Молекулярно-генетический анализ наследственной формы рака молочной железы и/или яичников

Логинова, Анна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ наследственной формы рака молочной железы и/или яичников
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ наследственной формы рака молочной железы и/или яичников"

На правахрукописи

УДК 575.224

Логинова Анна Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ФОРМЫ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И/ИЛИ ЯИЧНИКОВ.

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2004

Работа выполнена в ГУ Медико-генетическом научном центре РАМН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Карпухин А. В.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Петрин А.Н. доктор биологических наук, профессор Носиков В.В.

Ведущая организация:

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

«¿р» С&^ГЛ^Ьр 2004 г. в

на

Защита диссертации состоится заседании Диссертационного совета Д.001.016.01. при Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук,

профессор

Курило Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Рак молочной железы (РМЖ) относится к наиболее распространенным онкологическим заболеваниям. В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди женщин в России рак этой локализации занимает 1-е место, а в структуре смертности — 2-е [Аксель и др., 2002]. Ежегодно в мире выявляют около 1 миллиона новых случаев, прогнозируя рост числа заболевших к 2010 году до "1,45 миллиона. Вероятность заболеть раком молочной железы в России на протяжении предстоящей жизни для новорожденной девочки составляет 3,5%, умереть от него - 1,8%. В России доля этой формы рака составила в 2000 году 19,3%.

Доля заболеваний вследствие высокого генетически обусловленного риска оценивается в 5 -10% всех случаев рака молочной железы на протяжении жизни людей и составляет более трети случаев рака молочной железы в возрасте до 30 лет [Claus et al., 1991]. Наследственная предрасположенность к раку молочной железы проявляется в накоплении случаев указанного заболевания в семьях. Наряду с раком молочной железы в таких семьях нередко наблюдается также рак яичников. Коренные сдвиги в понимании этого явления произошли в последнее десятилетие. Аутосомно-доминантное наследование рака молочной железы было показано в семьях с высоким риском этого заболевания [Newman et al., 1988]. Вскоре в области хромосомы 17q21 был картирован ген BRCA1 [Hall et al., 1990; Claus et al., 1991], выделенный в 1994 г. [Miki et al., 1994], который ответственен за наследственную предрасположенность к раку молочной железы и яичников. Спустя 2 года был клонирован второй ген, обусловливающий наследование повышенного риска рака молочной железы - BRCA2, локализованный в районе хромосомы 13ql2 [Tavtigian et al., 1996]. Наибольшая доля наследуемых форм рака молочной железы и/или яичников связана с мутациями в гене BRCA1 [Ford et al., 1998]. Мутации данного гена являются высокопенетрантными и приводят к 50-90% риску возникновения заболевания [Antoniou et al., 2002].

За прошедший после выделения генов период накоплена значительная информация о наследуемых мутациях в гене BRCA1. Известно, в частности, что мутации распределены по всему гену. В то же время, наблюдается популяционная зависимость в распределении мутаций. В этой связи, определение спектра мутаций в различных популяциях важно как с фундаментальной точки задач

медицинской генетики. Изучение характеристик мутаций на выборках из разных популяций позволит получить фундаментальную информацию по возникновению и распространению мутаций, их связи с клиническими проявлениями в составе разных генотипов. Семьи с наследственной предрасположенностью гетерогенны как по отягощенности раком яичников наряду с раком молочной железы, так и по числу пораженных заболеванием членов семьи. Эти характеристики семей могут быть связаны с вероятностью обнаружения мутации в гене BRCA1. Учитывая различия спектров мутаций в гене BRCA1 в разных популяциях, изучение наследуемых мутаций в связи с указанными характеристиками семей представляет существенный интерес. Такая информация важна, например, для выяснения возможной зависимости риска возникновения рака различной локализации (молочной железы или яичников) от положения мутации в гене [Thompson et al., 2002], а также выяснения взаимосвязи мутаций в данном гене с другими особенностями их клинического проявления. Помимо мутаций в гене BRCA1 обнаруживают ряд полиморфизмов. В ряде работ представлена информация по полиморфизмам в этом гене, но их анализ при семейном раке молочной железы и яичников пока нельзя признать достаточным. В частности, не ясна связь однонуклеотидных полиморфизмов в гене BRCA1 с мутациями данного гена.

Определение спектра мутаций в гене BRCA1 и решение других указанных вопросов важно не только с фундаментальной точки зрения, но и для решения практических медико-генетических задач. Актуальность для практики обусловлена в частности тем, что смертность от РМЖ, являющаяся высокой, постоянно растет. Основной причиной высокой смертности больных раком молочной железы и яичников является позднее выявление болезни. Доля больных с IV стадией заболевания в структуре заболеваемости раком молочной железы неуклонно растет [Трапезников и др., 2001]. Следовательно, вопросы своевременной диагностики и профилактики рака молочной железы и яичников весьма актуальны, так как запоздалая клиническая диагностика во многих случаях этого онкологического заболевания обусловливает существенное сокращение продолжительности жизни, несмотря на лечение.

Изучение генов BRCA1 и BRCA2, ответственных за наследственную предрасположенность к раку молочной железы и яичников, создает новые возможности медико-генетического консультирования и профилактики при этом заболевании. Выявление мутаций в гене BRCA1 обеспечивает

объективный критерий для формирования групп повышенного риска рака молочной железы с целью его профилактики и своевременной диагностики в случае возникновения заболевания. Более ранний возраст рака молочной железы и его существенная доля вследствие высоко пенетрантных наследуемых мутаций дополнительно акцентирует важность изучения соответствующих генов и практического использования полученных результатов. Создание ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников на основе выявления мутаций в гене BRCA1 весьма важно и создает базу для формирования групп риска и развития профилактики на принципиально новой основе.

Целью настоящей работы было исследование мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов в гене BRCA1 при наследственных формах рака молочной железы и яичников. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

• изучить спектр мутаций в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы и яичников;

• изучить однонуклеотидные полиморфизмы в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы и яичников и в контрольной выборке;

• изучить связь мутаций в гене BRCA1 с клиническими характеристиками семей, а также провести сравнительный анализ выявленных частот и характеристик мутаций с наблюдаемыми в выборках из других популяций.

Научная новизна. Впервые изучен спектр мутаций в гене BRCA1 в выборке семейного рака молочной железы и яичников в России. Обнаружено, что частота мутации 5382insC в спектре является наибольшей по сравнению с выборками из других популяций. На основании результатов по частотам гаплотипов, охарактеризованных по однонуклеотидным полиморфизмам (ОНП) при мутации 5382^^ и анализа частот встречаемости данной мутации в европейских странах, выдвинуто предположение о происхождении мутации 5382insC в европейской части России. Выявленное преобладание мутации 5382insC как при семейном раке молочной железы, так и яичников, а также результаты анализа соотношения семей с РМЖ, включающих и не включающих РЯ, свидетельствуют об отсутствии определяющего влияния положения мутации в гене BRCA1 на локализацию рака. Анализ частот ОНП при мутациях и без мутаций в данном гене среди пробандов с РМЖ или РЯ

позволил сформулировать гипотезу об ассоциации варианта гена БЯСЛ1 с другим геном.

Практическая значимость. Научно-практическая значимость результатов настоящей работы обусловлена выявлением спектра мутаций в гене БЯСЛ1 при семейном раке молочной железы и яичников. Выявленное преобладание одной мутации в спектре имеет существенное значение для практической ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников. Указанный феномен обеспечивает возможность проведения скрининговых исследований на предрасположенность к указанному заболеванию. Разработан оптимизированный способ обнаружения наиболее частых мутаций в гене БЯСЛ1. Способ был применен для выявления мутаций в семьях с повышенным риском к раку молочной железы и яичников. Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Изучены спектры мутаций и ОНП в гене БЯСЛ1 при семейном раке молочной железы и/или яичников. Найденная частота мутаций при семейном раке молочной железы и яичников составила 32%, при семейном раке только яичников - 86%.

2. В спектре мутаций в гене БЯСЛ1 как при семейном РМЖ, так и при семейном РЯ преобладает мутация 53821шС.

3. Мутации в гене БЯСЛ1 наиболее часто встречаются среди семей с РМЖЯ - мутации найдены у 61% таких семей. Среди семей с РМЖ мутации найдены у 16% семей.

4. Частоты генотипов по ОНП в группе пробандов с мутациями отличаются от соответствующих частот в группе пробандов без мутаций в гене БЯСЛ1.

Личный вклад соискателя. Основные результаты исследования, представленные в диссертации, получены и оформлены автором в лаборатории молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний Медико-генетического научного центра РАМН. Сбор образцов крови пациентов и выяснение родословных семей пробандов осуществлялся в Российском Онкологическом Научном Центре им. Блохина лабораторией онкологической генетики при участии ст. научн. сотрудника, к.м.н. Л.Н. Любченко и заведующей лабораторией, проф., д.м.н. Р.Ф. Гарькавцевой. Секвенирование фрагментов ДНК проводилось при помощи автоматического секвенатора

совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН А. В. Будиловым и В.М. Захарьевым.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты доложены на симпозиумах и конференциях: the 3 rd International Workshop on Advanced Genomics. SNPs: Application and Related Technologies (Yokohama, 2000); II конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001); 10th International Congress of Human Genetics (Vienna, 2001); European Human Genetics Conference (Birmingham, 2003); 14th General Meeting ofthe BCLC/ICG-FBOC - The Breast Cancer Linkage Consortium (Madrid, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации, Диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 121 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 22 рисунка. Список литературы включает 134 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Пациенты. Критерием отбора при семейном раке молочной железы и яичников было наличие у пробанда одного или более родственников 1Л1 степени родства, страдающего каким-либо из указанных заболеваний, при обязательном присутствии в семье больного раком молочной железы. Рак яичников считали семейным при наличии двух и более родственников I/II степени родства, страдающих данным заболеванием, и при отсутствии среди них больных раком молочной железы. Среднее число больных членов семьи (I и II степени родства) в выборке составило 3 человека. Контрольная выборка была сформирована из женщин, члены семей которых и они сами не имели указанных заболеваний. Пациенты были преимущественно из Москвы и Московской области, в возрасте от 23 до 62 лет. Исследованы образцы ДНК 83 пробандов и их родственников, а также 28 индивидуумов контрольной выборки.

Анализ первичной структуры гена BRCA1. Определение мутантных фрагментов ДНК указанного гена проводили с помощью электрофоретического метода с последующим подтверждением наличия мутации и выявлением ее характеристик путем секвенирования.

При выполнении указанной схемы проводили следующие процедуры: выделение ДНК из образцов крови пациентов; амплификацию экзонов изучаемого гена; электрофоретический анализ продуктов амплификации; секвенирование фрагментов ДНК, идентифицированных в качестве мутантных.

Выделение ДНК. ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови пациентов стандартным методом.

Полимеразная цепная реакция. При проведении полимеразной цепной реакции (ПНР) был использован набор олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих амплификацию экзонов с примыкающими частями интронов (50 - 100 п. н.). Было синтезировано 39 пар праймеров, что позволяет охватить все экзоны гена BRCA1. Были определены оптимальные условия ПНР, экспериментально отработанные для всех синтезированных праймеров, такие как температура отжига, параметры циклов амплификации, состав буфера.

Электрофорез. Для электрофоретического определения мутантных фрагментов ДНК был избран конформационно-чувствительный гель электрофорез (CSGE), который обладает высокой чувствительностью, универсальностью и простотой.

В работе были использованы следующие параметры: состав геля: 10% полиакриламид, 10% этиленгликоль, 15% формамид в 0,5Х ТТЕ' буфере. Толщина геля 0,8 мм. Префорез проводили при 700 В в 0.5Х ТТЕ буфере, время префореза 30 мин. Электрофорез проводили при 550 В в течение 24 часов. Часть работы была выполнена с использованием коротких гелей на стандартных аппаратах для электрофореза.

Окраска геля. Окраску геля проводили методом серебрения.

Секвенирование. Амплифицированную ДНК для секвенирования очищали с помощью наборов Wizard, кат. N А7170 (Promega, США). Секвенирование фрагментов ДНК осуществляли при помощи автоматического секвенатора.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия на основе

четырехклеточных таблиц (программа Statistica). При необходимости был использован точный критерий Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Выявление особенностей первичной структуры ДНК в гене BRCA1.

Были найдены оптимальные условия реализации CSGE для выявления вариаций нуклеотидной последовательности гена BRCA1. Найденные условия позволяют с высокой чувствительностью обнаруживать полиморфные варианты и мутации в исследуемом гене. На первом этапе работы были изучены различные параметры, связанные с чувствительностью и воспроизводимостью методики. Характеристики вариаций определяли секвенированием по двум комплементарным цепям фрагментов ДНК. Первоначально тестировали возможности методики по выявлению однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП). Пример получаемой электрофореграммы представлен на рис.1. На данном рисунке показан анализ ряда полиморфизмов в гене BRCA1. Как видно из рисунка, на одном геле могут быть проанализированы фрагменты ДНК различной длины и природы. Например, вариации в составе нуклеотидов могут быть обнаружены как в относительно длинных фрагментах ДНК (рис.1., лунка 11 - 378 п.н.), так и в коротких (рис. 1, лунка 4 - 211 п.н.).

В результате секвенирования фрагментов ДНК с найденными вариациями первичной структуры были получены их характеристики, приведенные на рис.1. Из указанных результатов следует, что найденные полиморфизмы локализуются в разных местах амплифицированных фрагментов ДНК. Так, например, в одном из фрагментов ДНК (лунка 1) найден интронный вариант, находящийся на расстоянии 115 нуклеотидов от экзона. В ряде других фрагментах ДНК ОНП были локализованы в экзонах (лунки 6-9). Большинство полиморфизмов связаны с однонуклеотидными заменами и только один (лунка 4) обусловлен делецией нуклеотида. Наибольшее разделение гетеродуплексов наблюдается в этом случае, но хорошо разделяются и фрагменты ДНК с различными нуклеотидными заменами (рис.1). Например, выявлена замена T/G (лунка 1), замена A/G (лунка 7), замена C/G (лунка 11).

Следовательно, используемый метод конформационно-чувствительного электрофореза позволяет выявлять вариации нуклеотидов в фрагментах ДНК различной длины, находящиеся в различных участках амплифицированных фрагментов ДНК, в том числе близко к концам фрагментов ДНК, а также различные однонуклеотидные замены. На рис.2 представлены примеры обнаружения и анализа мутаций. Как видно на рис.2 при отсутствии изменений

„(Ь1-*, г, I

^ ч !

-л

лунка 1 - экзоп 2 1У51-И5Т/С

лунка 2 - экзон 3 норма

лунка 3 - экзон 5 норма

лунка 4 - экзон 9 1У58 - 58(1е1Т ■

лунка 5' - экзон 10 ' норма

лунка 6 - экзон 11 2430Т/С

лунка 7 - экзон 11 3232АЛ!

лунка 8 - экзон 11 3667А/С

лунка 9 1 - экзон 13 4428Т/С

лунка 10 - экзон 14 норма'

лунка И - экзон 15 1У514-63С/С

Рис. 1. Электрофоретическое разделение методом CSGE

амплифицированных фрагментов ДНК гена BRCA1. в амплифицированном фрагменте ДНК наблюдается одна полоса; при наличии изменений в составе нуклеотидов на электрофореграмме появляется несколько полос. На рис.2А представлен пример выявления варианта в 20 экзоне. По результатам секвенирования фрагмента ДНК была обнаружена вставка одного нуклеотида - цитозина. В соответствии с принятой номенклатурой, этот вариант (5283^^ является мутацией сдвига рамки считывания, которая приводит к стоп — кодону 1829.

На рис.2В представлен анализ варианта во втором экзоне гена БЯСЛ1. В результате секвенирования была обнаружена делеция двух нуклеотидов -аденина и цитозина. В соответствии с номенклатурой, этот вариант (185ёе1ЛО) является мутацией сдвига рамки считывания, которая приводит к стоп - кодону

39.

Г, , - ^ Гч'- : • *

Г'

Г,- /Л

1 2

лунка 1 - экзон 20 5382шзС лунка 2 - экзон 20 норма

М- '„,.--,,».

I-.. г..'г'- 7-

5 * • -Т ь.".-^ ■ j

г. %> -- „

*„' Л-'.:Лг <..1. ^ 1 2

лунка 1 - экзоп 2 185(1е1АС

лунка 2 - экзон 2 норма

Рис. 2. Электрофорез (С80Е) амплифицированных фрагментов ДНК гена БЯСЛ1. А - 20-й экзон; В - 2-й экзон.

В ряде случаев при обнаружении мутации у пробанда были исследованы также члены его семьи. При таком анализе обнаруженная у пробанда мутация была выявлена также у его родственников.

Таким образом, приведенные результаты демонстрируют надежность и чувствительность примененной методики исследования первичной структуры гена БЯСЛ1. Электрофоретическое разделение методом С80Е позволяет на одном геле выявлять точечные замены нуклеотидов в амплифицированных фрагментах ДНК разной длины и с различным расположением разных нуклеотидных замен. Результаты, полученные при изучении наследования мутаций, показывают надежность их выявления и идентификации.

Спектр мутаций в гене БЯСЛ1 при семейном раке молочной железы.

В настоящей работе представлены результаты по изучению первичной структуры гена БЯСЛ1 у 111 человек. В данном разделе рассматриваются результаты исследования гена БЯСЛ1 у пробандов в выборке семей с раком молочной железы и яичников.

Было исследовано 50 семей с наследственной отягощенностью раком молочной железы и яичников. В эту выборку входят также семьи с

наследственным раком молочной железы только. При изучении выборки семейного рака молочной железы и яичников у пробандов было выявлено 16 мутаций в гене BRCA1 (32%). Среди выявленных мутаций основную долю спектра заняла мутация 5382insC (рис.3). Таких мутаций было обнаружено 15, что составило 94% спектра мутаций в гене BRCA1. Единственной иной мутацией оказалась 185delAG.

Рис. 3. Спектр мутаций в гене БКСЛ1 при наследственной форме рака молочной железы и яичников.

По данным литературы, так же как и в нашем случае, некоторые популяции имеют повторяющиеся мутации. Так, например, у евреев Ашкенази наиболее частой мутацией в гене BRCA1 является 185delAG, которая составляет около 80% спектра мутаций в гене ^гс^у, Biesecker, 1998].

Во многих странах центральной Европы мутация 5382insC является самой распространенной. Как видно на рисунке 4, частота мутации 5382msC от максимального значения в европейской части России резко убывает в северном и западном направлениях и плавно убывает в южном направлении. Частоты, наиболее близкие к наблюдаемым в России, найдены в Латвии, Польше, Чехословакии, Венгрии и Югославии - 40 - 60% Следовательно, наибольшая распространенность мутации 5382insC наблюдается в юго-западном и южном направлении по отношению к европейской части России, В Швеции, Норвегии и Испании мутация 5382insC не встречается. В странах Азии и Южной Америки эту мутацию тоже не находят.

Таким образом, мутация 5382insC характерна для основного числа европейских стран. Ее частота плавно убывает в южном направлении от

Л1ИЛ1,-| -)-т м ¿104 И-ЮН ЛООН ИЧШ 41-1114 (1-7ГЧ >10%

Рис. 4. Распространенность мутации 53821шС в странах Европы. европейской части России. Существенно, что гаплотипирование по микросателлитным маркерам свидетельствует об эффекте основателя в происхождении этой мутации [№иИашеп й аИ, 1996; Szabo й а1., 2003]. С учетом этого фактора, самая высокая частота мутации 53821шС, найденная нами, и выявленный характер ее изменения по мере географического удаления от России могут свидетельствовать о происхождении данной мутации в европейской части России.

Спектр мутаций в гене БЯСЛ1 при семейном раке яичников.

Наряду с семьями, в которых встречаются оба исследуемых в данной работе типа рака - молочной железы и яичников, с меньшей частотой наблюдаются семьи с наследованием только рака яичников. В рамках поставленных задач было интересно изучить встречаемость и характеристики мутаций в гене БЯСЛ1 в семьях такого типа. В частности, исследование семейного рака яичников и сравнение результатов с уже полученным спектром

мутаций в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы и яичников является существенным для прояснения вопроса о взаимосвязи фенотипического проявления мутаций с их положением в гене BRCA1. Действительно, при изучении семейного рака молочной железы и яичников мы нашли, что мутация 5382insC в гене BRCA1 в российских семьях с высокой частотой связана с наследственной предрасположенностью как к раку молочной железы, так и к раку яичников.

Исследование мутаций в гене BRCA1 было проведено у пробандов 7 семей с наследственной отягощенностью раком яичников. Мутации были найдены у 6 из них (86%). Как и при семейном раке молочной железы и яичников, основную долю спектра заняла мутация 5382insC (50%). Также были обнаружены и другие мутации: 2080delA и 4154delA (рис.5).

Найденная нами частота мутаций в гене BRCA1 при семейном раке только яичников оказалась в 2,5 раза выше, чем при семейном раке молочной железы и яичников. Более высокая частота мутаций в гене BRCA1 при раке только яичников по отношению к частоте мутаций при раке молочной железы и яичников было найдено и в некоторых выборках из других популяций.

Обнаруженная нами частота мутаций в гене BRCA1 и доля мутации 5382insC в спектре схожи с полученными на другой российской выборке семейного рака яичников [Gayther et.al., 1997]. Хотя доля мутации 5382insC в спектре при семейном раке яичников оказалась несколько ниже, чем при

Рис. 5. Спектр мутаций в гене BRCA1 при семейном раке яичников.

семейном раке молочной железы и яичников, она составляет основную долю обнаруженных при семейном раке яичников мутаций. Следовательно, мутация

5382insC в гене BRCA1 приводит как к раку молочной железы, так и к раку яичников. Полученные нами результаты не дают оснований для утверждения о связи положения наследуемой мутации в гене BRCA1 с местом локализации раковой опухоли.

При семейном раке яичников нами были найдены две мутации, которые не встречались при семейном раке молочной железы/яичников: 2080delA и 4154delA. Однако эти же мутации встречаются в выборках из других популяций также при раке молочной железы. Например, мутация 2080delA в работе [Liede et. в1., 2002a] наблюдалась как при раке молочной железы, так и при раке яичников.

Гетерогенность семей с раком молочной железы и яичников по встречаемости мутаций в гене BRCA1.

Семьи с исследуемыми заболеваниями различаются по наличию или отсутствию в семье рака яичников наряду с раком молочной железы, а также по числу заболевших родственников. Наибольшее число мутаций в гене BRCA1 было найдено в семьях, включающих четыре и более случаев заболевания раком молочной железы и яичников (РМЖЯ), что составляет 62% от всех мутаций, в то время как доля таких семей в выборке составляет 28% (табл.1).

Таблица 1.

Распределение семей по встречаемости рака молочной железы и яичников и частоты семей с мутациями в гене BRCA1.

Характеристика семьи Количество семей Количество семей с мутациями в гене ВИСА!

4 и более РМЖ 0 (0%)

4 и более РМЖЯ 14 10(71%)

2-3 РМЖ 24 5 (21%)

2-3 РМЖЯ 4 1 (25%)

Сумма 50 16 (32%)

Напротив, в семьях с четырьмя и более случаями рака только молочной железы (РМЖ), не было найдено ни одной мутации в гене BRCA1. Выявленное различие в частотах мутаций среди семей с четырьмя и более случаями данных раковых заболеваний, включающих либо не включающих рак яичников, статистически значимо (Р < 0,002, точный критерий Фишера). Статистически

значимое отличие частоты мутаций в гене BRCA1 среди семей с 4 и более случаями только рака молочной железы найдено также по отношению к частоте мутаций для всей остальной (за исключением семей с 4 и более случаями только РМЖ) части выборки (Р < 0,045). Наблюдаемое понижение частоты мутаций в гене BRCA1 среди семей с высоким уровнем заболеваемости раком только молочной железы может быть обусловлено значительной вероятностью возникновения в семье рака яичников при мутациях в данном гене.

При анализе частоты мутаций в гене BRCA1 среди семей с РМЖЯ и РМЖ независимо от числа случаев рака в семье показано преобладание встречаемости мутаций среди семей с РМЖЯ - мутации найдены у 61% семей. Среди семей с РМЖ мутации найдены у 16% семей. Отличие частоты мутаций среди семей с РМЖЯ и РМЖ статистически значимо даже в том случае, если не учитывать семьи с четырьмя и более заболеваниями РМЖ, среди которых не найдено мутаций в гене BRCA1 и которые могут представлять собой особую группу (X2 = 7,08; Р = 0,008).

Сравнение частоты семей с раком яичников с мутациями и без мутаций в гене BRCA1 показало, что 69% всех семей с мутациями составляют семьи с РМЖЯ. В то время как при отсутствии мутаций в гене BRCA1 только 21% семей включает рак яичников (X2 = 10,95; Р = 0,0009).

Мы сравнили полученные нами данные с результатами изучения выборок из других популяций, при формировании которых критерии отбора семей были аналогичны использованным нами. Например, в выборке семейного рака молочной железы и яичников во Франции мутации в гене BRCA1 были найдены среди 24% семей [Stoppa-Lyonnet et.al., 1997], что не отличается статистически достоверно от полученного нами значения (32%). В то же время, в Финляндии мутации в гене BRCA1 были найдены только у 10% семей [Vehmanen et.al., 1997], в Нидерландах - у 20% [Verhoog et.al., 2001]. Такой уровень представленности семей с мутациями в гене BRCA1 статистически значимо отличается от найденного нами в России (Р = 0,0008 и 0,043, соответственно). Результаты сравнения показывают, что численные различия частоты мутаций в гене BRCA1 имеют неслучайный характер, по крайней мере, для некоторых популяций.

В соответствии с полученными нами результатами, частоты мутаций в гене BRCA1 среди семей с РМЖЯ и РМЖ различны. Такой феномен характерен и для ряда популяций в Европе. Исходя из выводов некоторых

работ о связи частоты возникновения рака молочной железы или яичников с положением мутации в гене BRCA1, можно было бы предположить, что доля семей с РЯ в нашей выборке должна отличаться от доли таких же семей в других популяциях с иным спектром мутаций в гене BRCA1. Однако, значимого различия отношения числа семей с РМЖЯ к числу семей с РМЖ при мутациях в гене BRCA1 в нашей выборке и в выборках, полученных во Франции, Нидерландах и Финляндии, не было найдено (Р = 0,57 - 0,95). Следовательно, мутации в гене BRCA1 примерно в одинаковых пропорциях встречаются в семьях с РМЖЯ или РМЖ в разных популяциях, в том числе в популяциях с достоверно различной долей мутаций в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы и яичников. Спектры мутаций в гене BRCA1 во всех сравниваемых популяциях различны. Результаты сравнения пропорций возникновения семейного РМЖЯ и РМЖ при мутациях в гене BRCA1 в разных популяциях не свидетельствуют в пользу концепции связи локализации рака с положением мутации, так как сходство данных пропорций наблюдается при различных спектрах мутаций в гене BRCA1.

Дополнительно, эти данные также показывают, что отсутствие зависимости возникновения РМЖ или РЯ от положения мутации не является особенностью только российской выборки. Следует также отметить, что факторы, модифицирующие риск развития опухоли той или иной локализации, в соответствии с результатами сравнительного, анализа могут быть подобны для рассматриваемых популяций.

Особенностью распределения мутаций в гене BRCA1 среди семей в нашей выборке является достоверно пониженная их частота в семьях с РМЖ с не менее чем четырьмя случаями данного заболевания (табл.1). Подобное явление отмечено при изучении выборок из некоторых других популяций [Ford et.al.,1998; Stoppa-Lyonnet et.al.,1997]. В то же время, в финской выборке [Vehmanen et.al.,1997] сопоставление аналогичных характеристик не выявило достоверных отличий в рассматриваемых частотах мутаций в гене BRCA1 (X2 = 1,06; Р = 0,30). Следовательно, феномен пониженной частоты мутаций в гене BRCA1 среди семей с РМЖ с 4 и более случаями характерен для ряда популяций, но не является всеобщим. По-видимому, генотипические особенности некоторых популяций оказывают определенное влияние на проявление мутаций в гене BRCA1.

За исключением рассмотренной группы семей, достоверной зависимости частоты мутаций в гене BRCA1 от числа заболевших членов семьи нами не было обнаружено. Эти данные соответствуют результатам, полученным на некоторых других выборках. Видимо, иные характеристики, помимо количества пораженных родственников в семье (или дополнительно к данному клиническому параметру), могут указывать на повышенную вероятность наличия мутации в гене BRCA1.

Таким образом, вероятность наследования мутации в гене BRCA1 при семейной предрасположенности к раку молочной железы и яичников не связана достоверно с числом заболевших родственников в семье. Значимой характеристикой в этом плане является наличие в семье заболевших раком яичников. Если в семье есть заболевшие раком яичников, то вероятность присутствия мутации в гене BRCA1 значительно выше по сравнению с семьей, в которой у всех заболевших рак локализован только в молочной железе. Как следует из результатов сравнительного анализа, такое соотношение характерно для ряда популяций. Величина этого соотношения сохраняется, несмотря на различие спектров и частот мутаций в гене BRCA1 в выборках из разных популяций. В то же время, в соответствии с нашими данными, вероятность мутаций в гене BRCA1 существенно понижена среди семей, наследующих только рак молочной железы при четырех и более случаях заболевания в семье. Данная закономерность присуща также некоторым другим, но не всем популяциям в Европе.

Характеристика одионуклеотидных полиморфизмов в гене BRCA1.

Помимо мутаций, в гене BRCA1 был найден широкий набор полиморфизмов. Всего обнаружено 14 вариантов в нуклеотидной последовательности гена BRCA1. Экзонных вариантов найдено 8, из них 5 , E1038G, S1040N, K1183R и S1613G) приводят к замене кодируемой аминокислоты. Наиболее частыми вариантами структуры гена BRCA1 оказались два варианта, обозначенные как гаплотип А и гаплотип В. Гаплотип А представляет собой последовательность нуклеотидов, относительно которой определяются полиморфные варианты. Этот вариант именуют консенсусным [Shattuck-Eidens,et.al.,1997]. Гаплотип В содержит 11 вариантов ОНП, находящихся в строгом неравновесии по сцеплению (табл.2). Среди пробандов семей с раком молочной железы и яичников частота гаплотипа В составила 32%

Для сравнения была изучена контрольная выборка из 28 человек, семьи которых не отягощены раком молочной железы и яичников. У 14 человек в гене BRCA1 было выявлено присутствие гаплотипа В. У одного из них наблюдалась гомозиготность по гаплотипу В. Частота гаплотипа В составила 27%, что не отличается достоверно от соответствующей частоты среди больных с семейным раком молочной железы и яичников (X2 = 0,26; Р = 0,61). Таблица 2.

Полиморфные варианты и гаплотнпы гена BRCA1.

* Варианты 1 Экзон ; \ Гяшишш'- ''

'' Л ] в

.,т1-1031Ус; ' | 1 ; - I +

1 ' 1 +

9 г«' 1 +

и Г-Н +

„ 'Е771Ь И +

- >Р8711/' | 11 " - а +

• К 103.40 | 11 ' - I +

Г '.лКАШЛ,' "" 11 : - л-' 1 -

51436?. • ' | 13 +

15 - \ +

/Ябис,, 1 ..1а—1 .. Л.—;___ 16

При наиболее частой мутации 5382insC только у 4 пробандов из 15 был выявлен гаплотип В, т.е. основное число указанных мутаций находится в составе гаплотипа А. В работе [Shattuck-Eidens et в1., 1997] описаны аналогичные частоты встречаемости мутации 5382insC в составе указанных гаплотипов.

Сравнение полученных нами и в работе [Shattuck-Eidens et в1., 1997] данных не показало значимого различия частот гаплотипов (X2 = 0,62; Р = 0,43) и генотипов (X2 = 0,71; Р = 0,40) при мутации 5382^С Однородность частот гаплотипов в выборках из западно-европейской и российской популяциях подкрепляет основанное на частотах мутации 5382insC предположение о районе ее происхождения. Это обстоятельство дает также основание для объединения данных с целью увеличения статистической надежности.

Частоты хромосом с гаплотипами А и В у пробандов с мутацией 5382insC при объединении с приведенными выше результатами работы [Shattuck-Eidens et в1., 1997], позволившем удвоить выборку, составили 57 и 7, соответственно. Показано, что распределение гаплотипов А и В в геномах с мутацией 5382insC

достоверно отличается от частот этих гаплотипов в популяции (X2 = 5,14; Р = 0,023). При этом гаплотип А среди пробандов с мутацией 5382insC встречается почти в 3 раза чаще, чем в популяции: отношение шансов ЯЯ = 2,98.

Среди пробандов с раком молочной железы или яичников, у которых не выявлены мутации в гене ВЯСА1 (34 человека) найдены следующие частоты гаплотипов: А - 38, В - 26; 4 гаплотипа характеризовались наличием только отдельных ОНП. Так как мутация 185delAG встречается в составе гаплотипов А либо В в зависимости от этнической группы [Shattuck-Eidens е! а1., 1997], то при дальнейшем анализе частот данные по этой мутации были исключены.

Сравнение встречаемости генотипов среди пробандов с мутациями в гене ВЯСА1 и без таковых (7 геномов с гаплотипом А) выявило значимые различия. Частота АА оказалась почти в 9 раз ниже в группе пробандов с раком молочной железы/раком яичников, но без мутаций в гене ВЯСА1, по отношению к пробандам с мутациями (X2 = 10,87; Р = 0,001; ЯЯ = 8,94). Интересно, что недавно подобное явление было обнаружено на выборке из другой популяции при ином, по сравнению с наблюдаемым нами, спектре мутаций в гене ВЯСА1 [Азопо е! а1., 2003]. По отношению к контролю обнаружено достоверное снижение частоты генотипа АА среди пробандов без мутаций в гене ВЯСА1 (X2 = 4,70; Р = 0,03; ЯЯ = 3,25).

Следовательно, наблюдаются различия в частотах генотипов как между группами пробандов с мутациями и без мутаций в гене ВЯСА1, так и в группе пробандов с раком молочной железы или яичников, но без мутаций в гене ВЯСА1, по сравнению с популяционными частотами.

Поскольку выборка пациентов не является популяционной, а ограничена семейными случаями, трактовка результатов с точки зрения связи с риском некорректна. В то же время, наблюдается ассоциация частот генотипов по гену ВЯСА1 с изучаемым заболеванием. В этой связи, причиной сдвига частот генотипов по гену ВЯСА1 в группе пробандов без мутаций может являться ассоциация его вариантов с вариантами другого гена. Наиболее вероятным кандидатом на роль ассоциирующего гена представляется ВЯСА2. Как и ВЯСА1, ген ВЯСА2 связан с семейным раком молочной железы. Оба указанных гена имеют сходные функции, вовлечены в контроль гомологичной рекомбинации и репарацию двуцепочечных разрывов, участвуя в комплексе Rad51, и взаимодействуют между собой. Следует отметить, что в состав гаплотипа В входят 4 вариации, приводящие к замене аминокислот. Их

сочетание с вариациями гена BRCA2 может иметь функциональные последствия, модифицируя, например, уровень риска рака молочной железы. В настоящее время в нашей лаборатории проводится экспериментальная проверка выдвинутого предположения.

ДНК-диагностнка наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников.

При исследовании гена BRCA1 у пациентов с семейным накоплением рака молочной железы и яичников в настоящей работе получены результаты, имеющие существенное значение для целей практической ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников. Прежде всего, при изучении спектра мутаций в гене BRCA1 было показано преобладание одной мутации - 5382шбС, занимающей более 90% спектра. Этот факт позволяет не только принципиально упростить и удешевить ДНК-диагностику, но и проводить скрининговые исследования для формирования группы повышенного риска. Получены также данные по связи клинических и генетических характеристик семей с вероятностью наличия мутации в гене BRCA1, которые позволяют повысить эффективность ДНК-диагностики. В соответствии с результатами, наибольшая вероятность обнаружения мутации в гене BRCA1 при наличии в семье случаев заболевания раком яичников. Эта вероятность не зависит (или зависит в слабой степени) от количества в такой семье родственников, больных РМЖ. Вероятность обнаружить мутацию в гене BRCA1 минимальна в том случае, если в семье присутствует четыре и более родственника с РМЖ при отсутствии случаев заболевания РЯ. Указанные данные имеют также прогностическое значение. Они свидетельствуют, что у женщин с мутацией в гене BRCA1 велик риск заболевания не только РМЖ, но и раком яичников. Это необходимо учитывать при диспансерном наблюдении таких пациентов.

Хотя в спектрах мутаций при раке молочной железы и/или яичников преобладает одна мутация - 53821шС, было выявлено присутствие и некоторых других мутаций. Все выявленные «вредные» мутации являются мутациями сдвига рамки считывания и обусловлены вставками или делециями нуклеотидов. Данное обстоятельство позволяет упростить методику обнаружения мутаций. В связи с этим, в настоящей работе была предпринята разработка оптимального метода, ориентированная на выявление основного числа мутаций в гене BRCA1, характерных для исследованных выборок.

Возможность оптимизации обусловлена меньшими требованиями к чувствительности методики при выявлении дефектов гена, связанных только со вставками или делециями нуклеотидов. Создание оптимального метода ДНК-диагностики было связано с поиском условий, позволяющих существенно сократить время анализа и расход материалов, а также увеличить количество анализируемых в одном цикле образцов при CSGE.

Оптимизировать указанные параметры можно, если найти условия, позволяющие использовать стандартные электрофоретические аппараты вместо применяемых при CSGE приборов для секвенирования (типа МасгорЬэг). Стандартные аппараты ориентированы на более короткие гели, зачастую допускают закладку одновременно двух гелей.

Были разработаны условия, которые позволяют в 2 - 3 раза увеличить количество одновременно анализируемых образцов, в 4 раза сократить время электрофореза, а также снизить расход материалов, что повышает эффективность и экономичность работы. Сравнительный анализ разделения в двух указанных выше типах гелей показал, что чувствительность определения мутаций одинакова при наличии однонуклеотидных вставок или делеций.

Разработанные подходы были применены при ДНК-диагностике наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников. Наряду с определением мутаций в гене ВЯСА1 у больных РМЖ или РЯ, наличие предрасположенности к указанным заболеваниям выявляли у здоровых членов семей с наследственным отягощением. Последнее представляет наибольший интерес, поскольку позволяет формировать группу повышенного риска для проведения профилактических мероприятий. Было исследовано 26 человек. Среди родственников пробандов с мутациями в гене ВЯСА1 у 10 здоровых женщин также были найдены мутации. Данная группа имеет повышенный риск заболевания раком молочной железы и яичников и нуждается в диспансерном наблюдении. Четыре женщины мутации не унаследовали и, следовательно, риск заболевания в этой группе не отличается от средне популяционного.

Таким образом, в настоящей работе исследована первичная структура гена ВЯСА1 в семьях с наследственной предрасположенностью к раку молочной железы и/или яичников, изучена взаимосвязь выявленных мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов в гене ВЯСА1, а также взаимосвязь мутаций с клиническими характеристиками семей. Было найдено, что мутации

в гене БЯСЛ1 присутствуют у 32% семей с предрасположенностью к раку молочной железы и яичников и у 86% семей с раком только яичников. В спектре мутаций в гене БЯСЛ1 среди таких семей мы обнаружили существенное преимущество одной мутации в 20 экзоне - 5382гпзС. При семейном раке молочной железы и яичников доля этой мутации составила 94%, при раке только яичников — 50%. Рассматривая столь высокий процент одной мутации в спектре, следует отметить, что для анализа особенностей первичной структуры гена БЯСЛ1 была использована высокочувствительная методика, позволившая выявить большое количество полиморфизмов. Ряд этих полиморфизмов связан с различными заменами, одного нуклеотида, полиморфизмы рассеяны по всему гену и расположены в разных участках анализируемых фрагментов ДНК. Суммарная частота мутаций в наших выборках относится к наиболее высоким частотам, выявленным на других выборках при аналогичных критериях их формирования. Например, в странах западной Европы частота мутаций в гене БЯСЛ1 при семейном РМЖ и РЯ, как правило, составляет 20-25%. В то время как при семейном РМЖ и РЯ доля иных, помимо 5382шбС, мутаций составила менее 10%, при раке только яичников доля иных мутаций составила около 50%.

Найденная нами максимальная из известных частота мутации 53821шС и характеристики ее распространенности в Европе указывают на происхождение этой мутации в европейской части России. В пользу этого говорит также показанная в настоящей работе одинаковость частот гаплотипов по однонуклеотидным полиморфизмам гена БЯСЛ1 при мутации 53821шС в России и среди европейцев. Кроме того, для данной - мутации наблюдается эффект основателя [№иЬаизеп et а1., 1996; Szabo et а1., 2003].

Как найдено нами, одна мутация - 5382гпзС - является преобладающей при наследственной форме рака молочной железы или яичников, а также при раке только яичников. Более того, проведенный сравнительный анализ клинических характеристик семей с раком молочной железы или яичников и с мутациями в гене БЯСЛ1 в нашей выборке и характеристик семей ряда выборок из других популяций, показал устойчивость соотношения семей с РМЖЯ и с РМЖ. Указанные соотношения для выборок из других популяций не отличались достоверно от найденного нами соотношения, несмотря на различия спектров мутаций в гене БЯСЛ1 во всех проанализированных

выборках. В целом, наши данные показывают, что положение мутации в гене ВЯСА1 не является основным фактором, определяющим локализацию рака.

Анализ встречаемости мутаций в гене ВЯСА1 среди семей с разными клиническими характеристиками показал, что наличие в семье рака яичников, независимо от присутствия рака молочной железы, с большой вероятностью указывает на наличие мутации в гене ВЯСА1. Интересной особенностью распределения мутаций в гене ВЯСА1 среди семей в нашей выборке оказалась достоверно пониженная их частота в семьях с РМЖ с не менее чем четырьмя случаями данного заболевания. Феномен пониженной частоты мутаций в гене ВЯСА1 среди семей с РМЖ с 4 и более случаями характерен для ряда популяций, но не является всеобщим. По-видимому, генотипические особенности некоторых популяций оказывают определенное влияние на проявление мутаций в гене ВЯСА1.

Частота гаплотипов, охарактеризованных по однонуклеотидным полиморфизмам, в контрольной выборке не отличается достоверно от соответствующей частоты в выборке больных с семейным раком молочной железы и яичников. Наряду с этим, показана статистически достоверная преимущественная ассоциация мутации 53821шС с одним из гаплотипов. Наблюдаются различия в частотах генотипов как между группами пробандов с мутациями и без мутаций в гене ВЯСА1, так и в группе пробандов с раком молочной железы или яичников, но без мутаций в гене ВЯСА1, по сравнению с популяционными частотами.

При исследовании гена ВЯСА1 у пациентов с семейным накоплением рака молочной железы и яичников в настоящей работе получены результаты, имеющие существенное значение для целей практической ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников. Прежде всего, было показано преобладание одной мутации — 53821шС. Этот факт позволяет не только принципиально упростить и удешевить ДНК-диагностику, с помощью, например, разработанного в данной работе способа, но и проводить скрининговые исследования' для формирования группы повышенного риска. Полученные данные по связи клинических и генетических характеристик семей с вероятностью наличия мутации в гене ВЯСА1, позволяют повысить эффективность ДНК-диагностики и медико-генетического консультирования при семейном раке молочной железы и яичников.

Разработанные подходы были применены при ДНК-диагностике наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников. Наряду с определением мутаций в гене BRCA1 у больных РМЖ или РЯ, наличие предрасположенности к указанным заболеваниям выявляли у здоровых членов семей с наследственным отягощением. Последнее позволяет формировать группу повышенного риска для проведения профилактических мероприятий.

ВЫВОДЫ.

1. Частота мутаций в гене БЯСЛ1 в семьях, отягощенных раком молочной железы и яичников составила 32% и в семьях с раком только яичников -86%.

2. В выявленном спектре мутаций в гене БЯСЛ1 при семейном раке молочной железы и яичников преобладает мутация 53821шС с частотой 94%.

3. Гаплотипы гена БЯСЛ1, изученные по однонуклеотидным полиморфизмам, при мутации 53821шС в России совпадают с таковыми среди европейцев. Аналитически выявлено снижение частоты этой мутации по мере удаления от европейской' части России. Эти данные могут указывать на происхождение мутации 53821шС в европейской части России.

4. Мутация 5382шбС в гене БЯСЛ1 преобладает также при семейном раке только яичников с частотой в спектре, составляющей 50%. Следовательно, одна и та же мутация приводит к семейному раку как молочной железы, так и яичников, что свидетельствует об отсутствии связи типа рака с положением мутации в гене.

5. Соотношение семей с раком молочной железы и раком яичников (РМЖЯ) и с раком только молочной железы (РМЖ) при мутациях в гене БЯСЛ1, найденное в настоящей работе, не отличается достоверно от аналогичного соотношения для выборок из ряда других популяций. Так как указанное соотношение наблюдается при различных спектрах мутаций в гене БЯСЛ1, этот результат дополнительно показывает, что положение мутации в гене БЯСЛ1 не является фактором, определяющим локализацию рака.

6. Семьи с раком молочной железы и яичников гетерогенны по встречаемости мутаций в гене БЯСЛ1. Частота мутаций в семьях, включающих четыре и более случаев рака только молочной железы, достоверно понижена по отношению к остальным семьям в выборке. Частота мутаций среди семей с РМЖЯ (61%) достоверно выше, чем среди семей с РМЖ (16%).

7. Частоты генотипов между группами пробандов с мутациями и без мутаций в гене БЯСЛ1 различны и отличаются в этих группах от соответствующих популяционных частот. Найденные различия частот могут отражать ассоциацию вариантов гена БЯСЛ1 с вариантами другого гена.

Список работ» опубликованных по теме диссертации:

Статьи:

1. Карпухин А.В., Поспехова Н.И, Любченко Л.Н., Логинова А.Н., Хомич Е.В., Будилов А.В., Сергеев А.С., Захарьев В.М., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в гене BRCA1 при наследственно обусловленном раке молочной железы и яичников// ДАН. -2002. - Т.383, №5. - С.706-709.

2. Карпухин А.В., Логинова А.Н., Хомич Е.А., Поспехова Н.И. Наследственная предрасположенность к раку молочной железы// Медицинская генетика. -2002. - Т. 1, № 6. - С.254-261.

3. Логинова А.Н., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., Будилов А.В., Захарьев В.М., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Спектр мутаций в гене BRCA1 при наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников в российских семьях// Бюллетень эксп. биол. и мед. - 2003. -Т.136,№9.-С.315-317.

4. Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Гетерогенность семей с наследственной предрасположенностью к раку молочной железы и яичников по встречаемости мутаций в гене BRCA1// Медицинская генетика. - 2003. -№11.-С.459-463.

Тезисы конференций, симпозиумов и т.д.:

1. Карпухин А.В., Поспехова Н.И, Любченко Л.Н., Логинова А.Н., Хомич Е.В., Будилов А.В., Полтараус А.Б., Захарьев В.М., Гинтер Е.К., Гарькавцева Р.Ф. Наследуемые вариации структуры генов BRCA1/2, ответственных за предрасположеннрсть к раку молочной железы. Второй (четвертый) российский съезд медицинских генетиков. Курск, 2000, С. 266-267.

2. Логинова А.Н., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., Хомич Е.В., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Структурные особенности гена BRCA1, связанные с предрасположенностью к раку молочной железы или яичников. II Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, 2001, С.15.

3. Karpukhin A.V., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Loginova A.N., Khomich E.V., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Garkavtseva R.F., Ginter E.K. Association of BRCA1 gene single nucleotide polymorphisms with the occurrence of breast or ovarian cancer in families under inherited predisposition. The 3 rd International Workshop on Advanced Genomics SNP's: Application and Related Technologies, 2000, Yokohama, Japan, P. 147.

4. Karpukhin A.V., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Loginova A.N., Khomich E.V., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Garkavtseva R.F., Ginter E.K. Inherited variations of BRCA1 gene in breast/ovarian cancer families and family phenotype. The 3 HUGO Pacific Meeting and the 4 Asia-Pacific Conference on Human Genetics Shanghai, China, 2000, P. 123.

5. Loginova A.N., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Khomich E.V., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Ginter E.K., Garkavtseva R.F., Karpukhin A.V. New sequence variations of BRCA1 gene correlative to breast/ovarian cancer family phenotype. 4 International Balkan Meeting on Human Genetics, 2000, Novi Sad, Yugoslavia,

6. Loginova A.N., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Khomich E.V., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Ginter E.K., Garkavtseva R.F., Karpukhin A.V. Mutations and Sequence Variations of BRCA1 Gene in Breast/Ovarian Cancer Families from Russia. Eur. J. Hum Genet., 2001, v. 9, suppl. 1, P. 115.

7. Karpukhin A.V., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Loginova A.N., Khomich E.V., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Garkavtseva R.F., Ginter E.K. The Occurrence Of Breast Or Ovarian Cancer In Families Under Inherited Predisposition Is Associated With Single Nucleotide Polymorphisms Of BRCA1 Gene. Eur. J. Hum Genet., 2001, v. 9, suppl. 1, P. 114-115.

8. Loginova A.N., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Khomich E.V., Kuzmina I.V., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Ginter E.K., Garkavtseva R.F., Karpukhin A.V. Association of 5382insc mutation with SNP's of brcal gene and the mutation frequency in Russia. Abstract Of European Human Genetics Conference 2002. Europ. J. Human Genet. 2002, v. 10 - Suppl. 1, P.85.

9. Loginova A.N., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Ginter E.K., Garkavtseva R.F., Karpukhin A.V. Analysis of genetic heterogeneity breast cancer families by BRCA1/2 gene mutations and single nucleotide polymorphisms. Eur.J.Hum.Gen. - 2003. - V.I 1. Suppl. 1. - P.66.

10.Karpukhin A.V., Loginova A.N., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Garkavtseva R.F., Ginter E.K. The combination of BRCA1 and BRCA2 variants is associated with risk of familial breast cancer among probands without BRCA1/2 mutations , 14th General Meeting of the BCLC/ICG-FBOC - The Breast Cancer Linkage Consortium - Madrid, Spain. - 2003. Abstr. P.41.

P.326.

Служба множительной техник» ГУ РОНЦ им НН Блохина РАМН Подписано в печать 19 .05 .04 Заказ К» 191 Тираж 100 зн

- 1 48 26

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Логинова, Анна Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Ген BRCA1 - супрессор опухолевого роста.

2. Структура и функции гена BRCA 1.

2.1. Структура гена BRCA 1.

2.2. Функции гена BRCA1.

2.2.1. Роль BRCA 1 в репарации ДНК.

2.2.2. PcmbBRCAl в регуляции транскрипции.

2.2.3. Участие BRCA1 в контроле клеточного цикла.

3. Механизмы злокачественной трансформации клетки при дефектах гена BRCA 1.

4. Мутации в гене BRCА1.

4.1. Общие характеристики мутаций.

4.2. Номенклатура вариаций.

4.3. Спектр мутаций в гене BRCA 1.

4.4. Частоты встречаемости мутаций в генах BRCA 1/2.

5. Полиморфизмы в гене BRCA1.

5.1. Критерии полиморфизмов.

5.2. Исследование полиморфизмов в гене BRCA1.

6. Методы идентификации мутаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Пациенты.

2. Анализ первичной структуры гена BRCA1.

2.1. Выделение ДНК.

2.2. ПЦР (полимеразная цепная реакция).

2.3. Электрофорез.

2.4. Окраска геля.

2.5. Секвенирование.

2.6. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Выявление особенностей первичной структуры ДНК в гене BRCА1.

2. Спектр мутаций в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы.

3. Спектр мутаций в гене BRCA1 при семейном раке яичников.

4. Гетерогенность семей с раком молочной железы и яичников по встречаемости мутаций в гене BRCA1.

5. Характеристика однонуклеотидных полиморфизмов в rEHEBRCAl.

6. ДНК-диагностика наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ наследственной формы рака молочной железы и/или яичников"

Рак молочной железы (РМЖ) относится к наиболее распространенным онкологическим заболеваниям. В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди женщин в России рак этой локализации занимает 1-е место (рис.1), а в структуре смертности — 2-е [Аксель и др., 2002].

Ежегодно в мире выявляют около 1 миллиона новых случаев, прогнозируя рост числа заболевших к 2010 году до 1,45 миллиона. Вероятность заболеть раком молочной железы в России на протяжении предстоящей жизни для новорожденной девочки составляет 3,5%, умереть от него - 1,8%. В структуре онкологической заболеваемости женщин доля этой локализации варьирует в экономически развитых странах Европы от 25,7% в Испании до 34,3% во Франции, которая занимает первое ранговое место. В России доля этой формы рака составила в 2000 году 19,3% (рис.1).

Доля заболеваний вследствие высокого генетически обусловленного риска оценивается в 5 -10% всех случаев рака молочной железы на протяжении жизни людей и составляет более трети случаев рака молочной железы в возрасте до 30 лет [Claus et al., 1991]. Наследственная предрасположенность к раку молочной железы проявляется в накоплении случаев указанного заболевания в семьях. Наряду с раком молочной железы в таких семьях нередко наблюдается также рак яичников. Коренные сдвиги в понимании этого явления произошли в последнее десятилетие. Аутосомно-доминантное наследование рака молочной железы было показано в семьях с высоким риском этого заболевания [Newman et al., 1988]. Вскоре в области хромосомы 17q21 был картирован ген BRCA1 [Hall et al., 1990; Claus et al., 1991], выделенный в 1994 г. [Miki et al., 1994], который ответственен за наследственную предрасположенность к раку молочной железы и яичников. Спустя 2 года был клонирован второй ген, обусловливающий наследование повышенного риска рака молочной железы -BRCA2, локализованный в районе хромосомы 13ql2 [Tavtigian et al., 1996]. Результаты клонирования были подтверждены при анализе мутаций в выделенных генах у больных с семейной историей рака молочной железы [Castilla et al., 1994; Tavtigian et al., 1996]. Наибольшая доля наследуемых форм рака молочной железы и/или яичников связана с мутациями в гене BRCA1 [Ford et а1.,1998]. Мутации данного гена являются высокопенетрантными и приводят к 50-90% риску возникновения заболевания [Antoniou et al., 2002].

За прошедший после выделения генов период накоплена значительная информация о наследуемых мутациях в гене BRCAL Известно, в частности, что мутации распределены по всему гену. В то же время, наблюдается популяционная зависимость в распределении мутаций. В этой связи, определение спектра мутаций в различных популяциях важно как с фундаментальной точки зрения, так и для решения практических задач медицинской генетики. Изучение характеристик мутаций на выборках из разных популяций позволит получить фундаментальную информацию по возникновению и распространению мутаций, их связи с клиническими проявлениями в составе разных генотипов. Семьи с наследственной предрасположенностью гетерогенны как по отягощенности раком яичников наряду с раком молочной железы, так и по числу пораженных заболеванием членов семьи. Эти характеристики семей могут быть связаны с вероятностью обнаружения мутации в гене BRCA1. Учитывая различия спектров мутаций в гене BRCA1 в разных популяциях, изучение наследуемых мутаций в связи с указанными характеристиками семей представляет существенный интерес. Такая информация важна, например, для выяснения возможной зависимости риска возникновения рака различной локализации молочная железа кожа желудок ободочная кишка тело матки шейка метки яичник прямая кишка легкое гемобластозы поджелудочная железа 1

J 9,3

Bi-V: 6,6

S,5

5,3 5

4,8 ft A t I

4,2

2/i

12.?

Женщины

Рис. 1. Структура заболеваемости населения России злокачественными новообразованиями в 2000 году (%) приводится в соответствии с работой Аксель и др., 2002).

1985 1990 1999

Рис. 2. Доля IV стадии в структуре РМЖ по данным работы Трапезников и др., 2001). молочной железы или яичников) от положения мутации в гене [Thompson et al., 2002], а также выяснения взаимосвязи мутаций в данном гене с другими особенностями их клинического проявления. Помимо мутаций в гене BRCA1 обнаруживают ряд полиморфизмов. В ряде работ представлена информация по полиморфизмам в этом гене, но их анализ при семейном раке молочной железы и яичников пока нельзя признать достаточным. В частности, не ясна связь однонуклеотидных полиморфизмов гена BRCA1 с мутациями данного гена.

Определение спектра мутаций в гене BRCA1 и решение других указанных вопросов важно не только с фундаментальной точки зрения, но и для решения практических медико-генетических задач. Актуальность для практики обусловлена в частности тем, что смертность от РМЖ, являющаяся высокой, постоянно растет. Основной причиной высокой смертности больных раком молочной железы и яичников является позднее выявление болезни. Доля больных с IV стадией заболевания в структуре заболеваемости раком молочной железы неуклонно растет (рис.2) [Трапезников и др., 2001]. Следовательно, вопросы своевременной диагностики и профилактики рака молочной железы и яичников весьма актуальны, так как запоздалая клиническая диагностика во многих случаях этого онкологического заболевания обусловливает существенное сокращение продолжительности жизни, несмотря на лечение.

Изучение генов BRCA1 и BRCA2, ответственных за наследственную предрасположенность к раку молочной железы и яичников, создает принципиально новые возможности медико-генетического консультирования и профилактики при этом заболевании. Выявление мутаций в гене BRCA1 обеспечивает объективный критерий для формирования групп риска рака молочной железы с целью его профилактики и своевременной диагностики в случае возникновения заболевания. Более ранний возраст рака молочной железы и его высокая доля вследствие высоко пенетрантных наследуемых мутаций дополнительно акцентирует важность изучения соответствующих генов и практического использования полученных результатов. Создание ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников весьма важно и создает базу для формирования групп риска и развития профилактики на принципиально новой основе.

В связи со сказанным, целью настоящей работы было исследование мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов в гене BRCA1 при наследственных формах рака молочной железы и яичников.

Были поставлены следующие задачи:

• изучить спектр мутаций в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы и яичников;

Научно-практическая значимость работы.

Научно-практическая значимость результатов настоящей работы обусловлена выявлением спектра мутаций в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы и яичников. Выявленное преобладание одной мутации в спектре имеет существенное значение для практической ДНК-диагностики наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников. Указанный феномен обеспечивает возможность проведения скрининговых исследований на предрасположенность к указанному заболеванию. Разработан оптимизированный способ обнаружения наиболее частых мутаций в гене BRCA1. Способ был применен для выявления мутаций в семьях с повышенным риском к раку молочной железы и яичников.

Новизна полученных результатов.

Впервые изучен спектр мутаций в гене BRCA1 на выборке семейного рака молочной железы и яичников в России. Показано, что частота мутации 5382insC является наибольшей по сравнению с выборками из других популяций. На основании результатов по частотам гаплотипов, охарактеризованных по ОНП, при мутации 5382insC и анализа частот встречаемости данной мутации в европейских странах выдвинута концепция о происхождении мутации 5382insC в европейской части России. Выявленное преобладание мутации 5382insC как при семейном раке молочной железы, так и яичников, а также результаты анализа соотношения семей с РМЖ, включающих и не включающих РЯ, свидетельствует об отсутствии определяющего влияния положения мутации в гене BRCA1 на локализацию рака. Анализ ОНП в гене BRCA1 при мутациях и без мутаций в данном гене среди пробандов с РМЖ или РЯ позволил сформулировать гипотезу об ассоциации гена BRCA1 с другим геном, предположительно, с геном BRCA2.

Положения, выносимые на защиту.

Изучены спектры мутаций и ОНП в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы и яичников. Найденные частоты мутаций при семейном раке молочной железы и яичников составили 32%, при семейном раке только яичников - 86%. В спектре мутаций в гене BRCA1 преобладает мутация 5382insC. Частота данной мутации является наибольшей из выявленных на выборках из других популяций. Мутация 5382insC преобладает как при семейном РМЖ, так и при семейном РЯ. Семьи с раком молочной железы и яичников гетерогенны по частотам встречаемости мутаций в гене BRCA1. Частота мутаций в гене BRCA1 в семьях, включающих четыре и более случаев рака только молочной железы, достоверно понижена по отношению к остальным семьям в выборке. Показано преобладание встречаемости мутаций среди семей с РМЖЯ - мутации найдены у 61% таких семей. Среди семей с РМЖ мутации найдены у 16% семей. Показано различие частот генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам между группами пробандов с мутациями и без мутаций в гене BRCA1. Показано, что частоты генотипов в группе пробандов с раком молочной железы или яичников, но без мутаций в гене BRCA1, отличаются от соответствующих популяционных частот.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Логинова, Анна Николаевна

выводы

1. Частота мутаций в гене BRCA1 в семьях, отягощенных раком молочной железы и яичников составила 32% и в семьях с раком только яичников - 86%.

2. В выявленном спектре мутаций в гене BRCA1 при семейном раке молочной железы и яичников преобладает мутация 5382insC с частотой 94%.

3. Гаплотипы гена BRCA1, изученные по однонуклеотидным полиморфизмам, при мутации 5382insC в России совпадают с таковыми среди европейцев. Аналитически выявлено снижение частоты этой мутации по мере удаления от европейской части России. Эти данные могут указывать на происхождение мутации 5382insC в европейской части России.

4. Мутация 5382insC в гене BRCA1 преобладает также при семейном раке только яичников с частотой в спектре, составляющей 50%. Следовательно, одна и та же мутация приводит к семейному раку как молочной железы, так и яичников, что свидетельствует об отсутствии связи типа рака с положением мутации в гене.

5. Соотношение семей с раком молочной железы и раком яичников (РМЖЯ) и с раком только молочной железы (РМЖ) при мутациях в гене BRCA1, найденное в настоящей работе, не отличается достоверно от аналогичного соотношения для выборок из ряда других популяций. Так как указанное соотношение наблюдается при различных спектрах мутаций в гене BRCA1, этот результат дополнительно показывает, что положение мутации в гене BRCA1 не является фактором, определяющим локализацию рака.

6. Семьи с раком молочной железы и яичников гетерогенны по встречаемости мутаций в гене BRCA1. Частота мутаций в семьях, включающих четыре и более случаев рака только молочной железы, достоверно понижена по отношению к остальным семьям в выборке. Частота мутаций среди семей с РМЖЯ (61%) достоверно выше, чем среди семей с РМЖ (16%).

7. Частоты генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам между группами пробандов с мутациями и без мутаций в гене BRCA1 различны и отличаются в этих группах от соответствующих популяционных частот. Найденные различия частот могут отражать ассоциацию вариантов гена BRCA1 с вариантами другого гена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В настоящей работе исследована первичная структура гена BRCA1 в семьях с наследственной предрасположенностью к раку молочной железы и/или яичников, изучена взаимосвязь выявленных мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов в гене BRCA1, а также взаимосвязь мутаций с клиническими характеристиками семей. Было найдено, что мутации в гене BRCA1 присутствуют у 32% семей с предрасположенностью к раку молочной железы и яичников и у 59% семей с раком только яичников. В спектре мутаций в гене BRCA1 среди таких семей мы обнаружили существенное преимущество одной мутации в 20 экзоне - 5382insC. При семейном раке молочной железы и яичников доля этой мутации составила 94%, при раке только яичников — 60%. Рассматривая столь высокий процент одной мутации в спектре, следует отметить, что для анализа особенностей первичной структуры гена BRCA1 была использована высокочувствительная методика, позволившая выявить большое количество полиморфизмов. Ряд этих полиморфизмов связан с различными заменами одного нуклеотида, полиморфизмы рассеяны по всему гену и расположены в разных участках анализируемых фрагментов ДНК. Суммарная доля мутаций в гене BRCA1, обнаруженная в нашей выборке, значительно выше, чем суммарная доля мутаций, выявленная в других выборках, при аналогичных критериях их формирования. Например, в странах западной Европы частота мутаций в гене BRCA1 при семейном РМЖ и РЯ, как правило, составляет 20-25%. В то время как при семейном РМЖ и РЯ доля иных, помимо 5382insC, мутаций составляет менее 10%, при раке только яичников доля иных мутаций составляет около 40%.

Столь высокая частота одной мутации не является уникальной особенностью выборки только из нашей популяции. Так, мутация 185deLAG составляет около 80% спектра мутаций в гене BRCA1 среди евреев ашкенази [Brody, Biesecker, 1998]. Мутация 999del5 в гене BRCA2 является доминирующей в Исландии [Barkardottir, et.al., 2001] и составляет 33% всех мутаций в этом гене в Финляндии [Sarantaus, Huusko, 2000].

Мутация 5382insC обнаружена во многих европейских странах (табл.1), причем в некоторых из них является наиболее распространенной. Наиболее резко, по отношению к частоте мутации 5382insC в европейской части России, встречаемость этой мутации убывает в северном и западном направлениях Европы - в Финляндии, Дании, Голландии, Англии представленность мутации 5382insC находится в пределах 3 - 5%. В Швеции мутация 5382insC уже не встречается. Частоты, наиболее близкие к наблюдаемым в России, найдены в Латвии, Польше, Чехословакии, Венгрии и Югославии - 40 - 60%. В Греции и Турции частота мутации 5382insC близка к 30%. В более западных по отношению к России странах - Германии, Франции, Италии встречаемость мутации 5382insC составляет 10 -20%, убывая в указанных пределах к югу от Германии. В Испании мутация 5382insC не найдена. Следовательно, наибольшая распространенность мутации 5382insC наблюдается в юго-западном и южном направлении по отношению к европейской части России, причем отчетливо прослеживается градиент убывания частоты этой мутации, с наиболее плавным убыванием в направлении на Балканы. В странах Азии и Южной Америки мутацию 5382insC не находят.

Найденная нами максимальная из известных частота мутации 5382insC и характеристики ее распространенности в Европе указывают на происхождение этой мутации в европейской части России. В пользу этого говорит также показанная в настоящей работе одинаковость частот гаплотипов по однонуклеотидным полиморфизмам гена BRCA1 при мутации 5382insC в России и среди европейцев. Кроме того, гаплотипирование по микросателлитным маркерам свидетельствует об эффекте основателя в происхождении этой мутации [Neuhausen et al., 1996; Szabo et al., 2003].

В последние годы в мировой литературе активно обсуждается вопрос о возможной связи локализации наследственно обусловленного рака (молочной железы или яичников) с положением мутации в гене BRCA1. В частности, были утверждения о том, что возникновение РМЖ или РЯ зависит от близости мутации к какому-либо из концов гена BRCA1 [Gayther et al., 1995]. В другой работе находили наибольшую вероятность РЯ при положении мутации в средней части гена BRCA1 [Thompson, Easton,2002]. Некоторые авторы не обнаруживали достоверной зависимости обсуждаемого параметра от положения мутации в гене BRCA1 [Stoppa-Lyonnet et al., 1997]. В нашем исследовании оказалось, что одна и та же мутация - 5382insC -является преобладающей и при наследственной форме рака молочной железы или яичников, и при раке только яичников. Более того, проведенный сравнительный анализ клинических характеристик семей с раком молочной железы или яичников и с мутациями в гене BRCA1 в нашей выборке с характеристиками семей ряда выборок из других популяций, показал устойчивость соотношения семей с РМЖЯ и с РМЖ. Указанные соотношения для выборок из других популяций не отличались достоверно от найденного нами соотношения, несмотря на различия спектров мутаций в гене BRCA1 во всех проанализированных выборках. В целом, наши данные показывают, что положение мутации в гене BRCA1 не является определяющим локализацию рака фактором. По-видимому, другие генотипические особенности определяют тип заболевания.

Значение факта обнаружения при семейном раке только яичников двух мутаций, которые не были найдены при семейном раке молочной железы или яичников - 2080delA и 4154delA - в настоящее время не ясно и требует дальнейших исследований.

Выборка семей с раком молочной железы и яичников включает в себя семьи как с РМЖЯ, так и с РМЖ только. Анализ таких семей показал, что частота встречаемости мутаций в гене BRCA1 среди семей с только РМЖ составила - 16%, среди семей с раком молочной железы, где встречается еще и рак яичников - 61%. Следовательно, наличие в семье рака яичников, независимо от присутствия рака молочной железы, с большей вероятностью указывает на наличие мутации в гене BRCA1.

Далее связь характеристик мутаций с клинико-генетическими параметрами семей изучали, исследуя частоты мутаций в семьях определенного типа. В выборке семейного рака молочной железы и яичников 36% составили семьи, отягощенные РМЖЯ. Соответственно, 64% семей были отягощены только РМЖ.

Интересной особенностью распределения мутаций в гене BRCA1 среди семей в нашей выборке оказалась достоверно пониженная их частота в семьях с РМЖ с не менее чем четырьмя случаями данного заболевания. Более низкая частота мутаций в семьях этого типа наблюдается как по отношению к остальной части выборки, так и по отношению к семьям с РМЖЯ с таким же числом случаев заболевания. Проведенная нами статистическая оценка на основе представленных в опубликованных работах данных показала, что, например, во Франции [Stoppa-Lyonnet et al., 1997] частота мутаций в гене BRCA1 в семьях с не менее чем четырьмя случаями только рака молочной железы достоверно ниже, чем частота мутаций в остальной части выборки. В то же время, в Финляндии [Vehmanen et.al., 1997] сопоставление аналогичных характеристик не выявило достоверных отличий в рассматриваемых частотах мутаций в гене BRCA1. Следовательно, феномен пониженной частоты мутаций в гене BRCA1 среди семей с РМЖ с 4 и более случаями характерен для ряда популяций, но не является всеобщим. По-видимому, генотипические особенности некоторых популяций оказывают определенное влияние на проявление мутаций в гене BRCA1.

Указанный факт низкой частоты мутаций в гене BRCA1 среди семей с РМЖ с 4 и более случаями резко контрастирует с тем, что наибольшее число мутаций в гене BRCA1 было найдено в семьях, включающих четыре и более случаев заболевания РМЖЯ - 62% от всех мутаций, в то время как доля таких семей в выборке составила 28%. Выявленное различие в частотах мутаций среди семей с четырьмя и более случаями данных раковых заболеваний, включающих либо не включающих рак яичников, статистически значимо (Р < 0,002, точный критерий Фишера).

Достоверной зависимости частоты мутаций в гене BRCA1 от числа заболевших членов семьи нами не было обнаружено, хотя среди пробандов из семей с РМЖЯ и РМЖ с четырьмя и более случаями заболеваний частота мутаций в гене BRCA1 была примерно в два раза выше, чем в семьях с двумя-тремя случаями. Эти данные соответствуют результатам, полученным на некоторых других выборках [Stoppa-Lyonnet D et al.,1997, Vehmanen et al., 1997]. Видимо, иные характеристики [German Consortium for Hereditary Breast and Ovarian Cancer, 2002], помимо количества пораженных родственников в семье (или дополнительно к данному клиническому параметру), могут достоверно указывать на повышенную вероятность наличия мутации в гене BRCA1.

Как уже отмечалось, в выборке семейного рака молочной железы и яичников частота мутаций в гене BRCA1 составила 32%, при только раке яичников - 86%. В то же время, при анализе частоты мутаций в гене BRCA1 среди семей с РМЖЯ и РМЖ независимо от числа случаев рака в семье показано преобладание встречаемости мутаций среди семей с РМЖЯ - мутации найдены у 61%. Среди семей с РМЖ мутации найдены у 16% семей. Без учета семей с РМЖ с четырьмя и более случаями рака данная доля равна 21%. Следовательно, частота мутаций при РМЖЯ близка частоте мутаций при только РЯ. То есть, особенностью отягощенной раком семьи, определяющей вероятность присутствия мутации в гене BRCA1, является не отсутствие в семье рака молочной железы, как при семейном раке яичников, а возникновение в семье рака яичников, независимо от наличия рака молочной железы.

Вероятность предрасположенности к раку молочной железы и яичников вследствие наследования мутации в гене BRCA1 не связана достоверно с числом заболевших родственников в семье. Значимой характеристикой в этом плане является наличие в семье заболевших раком яичников. Если в семье есть заболевшие раком яичников, то вероятность присутствия мутации в гене BRCA1 существенно выше по сравнению с семьей, в которой у всех заболевших рак локализован только в молочной железе. Как следует из результатов сравнительного анализа, такое соотношение характерно для ряда популяций. Величина этого соотношения сохраняется, несмотря на различие спектров и частот мутаций в гене BRCA1 в выборках из разных популяций. В то же время, в соответствии с нашими данными, вероятность мутаций в гене BRCA1 существенно понижена среди семей, наследующих только рак молочной железы при четырех и более случаях заболевания в семье. Данная закономерность присуща также некоторым другим, но не всем популяциям в Европе.

Помимо мутаций, в гене BRCA1 был найден широкий набор полиморфизмов. Всего было обнаружено 14 вариантов. Экзонных вариантов найдено 8, из них 5 (P871L, E1038G, S1040N, К1183R и S1613G) приводят к замене аминокислоты. Наиболее частыми вариантами структуры гена BRCA1 оказались два варианта, обозначенные как гаплотип А и гаплотип В. Гаплотип А представляет собой последовательность нуклеотидов, относительно которой определяются полиморфные варианты. Этот вариант именуют консенсусным. Гаплотип В содержит 11 вариантов ОНП, находящихся в строгом неравновесии по сцеплению.

Частота гаплотипа В в контрольной выборке составила 32%, что не отличается достоверно от соответствующей частоты среди больных с семейным раком молочной железы и яичников. Наряду с этим, показана статистически достоверная преимущественная ассоциация мутации 5382insC с гаплотипом А.

Сравнение встречаемости генотипов, включающих гаплотип В, среди пробандов с мутациями в гене BRCA1 и без таковых выявило значимые различия. Частота генотипа АА оказалась почти в 6 раз ниже среди пробандов без мутаций (RR = 5,75; Р < 0,008). Частоты гаплотипов в этих группах пробандов также значимо различались. Обнаружено достоверное снижение частоты генотипа АА среди пробандов без мутаций в гене BRCA1 по сравнению с контролем (RR = 3,25; Р = 0,03;).

Следовательно, наблюдаются различия в частотах генотипов как между группами пробандов с мутациями и без мутаций в гене BRCA1, так и в группе пробандов с раком молочной железы или яичников, но без мутаций в гене BRCA1, по сравнению с популяционными частотами.

Причиной сдвига частот генотипов по гену BRCA1 в группе пробандов без мутаций может являться ассоциация его вариантов с вариантами другого гена. Наиболее вероятным кандидатом на роль ассоциирующего гена представляется BRCA2.

Рак молочной железы является одной из главных причин женской смертности от онкологических заболеваний во всём мире. На сегодняшний день не существует достаточно эффективных методов лечения уже сформированного рака молочной железы. Многие опухоли выявляются слишком поздно, поэтому ранняя диагностика рака молочной железы необходима для эффективного лечения, что позволит снизить смертность от этого заболевания.

Одним из эффективных подходов для ранней диагностики и профилактики является ДНК-диагностика наследственных заболеваний, то есть выявление мутаций в генах, ответственных за развитие данного заболевания. Наследственная форма рака молочной железы и яичников в значительном числе случаев является результатом мутаций в гене BRCA1. При обнаружении мутаций в этом гене человек должен находиться под диспансерным наблюдением, что, как минимум, позволит обнаружить заболевание на ранней стадии развития и, тем самым, позволит избежать тяжких последствий.

ДНК-диагностику, с помощью, например, разработанного в данной работе способа, но и проводить скрининговые исследования для формирования группы повышенного риска. Полученные данные по связи клинических и генетических характеристик семей с вероятностью наличия мутации в гене BRCA1, позволяют повысить эффективность ДНК-диагностики и медико-генетического консультирования при семейном раке молочной железы и яичников.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Логинова, Анна Николаевна, Москва

1. Аксель Е.М., Давыдов М.И. Статистика заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований в 2000 году// сборник "Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2000" г. Москва, РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2002. - С.85-106.

2. Горбунова В.Н., Баранов B.C.: Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб. 1997.

3. Комарова Л.Е. Скрининг рака молочной железы// Современная онкология. -2002. Т.4, №2.

4. Трапезников Н.Н., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ// М. 2001.

5. Шайн А.А. Опухоли грудной клетки. Тюмень: Поиск. - 2001. - Т.2. - С. 5-87.

6. Antoniou А.С., Gayther S.A., Stratton J.F., Ponder B.A.J., Easton D.F. Risk models for familial ovarian and breast cancer// Genet. Epidemiol. 2000. - V.18. - P.173-190.

7. Antoniou A.C., Pharoah P.D.P., McMullan G., et al. A comprehensive model for familial breast cancer incorporating BRCA1, BRCA2 and other genes// British Journal of Cancer. 2002. - V.86. - P.76-83.

8. Balci A., Huusko P., Paakkonen K. Mutation analysis of BRCAI and BRCA2 in Turkish cancer families: a novel mutation BRCA2 3414del4 found in male breast cancer// Eur. J. Can. 1999. - V.35, № 5. - P.707-710.

9. Barkardottir R. В., Sarantaus L., Arason A., et al. Haplotype analysis in Icelandic and Finnish BRCA2 999del5 breast cancer families// Europ. J. Hum. Genet. 2001. -V.9. - P.773-779.

10. Beaudet A.L., Tsui L.C. A suggested nomenclature for designating mutations// Hum. Mutat. 1993. - V.2. - P.245-248.

11. Bell D.W., Erban J., Sgroi D.C., Haber D.A. Selective loss of heterozygosity in multiple breast cancers from a carrier of mutations in both BRCAI and BRCA2// Cancer Res. 2002. - V.62, № 10. - P. 2741-2743.

12. Bergthorsson J.T., Ejlertsen В., Olsen J.H., et al. BRCAI and BRCA2 mutation status and cancer family history of Danish women affected with multifocal or bilateral breast cancer at a young age// J. Med. Genet. 2001. - V.38. - P.361-368.

13. Blesa J.R., Hernandez-Yago J. Adaptation of conformation-sensitive gel•rwelectrophoresis to an ALFexpress DNA sequencer to screen BRCAI mutations// Bio Techniques. -2000. -V.28. P. 1019-1025.

14. Brody L.C., Biesecker B.B. Breast cancer susceptibility genes BRCAI and BRCA2// Rev. in Molec. Medicine. 1998. - V.77, № 3. - P.208-226.

15. Castilla L. H., Couch F. J., Erdos M. R., et al. Mutations in the BRCAI gene in families with early-onset breast and ovarian cancer// Nature Genet. 1994. - V.8. -P.387-391.

16. Chapman M.S., Verma I.M. Transcriptional activation by BRCAI// Nature 1996. -V.382. - P.678-679.

17. Chen C.F., et al. The nuclear localization sequences of the BRCA1 protein interact with the importin-alpha subunit of the nuclear transport signal receptor// J. Biol. Chem. 1996. - V.271. - P.32863-32868.

18. Chen J., et al. Stable interaction between the products of the BRCA1 and BRCA2 tumor suppressor genes in mitotic and meiotic cells// Mol. Cell. 1998. - V.2. -P.317-328.

19. Claus E. В., Risch N., Thompson W. D., et al. Genetic analysis of breast cancer in the cancer and steroid hormone study// Am. J. Hum. Genet. 1991 - V.48. - P. 232-242.

20. Cortez D., et al. Requirement of ATM-dependent phosphorylation of Brcal in the DNA damage response to double-strand breaks// Science. 1999. - V.286. - P.l 162— 1166.

21. Csokay В., Tihomirova L., Stengrevics A., Sinicka O., Olah E. Strong founder effects in BRCA1 mutation carrier breast cancer patients from Latvia// Hum. Mut. Mutation in Brief. Online. 1999. - V.258. - P. 1-6.

22. Curci A., Capasso I., Romano A., et al. Characterization of 2 novel and 2 recurring BRCA1 germline mutations in breast and/or ovarian carcinoma patients from the area of Naples// Int. J. One. 2002. - V.20, № 5. - P.963-970.

23. De Jong M.M., Nolte I.M., te Meerman G. J. et al. Genes other than BRCA1 and BRCA2 involved in breast cancer susceptibility// J. Med. Genet. 2002. - V.39. -P.225-242.

24. Deffenbaugh A. M., Frank T.S., Hoffman M., Cannon-Albright L., Neuhausen S.L. Characterization of common BRCA1 and BRCA2 variants// Gen. Test. 2002. - V.6, №2.-P.l 19-121.

25. Deng C.X. Roles of BRCA1 in centrosome duplication// Oncogene. 2002. - V.21. -P.6222-6227.

26. Deng C.X., Brodie S.G. Roles of BRCA1 and its interacting proteins// Bioessays. -2000. V.22. - P.728-737.

27. Deng C.X., Wang R.-H. Roles of BRCA 1 in DNA damage repair: a link between development and cancer// Hum. Mol. Genet. 2003. - V.12. - P.l 13-123.

28. Diez O., Cortes J., Domenech M. BRCA1 mutation analysis in 83 Spanish breast and breast/ovarian cancer families// Int. J. Can. 1999. - V.83. - P.465-469.

29. Dunning A.M., Chiano M., Smith N. R., et. al. Common BRCA1 variants and susceptibility to breast and ovarian cancer in the general population// Hum. Mol. Gen. 1997. - V.6, №2. - P.285-289.

30. Durocher F., Shattuck-Eidens D., McClure M., et. al. Comparison of BRCA 1 polymorphisms, rare sequence variants and/or missense mutations in unaffected and breast/ovarian cancer populations// Hum. Mol. Genet. 1996. - V.5, №6. - P.835-842.

31. Elledge S.J., Amon A. The BRCA1 suppressor hypothesis: An explanation for the tissue-specific tumor development in BRCA1 patients// Can. Cell. 2002. - V.l. -P.129-132.

32. Ellis D., Greenman J., Hodgson S., et. al. Low prevalence of BRCA1 mutations in early onset breast cancer without family history// J.Med.Genet. 2000. - V.7. -P.792-794.

33. Fan S., Ma Y.X., Wang C., et. al. Role of direct interaction in BRCA1 inhibition of estrogen receptor activity// Oncogene. 2001. - V.20. - P.77-87.

34. Fan S., Wang J., Yuan R., et. al. BRCA1 inhibition of estrogen receptor signaling in transfected cells// Scien. 1999. - V.284. -P.1354-1356.

35. Fleming M.A., Potter J.D., Ramirez C. J., Ostrander G.K., Ostrander E.A. Understanding missense mutations in the BRCA1 gene: an evolutionary approach// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V.l00, № 3. - P. 1151-1156.

36. Ford D., Easton D. F., Stratton M., et al. Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer families// Am. J. Hum. Genet. 1998. - V.62. - P.676-689.

37. Ganguly A., Williams C. Detection of mutations in multi-exon genes: comparision of conformation sensitive gel electrophoresis and sequencing strategies with respect to cost and time for finding mutations// Hum. Mutat. 1997. - V.9. - P.339-343.

38. Gao Q., Adebamowo C.A., Fackenthal J. Protein truncating BRCA1 and BRCA2 mutations in African women with pre-menopausal breast cancer// Hum. Genet. -2000. V. 107. - P. 192-194.

39. Gayther S. A., Harrington P., Russell P., Kharkevich G., Garkavtseva R. F., Ponder B. A. J. Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia// Am. J. Hum. Genet. 1997. - V.60. - P.1239-1242.

40. Gayther S. A., Warren W., Mazoyer S., et al. Germline mutations of the BRCA1 gene in breast and ovarian cancer families provide evidence for a genotype-phenotype correlation// Nature Genet. 1995. - V.l 1. - P.428-433.

41. Ginolhac S.M., Gad S., Corbex M., et. al. BRCA1 wild-type allele modifies risk of ovarian cancer in carriers of BRCA1 germ-line mutations// Can. Epidem., Biom.& Prev. 2003. - V.12. - P.90-95.

42. Goelen G., Teugels E., Bonduelle M., et. al. High frequency of BRCA1/2 germline mutations in 42 Belgian families with a small number of symptomatic subjects// J. Med. Gen. 1999. - V.36. - P.304-308.

43. Gorski В., Byrski Т., Huzarski Т., Jakubowska. Founder mutations in the BRCA1 gene in Polish families with breast-ovarian cancer// Am. J. Hum. Genet. 2000. -V.66. - P.1963-1968.

44. Hall J. M., Lee M. K., Newman В., et al. Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21// Science 1990. - V.250. - P.1684-1689.

45. Hamann U., Brauch H., Garvin A. M., Bastert G., Scott R.J. German family study on hereditary breast and/or ovarian cancer: germline mutation analysis of the BRCA1 gene// Genes, Chromos.& Cancer. 1997. - V.18. - P. 126-132.

46. Harkin D.P., Bean J.M., Miklos D., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1// Cell. 1999. -V.97. -P.575-586.

47. Hartman A.R., Ford J.M BRCA1 induces DNA damage recognition factors and enhances nucleotide excision repair// Nat.Genet. 2002. - V.32. - P. 180-184.

48. Healey С. S., Dunning A. M., Teare M. D., et al. A common variant in BRCA2 is associated with both breast cancer risk and prenatal viability// Nature Genet. 2000. - V.26. - P.362-364.

49. Hoffman J. D., Hallam S.E., Venne V.L., Lyon E., Ward K. Implications of a novel cryptic splice site in the BRCA1 gene// Am. J. Med. Genet. 1998. - V.80. - P. 140144.

50. Hollander M.C., Sheikh M.S., Bulavin D.V., et al. Genomic instability in Gadd45a-deficient mice//Nat. Genet. 1999. - V.23. - P.176-184.

51. Hsu L.C., White R.L. BRCA1 is associated with the centrosome during mitosis// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V.95. - P. 1283-12988.

52. Hu Z., Wu J., Liu C.H., et. al. The analysis of BRCA1 mutations in eastern Chinese patients with early onset breast cancer and affected relatives// Hum. Mut. 2003. -V.22, № 1.-P.104.

53. Huber L.J., Yang T.W., Sarkisian C.J., Master S.R., Deng C.X., Chodosh L.A. Impaired DNA damage response in cells expressing an exon 11-deleted murine Brcal variant that localizes to nuclear foci// Mol. Cell Biol. 2001. - V.21. - P.4005-4015.

54. Huttley G. A., Easteal S., Southey M. C., et al. Adaptive evolution of the tumour suppressor BRCA1 in humans and chimpanzees// Nature Genet. 2000. - V.25. -P.410-413.

55. Janezic S.A., Ziogas A., Krumroy L. M., et. al. Germline BRCA1 alterations in a population-based series of ovarian cancer cases// Hum. Mol. Genet. 1999. - V.8, №5.-P.889-897.

56. Jara L., Ampuero S., Seccia L., Bustamante M., Blanco R., Ojeda J.M. Analysis of 5382insC (BRCA1) and 6174delT (BRCA2) mutations in 382 healthy Chilean women with a family history of breast cancer// Biol. Res. 2002. - V.35, № 1. -P.85-93.

57. Jasin M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection// Oncogene. 2002. - V.21. - P.8981-8993.

58. Jensen R, Thompson M., Jetton Т., et al. BRCA1 protein products—antibody specificity. functional motifs . and secreted tumor suppressors—reply// Nat. Genet. 1996. - V.13. - P.269-272.

59. Jin Y., Xu X. L., Yang M.C.W., et. al. Cell cycle-dependent colocalization of BARD1 and BRCA1 proteins in discrete nuclear domains// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997.- V.94.- P. 12075-12080.

60. Johannsson O., Loman N., МбИег Т. Incidence of malignant tumours in relatives of BRCA1 and BRCA2 germline mutation carriers// Eur. J. Of Can. 1999. -V.35, №8. -P.1248-1257.

61. Kinzler K.V. and Vogelstein B. Cancer susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers. //Nature. 1997. V. 386. P. 761-763.

62. Konstantopoulou I., Kroupis C., Ladopoulou A., Pantazidis A., Boumba D., Lianidou E.S. BRCA1 mutation analysis in breast/ovarian cancer families from Greece// Hum. Mut. 2000. - V. 16, №3. P.272-273.

63. Kozlowski P., Sobczak K., Jasinska A., Krzyzosiak W.J. Allelic imbalance of BRCAI transcript in the IVS20 12-bp insertion carrier// Hum. Mut. 2000. - №.366. -P. 1-6. Online.

64. Ladopoulou A., Kroupis C., Konstantopoulou I., Ioannidou-Mouzaka L., Schofield A.C. Germline BRCA1/BRCA2 mutations in Greek breast/ovarian cancer families: 5382insC is the most frequent mutation observed// Can. Lett. 2002. - V.185, №1. -P.61-70.

65. Li S., Tseng H.-M., Yang T.-P. Molecular characterization of germline mutations in the BRCAI and BRCA2 genes from breast cancer families in Taiwan// Hum. Genet. 1999. -V. 104. -P.201-204.

66. Liede A., Malik I.A., Aziz Z., et. al. Contribution of BRCAI and BRCA2 mutations to breast and ovarian cancer in Pakistan// Am. J. Hum. Genet. 2002a. - V.71, №3. -P.595-606.

67. Liede A., Narod S. A., et. al. Hereditary breast and ovarian cancer in Asia: genetic epidemiology of BRCAI and BRCA2// Hum. Mut. 2002b. - V.20. - P.413-424.

68. Lorick K.L., et al. RING fingers mediate ubiquitinconjugating enzyme (E2)-dependent ubiquitination// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V.96. - P.l 136411369.

69. Machackova E., Foretova L., Navratilova M., Valik D., Claes K., Messiaen L. A high occurrence of BRCA1 and BRCA2 mutations among Czech hereditary breast and breast-ovarian cancer families// Cas. Lek. Cesk. 2000. - V.139, №20. - P.635-637.

70. Manguoglu A.E., Luleci G., Ozcelik Т., et al. Germline mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes in Turkish breast/ovarian cancer patients// Hum. Mutat. 2003. -V.21, №4. -P.444-445.

71. Maquat L.E. The power of point mutations// Nature Genet. 2001. - V.21. - P.5-6.

72. Miki Y., et al. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1// Science. 1994. - V.266. - P.66-71.

73. Moller P., Heimdal K., Apold J., et.al. Genetic epidemiology of BRCA1 mutations in Norway// Eur. J. Cancer. 2001. - V.37, №18. - P. 2428-2434.

74. Monteiro A.N., August A., Hanatusa H. Evidence for a transcriptional activation function of BRCA1 C-terminal region// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. - V.93. -P.13595-13599.

75. Monteiro A.N. A. BRCA1: the enigma of tissue-specific tumor development// TRENDS in Gen. 2003. - V. 19, №.6. - P.312-315.

76. Monteiro A.N.A., August A., Hanafusa H. Common BRCA1 variants and transcriptional activation// Am. J. Hum. Genet. 1997. - V.61. - P.761-762.

77. Nadeau G., Boufaied N., Moisan A., et al. BRCA1 can stimulate gene transcription by a unique mechanism// EMBO Reports. 2000. - V.l, № 3. - P.260-265.

78. Neuhausen S., Gilewski Т., Norton L., et al. Recurrent BRCA2 6174delT mutations in Ashkenazi Jewish women affected by breast cancer// Nature Genet. 1996. - V.13. -P. 126-128.

79. Newman В., Austin M.A., Lee M., King M.C. Inheritance of human breast cancer: Evidence for autosomal dominant transmission in high-risk families// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988. - V.85. - P.3044-3048.

80. Ouchi Т., Monteiro A.N., August A., Aaronson S.A., Hanafusa H. BRCA1 regulates p53-dependent gene expression// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V.95. -P.2302-2306.

81. Papp J., Raicevic L., Milasin J., Dimitrijevic В., Radulovic S., Olah E. Germline mutation analysis of BRCA1 and BRCA2 genes in Yugoslav breast/ovarian cancer families// One. Rep. 1999. -V.6, № 6. -P.1435-1438.

82. Perkowska M, BroZek I, Wysocka B, et al. BRCA1 and BRCA2 mutation analysis in breast-ovarian cancer families from northeastern Poland// Hum Mutat. 2003. -V.21, №5. -P.553-554.

83. Phelan C.M., Rebbeck T.R., Weber B.L., et al. Ovarian cancer risk in BRCA1 carriers is modified by the HRAS1 variable number of tandem repeats (VNTR) locus// Nat. Genet. 1996. - V.12. - P.309-311.

84. Pohlreich P., Stribrna J., Kleibl Z., et al. Mutations of the BRCA1 gene in hereditary breast and ovarian cancer in the Czech Republic// Med. Princ. Pract. 2003. - V. 12, №1. -P.23-29.

85. Presneau N., Laplace-Marieze V., Sylvain V., et al. New mechanism of BRCA1 mutation by deletion/insertion at the same nucleotide position in three unrelated French breast/ovarian cancer families// Hum. Genet. 1998. - V. 103. - P.334-339.

86. Pyne M.T., Pruss D., Ward B.E., Scholl T. A characterization of genetic variants in BRCA1 intron 8 identifies a mutation and a polymorphism// Mut. Res. Genom. -1999. V.406. - P.101-107.

87. Rebbeck T.R., Kantoff P.W., Krithivas K., et al. Modification of breast cancer risk in BRCA1 variant carriers by the androgen receptor CAG repeat polymorphism// Am. J. Hum. Genet. 1999a. -V.64. - P. 1371-1377.

88. Rebbeck T.R., Kantoff P. W., Krithivas K., et al. Modification of breast cancer risk in BRCA1 mutation carriers by the AIB1 gene// Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. -1999b.-V.40.-P.1293.

89. Rhei E., Bogomolniy F., Federici M.G., et. al. Molecular genetic characterization of BRCA1- and BRCA2-linked hereditary ovarian cancers// Can. Res. 1998. - V.58, №15.-P.3193-3196.

90. Rostagno P., Gioanni J., Garino E. et. al. A mutation analysis of the BRCA1 gene in 140 families from southeast France with a history of breast and/or ovarian cancer// J. Hum. Gen. 2003. - V.48. - P.362-366.

91. Ruiz-Flores P., Sinilnikova O.M., Badzioch M. BRCA1 and BRCA2 mutation analysis of early-onset and familial breast cancer cases in Mexico// Hum. Mut. -2002. V.20, №6. - P.474-475.

92. Sambrook, Fritsch, Maniatis. Molecular cloning. // Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

93. Santarosa M., Dolcetti R, Magri M.D., Crivellari D., Tibiletti M.G., Gallo A. BRCA1 and BRCA2 genes: role in hereditary breast and ovarian cancer in Italy// Int. J. Can.-1999.-V.83,№ 1.-P.5-9.

94. Sarantaus L., Huusko P., Eerola H., et. al. Multiple founder effects and geographical clustering of BRCA1 and BRCA2 families in Finland// Eur. J. Of Hum. Gen. 2000.- V.8. — P.757-763.

95. Sasano H., Harada N. Intratumoral aromatase in human breast, endometrial and ovarian malignancies// Endocr.Rev. 1997. - V.19. - P.593 607.

96. Saxena S., Szabo C.I., Chopin S. BRCA1 and BRCA2 in Indian breast cancer patients// Hum. Mutat. 2002. - V.20, № 6. - P.473-474.

97. Scholl Т., Pyne M.T., Ward В., Pruss D. Biochemical and genetic characterization shows that the BRCA1IVS20 insertion is a polymorphism// J. Med. Genet. 1999. -V.36. -P.571-572.

98. Scully R. et al. Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are initiated by DNA damage// Cell. 1997a. - V.90. - P.425^35.

99. Scully R., Anderson S. F., Chao D. M., et al. BRCA1 is a component of the RNA polymerase II holoenzyme// Proc. Nat. Acad. Sci. 1997b. - V.94. - P.5605-5610.

100. Scully R., et al. Association of BRCA 1 with Rad51 in mitotic and meiotic cells// Cell.- 1997c. V.88. - P.265-275.

101. Shattuck-Eidens D., Oliphant A., McClure M., et al. BRCA1 sequence analysis in women at high risk for susceptibility mutations// JAMA. 1997. - V.278, №15 -P. 1242-1250.

102. Shin H.A., Nathanson K.L., Seal S., et.al. BRCAI and BRCA2 mutations in breast cancer families with multiple primary cancers// Clin. Cane. Res. 2000. - V.6. -P.4259-4264.

103. Shinohara A., Ogawa H., Matsuda Y., Ushio N., Ikeo K.,Ogawa T. Cloning of human, mouse and fission yeast recombination genes homologous to RAD51 and recA// Nat. Genet. 1993. - V.4. -P.239-243.

104. Shinohara A., Ogawa H.,Ogawa T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein// Cell. 1992. - V.69. - P.457-470.

105. Slatkin M. Allele age and a test for selection on rare alleles// Phil. Trans. R. Soc. Lond. 2000. - V.355. - P.1663-1668.

106. Smith, M.L., Ford, J.M., Hollander, M.C., et al. P53-mediated DNA repair responses to UV radiation: studies of mouse cells lacking p53, p21, and/or gadd45 genes// Mol. Cell Biol. 2000. - V.20. - P.3705-3714.

107. Somasundaram K., et al. Arrest of the cell cycle by the tumor suppressor BRCAI requires the CDK-inhibitor p21WAF/Cipl// Nature. 1997. - V.389. - P. 187-190.

108. Stoppa-Lyonnet D., Laurent-Puig P., Laurent E. et al. BRCAI sequence variations in 160 individuals referred to a breast/ovarian family cancer clinic// Am. J. Hum. Genet. 1997.-V.60.-P.1021-1030.

109. Szabo C., Neuhausen S., Deville P., et. al. BRCAI founder mutations: population genetics and genome evolution// Materials of the Breast Cancer Linkage Consortium (BCLC), Madrid, 2003, P.25.

110. Takimoto R., MacLachlan Т.К., Dicker D.T., Niitsu Y., Mori Т., el-Deiry W.S. BRCAI transcriptionally regulates damaged DNA binding protein (DDB2) in the

111. DNA repair response following UV-irradiation// Cancer Biol. Ther. 2002. - V. 1. -P. 177-186.

112. Tavtigian S.V., Simard J., Rommens J., et al. The complete BRCA2 gene and mutations in chromosome 13q-linked kindreds// Nature Genet. 1996. - V.l2. -P.333-337.

113. Thompson D., Easton D., Breast Cancer Linkage Consortium. Variation in BRCA1 cancer risks by mutation position// Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2002. -V.ll, № 4. - P. 329-336.

114. Thorlacius S., Sigurdsson S., Bjarnadottir H., et al. Study of a single BRCA2 mutation with high carrier frequency in a small population// Am. J. Hum. Genet. -1997. V.60. - P.1079-1084.

115. Van der Looij M., Szabo C., Besznyak I. et al. Prevalence of founder BRCA1 and BRCA2 mutations among breast and ovarian cancer patients in Hungary// Int. J. Cancer. 2000. - V.86. - P.737 - 740.

116. Vehmanen P., Friedman L.S., Eerola H. Low proportion of BRCA1 and BRCA2 mutations in Finnish breast cancer families: evidence for additional susceptibility genes// Hum. Mol. Gen. 1997. - V.6, №13. - P.2309-2315.

117. Venkitaraman A.R. Cancer susceptibility and the functions of RCA1 and BRCA2// Cell. 2002. - V. 108. - P. 171-182.

118. Verhoog L.C., Van den Ouweland A.M.W., Berns E., et. al. Large regional differences in the frequency of distinct BRCA1/BRCA2 mutations in 517 Dutch breast and/or ovarian cancer families// Eur. J. of Can. 2001. - V.37. - P.2082-2090.

119. Wagner T.M., Moslinger R.A., Muhr D., et al. BRCA1-related breast cancer in Austrian breast and ovarian cancer families: specific BRCA1 mutations and pathological characteristics// Int. J. Cancer. 1998. - V.77, №3:354-60.

120. Wang Q., Zhang H., Kajino K., Greene M.I. BRCA1 binds cMyc and inhibits its transcriptional and transforming activity in cell// Oncogene. 1998. - V.17. -P. 1939-1948.

121. Wang Y., Cortez D., Yazdi P., Neff N., Elledge S.J., Qin J. BASC, a super complex of BRCA1-associated proteins involved in the recognition and repair of aberrant DNA structures// Genes Dev. 2000. - V. 14. - P.927-939.

122. Weinberg RA. Tumor suppressor genes// Science. 1991. - V.254. - P. 1138-1146.

123. Welcsh P. L., Owens K. N., King M.-C. Insights into the functions of BRCA1 and BRCA2// TIG. 2000. - V.16, №2. - P.69-74.

124. Wu L.J.C., Wang Z.W., Tsan J.T., et al. Identification of a RING protein that can interact in vivo with the BRCA1 gene product// Nat. Genet. 1996. - V. 14. - P.430-440.

125. Xu X. et. al. Centrosome amplification and a defective G2-M cell cycle checkpoint induce genetic instability in BRCA1 exon 11 isoform-deficient cells// Mol. Cell. -1999. V.3. - P.389-395.

126. Yazici H, Bitisik O, Akisik E, et al. BRCA1 and BRCA2 mutations in Turkish breast/ovarian families and young breast cancer patients// Br. J. Can. 2000. - V.83, №6. - P.737-742.

127. Zheng L., Annab L.A., Afshari C.A., Lee W.H., Boyer T.G. BRCA1 mediates ligand-independent transcriptional repression of the estrogen receptor// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V.98. - P.9587-9592.

128. Zhi X., Szabo С., Chopin S. BRCA1 BRCA2 sequence variants in Chinese breast cancer families// Hum. Mutat. 2002. - V.20, №6. - P.474.

129. Zhong Q., Chen C.F., Li S., et al. Association of BRCA1 with the hRad50-hMrel 1-p95 complex and the DNA damage response// Science. 1999. - V.285. - P.747-750.

Информация о работе

Логинова, Анна Николаевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.15

Диссертация

Молекулярно-генетический анализ наследственной формы рака молочной железы и/или яичников - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы