Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое изучение рака молочной железы

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое изучение рака молочной железы"

00501/

На правах рукописи

ФАРАХТДИНОВА АЛЬБИНА РАУФОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 от

Уфа-2012

005017008

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека

Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель: Хуснутдинова Эльза Камилевна

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный

Защита диссертации состоится 29 мая 2012 г. в «14-00» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: 450054, Уфа, просп. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН (г. Уфа, просп. Октября, 71), с авторефератом - на сайте ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru/dissov.html, e-mail: molgen@anrb.ru. mbb@anrb.ru

Автореферат разослан « ¿.-У » апреля 2012 г.

Официальные оппоненты:

Викторова Татьяна Викторовна доктор медицинских наук, профессор, Башкирский государственный медицинский университет, зав. кафедрой биологии

Карпухин Александр Васильевич доктор биологических наук, профессор ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, зав. лабораторией

исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Ученый секретарь . Л

диссертационного совета J^p^f С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В мире ежегодно выявляется около 1 млн. новых случаев рака молочной железы (РМЖ) и более чем 400 ООО смертельных случаев от данной патологии (Kamangar et al, 2006). В России ежегодно регистрируется более 46 тыс. случаев РМЖ. Риск возникновения заболевания в течение жизни оценивается в среднем у женщин - 11%, у мужчин - 0.1%. В структуре онкологической патологии женского населения России рак молочной железы занимает первое место (20.1%) (Чиссов, 2011). Злокачественные новообразования молочных желез имеют наибольший вес в структуре смертности женщин (17.4%). В Республике Башкортостан показатели заболеваемости и смертности от рака молочной железы в 2009 году составили 55.77+1.15 и 16.1+0.6 на 100 тыс. населения соответственно (Чиссов, 2011). За период с 1999 по 2009 гг. наблюдается тенденция к неуклонному росту показателя смертности от РМЖ, прирост которого за 10 лет составил 10.4%.

Хорошо известно, что генетические факторы играют ведущую роль в патогенезе спорадических и семейных форм рака молочной железы, который является сложным, многофакторным заболеванием (Nathanson et al., 2001). Каждая женщина с раком молочной железы имеет генетическую детерминанту, однако, лишь небольшое число случаев заболевания можно объяснить нарушениями в уже известных на сегодняшний день генах, ассоциированных с раком молочной железы.

Мутации в генах BRCA1 и BRCA2 объясняют не более 25% случаев наследственных форм заболевания. BRCA1/2 являются компонентами общего сигнального пути, контролирующего целостность генома, апоптоз и дифференцировку клеток. Данный сигнальный путь определяет нормальный ответ клетки на воздействие ионизирующего излучения и включает множество участников, среди которых продукты таких генов как ATM, RAD50, MREU, СНЕК2, NBN и др. Нарушения в работе этих генов являются ключевым звеном в этиологии злокачественных новообразований.

В результате проведенных полногеномных анализов ассоциаций (GWAS) выявлены новые локусы, ассоциированные с раком молочной железы (Pharoah et al., 2004; Kammerer et al., 2004; Сох et al., 2007; Easton et al., 2007; Hunter et al., 2007; Stacey et al., 2008; Stacey et al., 2008; Garcia-Glosas et al., 2008; Ahmed et al., 2009; Thomas et al., 2009; Zheng et al., 2009; Antoniou et al., 2010; Milne et al., 2010; Tumbul et al., 2010; Fletcher et al., 2011; Ghoussaini et al., 2012). Некоторые из аллелей этих полиморфных вариантов изменяют риск развития рака молочной железы у носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. Оценки рисков для отдельных аллелей могут быть не высокими, совместный эффект их взаимодействия увеличивает прогностический потенциал маркеров для предсказания вероятности развития заболевания.

Спектр мутаций, генетическая вариабельность полиморфных маркеров могут сильно варьировать между отдельными странами и этническими группами. Этим обусловлена необходимость проведения наших исследований в различных популяциях России.

Цель работы: провести анализ спектра и частоты мутаций в генах BRCA1, BRCA2, СНЕК2, NBN и ATM у больных раком молочной железы из Республики Башкортостан и изучить ассоциации полиморфных локусов генов-кандидатов с развитием заболевания. Задачи исследования:

1. Изучить частоту высокопенетрантных мутаций 5382insC, p.CôlG, 4153delA в гене BRCA1 и мутации 6174delT в гене BRCA2 у больных раком молочной железы.

2. Изучить частоту мутаций IVS2+1G>A, CHEK2dele9,10 (5kb), IlOOdelC, I157T в гене СНЕК2, c.657del5 и p.R215W в гене NBN и р.Е1978Х в гак ATM у больных раком молочной железы и в группе контроля.

3. Провести анализ клинических особенностей рака молочной железы у носителей мутаций в генах BRCA1, BRCA2, NBN, ATM и СНЕК2.

4. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов 12 полиморфных локусов «2981582 гена FGFR2, «13387042 в области 2q35, «889312 гена MAP3KJ, «3803662 в регионе 16ql2, «10941679 в области 5р12, «4973768 гена SLC4A7, «6504950 гена STXBP4, «1982073 гена TGFbl, «3817198 гена LSP1, «1045485 гена CASP8, rsJ607237 гена PI КЗ С А и «13281615 в регионе 8q24 у больных раком молочной железы и в контрольной группе.

5. Дать оценку ассоциации исследованных полиморфных локусов и их сочетаний с риском развития рака молочной железы.

Научная новизна. Впервые проведено молекулярно-генетическое изучение рака молочной железы в Республике Башкортостан на репрезентативных выборках больных (п=977) и контрольной группы (п=1069). Показано неравномерное распределение спектра и частот мутаций в генах BRCA1, СНЕК2, NBN и ATM у больных раком молочной железы разного этнического происхождения. Впервые установлено, что маркерами повышенного риска развития рака молочной железы у женщин из Республики Башкортостан являются аллель *Т и генотипы *Т*Т и *С*Т локуса«2981582 в гене FGFR2, аллель *А и генотип *А*А локуса «13387042 в области 2q35, генотип *А*С локуса «889312 в гене МАРЗК1 и аллель *Т и генотип *С*Тполиморфного локуса «3803662 в регионе 16ql2.

Научно-практическая значимость. Результаты работы расширяют знания о генетических основах предрасположенности к заболеванию раком молочной железы. Полученные результаты могут быть использованы при медико-генетическом консультировании семей, отягощенных раком молочной железы или раком яичников, а также при проведении ДНК-диагностики онкологических заболеваний. Материалы диссертации могут быть включены в курс лекций биологических факультетов университетов, медицинских ВУЗов, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на V Всероссийском Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009); международном совещании членов консорциума по изучению рака молочной железы (Амстердам, 2009), II научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской генетики на Крайнем Севере» (Якутск, 2009); Всероссийской научной конференции «Медико-генетические проблемы онкологических заболеваний» (Стерлитамак, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы и перспективы изучения естественных и антропогенных экосистем Урала и прилегающих регионов» (Стерлитамак, 2011); Всероссийской школе-конференции молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из которых 5 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и обьем диссертации. Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, главы результатов исследований и их обсуждения, выводов и перечня цитируемой литературы, состоящего из 400 источников (55 отечественных и 345 зарубежных). Рукопись содержит 66 рисунков и 52 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для нашего исследования послужили образцы ДНК больных раком молочной железы (п=977), находившихся на стационарном лечении в Клиническом онкологическом диспансере г. Уфы и Клинической больнице № 1 г. Стерлитамак Республики Башкортостан за период 2000-2009 гг. Диагноз был верифицирован согласно гистологической классификации Международного противоракового союза. Возраст больных раком молочной железы в исследуемой выборке колеблется от 24 до 85 лет, средний возраст

составляет 52,2±10,8 года. Данные о каждой пациентке заносились в специально разработанную нами формализованную карту, на основании которой создана компьютерная база данных. В контрольную выборку были отобраны женщины (N=1069) без онкологической патологии в анамнезе на момент забора крови. Группа контроля соответствует по возрасту и этническому составу выборке больных раком молочной железы. Все участники исследования дали информированное согласие на проведение молекулярно-генетических исследований.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984). Анализ мутаций в генах BRCA1, СНЕК2, NBN и ATM осуществляли методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР), аллель-специфичной ПЦР и ПДРФ-анализом с последующим электрофорезом в 7% полиакриламидном или 1-3% агарозном геле. Все позитивные случаи были подтверждены секвенированием на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100 согласно протоколу фирмы производителя. Генотипирование полиморфных вариантов /-¿3803662, «1982073, «2981582, «3817198, «10941679, «6504950, «4973768, «889312, «1045485, «13281615, «1607237 и «13387042, а также локуса R215W в гене NBN проводили методом аплельной дискриминации ПЦР в реальном времени с конкурирующими зондами TaqMan (7500 Fast System Software, Applied Biosystems). Математическую обработку результатов проводили с использованием пакетов программ: MS Office Excel 2003 (Microsoft), STATISTICA v.6.0. (StatSoft), BIOSTAT (Гланц С, 1999). При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовали критерий х2 (р) Для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Иэйтса на непрерывность. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя соотношения шансов Odds Ratio (OR) (Schlesselman et al., 1982). Анализ межгенных взаимодействий проводили с помощью программ MDR (Ritchie et al., 2001) и GMDR (Lou et al., 2007; Chen et al., 2011).

s

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ мутаций в генах BRCA1, СНЕК2, ATM, NBN у больных раком молочной железы BRCA1 - ген, ассоциированный с раком молочной железы, 1.

Скрининг мутаций 5382insC, 4153delA, р.СбЮ в гене BRCAI в выборке из 977 больных раком молочной железы, проживающих в Республике Башкортостан, выявил 38 носительниц одного из изменений, что составляет 3.9%. Лидирующее положение по частоте встречаемости занимает инсерция 5382insC (3.3%). Инсерция 5382insC в гене BRCA1 в единичных случаях выявлена среди башкир, а также представителей финно-угорской группы -мари, мордвы. Считается, что данная мутация произошла в Восточной Европе (Neuhausen et al., 2000; Hamel et al., 2010). Она редко встречается в странах Скандинавии (0.12%), Германии (1.0%), Греции (1.2%) (Sorlie et al., 1998; Backe et al., 1999; Malander et al., 2004; Soegaard et al., 2008; Armao et al., 2009). Ее частота возрастает в направлении Восточной Европы: так, в Белоруссии и Литве частота 5382insC в гене BRCA1 составляет 2.5% (Bogdanova et al., 2010; Elsakov et al., 2010), в Польше и Латвии - 2.1% и 2.7% соответственно (Gorski et al., 2004; Plakhins et al., 2011).

Мутации 4153delA (1.07%) и p.C61G (2.15%) в гене BRCAI являются редкими в нашей выборке больных, они выявлены с более низкой частотой, чем в Эстонии, Польше или Белоруссии (6-10%) (Ciernikova et al., 2006; Ratajska et al., 2008; Bogdanova et al., 2010). Для ВДС,4/-ассоциированного РМЖ характерны некоторые особенности, такие как ранний возраст манифестации заболевания, большой процент случаев заболевания раком молочной железы или раком яичников у родственниц женщин с мутациями в гене BRCAI, билатеральное поражение молочных желез, высокая степень злокачественности опухолевых клеток.

BRCA2 - ген, ассоциированный с раком молочной железы, 2. Мутация 6174delT в гене BRCA2 в нашей выборке больных раком молочной железы не обнаружена.

СНЕК2 - ген киназы сверочных точек 2. Скрининг мутаций 1100ёе1С, тг+Ю, CHEK2dele9>10(5kb) в гене СНЕК2 у больных раком молочной железы из Республики Башкортостан выявил 20 (2.1%) носительниц одного из трех изменений (рис. 1), Деления С#£Юс1е1е9,10(5кЬ) обнаружена с частотой 1.2%, СЖ = 1.9; Р = 0.004.

Ш больные И контроль

11<Ше1С ГУ82+1С>А <1е1е9,10(5кЬ)

Рис. 1. Частота мутаций ПООёеЮ, 1У82+Ю>А, СНЕК2с1е1е9,10(5кЬ) в гене СНЕК2 в выборке больных раком молочной железы и контрольной группе.

Из трех мутаций, проанализированных в гене СНЕК2, в 79% случаев мутации определены у женщин русской, в 11% - украинской, в 5% -белорусской и татарской этнической принадлежности. Одна пациентка украинского происхождения является носительницей двух мутаций 1100с1е1С и 1У82+Ш>А в гене СНЕК2. У двух носительниц мутаций в гене СНЕК2 отмечаются случаи заболевания раком молочной железы у родственниц. У двух женщин выявлено билатеральное поражение молочных желез. Более раннее развитие рака молочной железы характерно для женщин с мутацией 1 ЮОёеЮ в гене СНЕК2 (45 лет).

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфного варианта И57Т (с.470Т>С) в гене СНЕК2 между больными раком молочной железы и группой контроля достоверных различий не обнаружил (Р>0.05). Частота аллеля *Т достигает 97% как у больных раком молочной железы, так

и у здоровых доноров (рис. 2). Генотип *Т*Т выявлен с частотой 95% в обеих выборках. Гетерозиготный генотип идентифицирован с частотой -5% у больных и в контроле. Гомозиготы по аллелю *С определены только в контрольной группе (0.1%).

о н

w «

В"

гг ст сс тс

генотипы аллели

Рис 2. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса I157T (с.470Т>С) в гене СНЕК2.

ATM- ген атаксии телеангиэктазии. В нашей выборке больных РМЖ мутация c,5932G>T в гене ATM выявлена с низкой частотой 0.2% (2/977), в контрольной выборке мутация (п=1069) не обнаружена. Возраст манифестации заболевания у пациенток с данной мутацией - 34 и 58 лет. Обе женщины русской этнической принадлежности. В семейном анамнезе одной из носительниц отмечается случай заболевания раком молочной железы (первая степень родства).

NBN - ген нибрина. В выборке больных раком молочной железы мутация c.657del5 в гене NBN обнаружена с частотой 0.41% (4/977), в контрольной группе - 0.37%. (4/1069). Достоверных различий между значениями частот генотипов между выборками больных и контроля не выявлено (Р=1.00). Средний возраст пациенток с делецией c.657del5 в гене NBN составляет 50 лет. У носительниц данной мутации случаев заболевания

раком молочной железы в семье не отмечается. У одной пациентки у родственницы первой степени родства выявлен рак яичников. По этнической принадлежности пациентки с мутацией c.657del5 распределились следующим образом: 2 пациентки - русские, одна - мордва и одна - украинка. В ряде работ было показано, что мутация c.657del5 гена NBN ассоциирована с раком молочной железы у женщин Восточной Европы (Buslov et al., 2005; Gorski et al., 2005; Bogdanova et al., 2008). Также отмечено, что частота делеции c.657del5 повышается в группе больных раком молочной железы с наследственной формой заболевания и при билатеральном поражении молочных желез (Steffen J. et al., 2006).

Другая мутация в гене NBN (p.R215W) обнаружена у больных раком молочной железы с частотой 0.5% (5/977), в контрольной группе ее частота составила 0.2% (2/1060), Р=0.8. Средний возраст манифестации заболевания у женщин с мутацией p.R215W - 47.5 лет. Семейных случаев заболевания в анамнезе пациенток не отмечается. Носители данной мутации относятся к трем этническим группам: двое русских, одна украинка и одна татарка.

Таким образом, мутация 5382insC в гене BRCA1 наиболее часто встречается среди изученных мутаций (3.3%), ассоциированных с высоким риском развития РМЖ, у женщин Республики Башкортостан. Второе место по частоте распространения (1.2%) занимает мутация CHEK2dele9,10(5kb) в гене С НЕЮ. На долю мутаций р.СбЮ в гене BRCA1, llOOdelC, IVS2+1G>A в гене СНЕК2 и 657del5 в гене NBN приходится по 0.4%. Мутации р.Е1978Х в гене ATM и 4153delA в гене BRCA1 выявлены с самой низкой частотой -0.2% (табл. 1, стр. 17). Мутация 6174delT в гене BRCA2 не характерна для нашего региона В целом, лишь 7% случаев заболевания раком молочной железы в Республике Башкортостан мы можем объяснить наличием одной из изученных мутаций (рис. 3).

0,4% 0.5% О.2"/"—

0,4%-

3,3%

и 5382insC BRCA1

H 4153deL4 BRCA1

Ш C61G ВЯСА1

Й dele9,10 (5kb) CBEK2

El HOOdelC СПЕК2

И IVS2+1G>A CUEK2

И p.1978ХАГМ

■ c657del5 NHN

У P.R215W NBN

Рис. 3. Спектр и доля изученных мутаций в генах BRCA1, СНЕК2, ATM, NBN в общей выборке больных из Республики Башкортостан.

Наши результаты демонстрируют неравномерное распределение частот изученных мутаций в различных этнических группах (рис. 4). Все вышеперечисленные мутации встречаются у русских, почти весь спектр мутаций представлен у женщин украинской этнической принадлежности. У башкир выявлена в одном случае инсерция 5382insC в гене BRCA1. В группе больных РМЖ татарского происхождения встречаются мутации 5382insC, C61G в гене BRCA1, CHEK2dele9,10(5kb) в гене СНЕК2 и p.R215W в гене NBN.

Одной из клинико-генетических характеристик наследственной формы РМЖ является наличие билатерального поражения молочных желез. В нашей группе больных выявлено 29 женщин с двусторонним РМЖ, что составляет 3% от общей выборки больных. Из них у 4 пациенток обнаружена мутация 5382insC в гене BRCA1, мутации llOOdelC и IVS2+1G>A в гене СНЕК2 определены в одном случае. Три женщины с двусторонним поражением молочных желез, указывают на случаи заболевания РМЖ у ближайших родственниц. Наши результаты подтверждают тот факт, что у носителей

мутаций в генах ВЯСА1 и СНЕК2 высокая вероятность развития билатерального РМЖ.

0 5382ШСШСА1 0 4153(1е1А ВКСА1 И СбЮВКСА! т1УЯ2+1(х>А СНЕК2 а <1е1е9,10(5кЪ) СНЕК2 Ш 1100йе1С СНЕК2 И р.Е19 78ХА ТМ Шс.657<1е15 МВЛГ И p.R215tVNBN

Рис. 4. Спектр и частота изученных мутаций в генах ВЯСА1, СНЕК2, АТМн ЫВМ в разных этнических группах больных раком молочной железы.

Одним из критериев прохождения молекулярно-генетической диагностики на наличие генетических нарушений у родственников больного является развитие онкологического заболевания у пробанда в молодом возрасте. Из полученных нами результатов следует, что для женщин с изученными мутациями, характерно более раннее развитие заболевания по сравнению со средним возрастом манифестации рака молочной железы у женщин без мутаций (рис. 5). Ранняя манифестация заболевания особенно характерна для пациентов с мутациями в гене ВКСА1, у которых средний возраст составляет 44±8,8 года (таб. 1).

Известно, что наследственные опухолевые синдромы составляют незначительную пропорцию от общего числа новообразований (1%), хотя при раке молочной железы их удельный вклад достигает более высоких показателей (5-20%) (Имянитов, 2010).

BRCAl CHEK2 ATM NBN

Рис. 5. Средний возраст больных РМЖ с мутациями в генах BRCAl, СНЕК2, ATMhNBN.

В S382insCBRCAl Е) 41S3delA BRCAl 0 C61G BRCAl miVS2+lG>A CHEK2 Я dele9,10(Skb) CHEK2 13 HOOdelC CHEK2 В p.E197SX ATM Ш c.6S7delS NBN И p.R215W NBN

Ш без мутаций

В нашей выборке больных выделена группа из 103 женщин, указавших на наличие случаев заболевания раком молочной железы или раком яичников у родственников. Спектр и доля выявленных мутаций у пациенток с отягощенным семейным анамнезом и у женщин со спорадическими случаями заболевания представлены на рис.б,

У 15 женщин (14.6%) с наследственной формой РМЖ выявлена инсерция 5382тзС в гене ВЯСА1, у двух (1.9%) пациенток обнаружена замена р.СбЮ в гене 5ЛС4Л мутации 5ЛС^/*4153ае1А, СЯ£Я2*1У82+Ш>А, СЯЖ2ае1е9,10(5кЬ), Л®У*657с1е15 и р.Е1978Х в гене ЛГЛ/ определены только однажды (1%).

Мутация 5382тзС в гене у больных с отягощенным семейным

анамнезом встречается в семь раз чаще, чем в оставшейся выборке женщин с РМЖ. Следует отметить высокую частоту встречаемости протяженной делеции в гене СНЕК2 у больных со спорадической формой заболевания. Интересно, что мутация 1100с1е1С в гене СНЕК2 не обнаружена в группе с наследственной формой РМЖ, тогда как сообщается о более высокой частоте

встречаемости данной мутации в отягощенных семьях (Меуеге-НеуЬоег <л а1„ 2002).

1.0% 1.0%

0.34%

0.57%

1.9%

0.461

5Э82ш зСВЯСА! ЕЗ 4153<1еМ ВЯСЛ1 Ш С61 вВЛСА1 Н йе!е9,10 (5кЬ) СНЕК2 В ПООйеЮ С11ЕК2 Щ 1У82+Ю>А СНЕК2 И р.1978ХАТМ ■ с.657<1е15 /У/Ш М p.R215W УВМ

А Б

Рис. 6. Спектр и доля мутаций генов ВЯСА1, СНЕК2, АТМнМВМ у больных А) с генетически отягощенным анамнезом, п=103 Б) со спорадическими случаями заболевания, п=874.

Подводя итог выше изложенному, необходимо сказать, что диагностика генетической предрасположенности к развитию злокачественных новообразований позволяет правильно организовать медицинское наблюдение и предотвратить неблагоприятный исход заболевания. Результаты данного раздела позволяют разработать дальнейшую стратегию молекулярно-генетических исследований с целью поиска новых ДНК-маркеров, ассоциированных с раком молочной железы. В регионе, где проживает этнически гетерогенное население, необходимо учитывать особенности генетической структуры популяций. Например, в тест-системах на ДНК диагностику ряд коммерческих лабораторий России предлагает скрининг на мутацию 6174с1е1Т в гене ВЯСА2, наши данные позволяют говорить о необоснованности такого подхода в Республике Башкортостан.

Таблица 1.

Частота распространения мутаций в генах ВЯСА1, ВКСА2, СНЕК2, ИВИнАТМу больных раком молочной железы из Республики Башкортостан

Ген Принятые обозначения Изменение на уровне ДНК Число носителей мутации в общей выборке больных, N-977 Число носителей мутации у больных с семейными случаями РМЖили РЯ, N»103 Средний возраст манифестации заболевания Этническая принадлежность

BRCA1 5382insC c.5266dupC 32 (0.33) 15 (14.6%) 44.8+9.02 русские, татары, башкиры, мордва, мари, украинцы

p.C61G c,181T>G 4 (0.4) 2(1.9%) 46+6.4 русские, татары

4153delA c.4034delA 2 (0.2) 1 (1%) 31 и 38 русские, украинцы

BRCA2 6174delT c.5946delT - - _

СНЕК2 1 lOOdelC c.I IOOdelC 4 (0.4) 0 45.5+10.7 русские, украинцы

IVS2+1G>A C.444+1G> A 4 (0.4) 1 (1%) 47+12.7 русские,

dele9,10(5kb) 12(1.2) 1(1%) 49+11.4 русские, украинцы.

АТМ P.E1978X c.5932G>T 2 (0.2) 1(1%) 34 и 58 русские

NBN 657del5 c.6S7delS 4 (0.4) 1(1%) 50+5.7 русские, украинцы, мордва

P.R215W c.643C>T 5 (0.5) 0 47+7.04 русские, украинцы, татары

Анализ ассоциации полиморфных локусов с раком молочной железы

Результаты проведенных полногеномных исследований позволили идентифицировать новые полиморфные локусы, ассоциированные с раком молочной железы в европейских и азиатских популяциях (Easton et al, 2007; Hunter et al, 2007; Stacey et al, 2007; Stacey et al, 2008; Garcia-Glosas et al, 2008; Ahmed et al, 2009; Thomas et al, 2009; Zheng et al, 2009; Antoniou et al, 2010; Milne et al, 2010; Turnbull et al, 2010; Fletcher et al, 2011; Ghoussaini et al, 2012). Несмотря на то, что оценки риска для отдельных аллелей могут быть не высокими, совместный эффект их взаимодействия увеличивает

прогностический потенциал данных для предсказания вероятности развития заболевания.

В нашей работе проведен анализ ассоциации полиморфных локусов с раком молочной железы, которые были отобраны на основе результатов исследований полногеномного анализа ассоциаций однонуклеотидных полиморфных вариантов с развитием заболевания: «2981582 гена «13387042 в области 2я35, «889312 гена МАРЗК1, «3803662 в регионе 16я12, «10941679 в области 5р12, «4973768 гена 8ЬС4А7, «6504950 гена 8ТХВР4, «1982073 гена ТвРЫ, «3817198 гена 15РУ, гб!607237 гена Р1КЗСА, «1045485 гена САБР8 и «13281615 в регионе 8я24.

Обнаружена ассоциация четырех полиморфных локусов: «2981582 (ОТ) в гене рецептора факторов роста фибробластов (РСРР2), «13387042 (в>А) в области 2ц35, «3803662 (ОТ) в регионе 16ч12, «559572 (А>С) в гене митоген активированной протеин киназы киназы киназы 1 (МАРЗК1) с раком молочной железы (рис. 7).

частота %

Рис. 7. Генетические маркеры повышенного риска развития рака молочной железы у женщин из Республики Башкортостан

Установлено, что у женщин русской этнической принадлежности и в общей выборке в целом аллель «2981582*Г и генотип *Т*Т в гене FGFR2, повышают риск заболевания РМЖ (OR=1.4 [1.14-1.71], РЮ.0019 и OR=1.33 [1.18-1.53], Р=0.005; OR=2.23 [1.4-3.56], Р=0.0012 и OR=1.85 [1.38-2.48], Р=0.0005, соответственно), что согласуется с результатами зарубежных и отечественных исследований (Easton et al., 2007; Liang et al., 2008; Milne et al, 2010; Boyarskikh et al, 2010). Общая тенденция повышения частоты аллеля *Т и генотипа *Т*Т у больных РМЖ татарской и башкирской этнической группы сохраняется, но не достигает статистической значимости (Р>0.05).

Выявлена ассоциация полиморфного локуса 2q35-«l3387042 с РМЖ. Аллель «13387042*4 и генотип *А*А являются маркерами повышенного риска развития рака молочной железы (OR=1.22 [1.08-1.33], Р=0.002 и OR=1.48 [1.15-1.92], Р=0.003).

Для общей выборки больных и для женщин татарской и башкирской этнической группы показана ассоциация полиморфного варианта «889312 в гене МАРЗК1 с РМЖ. У носителей аллеля *С и генотипа *А*С повышен риск развития заболевания: выборка в целом (OR=1.18 [1.04-1.35], Р=0.013 и OR=1.34 [1.11-1.63], Р=0.003); татары (OR=1.32 [1.04-1.69], РЮ.025 и OR=1.57 [1.1-2.26], Р=0.014); башкиры (OR=2.64 [1.8-3.9], РЮ.0005 и OR=2.45 [1.27-4.75], Р=0.007). Согласно данных зарубежных исследователей полиморфный локус «889312 ассоциирован с риском РМЖ у европейских женщин (Easton et al, 2007; Garcia-Glosas et al, 2008; Long et al, 2010).

В результате нашего исследования показана ассоциация полиморфного локуса «3803662 в области 16ql2 (ТОХЗ) с раком молочной железы как в общей выборке больных, так и у женщин татарской этнической принадлежности. Редкий аллель *Т и генотип *С*Т полиморфного локуса «3803662 являются маркерами повышенного риска развития рака молочной железы: выборка в целом (OR=1.18 [1.04-1.35], Р=0.013 и OR=1.36 [1.00-1.84],

РЮ.005); женщины татарской этнической принадлежности (OR=1.36 [1.061.74], Р=0.015 и OR=1.9 [1.06-3.42], Р=0.031).

Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к раку молочной железы

В представленной работе для моделирования межгенных взаимодействий были использованы программы MDR и GMDR [Ritchie et al., 2001; Lou et al., 2007], в которых с помощью многократного перекрестного пересчета первичных данных были выбраны оптимальные модели межгенных взаимодействий.

Была определена двухлокусная модель ген-генного взаимодействия, предрасполагающая к развитию рака молочной железы: «2981582 в гене FGFR2 - rs 1607237 в гене PIK3CA. Тестируемая сбалансированная точность (Bal.Acc.) данной модели составила 0.76, чувствительность (Se) - 0.67, специфичность (Sp) - 0.85, повторяемость результата - 10/10, OR = 11.7155 [8.5822- 15.9929], Р< 0.0001.

АА

N

Sac

<ю

сс

Рис. 8. Комбинации генотипов полиморфных локусов «2981582 в гене «889312 в гене МАРЗК1, кШ12Ъ1 в гене Р1КЗСА, ассоциированные с повышенным или пониженным риском заболевания раком молочной железы.

Примечание: темно-серым цветом выделены ячейки с сочетанием генотипов повышенного риска, светло-серого - пониженного риска.

Также определена трехлокусная модель ген-генного взаимодействия, предрасполагающая к развитию рака молочной железы: [«2981582 в гене

FGFR2 - ri889312 в гене МАРЗК1 - «1607237 в гене PIK3CA] (рис.8). Тестируемая сбалансированная точность (Bal.Acc.) данной модели составила

0.77. чувствительность (Se) - 0.69, специфичность (Sp) - 0.84, повторяемость результата - 7/10, OR = 11.7338 [8.6287-15.9563], Р < 0.0001.

Таким образом, проведенный анализ ген-генных взаимодействий изученных локусов дал возможность установить такие сочетания полиморфных вариантов, которые способствуют формированию генетической предрасположенности к раку молочной железы.

ВЫВОДЫ

1. Частота мутаций 5382insC, р.СбЮ и 4153delA в гене BRCA1 в семьях, отягощенных раком молочной железы или раком молочной железы/раком яичников, составила 17.5%, в выборке больных со спорадической формой рака молочной железы - 2.24%. Наиболее высокая частота мутации 5382insC в гене BRCA1 обнаружена у больных славянского происхождения. Мутация 6174delT в гене BRCA2 не встречается у больных раком молочной железы из Республики Башкортостан.

2. Установлено, что частота мутации CHEK2dele9,10(5kb) составляет 1.2% в общей выборке больных РМЖ, на долю мутаций llOOdelC и IVS2+1G>A в гене СНЕК2 приходится по 0.4%. Ассоциации полиморфного локуса I157T в гене СНЕК2 с раком молочной железы не выявлено.

3. Мутации c.657del5 и p.R215W в гене NBN и р.Е1978Х в гене ATM вносят незначительный вклад в развитие рака молочной железы в Республике Башкортостан (частота 0.4%, 0.5%, 0.2%, соответственно).

4. Установлено, что для больных с мутациями 5382insC, p.C61G и 4153delA в гене BRCA1 характерны: ранний возраст манифестации заболевания, билатеральное поражение молочных желез и семейная история заболевания раком молочной железы.

5. Обнаружена ассоциация полиморфных вариантов «2981582 в гене рецептора факторов роста фибробластов FGFR2, «13387042 в области 2q35,

«889312 в гене митоген активированной протеин киназы киназы киназы 1 МАРЗК1, локуса «3803662 в области 16я12 с раком молочной железы. Маркерами повышенного риска развития рака молочной железы являются аллель *Ти генотипы *Т*Ти *С*Тлокуса «2981582 в гене аллель *А

и генотип *А*А локуса «13387042 в области 2ц35, генотип *А*С локуса «889312 в гене МАРЗК1 и аллель *Т и генотип *С*Т полиморфного локуса «3803662 в регионе 1бя12.

6. Выявлены две оптимальные модели межгенного взаимодействия локусов: двухлокусная - «2981582 в гене рецептора факторов роста фибробластов и «1607237 в гене фосфатидил инозитол 3 киназы Р1КЗСА■ трехлокусная - «2981582 в гене рецептора факторов роста фибробластов «889312 в гене митоген активированной протеин киназы киназы киназы 1 МАРЗК1и «1607237 в гене фосфатидил инозитол 3 киназы Р1КЗСА, определяющие формирование генетической предрасположенности к заболеванию раком молочной железы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Бермишева М.А., Богданова Н.В., Зиннатуллина Г.Ф., Кононова В.А., Фарахтдинова А.Р., Ганцев Ш.Х., Доерк Т., Хуснутдинова Э.К. Анализ мутаций с.657с!е15 и р.11215\У гена ИВЫ у больных раком молочной железы в Республике Башкортостан и Ханты-Мансийском автономном округе. // Медицинская генетика. 2009. № 8. Стр. 36-40.

2. Фарахтдинова А.Р., Федорова С.А., Николаева Т.И., Иванов П.М., Бермишева М.А., Доерк Т., Хуснутдинова Э.К. Анализ мутаций в генах В11СА1, СНЕК2, ЫВ51 у больных раком молочной железы из Республики Саха (Якутия) // Якутский медицинский журнал. 2009. № 2. Стр. 91-93.

3. Зинатуллина Г.Ф., Бермишева М.А., Кононова В.А., Фарахтдинова А.Р., Хуснутдинова Э.К. Прогнозирование возникновения риска молочной железы

на основе генетических исследований // Креативная хирургия. Онкология. 2009. №2. Стр. 61-62.

4. Хуснутдинова Э.К., Ганцев Ш.Х., Бермишева М.А., Фарахтдинова А.Р., Зинатуллина Г.Ф., Прокофьева Д.С. Молекулярно-генетическое изучение рака молочной железы в Республике Башкортостан // Креативная хирургия. Онкология. 2010. № 4. Стр. 56-58.

5. Milne RL, Goode EL, Garcia-Closas M, Couch FJ, Severi G, Hein R, ...(Collaborators 125) Khusnutdinova E, Bermisheva M, Prokofieva D, Farahtdinova A, Oison JE, Wang X, Humphreys MK, Wang Q, Chenevix-Trench G; kConFab Investigators; AOCS Group, Easton DF. Confirmation of 5pl2 as a susceptibility locus for progesterone-receptor-positive, lower grade breast cancer // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2011. V. 20: P. 2222-31.

6. Фарахтдинова A.P., Бермишева M.A., Зиннатуллина Г.Ф., Ганцев Ш.Х., Кочанова В.А., Федорова С.А., Хуснутдинова Э.К. Анализ мутаций в генах BRCA1/2, ATM, NBN, СНЕК2 у больных раком молочной железы различного этнического происхождения // Материалы V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 2009. Стр. 515.

7. Прокофьева Д.С., Бермишева М.А., Фролова В.Ю., Зиннатуллина Г.Ф., Фарахтдинова А.Р., Богданова Н.В., Doerk-Bousset Т., Ганцев Ш„ Хуснутдинова Э.К. Вклад мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и PALB2 в развитие рака яичников у жителей Республики Башкортостан // Материалы II Всероссийской школы-конференции молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. Биомика/Biomics. 2011. Том 1,№2, Стр. 101-103.

8. Фарахтдинова А.Р. Полногеномные исследования многофакторных заболеваний // Материалы всероссийской научно-практической конференции «Проблемы и перспективы изучения естественных и антропогенных экосистем Урала и прилегающих регионов». 2011. Стр. 104-106.

Список сокращений и условных обозначений

РМЖ - рак молочной железы

РЯ - рак яичников

OR - Odds Ratio (соотношение шансов)

95%CI - Confidence interval (доверительный интервал)

GWAS - полногеномный анализ ассоциаций

BRCAI - ген, ассоциированный с РМЖ, 1

BRCA2 - ген, ассоциированный с РМЖ, 2

СНЕК2 - киназа сверочных точек 2

А ТМ - ген атаксии телеангиэктазии

NBN — ген нибрина

Подписано в печать 26.04.12. Формат 60x84шб. Бумага офсетная. Печать оперативная. Тираж 100 экз. Заказ № 173 /12. Гарнитура «Times New Roman». Отпечатано в полиграфическом участке Стерлитамакской государственной педагогической академии им. Зайнаб Биишевой г. Стерлитамак, пр. Ленина 49, т/ф: 3473-20-28-16

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фарахтдинова, Альбина Рауфовна, Уфа

61 12-3/1270

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

На правах рукописи

ФАРАХТДИНОВА АЛЬБИНА РАУФОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н., проф. Хуснутдинова Э.К.

Уфа-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 6

ВВЕДЕНИЕ 7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1.1. Факторы риска развития рака молочной железы (РМЖ) 12

1.2. Эпигенетические изменения при РМЖ 15 • 1.3. Клеточный ответ на повреждения ДНК 16

1.4. Гены с высокой пенетрантностью, ответственные за наследственную 120 предрасположенность к РМЖ

1.4.1. Ген £RC4i(Breast cancer 1 gene) 20

1.4.2. Ген BRCA2 (Breast cancer 2 gene) 22

1.4.3. Роль ВЯСА1 и ВЫСА2 в репарации двунитевых разрывов и контроле 24 клеточного цикла

1.4.4. Анализ мутаций в генах ВЯСА1 и ВЯСА2 в различных популяциях 25 мира

1.5. Гены с умеренной пенетрантностью, вовлеченные в патогенез рака 25

молочной железы

1.5.1. Ген АТМ (Ataxia-Telangiectasia Mutated) 25

1.5.2. Ген NBN(NBS1, Nijmegen breakage syndrome) 30

1.5.3. Ген CHEK2 (Checkpoint kinase 2) 33 1.6. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов с РМЖ 36 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39

2.1. Материалы исследования 3 9

2.2. Молекулярно-генетические методы. 41 ' 2.2.1. Выделение ДНК из периферической крови. 41

2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 42

2.2.3. Аллель-специфичная ПНР 42

2.2.4. Рестрикционный анализ 43

2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 43

2.2.6. ПЦР в реальном времени 44

2.3. Статистические методы 46

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48

3.1. Анализ мутаций в гене ВЯСА1 у больных раком молочной железы 48

3.1.1. Скрининг мутации 5382тзС (с.5266скфС) в гене ВЯСА 1 48

3.1.2. Скрининг мутации 300Т>в (с. 181Т>0, р.Сб 10) в гене ВЯСА1 50

3.1.3. Скрининг мутации 4153с1е1А (с.4034ёе1А) в гене ВЯСА! 51

3.1.4. Анализ мутаций 5382insC, 4153delA и p.C61G в гене BRCA1 у 53 * больных РМЖ

3.2. Анализ мутации 6174delT (c.5946delT) в гене BRCA2 у больных РМЖ 58

3.3. Анализ мутаций в гене СНЕК2 в выборке больных РМЖ и в группе 59 контроля

3.3.1. Скрининг мутации llOOdelC в гене СНЕК2 у больных РМЖ и в 59 контрольной группе

3.3.2. Скрининг мутации IVS2+1G>A в гене СНЕК2 у больных РМЖ и в 61 контрольной группе

3.3.3. Скрининг мутации CHEK2dele9,10(5kb) у больных РМЖ и в 63 " контрольной группе

3.3.4. Анализ полиморфного варианта I157T в гене СНЕК2 у больных 64 РМЖ и в контрольной группе

3.3.5. Анализ мутаций llOOdelC, IVS2+1G, CHEK2dele9,10(5kb) в гене 68 СНЕК2

3.4. Анализ мутации c.5932G>T в гене ATM у больных РМЖ и в 70 контрольной группе

3.5. Анализ мутаций c.657del5 и p.R215W в гене NBN у больных РМЖ и в 73 контрольной группе.

' 3.5.1. Скрининг мутации c.657del5 в гене NBN 73

3.5.2. Скрининг мутации с.643С>Т (p.R215W) в гене NBN 76

3.6. Комплексный анализ мутаций в генах BRCA1, СНЕК2, ATM, NBN у 79 больных раком молочной железы

• 3.7. Анализ ассоциаций полиморфных локусов га2981582 гена FGFR2, 85 га13387042 в области 2q35, га889312 гена МАРЗК1, га3803662 в регионе 16ql2, га 10941679 в области 5р12, га4973768 гена SLC4A7, rs6504950 гена STXBP4, га 1982073 гена TGFbl, га3817198 гена ZSPi, га1607237 в гене PIK3CA, га 1045485 гена CASP8 и га13281615 в регионе 8q24 с раком молочной железы

3.7.1. Анализ ассоциации полиморфного варианта rs2981582 (ОТ) в гене 86 FGFR2 с раком молочной железы

3.7.2. Анализ ассоциации полиморфного локуса га13387042 (G>A) в 91

• области 2q35 с раком молочной железы

3.7.3. Анализ ассоциации полиморфного варианта га889312 (А>С) в гене 95 МАРЗК1 с раком молочной железы

3.7.4. Анализ ассоциации полиморфного варианта га3803662 (ОТ) в 101 области 16ql2 с раком молочной железы

3.7.5. Анализ ассоциации полиморфного варианта га10941679 (A>G) в 106 области 5р12 с раком молочной железы

3.7.6. Анализ ассоциации полиморфного варианта га4973768 (ОТ) в 111 области Зр24 с раком молочной железы

■ 3.7.7. Анализ ассоциации полиморфного варианта га6504950 (G>A) в гене 114 STXBP4 с раком молочной железы

3.7.8. Анализ ассоциации полиморфного варианта L10P, га 1982073 (Т>С) в 118 гене TGFJ31 с раком молочной железы

3.7.9. Анализ ассоциации полиморфного варианта га3817198 (Т>С) в гене 122 LSP1 с раком молочной железы

3.7.10. Анализ ассоциации полиморфного варианта га13281615 (Т>С) в 126 области 8q24 с раком молочной железы

3.7.11. Анализ ассоциации полиморфного варианта D302H, га1045485 130 ' (G>C) в гене CASP8 с раком молочной железы

3.7.12. Анализ ассоциации полиморфного варианта га1607237 в гене 134 PIK3CA (Т>С) с раком молочной железы

3.8. Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании 139 предрасположенности к РМЖ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 142

ВЫВОДЫ 146

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 148

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

* РМЖ - рак молочной железы

РЯ - рак яичников

РБ - Республика Башкортостан

OR - Odds Ratio (соотношение шансов)

95%CI - Confidence interval (доверительный интервал)

GWAS - полногеномный анализ ассоциаций

BRCA1 - ген, ассоциированный с РМЖ 1

СНЕК2 - ген киназы сверочных точек 2

ATM - ген атаксии телеангиэктазии

" NBN - ген нибрина

FGFR2 - ген рецептора факторов роста фибробластов

МАРЗК1 - ген митоген активированной протеинкиназы киназы киназы 1

CASP8 - ген каспазы 8

TGFfil - ген трансформирующего фактор роста бета 1

PIK3CA - ген фосфатидилинозитол-3-киназы

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В мире ежегодно выявляется около 1 млн. . новых случаев рака молочной железы (РМЖ) и более чем 400 ООО смертельных случаев от данной патологии [Kamangar F. et al, 2006]. В России ежегодно регистрируется более 46 тыс. случаев РМЖ. Риск возникновения заболевания в течение жизни оценивается в среднем у женщин - 11%, у мужчин - 0.1%. В структуре онкологической патологии женского населения России РМЖ занимает первое место (20,1%) [Чиссов В., 2011]. Злокачественные новообразования молочных желез имеют наибольший вес в структуре смертности женщин (17.4%). В Республике Башкортостан показатели заболеваемости и смертности от РМЖ в 2009 году составили « 55.77+1.15 и 16.1+0.6 на 100 тыс. населения соответственно [Чиссов В., 2011]. За период с 1999 по 2009 гг. наблюдается тенденция к неуклонному росту показателя смертности от РМЖ, прирост которого за 10 лет составил 10.4%.

Хорошо известно, что генетические факторы играют ведущую роль в патогенезе спорадических и семейных форм РМЖ, который является сложным, многофакторным заболеванием [Nathanson К. et al., 2001]. Каждая женщина с раком молочной железы имеет генетическую детерминанту [Rebbeck Т., 1999], однако, лишь небольшое число случаев заболевания • можно объяснить нарушениями в уже известных на сегодняшний день генах, ассоциированных с РМЖ.

Мутации в генах BRCA1 и BRCA2 объясняют не более 25% случаев наследственных форм заболевания. Эти гены являются компонентами общего сигнального пути, контролирующего целостность генома, апоптоз и дифференцировку клеток. Данный сигнальный путь определяет нормальный ответ клетки на воздействие ионизирующего излучения и включает множество участников, среди которых продукты таких генов, как ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated), RAD50 (homolog RAD50 С. Cerevisia), MRE11

(meiotic recombination 11 homolog A), CHEK2 (Checkpoint kinase 2), NBN (Nijmegen breakage syndrome) и др. Нарушения в работе этих генов являются ключевым звеном в этиологии злокачественных новообразований.

В результате проведенных исследований полногеномного анализа ассоциаций (GWAS) выявлены новые локусы, ассоциированные с РМЖ [Pharoah P. et al, 2004; Kammerer S. et al., 2004; Сох A. et al., 2007; Easton D. et al, 2007; Hunter D. et al., 2007; Stacey,S. et al., 2007; Stacey,S. et al, 2008; Garcia-Glosas M. et al., 2008; Ahmed S. et al., 2009; Thomas G. et al., 2009; Zheng W. et al., 2009; Antoniou A. et al., 2010; Couch F. and Wang X., 2010; Milne R. et al, 2010; Turnbull С. et al., 2010; Fletcher О. et al., 2011; Ghoussaini M. et al., 2012]. Некоторые из аллелей полиморфных локусов га2981582 гена FGFR2, га 13387042 в области 2q35, га889312 гена МАРЗК1, га10941679 в области 5р12, ^4973768 гена SLC4A7, ^6504950 гена STXBP4, ^3817198 гена LSP1 изменяют риск развития рака молочной железы у носителей мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 [Antoniou A. et al., 2010]. Несмотря на то, что оценки рисков для отдельных аллелей могут быть невысокими, совместный эффект их взаимодействия увеличивает прогностический потенциал маркеров для предсказания вероятности развития заболевания.

Несомненно, за последние два десятилетия получены значительные достижения в области молекулярной генетики в решении вопросов этиологии, патогенеза и ранней диагностики РМЖ, но остается много не изученных вопросов. Спектр мутаций, генетическая вариабельность полиморфных маркеров могут сильно варьировать между отдельными странами и этническими группами. Этим обусловлена необходимость проведения молекулярно-генетических исследований в различных популяциях России.

Цель работы: Провести анализ спектра и частоты мутаций в генах BRCA1, BRCA2, СНЕК2, NBN и ATM у больных раком молочной железы из

Республики Башкортостан и изучить ассоциации полиморфных локусов генов-кандидатов с развитием заболевания.

Задачи исследования:

1. Изучить частоту высокопенетрантных мутаций 5382insC, p.C61G, 4153 del А в гене BRCA1 и мутации 6174delT в гене BRCA2 у больных раком молочной железы.

2. Изучить частоту мутаций IVS2+1G>A, CHEK2dele9,10 (5kb), llOOdelC, I157T в гене СНЕК2, c.657del5 и p.R215W в гене NBNи р.Е1978Х в гене ATM у больных раком молочной железы и в группе контроля.

3. Провести анализ клинических особенностей рака молочной железы у носителей мутаций в генах BRCA1, BRCA2, NBN, ATM и СНЕК2.

4. Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов 12 полиморфных локусов га2981582 гена FGFR2, га 13387042 в области 2q35, га889312 гена МАРЗК1, га3803662 в регионе 16ql2, ral0941679 в области 5р12, га4973768 гена SLC4A7, га6504950 гена STXBP4, га1982073 гена TGFbl, га3817198 гена LSP1, га1045485 гена С ASP 8, rsl607237 гена PIK3CA и га13281615 в регионе 8q24 у больных раком молочной железы и в контрольной группе.

5. Дать оценку ассоциации исследованных полиморфных локусов и их сочетаний с риском развития рака молочной железы.

Научная новизна исследования

Впервые проведено молекулярно-генетическое изучение рака молочной железы в Республике Башкортостан на репрезентативных выборках больных (п=977) и контрольной группы (п=1069). Показано неравномерное распределение спектра и частот мутаций в генах BRCA1, СНЕК2, NBN и ATM у больных РМЖ разного этнического происхождения. Впервые дана оценка ассоциации полиморфных вариантов га2981582 гена FGFR2, га 13387042 в области 2q35, га889312 гена МАРЗК1, га3803662 в

регионе 16я12, 0941679 в области 5р12, га4973768 гена 8ЬС4А7, га6504950 гена 8ТХВР4, га1982073 гена ТвРЫ, гз1607237 гена Р1КЗСА, га3817198 гена ЬБР1, га 1045485 гена СА8Р8 и га13281615 в регионе 8ц24 с раком молочной железы при анализе больных из РБ. Обнаружена ассоциация полиморфных вариантов га2981582 в гене га 13387042 в области 2ф5, га889312 в

гене МАРЗК1, локуса га3803662 в области 16ц12 (ТОХЗ) с раком молочной железы.

Научно-практическая значимость работы

Результаты диссертационной работы расширяют знания о генетических основах предрасположенности к заболеванию раком молочной железы. Полученные результаты могут быть использованы при медико-генетическом консультировании семей, отягощенных раком молочной железы и/или раком яичников, а также при проведении ДНК-диагностики онкологических заболеваний. Материалы диссертации могут быть включены в курс лекций биологических факультетов университетов, медицинских ВУЗов, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

По данным ВОЗ в мире ежегодно выявляется около 1 млн. новых случаев рака молочной железы. В структуре онкологической патологии женского населения России РМЖ занимает первое место (20,1%) [Чиссов В., 2011]. Злокачественные новообразования молочных желез имеют наибольший вес в структуре смертности женщин (17,4%). За последнее десятилетие отмечается рост заболеваемости РМЖ, а также смертности от данного онкологического заболевания (рисунок 1а, 16).

80

= 50--:-:-:-:-

л

I 40 -:--

« ...... ........ ■ ■ ■

5 30 --:-—-----:-:-:-

5

| 20--———-------—

I 10--:--:-:-----

0 -1.........................................................................................................................................—.....-.................-

1999г 2000г 2001г 2002г 2003г 2004г 2005г 2006г 2007г 2008г 2009г

Рисунок 1а. Динамика заболеваемости РМЖ женского населения России за период 1999-2009 гг [Чиссов В., 2011].

Рисунок 16. Динамика смертности женского населения России от РМЖ за период 1999-2009 гг [Чиссов В., 2011].

1.1. Факторы риска развития рака молочной железы

Выделяют несколько основных факторов, способствующих развитию РМЖ (рисунок 2).

> Возраст начала менструации

> Возраст первых

родов 1

> Менопаузальный статус

> Период лактации

> Заместительная гормональная

терапия

5ч/ ■ ■ ?

Гормональные факторы

■■■"'- ''ЩжжШШШШЯ/Ш/'* Ш, - • • Щт

Факторы риска развития рака молочной железы

Генетические факторы

г Мутации

в генах BRCA1,

(142. СНЕ;

ATM/NBN идр

--Щ

Индивидуальны! факторы

н

> Пол

> Возраст

> Маммографическая плотность

> Этническая принадлежность

)кзог фак енные торы 1 :

Образ

> Ионизирую щая радиация

> Химические канцерогены

> Вирусы

> Курение

> Алкоголь

> Избыточная масса тела

> Стрессы

> Низкая физическая

активность

;

: . / ;

Рисунок 2. Факторы риска развития рака молочной железы.

Гормональные факторы. К факторам, связанным с состоянием репродуктивной системы, относят возраст первых родов, возраст первых менструаций, менопаузальный статус и другие [Чеснокова Н. и др., 2008].

По некоторым данным раннее менархе (до 12 лет) повышает, позднее (после 14 лет) - снижает риск РМЖ [Chang-Claude J. et al., 2007]. При позднем наступлении менопаузы (после 55 лет), риск РМЖ в 2 раза выше, чем при раннем её наступлении (до 45 лет). Каждый год, на который

задерживается менопауза, риск заболевания повышается на 5-10% [Ferguson D. and Anderson Т., 1981; Chang-Claude J. et al., 2007].

У нерожавших женщин риск развития РМЖ выше, чем у рожавших в 1.4 раза. При этом имеют значение возраст первых родов, интервал между менархе и первыми родами, а также длительность лактации [Маммология, Национальное руководство. Российская Ассоциация Маммологов, 2008].

К экзогенным гормональным влияниям относят заместительную гормональную терапию и прием оральных контрацептивов. Считается, что длительный прием комбинированных препаратов эстрогена и прогестерона увеличивает риск развития РМЖ [Beral W. et al., 2003]. Результаты исследований женщин в возрасте от 35 до 64 лет, использовавших оральные контрацептивы, показали незначительное увеличение риска развития РМЖ [Marchbanks Р. et al., 2002; Ursin G. et al., 2005].

Возраст. Около 77% случаев РМЖ у женщин встречается после 50 лет в момент установления диагноза. У женщин моложе 30 лет рак молочной железы встречается лишь в 0.3% случаев [Аксель Е., 2006]. Так, в 2005 году в России в возрастной группе от 30 до 34 лет заболеваемость составила 13,3 на 100 000 человек, а в группе от 50 до 54 лет 119,6 на 100 000 [Маммология, Национальное руководство. Российская Ассоциация Маммологов. 2008].

Маммографическая плотность. В последнее время принято считать, что повышение маммографической плотности - важный признак развития РМЖ [Byrne С. et al., 2000]. Эпидемиологические исследования показали, что повышение маммографической плотности является высоким и независимым фактором риска развития РМЖ. По разным данным, этот сравнительный риск оценивается в пределах от 2 до 6, что значительно выше, чем вклад других факторов [Boyd N. et al., 2002; Greendale G. et al., 2003]. В недавнем исследовании с использованием близнецового метода, в котором была изучена взаимосвязь маммографической плотности и риска развития рака с учетом наследственности, было показано, что на 60% плотность ткани

молочной железы обусловлена генетическими факторами [Boyd N. et al., 2002].

Факторы окружающей среды и образ жизни.

Алкоголь. Результаты исследования Longnecker М. свидетельствуют о повышении риска развития РМЖ у женщин, употребляющих алкоголь на 30% [Longnecker М., 1994]. Ежедневный приём 15-30 г алкоголя значительно повышает активность эстрогенов в сыворотке крови [Shumin М. et al., 2007; Bissonauth V. et al., 2009].

Курение. В ряде работ, посвященных изучению роли курения в развитии РМЖ, не было показано какой-либо взаимосвязи [Barbour S. et al., 2002; Fink A. and Lash Т., 2003]. Недавнее исследование женщин, которые курили в течение 40 и более лет, выявило, что риск развития РМЖ на 60 % выше, чем для женщин, которые никогда не курили [Abergavenny R., 2002].

Особенности питания играют важную роль в этиологии рака. Считается, что потребление жиров, особенно животного происхождения, положительно ассоциируется с заболеваемостью РМЖ [Заридзе Д., 2004].

Физическая активность сопряжена с меньшим риском развития РМЖ, что возможно, также связано с воздействием на гормональный метаболизм. По данным ВОЗ гиподинамия вызывает примерно 10-16% всех случаев РМЖ во всех странах мира [Маммология, Национальное руководство. Российская Ассоциация Маммологов. 2008].

Химические канцерогены разделяются на две группы: генотоксические канцерогены, которые реагируют непосредственно с ДНК клетки, и эпигенетические канцерогены, которые вызывают другие биологические эффекты, составляющие причину их канцерогенности [DunnickJ. et al., 1995].

Ионизирующее излучение. В первую очередь, риск развития рака молочной железы повышается у женщин, получавших лучевое лечение по поводу послеродового мастита, перенесших длительные рентгеноскопические исследования при туберкулезе или подвергавшихся

интенсивному радиоактивному облучению в возрасте до 30 лет (чаще всего в процессе лечения опухолей, таких как лимфома) [Leeuwen F. et al., 2005]. Риск возникновения заболевания зависит от дозы и возраста подвергания облучению, особенно высокий риск возникает в период полового созревания [Leeuwen F. et al., 2005].

Семейная история. Приме