раком молочной железы и яичника Санкт-Петербурга и некоторых других популяций.

Сан кт-Пстсрбур г Кянздл (ПигоеИег е1а1,1У%)

СД'=11.64/0.36 С7Т=0.Ш).34

х'ИЫб

Таблица 2. Сравнение часки аллелей полиморфшма 1.7711. и ¡р_\Нпах больныч раком молочной железы и яичника СапюМЧеюрбурш и некоюрых лр>|и\ популяций.

Санкт-Петербург

170=0.64/0.36

США (Friedman et а!, 1994) США белое население (King/Newman. 1997. LUC) США афро-американны {King/Newman, 1947.В1С) Канада (ОшоеЬег cl al. 19%)

Т/С=0.67/0.33 Т/С=0,68/0.3 2 Г/СИ) К 1/(1.19 Т/С=0.6Ш,32

xJ=o.M X1=0.4S XJ=9.42 .хЧш

Tu&iHita 3. Сраинепие частот аллелей полнморфюма Lil038G в iji}irn;t\ больных раком молочной желеды и яичника Cai нет-Петербурга н некоюрыч других популяниП.

Санкт-Пмербург

Л/СМ) 64/0.36

США (ГгМшап et al. 1994) США белое население {King/Newman. 1997, ШС) США афро-американцы (King/New man. 1997. HIC) Канада (Durochcr cl al. 1996)

Г/С=0.67/0.33 Т/С=0 6Ш 32 1/00 81/0 19 'I700 66/0.34

х*=0,45 IJ=9.42

Поиск мутаций в 5 эгооке гена BRCAI. В настоящее время по данным BIC извеемю 44 различных мукщий п 5 жзоие юна HRC.ll. Например, одна из наиболее рлсцроараненных му1аций и Польше (C6IG) (Gon>ki et a!.. 2000. Gr7\bowska et al.. 2000, van der l.ooij et aL 2000; Peikowska, el al., 2003) локализована u пределах именно 'лотжзопа. Чакже rra мутация бым найдена в Лапши е лоааючцо высокой частотой (8.7%) (Csokaj et а!.. 19У9). С связи с я им мы произвели скрипит, всех образцов банка на наличие MVI анионных изменений в 5 1кзоне с помощью меюдов rciepo;i>ibieKCiioio и SSCT-аиализа. по не обнаружили пи одною случая изменения пуклеожлпой последова1елыюс1И. Возможно, тм факч свидсчельсгвус! об oicyicrBHH мутаций в последовательное!и жзоиа 5 гена HRCAI у больных семейными формами рака молочной железы в Сашл-Петербурге.

Заключение. При исследовании 5. 20 и II жзонов icna ИНС. II ДНК 43 нацист он с семейными формами рака молочной железы мы обнаружили II различных вариантв пуклеождной ноеледоваюлыюеш. включая норма п>н\ю послсловтелыюсп» (GenBank, U.14680) Семь из )гнх вариантов MOIA i бып,

охарактеризованы как содержащие.мутации, ведущие к предрасположенности к !

раку молочной железы (Табл. 4.5). Три других варианта являются ранее описанными в мире полиморфизмами. Впервые в России обнаружены 5 мутаций, из них одна (2963dellO) является повой.

Две найденные нами у больных из Санкт-Петербурга мутации (5382insC и 3875del4) встречаются у больных в других регионах Российской Федерации. В некоторых случаях вычисленные нами частоты встречаемости данных мутаций существенно отличаются от описанных в других регионах частот, что может быть связано с различиями выборок, анализированных авторами.

Наблюдаемая в данном исследовании спеплеиность обнаруженных i

полиморфизмов согласуется с данными, полученными другими исследователями при изучении вариабельности гена HRCA1 в других популяциях (Friedman et al., 1994: Durocher et al., 1996; Карпухин и др.. 2002). Хотя нам не. удалось показать связь какого-либо гаплогииа с обнаруженными *

мутациями даже » пределах одной семьи, данные о полиморфных вариантах гена представляют определенный научный интерес, так как в ряде случаев являются удобными генетическими маркерами.

Таблица .4. Характеристика мутаций гена BRCAI. выявленных в ходе данного исследования у больных семейными формами рака молочной железы Санкт-Петербурга.

MKIOU MlIHHIIH *)ффскт Мстид TFCI 1(|№№Я|||ГЯ 11мсло ccnrcii (паписпгш) Примем и и in'

20 5382insC Стоп 1829 Гсгсродуплскснмй пиши н 4(4) litneenia« и мире

II 2963<tell 0 Спш W 1 'ci с роду 11 лекены Ii ШСиИ! i 1(3) 1IUIUM

II 3SI9ÜCI5 Cnw 1241 Гаеридунлехсный aiiajiiu 2(2) Ишссиш и мире

II 3875üc14 Стоп 1262 1 етероду о леш u.iil an im in 1 (2) Ншеспш n мире

11 2274 i iu А Civil 725 ГаерияуплекеныН anалin HD И шестая и мире

И R1203X Ais-стон SSL'i'-aniuiii i ИЗ) HtnCLIIIilU н мире

II Н12Ж Cilu-Lyb MSCI'-aiiajuri 1 (2) Итссшйя н MllpC

Р

! 2,

I Таблица 5 Характерно шка полиморфных вариашов i сна БКСЛ1.

выявленных в ходе данного исследования у больных семейными формами рака 1 молочной железы Санкт-Пе1ерб)р1а

И SSCP-a^йJ¡tп Час гмЛ |<1)Л||\Шрф|Н м ЧасЮ1Ы аллелей 1 »64. С 036 н=43

>1 1,7711. 1 ей-! еи ^ЛСТ-.ничи 1 Чпсгын ИО'ШЪШрфи1 м Чги, г<п |,1 .1 иле чем ГО 64. С 0 36 »=43

11 [.юз кс; С1и-0!у ЧЧСРчшалн» Часгии (ИМНМОрфи? »1 Чаекнм аллелои 1 0 64. С 0 36 п=43

п - число проанализированных хромосом

ВЫВОДЫ

1. В коллекции из 43 образцов i спомиой ДНК больных семейными формами рака молочной железы в Сапкт-Петербур1е идентифицированы семь мутаций в гене ВЯСЛ1: 5382ш8С. 2963ёе1Ю, 38Ше15, 3875ёс14, 2274ins/V Ш203Х и Ы250К. Мутация 2963ёе11() явчяется новой, мутация 2274шsЛ впервые обнаружена в Гвроне, а мутации 3875ёе14, Ы203Х и К1250К впервые обнаружены в России Таким образом была охарактеризована вариабельность юпа ВКСЛ1 у больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-1Ыер6урге.

2 Показано, что для больных Санкт-Петербурга, имеющих семейную исюрию заболевания рака молочной железы, не хараЮерпо наличие мугаций в 5 жзоне i епа ВКСЛ1.

3. Па основе метода кмеродунлекспою анализа разработана методика для жепресс-юстирования на наличие новой мутации 2%3ёе110 (с.2963-2972ёе110) в последовательное!и гена ВЯСЛ!

4 Анализ ДНК родственников нацистов, у котрых были обнаружены мутации, позволил провести генетическое консулыировапие в семьях больных семейными формами рака молочной железы и яичника.

5. Впервые в Санкт-Петербурге обнаружен ряд сцепленных дру| с др\тм полиморфизмов (S694S. L771L и EI038G), ранее описанных во мпошх популяциях мира

Список работ, опубликованных но теме диссертации:

1. Грулнинпа И.Л.. Ламбер Е.Г1. Нош.ю и часто встречающиеся наследуемые мутации в генах BRCA-семейства у больных раком молочной желечы Санкт-Петербурга». // Пятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователем «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 21 апреля 2002 г.. с. 6061.

2. Грулшпша Н.Л.. Голубков В.И.. Татищева Ю.Л.. Брежнева Т.Н.. Насилье» В.Б., Хансон К.П., Мандельштам M.IO. Успехи в молекулярной диагностике наследуемых форм рака молочной желечы. // Технологии (еноднагностнки и практическом.здравоохранении, сборник трудов симпозиума. Москва 20-21 июня .

2002 г.. с. 165-167. ' _ '

*

3. Грудинина И.Л., Ламбер Е.1Ц Голубков В.И.. Брежнева Т.В., Васильев В.Б., Хансон К.П., Мандельштам М.Ю. Изучение спектра мутаций » гене BRCA1 у

больных раком молочной железы и яичника Санкт-Петербурга. // ill съезд '

биохимического общества, VI симпозиум. Тезисы научных докладов. Санкт-Петербург, 26.06.2002-1.07.2002 г., стр. 284.

4. Grudinina М.Л., Tatishcheva J.A. Molecular diagnostics of familial breast cancer. // i 13 th European Students' Conference 2002, October 29 th - November 2 nd. Abstract

book. p. 141.

5. Тихомирова О.С, Грудинина П.Л.. Деления 9481's в гене BRCAI у больных семейными формами рака молочной железы. // Шестая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье». Санкт-Петербург, 19 апреля 2003 г., с. 166-167. 1

6. Тихомирова О.С., Грудинина Н.Л. Семейная форма рака молочной железы и яичника, вызванная мутацией в II жзоие гена BRCAI. II Молодые биологи Санкт-Петербурга -300-детню города, материалы конференции. Санкт-Петербург. 2003 г.. с. 104.

Т. Мандельштам М.Ю.. Грулшпша Н.Л., Тихомирова О.С., Голчбков В.П.. Брежнева Т.В.. Хансон К.П., Васильев В.Б. Мутации гена BRCAI у онкологических '

больных Санкт-Петербурга: преобладают широко распространенные мутации. // Всероссийская - научно- практическая конференция «Современные достижения клинической генетики», Москва. 25-27 ноября 2003 г.. Медицинская генетика том 2 №10. с. 427.

В. Гру/шннна Н.А.. Тихомирова О.С, Идентификация мутаций, вызывающих преждевременную термииацпю трансляции мРПК гена BRCAL у больных семенными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге. // Седьмая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и em здоровье», Санкт-Петербург, 1В апреля 2004 г., с. 67-6В.

9. Грулшпша Н.А., Голубков В.И.. Тихомирова О.С, Брежнева Т.В.. Хансон К.П.. Васильев В.Б., Мандельштам М.Ю., Идентификация мутаций в гене BRCAI у больных раком молочной железы Санкт-Петербурга (2004). // Вестник Российского Па) много Центра реитгеноралнологии Минздрава России вып.№3. http://vestnik.rncrr.ru/

I

*

Подписано в печать 20 05.04. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 70 экз. Заказ Ы*£&д

ЦОП типографии Издательства СПбГУ. 199061, С-Петербург, Средний пр., 41.

*\гъгъ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грудинина, Наталья Андреевна

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Научная новизна

1.3. Цель работы

1.4. Задачи

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Строение молочной железы

2.2. Формы рака молочной железы. КлассификацияИ

2.3. Статистика заболеваемости раком молочной железы

2.4. Возможные механизмы возникновения рака при мутациях в генах опухолевых супрессоров1.

2.5. Тканеспецифичность проявления мутаций в гене ВЯСА

2.6. Заболевания, связанные с мутациями в генах ВЯСА1 и ВЯСА

2.7. Наследственная предрасположенность к раку молочной железы

2.8. Структура гена и белка В11СА

2.9. Роль ВЯСА1 в регуляции транскрипции

2.9.1. С-Мус и ВЯСА

2.9.2 СйР и ВЯСА

2.9.3 ЯНА и ВЯСА

2.9.4р53 и ВЯСА

2.10. Роль ВЯСА1 в репарации ДНК

2.11. Роль ВЯСА1 в росте и дифференцировке клеток

2.12. Мутации гена ВЯСА

2.13. Спектр мутаций в гене ВЯСА1 в разных популяциях

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Пациенты

3.2. Выделение ДНК из свежей и замороженной крови по методу Кюнкеля 3.2.1 Выделение ДНК из свежей крови

3.2.2 Выделение ДНК из замороженной крови

3.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле

3.4. Полимеразная цепная реакция

3.5. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле

3.6. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях

3.7. Гетеродуплексный анализ

3.8. SSCP-анализ

3.9. Окрашивание образцов ДНК6J

3.9.1 Окрашивание бромистым этидием

3.9.2 Окрашивание нитратом серебра

3.10. Клонирование

3.10.1 Лигирование

3.10.2. Трансформация E.coli

3.10.3. Идентификациярекомбинантных клонов путем амплификации клонированных последовательностей

3.11. Секвенирование ДНК

3.12. Статистические методы

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Мутация 2963del 10 (c.2963-2972del 10)

4.2. Мутация 5382insC (c.5382-5383insC)

4.3. Мутация 3819del5 (c.l234-1235del5)

4.4. Мутация 3875del4 (c.l252-1253del4)

4.5. Мутация 2274insA (c.720insA)

4.6. Мутация R1203X (c.3726C>T)НИ

4.7. Мутация E1250K (c.3867G>A)

4.8. Полиморфизм S694S (c.2201C>T)

4.9. Полиморфизм L771L (с.2430Т>С)

4.10. Полиморфизм E1038G (с. 3232A>G)П

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. ВведениеЦ

5.2. Мутация 5382тзС - одна из наиболее распространенных в мире

5.3. Впервые обнаруженная мутация 2963с1е

5.4. Роль мутаций 3819с1е15 и 3875с1е14 в развитии предрасположенности к заболеванию

5.5. Редкая мутация 2274тзА

5.6. Нонсенс-мутация Ш203Х

5.7. Миссенс-мутация Е1250К- мутация или полиморфизм?

5.8. Полиморфизмы Е10380, Б6948 и Ь771Ь

5.9. Поиск мутаций в 5 экзоне гена ВЯСА

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск и изучение мутаций в гене BRCA1 у больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге"

1.1. Актуальность проблемы

Достижения молекулярной генетики последних десятилетий привели к идентификации десятков тысяч генов человека. Это позволяет уже в настоящее время проводить молекулярную диагностику сотен моногенных заболеваний и определять генетические факторы риска развития распространенных болезней человека. Появился новый раздел медицины, получивший название молекулярной медицины, основанный на точном знании молекулярных механизмов возникновения наследственных заболеваний (Баранов и др., 2000). Определенные успехи достигнуты и в изучении механизмов патогенеза так называемых мультифакториальных (Горбунова и др., 1997) заболеваний, в этиологию которых наряду с факторами внешней среды значительный вклад вносят генетические составляющие.

Рак принадлежит к группе мультифакториальных заболеваний, хотя в некоторых случаях предрасположенность к раку наследуется по моногенному типу. Именно так наследуется предрасположенность к семейным формам рака молочной железы, вызванным мутациями в генах ВЯСА! и ВЯСА2.

Рак молочной железы является одной из наиболее часто встречающихся форм онкопатологии. В развитых странах мира около 10% женщин заболевают раком молочной железы в течение жизни. Изучение семей с несколькими случаями рака молочной железы в анамнезе позволило изолировать специфические гены предрасположенности к этому заболеванию, получившие название генов ВЯСА1 (1УП1а е1 а1.,1994) и ВЯСА2 (\Vooster а1.,1995) (ВЯеаз1 САпсег). При мутации в любом из этих генов высока вероятность развития рака молочной железы, а при мутациях в гене

ВЯСА1 возрастает вероятность развития рака яичника. Носители мутаций в этих генах имеют риск развития заболевания в течение жизни, приближающийся к 80%.

Интенсивные исследования вариабельности генов ВЯСА-семейства проводятся во всем мире. Первые популяционные исследования мутаций в гене ВЯСА1 были проведены в Канаде в 1994 году (81тагс1 а1., 1994). К настоящему времени известны около 1200 мутаций и полиморфных вариантов гена ВЯСА1 (В1С), причем набор мутаций и степень распространенности каждой из них характерен для каждой популяции и этнической группы. В связи с этим невозможно использовать данные, полученные при изучении мутаций и полиморфизмов генов ВЯСА в одних странах, для проведения ранней ДНК-диагностики предрасположенности к раку молочной железы в других. Именно этот вид диагностики позволяет выявить контингент женщин с высоким риском развития данного заболевания до возникновения клинических его проявлений. Предыдущие исследования российской популяции (вауШег а1., 1997; Мандельштам и др., 2001; ТегеБсЬепко е1 а!., 2002, Карпухин А.В. и др., 2002) показали как наличие распространенной в Европе мутации (5382 тэС), так и существенные различия спектра мутаций в гене ВЯСА1 в различных регионах (ОауШег е1 а1., 1997; Карпухин А.В. и др., 2002; ТегеБсЬепко е! а1., 2002).

Эффективность лечения рака молочной железы во многом зависит от своевременной диагностики. ДНК-диагностика позволяет выявить предрасположенность к раку молочной железы и осуществить постановку на учет к онкологу еще до возникновения клинических проявлений заболевания. В связи с постоянным увеличением заболеваемости раком молочной железы проблема ранней диагностики приобретает чрезвычайную актуальность.

1.2. Научная новизна

У больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге идентифицированы семь мутаций в гене ВЯСА1: 5382тБС, 2963<3е110, 3819с1е15, 3875с1е14, 2274тзА, Я1203Х и Е1250К, причем мутация 2963с1е110 является новой. Из числа выявленных пять мутаций (3875с1е14, 2274тзА, 2963с1е110, Ш203Х и Е1250К) ранее в Российской Федерации обнаружены не были. Впервые в Санкт-Петербурге обнаружен ряд сцепленных друг с другом полиморфизмов (86948, Ь771Ь и Е10380), ранее описанных во многих странах мира.

В результате работы была охарактеризована вариабельность гена ВЯСА1 у больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге. Разработанные для обнаруженных нами мутаций методы экспресс-диагностики могут быть использованы для генетического консультирования в семьях больных семейными формами рака молочной железы, а также для ранней диагностики предрасположенности к этому заболеванию.

1.3. Цель работы

Основной целью работы было изучение спектра мутаций гена ВЯСА1 у больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге.

1.4. Задачи:

1. Создать коллекцию образцов ДНК пациентов с семейными формами рака молочной железы;

2. Осуществить поиск мутаций в 5, 11 и 20 экзоне гена ВИ.СА1 этих пациентов методами гетеродуплексного анализа и анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (88СР-анализа);

3. Идентифицировать обнаруженные мутации методом секвенирования ДНК;

4. Разработать быстрые методы идентификации обнаруженных мутаций;

5. Провести анализ ДНК родственников пациентов, у которых были обнаружены мутации, с целью проведения генетического консультирования в семьях больных.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Грудинина, Наталья Андреевна

6. выводы

1. В коллекции из 43 образцов геномной ДНК больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге идентифицированы семь мутаций в гене ВЯСА1: 5382твС, 2963с1е110, 3819с1е15, 3875<М4, 2274тБА, Я1203Х и Е1250К. Мутация 2963с1е110 является новой, мутация 2274шбА впервые обнаружена в Европе, а мутации 3875с1е14, Я1203Х и Е1250К впервые обнаружены в России. Таким образом была охарактеризована вариабельность гена ВЯСА1 у больных семейными формами рака молочной железы в Санкт-Петербурге.

2. Показано, что для больных Санкт-Петербурга, имеющих семейную историю заболевания рака молочной железы, не характерно наличие мутаций в 5 экзоне гена ВЯСА1.

3. На основе метода гетеродуплексного анализа разработана методика для экспресс-тестирования на наличие новой мутации 2963с1е110 (с.2963-2972с1е110) в последовательности гена ДЯС47.

4. Анализ ДНК родственников пациентов, у которых были обнаружены мутации, позволил провести генетическое консультирование в семьях больных семейными формами рака молочной железы и яичника.

5. Впервые в Санкт-Петербурге обнаружен ряд сцепленных друг с другом полиморфизмов (86948, Ь771Ь и Е10380), ранее описанных во многих популяциях мира.

5.10. Заключение

При исследовании 5, 20 и 11 экзонов гена ВЯСА1 ДНК 43 пациентов с семейными формами рака молочной железы мы обнаружили 11 различных вариантов нуклеотидной последовательности, включая нормальную последовательность (вепВапк, и 14680). Семь из этих вариантов могут быть охарактеризованы как несущие мутации, ведущие к предрасположенности к раку молочной железы (Табл. 5.4). Три других варианта являются ранее описанными в мире полиморфизмами. Впервые в России обнаружены 5 мутаций, из них одна (2963с1е110) является новой (Табл. 5.5).

Две найденные нами у больных Санкт-Петербурга мутации (5382шзС и 3875с1е14) встречаются у больных других регионов Российской Федерации. В некоторых случаях вычисленные нами частоты встречаемости данных мутаций существенно отличаются от описанных в других регионах частот, что может быть связано с различиями выборок, анализированных авторами. Так, отличие частот встречаемости мутации 5382тБС скорее всего связано с разными критериями отбора пациентов для исследования. Например, в группе больных раком яичника, исследованных вауШег и др. в 1997, критерием отбора служило наличие у пробанда с раком яичника по крайней мере двух родственников первой степени родства с эпителиальной формой рака яичника. Группа, исследованная Карпухиным с соавторами (Карпухин и др., 2002), состояла из больных с семейными формами рака молочной железы и яичника, причем в среднем имелось 3-4 родственника 1-Н степени родства, страдающих данными заболеваниями. Частоты мутации 53821пбС в этих группах составили 47% и 33%, соответственно (Табл. 5.5). Эти данные по встречаемости мутации 5382тзС в Московском регионе наиболее близки к частотам встречаемости этой мутации в Польше (27%) (СогбИ е1 а1., 2000) и Латвии (22 %) (Сэокау е1 а1., 1999), где, видимо, использовались сходные критерии отбора пациентов. В то же время при отборе пациентов с семейными формами рака молочной железы группами исследователей из

Санкт-Петербурга и Томска (Tereshenko et al., 2002) использовались критерии, отличные от предыдущих групп исследователей, и частота мутации 5382insC составила 8% и 12%, соответственно (Табл. 5.5). Мы предполагаем, что наблюдаемое существенное различие частот встречаемости мутации 5382insC в различных регионах может быть связана как с фактическим их отличием, так и с используемыми исследователями критериями отбора. Наше предположение подтверждается, например, при сопоставлении данных относительно распространенности этой мутации в северо-восточной Польше, полученных двумя группами исследователей. Так, частота мутации 5382insC в группе из 25 больных семейными формами рака молочной железы и яичника (van der Looij et al., 2000) составила 4% в то время как в другой группе из 60 больных того же региона (Perkowska et al., 2003) составляет 10%. Проблема влияния критериев отбора больных для исследования на частоту обнаружения мутаций в гене BRCA1 подробнее обсуждается Gayther (Gayther et al., 1999).

Наблюдаемая в данном исследовании сцепленность обнаруженных полиморфизмов согласуется с данными, полученными другими исследователями при изучении вариабельности гена BRCA1 в других популяциях (Friedman et al., 1994; Durocher et al., 1996; Карпухин и др., 2002). Хотя нам не удалось показать связь какого-либо гаплотипа с обнаруженными мутациями даже в пределах одной семьи, данные о полиморфных вариантах гена представляют определенный научный интерес, так как в ряде случаев являются удобными генетическими маркерами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грудинина, Наталья Андреевна, Санкт-Петербург

1. Anderson S.F., Schlegel B.P., Nakajima T., Wolpin E.S., Parvin J.D. BRCA1 protein is linked to the RNA polymerase II holoenzyme complex via RNA helicase. A. Nat. Genet. (1998) 19:254-256.

2. Arason A., Barkardottir R.B., Egilsson V. Linkage analysis of chromosome 17q markers and breast-ovarian cancer in Icelandic families, and possible relationship to prostatic cancer. Am. J. Hum. Genet. (1993) 52: 711-717.

3. Backe J., Hofferbert S., Skawran B., et al: Frequency of BRCA1 mutation 5382insC in German breast cancer patients. Gynecol. Oncol. (1999) 72:402406.

4. Balci A., Huusko P., Paakkonen K., Launonen V., Uner A., Ekmekci A., Winqvist R. Mutation analysis of BRCA1 and BRCA2 in Turkish cancer families: a novel mutation BRCA2 3414del4 found in male breast cancer. Eur. J. Cancer (1999) 35(5):707-10.

5. Bell G.I., Karam J.H., Rutter W.J. Polymorphic DNA region adjacent to the 5'-end of the human insulin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:57595763.

6. Beller U, Halle D, Catane R et al. 1997. High frequency of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Ashkenazi Jewish ovarian cancer patients, regardless of family history. Gynecol. Oncol. 67(2):123-126.

7. BIC (Breast Cancer Informational Core): http://www.nhgri.nih.gov/Intramural research/Lab transfer/Bic/

8. Bork P., Hofmann K., Bucher P., Neuwald A.F., Altschul S.F., Koonin E.V. A superfamily of conserved domains in DNA damage-responsive cell cycle checkpoint proteins. FASEB J. (1997) 11:68-76.

9. Callebaut I., Mornon J.P. From BRCA1 to RAP1: a widespread BRCT module closely associated with DNA repair. FEES Lett. (1997) 400:25-30.

10. Chapman M.S., Verma I.M. Transcriptional activation by BRCA1. Nature (1996) 382:678-679.

11. Chen C.F., Li S., Chen Y., Chen P.L., Sharp Z.D., Lee W.H. The nuclear localization sequences of the BRCA1 protein interact with the importin-a subunit of the nuclear transport signal receptor. J. Biol. Chem. (1996(a)) 271:32863-32868.

12. Chen Y., Farmer A.A., Chen C.F., Jones D.C., Chen P.L., Lee W.H. BRCA1 is a 220 kDa nuclear phosphoprotein that is expressed and phosphorylated in a cell cycle dependent manner. Cancer Res. (1996(6)) 56:3168-3172.

13. Chen Y., Lee W.-H., Chew H.K. Emerging roles of BRCA1 in transcriptional regulation and DNA repair. J. of Cellular Physiology (1999) 181:385-392.

14. Claes K., Machackova E., De Vos M., et. al. Mutation analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in the Belgian patient population and identification of a Belgian founder mutation BRCA1 IVS5 + 3A > G. Dis. Markers (1999) 15:69-73.

15. Claus E.B.; Risch N.; Thompson W.D. Genetic analysis of breast cancer in the cancer and steroid hormone study. Am. J. Hum. Genet. (1991) 48: 232-242.

16. Claus E.B., Schildkraut J.M., Thompson W.D., Risch NJ. The genetic attributable risk of breast and ovarian cancer. Cancer (1996) 77:2318-2324.

17. Csokay B., Tihomirova L., Stengrevics A., Sinicka O., Olah E. Strong founder effects in BRCA1 mutation carrier breast cancer patients from Latvia. Human Mutation:Mutation in Brief #2585 (1999) Online.

18. Durocher F., Tonin P., Shattuck-Eidens D., Skolnick M., Narod S.A., Simard J. Mutation analysis of the BRCA1 gene in 23 families with cases of cancer of the breast, ovary, and multiple other sites. J. Med. Genet. (1996) 33(10):814-819.

19. Easton D.F., Bishop D.T., Ford D., Crockford G.P. Genetic linkage analysis in familial breast and ovarion cancer: results from 214 families. The Breast Cancer Linkage Consortium. Am. J. Hum. Genet. (1993) 52:678-701.

20. Fan S., Wang J., Yuan R., Ma Y., Meng Q., Erdos M.R., Pestell R.G., Yuan F., Auborn K.J., Goldberg I.D., Rosen E.M. BRCA1 inhibition of estrogen receptor signalling in trsncfected cells. Science (1999) 284:1354-1356.

21. Fleming I.D., Cooper J.S., Henson D.E. et al. Staging Manual, 5th ed. Philadelphia, Lippincot Raven. AJCC (1997).

22. Friedman L.S., Ostermeyer E.A., Szabo C.I., Dowd P., Lynch E.D., Rowell S.E., King M.C. Confirmation of BRCA1 by analysis of germline mutations linked to breast and ovarian cancer in ten families. Nature Genet. (1994) 8:399404.

23. Gayther S.A., Harrington P., Russell P. et al. Frequently occurring germline mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia. Am. J. Human. Genet. (1997) 5:1239-1242.

24. Glavac D., Dean M. Optimization of the single-strand conformational polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutation. (1993) Hum. Mut. 2:404-414.

25. Gowen L.C., Johnson B.L., Latour A.M., Sulik K.K., Koller B.H. Brcal deficiency results in early embryonic lethality characterized by neuroepithelial abnormalities. Nature Genet. (1996) 12:191-194.

26. Gowen L.C., Avrutskaya A.V., Latour A.M., Koller B.H., Leadon S.A. BRCA1 required for transcription-coupled repair of oxidative DNA damage. Science (1998) 281:1009-1012.

27. Greenman J., Mohammed S., Ellis D. et. al. Identification of missens and truncating mutations in the BRCA1 gene in sporadic and familial breast and ovarian cancer. Genes, Chrom. and Cancer (1998) 21:244-249.

28. Hall J.M., Lee M.K., Newman B., Morrow J.E., Anderson L.A., Huey B., King M.C. Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21. Science (1990) 250:1684-1689.

29. Hilakivi-Clarke L. Estrogens, BRCAaal, and breast cancer. Cancer Res. (2000) 60(18):4993-5001.

30. Huusko P. Predisposing genes in hereditery breast and ovarian cancer. Oulun Yliopisto, Oulu (1999) (http://herkules.oulu.fi/issn03553221/)

31. Isaacs S.D.; Kiemeney L.A.L.M.; Baffoe-Bonnie A., Beaty T.H., Walsh P. C. Risk of cancer in relatives of prostate cancer probands. J. Nat. Cancer Inst. (1995) 87: 991-996.

32. Jasin M. LOH and Mitotic recombination. DNA Alternations in cancer. Ed. Ehrlich M. (2000) Eaton Publishing:Natick, MA.

33. Jasinska A., Krzyzosiak W.J. Prevalence of BRCA1 founder mutations in Western Poland. Human Mutation:Mutation in Brief #389 (2000) Online.

34. Jensen R.A., Thompson M.E., Jetton T.L., Szabo C.I., van der Meer R., Helou B., Tronick S.R., Page D.L., King M.-C., Holt J.T. BRCA1 is secreted and exhibits properties of a granin. Nature Genet. (1996) 12: 303-308.

35. Jensen D.E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCAl-mediated cell growth suppression. Oncogene {1998) 16:1097-1112.

36. Joazeiro C.A. et. al. The tyrozine kinase negative regulator c-Cbl as a RINGtype, E2-dependent ubiquitin-protein ligase. Science (1999) 286:309-312.

37. Kiechle M., Gross E., Schwarz-Boeger U., Pfisterer J., Jonat W., Gerber W.

38. D., Albacht B., Fischer B., Schlegelberger B., Arnold N. Ten Novel BRCA1 and BRCA2 Mutations in breast and/or ovarian cancer families from Northern Germany. Human Mutation:Mutation in Brief #379 (2000) Online.

39. Konstantopoulou I., Kroupis C., Ladopoulou A., PantazidisA., Boumba D., Lianidou E.S., Petersen M.B., Florentin L., Chiotellis E., Nounesis G., Efstathiou

40. E., Skarlos D., Tsionou C., Fountzilas G., Yannoukakos D. BRCAI mutation analysis in breast/ovarian cancer families from Greece. Human Mutation:Mutation in Brief #359 (2000) Online.

41. Koonin E.V., Altschul S.F., Bork P. BRCA1 protein products: functional motifs. Nature Genet. (1996) 13:266-267.

42. Kunkel L.M., Smith K.D., Boyer S.H. et. al. Analyses of human Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1997) 74:1245-1249.

43. Langston, A. A.; Malone, K. E.; Thompson, J. D.; Daling, J. R.; Ostrander, E. A. BRCA1 mutations in a population-based sample of young women with breast cancer. New Eng. J. Med. (1996) 334: 137-142.

44. Levy-Lahad E., Catane R., Eisenberg Sh. et. al. Founder BRCA1 and BRCA2 mutations in Ashkenazi Jews in Israel: Frequency and differential penetrance in ovarian cancer and in breast-ovarian families. Am. J. Human. Genet. (1997) 60:1059-1067.

45. Liu C.Y., Flesken- Nikitin A., Li S., Zeng Y.Y., Lee W.H. Inactivation of the mouse Brcal gene leads to failure in the morphogenesis of the egg cylinder in early postimplantation development. Genes Dev. (1996) 10:1835-1843.

46. Lorick K.L., Jensen J.P., Fang S., Ong A.M., Hatakeyama S., Weissman A.M. 1999. RING fingers mediate ubiquitin-conjugating enzume (E2)-dependent ubiquitination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:11364-11369.

47. Lu M., Conzen S.D., Cole C.N., Arrick A. Characterization of functional messenger RNA splice variants of BRCA1 expressed in nonmalignant and tumor-derived breast cells. Cancer Res. (1996) 56:4578-4581.

48. Machackova E., Damborsky J., Valik D., Foretova L. Novel germline BRCA1 and BRCA2 mutations in breast and breast/ovarian cancer families from the Czech Republic. Human Mutation:Mutation in Brief #459 (2001) Online.

49. Manguoglu E.A., Luleci G., Ozcelik T., Colak T., Schayek H., Akaydin M., Friedman E. Germline mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes in Turkish breast/ovarian cancer patients. Human Mutation (2003) 21(4):444-445.

50. Markoff A., Savov A., Vladimirov V., Bogdanova N., Kremensky I., Ganav V. Optimization of single-strand conformational polymorphism analysis in the presence of polyethylene glycol. Clin. Chem. (1997) 43:30-33.

51. Maza J.E., et.al. Mapping the functional domains of BRCA1. Interaction of the ring finger domains of BARD1. J. Biol. Chem. (1999) 274:5659-5665.

52. Meyer P., Voigtlaender T., Bartram C.R., Klaes R. Twenty-three novel BRCA1 and BRCA2 sequence alterations in breast and/or ovarian cancer families in Southern Germany. Human Mutation:Mutation in Brief #645 (2003) Online.

53. Monteiro A.N.A., August A., Hanafusa H. Evidence for a transcriptional activation function of BRCA1 C-terminal region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:13595-13599.

54. Nastiuk K.L., Mansukhani M., Terry M.B., Kularatne P., Rubin M.A., Melamed J., Gammon M.D., Ittmann M., Krolewski J.J. Common mutations in BRCA1 and BRCA2 do not contribute to early prostate cancer in Jewish men. Prostate (1999) 40: 172-177.

55. Neuhausen S., Gilewski T., Nortron L. et. al. Recurrent BRCA2 6174delT mutations in Ashkenazi Jewish women affected by breast cancer. Nature Genet. (1996) 13:126-128.

56. Oddoux C., Struewing J.P., Clayton C.M. et al. The carrier frequency of the BRCA2 6174delT mutation among Ashkenazi Jewish individuals is approximately 1%. Nature Genet. (1996) 14:188-190.

57. Ouchi T., Monteiro A.N.A., August A., Aaronson S.A., Hanafusa H. BRCA1 regulates p53-dependent gene exspression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95:2302-2306.

58. Ozcelic H., Antebi Y. J., Cole D.E.C., Andrulis I.L. Heteroduplex and protein truncation analysis of the BRCA1 185delAG mutation. Hum. Genet. (1996)98:310-312.

59. PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification.

60. Ed. Erlich H.A. Stocktons New York and MCMilan London (1989) P. 7-16.

61. Peelen T., van Vliet M., Petrij-Bosch A., et al: A high proportion of novel mutations in BRCA1 with strong founder effects among Dutch and Belgian hereditary breast and ovarian cancer families. Am. J. Hum. Genet. (1997) 60:1041-1049.

62. Petrij-Bosch A., Peelen T., van Vliet M., et. al. BRCA1 genomic deletions are major founder mutations in Dutch breast cancer patients. Nat. Genet. (1997) 17:341-345.

63. Perrin-Vidoz L., Sinilnikova O.M., Stoppa-Lyonnet D., Lenoir G.M., Mazoyer S. The nonsense-mediated mRNA decay pathway triggers degradation of most BRCA1 mRNAs bearing premature termination codons. Human Mol. Genet. (2002) Vol. 11, 23:2805-2814.

64. Phelan C.M., Kwan E., Jack E., Li S., Morgan S., Aube J., Hanna D., Narod S.A. A low frequency of non-founder BRCA1 mutations in Ashkenazi Jewish breast-ovarian cancer families. Human Mutation (2002) 20(5):352-357.

65. Pohlreich P., Stribrna J., Kleibl Z., Zikan M., Kalbacova R., Petruzelka L., Konopasek B. Mutations of the BRCA1 gene in hereditary breast and ovarian cancer in the Czech Republic. Med. Princ. Pract. (2003) 12(l):23-9.

66. Roa B.B., Boyd A.A., Volcik K., Richards C.S. Ashkenazi Jewish population frequencies for common mutation in BRCA1 and BRCA2. Nature Genet. (1996) 14:185-187.

67. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating ingibitors. PNAS{\911) 74:5463-5467.

68. Scully R., Chen J.J., Ochs R.L., Keegan K., Hoekstra M., Feunteun J., Livingston D.M. Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are initiated by DNA damage. Cell (1997(a)) 90:425-435.

69. Scully R., Anderson S.F., Chao D.M., Wei W., Ye L., Young R.A., Livingston D.M., Parvin J.D. BRCA1 is a component of the RNA polymerase II holoenzyme. Proc. Nat. Acad. Sci. (1997(6)) 94: 5605-5610.

70. Scully R., Chen J.J., Plug A., Xiao Y.H., Weaver D., Feunteun J., Ashley T.,Livingston D.M. Assosiation of BRCA1 with Rad51 in mitotic and meiotic cells. Cell (1997(c)) 88:265:275.

71. Seen. D., Wu. Y., Chillar R., Vadgama J.V. Missense alterations of BRCA1 gene detected in diverse cancer patients. Anticancer Res. (2000) 20(2B): 1129-32.

72. Smith T.M., Lee M.K., Szabo C.I., Jerome N., McEuen M., Taylor M., Hood L., King M.C. Complete genomic sequence and analysis of 117 kb of human DNA containing the gene BRCA1. Genome Res. (1996) 6(11):1029-49.

73. Tereshenko I.V., Basham V.M., Ponder B.A.J., Pharoah P.D.P. BRCA1 and BRCA2 mutations in russian familial breast cancer. Human Mutation:Mutation in Brief #479 (2002) Online.

74. Thomas J.E., Smith M., Tonkinson J.L., Rubinfeld B., Polakis P. Induction of phosphorylation on BRCA1 during the cell cycle and after DNA damage. Cell Growth Differ. (1997) 8:801-809.

75. Thompson M.E., Jensen R.A., Obermiller P.S., Page D.L., Holt J.T. Decreased expression of BRCA1 accelerates growth and is often present during sporadic breast cancer progression. Nature Genet. (1995) 9:444-450.

76. Venkitaraman A.R. Cancer susceptibility and the functions of BRCA1 and BRCA2. Cell (2002) 108:171-182.

77. Wang Q., Zhang H., Kajino K., Greene M.I. BRCA1 binds c-Myc and inhibits its transcriptional and transforming activity in cells. Oncogene (1998) 17:1939-1948.

78. Welch P.L., Owens K.N., King M.-C. Insights into the functions of BRCA1 and BRCA2. TIG (2000) 16(2).

79. White M.B., Carvalho M., Derse D. et. al. Detecting single base substitutions as heteroduplex polymorphisms. Genomics (1992) Vol. 12, p. 301306.

80. Wong A.K., Ormonde P.A., Pero R., Chen Y., Lian L., Salada G., Berry S., Lawrence Q., Dayananth P., Ha P., Tavtigian S.V., Teng D.H., Bartel P.L. Characterization of a carboxy-terminal BRCA1 interacting protein. Oncogene (1998) 17:2279-2285.

81. A., Stratton M.R. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. Nature (1995) 378:789-792.

82. Wu L.C., Wang Z.W., Tsan J.T., Spillman M.A., Phung A., Xu X.L., Yang M.C., Hwang L.Y., Bowcock A.M., Baer R. Identification of a RING protein that can interact in vivo with BRCA1 gene product. Nat. Genet. (1996) 14:430440.

83. Xu C.-F., Brown M.A., Chambers J.A., Griffiths B., Nicolai H., Solomon E. Distinct transcription start sites generate two forms of BRCA1 mRNA. Hum. Mol. Genet. (1995)4:2259-2264.

84. Yossepowitch O., Olvera N., Satagopan J.M., Huang H., Jhanwar S., Rapaport B., Boyd J., Offit K. BRCA1 and BRCA2 germline mutations in lymphoma patients. Leuk Lymphoma (2003) 44(1): 127-31.

85. Yu X., Wu L.C., Bowcock A.M., Aronheim A., Baer R. The C-terminal (BRCT) domains of BRCA1 interact in vivo with CtIP, a protein implicated in the CtBP pathway of transcriptional repression. J. Biol. Chem. (1998) 273:25388-25392.

86. Zhang H., Somasundaram K., Peng Y., Tian H., Bi D., Weber B.L., Eldiery W.S. BRCA1 physically associates with p53 and stimulates its transcriptional activity. Oncogene {1998) 16:1713-1721.

87. Zheng L., Annab L.A., Afshari C.A., Lee W.-H., Boyer T.G. BRCA1 mediates ligand-independent transcriptional repression of the estrogen receptor. PNAS (2001) 98(17):9587-9592.

88. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика, (в Зх томах) (1988) Москва, Мир т.З.

89. Аксель Е.М., Двойрин В.В. Статистика злокачественных новообразований: заболеваемость, смертность, тенденции, социально-экономический ущерб, продолжительность жизни. Москва (1992).

90. Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности». (Введение в предиктивную медицину). (2000) СПб:Интермедика.

91. Баранова A.B., Янковский Н.К. Гены супрессоры опухолевого Роста. Молекулярная Биология (1998) т. 32, № 2. с. 206-218

92. Глотов Н.В., Животовский JI.A., Хованов Н.В., Хромов-Борисов H.H. Биометрия. (1982) Ленинград, Ленинградский университет.

93. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. Санкт-Петербург: Специальная литература (1997) 286 с.

94. Калинин B.JI. Транскрипция и регуляция экспрессии генов. СПб: Изд-во СПбГТУ (2001) 247с.

95. Льюин Б. Гены. Москва: Мир (1987) 647 с.

96. Мандельштам М.Ю., Голубков В.И., Ламбер Е.П., Шапиро И.М., Брежнева Т.В., Семиглазов В.Ф., Липовецкий Б.М., Хансон К.П., Гайцхоки

97. B.C. Поиск часто встречающихся мутаций в генах предрасположенности к раку молочной железы. Генетика (2001) 37(12): 1681-1686.

98. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир (1984) 480 с.

99. Остерман JI. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. Москва:Наука (1981) с. 131-135.

100. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. СПб: Изд-во СПбГГУ (1999) 522 с.

101. Скрябин О.Н., Роман Л.Д., Богородский Ю.П. Современные тенденции хирургического лечения больных раком молочной железы. СПб: Журнал акушерства и женских болезней (2000) т. XLIX, вып. 1.

102. Трапезников Н. Н., Аксель Е. М. Заболеваемость злокачественными новообразованиями и смертность от них населения стран СНГ в 1996 г. М. ОНЦ РАМН (1997).

103. Тюрин Ю.Н., Макаров A.A. Статистический анализ данных на компьютере. Под редакцией В.Э. Фигурнова. (1998) Москва, Инфра М.

104. Хайленко В.А. Ранняя диагностика рака молочной железы. VI ежегодная Российская Онкологическая конференция (2002).