Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетических факторов риска развития рака яичников

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетических факторов риска развития рака яичников"

На правах рукописи

ПРОКОФЬЕВА ДАРЬЯ СИМОНОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ РИСКА РАЗВИТИЯ РАКА ЯИЧНИКОВ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2013

Ш ¿013

00506Т«*" ^

005061198

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека

Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель: Хуснутдинова Эльза Камилевна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Викторова Татьяна Викторовна

доктор медицинских наук, профессор, Башкирский государственный медицинский университет, зав. кафедрой биологии.

Александр Васильевич Карпухин доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение, Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, руководитель лаборатории молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний

Ведущая организация: ГБОУ ВПО российский национальный

исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова. Зав. кафедрой общей и медицинской генетики МБФ Ситников Владимир Федорович

Защита диссертации состоится « §0» июня 2013 г. в « цО » часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, Пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, Пр. Октября, 71 и на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: vak.ed.gov.ru, ibg.anrb.ru >

e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан «_» мая 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н

С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Во всем мире проблема заболеваемости и смертности, связанная с онкологическими заболеваниями, на протяжении многих лет занимает лидирующие позиции и является актуальной. Ежегодно от рака умирают более 4 млн. человек во всем мире (Pertmuth-Wey et al., 2009). В России за последние два десятилетия отмечается неуклонный рост показателей заболеваемости злокачественными новообразованиями, а также тенденция к "омоложению" рака.

Рак яичников (РЯ) занимает первое место по смертности среди гинекологических раков, поскольку часто заболевание диагностируется на поздних стадиях развития (III или IV). В России ежегодно регистрируют более 12000 случаев заболевания раком яичников (Чиссов с соавт., 2011). Высокий уровень заболеваемости наблюдается также в Республике Башкортостан (РБ). Ежегодно выявляют более 700 случаев рака яичников, при этом, наблюдается высокий уровень смертности от данного заболевания, около 400 человек в год (Ручкин с соавт., 2011; Кудряшова с соавт., 2012).

На сегодняшний день не вызывает сомнения ведущая роль генетических факторов в развитии рака яичников. Высокий риск развития заболевания в первую очередь связан с нарушениями в генах BRCA1 и BRCA2 (Antoniou et al., 2005; Janavicius, 2010). Продукты этих генов вовлечены в общий сигнальный путь ответа клетки на повреждения ДНК, который включает в себя множество участников: BRCA1, BRCA2, СНЕК2, NBN, ATM, MDC1, PALB2, RAD51D, ТР53, MRE11 и другие (Petrini et al., 2003). Нарушения в генах, которые являются компонентами процессов передачи сигнала о повреждении ДНК, регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза, вовлечены в развитие опухолей различной локализации, в том числе РЯ (O'Donovan et al., 2010).

Эпидемиологические исследования указывают на то, что семейная история заболевания, гормональный статус, возраст, бесплодие, образ жизни, вредные привычки играют важную роль в развитии РЯ (Permuth-Wey et al., 2009).

Рак яичников относят к гормонозависимым опухолям и нарушения метаболизма эстрогенов являются одним из факторов канцерогенеза. Эстрогены могут напрямую или опосредованно влиять на образование опухоли. Под воздействием эстрогенов могут возникать спонтанные ошибки репликации ДНК. Продукты метаболизма эстрогенов содержат активные формы кислорода и могут участвовать в повреждении ДНК. Также эстрогены способствуют пролиферации

клеток с возникшей мутацией (Заридзе, 2004). Генетические нарушения в генах метаболизма эстрогенов могут приводить к изменению активности ферментов, что также может способствовать развитию гормонозависимых опухолей.

Для всестороннего и комплексного изучения рака яичников эпидемиологами, клиницистами, генетиками создан международный консорциум для проведения масштабных исследований, в том числе и полногеномного анализа ассоциаций (GWAS), который направлен на поиск новых генов, вовлеченных в патогенез заболевания (Song Н. et al., 2009). В результате GWAS были обнаружены новые гены-кандидаты: BNC2, MERIT40, HOXD1, TiPARP, МУС, SKAP1 и TERT, ассоциированные с раком яичников (Goode et al., 2008; Song et al., 2009; Goode et al., 2010, Bolton et al., 2010, Beesley et al., 2011, Bolton et al., 2012; Pbaroah et al., 2013).

Изучение генетических факторов рака яичников проводится и в России, которое, главным образом, сконцентрировано в Москве и Санкт-Петербурге (Хансон с соавт., 2000; Suspitsin et al., 2009; Любченко с соавт., 2010). В Республике Башкортостан существует значительное своеобразие генофонда населения, формирование которого имеет длительную и сложную историю, что должно отражаться на структуре заболеваемости онкопатологиями, в том числе и рака яичников.

На основании всего вышеизложенного нами были сформулированы цель и задачи исследования.

Цель работы: молекулярно-генетическое изучение рака яичников в Республике Башкортостан.

Задачи исследования:

1. Провести скрининг мутаций c.5266dupC, C.181T>G и c.4034delA в гене BRCA1, c.5946delT в гене BRCA2, CHEK2dele9,10(5kb), c.444+lG>A, c.llOOdelC и с.470Т>С в гене СНЕК2, c.5932G>T в гене ATM, c.657del5 в гене NBN, инсерции c.3855insl23 в гене MDC1 у больных РЯ.

2. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене PALB2 у больных раком яичников.

3. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене RAD51D у больных раком яичников с семейной формой заболевания.

4. Изучить динамику репарации ДНК от двунитевых разрывов после воздействия радиации в клетках (LCL), гомозиготных по инсерции c.3855insl23 в гене MDC1.

5. Провести анализ ассоциации 8 однонуклеотидных полиморфных вариантов «3814113 в регионе 9р22.2, «8170 в гене МЕШТ40, «2072590 в регионе 2цЗ 1, та2665390 в гене TiP.UU>, «10088218 в регионе 8с]24, «9303542 в гене ЯКЛР!, «2736108 и «2736109 в гене ТЕНТ с риском развития рака яичников.

6. Провести анализ ассоциации 5 полиморфных локусов «762551, «2740574, «1056836, «4680 и «700519 в генах метаболизма эстрогенов СУР1А2, СУР3.44, СУР1ВЕ СОМТ и СУР¡9, соответственно, с риском развития рака яичников.

Научная новизна исследования. Проведено молекулярно-генетическое изучение рака яичников в Республике Башкортостан на репрезентативных выборках больных РЯ (п=243) и контрольной группы (п=374). С высокой частотой обнаружена мутация с.5266<1ирС в гене ВЯСА1 (5,3%). У больных РЯ впервые выявлена мутация р.Ш45\У в гене СНЕК2 с частотой 0,8% у женщин русского и татарского происхождения. Впервые обнаружены мутация с.172_175<1е1ТГСТ в гене РА1.В2 у больной РЯ (0,4%) русской этнической принадлежности и новый полиморфный вариант с.26Т>А (р.Ь9Ь).

Впервые дана оценка ассоциации полиморфных вариантов «3814113 в регионе 9р22.2, «8170 в гене МЕШ40, «2072590 в регионе 2Ч31, «2665390 в гене ПРАЯР, «10088218 в регионе 8я24, «9303542 в гене 5КАР!, «2736108 и «2736109 в гене ТЕНТ с раком яичников при анализе больных из РБ. Обнаружена ассоциация полиморфного локуса «2072590, расположенного на хромосоме 2ц31, с РЯ в общей выборке больных ((Ж=1.5, 95% С1 1.0-2.1, р=0.045). Выявлена ассоциация полиморфного варианта «8170 в гене МЕШТ40 с риском развития РЯ у русских (ОК= 0.5; 95% С1 0.3-0.9, р=0.03).

Проведен анализ ассоциации 5 полиморфных вариантов генов системы метаболизма эстрогенов п762551/СГР1А2, «2740574/СТР1-Н «105683/07'/В/, «4680/СШ/Г и г.у70()519/ОТ/9 с РЯ у женщин из РБ. Показано, что данные полиморфные варианты не являются маркерами риска развития рака яичников.

Научно-практическая значимость работы. Данные, полученные в результате нашего исследования, расширяют знания о генетических основах предрасположенности к развитию рака яичников. Результаты диссертационной работы востребованы при медико-генетическом консультировании в Республике Башкортостан и при проведении ДНК - тестирования.

Материалы диссертации могут быть включены в курс лекций биологических факультетов университетов, медицинских ВУЗов, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на Всероссийской конференции, посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям (Уфа, 2009); VI съезде общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); II Всероссийской научно-практической конференции "Медико-биологические аспекты мультифакториальных патологий" (Курск, 2011); Международной конференции по генетике человека (Amsterdam, 2011); II Всероссийской школе молодых ученых уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2011); V Всероссийской конференции с международным участием "Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской школе-конференции молодых ученых: "Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов" (Уфа, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из которых 6 статей в иностранных журналах и 2 в российских изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, главы результатов исследований и их обсуждений, выводов и перечня цитируемой литературы, состоящего из 297 источников (12 отечественных и 285 зарубежных). Рукопись содержит 36 таблиц и 60 рисунков.

Благодарность. Автор данной работы выражают благодарность доктору биологических наук, профессору Эльзе Камилевне Хуснутдиновой, доктору естественных наук Т. Doerk и доктору естественных наук Богдановой Н.В.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования. Работа выполнена на образцах ДНК, выделенных из крови 243 больных с диагнозом «рак яичников». Материал собран в отделении гинекологии Клинического онкологического диспансера Министерства Здравоохранения РБ г. Уфы и онкологического отделения Городской клинической

больницы № 1 (п=87) г. Стерлитамака, за период 2007 -2012 гг. Забор крови осуществлялся на базе вышеуказанных лечебных учреждений после осмотра исследуемых групп. Данные о каждой пациентке со злокачественным новообразованием яичников, собранные путем опроса, объективного и физикальных методов обследования, занесены в специально разработанную нами формализованную карту, на основании которой создана компьютерная база данных.

Средний возраст манифестации заболевания у женщин с РЯ составляет 50 лет (17 - 76 лет). По этническому составу группа больных РЯ не однородна: русские - 98 (52%), татары - 51 (27%), украинцы - 13 (7%), башкиры - 7 (4%), чуваши - 6 (3%), метисы - 10 (5%), к оставшимся 2% относятся представители других этнических групп (Рис. 1). Среди 243 больных РЯ у 20 женщин отмечены случаи заболевания РЯ и/или РМЖ в семье. Репродуктивная функция на момент манифестации заболевания сохранена у 49% пациенток, в состоянии менопаузы - 51% больных. Поражение обоих яичников выявлено у 62% женщин с РЯ. В выборке больных РЯ, в основном, преобладают серозные опухоли.

. .. .... ;ь/ Метисы 5% уваши 3%

Вашкнры 4%

Чуваши 3% .

/ ^ ^ нац. 2%

V

Украинцы 7%

Русские 52%

Татары 27%

Рис. 1. Этнический состав больных РЯ (%)

Контрольную выборку составили 374 женщины без онкологической патологии, проживающие в РБ. Но этническому составу контрольная группа соответствует группе больных РЯ: русские - 46%, татары - 33%, башкиры - 8%, чуваши -6 %, украинцы- 2%, метисы - 2%, к оставшимся 3% относятся представители других этнических групп. Средний возраст женщин из контрольной группы составил 41 год (18-69 лет).

Для сравнительного анализа на отдельных этапах выполнения работы были использованы образцы ДНК 977 больных раком молочной железы (РМЖ). Средний возраст пациенток с РМЖ - 52 года.

Все участники исследования дали информированное согласие на проведение молекулярно-геиетических исследований. Работа одобрена биоэтическим комитетом ИБГ УНЦ РАН.

В работе были использованы лимфобластоидные клеточные линии: L325 (клеточная линия здорового донора); L493 (клеточная линия, гомозиготная по инсерции c.3855insl23 в гене MDC1); L226 (клеточная линия, дефицитная по NBN); L56 (клеточная линия, дефицитная по ATM).

Методы исследования. Выделение ДНК из периферической крови проводили методом последовательной фенолыю-хлороформной экстракции по Мэтью (Mathew, 1984). В работе применялись следующие методы, полимеразная цепная реакция (ПЦР); анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ); анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM) на Rotor-Gene 6000 или CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System с использованием флуоресцентного красителя Eva Green; дискриминация аллелей TaqMan (Applied Biosystems); прямое секвенирование на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100 согласно протоколу фирмы производителя; Вестерн-блот анализ; иммуно-цитохимический анализ.

Математическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ: MS Office Excel 2003 (Microsoft), STATISTICA v.6.0. (StatSoft), BIOSTAT (Гланц, 1999); попарное сравнение частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля - с помощью критерия х2 (р) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Иэйтса на непрерывность; анализ силы ассоциаций - с помощью значений показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR) (Schlesselman et al., 1982); анализ межгенных взаимодействий - с помощью программ MDR (Richie et al., 2001) и GMDR (Lou et al., 2007; Chen et al., 2011).

ДИЗАИН ИССЛЕДОВАНИЯ

Больные РЯ/контроль

Скрининг мутаций с.5266с1ирС, с.4034(1е1А, с.181Т>0 в гене ВЯСА1; с.5946с!е1Т в гене ВНСЛ2; с1еІе9,10(5кЬ), С.444+10А, с.ПООсІеІС и полиморфного варианта с.470Т>С в гене СНЕК2; с.657(1е15 в гене с.5932С>Т в гене АТМ Методы:

- аллель-специфическая ПЦР

- аллель-специфическая дуплексная ПЦР

- ПДРФ анализ

- дискриминация аллелей ТадМап.

Поиск изменений

нуклеотидной

последовательности

в генах РАЬВ2 и

ЯА05Ю

Методы:

-НІШ

- секвенирование.

Ассоциативные исследования

Определение

функциональной

значимости

инсерции

С.3855ІП8С в гене

МИСІ

Методы:

- Вестерн-блот;

- иммуно-цитохимический анализ.

По данным С\¥А8:

- гі38141 13/9р22.2;

- гі8170/19р13.11;

- /-л'2072590/2с)31;

- «2665390/3я25;

- га,10088218/8ц24; -гі9303542/17Я21;

- га2736108/ ТЕНТ:

- ^2736109/77^7:

Методы: дискриминация аллелей ТадМап.

Гены метаболизма эстрогенов:

- га76255\ICYP1A2;

- ¿-2740574/СУР ЗА 4;

- ГІІ05683/СКР/В7;

- г?4680/СОМГ;

- гл700519ІСУР19. Методы: ПДРФ анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Скрининг мутаций в генах Ш(СА1,11НСА2, СНЕК2,АТМ, NBNу больных РЯ.

ВЯСА1 - ген, ассоциированный с раком молочной железы, 1. В нашем исследовании проведен скрининг мутаций с.5266с!ирС, с.4034с!е1А, с. 181 Т>0 в гене ВЯСА1 у 243 больных РЯ. Мутация с.5266с1ирС выявлена в общей выборке больных с наибольшей частотой, которая составляет 5,3% (13/243), 011: 10.3; 95% С1 2.3-46.0; р=0.0005. Дупликация с.5266с1ирС выявлена у женщин, принадлежащих к разным этническим группам: русские - 5/13, татары - 5/13, башкиры -2/13, украинцы -1/13.

Средний возраст манифестации заболевания у носительниц мутации с.5266с!ирС в гене ВЯСА1 - 51 год. У двух пациенток отмечается семейная история РМЖ и/или РЯ. У 8/13 больных РЯ с дупликацией с.5266с!ирС в гене ВЯСА1 наблюдается поражение обоих яичников. 4 пациентки находились в менопаузе в момент постановки диагноза.

Известно, что мутация с.5266с1ирС в гене ВИСА! широко распространена в разных популяциях мира, но максимальной частоты достигает у больных РЯ в Восточной Европе (Польша - 7.7%, Латвия - 4,8%, Чешская Республика - 8%, Белоруссия - 12,9%) (Рис. 2).

РБ

Белоруссия Чехия Латвия Польша Венгрия Скандинавия

1.1' J 0,3%

Рис. 2. Частота мутации c.5266dupC в гене BRCA1 у больных раком яичников в европейских странах (Van der Looij et al., 2000; Menkiszak et al., 2003; Zikan et al., 2005; Ferla et al., 2007; Bogdanova et al., 2010; Plakhins et al., 2011)

Мутация c,181T>G в гене BRCA1 выявлена в нашей выборке больных раком яичников с частотой 1,2% (3/243). Средний возраст манифестации заболевания у женщин с данной мутацией 47 лет. У одной пациентки отмечается заболевание РМЖ в семье (I степень родства). По этническому составу женщины с мутацией c,181T>G разного происхождения: татары - 2, русские - 1. Согласно литературным данным, мутация c,181T>G в гене BRCA1 также встречается у больных РЯ из Белоруссии -1,5% (Bogdanova et al., 2010), Чешской Республики - 9.8% (Machackova et al., 2008) и Польши - 3,6% (Menkiszak et al., 2003).

Среди больных раком яичников из Республики Башкортостан число носительниц мутаций c.5266dupC и c,181T>G в гене BRCA1 выше в группе пациенток с семейной формой заболевания, чем в группе женщин со спорадическим РЯ (15% (3/20) и 6% (13/223), соответственно).

Делеция c.4034delA в гене BRCA1 не обнаружена среди больных РЯ и здоровых доноров из нашего региона.

СНЕК2 - ген киназы сверочных точек 2. В нашей работе проведен скрининг мутаций CHEK2dele9,10(5kb), c.444+lG>A, c.llOOdelC и c.470T>C в гене СНЕК2 у 243 больных РЯ и 368 человек контрольной группы. Мутация CHEK2dele9,10(5kb)

выявлена у 2 (0.8%) женщин русской этнической принадлежности. У обеих пациенток диагноз РЯ был установлен в период постменопаузы. У одной из носительниц этой мутации отмечается поражение обоих яичников.

Мутация сайта сплайсинга с.444+Ю>А в гене СНЕК2 не определена у больных РЯ из РБ, но обнаружена в контрольной выборке с частотой 0,5%. Мутация с. 1 lOOdelC не выявлена ни у больных РЯ, ни у здоровых индивидов.

В результате секвенирования 2 и 3 экзонов гена СНЕК2 в нашей выборке больных РЯ вьивлено 2 (0,8%) женщины с мутацией p.R145W. Согласно данным литературы, мутантная форма p.R145W в FHA домене кипазы СНЕК2 не фосфорилируегся через ATM и не активируется под действием ионизирующего облучения, что было показано в работе Wu et al. (Wu et al., 2001).

Известно, что мутации в гене СНЕК2 ассоциированы с риском развития РМЖ (Bogdanova et al., 2005; Gorski et al., 2005; Cybulski et al., 2007), результаты исследований у больных РЯ не многочисленны и противоречивы. В нашей работе показано, что нарушения в гене СНЕК2 не вносят значительного вклада в формирование генетической предрасположенности к РЯ, частота двух мутаций CHEK2dele9,10(5kb) и p.R145W в выборке больных РЯ составляет 1,6%.

ATM (ген атаксии телеангиэктазии), NBN (ген нибрина), BRCA2 (ген, ассоциированный с раком молочной железы, 2). У больных раком яичников и в группе контроля из РБ мутации c.5946delT в гене BRCA2, c.5932G>T в гене ATM и c.657del5 в гене NBN не обнаружены.

Анализ кодирующего региона гена PALB2 (партнер и локализатор BRCA2) у больных раком яичников.

В 2006 году был открыт новый участник комплекса белков, вовлеченных в репарацию повреждений ДНК, PALB2. Протеин PALB2 необходим для локализации BRCA2 в участках повреждения ДНК и взаимодействия белков BRCA1 и BRCA2 (Xia et al, 2007).

В нашей работе проведен поиск изменений нуклеотидной последовательности кодирующей части гена PALB2 у 243 больных РЯ. Выявлены мутация c.l72_175delTTGT (Рис. 3) и 9 полиморфных вариантов, один из которых обнаружен впервые (Таблица 1).

Мутация c,172_175delTTGT определена у одной женщины русского этнического происхождения, что составляет 0,4%. В результате делеции четырех нуклеотидов, расположенной в 3 экзоне гена PALB2, происходит сдвиг рамки

считывания и формирование преждевременного стоп-кодона, что приводит к синтезу укороченного белка, неспособного связывать протеины ВЯСА1 и ВЯСА2 и определять положение белка ВЯСА2 в ядре. У женщины с данной мутацией диагностирована серозная карцинома с высокой степенью злокачественности и с поражением обоих яичников в возрасте 46 лет. Ранее у этой пациентки была диагностирована меланома кожи. Согласно литературным данным, деления с. 168_175с1е14 (с. 172 175(1е1ТГСТ) в гене РАЬВ2 также обнаружена у больной РМЖ, проживающей в Ирландии (Сазайе! е! а!.. 2011).

Рис. 3. а, б. Анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (НИМ): а) нормированный график кривых Н1Ш образцов без мутации и с мутацией с. 172 175(1е1ТТСТ; б) кривые плавления образцов в норме и с делецией с.172_175с1еПТСТ; в) фрагмент нуклеотидной последовательности гена РА1В2 с мутацией с. 172_175<Зе1ТТОТ

Дополнительно, нами был проведен поиск выявленной делении в группе из 977 больных РМЖ из РБ и обнаружены три (0,3%) носительницы мутации с. 172 175ёе1ТТОТ в гене РА1В2. У двух пациенток с РМЖ диагноз был поставлен в возрасте до 50 лет, у одной из них отмечается семейная история заболевания. Все женщины с выявленной мутацией были русской этнической принадлежности. Возможно, что с.172_175ёе1ТТСТ является специфичной мутацией для славянских популяций.

Таблица 1.

Изменения, выявленные в гене РАЬВ2, у больных раком яичников из Республики

Башкортостан.

Экзон Изменения на нуклеотидном уровне Изменения на аминокислотном уровне Число пациентов с изменениями (п) Частота, % Ссылка

5'-іта с.-470>А - И 4,3 «8053188

1 с.26Т>А р.Ь9Е 1 0.4 данное исследование

3 і П2 Г'чкІІІ р ! ї | 0,4 ( .ь.ккі сі ,)1.

4 с.212-58А>С - 4 1,6 «80291632

4 с.1010Т>С р.1,3378 1 0,4 „45494092

4 с.1676А>С р.д559Я 51 20 «152451

5 с.2014С>0 р.Е672(3 18 7,1 «45532440

8 с.2794С>А р.У932М 2 0,8 «45624036

9 с.29930>А Р.С998Е 9 3,5 «45551636

12 с.3300Т>С р.ТПООТ 14 5,5 «45516100

Таким образом, результаты нашей работы говорят в пользу того, что ген РА£В2 ассоциирован с раком яичников, но мутации в этом гене встречаются с низкой частотой. Спектр мутаций данного гена ограничивается одним вариантом, который также выявлен у больных РМЖ славянского происхождения.

Анализ кодирующего региона гена НА05Ю (КЛГ)51 гомолог I) (Б. сеге\ч$1ае)) у больных раком яичников с семейной историей рака яичников и/или рака молочной железы

Известно, что мутации в гене Я4В5Ю ассоциированы с высоким риском развития наследственного РЯ (Ьоуеёау е1 а1.. 2011). В ходе нашей работы проведено прямое секвенирование 10 экзонов гена ЯА05Ю у 15 больных раком яичников. Выборка сформирована с учетом семейной истории заболеваний РЯ и/или РМЖ, у которых не обнаружено мутаций в генах ВЛСА1 и ВЯСА2. В результате исследования у двух пациенток выявлено два полиморфных варианта «9901455 и «4796033 (Рис. 4). Мутаций в гене &41ШД приводящих к потере функции белка, не обнаружено.

вариант w990I455: б) полиморфный вариант га4796033

Изучение особенностей репарации ДНК после ионизирующего облучения в лимфобластоидных клетках с инсерцией c.3855ins!23 в гомозиготном состоянии в гене MDC1 (медиатор сверочных точек повреждений ДНК 1).

Ген MDC1 рассматривается в качестве гена-кандидата при изучении онкологических заболеваний. Белок MDC1 является важным модулятором в процессе передачи сигнала о повреждении ДНК. Взаимодействие MDC1 с белком ATM способствует пролонгированной локализации последнего в местах двунитевых разрывов ДНК и фосфорилированию отдаленных молекул гистонов ШАХ, что, в свою очередь, содействует распространению и усилению первоначального сигнала о повреждении ДНК (Lou et al., 2006). Протеин MDC1 действует не только как сенсор о повреждении хроматина (взаимодействуя с у-Н2АХ), но и как сенсор для активации ATM (So et al., 2009).

В результате совместных исследований с коллегами из Медицинской школы Ганновера (Германия) при анализе гена MDCX была выявлена ранее не описанная в литературе инсерция c.3855insl23. Это изменение приводит к удлинению белка на 41 аминокислоту. В выборке РЯ инсерция определена у 12/243 (5%) женщин. Дополнительно данный локус был изучен в выборке больных РМЖ, где были обнаружены две гомозиготные носительницы c.3855insl23 в гене MDC1. Для оценки функциональной роли инсерции был проведен ряд экспериментов.

От пациентки, являющейся гомозиготой по инсерции c.3855insl23 в гене MDC1, была установлена лимфобластоидная клеточная линия с помощью иммортализации периферических В-лимфоцитов крови вирусом Эпштейна-Барра (EBV) - L493. В работе также были использованы клеточные линии лимфобластов от здорового донора L325, а также, дефицитная по NBN - L226 и дефицитная по ATM -L56 (Медицинская школа Ганновера, Германия).

На первом этапе проведен Вестерн-блот для анализа уровня белков SMC 1 (Ser-969), КАР1 (Ser-824), СНЕК2 (Ser-19) в облученных (6 Гр) и не облученных клетках. В качестве количественного контроля был использован p-actin (Рис. 5).

Анализируемые протеины являются основными эффекторами MDC1. Белок SMC1 (Structural maintenance of chromosomes 1) выполняет важную роль в процессах сцепления сестринских хроматид, конденсации хромосом, рекомбинации и репарации ДНК. В ответ на повреждение ДНК MDC1 опосредованно регулирует активацию протеина SMC1 (Stewart et al., 2003). Белок MDC1 также регулирует фосфорилирование фактора конденсации хроматина КАР1 (Kruppel-associated Box (KRAB)-associated protein 1) (Noon et al., 2009), который в ответ на повреждение ДНК фосфорилируется белком ATM в позиции Ser-824, взаимодействует с конденсированным хроматином и вызывает релаксацию нуклеосом. В отсутствие фосфорилированного КАР1 происходит задержка репарации гетерохроматина (Yuan et al., 2009). В ответ на ионизирующее излучение белок MDC1 через FHA домен связывается с киназой СНЕК2 и способствует фосфорилированию протеина р53 (Lou et al., 2003). Белок СНЕК2 также необходим для деградации фосфатазы Cdc25A, препятствуя, тем самым, активации циклин-зависимой киназы Cdk2 и инициации репликации ДНК (Falck et al., 2002).

В результате проведенного анализа не было обнаружено различий в количестве белков SMC1, КАР1, СНЕК2 между клетками L325 и L493, в отличие от клеток, дефицитных по ATM или NBN, для которых характерна повышенная чувствительность к ионизирующей радиации.

p. SMC1 (Ser 969)

p. КАРІ

(Ser 824)

p. СНЕК2 (Serl9)

li-actin

£ а

• т •

Ж.

150 kDa

37 kDa

L 325 L 493 L 226 L 56 N ins!23 NBN ATM

Рис. 5. Вестерн-блот анализ фосфорилированных белков SMC1, КАРІ и СНЕК2. L 325 - клеточная линия здорового донора; L 493 - клеточная линия, гомозиготная по инсерции c.3855insl23 в гене МЭСУ; L 226 - клеточная линия, дефицитная по NBN; L 56 - клеточная линия, дефицитная по ATM

На втором этапе для оценки уровня двунитевых разрывов ДНК и эффективности их репарации использовался метод анализа флуоресцентных фокусов

белков репарации ДНК уН2АХ и 53ВР1. Клетки опухолевой линии от больного, гомозиготного по 1УШС1(т8123Ьр), подвергались воздействию ионизирующей радиации бОу.

Известно, что гистон Н2АХ немедленно фосфорилируется в сайтах повреждений ДНК и фосфорилированный Н2АХ (у-Н2АХ) может быть визуализирован с применением специфичных антител. Гистон у-Н2АХ локализуется точно на двунитевых разрывах и служит идеальным маркером для их визуализации. Другим не менее важным маркером двунитевых разрывов ДНК является белок 53ВР1, который формирует дискретные ядерные "фокусы" при действии ионизирующей радиации и колокализуется с Н2АХ и ЭМА-РК. Идентификация этих белков позволяет получить полную информацию о локализации двунитевых разрывов в ядре, их количестве, эффективности и кинетике репарации повреждения.

Уровень фокусов уН2АХ оценивали через 24 часа и 48 часов, в случае 53ВР1 через 1 час, 24 часа и 48 часов после облучения (Рис. 6). Увеличение числа фокусов отмечалось через один час. Поскольку радиационно-индуцированные фокусы белков репарации ДНК - это динамичная структура, и их количество точно отражает количество двунитевых разрывов, в норме через 24 часа должно происходить восстановление поврежденных участков ДНК, уменьшение числа и исчезновение фокусов фосфорилированного гистона уН2АХ и медиаторного белка 53ВР1. Нами были проведены 3 повторности эксперимента.

DAPI

уШАх 53ВР1 Merge

уНЗАх

53ВР1

Merge

Рисунок 6. а) Иммуно-цитохимический анализ фокусов у-Н2АХ и 53ВР1 в клеточной

линии здорового донора (L325); б) в лимфобластоидной клеточной линии, гомозиготной по c.3855insl23 гена MDC1 (L493): UNT - необлученные клетки; 6Gy lh - облученные клетки, 1 час после облучения; 6Gy 24h - облученные клетки, 24 ч. после облучения; 6Gy 48h - облученные клетки, 48 ч. после облучения. DAPI -окраска ядра; у-Н2АХ - окраска гистона у-Н2АХ; 53ВР1 - окраска белка 53ВР1; Merge - все красители вместе

Динамика образования фокусов белка 53ВР1 не различалась между клеточными линиями Ь325 и Ь493. При этом, кинетика формирования фокусов гистона у-Н2АХ в клетках Ь493 отличалась от таковой в клетках Ь325 и была ближе к клеткам Ь56, для которых характерны нарушения в активации точек проверки клеточного цикла и репарации двунитевых разрывов, от пациентки с синдромом Атаксия-Телеангиэктазия (Рис. 7). Количество фокусов у-Н2АХ через 24 и 48 часов после облучения не достигало исходного уровня, характерного для нормальных клеток без каких-либо нарушений, что указывает на задержку репарации ДНК в клетках гомозиготных по инсерции с.3855тз!23 в гене МЛС1.

13 4 1\д4 13 4 13 4

Т325 1,493 Ь226 Ь56

12 3 4 ЬОЛ4 1234 1234

Ь325 Ь493 Ь226 Ь56

Рис. 7. Количество фокусов у-Н2АХ и 53ВР1: 1 - необлученные клетки; 2— облученные клетки, через 1 час после облучения, с дозой радиации бОу; 3 -облученные клетки, через 24 часа после облучения, с дозой радиации бЄу; 4-облученные клетки, через 48 часов после облучения, с дозой радиации 60у

Таким образом, изучение особенностей репарации ДНК в клетках лимфобластов после воздействия ионизирующего излучения показало, что восстановление поврежденной ДНК в клетках с инсерцией с.3855іпз123 в гене МБСІ происходит не полностью, что может способствовать накоплению мутаций и дальнейшей злокачественной трансформации клеток.

Анализ ассоциаций 8 полиморфных вариантов ге3814113/9р22.2, г.у8170/19р13.11, п2072590/2г|31, «2665390/^25, «10088218/^24, «9303542/17Ч21, «2736108 и «2736109 в гене ТЕЯТ с раком яичников

В качестве другого подхода к изучению генетических факторов, предрасполагающих к развитию рака яичников, мы использовали анализ ассоциаций полиморфных вариантов, оперируя значениями частот аллелей и генотипов при сравнении группы больных и контроля. Выбор исследуемых локусов базировался на

данных полногеномных исследований SNPs (Song et al., 2009; Goode et al.. 2010, Bolton et al., 2010, Beesley et al., 2011).

Нами поведен анализ 8 полиморфных локусов «3814113 в регионе 9р22.2, «8170 в области 19р13.11, «2072590 на хромосоме 2q31, «2665390 в регионе 3q25, «10088218/8q24 на длинном плече хромосомы 8, «9303542 в регионе 1.7q21, «2736108 и «2736109 в гене TERTв выборках больных РЯ и контрольной группе.

В результате нашего исследования установлено, что локус «2072590 в регионе 2q31 ассоциирован с раком яичников в общей выборке больных, OR= 1.5, 95% CI 1.02.1, р=0.045 (Рис. 8). Однако, сравнительный анализ частот аллелей и генотипов между группами больных, и контроля в разных этнических группах достоверных различий не выявил.

Полиморфный вариант «2072590 локализован на второй хромосоме в области, содержащей семейство гомеобоксных генов, необходимых для регуляции процессов эмбриогенеза и органогенеза, в некодирующем регионе между генами HOXD3 и HOXD1. Оба гена вовлечены в процесс опухолеобразования (Okubo et al, 2002, Jacinto et al., 2007).

0% 20% 40% 60% 80% 100%

контроль к больные РЯ

Рис. 8. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта «2072590/2q31 среди больных РЯ и здоровых женщин

У больных раком яичников из РБ выявлена ассоциация полиморфного варианта «8170, локализованного в гене MERIT40 (медиатор взаимодействия и связывания, 40-KD)) , с РЯ у русских, OR=0.5, 95% CI 0.3-0.9, р== 0.03 (Рис. 9).

Известно, что продукт гена MERIT40 способствует пролонгированной локализации протеина BRCA1 в местах двунитевых разрывов (Wang et al., 2009). В работе Bolton et al. при проведении GWAS была показана ассоциация полиморфного варианта «8170 с высоким риском развития эпителиального РЯ (OR= 1.12; 95%, CI 1.07-1.17, р=3.6хЮ~6) (Bolton et al., 2010).

mmm OR= 0.6, 1)= 0.049

mmmm. m ттшш «жшм В шш } тяштш OR= 0.5, J=- 0.03

тттжтттттшшшШ шв

0% 2(1% 40% 60% 80% 100%

контроль ж больные ¡'Я

Рис. 9. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта «8170 в гене MERIT40 у больных РЯ и контрольной группы русской этнической принадлежности

Анализ ассоциации полиморфных локусов «762551 в гене CYP1A2, «2740574 в гене CYP3A4, «] 056836 в генeCYPlBl, «4680 в гене СОМТ и «700519 в гене CYP19 с раком яичников.

В работе изучено 5 полиморфных вариантов генов системы метаболизма эстрогенов /-<>762551 в гене CYP1A2, «2740574 в гене CYP3A4, «105683 в гене CYP1B1, «4680 в гене СОМТ в «700519 в гене CYP19 у больных раком яичников и в контрольной группе. Данные полиморфные локусы влияют на каталитическую активность ферментов, что приводит к изменениям в процессах синтеза и метаболизма эстрогенов, что в свою очередь может способствовать развитию гормонозависимых опухолей (Badawi et al., 2001; Lord et al., 2007; Tao et al., 2007; Onsory et al,, 2008).

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных локусов в генах CYP1A2, CYP3A4, CYP1B1, С.ОМТ и CYP19 не выявил достоверных различий между больными РЯ и контрольной группой, как в целом, так и при разделении по этническим группам. Наши данные не согласуются с результатами исследований других авторов. Например, в одной из работ Mikhailova et al. (2006) была показана ассоциация полиморфного варианта «762551 в гене CYP1A2 с риском развития РЯ (OR:0.50, р= 0.0003). Данное несоответствие можно объяснить как небольшим объемом анализируемых групп, так и их этнической гетерогенностью.

Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к раку яичников

В нашей работе проведено моделирование межгенных взаимодействий исследованных полиморфных локусов: I - [«3814113/9р22.2, «8170/19р13.11, «2072590/2q31, «2665390/3q25, «10088218/8q24, «9303542/17q21, «2736108/2ЖГ и

rs2T$6\09ITERT\ и 2 - [rs76255VCYPlA2, rs274Q574/CYP3A4, rslQ56S3/CYPlBl, ЫбШСОМТ и rv700519/C}779] в отношении риска развития РЯ с помощью программ MDR и GMDR (Ritchie et al., 2001; Lou et al., 2007), которые позволяют выбрать комбинации генных локусов, обладающих наибольшей значимостью в патогенезе РЯ. Однако, в результате данного анализа, не было выявлено статистически значимых моделей межгенных взаимодействий.

ВЫВОДЫ

1. Мутации c.5266dupC и c.181T>G в гене BRCA1 обнаружены у женщин с раком яичников разной этнической принадлежности с частотой 5,3% и 1,2%, соответственно. Идентифицированные мутации встречаются у больных раком яичников с семейной формой заболевания с более высокой частотой (15%), по сравнению со спорадическими случаями (6%). Мутация c.4034delA в гене BRCA1 не выявлена

2. В гене киназы СНЕК2 у женщин с раком яичников русской и татарской этнической принадлежности обнаружены мутации dele9,10(5kb) (0,8%) и p.R145W (0,8%). Мутации c.5946delT в гене BRCA2, c.5932G>T в гене атаксии телеашиоэктазии (ATM) и c.657del5 в гене нибрина (NBN) у пациенток с раком яичников из Республики Башкортостан не выявлены.

3. В гене партнера и локализатора BRCA2 (PALB2) у женщин с раком яичников впервые обнаружены мутация c.l72_175delTTGT с частотой 0,4% и полиморфный вариант с.26Т>А (0,4%).

4. В гене гомолога D S. cerevisiae RAD51 (RAD51D) у больных раком яичников с семейной формой заболевания обнаружены полиморфные варианты r.s9901455 (20%) и «4796033 (13,3%). Мутаций, приводящих к синтезу укороченного белка RAD51D, не выявлено.

5. Инсерция c.3855insl23 в гене медиатора сверочных точек повреждений ДНК 1 (MDCJ) определена у 5% женщин с раком яичников. Установлено, что при воздействии ионизирующей радиации изменяется динамика накопления фосфорилированного гистопа у-Н2АХ в лимфобластоидных клетках, гомозиготных по инсерции c.3855insl23 в гене MDC1, по сравнению с клетками здорового донора, что свидетельствует о задержке репарации ДНК.

6. Выявлена ассоциация полиморфного варианта г.у2072590, расположенного в регионе 2q31, с риском развития рака яичников (OR=1.5, 95% CI 1.0-2.1, р=0.045) и

полиморфного варианта «8170 в гене MERIT40 у русских (OR= 0.5; 95% CI 0.3-0.9, р=0.03).

7. Ассоциации полиморфных вариантов «762551, «2740574, «105683, «4680 и «700519 в генах метаболизма эстрогенов CYP1A2, CYP3A4, CYP1B1, СОМТ и CYP19, соответственно, с риском развития рака яичников не обнаружено.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Prokofyeva, D. Rare occurrence of PALB2 mutations in ovarian cancer patients from the Volga-Ural region / D. Prokofyeva, N. Bogdanova, M. Bermisheva, G. Zinnatullina, P. Hillemanns, E. Khusnutdinova, T. D6rk. // Clinical Genetics. 2012. V. 82 (1):P. 100-101.

2. Prokofyeva, D. Nonsense mutation p.Q548X in BLM, the gene mutated in Bloom's syndrome, is associated with breast cancer in Slavic populations / D. Prokofyeva, N. Bogdanova, N. Dubrowinskaja, M. Bermisheva, Z. Takhirova, N. Antonenkova, N. Turmanov, I. Datsyuk, S. Gantsev, H. Christiansen, Tjoung-Won Park-Simon, P. Hillemanns, E. Khusnutdinova, T. Doerk // Breast Cancer Res Treat. 2013. V. 137(2): P. 533-539.

3. Ghoussaini, M. Genome-wide association analysis identifies three new breast cancer susceptibility loci / M. Ghoussaini, O. Fletcher, K. Michailidou, C. Turnbull, M. Bermisheva, D. Prokofieva, E. Khusnutdinova et al. // Nature Genetics. 2012. V. 44 (3): P. 312-318.

4. Lambrechts, D. Ilql3 is a Susceptibility Locus for Hormone Receptor Positive Breast Cancer / D. Lambrechts, T. Truong, C. Justenhoven, M.K. Humphreys, E. Khusnutdinova, M. Bermisheva, D. Prokofyeva et al. // Human mutation. 2012. V. 33 (7): P. 1123-1132.

5. Figueroa, J. Associations of common variants at lpll.2 and 14q24.1 (RAD51L1) with breast cancer risk and heterogeneity by tumor subtype: Findings from the Breast Cancer Association Consortium / J. Figueroa, M. Garcia-Closas, M. Bermisheva, D. Prokofyeva,

5.H. Gancev, E. Khusnutdinova, (HUBCS) et al. //Hum. Mol. Genet. 2011. V. 20 (23): P. 4693-4706.

6. Milne, R.L. Confirmation of 5pl2 As a Susceptibility Locus for Progesterone-Receptor-Positive, Lower Grade Breast Cancer / R.L. Milne, E.L. Goode, E. Khusnutdinova, M. Bermisheva, D. Prokofyeva, A. Farahtdinova et al. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2011. V. 20(10): P. 2222-2231.

7. Прокофьева, Д.С. Анализ мутаций в генах BRCA1, NBN и СНЕК2 у больных раком яичников в Республике Башкортостан / Д.С. Прокофьева, Ш.Х. Ганцев, М.А. Бермишева, Э.К. Хуснутдинова // Креативная хирургия и онкология. № 4. Стр. 50-52.

8. Хуснутдинова, Э.К. Молекулярно-генетическое изучение рака молочной железы в Республике Башкортостан / Э.К. Хуснутдинова, Ш. Ганцев, М.А. Бермишева, А.Р. Фарахтдинова, В.А. Кононова, Г.Ф. Зиннатуллина Д.С. Прокофьева // Креативная хирургия и онкология. № 4. Стр. 56-58.

9. Прокофьева, Д.С. Роль полиморфных вариантов генов метаболизма эстрогенов в развитии рака яичников / Д.С. Прокофьева, М.А. Бермишева, А.Р. Фарахтдинова, Э.К. Хуснутдинова // Сборник материалов всероссийской школы-конференции молодых ученых "Актуальные проблемы генетики человека, животных, растений и микроорганизмов". 2012. Стр. 135.

10. Прокофьева, Д.С. Анализ мутаций в гене PALB2 у больных раком яичников из Республики Башкортостан / Д.С. Прокофьева, М.А. Бермишева, Н.В. Богданова, Т. Dôrk-Bousset, Э.К. Хуснутдинова // Материалы V Всероссийской конференции с международным участием "Перинатальная диагностика и генетический паспорт -основа профилактической медицины в век нанотехнологий. 2012. Стр. 195.

11. Прокофьева, Д.С. Вклад мутаций в генах BRCA 1, BRCA 1 и РЛ1.В2 в развитие рака яичников у жителей Республики Башкортостан / Д.С. Прокофьева, М.А. Бермишева, В.Ю. Фролова, Г.Ф. Зиннатуллина, А.Р. Фарахтдинова, Н.В. Богданова, T. Doerk-Bousset, Ш. Ганцев, Э.К. Хуснутдинова // Материалы II Всероссийской школы молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. 2011. Стр .101.

12. Prokofyeva, D. Contribution mutations of CHEK2 gene in ovarian cancer development in populations of the Volga-Ural région of Russia / D. Prokofyeva, M. Bermisheva, S. Gancev, V. Frolova, V. Kononova, O. Popov, T. Dôrk-Bousset, E. Khusnutdinova // European Human Genetics Conférence. 2011. P. 227.

13. Прокофьева, Д.С. Роль мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 в развитии рака яичников у жителей Республики Башкортостан / Д.С. Прокофьева, М.А. Бермишева, Ш.Х. Ганцев, В.Ю. Фролова, В.П. Кононова, Э.К. Хуснутдинова // Сборник материалов II Всероссийской научно-практической конференции "Медико-биологические аспекты мультифакториальных патологий". 2011. Стр. 90.

14. Прокофьева, Д.С. Изучение генетических факторов риска развития рака яичников в республике Башкортостан / Д.С. Прокофьева, М.А. Бермишева, Э.К. Хуснутдинова // VI съезд Общества медицинских генетиков 2010. № 6. Стр. 148.

15. Прокофьева, Д.С. Анализ мутаций в гене BRCA1 у больных раком яичников / Д.С. Прокофьева, М.А. Бермишева, Э.К. Хуснутдинова // труды Всероссийской конференции, посвященной 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям. 2009. Стр. 72-75.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

РЯ -рак яичников

РМЖ -рак молочной железы

РБ - Республика Башкортостан

OR -Odds Ratio (соотношение шансов)

CI -Confidence interval (доверительный интервал)

GWAS - полногеномный анализ ассоциаций

BRCA1 - Breast cancer 1 gene (ген, ассоциированный с РМЖ, 1)

BRCA2 - Breast cancer 1 gene (ген, ассоциированный с РМЖ, 2)

СНЕК2 - Checkpoint kinase 2 (ген киназы сверочных точек 2)

А ТМ - Ataxia-telangectasia mutated gene (ген атаксии телеангиэктазии)

NBN - Nibrin (ген нибрина)

MDC1 - Mediator of DNA damage checkpoint protein 1 (медиатор сверочных точек повреждений ДНК 1)

PALB2 - Pertner and localizer of BRCA2 (партнер и локализатор BRCA2)

RAD51D - RAD51, S. Cervisiae, homolog of, D (RAD51 гомолог D (S. cerevisiae))

SNP -однонуклеотидный полиморфный вариант

Подписано в печать 16/05/13. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ргоографическая. Тираж 100 экз. Заказ 932. Гарнитура «Тіте8№\¥ІІотап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4. т/ф: 8(347) 27-27-600,27-29-123

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прокофьева, Дарья Симоновна, Уфа

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Й4?П1А

На правах рукописи %

ПРОКОФЬЕВА ДАРЬЯ СИМОНОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ РИСКА РАЗВИТИЯ РАКА

ЯИЧНИКОВ

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н., проф. Хуснутдинова Э.К.

Уфа-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпидемиология рака яичников 9

1.2. Факторы риска развития рака яичников 12

1.3. Роль генов систем передачи сигнала о повреждении ДНК, регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза в развитии 17 рака яичников

1.4. Роль генов системы метаболизма эстрогенов в развитии рака ^ яичников

1.5. Полногеномный анализ ассоциаций при изучении рака яичников 33 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 40

2.1. Материалы исследования 40

2.2 Молекулярно-генетические методы исследования 45

2.2.1 Выделение ДНК из периферической крови 45

2.2.2 Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 46

2.2.3. Аллель-специфичная ПЦР 46

2.2.4. Аллель-специфичная дуплексная ПЦР 47

2.2.5. Рестрикционный анализ 47

2.2.6. Анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM)

2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 49

2.2.8. Метод дискриминации аллелей TaqMan (Gene Expression Assays) 51

2.2.9. Установление лимфобластоидной клеточной линии 52

2.2.10. Выделение белков из лимфобластоидной клеточной линии 53

2.2.11. Вестерн-блот анализ 54

2.2.12. Иммуноцитохимический анализ 57 2.3. Статистические методы 59 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 6 х

3.1. Анализ мутаций c.5266dupC, c.l81T>G и c.4034delA в гене BRCA1 у больных раком яичников

3.2. Анализ мутации c.5946delT (6174delT) в гене BRCA2 у больных раком яичников и в контрольной группе

3.3. Скрининг мутаций CHEK2dele9,10(5kb), IVS2+1G>A, llOOdelC и полиморфного варианта I157T в гене СНЕК2 в выборке больных раком 73 яичников и в группе контроля

3.4. Анализ мутации c.5932G>T (р.Е1978Х) в гене ATM у больных ^ раком яичников и в контрольной группе

48

61 72

3.5. Анализ мутации c.657del5 в гене NBNy больных раком яичников и

в контрольной группе

3.6. Анализ кодирующего региона гена PALB2 (Partner and localizer of BRCA2) у больных раком яичников

3.7. Анализ кодирующего региона гена RAD51D у больных раком яичников с семейной историей рака яичников и/или рака молочной 95 железы

3.8. Изучение варианта c.3855insl23 в гене MDC1 (Mediator of DNA ^ damage checkpoint 1) у женщин с онкопатологией

3.9. Анализ ассоциаций однонуклеотидных полиморфных вариантов «3814113 / 9р22.2, «8170 / 19р13.11, «2072590 / 2q31, «2665390 / 3q25, « 10088218 / 8q24, «9303542 / 17q21, «2736108 и «2736109 в гене TERT с раком яичников

3.10. Анализ ассоциации полиморфных локусов «762551 в гене

CYP1A2, «2740574 в гене CYP3A4, «1056836 в гене CYP1B1, «4680 в 133 гене СОМТ и «700519 в гене CYP19 с риском развития рака яичников

3.11. Изучение роли межгенных взаимодействий в формировании ^^ предрасположенности к раку яичников

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 151

ВЫВОДЫ 157

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

158

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

РЯ -рак яичников

РМЖ -рак молочной железы

РБ - Республика Башкортостан

OR -OddsRatio (соотношение шансов)

CI -Confidence interval (доверительный интервал)

GWAS - полногеномный анализ ассоциаций

BRCA1 - Breast cancer 1 gene (ген, ассоциированный с РМЖ 1)

BRCA2 - Breast cancer 1 gene (ген, ассоциированный с РМЖ 2)

СНЕК2 - Checkpoint kinase 2, S Pombe, homolog of (ген киназы

сверочных точек 2) ATM - Ataxia-telangectasia mutated gene (ген атаксии

телеангиэктазии) NBN - Nibrin (ген нибрина)

MDC1 - Mediator of DNA damage checkpoint protein 1

(медиаторсверочных точек повреждений ДНК 1) PALB2 - Pertner and localizer of BRCA2 (партнер и локализатор

BRCA2)

RAD51D - RAD51, S. Cervisiae, homolog of, D (RAD51 гомолог D (S. cerevisiae))

SNP - однонуклеотидный полиморфный вариант

Введение

Актуальность проблемы. Во всем мире проблема заболеваемости и смертности, связанная с онкологическими заболеваниями, на протяжении многих лет занимает лидирующие позиции и является актуальной. Ежегодно от рака умирают более 4 млн. человек во всем мире [192]. В России за последние два десятилетия отмечается неуклонный рост показателей заболеваемости злокачественными новообразованиями, а также тенденция к "омоложению" рака.

Рак яичников (РЯ) занимает первое место по смертности среди гинекологических раков, поскольку часто заболевание диагностируется на поздних стадиях развития (III или IV). В России ежегодно регистрируют более 12000 случаев патологии [12]. Высокий уровень заболеваемости наблюдается также в Республике Башкортостан (РБ). Ежегодно выявляют более 700 случаев рака яичников, при этом, наблюдается высокий уровень смертности от данного заболевания, около 400 человек в год [7; 9].

На сегодняшний день не вызывает сомнения ведущая роль генетических факторов в развитии рака яичников. Высокий риск развития заболевания в первую очередь связан с нарушениями в генах BRCA1 и BRCA2 [19; 118]. Продукты этих генов, вовлечены в общий сигнальный путь ответа клетки на повреждения ДНК, который включает в себя множество участников: BRCA1, BRCA2, СНЕК2, NBN, ATM, MDC1, PALB2, RAD51D, ТР53, MRE11 и другие [194]. Нарушения в генах, которые являются компонентами процессов передачи сигнала о повреждении ДНК, регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза, вовлечены в развитие опухолей различной локализации, в том числе РЯ [180].

Эпидемиологические исследования указывают на то, что семейная история заболевания, гормональный статус, возраст, бесплодие, образ жизни, вредные привычки играют важную роль в развитии РЯ [192].

Рак яичников относят к гормонозависимым опухолям и нарушения метаболизма эстрогенов являются одним из факторов канцерогенеза. Эстрогены могут напрямую или опосредованно влиять на образование опухоли. Под

воздействием эстрогенов могут возникать спонтанные ошибки репликации ДНК. Продукты метаболизма эстрогенов содержат активные формы кислорода и могут участвовать в повреждении ДНК. Также эстрогены способствуют пролиферации клеток с возникшей мутацией [5]. Генетические нарушения в генах метаболизма эстрогенов могут приводить к изменению активности ферментов и, как следствие, к развитию гормонозависимых опухолей.

Для всестороннего и комплексного изучения рака яичников эпидемиологами, клиницистами, генетиками создан международный консорциум для проведения масштабных исследований, в том числе и полногеномного анализа ассоциаций (GWAS), который направлен на поиск новых генов, вовлеченных в патогенез заболевания [239]. В результате GWAS были обнаружены новые гены-кандидаты: BNC2, MERIT40, HOXD1, TiPARP, МУС, SKAP1 и TERT, ассоциированные с раком яичников [97; 239; 97; 33; 25; 34].

Изучение генетических факторов риска развития рака яичников проводится и в России, которое, главным образом, сконцентрировано в Москве и Санкт-Петербурге [11; 244]. Важно учитывать, что существует значительное своеобразие генофонда населения Республики Башкортостан, формирование которого имеет длительную и сложную историю, что должно отражаться на структуре заболеваемости онкопатологиями, в том числе и рака яичников.

На основании всего вышеизложенного нами были сформулированы цель и задачи исследования.

Цель работы: молекулярно-генетическое изучение рака яичников в Республике Башкортостан.

Задачи исследования:

1. Провести скрининг мутаций c.5266dupC, c.181T>G и c.4034delA в гене BRCA1, c.5946delT в гене BRCA2, CHEK2dele9,10(5kb), c.444+lG>A, c.llOOdelC и с.470Т>С в гене СНЕК2, c.5932G>T в гене ATM, c.657del5 в гене NBN, инсерции c.3855insl23 в гене MDC1 у больных раком яичников.

2. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене PALB2 у больных раком яичников.

3. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене RAD51D у больных раком яичников с семейной формой заболевания.

4. Изучить динамику репарации ДНК от двунитевых разрывов после воздействия радиации в клетках (LCL) гомозиготных по инсерции c.3855insl23 в гене MDC1.

5. Провести анализ ассоциации 8 однонуклеотидных полиморфных вариантов /луЗ814113 в регионе 9р22.2, п?8170 в гене MERIT40, rs2072590 в регионе 2q31, га2665390 в гене TiPARP, ^10088218 в регионе 8q24, rs9303542 в гене SKAP1, га2736108 и гл2736109 в гене TERTс риском развития рака яичников.

6. Провести анализ ассоциации 5 полиморфных локусов га762551, га2740574, га1056836, га4680 и га700519 в генах метаболизма эстрогенов CYP1A2, CYP3A4, CYP1B1, СОМТ и CYP19, соответственно, с риском развития рака яичников.

Научная новизна исследования. Проведено молекулярно-генетическое изучение рака яичников в Республике Башкортостан на репрезентативных выборках больных РЯ (п=243) и контрольной группы (п=374). С высокой частотой обнаружена мутация c.5266dupC в гене BRCA1 (5,3%). У больных РЯ выявлены мутации dele9,10(5kb) и p.R145W в гене СНЕК2 с частотой 1% у женщин славянского происхождения. Впервые обнаружена мутация c.l72_175delTTGT в гене PALB2 у больной РЯ (0,4%) русского этнического происхождения.

Впервые дана оценка ассоциации полиморфных вариантов га3814113 в регионе 9р22.2, га8170 в гене MERIT40, га2072590 в регионе 2q31, га2665390 в гене TiPARP, ral0088218 в регионе 8q24, га9303542 в гене SKAP1, га2736108 и го2736109 в гене TERT с раком яичников при анализе больных из РБ. Обнаружена ассоциация полиморфного локуса га2072590, расположенного на хромосоме 2q31 с РЯ в общей выборке больных (OR: 1.5; 95% CI 1.0-2.1; р=0.045). Выявлена ассоциация полиморфного варианта га8170 в гене MERIT40 с риском развития РЯ у русских.

Проведен анализ ассоциации 5 полиморфных вариантов генов системы метаболизма эстрогенов rsl62551ICYP1A2, rs21№514ICYP3A4, rs\056S3/CYP1В1, rs46SO/COMT и rsl00519/CYP19 с раком яичников у женщин из РБ. Показано, что

данные полиморфные варианты не являются маркерами риска развития рака яичников.

Научно-практическая значимость работы. Данные, полученные в результате нашего исследования, расширяют знания о генетических основах предрасположенности к развитию рака яичников. Результаты диссертационной работы востребованы при медико-генетическом консультировании в Республике Башкортостан и при проведении ДНК - тестирования.

Материалы диссертации могут быть включены в курс лекций биологических факультетов университетов, медицинских ВУЗов, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Эпидемиология рака яичников

Злокачественные новообразования - вторая по значимости причина смерти во всем мире после сердечно-сосудистой патологии. В России в 2009 году было выявлено 504975 новых случаев заболевания злокачественными патологиями различной локализации. Большую часть онкологических заболеваний женского населения России занимают злокачественные новообразования органов репродуктивной системы (37.5%), при этом на долю опухолей половых органов приходится 17.4% всех злокачественных новообразований женского населения. Ведущее место среди онкологических заболеваний у женщин занимает рак молочной железы (РМЖ) (20.1%). Рак яичников (РЯ) встречается с частотой 4,8% и занимает седьмое место в структуре женского населения России [12]. В структуре смертности женщин России наибольший удельный вес имеют злокачественные новообразования молочной железы (17,4%). Рак яичников занимает 6 место (5,7%). Отмечена тенденция к увеличению смертности от рака яичников в группе женщин моложе 30 лет (4.5%) (рисунки 1 и 2).

Рисунок 1. Динамика заболеваемости раком яичников в России за период 1999-2009 гг [12]

Рисунок 2. Динамика смертности от рака яичников в России за период 19992009 гг [12]

Похожая ситуация складывается в Республике Башкортостан. В 2010 году было выявлено 11162 больных злокачественными новообразованиями различной локализации. За последние 10 лет число больных онкопатологиями возросло на 4.5%. В том числе, заболевших РЯ стало больше на 0.95%. Первое место среди онкологических заболеваний женского населения нашего региона занимает РМЖ (3.44%). На долю опухолей половых органов приходится 2.75% всех злокачественных новообразований женского населения. Рак яичников занимает третье место среди онкологических заболеваний репродуктивной системы и встречается с частотой 0.7%. В структуре смертности женского населения Республики Башкортостан РЯ занимает второе место (0.44%) после РМЖ (1.17%). В последние годы наблюдается тенденция к росту смертности от рака яичников (рисунки 3 и 4).

Рисунок 3. Динамика заболеваемости раком яичников на 100 тыс. населения в Республике Башкортостан за период 2001-2010 гг [9]

Рисунок 4. Динамика смертности от рака яичников на 100 тыс. населения в Республике Башкортостан за период 2001-2010 гг [7]

В мире рак яичников занимает второе место среди гинекологических раков и является самой частой причиной смерти у женского населения [192].

1.2. Факторы риска развития рака яичников

Развитие РЯ определено большим числом факторов [4]. Важное место среди них занимает генетическая предрасположенность к развитию заболевания. Так, у

10-15% пациенток с раком яичников отмечаются случаи заболевания у ближайших родственников [134; 175; 6]. У женщин с первой степенью родства риск развития заболевания возрастает в 3-7 раз, при этом характерно возникновение РЯ в раннем возрасте, особенно, если случаи заболевания встречаются у нескольких родственниц [187].

Большая часть наследственного рака яичников и рака молочной железы связана с нарушениями в высоко-пенентрантных генах-супрессорах опухолевого роста - BRCA1 и BRCA2. Мутации в этих генах приводят к значительному повышению риска развития рака яичников и рака молочной железы в течение жизни. У носительниц мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 риск развития РМЖ составляет 65-80% и 45-80%, соответственно. Риск РЯ увеличивается до 37-62% и

11-23%, соответственно [23]. Однако лишь 10-15 % всех случаев РЯ и 5-10% случаев РМЖ могут быть обусловлены мутациями в этих генах [186; 207]. В патогенез РЯ вовлечены и другие гены с умеренной и низкой пенетрантностью [192].

Во многих исследованиях показано, что в семьях, отягощенных некоторыми наследственными синдромами (синдром Линча, Анимия Фанкони, синдромы ATM и NBS) риск РЯ выше [1; 11]. У членов семей с синдромом Линча, чаще встречались первичные опухоли различной локализации, в том числе, карциномы эндометрия и яичников, желудка, тонкого кишечника и других органов [156]. Согласно литературным данным, мутации в генах репарации неспаренных оснований (mismatch) (hMLHl, hMSH2, hPMSl, hPMS2, hMSH6), ассоциированные с синдромом Линча, ответственны за 2% эпителиального рака яичника и повышают риск РЯ в течение жизни на 12 % [200; 159].

При изучении тяжелого наследственного заболевания Атаксия-Телеангиэктазия, вызванного инактивацией обоих аллелей гена ATM, было

обнаружено, что у гетерозиготных носителей мутаций риск развития рака, различной локализации в 100 раз выше [246]. Согласно литературным данным, мутации в гене ATM значительно чаще встречаются в семьях со случаями РЯ и РМЖ [258].

Иннактивация обоих аллелей гена PALB2 приводит к развитию наследственного синдрома Анемия Фанкони, который связан с тяжелыми пороками развития и предрасположенностью к злокачественным новообразованиям различной локализации [20].

У больных синдромом NBS (Nijmegen Breakage Syndrome), вызвонного инактивацией гена NBN, наблюдается нарушение функции яичников и более высокая частота РЯ [196].

Поскольку рак яичников относится к гормонозависимым опухолям, нарушения в системе превращения эстрогенов могут способствовать развитию заболевания [11; 5]. Нарушения в работе ферментов, вовлеченных в метаболизм эстрогенов, или изменение их активности может стать одним из факторов, способствующих развитию РЯ.

Эстрогены потенциально способны вызвать увеличение числа спонтанных ошибок в результате репликации ДНК. Стимулируя пролиферацию, эстрогены могут способствовать увеличению числа клеток с возникшей мутацией. С другой стороны, продукты окисления эстрогенов, такие как катехолэстрогены, семихиноны и хиноны, содержат активные формы кислорода, которые могут участвовать в повреждении ДНК. Продукты метаболизма эстрогенов могут приводить к возникновению мутаций, которые, в свою очередь, опосредуют развитие опухоли [49].

Однако, литературные данные, в которых отражены исследования полиморфных вариантов генов метаболизма эстрогенов при развитии гормонозависимых опухолей, весьма противоречивы [ 240; 123; 49].

С риском РЯ также ассоциированы ранний возраст менархе и поздний возраст менопаузы, поскольку увеличивается количество овуляторных циклов

[192]. Большое количество циклов овуляции и ранний возраст менархе связаны с высокой смертностью больных раком яичников [213]. Снижение числа овуляций в течение жизни, под воздействием беременностей, периода кормления грудью, приема оральных контрацептивов с низкой дозой содержания гормонов, приводит к уменьшению риска развития РЯ [202]. У рожавших женщин вероятность заболевания РЯ ниже на 30-70% по сравнению с нерожавшими [170; 136].

Беременность выступает в качестве протективного фактора в развитии РЯ, поскольку вызывает прекращение овуляции и подавляет секрецию гипофизом гонадотропинов. Кроме того, каждый дополнительный полный срок беременности, снижает риск РЯ на 8% [263]. На сегодняшний день недостаточно ясна степень влияния возраста рождения первого ребенка на риск развития рака яичников. Во многих исследованиях показана положительная ассоциация РЯ с поздним возрастом рождения первого ребенка (>30 лет) [249; 197]. Однако,