Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые маркеры аномального метилирования ДНК при раке молочной железы, идентифицированные непредвзятым скринингом дифференциального метилирования геномов

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Новые маркеры аномального метилирования ДНК при раке молочной железы, идентифицированные непредвзятым скринингом дифференциального метилирования геномов"

На правах рукописи

005013405

РУДЕНКО Виктория Владимировна

НОВЫЕ МАРКЕРЫ АНОМАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫЕ НЕПРЕДВЗЯТЫМ СКРИНИНГОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ

03.02.07 "Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 мдр Ж1

Москва - 2012

005013405

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Стрельников Владимир Викторович

Официальные оппоненты:

Рсвазова Юлия Анатольевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Федеральный научный центр гигиены им.Ф.Ф.Эрисмана» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, ведущий научный сотрудник

Сальникова Любовь Ефимовна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории экологической генетики

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится _2012 г.

в \S~4ac. на заседании Диссертационного Совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор , Зинченко Рена Абульфазовна

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Задачами онкогеномики являются изучение молекулярных механизмов канцерогенеза и разработка эффективных методов диагностики, прогноза течения, оптимизации лечения и мониторинга рецидивирования опухолей. Процесс злокачественной трансформации клеток характеризуется накоплением большого количества повреждений в геноме опухолевой клетки. Нарушение функционирования генов, вовлеченных в процессы канцерогенеза, связывают как со структурными повреждениями, так и с эпигенетическими аномалиями, к числу которых относится, в частности, гиперметилироваиие ДНК в регуляторных областях генов (Esteller М. et al., 2001). Анализ маркеров метилирования на сегодняшний день является оптимальным инструментом молекулярно-генетической диагностики и мониторинга в онкологии. По специфичности он не уступает анализу экспрессии генов, значительно превосходя последний по простоте и доступности. Что же касается анализа структурных аномалий, то это остается достаточно дорогостоящей процедурой и находит применение в основном в диагностике наследственных онкологических синдромов и для выявления стандартных мутаций, определяющих чувствительность опухолей к тем или иным химиопрепаратам (Васильев Е.В. с соавт., 2009; Бабенко О.В. с соавт., 2009; Алексеева Е.А. с соавт., 2012).

Анализ метилирования ДНК имеет ряд преимуществ перед детекцией мутаций при выявлении клеток рака в образцах тканей или свободной ДНК из опухолевых клеток в биологических жидкостях. Во-первых, частоты аномального метилирования CpG-островков множества генов значительно превышают частоты структурных повреждений тех же генов при канцерогенезе (Kaneda А. et al., 2002; Miyamoto К. et al., 2003). Во-вторых, выявление аномально метилированных молекул ДНК в избытке нормального биологического материала не вызывает значительных проблем, детекция же мутаций/делеций в этой ситуации практически невозможна. В-третьих, анализ метилирования технически прост и в большинстве случаев сводится к ПЦР одного локуса. Поиск мутаций в одном гене требует анализа многих локусов; кроме того, 100%-пая эффективность достигается только после секвенирования фрагментов ПЦР. Наконец, аномальное метилирование наблюдается в пренеопластических тканях и может служить одним из наиболее ранних маркеров канцерогенеза (Esteller М. et al., 2001).

Несмотря на диагностические преимущества маркеров метилирования ДНК, они до сих пор не получили широкого распространения в клинической онкологии. Это объясняется, в частности, недостатком хорошо изученных и охарактеризованных генов, аномальное метилирование которых достоверно связано с тем или иным патоморфологическим типом опухоли (Jones Р. et al., 2007). В связи с этим особое значение приобретает идентификация и подробная характеристика особенностей метилирования новых геномных локусов, непосредственно или опосредованно вовлеченных в канцерогенез, что в значительной степени определило цель и задачи настоящей работы.

Первое место в структуре смертности от онкологических заболеваний у женщин занимает рак молочной железы (Давыдов М. И. с соавт., 2007). Чрезвычайная гетерогенность молекулярно-генетических характеристик этого заболевания находит свое отражение на клиническом уровне. Рак молочной железы характеризуется крайне разнообразным клиническим течением - от агрессивного до вялотекущего с поздним и редким метастазированием (Ермилова В.Д., 2002). Выраженная гетерогенность на

клиническом, гистопатологическом и молекулярном уровнях привела к созданию многочисленных маркеров заболевания, которые, тем не менее, не всегда обеспечивают достаточный уровень эффективности диагностики. Это объясняет необходимость разработки более современных мультигенных панелей маркеров, в том числе и панелей маркеров метилироваиия (Maier S. et al., 2007; Widschwendter M. et al., 2008). Современные исследования говорят о принципиальной возможности использования как панелей маркеров, так и единичных маркеров метилирования в качестве прогностических и предиктивных при раке молочной железы (Hartmann О. et al., 2009). Использование оптимизированого метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов в исследованиях рака молочной железы уже привело к выявлению целого ряда новых маркеров (Кузнецова Е.Б. с соавт., 2007), которые в настоящее время активно изучаются как с точки зрения участия в процессах канцерогенеза, гак и с точки зрения диагностических приложений (Rutella, S. et al., 2009; Hawes S.E. et al., 2010; Wang Y., Rekaya R., 2010). Разработка и внедрение более современных протоколов скрининга дифференциального метилирования и характеристики новых маркеров аномального метилирования должны повысить эффективность создания систем диагностических маркеров рака молочной железы.

Цель работы. Сформировать систему диагностических маркеров рака молочной железы, используя унифицированный метод выявления и характеристики новых локусов генома, аномально метилированных в процессе канцерогенеза.

Задачи исследования.

1. Разработать модификацию лабораторного протокола амплификации интерметилированных сайтов для непредвзятого скрининга дифференциального метилирования ДНК.

2. Идентифицировать новые дифференциально метилированные геномные локусы в злокачественных опухолях, тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы.

3. Оценить частоты метилирования выявленных геномных локусов в злокачественных опухолях, тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы.

4. Охарактеризовать корреляции дифференциального метилирования выявленных локусов с клинико-морфологическими характеристиками опухолей молочной железы.

5. Предложить систему маркеров метилирования для диагностики рака молочной железы, оценить параметры её чувствительности, специфичности и достаточности состава маркеров с точки зрения молекулярной классификации образцов клинического материала.

Научная новизна.

В результате проведенного исследования разработана модификация метода непредвзятого скрининга дифференциального метилировашшя геномов, применение которой позволило выявить 4 константно метилированных и 19 дифференциально метилированных областей генома. Дифференциальное метилирование при раке молочной железы впервые показано для 15 генов: LAMBI, RAI1, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1, PPP2R5C, PHF15, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2, АХ746725/АК127124, ТМЕМ176А/ТМЕМ176В, FOXMJ/HKMT1188. Четыре дифференциально метилированные области впервые выявлены в межгенных областях на хромосомах 1рЗЗ, 5р15.33, 12ql3.13 и 13q32.1. В выборке 140 образцов РМЖ

проведена оценка частот аномального метилирования указанных локусов. Особенности метилирования выявленных областей охарактеризованы впервые.

Впервые продемонстрированы ассоциации метилирования CpG-островков генов SH3KBP1, PHF15, GPC2 и LAMBI с клинико-морфологическими свойствами опухолей молочной железы. Промоторы SH3KBP1 и PHF15 достоверно чаще метилированы в опухолях со второй степенью злокачественности по сравнению с третьей степенью злокачественности. В то же время CpG-островок гена GPC2 обнаруживает различия уже в пределах второй степени злокачественности, что говорит о субъективизме критерия «степень злокачественности» и недостаточности только морфологических характеристик для его определения. Также показано, что ген SII3KBP1 достоверно чаще метилирован в группе опухолей молочной железы с размером Т1 против опухолей с размером Т2. Метилирование промоторного CpG-островка гена LAMBI в образцах рака молочной железы ассоциировано с негативным иммуногистохимическим статусом эстрогеновых рецепторов.

Сформированы оригинальные системы маркеров метилирования для диагностики рака молочной железы, демонстрирующие высокие показатели чувствительности и специфичности. Показано, что для формирования системы, обеспечивающей молекулярную классификацию тканей молочной железы со специфичностью 100%, достаточно семи маркеров метилирования.

Тсорстичсская и практическая значимость.

Выявленные дифференциально метилированные локусы и разработанная система скрининга дифференциального метилирования геномов позволяют проводить сравнительные исследования паттернов метилирования ДНК в норме и при злокачественных новообразованиях. Предложенный дизайн адаптер-опосредованной метилчувствителыюй полимеразной цепной реакции позволяет определять в формате реакции в одной пробирке состояние метилирования 7 геномных локусов, составляющих систему маркеров диагностики рака молочной железы, различающую злокачественную опухоль от окружающей морфологически нормальной ткани молочной железы с чувствительностью 89,8% и специфичностью 100%. Использование этой системы для молекулярной классификации злокачественной опухоли и здоровой ткани молочной железы обеспечивает диагностическую чувствительностью 100% при 100%-ной специфичности.

Определено количество маркеров метилирования, необходимое и достаточное с точки зрения молекулярной классификации образцов клинического материала. В частности, в системе из 7 маркеров для постановки диагноза «рак молочной железы» достаточно выявления 4 маркеров в метилированном состоянии; наличие 2-3 маркеров характерно для прилежащей к опухоли морфологически нормальной ткани; в здоровой ткани молочной железы выявляется метилирование одного из маркеров системы. Указанные параметры позволяют проводить диагностику со специфичностью 100%.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная модификация метода амплификации иитерметилированных сайтов является эффективным унифицированным инструментом скрининга дифференциального метилирования геномов, который может использоваться как для поиска, так и для характеристики новых маркеров метилирования при канцерогенезе.

2. Применение оригинального лабораторного протокола позволяет выявлять дифференциально и константно метилированные локусы генома в злокачественных

опухолях, тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы.

3. Определены достоверные связи ряда выявленных дифференциально метилированных локусов генома с клинико-морфологическими параметрами злокачественных опухолей молочной железы.

4. Существуют значительные различия в частотах аномального метилирования (информативности) маркеров в наборах, получаемых при использовании различных вариантов амплификации интерметилированных сайтов, в выборке образцов рака молочной железы. Наблюдаемые различия необходимо учитывать при формировании систем молекулярно-генетических маркеров для классификации образцов тканей молочной железы.

5. Характеристика частот метилирования геномных локусов позволяет сформировать системы диагностических маркеров, которые могут быть использованы для молекулярно-генетической классификации тканей молочной железы.

Апробация работы.

Материалы исследования были доложены на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва) в 2008 г., конференции молодых ученых, посвященной 40-летию МГНЦ РАМН (г. Москва) в 2009 (диплом и премия), VI съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 г. (г. Ростов-на-Дону), III международной научно-практической конференции молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (г. Москва) в 2011 г., на конкурсе региональной программы "Умник" (г. Москва) в 2011г.

Разработанные в рамках исследования алгоритмы и компьютерные программы были использованы при выполнении НИР по гранту РФФИ № 08-04-01685 «Общие закономерности структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы», по государственному контракту № 8/3-655н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака мочевого пузыря», по государственному контракту № 8/3-657н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака почки», по государственному контракту № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых диагностических технологий на основе механизмов эпигенетической регуляции», по фанту Earlier Breast Cancer Test Foundation "Development and validation of a differential methylation screening technology applicable for the identification of early breast cancer diagnostic markers" (2007-2010 гг.).

Личный вклад автора.

Проведен анализ дифференциального метилирования ДНК в злокачественных опухолях, условно нормальных тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы. Анализ включал в себя следующие этапы: экстракцию геномной ДНК, амплификацию интерметилированных сайтов и сравнение геномных профилей, планирование и осуществление рестриктазного картирования выявленных локусов. Все этапы исследования дифференциального метилирования ДНК выполнены лично. Проведен анализ полученных результатов: описание выявленных дифференциально метилированных локусов, оценка частот их метилирования,

выявление корреляций дифференциального метилирования выявленных локусов с клинико-морфологическими характеристиками опухолей молочной железы. Разработаны системы маркеров метилирования для диагностики рака молочной железы, проведена оценка параметров чувствительности, специфичности и достаточности состава маркеров.

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 25 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации, 17 тезисов, зарегистрировано 3 реклампо-технических описания компьютерных программ и 1 новая медицинская ДНК-технология.

Структура и объем дисссртации. Диссертационная работа изложена на 166 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 173 ссылки. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 55 рисунками.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материал для исследования. Образцы тканей рака молочной железы (РМЖ) были получены от 140 пациентов, прооперированных в ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздравсоцразвития России и ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России.

Гистологическую идентификацию тканей проводили в Кпинико-морфологическом отделе ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздравсоцразвития России и в Патологоанатомическом отделении ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России. Гистологическую идентификацию тканей проводили по стандартной методике, степень дифференцировки опухолей оценивали согласно рекомендациям ВОЗ 1973 года. Все случаи РМЖ классифицированы по классификации TNM согласно требованиям Международного противоракового союза (UICC, версия 1989 г.) и Американского объединенного комитета по раку (AJCC, версия 2010 г.).

Клеточная линия РМЖ MCF7 предоставлена Федеральным государственным бюджетным учреждением науки «Институт биологии гена» Российской академии наук. Образцы крови нормальных доноров предоставлены донорским пунктом ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. ДНК клеточной линии РМЖ и нормальных мононуклеаров периферической крови использовали для валидации результатов применения разработанного модифицированного протокола амплификации интерметилированных сайтов.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты геномную ДНК из лимфоцитов периферической крови и тканей выделяли стандартным методом (Sambrook et al., 1989).

Ферментативный гидролиз ДНК и лигированис с адаптерами.

Предварительную обработку ДНК проводили ферментами рестрикции -изошизомерами Smal, Xmal (Сибэнзим, Россия), для дальнейшего лигирования ферментом Т4 DNA Ligase (Fermentas, Литва) и амплификации.

Полимсразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме (Saiki, 1989) при помощи программируемого многоканального амплификатора ДНК «Терцик» фирмы ДНК-Технология с использованием термофильной ДНК-полимеразы Taq фирмы «ИнтерЛабсервис», г. Москва. В работе использована метилчувствительная ПЦР (МЧ-ПЦР). Принцип метода МЧ-ПЦР приведен в ранее опубликованных работах (Землякова и др., 2003).

Реакцию автоматического прямого секвенирования проводили на приборе ABI Prism 310, с использованием Genetic Analyzer Kits "Applied Biosystems" по протоколам производителя. Результаты секвенирования обрабатывали с использованием программы Chromas 3.01. Очистку продукта ПЦР для МС-секвенирования проводили согласно протоколу Quantum Prep Freeze 'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns (BIO-RAD, США).

Полимеразиая цепная реакция для метода амплификации интерметилированных сайтов (АИМС).

ПЦР проводили по следующей схеме: к 0.1 мкг геномной ДНК добавляли 0.05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 2.5 мкл десятикратного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5 мМ MgCl2, 1.3 мкл формамида.

Фрагмснтный анализ продуктов АИМС.

Для визуализации результатов продуктов амплификации метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов проводили фрагментный анализ полученных проб, содержащих праймер с флуоресцентной меткой FAM. Фрагментный анализ проводили по протоколам ABI Prism 3100 Genetic Analyzer Kits ("Applied Biosystems", США).

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программ Blast и Fasta, Genebank Pustell, Genepro, WIN-SUN, Oligo 4.0, MethPrimer, Executor и Chromas. Дизайн эксперимента непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов осуществлен с помощью программы AIMS in silico\ анализ электрофореграмм фрагментного анализа - с помощью программы PeakPick.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 3.1. МОДИФИКАЦИЯ ИСХОДНОГО ПРОТОКОЛА МЕТОДА АМПЛИФИКАЦИИ ИНТЕРМЕТИЛИРОВАННЫХ САЙТОВ

Метод амплификации интерметилированных сайтов (АИМС) генерирует большое число фрагментов, отражающих профиль метилирования ДНК в клетке (Frigola J. et al., 2002). Модификации, введенные в оригинальный протокол формирования продуктов АИМС (рис.1), касаются этапов лигирования и амплификации продуктов рестрикции; протокол этапа рестриктазной обработки сохранен в виде, предложенном авторами метода.

Модификации метода АИМС на этапе лигирования

Процедура лигирования подразумевает ковалентные сшивки липких концов фрагментов, полученных в результате гидролиза ДНК рестриктазой Xmal (сайт узнавания C/CCGGG) с последовательностями двуцепочечных адаптеров путем денатурации их эквимолярной смеси при 65°С с последующим отжигом при комнатной температуре.

АМПЛИФИКАЦИЯ ИНТЕРМЕТИЛИРОВАННЫХ САЙТОВ (АИМС)

Smal (CCC/GGG) Xmal (C/CCGGG)

Адаптер

ЙР

СССОО0 сс&зос OOQCCC ООСССС

Рис. 1. Схема, изображающая поэтапное проведение метода амплификации интерметилированных сайтов (АИМС): рестриктазной обработки, лигирования и амплификации; m - мегильная группа.

Адаптер имеет следующую структуру:

5'-ATTCGCAAAGCTCTGA-3' I I I I I I I II I I I I I I I

3'-TAAGCGTTTCGAGACTGGCC-51

Одной из главных задач при разработке лабораторного протокола АИМС является создание таких условий реакции лигирования, при которых молекулы адаптера были бы полностью израсходованы. Такой результат обеспечивается минимизацией входной концентрации адаптеров.

Проведенный теоретический расчет реакции лигирования показал, что соотношение уровней полезного сигнала АИМС и шума равно соотношению входящих концентраций адаптеров и липких концов продуктов гидролиза ДНК. В настоящей работе входное количество ДНК составляет 1500 нг, что соответствует 30 нМ результирующих липких концов. Тогда для обеспечения соотношения «сигнал/шум», равного 100/1, входящая концентрация адаптеров должна составить 3000 нМ (3 мкМ). Для практического использования выбрана концентрация адаптеров 10 мкм, обеспечивающая превышение уровня сигнала над шумом примерно в 300 раз.

Титрование по входной концентрации адаптеров проведено для концентрации, предложенной авторами метода АИМС (100 мкМ) и трех последовательных порядковых разведений (рис. 2). Критерий отбора оптимальной концентрации сформулировали следующим образом: наилучшее разрешение продуктов реакции при сохранении максимального числа фрагментов.

Как видно на рис. 2, в наибольшей степени этому критерию удовлетворяет реакция, проведенная при концентрации адаптеров, на порядок сниженной относительно оригинального протокола, что составляет 10 мкМ и соответствует результатам проведенного теоретического расчета.

Очистка ПЦР

10А(-3) 10л(-2) 10л(-1) 1

Рис. 2. Результаты титрования по входной концентрации адаптеров. Дорожки маркированы значениями кратностей порядковых разведений относительно оригинального протокола.

Модификации метода АИМС на этане ПЦР

В исходном протоколе метода АИМС (Frigola J. et al., 2002) для проведения ПЦР использовано 3 пары праймеров с различными трех- и четырехнуклеогидными удлинителями, для каждой из которых были отработаны специфические условия амплификации:

Set A: Blue-CCGGG-CTA + Blue-CCGGG-TGG Set В: Blue-CCGGG-CTG + Blue-CCGGG-TGG Set С: Blue-CCGGG-CGCG + Bhie-CCGGG-CAAC

(удлинители выделены полужирным шрифтом).

В работе, посвященной дизайну экспериментов и анализу результатов АИМС с использованием программы AIMS in silico (Танас A.C. с соавт., 20Ю) показано, что оптимальным для анализа метилирования промогорных СрО-островков является использование удлинителей CCG и GCG в раздельных реакциях. Для реакций АИМС с удлинителями CCG и GCG разработаны протоколы амплификации, параметры которых также определялись исходя из критерия получения наилучшего разрешения продуктов реакции при сохранении максимального числа фрагментов.

Модификации метода АИМС на этапах визуализации и геномной идентификации продуктов АИМС

В исходном протоколе для визуализации продуктов амплификации авторы использовали 6% денатурирующий полиакриламидный гель (ПААГ). Праймеры для ПЦР были снабжены радиоактивными метками. Поэтому после ПЦР проводилась радиоавтография геля.

Для идентификации продуктов реакции их вырезали и элюировали из геля. Затем авторы клонировали полученную ДНК в плазмидный вектор и секвенировали по стандартной методике Сэнгера. В разработанной модификации метода амплификация совокупности лигированных фрагментов проводится с флуоресцентно меченых праймеров. Флуоресцентная детекция спектра ПЦР-продуктов осуществляется с помощью фрагментного анализа на базе капиллярного электрофореза (рис. 3). Таким образом, методическая платформа исследования интегрирует метод АИМС и капиллярный электрофорез. Интеграция осуществляется при помощи специально разработанных для этого компьютерных программ AIMS in silico и PeakPick, анализирующих экспериментальные данные в контексте известных последовательностей генома человека.

Рис. 3. Пример визуализации флуоресцентно меченых продуктов АИМС, разделенных методом капиллярного электрофореза, с помощью специализированной программы PeakPick.

Традиционный дизайн АИМС с клонированием и секвенированием заменен последовательными этапами ресгриктазного картирования in silico и in vitro.

При проведении такого ресгриктазного картирования продукты АИМС обрабатываются ферментами рестрикции, индивидуально подбираемыми для каждого локуса с помощью программы AIMS in silico. Затем проводится сравнение электрофореграмм исходного продукта и того же продукта после обработки ферментом рестрикции (рис. 4).

Альтернативным методом, использованным для идентификации геномной принадлежности продуктов АИМС, является картирование по аналогии. Предполагаемый локус амплифицируется со специфических праймеров, причем область амплификации превышает исходные размеры искомого локуса, для того, чтобы в получаемый фрагмент полностью вошли сайты узнавания рестриктаз Smal, Xmal. После амплификации и проверки на ПААГ локус проходит все этапы стандартной обработки АИМС и визуализируется при помощи капиллярного электрофореза. Наличие пика соответствующей формы на соответствующей длине определяется как идентифицированный локус.

Рис. 4. Пример рестриктазного картирования фрагментов АИМС-ОСй, соответствующих участку промоторного Срв-островка гена ООСК6 (сигналы целевого фрагмента указаны стрелками; для картирования использована рестриктаза Ара1). Синяя линия соответствует электрофореграмме исходных продуктов АИМС, красная - электрофореграмме продуктов АИМС после гидролиза рестриктазой.

3.2. ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТИЛИРОВАНИЯ НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ ГЕНОМОВ МОДИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДОМ АИМС

Применение разработанной модификации метода АИМС к выборке операционных образцов рака молочной железы и нормальных тканей позволило идентифицировать облигатное метилирование Срв-островка гена С11Х1 в составе альтернативного З'-концевого экзона, интронных областей генов МАОШ, ТАР4 и 3'-СрС-островка гена 2ВТВ4.

В работе выявлено 19 аномально метилированных локусов. Частоты аномального метилирования этих локусов при РМЖ составляют от 5,1% до 87,4%. Причем частоты метилирования локусов панели ОСв находятся в диапазоне от 34,5% до 87,4%, а панели ССв - в диапазоне от 5,1% до 59,1%.

Характеристика метилирования геномов модифицированным методом АИМС с удлинителем ССв

Анализ метилирования геномных локусов, соответствующих продуктам АИМС, проводится на основе сравнения электрофореграмм этих продуктов друг с другом и с полной репрезентацией (полным набором продуктов АИМС с конкретным удлинителем). Сравнения проводятся с использованием компьютерной программы РеакРюк (рис. 5).

5000 4000

&

3000 2000 1000

100 150 200 250 300

Nucleotide length

Рис. 5. Пример сравнения электрофореграмм полной репрезентации (синяя линия) и продуктов АИМС с удлинителем GCG для образца ДНК нормальной молочной железы (красная линия).

Характеристика константно метилированных участков геномов модифицированным методом АИМС с удлинителем GCG

Сравнение электрофореграмм полной репрезентации и продуктов АИМС для образцов ДНК нормальной молочной железы и РМЖ выявило среди продуктов АИМС с удлинителем GCG два константно метилированных фрагмента с длинами около 120 и около 150 п.н. (рис. 5). Рестриктазное картирование указанных областей показало, что эти фрагменты соответствуют интронному CpG-островку гена TAF4 (20q 13.33) и участку интрона гена MAD1L1 (7р22.3). Фактические длины соответствующих продуктов АИМС составляют 124 и 156 п.н., соответственно. Пример рестриктазного картирования участка гена MAD1L1 приведен на рис. 6, 7.

.44DILI

1 -да lift 1,

-A—Z-'v-^N.--„~

Extender: GCG; total: 65, intact: 61, hydrolyzed: 4

Nucleotides

Рис. 6. Рестриктазное картирование константно метилированного локуса MAD1L1 в режиме дизайна эксперимента AIMS in silico. Розовым на виртуальной электрофореграмме отмечен сигнал, соответствующий фрагменту ДНК, который содержит сайт узнавания рестриктазы ApaLI. Этот же сигнал соответствует фрагменту гена MAD1L1, получаемому при использовании АИМС с удлинителем GCG.

Рис. 7. Рестриктазное картирование константно метилированного локуса MAD1L1. Зеленым цветом показана полная репрезентация, краснцм - результат обработки образца ферментом рестрикции ApaLI. Картированный локус указан стрелкой.

Характеристика дифференциально метилированных участков геномов модифицированным методом АИМС с удлинителем GCG

Сравнение результатов АИМС с удлинителем GCG для образцов РМЖ позволило выявить дифференциальное метилирование 9 геномных локусов, положение некоторых из которых на электрофореграмме представлено на рис. 8. Среди них 7 локусов принадлежит определенным генам: LAMBÍ, RAI!, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1. Два локуса принадлежат межгенным областям: 1рЗЗ и 5р15.33. Четыре из б внутригенных локусов принадлежали CpG-островкам промоторных областей генов LAMBI, DOCK6, SH3KBP1, KCNH8; один - CpG-островку гена GPC2 вне промотора. Локус, входящий в состав гена RAI1, не принадлежит CpG-островку. Локусы 1рЗЗ и 5р15.33 соответствуют межтенным CpG-островкам (рис. 9).

J1 TAFI mm

rlRp A w Г

кет fr J \ ' —

100 150 200 250

Рис. 8. Пример выявления аномально метилированных СрО-островков 1рЗЗ, GPC2, RAI1, KCNH8, GPC2. Красный график - электрофореграмма продуктов AMMC-GCG, полученных с ДНК из образца РМЖ. Стрелками указаны сигналы продуктов аномально метилированных CpG-островков и константно метилированных генов TAF4 и MAD1L1. Ось абсцисс: длины продуктов АИМС в п.н.

1рЗЗ, 5р15.33

=£>

Промотор

LAMB1, DOCK6, SH3KBP1, KCNH8

Энхансеры, сайленсеры

Экзон Интрон

CpG-островок

Рис. 9. Схематичное изображение расположения локусов, полученных при использовании удлинителя праймера йСО, относительно кодирующих и регуляторных элементов генома.

Характеристика метилирования участков геномов модифицированным методом АИМС с удлинителем ССС

Краткая характеристика константно метилированных фрагментов АИМС с удлинителем ССС

Сравнение электрофореграмм полной репрезентации и продуктов АИМС для образцов ДНК нормальной молочной железы и РМЖ выявило среди продуктов АИМС с удлинителем ССй два константно метилированных фрагмента с длинами около 130 и около 140 п.н. (рис. 10).

Nucleotide length

Рис. 10. Выявление константно метилированных локусов генома путем сравнения электрофореграмм полной репрезентации (синяя линия) и продуктов АИМС (красная линия) с удлинителем CCG для образца ДНК нормальной молочной железы.

Константно метилированные локусы картировали методом прямого секвенирования. Сопоставление полученных последовательностей (рис.11) с базой данных генома человека показало соответствие этих продуктов АИМС участкам СрО-островка альтернативного З'-концевого экзона гена СЦХ1 и Срв-островка последнего экзона гена 2ВТВ4. Фактические длины соответствующих продуктов АИМС составляют 139 и 146 п.и., соответственно.

в

G G CSG G 1 A A G CG G G TG GAG G GCC T С С G

Рис. 11. Фрагменты последовательностей константно метилированных локусов, картированных методом прямого секвенирования: А - СШ7 (7ц22.1), В - 2ВТВ4 (17р13.1).

Дифференциально метилированные фрагменты АИМС с удлинителем CCG

Сравнение результатов АИМС с удлинителем CCG для образцов РМЖ позволило выявить дифференциальное метилирование 11 локусов, положение некоторых из которых на электрофореграмме представлено на рис. 12.

Из них девять принадлежит двенадцати генам: PPP2R5C, PHF15, ATMIN, C2CD2, K1AA1324L, IQSEC2, AX746725/AKI27124, ТМЕМ176А/ТМЕМ176В, FOXM1/HKMT1188. Два локуса принадлежат межгенным CpG-островкам на хромосомах 12q 13.13 и 13q32.1. Шесть генных локусов соответствуют CpG-островкам нромоторных областей генов PPP2R5C, PHF15, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2. Три локуса входят в состав CpG-островков, объединяющих промоторные области сразу двух генов: АХ746725/АК127124, ТМЕМ176А/ТМЕМ176В, FOXM1/HKMT1188 (рис. 13).

К1ЛП м I C VXl г=(-тлм V Л ! fc-"""' Л1 11 1 л ТМЕМ17ö. VI 76В 1-L-—...........„

100 150 200 250

Рис. 12. Пример выявления аномально метилированных СрС-островков в системе АИМС-ССО. Оба графика - элекгрофореграммы продуктов, полученных с ДНК из образцов РМЖ. Стрелками указаны сигналы продуктов аномально метилированных Срв-островков и константно метилированного участка гена 2ВТВ4. Ось абсцисс: длины продуктов АИМС в п.н.

^Промотор

TM EM 176 А/176В, FOXM1/HKMT1188, АХ746725/АК127124, IQSEC2

CpG-островок

S fl

лХ

PPP2R5C,

PHF1,

ATMIN,

C2CD2,

KIAA1324L

Возможные регуляторные области г

=Î>>

Экзон Интрон

12q13.13, 13q32.1

Рис. 13. Схематичное изображение расположения локусов, полученных при использовании удлинителя праймера ССв, относительно кодирующих и регуляторных элементов генома.

3.3. ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТИЛИРОВАНИЯ ИССЛЕДУЕМЫХ ЛОКУСОВ В НОРМЕ И ПРИ РМЖ

С использованием модифицированного метода АИМС определены частоты метилирования 20 локусов в нормальных и опухолевых тканях (9 локусов из выборки АИМС-GCG и 11 локусов из выборки АИМС-CCG; табл. 1).

"На сегодняшний день уже существует информация о состоянии метилирования некоторых локусов, исследуемых в настоящей работе, в небольшом количестве образцов нормальных мононуклеаров периферической крови, нормальной молочной железы и в клеточной линии рака молочной железы MCF7. Для подтверждения правильности определения состояния метилирования изучаемых локусов использовано сравнение с доступными базами данных (табл. 2).

Информация для валидации полученных результатов о метилировании CpG-островков в нормальной молочной железе, мононуклеарах периферической крови и клеточной линии РМЖ MCF7 получена из базы данных проекта ENCODE (The Encyclopedia of DNA Elements) при помощи программы просмотра элементов генома UCSC Genome Browser (University of California Santa Cruz). База данных содержит отчеты о статусе метилирования ДНК в составе более чем 500 тысяч CpG-динуклеотидов генома с помощью бисульфитного секвенирования ограниченных выборок (Meissner A. et al., 2008).

Информация о метилировании мононуклеаров крови получена также с помощью ресурсов базы данных NGSmethDB: A database for NGS single-cytosine-resolution DNA methylation data [http://bioinfo2.ugr.es/NGSmethDB/gbrowse/hgl9/]. Исследователи сообщили об анализе 92,62% метилома мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) азиата, чей геном был расшифрован в рамках проекта YH - изучения МКПК анонимного китайского мужчины, условно именуемого Yan Huang (YH). Метилирование CpG-пар определялось с помощью полногеномного бисульфитного секвенирования с использованием геномного анализатора компании Illumina (Li et al., 2010).

Таблица 1. Частоты метилирования локусов ЛИМС-бСС] и АИМС-ССО в образцах ткани РМЖ, прилежащей условно нормальной ткани и нормальной ткани молочной железы.

Локус Опухоль, % Условная норма, % Р Нормальная молочная железа, %

ЫМВ1 (17д31.1) 16,1 (14/87) 9,1 (3/33) н/д 0(0/4)

ТЛР4 (20с113.33) 100(87/87) 87,9 (29/33) <0,01 100 (4/4)

/Ш/(ПрИ.}) 72,4 (63/87) 0 (0/33) <0,01 0(0/4)

МЛЭ1Ы (7р22.3) 100 (87/87) 100(33/33) н/д 100 (4/4)

КСШIX (3р24.3) 80,8 (30/87) 12,1 (4/33) <0,05 0(0/4)

БОСК6 (19р13.2) 34,5 (70/87) 3 (1/33) <0,01 0(0/4)

йРС2 (7(¡22.1) 56,3 (49/87) 9 (3/33) <0,01 0(0/4)

БНЗКВР1 (Хр22.12) 64,4 (56/87) 54,5 (18/33) н/д 0 (0/4)

1рЗЗ 79,3 (69/87) 17 (4/33) <0,01 0(0/4)

5р 15.33 87,4(76/87) 39,4(13/33) <0,01 0(0/4)

РРР2Я5С (N(¡32.31) 14,5 (9/62) 0 (0/34) <0,01 0 (0/4)

Р11Р15 (5 (¡31.1) 19,3 (12/62) 0 (0/34) <0,01 0 (0/4)

АТМШ (16(]23.2) 17,7(11/62) 0 (0/34) <0,0! 0 (0/4)

С2С02 (21д22.3) 6,5 (4/62) 3(1/34) н/д 0 (0/4)

К1АА13241 (7ц21.12) 59,7 (37/62) 50(17/34) н/д 0 (0/4)

1дБЕС2 (Хр 11.12) 27,4 (16/62) 3(1/34) <0,01 0 (4/4)

12ц13.13 22,6 (15/62) 6 (2/34) <0,01 0 (0/4)

13ч32.1 14,5 (9/62) 6 (2/34) н/д 0 (0/4)

АХ746725/АК127124 (2ц21.1) 8,1 (5/62) 6 (2/34) н/д 0 (0/4)

ТМЕМ176А/176В (7(¡36.1) 27,4 (17/62) 8,8 (3/34) <0,05 0 (0/4)

РОХМ1/НКМТ1188 (12р13.33) 8,1 (5/62) 6 (2/34) н/д 0 (0/4)

РРР2И5С (N(¡32.31) 14,5 (9/62) 0 (0/34) <0,01 0 (0/4)

РПР15 (5 (¡31.1) 19,3 (12/62) 0 (0/34) <0,01 0(0/4)

АТМШ (16(]23.2) 17,7 (11/62) 0 (0/34) <0,01 0 (0/4)

С2С02 (21(122.3) 6,5 (4/62) 3(1/34) н/д 0 (0/4)

Примечание: Красным цветом отмечены локусы, показавшие динамику увеличения метилирования в процессе озлокачествления ткани, н/д - различия недостоверны.

Таблица 2. Статус метилирования ДНК в мононуклеарах периферической крови (МПК), клеточной линии рака молочной железы МСР7 и нормальной молочной железы (НМЖ) в настоящем исследовании (НИ) в сравнении с результатами, полученными из эпигеномных баз данных (БД).

Локус НМЖ, БД НМЖ, НИ МПК, БД МПК, НИ MCF7, БД MCF7, НИ

PPP2R5C (14q32.31) - - - - _ _

KIAA1324L (7q21.12J - - + + н/д +

IQSEC2 (Xpll.12) - - - - -

PHF15 (5q31.1) - - - - _

A TMIN (16q23.2) - - - -

12ql3.13 н/д - н/д - н/д +

13q32.1 н/д - н/д - н/д +

C2CD2 (21q22.3) - - - - - _

AX746725/AK127124 (2q21.1) - - - - - -

TMEM176A/176B (7q36.1) - - н/д - н/д +

FOXM1/HKMT1188 (12pl3.33) - - "/д - н/д -

LAMB1 (17q31.1) - - - - - _

TAF4 (20q 13.33) + + + + + +

RAIl(17pl 1.2) - - - н/с _

MAD1L1 (7p22.3) + + + + + +

KCNH8 (3p24.3) - - - - + +

DOCK6 (19pl3.2) - - - - _

GPC2 (7q22.1) - - - - _ _

SH3KBP1 (Xp22.12) - - - н/с н/с

lp33 - - - - + +

5p 15.33 - - - н/с - н/с

Примечание: «+» - метилирование, «-» - отсутствие метилирования, н/с - нет сигнала, н/д - нет данных.

3.4. КОРРЕЛЯЦИИ АНОМАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ВЫЯВЛЕННЫХ ЛОКУСОВ С КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ РМЖ Ассоциации отдельных маркеров метилирования с клинико-морфологическими характеристиками РМЖ Ген LAMB] обнаружил статистически достоверные различия в частотах метилирования в группах с РМЖ, отличающихся по показателям иммуногистохимических исследований (ИГХ). Сравнения, показавшие достоверные различия, обнаружены в группе ER-, PR-, HER2var (9/23) и ER+, PR+, HER2var (5/40), где/5=0,026 (OR=0,22; 95%С1=0,06-0,78), а также ER-, PR-, HER2-(5/12) и ER+, PR+, HER2var (5/40), гдер=0,039 (OR=Q,2; 95%С1=0,045-0,88).

В группах, отличающихся только по статусу HER2, достоверных различий обнаружено не было. Данные могут свидетельствовать не только об участии гена LAMB1 в патогенетическом механизме, связанном с эстрогеновыми рецепторами, но также о том, что аномальное метилирование данного локуса гена LAMBI является маркером агрессивного поведения опухоли.

Ген SH3KBP1 обнаружил достоверные различия по частоте метилирования в группах с 2-ой степенью злокачественности (СЗ, 6-7 баллов) (30/39) и 3-ей СЗ (8-9 баллов) (10/21), р=0,0427 (OR=3,7; 95%С1=1,2-11,4) (рис.14). Ген PHF15 обнаружил достоверные различия в частоте метилирования в группах с 2-ой степенью злокачественности (СЗ, 6-7 баллов) (10/40) и 3-ей СЗ (8-9 баллов) (0/17), р=0,0245 (OR=0,083; 95%С1=0,005-1,5). В то же время ген GPC2 обнаружил различия уже на уровне 2-ой СЗ: 6 баллов 73% (8/11) и 7 баллов 50% (14/28) (рис.14). Выявленная гетерогенность соответствует данным ряда авторов, которые говорят о субъективизме определения и невысокой воспроизводимости критерия СЗ (Ермилова В.Д., 2002).

2 СЗ (6-7 баллов) 3 СЗ (8-9 баллов)

Рис. 14. Частоты метилирования маркера SH3KBP1 в группах с 2-ой СЗ (6-7 баллов) и 3-ей СЗ (8-9 баллов).

2 СЗ (6 баллов) 2 СЗ (7 баллов)

Рис. 15. Частоты метилирования маркера ОРС2 в группах с 2-ой СЗ (6 баллов) и 2-ой СЗ (7 баллов).

В литературе SH3KBP1 ассоциируют с устойчивостью опухоли яичников к химиотерапии, объясняя это тем, что делеция локуса Хр22.12, содержащего ген SH3KBP1, вызывает ингибирование эндоцитоза EGFR и, таким образом, усиление EGFR-сигналинга, который может приводить к снижению чувствительности клеток опухоли к паклитакселу и/или препаратам платины (Feng L., et al., 2011).

Также ген SH3KBP1 обнаружил достоверные различия в частоте метилирования в группах с различным размером опухоли: Т1 94% (16/17) и Т2 52% (29/56), р=0,0014 (OR=14,9; 95%С1=1,9-120,2).

Таким образом, метилирование маркера SH3KBP1 характеризует более легкие формы РМЖ с низкой СЗ и малым размером, и, кроме того, может оказаться маркером устойчивости к препаратам химиотерапии.

Индексы метилирования и клипико-морфологические характеристики РМЖ

Индекс метилирования (ИМ) является основной обобщающей числовой характеристикой панелей маркеров метилирования, отражающей, в некоторой степени, динамику метилирования геномов при возникновении и прогрессии опухолей. В настоящей работе ИМ определяется как число метилированных локусов (ш) к общему числу локусов панели (N): HM=m/N.

Нормальная МЖ T1

Условно нормальная МЖ

о Mean □ MeanlSD X Mean±1,96*SD

Рис.

молочной опухоли, и

Т2 Т4

16. Средние значения индексов метилирования в нормальной ткани железы, условно нормальной ткани молочной железы, прилежащей к в ткани РМЖ.

Из рисунка 16 видно, что при переходе норма-опухоль и при дальнейшей прогрессии рака (норма-Т1) уровень метилирования СрО-островков в целом нарастает, что подтверждает общепринятые данные о метилировании как раннем процессе канцерогенеза. При прогрессии опухоли идут процессы общей дестабилизации генома, что отражается в неоднородной картине уровней метилирования.

При исследовании диагностической значимости маркеров панели, полученной при использовании удлинителя праймера ССС были рассмотрены корреляции ИМ с клинико-морфологическими характеристиками РМЖ. Получены достоверные различия ИМ для опухолей в зависимости от размера: для Т1 (<2см) ИМ составил 0,68±0,16, для Т2 (2-5 см) ИМ=0,58±0,17, значение ранговой корреляции Спирмена г = -0,232 (р=0,049).

На основе интегрального параметра - индекса метилирования - сформированы системы маркеров для диагностики РМЖ.

3.5. ФОРМИРОВАНИЕ СИСТЕМ МАРКЕРОВ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РМЖ

В работе проведено определение клинической чувствительности и специфичности наборов выявленных маркеров в отношении определения РМЖ с использованием ROC (Receiver Operator Characteristic)-anaim3a.

Таблица 3. Состав наборов маркеров в панелях, анализируемых с помощью ЯОС-анализа. _

CCG+GCG «20» CCG+GCG «13» GCG «9» GCG «7»

PPP2R5C (14q32.31) + + - -

KIAA1324L (7q21J2) + - - -

IQSEC2 (Xpl 1.12) + + - -

PHF15 (5q31.1) + + - -

A TMIN (16q 2 3.2) + + - -

12q 13.13 + + - -

13q32.1 + - - -

C2CD2 (21q22.3) + - - -

AX746725/AK127124 (2q2l. 1) + - - -

TMEM176A/176B (7q36.1) + + - -

FOXM1/HKMT1188 (12pl3.33) + - - -

LAMB1 (17q31.1) + - + -

TAF4 (20ql3.33) + + + +

RAll(17pl 1.2) + + + +

KCNH8 (3p24.3) + + + +

DOCK6 (19pl3.2) + + + +

GPC2 (7q22.1) + + + +

SH3KBP1 (Xp22.12) + - + -

1P33 + + + +

5p 15.33 + + + +

ROC-кривая наиболее часто используется для представления результатов бинарной классификации. Поскольку классов два, один из них называется классом с положительными исходами (случаи РМЖ), второй - с отрицательными исходами (норма или морфологически неизмененная ткань молочной железы, прилежащая к опухоли). При этом предполагается, что у классификатора имеется некоторый параметр, варьируя который, мы будем получать то или иное разбиение на два класса. Этот параметр часто называют порогом, или точкой отсечения (cut-off value). Панель маркеров, полученная с использованием удлинителя праймера GCG (табл.3), показала высокие значения чувствительности (Ч) и специфичности (С). 4=97,7%, С=100% при сравнении с нормальным биологическим материалом, за критическое принято значение ИМ > 0,22. 4=84,1%, С=100% при сравнении с условно нормальным биологическим материалом, тканью молочной железы, прилежащей к ткани РМЖ. За

критическое принято значение ИМ > 0,44. Учитывая статистическую достоверность различия в частоте метилирования между опухолью и морфологически нормальной тканью молочной железы, прилежащей к опухоли, из 9 маркеров метилирования, полученных при использовании удлинителя праймера йСО, было отобрано 7, для которых также были просчитаны значения клинической чувствительности и специфичности с помощью ЯОС-анализа. 4=100%, С=100% при сравнении с нормальным биологическим материалом, за критическое принято значение ИМ > 0,1429. 4=89,8%, С=100% при сравнении с условно нормальным биологическим материалом, тканью молочной железы, прилежащей к ткани РМЖ. За критическое принято значение ИМ > 0,4286 (рис. 17).

ИМ

. ЭегиМу - БресМ; Ыепоп: 89,8 -.1000 .

>0,4286

О 20 40 ео 80 100

ЮО-ЭресЖсНу

Рис. 17. Определение клинической чувствительности и специфичности системы в составе 7 из 9 маркеров, выявленных АИМС с удлинителем праймера ОСв, в отношении нормальной молочной железы по параметру «Индекс метилирования».

При объединении локусов, показавших достоверные различия в метилировании РМЖ и прилежащей морфологически нормальной ткани, из двух наборов маркеров -выявленных АИМС с удлинителями вСв и ССй - мы получили панель из 13 маркеров (табл.3). При использовании 1ЮС-анализа при сравнении РМЖ и нормальной тканью МЖ были получены значения чувствительности 93,9% и специфичности 100%. При сравнении РМЖ с прилежащей условной нормой значение чувствительности составило также 93,9%, при специфичности 93,9% (рис.18). Пороговый ИМ для данных значений чувствительности и специфичности, оказался равным 0,2308, что соответствует метилированию 3 любых локусов панели. Использование всех 20 маркеров снижает качество диагностики (чувствительность 83,7% и специфичность 93,9%).

Таким образом, для диагностики рака молочной железы предложены две системы, оптимизированные по количеству маркеров. Первая включает 13 маркеров и характеризуется чувствительностью 93,9% и специфичностью 93,9%. Вторая состоит из 7 маркеров, с чувствительностью 89,8% и специфичностью 100%. Относительно

нормальной молочной железы вторая система маркеров метилирования характеризуется чувствительностью 100% и специфичностью 100%. При использовании любой из двух систем для постановки диагноза «рак молочной железы» достаточно выявления 4 маркеров в метилированном состоянии; метилирование 2-3 маркеров характерно для прилежащей к опухоли морфологически нормальной ткани; в здоровой ткани молочной железы выявляется метилирование одного из маркеров (ТЛР4).

100

S3

ео

40

20

Рис. 18. Определение клинической чувствительности и специфичности для объединенной панели маркеров из 13 маркеров в отношении условно нормальной молочной железы по параметру «Индекс метилирования».

В заключение, в результате проведенного исследования разработана модификация лабораторного протокола амплификации интерметилированных сайтов, использование которой позволило выявить 4 константно метилированные области генома и 19 областей, дифференциально метилированных в злокачественных опухолях, тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы. Впервые проведена оценка частот аномального метилирования этих локусов при РМЖ. Для некоторых из выявленных дифференциально метилированных локусов определены достоверные связи с клинико-морфологическими параметрами злокачественных опухолей молочной железы. По результатам изучения особенностей метилирования этих областей сформированы системы маркеров метилирования для диагностики РМЖ, демонстрирующие высокие показатели чувствительности и специфичности. Предложенная модификация метода скрининга дифференциального метилированния геномов и проведенная характеристика эпигенетических маркеров и их систем при РМЖ могут быть использованы в дальнейшем при разработке новых панелей диагностических маркеров канцерогенеза.

ВЫВОДЫ

1. Разработана оригинальная модификация лабораторного протокола адаптер-опосредованной амплификации интерметилированных сайтов: модифицированы этапы лигирования и амплификации, предложены оригинальные подходы к

ИМ

........-1-

i Sensitivity: ЭЗ.Э / Specificity: ЭЗ.Э ./.. TrilRiinn ■ ъП 93ПЯ

0 23 40 СО 80 100

100-Specifiaty

определению геномной локализации дифференциально метилированных фрагментов ДНК на основе картирования по подобию, прямого секвенирования и рестриктазного картирования для локусов, предсказанных in silico.

2. С помощью разработанного метода выявлено 23 локуса, принадлежащих пулу интерметилированных сайтов. Из них 15 локусов, принадлежащие генам LAMBI, RAH, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBPI, PPP2R5C, PHF15, ATMIN, C2CD2, KJAA1324L, АХ746725/АК127124, TMEMl 76A/TMEM176B, FOXMl/HKMTi 188, IQSEC2, и 4 локуса, принадлежащие межгенным областям хромосомных районов 1рЗЗ, 5р15.33, 12q 13.13 и 13q32.1, охарактеризованы как дифференциально метилированные в злокачественных опухолях, тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы. Четыре локуса, представляющие собой участки генов CUX1, MAD1L1, TAF4 и ZBTB4, охарактеризованы как константно метилированные во всех исследованных нормальных и опухолевых образцах молочной железы.

3. Частоты аномального метилирования выявленных локусов при раке молочной железы составляют от 5,1% до 87,4%. Существуют значительные различия информативности маркеров в наборах, получаемых при использовании различных вариантов амплификации интерметилированных сайтов, в выборке образцов рака молочной железы. Частоты метилирования локусов панели GCG находятся в диапазоне от 34,5% до 87,4%, в то время как частоты метилирования локусов панели CCG - в диапазоне от 5,1% до 59,7%.

4. Промоторные CpG-островки генов SH3KBPÍ и PHF15 достоверно чаще метилированы в образцах рака молочной железы со второй степенью злокачественности по сравнению с третьей степенью злокачественности. В то же время CpG-островок гена GPC2 обнаруживает различия уже в пределах второй степени злокачественности, что может свидетельствовать о субъективизме критерия «степень злокачественности» и недостаточности только морфологических характеристик для его определения. Метилирование промоторного CpG-островка гена LAMBI в материале РМЖ ассоциировано с негативным иммуногистохимическим статусом эстрогеновых и прогестероновых рецепторов. Промотор гена SH3KBP1 достоверно чаще метилирован в группе опухолей молочной железы с размером Т1 против опухолей с размером Т2.

5. Для диагностики рака молочной железы предложены две системы, оптимизированные по количеству маркеров. Первая включает 13 маркеров (PPP2R5C, IQSEC2, PHF15, AT MIN, TMEMl 76А/ТМЕМ176В, TAF4, RAH, KCNH8, DOCK6, GPC2 и фрагменты межгенных хромосомных районов I2q 13.13, 1рЗЗ, 5р15.33) и характеризуется чувствительностью 93,9% и специфичностью 93,9%. Вторая состоит из 7 маркеров (RAI!, KCNII8, DOCK6, TAF4, GPC21 и фрагменты межгенных хромосомных районов 1рЗЗ, 5р 15.33), с чувствительностью 89,8% и специфичностью 100%. Относительно нормальной молочной железы вторая система маркеров метилирования характеризуется чувствительностью 100% и специфичностью 100%. При использовании любой из двух систем для постановки диагноза «рак молочной железы» достаточно выявления 4 маркеров в метилированном состоянии; метилирование 2-3 маркеров характерно для прилежащей к опухоли морфологически нормальной ткани; в здоровой ткани молочной железы выявляется метилирование одного из маркеров (TAF4).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Стрельников В.В., Танас А.С., Ш кару но (Руденко) В.В., Кузнецова Е.Б., КекееваТ.В., Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Залетаев Д.В. Современный высокотехнологичный метод скрининга дифференциального метилирования геномов на основе амплификации интерметилированных сайтов // Молекулярная медицина, 2009. №4. С. 18-26

2. Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Немцова М.В., Бабенко О.В., Кузнецова Е.Б., Землякова В.В., Кекеева Т.В., Михайленко Д.С., Шкарупо (Руденко) В.В., Танас А.С. Маркеры метилирования в диагностике онкологических заболеваний // Медицинская генетика, 2010. Т.9 №1. С. 15-21

3. Танас А.С., Шкарупо (Руденко) В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Дизайн эксперимента и анализ результатов амплификации интерметилированных сайтов с использованием компьютерной программы AIMS in silico // Молекулярная биология, 2010. Т.44 № 2. С. 355-365

4. Tanas A.S., Shkarupo (Rudenko) V.V., Kuznetsova E.B., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Novel tools for unbiased DNA differential methylation screening // Epigenomics, 2010. Vol. 2. No. 2. P. 325-333

Публикации в других изданиях:

5. Танас А.С., Стрельников В.В., Шкаруно (Руденко) В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Современный высокотехнологичный метод диагностики маркеров метилирования в онкологии // Онкогематология, 2008. №4. С. 73-74

6. Strelnikov V.V., Tanas A.S., Shkarupo (Rudenko) V.V., Kuznetsova E.B., Zaletaev D.V. Unbiased differential methylation screening assay for applications in cancer epigenetic research. 11 European Workshop on Cytogenetics and Molecular Genetics of Solid Tumours // Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology, 2008. P. 5960

7. Shkarupo (Rudenko) V.V., Tanas A.S., Kuznetsova E.B., Zavalishina L.E., Frank G.A., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. A semi-automated unbiased differential methylation screening assay for applications in cancer epigenetic research // Eur. J. Hum. Genet., 2008. V.16. Suppl. 2. P. 223

8. Шкаруио (Руденко) B.B., Танас A.C., Кузнецова Е.Б., Стрельников

B.В.,Залетаев Д.В. Метод анализа структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы // Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» Москва, 2008. С. 489

9. Стрельников В.В., Танас А.С., Шкаруно (Руденко) В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Синтетический непредвзятый метод скрининга дифференциального метилирования геномов опухолевых клеток // V Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», научная программа и тезисы, 2008.

C. 94-95

10.Танас А.С., Шкарупо (Руденко) В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Программное обеспечение для скринига дифференциального метилирования геномов на основе амплификации интерметилированных сайтов // Медицинская генетика, 2009. Т.8. №12 (90). С. 33

11.Tanas A.S., Shkarupo (Rudenko) V.V., Kuznetsova E.B., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. Amplification of intermethylated sites, Bioinformatics and Capillary electrophoresis: the ABC of the cancer methylomes // Eur. J. Hum. Genet., 2009. V.17. Suppl.2. P. 284

12.Tanas A.S., Shkarupo (Rudenko) V.V., Kuznetsova E.B., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Software for Genomic/Epigenomic Research // Eposters.net - the online journal of scientific posters, 2009. EP10983

13.Шкарупо (Руденко) B.B., Танас A.C., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников B.B. Современные подходы к скринингу дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы // Медицинская генетика, 2009. Т.8. №12 (90). С. 41

14.Стрельников В.В., Танас A.C., Шкарупо (Руденко) В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Современные высокотехнологичные методы диагностики маркеров метилирования ДНК в онкологии // Пятый московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 16-20 марта 2009. С. 90-91

15.Шкарупо (Руденко) В.В., Танас A.C., Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В., Залетаев Д.В. Скрининг дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, г.Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010. С. 197

16.Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Шкарупо (Руденко) В.В., Танас A.C., Залетаев Д.В. Уроки непредвзятого скрининга дифференциального метилирования ДНК // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, г.Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010. С. 172-173

17. Strelnikov V., Tanas A., Shkarupo (Rudenko) V., Kuznetsova E., Gorban N., Zaletaev D. Non-microarray DNA differential methylation screening in breast cancer // 12th European Workshop on Cytogenetics and Molecular Genetics of Solid Tumors, Nijmegen, the Netherlands, 3-6 June 2010. P. 104

18.Tanas A., Shkarupo (Rudenko) V., Kuznetsova E., Zaletaev D., Strelnikov V. AIMS in silico & PeakPick: a software package supporting unbiased screening of DNA differential methylation in cancer // 12th European Workshop on Cytogenetics and Molecular Genetics of Solid Tumors, Nijmegen, the Netherlands, 3-6 June 2010. P. 106

19.Танас A.C., Шкарупо (Руденко) B.B., Стрельников B.B. Компьютерная программа AIMS in silico // Рекламно-техническое описание, описание программы, описание применения. Регистрационный номер ВНТИЦ 50201050017. Москва, 2010 г.

20.Танас A.C., Руденко В.В., Стрельников В.В. Компьютерная программа PeakPick // Рекламно-техническое описание, описание программы, описание применения. Регистрационный номер ВНТИЦ 50201050040. Москва, 2010 г.

21.Руденко В.В., Танас A.C., Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Скрининг аномального метилирования ДНК на основе метода амплификации интерметилированных сайтов для диагностики злокачественного опухолевого процесса // Медицинская ДНК-технология, Разрешение ФС № 2011/132 от 27.05.2011г.

22.Танас A.C., Руденко В.В., Стрельников В.В., Залетаев Д.В. Алгоритмы и программное обеспечение скрининга эпигенетических нарушений при раке // Шестой московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2011. С. 139-140

23.Танас A.C., Руденко В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Алгоритмы и программное обеспечение скрининга дифференциального метилирования геномов клеток злокачественных новообразований // III Международная Студенческая Научно-практическая Конференция РУДН, 2011. С.25-26

24. Руденко В.В., Кузнецова Е.Б., Танас A.C., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Скрининг дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы // III Международная Студенческая Научно-практическая Конференция РУДН, 2011. С. 24-25

25.Танас A.C., Рудеико В.В., Стрельников B.B. Программа для ЭВМ "AIMS in silico 2". Рекламио-техиическое описание, описание применения. Регистрационный номер ВНТИЦ 50201151514, Москва, 2011 г.

Список сокращении.

АИМС - амплификация интерметилированных сайтов ДНК - дезоксирибоиуклеиповая кислота ИМ - индекс метилирования

МЧ-ПЦР - метилчувствигельная полимеразная ценная реакция

н.н. - пара нуклеотидов

ПААГ - нолиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РМЖ - рак молочной железы

РФФИ - Российский фонд фундаментальных исследований СЗ - степень злокачественности

ENCODE - энциклопедия ДНК-элементов (The Encyclopedia of DNA Elements) ROC - операционная характеристика классификатора (Receiver Operator Characteristic)

Подписано в печать. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 120 Экз. Заказ № 962 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Руденко, Виктория Владимировна, Москва

61 12-3/749

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Медико-генетический научный центр" Российской академии медицинских наук

На правах рукописи

Руденко Виктория Владимировна

НОВЫЕ МАРКЕРЫ АНОМАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК ПРИ РАКЕ

МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫЕ НЕПРЕДВЗЯТЫМ СКРИНИНГОМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ

03.02.07 «генетика»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель к.б.н. В.В. Стрельников

Москва 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.................................................4

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................................6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................14

1.1. Особенности морфологии молочной железы.........................................14

1.4. Стволовая клетка молочной железы.......................................................22

1.5. Влияние микроокружения на инициацию и прогрессию РМЖ.............25

1.6. Наследственные и спорадические формы РМЖ.....................................31

1. 7. Клинико-морфологические параметры и их системы...........................32

1.12. Значение метилирования в норме и в процессах канцерогенеза.........56

1.13. Маркеры гипо- и гиперметилирования.................................................57

1.14. Диагностические маркеры метилирования...........................................58

1.15. Применение маркеров метилирования в прогностических системах

для РМЖ..........................................................................................................62

1.17. Применение маркеров метилирования в морфологической и молекулярной таксономии РМЖ....................................................................66

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................70

2.1. Клинический материал.............................................................................70

2.2. Забор крови, операционного и биопсийного материала........................71

2.3. Выделение геномной ДНК.......................................................................72

2. 4. Ферментативный гидролиз ДНК и лигирование с адаптерами............73

2.5. Полимеразная цепная реакция для метода АИМС.................................73

2. 6. Рестрикционный анализ..........................................................................74

2.7. Картирование по аналогии.......................................................................74

2. 8. Фрагментный анализ продуктов АИМС................................................76

2. 9. Обработка ДНК бисульфитом натрия....................................................76

2. 10. Метил-специфическое секвенирование..............................................77

2. 11. Электрофорез в ПААГ..........................................................................77

2. 12. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра....................................78

2. 13. Программное обеспечение....................................................................78

2.14. Статистическая обработка данных........................................................79

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.................................................80

3.1. Модификация исходного протокола метода амплификации интерметилированных сайтов (АИМС)........................................................80

3.1.1. Модификации метода АИМС на этапе лигирования.......................81

3.1.2. Модификации метода АИМС на этапе ПЦР....................................87

3.1.3. Модификации метода АИМС на этапах визуализации и геномной идентификации продуктов АИМС..............................................................95

3.2. Характеристика метилирования нормальных и опухолевых геномов модифицированным методом АИМС............................................................99

3.2.1. Характеристика метилирования геномов модифицированным методом АИМС с удлинителем вСв.........................................................99

3.2.2. Характеристика метилирования участков геномов модифицированным методом АИМС с удлинителем ССв....................107

3.3. Описание функциональной значимости выявленных геномных локусов ........................................................................................................................114

3.4. Формирование систем диагностических маркеров метилирования и

выявление клинико-генетических корреляций..............................................120

3.4.1. Характеристика метилирования исследуемых локусов в норме и приРМЖ....................................................................................................120

3.4.2. Ассоциации маркеров метилирования с клинико-морфологическими характеристиками РМЖ...........................................125

3.4.3. Формирование системы маркеров для диагностики РМЖ............132

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................139

ВЫВОДЫ..........................................................................................................142

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................144

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ АА - акриламид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота МС-ПЦР - метилспецифическая ПЦР

МС-ДГГЭ - метилспецифический денатурирующий градиентный гель-электрофорез

МЧ-ПЦР - метилчувствительная ПЦР МС-сиквенс - метилспецифический сиквенс

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратных транскриптов ПААГ - полиакриламидный гель ПГ - потеря гетерозиготности

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПК - протеинкиназы

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РМЖ - рак молочной железы

ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

APS - аммония персульфат

dCTP - дезоксицитидинтрифосфат

dNTP - дизоксинуклеотидтрифосфат

dTTP - дезокситимидинтрифосфат

PBS - фосфатный буфер

SDS - додецилсульфат натрия

SSC - статдартный солевой раствор: 0,15 М хлорид натрия, 0,015 М цитрат натрия

SSCP - метод анализа конформации однонитевых фрагментов ТВЕ - трис-боратный буфер: 89 шМ трис-борат, 89 тМ борная кислота, 2 шМ ЭДТА

ТЕ - 10 шМ трис-HCl, рН 8.0, 1 шМ ЭДТА TEMED - тетраметилэтилендиамин

Аббревиатуры генов и их белковых продуктов, а так же сокращения распространённых единиц измерения даны в соответствии с общепринятыми номенклатурами.

ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы.

Задачами онкогеномики являются изучение молекулярных механизмов канцерогенеза и разработка эффективных методов диагностики, прогноза течения, оптимизации лечения и мониторинга рецидивирования опухолей. Процесс злокачественной трансформации клеток характеризуется накоплением большого количества повреждений в геноме опухолевой клетки. Нарушение функционирования генов, вовлеченных в процессы канцерогенеза, связывают как со структурными повреждениями, так и с эпигенетическими аномалиями, к числу которых относится, в частности, гиперметилирование ДНК в регуляторных областях генов (Esteller М. et al., 2001). Анализ маркеров метилирования на сегодняшний день является оптимальным инструментом молекулярно-генетической диагностики и мониторинга в онкологии. По специфичности он не уступает анализу экспрессии генов, значительно превосходя последний по простоте и доступности. Что же касается анализа структурных аномалий, то это остается достаточно дорогостоящей процедурой и находит применение в основном в диагностике наследственных онкологических синдромов и для выявления стандартных мутаций, определяющих чувствительность опухолей к тем или иным химиопрепаратам (Васильев Е.В. с соавт., 2009; Бабенко О.В. с соавт., 2009; Алексеева Е.А. с соавт., 2012).

Анализ метилирования ДНК имеет ряд преимуществ перед детекцией мутаций при выявлении клеток рака в образцах тканей или свободной ДНК из опухолевых клеток в биологических жидкостях. Во-первых, частоты аномального метилирования CpG-островков множества генов значительно превышают частоты структурных повреждений тех же генов при канцерогенезе (Kaneda et al., 2002; Miyamoto et al., 2003). Во-вторых, выявление аномально метилированных молекул ДНК в избытке нормального биологического материала не вызывает значительных

проблем, детекция же мутаций/делеций в этой ситуации практически невозможна. В-третьих, анализ метилирования технически прост и в большинстве случаев сводится к ПЦР одного локуса. Поиск мутаций в одном гене требует анализа многих локусов; кроме того, 100%-ная эффективность достигается только после секвенирования фрагментов ПЦР. Наконец, аномальное метилирование наблюдается в пренеопластических тканях и может служить одним из наиболее ранних маркеров канцерогенеза (Esteller М. etal, 2001).

Несмотря на диагностические преимущества маркеров метилирования ДНК, они до сих пор не получили широкого распространения в клинической онкологии. Это объясняется, в частности, недостатком хорошо изученных и охарактеризованных генов, аномальное метилирование которых достоверно связано с тем или иным патоморфологическим типом опухоли (Jones Р. et al., 2007). В связи с этим особое значение приобретает идентификация и подробная характеристика особенностей метилирования новых геномных локусов, непосредственно или опосредованно вовлеченных в канцерогенез, что в значительной степени определило цель и задачи настоящей работы.

Первое место в структуре смертности от онкологических заболеваний у женщин занимает рак молочной железы (Давыдов М. И. с соавт., 2007). Чрезвычайная гетерогенность молекулярно-генетических характеристик этого заболевания находит свое отражение на клиническом уровне. Рак молочной железы характеризуется крайне разнообразным клиническим течением - от агрессивного до вялотекущего с поздним и редким метастазированием (Ермилова В.Д., 2002). Выраженная гетерогенность на клиническом, гистопатологическом и молекулярном уровнях привела к созданию многочисленных маркеров заболевания, которые, тем не менее, не всегда обеспечивают достаточный уровень эффективности диагностики. Это объясняет необходимость разработки более современных мультигенных панелей маркеров, в том числе и панелей маркеров

метилирования (Maier S. et al., 2007; Widschwendter M. et al., 2008). Современные исследования говорят о принципиальной возможности использования как панелей маркеров, так и единичных маркеров метилирования в качестве прогностических и предиктивных при раке молочной железы (Hartmann О. et al., 2009). Использование оптимизированого метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов в исследованиях рака молочной железы уже привело к выявлению целого ряда новых маркеров (Кузнецова Е.Б. с соавт., 2007), которые в настоящее время активно изучаются как с точки зрения участия в процессах канцерогенеза, так и с точки зрения диагностических приложений (Rutella, S. et al., 2009; Hawes S.E. et al., 2010; Wang Y., Rekaya R., 2010). Разработка и внедрение более современных протоколов скрининга дифференциального метилирования и характеристики новых маркеров аномального метилирования должны повысить эффективность создания систем диагностических маркеров рака молочной железы.

Задачи исследования:

1. Разработать модификацию метода амплификации интерметилированных сайтов (АИМС) для непредвзятого скрининга дифференциального метилирования ДНК.

2. Идентифицировать новые дифференциально метилированные геномные локусы в опухолях, условно нормальных тканях молочной железы, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы.

3. Оценить частоты метилирования выявленных геномных локусов в опухолях, условно нормальных тканях молочной железы, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы.

4. Выявить корреляции дифференциального метилирования выявленных локусов с клинико-морфологическими характеристиками опухолей молочной железы.

5. Предложить систему маркеров метилирования для диагностики РМЖ, оценить параметры её чувствительности, специфичности и достаточности

состава маркеров с точки зрения молекулярной классификации образцов клинического материала.

Научная новизна.

В результате проведенного исследования разработана модификация метода непредвзятого скрининга дифференциального метилированния геномов, применение которой позволило выявить 4 константно метилированных и 19 дифференциально метилированных областей генома. Дифференциальное метилирование при раке молочной железы впервые показано для 15 генов: LAMBI, RAH, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1, PPP2R5C, PHF15, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2, АХ746725/АК127124, ТМЕМ176А/ТМЕМ176В, FOXM1/HKMT1188. Четыре дифференциально метилированные области впервые выявлены в межгенных областях на хромосомах 1рЗЗ, 5р15.33, 12ql3.13 и 13q32.1. В выборке 140 образцов РМЖ проведена оценка частот аномального метилирования указанных локусов. Особенности метилирования выявленных областей охарактеризованы впервые.

Впервые продемонстрированы ассоциации метилирования CpG-островков генов SH3KBP1, PHF15, GPC2 и LAMBI с клинико-морфологическими свойствами опухолей молочной железы. Промоторы SH3KBP1 и PHF15 достоверно чаще метилированы в опухолях со второй степенью злокачественности по сравнению с третьей степенью злокачественности. В то же время CpG-островок гена GPC2 обнаруживает различия уже в пределах второй степени злокачественности, что говорит о субъективизме критерия «степень злокачественности» и недостаточности только морфологических характеристик для его определения. Также показано, что ген SH3KBP1 достоверно чаще метилирован в группе опухолей молочной железы с размером Т1 против опухолей с размером Т2. Метилирование промоторного CpG-островка гена LAMBI в образцах рака молочной железы ассоциировано с негативным иммуногистохимическим статусом эстрогеновых рецепторов.

Сформированы оригинальные системы маркеров метилирования для диагностики рака молочной железы, демонстрирующие высокие показатели чувствительности и специфичности. Показано, что для формирования системы, обеспечивающей молекулярную классификацию тканей молочной железы со специфичностью 100%, достаточно семи маркеров метилирования.

Теоретическая и практическая значимость.

Выявленные дифференциально метилированные локусы и разработанная система скрининга дифференциального метилирования геномов позволяют проводить сравнительные исследования паттернов метилирования ДНК в норме и при злокачественных новообразованиях. Предложенный дизайн адаптер-опосредованной метилчувствительной полимеразной цепной реакции позволяет определять в формате реакции в одной пробирке состояние метилирования 7 геномных локусов, составляющих систему маркеров диагностики рака молочной железы, различающую злокачественную опухоль от окружающей морфологически нормальной ткани молочной железы с чувствительностью 89,8% и специфичностью 100%. Использование этой системы для молекулярной классификации злокачественной опухоли и здоровой ткани молочной железы обеспечивает диагностическую чувствительностью 100% при 100%-ной специфичности.

Определено количество маркеров метилирования, необходимое и достаточное с точки зрения молекулярной классификации образцов клинического материала. В частности, в системе из 7 маркеров для постановки диагноза «рак молочной железы» достаточно выявления 4 маркеров в метилированном состоянии; наличие 2-3 маркеров характерно для прилежащей к опухоли морфологически нормальной ткани; в здоровой ткани молочной железы выявляется метилирование одного из маркеров системы. Указанные параметры позволяют проводить диагностику со специфичностью 100%.

Апробация работы.

Материалы исследования были доложены на V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва) в 2008 г., конференции молодых ученых, посвященной 40-летию МГНЦ РАМН (г. Москва) в 2009 (диплом и премия), VI съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 г. (г. Ростов-на-Дону), III международной научно-практической конференции молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (г. Москва) в 2011 г., на конкурсе региональной программы "Умник" (г. Москва) в 2011г.

По результатам работы опубликовано 4 статьи, 15 тезисов.

Разработанные в рамках исследования алгоритмы и компьютерные программы были использованы при выполнении НИР по гранту РФФИ № 0804-01685 «Общие закономерности структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы», по государственному контракту № 8/3-655н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака мочевого пузыря», по государственному контракту № 8/3-657н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака почки», по государственному контракту № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых диагностических технологий на основе механизмов эпигенетической регуляции», по гранту Earlier Breast Cancer Test Foundation " Development and validation of a differential methylation screening technology applicable for the identification of early breast cancer diagnostic markers" (2007-2010rr).

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная модификация метода амплификации интерметилированных сайтов является эффективным унифицированным инструментом скрининга дифференциального метилирования геномов, который может использоваться как для поиска, так и для характеристики новых маркеров метилирования при канцерогенезе.

2. Применение оригинального лабораторного протокола позволяет выявлять дифференциально и константно метилированные локусы генома в злокаче