Идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы

Кузнецова, Екатерина Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы"

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА Екатерина Борисовна

Идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы

03.00.15 "Генетнка"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2006 г.

Работа выполнена в лаборатории эпигенетики Медико-генетического научного центра РАМН 1

Научный руководитель: кандидат биологических наук

В.В. Стрельников

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.В. Носиков; доктор биологических наук, профессор А.В.Поляков.

Ведущая организация: НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Защита диссертации состоится " "_200_ г.

в_час. на заседании Диссертационного Совета Д 001.016.01 по адресу:

Москва, 115478, ул. Москворечье, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан " "_2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор биологических наук

профессор

Л.Ф. Курило

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Основными задачами онкогеномики являются изучение молекулярных механизмов канцерогенеза и разработка оптимальных методов предупреждения, диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. В связи с этим особое значение приобретает проблема идентификации генов, вовлеченных в канцерогенез, и их подробная характеристика. Один из подходов к решению этой задачи основывается на анализе эпигенетических особенностей генома опухолей. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов подразумевает изменения генома, отличные от структурных вариаций кодирующих областей генов. К эпигенетическим явлениям относятся, в частности, метилирование-деметилирование ДНК и гистонов, ацетилирование-деацетилирование гистонов, полиморфизмы повторяющихся последовательностей в регуляторных областях генов.

В настоящее время разработан ряд методов, позволяющих выявлять аномально метилированные локусы в геноме опухолевой клетки. Идентифицированные с помощью подобных методов гены в дальнейшем характеризуются с точки зрения их молекулярной патологии при канцерогенезе, в частности, оценивается их экспрессия, структурные нарушения и метилирование в норме и патологии. Особое внимание целесообразно уделять подробной характеристике особенностей метилирования изучаемых генов. Это обусловлено тем, что анализ маркеров метилирования на сегодняшний день является оптимальным инструментом молекулярно-генетической диагностики и мониторинга в онкологии. По специфичности он не уступает анализу экспрессии генов, значительно превосходя последний по простоте и доступности. Что же касается анализа структурных аномалий, он остается достаточно дорогостоящей процедурой и находит применение, в основном, в диагностике наследственных онкологических синдромов.

Анализ аномалий метилирования должен опираться на фундаментальную научную основу. В частности, необходимо значительно расширить генный состав применяемых диагностических панелей. Список хорошо изученных диагностических и прогностических маркеров метилирования не превышает на сегодняшний день двух десятков, причем многие из них не являются специфичными. Все применяемые маркеры должны быть четко охарактеризованы с точки зрения тканеспецифичности опухолей, информативности, особенностей метилирования Срв-островков в норме и при патологии.

Актуальность проблемы заключается в следующем:

групп риска, раннему выявлению заболеваний, повышению эффективности дифференциальной диагностики, определению тактики лечения и контролю за его эффективностью.

2. Существующие панели молекулярно-генетических маркеров канцерогенеза не обеспечивают необходимого уровня эффективности диагностики, что объясняется, в первую очередь, недостатком всесторонне изученных маркеров.

3. На сегодняшний день одним из оптимальных инструментов молекулярно-генетической диагностики и мониторинга в онкологии является анализ маркеров метилирования. Тем не менее, выбор таких маркеров часто проводится на случайной основе без учёта эпигенетических характеристик конкретных геномных локусов. Совершенствование молекулярно-генетической диагностики онкозаболеваний невозможно без идентификации новых генов, вовлечённых в канцерогенез, и подробной характеристики особенностей эпигенетической регуляции их функционирования в норме и при патологии.

Цель н задачи исследования. Основной > целью работы является идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы.

Задачами исследования являются:

1. Оптимизация методологии скрининга дифференциального метилированния геномов нормальных и опухолевых клеток.

2. Идентификация локусов генома человека, аномально метилированных в образцах РМЖ и определение их принадлежности к конкретным генам.

3. Оценка частот метилирования CpG-островков выявленных генов в норме и при РМЖ.

4. Высокоразрешающее картирование метилирования CpG-островков изучаемых генов.

5. Изучение особенностей экспрессии исследуемых генов при РМЖ.

6. Оценка информативности выявленных эпигенетических маркеров канцерогенеза.

Научная новнзна. В результате проведенного исследования разработана эффективная и экономичная модификация метода поиска дифференциально метилированных CpG-островков в геноме опухолевых клеток. На основании применения этой методики выявлено семь областей генома человека, дифференциально метилированных в ДНК из образцов тканей РМЖ и принадлежащих CpG-островкам генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN], KCNH2, CACNG4 и PSMFL Для указанных генов впервые проведен анализ метилирования их промоторных областей при РМЖ, а также в нормальных тканях молочной железы и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров. Построены высокоразрешающие карты метилирования

CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B и В INI. Проведен количественный анализ экспрессии указанных генов в операционном материале РМЖ и клеточных линиях РМЖ. Показано снижение экспрессии генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BINI, KCNH2, CACNG4 и PSMF1 в тканях РМЖ с частотами от 44% до 94%. Показано значительное снижение экспрессии генов LAMC3 и BIN1 в клеточной линии РМЖ MCF7 и генов BIN1 и SEMA6B в клеточной линии РМЖ T47D.

Подробное исследование метилирования и экспрессии генов, выявленных в ходе работы, в злокачественных опухолях проведено впервые, а полученные результаты свидетельствуют о значительной роли эпигенетических факторов в регуляции функции этих генов при канцерогенезе.

Практическая значимость. Разработанная система скрининга дифференциального метилирования геномов высоко воспроизводима, подробно охарактеризована и может быть использована в дальнейшем в работах по характеристике эпигенетических нарушений, ассоциированных с социально значимыми заболеваниями. В настоящем исследовании скрининг дифференциального метилирования CpG-островков в 40 парных (опухоль и норма) образцах ДНК больных РМЖ позволил выявить семь генов, экспрессия которых подвержена аномальной эпигенетической регуляции при канцерогенезе: LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BINI, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Разработаны методики мультилокусной метилчувствительной ПЦР для CpG-островков каждого из изучаемых генов, предназначенные для оценки статуса их метилирования в материале опухоли. В выборке из 98 образцов РМЖ проведена оценка частот аномального метилирования генов LAMC3, SEMA6B, VC1P135, В INI, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Анализ экспрессии перечисленных генов в 16 парных образцах ДНК больных РМЖ позволил провести предварительную оценку информативности снижения экспрессии каждого из генов как маркера канцерогенеза. Созданные карты метилирования соответствующих CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B и BINI и результаты проведённого экспрессионного анализа изучаемых генов представляют собой базу для разработки научно обоснованных систем эпигенетических маркеров канцерогенеза. Для . генов SEMA6B и LAMC3 определены наиболее выраженные функциональные изменения при РМЖ (частота аномального метилирования SEMA6B - 38%, частота не менее чем 10-кратного снижения экспрессии SEMA6B - 38%, частота не менее чем 10-кратного снижения экспрессии LAMC3 - 59%). Полученные результаты позволяют рекомендовать включение этих генов в панели диагностических маркеров канцерогенеза.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная модификация метилчувствительного фингерпринтинга является эффективной системой скрининга дифференциального метилирования геномов.

2. Промоторные области генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1 подвергаются аномальному метилированию при РМЖ.

3. Разработаны карты метилирования CpG-динуклеотидов промоторных районов генов LAMC3, SEMA6B и BINI.

4. Экспрессия генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BINI, KCNH2, CACNG4 и PSMFI нарушается при РМЖ, с преобладанием ее снижения для большинства изученных генов.

Апробация работы.

Материалы исследования были доложены на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2005-2006 гг., на конференции Российского общества медицинских гёнетиков в 2005 г. (г. Уфа), на международной конференции «Биомедицина и биобезопасность» в 2005 г. (г. Москва), конференции по функциональной геномике Европейского Научного Фонда в 2005 г. (г. Осло). По результатам работы опубликовано 3 статьи и 5 тезисов. Решением Научного комитетá Европейской конференции генетики человека (Амстердам, 2006) исследование признано лучшей научной работой коллектива молодых ученых.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (результаты и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 146 ссылок. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 28 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материал для исследования был любезно предоставлен ГУ РОНЦ РАМН им. Н. Н. Блохина, Московским научно-исследовательским онкологическим институтом им. П.А. Герцена и донорским пунктом ММА им. И.М. Сеченова.

Все случаи РМЖ классифицированы по TNM согласно требованиям Международного противоракового союза (UICC, версия 1989 г.). Гистологическую идентификацию тканей проводили в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической онкологии РОНЦ РАМН и отделе патоморфологии Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена, где были получены серийные

срезы замороженных образцов опухолевых и прилежащих нормальных тканей.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты геномную ДНК из лимфоцитов периферической крови и тканей выделяли стандартным методом (Sambrook et al., 1989). Выделение РНК проводили методом кислофенольной экстракции с использованием набора "РИБО-золь-А" (фирма АмплиСенс, Россия)

Рестрикцию ДНК и электрофорез проводили стандартными методами (Sambrook et al., 1989). В работе использовались рестриктазы Rsal, Mspl и Hpall.

Разработана эффективная и экономичная модификация метода метилчувствительного фингерпринтинга (МЧФП). предназначенного для поиска дифференциально метилированных CpG-островков в геноме опухолевых клеток. В результате внесенных изменений исключены этапы радиоавтографирования гелей и клонирования продуктов реакции, расширены возможности визуального контроля на каждом этапе эксперимента.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме (Saiki, 1989) при помощи программируемого многоканального амплификатора ДНК «Терцик» фирмы ДНК-Технология с использованием термофильной ДНК-полимеразы Taq фирмы «ИнтерЛабсервис» г. Москва. В работе была использована метилчувствительная (МЧ-ПЦР) и метилспецифическая ПЦР (МС-ПЦР). Принцип методов МЧ-ПЦР и МС-ПЦР приведен в ранее опубликованных работах (Baur et al., 1999; Землякова и др., 2003).

Реакцию автоматического прямого секвенирования проводили на приборе ABI Prism 310, с использованием Genetic Analyzer Kits "Applied Biosystems" по протоколам производителя. Результаты секвенирования обрабатывали с использованием программы Chromas 3.01. Очистку продукта ПЦР для МС-секвенирования проводили согласно протоколу Quantum Prep Freeze 'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns (BIO-RAD).

Реакцию обратной транскрипции РНК проводили методом случайного праймирования с использованием High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems, США) по протоколу фирмы-производителя в термоциклере GeneAmp2700.

Анализ экспрессии изучаемых генов проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени на приборе ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, США) с использованием зондов TaqMan, меченых флуоресцентным красителем FAM. Зонды и праймеры предоставлены фирмой Applied Biosystems. В качестве эндогенных контролей использованы гены 18S-г RNA, GAPDH, АСТВ и В2М.

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программ Blast и Fasta, Genebank Pustell, Genepro, WIN-SUN, Oligo 4.0, Executor и Chromas.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Оптимизация метода поиска аномально метилированных CpG-островков.

Оптимизация метода МЧФП проводилась с учетом недостатков, присущих более ранним модификациям и сводилась к повышению воспроизводимости результатов, снижению токсичности, себестоимости и трудоемкости исследований, расширению возможностей визуального контроля на каждом этапе эксперимента.

В целом, подготовка пулов анализируемых CpG-островков проходила по стандартной методике ПЦР в мягких условиях со статистическими G,C-богатыми праймерамн (Gonzalgo et al., 1997). Однако мы отказались от использования радиоактивно меченых праймеров, применив вместо радиоавтографии метод визуализации продуктов фингерпринтинга в геле окраской нитратом серебра (рис. 1).

_1__2__э_ M

Ríil Rial Rt»I R»I R»I Rial Rial Rial Rial + + + + + +

bbpl НраП Mtpl НраП Mn'I НраП

Рис.1. Пример визуализации продуктов фингерпринтинга в геле путем окраски нитратом серебра. 1,2,3- образцы РМЖ, М - маркер молекулярного веса; стрелкой указан фрагмент, дифференциально метилированный в представленных образцах.

Проведенные нами эксперименты показали возможность четкого разделения продуктов фингерпринтинга в неденатурирующих полиакриламидных гелях (ПААГ), что позволило отказаться от использования денатурирующих агентов и гелей с низкой концентрацией акриламида. Такие нововведения значительно снизили токсичность, материальные и временные затраты, трудоемкость исследования. Кроме того, примененный способ окраски гелей позволил проводить непосредственный визуальный контроль за изоляцией интересующих фрагментов, а также обеспечил значительное

сокращение промежутка времени от анализа геля и выявления интересующих фрагментов до их реамплификации, что способствовало сохранению целостности фрагментов ДНК.

Процедура клонирования фрагментов ДНК, извлеченных из геля, которая применялась в первоначальной модификации метода, была заменена непосредственным прямым секвенированием с праймеров, использующихся при постановке МЧФП. Основная проблема при этом заключается в том, что даже при использовании в МЧФП пары разных праймеров продукт амплификации с высокой вероятностью может быть фланкирован только одним из них. Решение проблемы основано на том, что все интересующие продукты МЧФП содержат, по крайней мере, один сайт узнавания рестриктазы Mspl, поскольку именно по этому признаку и производится их селекция. Гидролиз продуктов реамплификации участков CpG-островков, элюированных из ПААГ, этим ферментом приводит к образованию фрагментов различной длины, два из которых оканчиваются последовательностями, гомологичными праймеру. Секвенирование смеси рестриктов с этого праймера в подавляющем большинстве случаев приводит к получению информативной нуклеотидной последовательности, достаточно протяженной для однозначной идентификации искомого участка генома.

Идентификация дифференциально метилированных CpG-островков в образцах ДНК больных РМЖ.

С использованием разработанной модификации метода МЧФП проанализировано 40 парных (норма + опухоль) образцов ДНК больных РМЖ и выявлено 43 фрагмента, содержащих, по крайней мере, один сайт узнавания рестриктазы Mspl. Среди этих фрагментов 25(58%) были метилированы и 11(26%) неметилированы во всех опухолевых образцах. Для 7(16%) фрагментов было показано дифференциальное метилирование, по крайней мере, в одной из пар .образцов. Эффективность выявления дифференциально метилированных 'фрагментов ДНК с помощью разработанной нами модификации метода сопоставима с результатами, полученными другими авторами. Так в работе Liang, основанной на применении метода МЧФП, разработанного Conzalgo, дифференциально метилированные фрагменты составили 13,5% от общего количества полученных фрагментов (Liang G et al, 1998). Следует отметить, что эффективность метода во многом зависит от последовательности выбранных для эксперимента праймеров.

Результаты прямого секвенирования выявленных фрагментов позволили провести компьютерный анализ их последовательности, на основании которого эти фрагменты были идентифицированы как участки CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Аномальное метилирование указанных CpG-островков при РМЖ

продемонстрировано впервые. Из перечисленных генов лишь для одного, супрессора опухолевого роста BIN1, доказано участие в канцерогенезе, в то время как целенаправленного изучения роли молекулярной патологии других генов при раке не проводилось. Необходимо отметить, что, в соответствии с информацией, полученной из доступных баз данных, идентифицированные нами гены экспрессируются во всех изученных нормальных тканях человека. Наличие промоторных CpG-островков создаёт возможность для негативной регуляции экспрессии этих генов посредством аномального метилирования в процессе канцерогенеза. В связи с этим следующими задачами работы явились подробная характеристика особенностей метилирования выявленных CpG-островков в норме и при РМЖ и оценка экспрессии соответствующих генов в клетках РМЖ. I

Характеристика метилирования исследуемых генов в нормальных тканях человека.

Поскольку ни для одного из исследуемых генов ранее не был определен статус метилирования в нормальных тканях, нами был проведён анализ их метилирования в 98 гистологически неизмененных образцах ткани молочной железы и 54 образцах ДНК из лимфоцитов периферической крови здоровых доноров методом МЧ-ПЦР со специфическими праймерами. При исследовании ДНК из лимфоцитов периферической крови нами не было выявлено ни одного случая метилирования изучаемых фрагментов. Также не было обнаружено метилирования ни одного из генов, кроме SEMA6B, в образцах условно нормальной ткани молочной железы. Метилирование гена SEMA6B выявлено в 3/98 (3%) образцах нормальной ткани молочной железы. Незначительное количество случаев аномального метилирования генов в нормальных тканях отмечалось во многих исследованиях. Метилирование генов HICI и pió (по 8%) и гена CDHI (5%) выявлено в нормальной ткани яичников (Rathi et al., 2002). Melki и сотр. изучая метилирование генов RB1, р/б. р15, CDHI, ER и CALCA в образцах костного мозга нормальных доноров, выявили низкий уровень метилирования для генов pió, p¡5n CALCA (Melki et al., 1999). Zochbauer-Muller, изучая профиль метилирования ряда генов при немелкоклеточном раке легкого, в качестве контроля исследовал прилежащую гистологически неизмененную ткань легкого и показал незначительный уровень метилирований (5%) генар14 (Zochbauer-Muller et al., 2001).

Анализ метилирования и экспрессии исследуемых генов в образцах опухолей РМЖ.

Анализ метилирования н экспрессии гена ВШ1.

Одиним из дифференциально метилированных фрагментов, выявленных нами методом МЧФП, был участок Срв-островка, локализованного в 5'-области гена ВШ1, кодирующего широко экспрессирующийся адапторный протеин, обладающий свойствами супрессора опухолевого роста. В1Ш специфически взаимодействует с МУС, ингибируя его онкогенную активность. Поскольку МУС играет ключевую роль в регуляции клеточного цикла как нормальных, так и неопластических клеток, усиление его онкогенной активности, вследствие повреждения В1Ш, может приводить к малигнизации клеток (ве е1 а!, 2000).

Ген ВШ1 расположен на хромосоме 2ql4.3, в локусе, для которого показана потеря гетерозиготности в 30-40% карцином молочной железы (Кегап£иеуеп е1 а!., 1997). В ряде работ было показано нарушение экспрессии ВШ1 в клеточных линиях и образцах РМЖ (Эакашиго е1 а1., 1 996; Ое е1 а1, 2000). Несмотря на наличие генетических повреждений ВШ1, в частности делеций (потерь гетерозиготности), частота этих нарушений недостаточна для объяснения всех случаев потери экспрессии гена, что позволяет предположить значимую роль эпигенетических факторов, в частности, метилирования промотора гена. В литературе не обнаружено сообщений о наличии аномального метилирования СрО-островка промотора при каких-либо онкологических заболеваниях, однако 1>ос!у§т с соавт. показали реактивацию экспрессии ВШ1 в одной из трех клеточных линий рака простаты (Ви-145) под действием 5-аза-2'-дезоксицитидина. Это позволяет предположить эпигенетический механизм регуляции экспрессии путем метилирования промотора гена (Ьос1у§т ег а!., 2005).

Для оценки характера метилирования СрО-островка гена ВШ1 нами был выполнен дизайн специфических праймеров для идентифицированного фрагмента ДНК и разработан протокол мультилокусной МЧ-ПЦР, позволяющий объективно оценить полученные результаты. Частота метилирования в образцах ткани первичных опухолей молочной железы составила 18/98 (18%), кроме того, метилирование было обнаружено в ДНК из клеточных линий РМЖ МСИ7 и Т470. В то же время, метилирования соответствующего участка в клеточных линиях рака простаты БШ45 и ЬЫСар выявлено не было. Для подтверждения полученных результатов проведено метилспецифическое секвенирование исследуемого фрагмента ДНК в 10 образцах условно нормальной ткани молочной железы, 9 образцах РМЖ и четырёх клеточных линиях (МСР7, Т47Б, ОШ45 и ЬИСар) (рис.2).

.•Л 7 7 Т Т 7 7 7

.г^лллллллл/^уу^/УУУУУ\А/УУ\ДАА/УУУ\/У

Рнс.2. Результаты метилспецифического секвенирования фрагмента промоторного СрО-островка гена ВПЧ1. А - метилированная последовательность, в качестве матрицы использована ДНК из клеточной линии \1CF7; Б — неметилнрованная последовательность (ДНК из нормальной ткани молочной железы). Стрелкой указаны неизмененные цитозины.

Показано наличие метилированных остатков цитозина в составе всех проанализированных СрС-динуклеотидов в ДНК из тканей РМЖ и клеточных линий РМЖ. (рис.3., позиции с +838 по +979 нуклеотидов). Метилирования цитозина в ДНК из образцов нормальной ткани молочной железы и линий 011145 и ЬИСар в соответствующих позициях выявлено не было (рис.3).

-0.9 тл.н. промотор

пнтрои 1

СрО-островок промотора_

МЧ2 |-1 МЧ1

-1 МС 2 I-1 МС1

Контрольные образцы (п*10) Образны РМЖ (п=»5) Образны РМЖ (4-4) Образны рака простаты (п»2) МСР7 Т470 011145 ЬЫСаР положение муклеотилов

Рнс.З. Л - схема промоторной области гена ВШ1, Б - локализация праймеров для МЧ- и МС-ПЦР, В - карта метилирования исследуемых участков СрО-островка.

Анализ экспрессии гена ВШ1 был выполнен методом ОТ-ПЦР в реальном времени и показал снижение или отсутствие экспрессии в 80% исследованных образцов опухолей. Исследование экспрессии проводилось по отношению к гистологически неизмененной ткани для 13 пар образцов и двух клеточных линий РМЖ (рис.4).

образцы РМЖ

Рнс.4. Анализ экспрессии гена BIN1 в образцах РМЖ. На оси абсцисс отображены номера образцов РМЖ, на оси ординат - десятичный логарифм кратности относительного изменения экспрессии гена.

В клетках линии MCF7 наблюдается полная потеря экспрессии BIN}, в линии T47D экспрессия снижена в 6 раз, что хорошо согласуется с полностью метилированным состоянием исследованного фрагмента CpG островка гена в MCF7 и частично метилированным — в T47D. Экспрессия BINI также снижена или отсутствует во всех исследованных образцах тканей РМЖ с метилированным участком промотора гена. Тем не менее, частота потери экспрессии BIN1 значительно превосходит частоту аномального метилирования его CpG-островка, что не позволяет считать метилирование доминирующим механизмом инактивации этого гена.

Следует отметить, что идентифицированный нами дифференциально метилированный фрагмент локализован в 3'-области CpG-островка (интрон 1) гена BIN1 и, согласно общепринятому мнению, его метилирование не может напрямую инактивировать экспрессию гена. Для оценки возможности прямого влияния метилирования промотора гена на экспрессию нами сконструированы праймеры для 5'-области CpG-островка и проведён анализ с помощью МЧ-ПЦР (30 образцов РМЖ) и метилспецифического секвенирования (9 образцов РМЖ). В результате этого .исследования не выявлено ни одного случая метилирования, в том числе в образцах, где ранее было обнаружено метилирование участка 3'-области CpG-островка. Полученные данные совпадают с результатами исследования этой области, проведенного Lodygin и сотр. для рака простаты (Lodygin et al., 2005). Интерпретировать полученные результаты (метилирование фрагмента CpG-островка, расположенного за

пределами промотора, при онкозаболевании) можно соотнеся их с подобными исследованиями других генов. I

Промоторы достаточно большого числа генов имеют CpG-островки протяженностью свыше 1000 п.н., которые характеризуются гетерогенным статусом метилирования. Метилирование часто присутствует в 3'-областях CpG-островков, однако его роль в репрессии транскрипции не доказана (Tsutsumi et al., 1998; Abe et al., 2002). Подобный характер метилирования был показан для CpG-островков генов CDKN2A (Tsutsumi et al., 1998), RASSFIA (Yan et al., 2003), MLHI (Miyakura et al., 2001).

CpG-островок, локализованный в промоторной области ВIN1, имеет протяженность 1650 п.н. и захватывает 5'-регион, первый экзон и фрагмент первого интрона, включая таким образом и промоторные и непромоторные последовательности. Структурный и функциональный анализ последовательности фрагмента 5'-области островка размером примерно 900 п.н., прилежащего к первому экзону, показал, что он содержит консенсусные сайты для ряда транскрипционных факторов и достаточен для базовой транскрипции BIN1 (Wechsler-Reya et al., 1997). Мы предполагаем, что CpG-островок гена BIN1, подобно островкам генов CDKN2A и RASSFIA, состоит из двух функционально неравнозначных частей: 3'-область достаточно часто и интенсивно метилируется, тогда как 5'-область в опухолях неметилирована. Полученные в ходе исследования результаты убедительно доказывают, что метилирование 3'-области CpG-островка является опухольспецифичным, и следовательно, может быть использовано при разработке панелей эпигенетических маркеров рака после оценки паттернов метилирования для различных типов опухолей.

Анализ метилирования и экспрессии гена LAMC3.

Ген LAMC3, локализованный на хромосоме 9q34.13, кодирует широко экспрессирующийся белок уЗ-цепи ламининов, семейства гликопротеинов внеклеточного матрикса, которые являются основными неколлагеновыми компонентами базальной мембраны (Koch et al., 1999).

Ламинины вовлечены в целый ряд. биологических процессов, включая клеточную адгезию, дифференцировку, миграцию, передачу сигналов и метастазирование. Иммуногистохимический анализ экспрессии общего ламинина при РМЖ показал отсутствие экспрессии приблизительно в 50% карцином (Ioachim tt al., 2002). В ряде работ было описано нарушение экспрессии цепей ламинина. При этом для ct3, РЗ и у2 цепей ламинина-5 отмечалось тканеспецифическое нарушение регуляции экспрессии в опухолях: в глиомах мозга и карциномах желудка было показано увеличение экспрессии, тогда как при раке простаты и базальноклеточных карциномах -снижение экспрессии (Martin et al., 1998; Нао et al., 1996). Недавние

исследования свидетельствуют о повышенном уровне (20-40%) метилирования генов, кодирующих цепи ламинина-5, при раке молочной железы, легких, мочевого пузыря, простаты (БаЛуапагауапа е1 а1., 2003; БаЛуапагауапа е1 а1., 2004), В результате исследования, проведенного на основе полногеномной гибридизации (СОН), ЫеБзПг^ и сотр. показали наличие делеции области 9я34, содержащей ген ЬАМСЗ, в образцах первичных опухолей молочной железы (Мевв!^ е1 а1., 2005). В настоящей работе нами было выявлено наличие дифференцального метилирования фрагмента СрО-островка гена ЬАМСЗ в образцах РМЖ, что послужило основанием для изучения характера метилирования и экспрессии этого гена.

Ген ЬАМСЗ содержит в 5'-области относительно небольшой Срв-островок, занимающий около 650 п.н. и содержащий 72 СрО-динукпеотида. СрО-островок полностью перекрывает первый экзон гена и содержит сайт инициации транскрипции. Фрагмент ДНК протяжённостью 300 п.н., выявленный нами как дифференциально метилированный методом МЧФП и фланкирующий сайт инициации транскрипции, содержит 4 участка узнавания метилчувствительной рестриктазы НраП, что создаёт предпосылки для успешного анализа его метилирования методом МЧ-ПЦР.

Аномальное метилирование указанного участка промотора 1АМСЗ, исследованное методом мультилокусной МЧ-ПЦР, в образцах тканей первичных опухолей составило 8/98 (8%) (рис.5).

М О 1о 1н 2о 2н Зо Зн 4о 4н 5о 5н П

Яш ■ Г"" 575 Г" ГЦ

14 Я ingi.it

1: и. ы | ? £ ^ Ш ьшсз

Рис. 5. Анализ метилирования промоторной области гена 1ЛМСЗ. М - маркер молекулярного веса, О - отрицательный контроль, 1-5 - номера парных образцов РМЖ (о -опухоль, н - норма); 1,2 — метилирование промоторной области 1ЛМСЗ, 3-5 - отсутствие метилирования, П - положительный контроль (негидролизованная ДНК).

Полученные результаты были подтверждены с помощью метилспецифического секвенирования.

Однако при последующем анализе экспрессии ЬАМСЗ в образцах опухолевых тканей больных РМЖ по отношению к гистологически неизмененной ткани снижение экспрессии отмечалось в 94% образцов (рис.6). Значительное снижение экспрессии гена было выявлено и в клеточной линии МСР7. Повышения уровня экспрессии ЬАМСЗ не было отмечено ни в одном

из образцов первичных опухолей и было показано лишь для клеточной линии Т470.

образцы РМЖ

Рнс.6. Анализ экспрессии гена LAMC3 в образцах РМЖ. На оси абсцисс отображены номера образцов РМЖ, на оси ординат - десятичный логарифм кратности относительного изменения экспрессии гена.

Столь значительная разница между частотами метилирования промоторной области гена и снижением его экспрессии может объясняться действием дополнительных факторов (потеря гетерозиготности, мутации и т. д.). Это не исключает непосредственного влияния метилирования CpG-островка LAMC3 на характер экспрессии гена, как это уже показано для LAMA3, LAMB3 и LAMC2 (Sathyanarayana et al, 2003), однако столь низкий процент аномального метилирования не позволяет использовать его как эффективный маркер РМЖ. В связи с этим нами был предпринят поиск участка CpG-остовка LAMC3, метилирование которого могло бы быть ассоциировано с РМЖ в более высоком проценте случаев. Поскольку повышенные уровни метилирования характерны, как уже отмечалось, для 3'-участков CpG-островков генов, вовлечённых в канцерогенез, было проведено картирование метилирования дистального участка промоторного CpG-остовка LAMC3. Однако метилспецифическое секвенирование выбранного участка выявило метилированное состояние всех проанализированных CpG-динуклеотидов как во всех исследованных образцах РМЖ, включая клеточные линии MCF7 и T47D, так и в образцах нормальной ткани молочной железы (рис. 7).

В целом для изученных генов субъединиц ламинина показаны относительно невысокие частоты метилирования промоторных областей при РМЖ: 40%, 5% и 15% для LAMA3, LAMB3 и LAMC2, соответственно (Sathyanarayana et al., 2003) и 8% для LAMC3 (настоящее исследование). Кроме того, особенности метилирования промоторных областей этих генов в норме исключают возможность использования анализа метилирования дистальных участков их CpG-островков в диагностических целях. Однако высокая частота снижения экспрессии (94%), показанная нами для гена

•Ймчи МЯМС

■1МЧи пма |м|)

Рнс.7. А - схема промоторной области гена ЬАМСЗ и локализации праймеров для МЧ- и МС-ПЦР, В - карта метилирования исследуемого участков СрО-островка.

ЬАМСЗ и нехарактерная для других генов субъединиц ламинина (10-55% для ЬАМАЗ, ЬАМВЗ и 1АМС2\ информативность экспрессионной панели из трёх генов 65%; БаЛуапагауапа е1 а1., 2003) предполагает возможность использования этого показателя как высокоинформативного маркера РМЖ. Кроме того, дальнейшее изучение молекулярной патологии ЬАМСЗ может привести к идентификации доминирующего фактора снижения экспрессии гена и разработке более рационального маркера опухолевого процесса при РМЖ.

Анализ метилирования н экспрессии гена Д'ЕМА6В.

Ген БЕМАбВ, локализованный на хромосоме 19р13.3, кодирует семафорин 6В, относящийся к семейству семафоринов - белков, характеризующихся наличием консервативного БЕМА-домена. В настоящее время насчитывается семь классов семафоринов, включающих как секреторные, так и трансмембранные формы, которые, по-видимому, задействованы в развитии центральной и периферической нервной системы. Первоначально считалось (по аналогии с первыми изученными представителями семейства), что функции семафоринов в нервной системе сводятся к регуляции направленного роста аксонов, однако для некоторых представителей семейства семафоринов уже показано участие в апоптозе, клеточной пролиферации и миграции, а также в определении метастатического потенциала опухоли (СЬес1о1а1 е1 а!., 2005).

В свете показанного в нашей работе дифференциального метилирования промоторной области БЕМАбВ при РМЖ, необходимо упомянуть, что

гнперметилирование промотора другого представителя семейства семафоринов, БЕМАЗВ, было ранее оЬисано при немелкоклеточном раке легкого (Кигок1 е1 а!., 2003). Недавние эксперименты по реактивации БЕМАЗВ в клетках рака молочной железы показали, что он обладает свойствами гена-супрессора опухолевого роста с проапоптотическим действием.

Ген БЕМЛбВ содержит небольшой (около 200 п.н.) СрО-островок, содержащий 24 СрО-динуклеотида и полностью перекрывающий первый экзон гена и сайт инициации транскрипции. Анализ статуса метилирования 5ЕМА6В в образцах РМЖ был выполнен методом мультилокусной МЧ-ПЦР, аномальное метилирование выявлено в 37/98 (38%) образцах опухолей. Для подтверждения полученных результатов было проведено метилспецифическое секвенирование как метилированых, так и неметилированных образцов ДНК опухолей (рис.8).

Рнс.8. Результаты метилспецифического секвенирования фрагмента промоторного СрО-островка гена 5ЕМА6В. А - метилированная последовательность, в качестве матрицы использована ДНК из материала опухоли; Б - неметилированная последовательность (ДНК из нормальной ткани молочной железы). Стрелкой указаны неизмененные цитозины.

На основании данных секвенирования построена карта метилирования исследуемого района (рис.9).

Анализ экспрессии гена в образцах РМЖ по отношению к гистологически неизмененному контролю показал снижение экспрессии в 7/14 (44%) опухолях. В одном образце наблюдалась гиперэкспрессия БЕМА6В, в 6/14 (50%) образцах уровень экспрессии совпадал с таковым в нормальной ткани (рис.10). В клеточной линии рака молочной железы МСР7 уровень экспрессии соответствовал таковому в нормальной ткани МЖ, в то время как в линии Т47Б наблюдалась потеря экспрессии исследуемого гена.

Ср№ктрв«я «ромотсф*

обрнш РМЖ (и-»)

Рис.9. А - схема промоторной области гена 8ЕМЛ6В и локализации праймеров для МЧ- и МС-ПЦР, Б - карта метилирования исследуемого участка СрО-островка.

£ ъ> <?> ^ ».*> V*5

_____I_Г|

1 0,5 0

-0,5 .1 -1,5 -2 -2.5 -3 -3,5

образцы РМЖ

Рнс.Ю. Анализ экспрессии гена 5ЕМА6В в образцах РМЖ. На оси абсцисс отображены номера образцов РМЖ, на оси ординат - десятичный логарифм кратности относительного изменения экспрессии гена.

Характеристика генов с низкими частотами метилирования при РМЖ.

Для четырех генов ((САСИ04, КСЫН2, УС1Р135 и РБМТП), выявленных методом МЧФП, были показаны низкие частоты метилирования (менее 5%) в выборке образцов РМЖ.

Гены СИСЖ?* и КСНН2 кодируют белки потенциалзависимых ионных каналов, у4- субъединицу кальциевого канала (СС04) и калиевый канал НЕ1Ю, соответственно. Внутриклеточный баланс ионов играет критическую роль во многих процессах развития, включая дифференцировку. Кроме того, известно, что приток ионов Са2+ через кальциевые каналы является важным

фактором в ходе инициации таких стадий клеточной смерти как апоптоз, ишемия и комплемент-индуцированная цитотоксичность (Toyota et al., 1999). Активность калиевых каналов играет важную роль в сигнальных путях, обеспечивающих пролиферацию, дифференцировку и деление клеток. Последние исследования показали, что усиление потока ионов калия напрямую вовлечено в апоптоз (Yu et al., 1999) и канцерогенез (Pardo et al., 1999).

Ген VCIP135 кодирует белок р135, содержащий OTU (Drosophila ovarian tumor) домен и взаимодействующий с валозинсодержащим белковым комплексом р97/р47 (VCP). Белок p97/VCP относится к ААА+ семейству АТФаз, представители которого вовлечены в широкий спектр различных клеточных процессов, включая протеолиз, репарацию ДНК и слияние мембран (Lupas et al., 2002).

Ген PSMTF1 кодирует субъединицу 1 протеосомного ингибитора (PI31), который играет важную роль в контроле гидролиза белков протеосомой 20S. Протеосомы удаляют аномальные белки из цитозоля, играют роль в активации транскрипционных факторов, в регуляции клеточного цикла (Zaiss et al., 2002). Таким образом, повреждения гена протеосомного ингибитора могут влиять на механизмы регуляции жизнедеятельности клетки опосредованно через нарушение функции протеосом.

Обобщая эти данные, можно предположить, что перечисленные гены могут играть значимую роль в канцерогенезе, в связи с чем нами был проведен анализ их экспрессии при РМЖ (рис. 11).

гязьяаав

1 . i

4« 44 62 SO 57 61 SS

CACNG4

|СЯ ■

all

образцы РМЖ

# & ❖ <? «f- £ # Ф ' <!> Ф

образцы РМЖ t¡> О «?• <Р «Р ^ # •!>

PSMF1

■■■■ж

образцы РМЖ

обрати РМЖ

Рис. 11. Анализ экспрессии генов CACNG4, KCNH2, VCIP135 и PSMTF1 в образцах РМЖ. На оси абсцисс отображены номера образцов РМЖ, на оси ординат - десятичный логарифм кратности относительного изменения экспрессии гена.

По результатам проведенного исследования снижение экспрессии указанных генов было показано с частотами от 60% до 80%, что позволяет считать их вовлеченными в канцерогенез при РМЖ.

Оценка эффективности модификации метода МЧФП ч информативности выявленных эпигенетических и экспресснонных маркеров канцерогенеза.

Проведённое исследование показало, что МЧФП - простой и эффективный метод идентификации генов, вовлечённых в канцерогенез. Из семи идентифицированных транскриптов аномальное метилирование промоторных CpG-островков при РМЖ с частотой, превышающей 5% (от 7 до 38%) показано для четырёх. Таким образом, эффективность метода с точки зрения выявления аномального метилирования при раке составила более 50%. В то же время, показано значительное снижение экспрессии всех семи транскриптов (с частотами от 44% до 94%), что позволяет считать все выявленные гены вовлечёнными в канцерогенез. При этом сравнение результатов изучения метилирования и экспрессии генов показало, что, по крайней мере, для большинства из них метилирование промоторных CpG-островков не является доминирующим фактором регуляции транскрипции. В то же время, для генов с высокой частотой метилирования при РМЖ показано более значительное снижение экспрессии по сравнению с генами, CpG-островки которых метилируются при РМЖ редко. В частности, более чем 10-кратное снижение экспрессии часто метилируемых генов SEMA6B, BIN1 и LAMC3 наблюдалось соответственно в 38%, 33% и в 59% образцов РМЖ, в то время как для редко метилируемых генов этот показатель составил от 10 до 33%.

Из исследованных генов наиболее выраженные изменения характера метилирования при РМЖ отмечены для SEMA6B (аномальное метилирование промоторной области в 38%).

Частоты метилирования большинства известных на сегодняшний день генов, вовлеченных в канцерогенез, при РМЖ колеблются в пределах от 5% до 40%. (Esteller et al., 2001; Herman et al., 1 995; Землякова с соавт., 2003). Сообщения о крайне высоких (50-95%) частотах аномального метилирования генов при канцерогенезе должны подвергаться тщательной проверке в силу двух обстоятельств. Во-первых, в таких случаях метилирование не всегда бывает статистически достоверно повышенным именно в клетках злокачественных опухолей. Классическим примером является метилирование гена HIC1 (hypermethylated in cancer), выявляемое как в нормальных, так и в опухолевых образцах (Rood et al., 2002), вследствие чего этот показатель не может считаться специфическим диагностическим маркером опухолевого процесса. Во-вторых, завышенные показатели метилирования могут явиться

следствием артефактов эксперимента. Так, метилирование гена АРС было выявлено в образцах опухолей различного происхождения, в т.ч., рака молочной железы (Esteller et al., 2000; Parrella et al., 2004). Однако, в 2004г. было показано, что АРС — ген, моноаллельно метилированный в нормальных тканях (Clement et al., 2004). Можно предполагать, что в предыдущих исследованиях метилирования АРС не были соблюдены необходимые требования к чувствительности и специфичности методов анализа метилирования.

Таким образом, на сегодняшний день не известно маркеров метилирования ДНК, достоверно выявляемых в более чем 50% случаев первичного рака молочной железы и являющихся специфичными для неопластического процесса. Это обусловлено как артефактами ранних исследований, так и отсутствием масштабных исследований эпигенетических нарушений при РМЖ. В связи с этим, очевидно, что ближайшая перспектива эпигенетической диагностики РМЖ, основанной на анализе аномального метилирования ДНК — не за отдельными генами с предположительно крайне высокими уровнями метилирования, а за системами подробно охарактеризованных маркеров, специфичных для канцерогенеза и характеризующихся информативностью в пределах 40-50%. Показатель частоты метилирования промоторной области SEMA6B, выявленный в настоящем исследовании, позволяет рекомендовать проведение расширенного исследования эпигенетической патологии этого гена как при различных клинических формах РМЖ, так и в образцах опухолей различного происхождения, с целью включения в диагностические (прогностические) панели молекулярных маркеров канцерогенеза. .

Показатели снижения экспрессии изученных нами генов (от 44% до 94%) позволяют считать каждый из них вовлеченным в процессы канцерогенеза с высокой частотой. Наиболее высокие частоты изменения экспрессии показаны в настоящем исследовании для генов LAMC3 и BIN1 (снижение экспрессии в 94% и в 80% образцов, соответственно). Тем не менее, при разработке экспрессионных маркёров канцерогенеза необходимо учитывать и такой параметр, как выраженность наблюдаемых изменений. При оценке диагностической ценности маркеров необходимо определение порогового значения изменения экспрессии, поскольку лишь выраженные отклонения позволяют детектировать изменения с помощью традиционных полуколичественных методов и диагностических экспрессионных микрочипов. Для оценки диагностической значимости маркеров нами установлен порог 10-кратного изменения экспрессии. Введение такого масштаба оценки экспрессии генов позволяет выявить изменения, детектируемые методом ОТ-ПЦР в реальном времени как AACt>3 и доступные для идентификации традиционными методами при правильном

определении параметров (количества циклов) ПЦР. При установлении указанного порога высокая частота снижения экспрессии гена BINI (80%) обесценивается с диагностической точки зрения, составляя 33%. Показатели снижения экспрессии генов LAMC3 и SEMA6B при этом страдают незначительно, снижаясь с 94% до 59% и'с 44% до 38% соответственно, и могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения в качестве высокоинформативных маркеров нарушения экспрессии генов при канцерогенезе.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана оригинальная модификация метода метилчувствительного фингерпринтинга: исключены этапы радиоавтографирования гелей и клонирования продуктов реакции, расширены возможности визуального контроля на каждом этапе эксперимента.

2. Использование разработанной модификации метода позволило идентифицировать 7 генов, подвергающихся аномальной эпигенетической регуляции при РМЖ: LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BINI, KCNH2, CACNG4 и PSMF1.

3. Определены частоты аномального метилирования промоторных CpG-островков выявленных генов при РМЖ. Значимые частоты аномального метилирования показаны для генов SEMA6B, BINI, LAMC3 и KCNH2 (38%, 18%, 8% и 7%, соответственно). Метилирование указанных генов не характерно для морфологически неизмененных тканей молочной железы.

4. Проведено картирование метилирования CpG-островков генов с высокими частотами метилирования (SEMA6B, BINI, LAMC3), что создаёт фундаментальную базу для разработки эффективных тест-систем анализа метилирования указанных генов.

5. Методом ПЦР в реальном времени показано снижение экспрессии генов LAMC3, SEMA6B, VCIPI35, BINI, KCNH2, CACNG4 и PSMF1 в тканях РМЖ с частотами от 44% до 94%. Показано значительное снижение экспрессии генов LAMC3 и BINI в клеточной линии РМЖ MCF7 и генов BINI и SEMA6B в клеточной линии РМЖ T47D.

6. Для генов SEMA6B и LAMC3 определены наиболее выраженные функциональные изменения при РМЖ (частота аномального метилирования SEMA6B - 38%, частота не менее чем 10-кратного снижения экспрессии SEMA6B - 38%, частота не менее чем 10-кратного снижения экспрессии LAMC3 - 59%). Полученные результаты позволяют рекомендовать включение этих генов в панели диагностических маркеров канцерогенеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Кузнецова Е.Б., Дрозд О.В., Бабенко О.В., Землякова В.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В, //Идентификация генов, вовлеченных в канцерогенез, методом метилчувствительного ПЦР-фингерпринтинга.// Медицинская генетика. 2004, т. 3, № 12, с. 563-568.

2. Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В., Дрозд О.В., Бабенко О.В., Землякова В.В., Кекеева О.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В. // Поиск и характеристика новых маркеров метилирования и генов, вовлеченных в канцерогенез, методом метилчувствительного фингерпринтинга. // Вестник НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М.Сеченова, 2005, № 5, с.73-88.

3. Strelnikov, V., Kuznetsova, Е., Lyubchenko, L., Zaletayev, D. // Abnormal methylation of LAMC3, SEMA6B, VC1P135, KCNH2, PSMTF1, CACNG4, LAMR1 and BIN1 CpG islands in breast cancer. // Breast Cancer Res., 2nd ESF Functional Genomics Conference. Oslo, Norway 2005, p. 73.

4. M. Nemtsova, V. Zemlyakova, E. Kusnetsova, V. Strelnikov, L. Lyubchenko, D. Zaletayev. // Aberrant methylation analysis of carcinogenesis-associated genes in sporadic breast cancer. // Breast Cancer Res., 2nd ESF Functional Genomics Conference. Oslo, Norway 2005, p. 133

5. Кузнецова Е.Б., Стрельников B.B., Дрозд O.B., Немцова М.В., Залетаев Д.В. //Поиск и характеристика новых маркеров метилирования и генов, вовлеченных в канцерогенез, методом метилчувствительного ПЦР-фингерпринтинга. И Тезисы второй международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 2005, с. 168.

6. Кузнецова Е.Б., Дрозд О.В., Немцова М.В., Стрельников В.В. // Идентификация генов, вовлеченных в канцерогенез, методом метилчувствительного ПЦР-фингерпринтинга. // V съезд российского общества медицинских генетиков, Уфа, Россия, «Медицинская генетика», №5, с. 214, 2005.

7. Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В. // Методы анализа метилирования ДНК. // Медицинская генетика. 2006, № 10.

8. V.V. Strelnikov, Е.В. Kuznetsova, M.V. Nemtsova, D.V. Zaletayev. // Identification of methylation and expression abnormalities associated with breast cancer. // European J. Hum. Genet., 2006, vol. 14, suppl. 1, p. 87.

Подписано в печать 03.07.06 г. Формат 60*84/16. Тираж 100 экз. Заказ № 344 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохииа РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузнецова, Екатерина Борисовна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Роль эпигенетики в изучении патогенеза рака молочной железы и разработке молекулярных маркеров канцерогенеза.

1.1.1. Краткая характеристика рака молочной железы.

1.1.2. Значение метилирования ДНК в норме и при патологии.

1.1.3. Особенности метилирования CpG-островков генов, вовлеченных в канцерогенез.

1.1.4. Значение нарушений метилирования ДНК при РМЖ как молекулярных маркеров канцерогенеза.

1.1.4.1. Аномальное метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез, при РМЖ.

1.1.4.2. Преимущества метилирования ДНК как молекулярного маркера канцерогенеза.

1.1.4.3. Аномальное метилирование ДНК в биологических жидкостях при РМЖ.

1.2. Методы анализа метилирования ДНК.

1.2.1. Методы исследования полногеномного метилирования.

1.2.2. Ген-специфический анализ метилирования. ф 1.2.2.1. Основные принципы ген-специфического анализа метилирования.

1.2.2.2. Выбор метода ген-специфического анализа метилирования.

1.2.3. Методы поиска дифференциально метилированных CpG-островков.

1.2.3.1 .Метилчувствительное рестрикционно-ориентированное геномное сканирование.

1.2.3.2. Метилчувствительный репрезентативно-дифференциальный анализ (МЧ-РДА).

1.2.3.3. Вычитательная гибридизация хромотографически изолированных пулов CpG-островков.

1.2.3.4. Метилчувствительный фингерпринтинг (МЧФП).

1.2.3.5. Амплификация интерметилированных CpG-островков.

1.2.3.6. Идентификация дифференциально метилированных CpG-островков с использованием микрочиповых технологий.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клинический материал.

2.2. Забор крови и операционного материала.

2.3. Выделение геномной ДНК.

2.4. Выделение РНК.

2.5. Модификация метода МЧФП.

2.5.1. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.5.2. Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР) с использованием CG-богатых праймеров.

2.5.3. Электрофорез в ПААГ.

2.5.4. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра.

2.5.5. Амплификация фрагментов CpG-островков и определение нуклеотидной последовательности.

2.6. Рестрикционный анализ.

2. 7. Метил-чувствительная ПЦР со специфическими праймерами.

2. 8. Обработка ДНК бисульфитом натрия.

2. 9. Метил-специфический сиквенс.

2.10. Синтез кДНК.

2.11. ОТ-ПЦР в реальном времени.

2.12. Микросателлитный анализ.

2. 13. Программное обеспечение.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Оптимизация метода поиска аномально метилированных CpG-островков.

3.2. Идентификация дифференциально метилированных CpG-островков в образцах ДНК больных РМЖ.

3.3. Характеристика метилирования исследуемых генов в нормальных тканях человека.

3.4. Анализ метилирования и экспрессии исследуемых генов в образцах опухолей РМЖ.

3.4.1. Анализ метилирования и экспрессии теш BIN 1.

3.4.2. Анализ метилирования и экспрессии гена LAMC3.

3.4.3. Анализ метилирования и экспрессии гена. SEMA6B.

3.4.4. Анализ генов, кодирующих субъединицы ионных каналов.

3.4.5. Анализ метилирования и экспрессии гена VCIP135.

3.4.6. Анализ метилирования и экспрессии гена PSMTF1.

3.5. Оценка эффективности модификации метода МЧФП и информативности выявленных эпигенетических маркеров канцерогенеза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы"

Основными задачами онкогеномики являются изучение молекулярных механизмов канцерогенеза и разработка оптимальных методов предупреждения, диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. В связи с этим особое значение приобретает проблема идентификации генов, вовлеченных в канцерогенез, и их подробная характеристика. Один из подходов к решению этой задачи основывается на анализе эпигенетических особенностей генома опухолей. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов подразумевает изменения генома, отличные от структурных вариаций кодирующих областей генов. К эпигенетическим явлениям относятся, в частности, метилирование-деметилирование ДНК и гистонов, ацетилирование-деацетилирование гистонов, полиморфизмы повторяющихся последовательностей в регуляторных областях генов.

Анализ аномалий метилирования должен опираться на фундаментальную научную основу. В частности, необходимо значительно расширить генный состав применяемых диагностических панелей. Список хорошо изученных диагностических и прогностических маркеров метилирования не превышает на сегодняшний день двух десятков, причем многие из них не являются специфичными. Все применяемые маркеры должны быть четко охарактеризованы с точки зрения тканеспецифичности опухолей, информативности, особенностей метилирования CpG-островков в норме и при патологии.

Коротко актуальность проблемы можно выразить следующим образом:

1. Злокачественные новообразования относятся к одним из наиболее социально значимых болезней. Использование в клинической практике высокоинформативных предиктивных, диагностических и прогностических молекулярных маркеров канцерогенеза должно способствовать формированию групп риска, раннему выявлению заболеваний, повышению эффективности дифференциальной диагностики, определению тактики лечения и контролю за его эффективностью.

Целью настоящей работы является идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы.

Задачи исследования

3. Оценка частот метилирования CpG-островков выявленных генов в норме и при РМЖ.

4. Высокоразрешающее картирование метилирования CpG-островков изучаемых генов.

5. Изучение особенностей экспрессии исследуемых генов при РМЖ.

6. Оценка информативности выявленных эпигенетических маркеров канцерогенеза.

Научная новизна.

В результате проведенного исследования разработана эффективная и экономичная модификация метода поиска дифференциально метилированных CpG-островков в геноме опухолевых клеток. На основании применения этой методики выявлено семь областей генома человека, дифференциально метилированных в ДНК из образцов тканей РМЖ и принадлежащих CpG-островкам генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Для указанных генов впервые проведен анализ метилирования их промоторных областей при РМЖ, а также в нормальных тканях молочной железы и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров. Построены высокоразрешающие карты метилирования CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B и BIN1. Проведен количественный анализ экспрессии указанных генов в операционном материале РМЖ и клеточных линиях РМЖ. Подробное исследование метилирования и экспрессии генов, выявленных в ходе работы, в злокачественных опухолях проведено впервые, и полученные результаты свидетельствуют о значительной роли эпигенетических факторов в регуляции функции этих генов при канцерогенезе.

Практическая значимость.

Разработанная система скрининга дифференциального метилирования геномов высоко воспроизводима, подробно охарактеризована и может быть использована в дальнейшем в работах по характеристике эпигенетических нарушений, ассоциированных с социально значимыми заболеваниями. В настоящем исследовании скрининг дифференциального метилирования CpG-островков в 40 парных (опухоль и норма) образцах ДНК больных РМЖ позволил выявить семь генов, экспрессия которых подвержена аномальной эпигенетической регуляции при канцерогенезе: LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Разработаны методики мультилокусной метилчувствительной ПЦР для CpG-островков каждого из изучаемых генов, предназначенные для оценки статуса их метилирования в материале опухоли. В выборке из 98 образцов РМЖ проведена оценка частот аномального метилирования генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Анализ экспрессии перечисленных генов в 16 парных образцах ДНК больных РМЖ позволил провести предварительную оценку информативности снижения экспрессии каждого из генов как маркера канцерогенеза. Созданные карты метилирования соответствующих CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B и BIN1 и результаты проведённого экспрессионного анализа изучаемых генов представляют собой базу для разработки научно обоснованных систем эпигенетических маркеров канцерогенеза.

Апробация работы.

Материалы исследования докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2005-2006 гг., на конференции Российского общества медицинских генетиков в 2005 г. (г. Уфа), на конференции «Биомедицина и биобезопасность» в 2005 г. (г. Москва), конференции по функциональной геномике Европейского Научного Фонда в 2005 г. (г. Осло). По результатам работы опубликовано 3 статьи и 5 тезисов. Решением Научного комитета Европейской конференции генетики человека (Амстердам, 2006) исследование признано лучшей научной работой коллектива молодых ученых.

Положения, выносимые на защиту.

2. Промоторные области генов LAMC3, SEMA6B,VCIP135,BIN1,KCNH2, CACNG4 и PSMF1 подвергаются аномальному метилированию при РМЖ.

3. Разработаны карты метилирования CpG-динуклеотидов промоторных районов генов LAMC3, SEMA6B и BIN1.

4. Экспрессия генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1 нарушается при РМЖ, с преобладанием ее снижения для большинства изученных генов.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кузнецова, Екатерина Борисовна

выводы.

3. Определены частоты аномального метилирования промоторных CpG-островков выявленных генов при РМЖ. Значимые частоты аномального метилирования показаны для генов SEMA6B, BIN1, LAMC3 и KCNH2 (38%, 18%, 8% и 7%, соответственно). Метилирование указанных генов не характерно для морфологически неизмененных тканей молочной железы.

4. Проведено картирование метилирования CpG-островков генов с высокими частотами метилирования (SEMA6B, BIN1, LAMC3), что создаёт фундаментальную базу для разработки эффективных тест-систем анализа метилирования указанных генов.

5. Методом ПЦР в реальном времени показано снижение экспрессии генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1 в тканях РМЖ с частотами от 44% до 94%. Показано значительное снижение экспрессии генов LAMC3 и BIN1 в клеточной линии РМЖ MCF7 и генов BIN] и SEMA6B в клеточной линии РМЖ T47D.

6. Для генов SEMA6B и LAMC3 определены наиболее выраженные функциональные изменения при РМЖ (частота аномального метилирования SEMA6B - 38%, частота не менее чем 10-кратного снижения экспрессии SEMA6B -38%, частота не менее чем 10-кратного снижения экспрессии LAMC3 - 59%). Полученные результаты позволяют рекомендовать включение этих генов в панели диагностических маркеров канцерогенеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Анализ эпигенетических нарушений в геномах опухолевых клеток является на сегодняшний день одним из оптимальных методов поиска новых генов, вовлеченных в канцерогенез. Результаты подобных исследований не только предоставляют доказательства участия тех или иных генов в развитии опухоли, но и создают фундаментальную базу для последующего включения идентифицированных генов в панели диагностических маркеров.

В настоящем исследовании была разработана эффективная модификация метода МЧФП, использование которой позволило идентифицировать семь генов, подвергающихся аномальной эпигенетической регуляции при РМЖ: LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Для указанных генов впервые проведен анализ метилирования их промоторных CpG-островков при РМЖ, а также в нормальных тканях молочной железы и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров с помощью разработаных нами протоколов мультилокусных МЧ-ПЦР. Исследование было выполнено на материале 98 парных образцов РМЖ и 54 образцов периферической крови. В результате проведенного анализа для генов LAMC3, SEMA6B, BIN1, KCNH2 было показано наличие аномального метилирования в образцах РМЖ с частотой, превышающей 5% (от 7% до 38%). Для генов VCIP135, CACNG4 и PSMF1 частота метилирования составила менее 5%.

Включение гена в диагностическую панель возможно лишь после детальной характеристики особенностей его экспрессии и метилирования как в опухолевой, так и в нормальной ткани. В представленной работе было выполнено высокоразрешающее картирование исследуемых областей CpG-островков генов, имеющих высокие частоты метилирования (SEMA6B, BIN1, LAMC3), дающее представление о характере метилирования каждого С,0-динуклеотида в составе фрагмента. Подобные карты являются необходимой базой для последующей разработки диагностических тест-систем с использованием изучаемых генов.

Проведен анализ экспрессии генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1 в тканях РМЖ. По результатам исследования показано снижение экспрессии всех генов с частотами от 44% до 94%. Сопоставление этих значений с относительно низкими частотами метилирования CpG-островков тех же генов при РМЖ показывает, что метилирование не является доминирующим механизмом инактивации большинства из них при РМЖ. Исключение составляет ген SEMA6B, для которого показаны сопоставимые значения частот метилирования и потери экспрессии. На основе высоких показателей этих значений предложено их использование как молекулярных маркеров канцерогенеза. Кроме того, рекомендована разработка нового маркера нарушения эпигенетической регуляции при раке на основе определения снижения экспрессии гена LAMC3.

Предложенная модификация метода поиска дифференциально метилированных CpG-островков и проведенная характеристика эпигенетической патологии ряда генов при РМЖ будут использованы в дальнейшем при разработке новых панелей диагностических маркеров канцерогенеза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузнецова, Екатерина Борисовна, Москва

1. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В. и др. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях // 2004. Молекулярная биология. 38(2), 213-223.

2. Землякова В.В., Жевлова А.И., Стрельников В.В. и др. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при спорадическом раке молочной железы.// Мол. Биол. 2003,4, 693-703.

3. Землякова В.В., Стрельников В.В., Зборовская И.Б. и др. Аномальное метилирование CpG-островков генов pl6/CDKN2A и pl4/ARF при немелкоклеточном раке легкого и остром лимфобластном лейкозе. // 2004. Молекулярная биология. 38(6), 966-972.

4. Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е. Межклеточное взаимодействие // 2003. М. «Медицина». С.82.

5. Abe М., Okochi Е., Kuramoto Т., Kaneda A., Takato Т., Sugimura Т., Ushijima Т. Cloning of the 5' upstream region of the rat pi 6 gene and its role in silencing. // 2002. Jpn. J. Cancer Res. 93(10), 1100-6.

6. Amigorena S., Choquet D., Teillaud J.L., Kom H., Fridman W.H. Ion channel blockers inhibit В cell activation at a precise stage of the G1 phase of the cell cycle. Possible involvement of K+ channels. //1990. J. Immunol. 144,2038 2045.

7. Amir R.E., Van den Veyver I.B., Wan M., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. //1999. Nat. Genet. 23(2), 185-188.

8. Andersen T.I. et al. Prognostic significance of TP53 alteraions in breast carcinoma. // 1993. Br. J. Cancer. 68,540.

9. Arapshian A., Kuppumbatti Y.S. et al. Methylation of conserved CpG sites neighboring the beta retinoic acid response element may mediate retinoic acid receptor beta gene silencing in MCF-7 breast cancer cells. // 2000. Oncogene. 19,4066-4070.

10. Arver В., Du J., Chen L. et al. Hereditary breast cancer. // 2000. Semin. Cancer Biol. 10, 271-288.

11. Bachman K.E., Herman J.G., Corn P.G. etal. Methylation-associated Silencing of the Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-3 Gene Suggests a Suppressor Role in Kidney, Brain, and Other Human Cancers. //1999. Cancer Res. 59,798-802.

12. Baylin S.B., Herman J.G., Graff J.R., et al. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia//1998. Adv. Cancer. Res. 72,141-196.

13. Benedict W.F., Xu H-J., Takahashi R. The retinoblastoma gene: its role in human malignancies. // 1990. Cancer Invest. 8,535-540.

14. Berns E.M. et al. Association between RBI gene alterations and factors of favourable prognosis in human breast cancer without effect on survival. // 1995. Int. J. Cancer. 64, 140.

15. Bestor Т.Н. The DNA methyltransferases of mammals // 2000. Hum. Mol. Genet. 9, 2395 2402.

16. Bhatia K., Siraj A., Hussain A., Bu R., Gutierrez M. The Tumor Suppressor Gene 14-3-3 er is commonly methylated in normal and malignant lymphoid cells. // 2003, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 12,165.

17. Bianco Т., Chenevix-Trench G., Walsh D.C. et al. Tumor-specific distribution of BRCA1 promoter region methylation supports a pathogenetic role in breast and ovarial cancer. // 2000. Carcinogenesis. 21,147-151.

18. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. // 2002. Genes & Dev. 16,621.

19. Bishop D.T. BRCA1 and BRCA2 and breast cancer incidence. // 1999. Ann. Oncol. 10, 113-119.

20. Borresen-Dale A.L. TP53 and breast cancer. // 2003. Human Mutat. 21,292-300.

21. Bovenzi V., Le N.L., Cote S. et al. DNA methylation of retinoic acid receptor beta in breast cancer and possible therapeutic role of 5-aza-2'-deoxycytidine. // 1999. Anticancer Drugs. 10,471-476.

22. Brock G.J.R., Huang Т.Н., Chen C., Johnson K.J. A novel technique for the identification of CpG islands exhibiting altered methylation patterns (ICEAMP). // 2001. Nucleic Acids Res. 29,123.

23. Chan J.K., Wong C.S. Loss of E-cadherin is the fundamental defect in diffuse-type gastric carcinoma and infiltrating lobular carcinoma of the breast. //2001. Adv. Anat. Pathol. 8,165-172.

24. Chan T.A., Hermeking H., Lengauer C. et al. 14-3-3Sigma is required to prevent mitotic catastrophe after DNA damage. //1999. Nature. 401,616-620.

25. Chedotal A., Keijan G., Moreau-Fauvarque C. The brain within the tumor: new role for axon guidance molecules in cancers. // 2005. Cell Death Differ. 12(8), 1044-1056.

26. Chen R.Z., Pettersson U., Beard C., et al. DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates //1998. Nature. 395(6697), 89-93.

27. Christensen C.R., Klingelhofer J., Tarabykina S., Lukanidin E. et al. Transcription of a novel mouse semaphorin gene, M-semaH, correlates with the metastatic ability of mouse tumor cell lines //1998. Cancer. Res. 58,1238 1244.

28. Clement G., Bosnian F., Fontolliet C., Benhattar J. Monoallelic methylation of the APC promoter is altered in normal gastric mucosa associated with neoplastic lesions. // 2004. Cancer. Res. 64,6867.

29. Conway K.E., McConnell B.B., Bowring C.E. et al. TMS1, a Novel Proapoptotic Caspase Recruitment Domain Protein, Is a Target of Methylation-induced Gene Silencing in Human Breast Cancers // 2000. Cancer Res. 60,6236-6242.

30. Costello J.F., Plass C. Methylation matters // 2001. J. Med. Genet. 38,285-303.

31. Costello J.F., SmiragliaD.J., Plass C. Restriction landmark genome scanning // 2002. Methods. 27(2), 144-149.

32. Cross H., Charlton J., Xinsheng N., Bird A. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column //1994. Nat. Genet. 6,236-244.

33. Cross S.H., Bird A.P. CpG islands and genes //1995. Curr. Opin. Genet. Dev. 5(3), 309314.

34. Deng G. et al. Loss of heterozygosity and p53 gene mutations in breast cancer. // 1994. Cancer Res. 54,499.

35. Deng G., Chen A., Hong J., Chae H.S., Kim Y.S. Methylation of CpG in a small region of the hMLHl promoter invariably correlates with the absence of gene expression. // 1999. Cancer Res. 59,2029-33.

36. Du Y., Carling Т., Fang W. et al. Hypermethylation in Human Cancers of the RIZ1 Tumor Suppressor Gene, a Member of a Histone/Protein Methyltransferase Superfamily. //2001. Cancer Res. 61, 8094-8099.

37. Duliami E., Hillinck J., Ibanez de Caceres et al. Tumor supperssor gene promoter hypermethylation in serum of breast cancer patients. // 2004. Clin. Cancer Res. 10, 61896193.

38. Enmark E., Pelto-Huikko M., Grandien K. et al. Human estrogen receptor beta-gene structure, chromosomal localization, and expression pattern. // 1997. J. Clin. Endocr. Metab. 82,4258-4265.

39. Esteller M., Corn P.G., Urena J.M. et al. Inactivation of glutathione S-transferase PI gene by promoter hypermethylation in human neoplasia. // 1998. Cancer Res. 58,4515-4518.

40. Esteller M., Sparks A., Toyota M., Sanchez-Cespedes M. Analysis of Adenomatous Polyposis Coli promoter hypermethylation in human cancer. // 2000. Cancer Res. 60, 4366.

41. Esteller M., С orn P., В aylin S., H erman J. A gene hypermethylation profile of human cancer. //2001. Can.Res. 61,3225-3229.

42. Evron E., Dooley W.C., Umbricht C.B. et al. Detection of breast cancer cells in ductal lavage fluid by methylation-specific PCR. // 2001b. Lancet. 357,1335-1336.

43. Evron E., Dooley W.C., Umbricht C.B. et al. Detection of breast cancer cells in ductal lavage fluid by methylation-specific PCR. // 2001. Lancet. 357, 1335-1336.

44. Evron E., Umbricht C.B., Korz D. et al. Loss of Cyclin D2 Expression in the Majority of Breast Cancers Is Associated with Promoter Hypermethylation // 2001a. Cancer Res. 61, 2782-2787.

45. Ferguson A.T., Nass S.J. DNA methylation and breast cancer. // 2000. Oncogene, 6, 1398-1409.

46. Ferguson A.T., Evron E., Umbricht C.B. et al. High frequency of hypermethylation at the 14-3-3 a locus leads to gene silencing in breast cance // 2000. PNAS, 97,6049.

47. Frigola J., Ribas M., Risques R., Peinado M.A. Methylome profiling of cancer cells by amplification of inter-methylated sites (AIMS). // 2002. Nucleic Acids Research 30(7) -e28.

48. Ge K., DuHadaway J., Du W., Herlyn M., Rodeck U., Prendergast G.C. Mechanism for elimination of a tumor suppressor: Aberrant splicing of a brain-specific exon causes loss of function of Binl in melanoma. //1999. PNAS. 96,9689-94.

49. Ge K., Duhadaway J., Sakamuro D., Wechsler-Reya R., Reynolds C., Prendergast G.C. Losses of the tumor suppressor BIN1 in breast carcinoma are frequent and reflect deficits in programmed cell death capacity. // 2000. Int. J. Cancer. 85(3), 376-83.

50. Ge K., Minhas F., Duhadaway J., et al. Loss of heterozygosity and tumor suppressor activity of Binl in prostate carcinoma. // 2000a. Int. J. Cancer. 86(2), 155-61.

51. Givant-Horwitz V., Davidson В., Reich R. Laminin-Induced Signaling in Tumor Cells: The Role of the Mr 67,000 Laminin Receptor // 2004. Cancer Res. 64,3572 3579.

52. Gonzalgo M.L., Jones P.A. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). //1997. Nucleic Acids Res. 25,2529-2531.

53. Gonzalgo M.L., Liang G., Spruck C.H., Zingg J.M., Rideout W.M., Jones P.A. Identification and characterization of differentially methylated regions of genomic DNA by methylation-sensitive arbitrarily primed PCR. //1997. Cancer Res. 57,594 599.

54. Graff J.R., Herman J.R., Myohanen S. et al. Mapping patterns of CpG island methylation in normal and neoplastic с ells i mplicated b oth u pstream a nd d ownstream r egion i n d e novo methylation. //1998. J. Biol. Chem. 227,22322-22329.

55. Han S., Ahn S.H., Park K. et al. P16INK4a protein expression is associated with poor survival of the breast cancer patients after CMF chemotherapy. // 2001. Breast Cancer Res. Treat. 70,205-212.

56. Hao J., Yang Y., McDaniel K.M., Dalkin B.L., Cress A.E., Nagle R.B. Differential expression of laminin 5 (alpha 3 beta 3 gamma 2) by human malignant and normal prostate. //1996. Am. J. Pathol. 149,1341 1349.

57. Hatada I., Kato A., Morita S., Obata Y., Nagaoka K., Sakurada A., Sato M., Horii A., Tsujimoto A., Matsubara K. A microarray-based method for detecting methylated loci. // 2002. J. Hum. Genet. 47(8), 448-451.

58. Herman J.G., Merlo A., Mao L., et al. Inactivation of the CDKN2/pl6/MTSl gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers. // 1995. Can. Res. 55,4525-4530.

59. Ни X.C., Wong I.H., Chow L.W. et al. Tumor-derived aberrant methylation in plasma of invasive ductal breast cancer patients. // 2003. Oncol. Rep. 10,1811-1815.

60. Hughes F.M. Jr, Bortner C.D., Purdy G.D., Cidlowski J.A. Intracellular K+ Suppresses the Activation of Apoptosis in Lymphocytes //1997. J. Biol. Chem. 272,30567 30576.

61. Hui R., Macmillan RD., Kenny FS et al. INK4a gene expression and methylation in primary breast cancer: overexpression of pl6INK4a messenger RNA is a marker of poor prognosis // 2000. Clin. Cancer Res. 6,2777-2787.

62. Issa J.P. Aging, methylation and cancer // 2000. Histol. Histopathol. 15(3), 835-842.

63. Ito Y., Kobayashi Т., Takeda T. et al. Expression of pi 6 and cyclin-dependent kinase 4 protein in primary breast carcinomas // Oncology. 54, 508-515.

64. Jackers P., Minoletti F., Belotti D., Clausse N., Sozzi G., Sobel M.E. Isolation from a multigene family of the active human gene of the metastasis-associated multifunctional protein 37LRP/p40 at chromosome 3p21.3 //1996. Oncogene. 1. 13(3), 495-503.

65. Jacob S., Moley K.H. Gametes and Embryo Epigenetic Reprogramming Affect Developmental Outcome: Implication for Assisted Reproductive Technologies // 2005. Pediatr. Res. 58,437 446.

66. Jahr S., Hentze H., Englisch S. et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. // 2001. Cancer Res. 61,1659-1665.

67. Jones P.A., Laird P.W. Cancer epigenetics comes of age //1999. Nat. Genet. 21(2), 163167.

68. Kaneda A., Kaminishi M., Yanagihara K. et al. Identification of silencing of nine genes in human gastric cancers. // 2002. Cancer Res. 62,6645-6650.

69. Kennet S.B., Udvadia A.J., Horowitz J.M. Sp3 encodes multiple proteins that differ in their capacity to stimulate or repress transcription. // 1997. Nucleic Acids Res., 26, 31103117.

70. Kerangueven F., Noguchi Т., Coulier F., et al. Genome-wide search for loss of heterozygosity shows extensive genetic diversity о f human breast с arcinomas. //1997. Cancer Res. 57, 5469-74.

71. Keijean A., Dupont J.M., Vasseur C., et al. Establishment of the paternal methylation imprint of the human H19 and MEST/PEG1 genes during spermatogenesis // 2000. Hum. Mol. Genet. 9,2183-2187.

72. Kious B.M., Baker C.V., Bronner-Fraser M., Knecht A.K. Identification and characterization of a calcium channel gamma subunit expressed in differentiating neurons and myoblasts // 2002. Dev Biol. 243(2), 249-259.

73. Koch M., Olson P.F., Albus A., Jin W., Hunter D.D., Brunken W.J. Characterization and Expression of the Laminin Y3 Chain: A Novel, Non-Basement Membrane-associated, Laminin Chain. // 1999. J. Cell Biol. 145,605 618.

74. Krassenstein R., Sauter E., Dulaimi E., et al. Detection of breast cancer in nipple aspirate fluid by CpG island hypermethylation. // 2004. Clin. Cancer Res. 10,28-32.

75. Kuiper, G. G., Enmark, E., Pelto-Huikko, M., et al. Cloning of a novel estrogen receptor expressed in rat prostate and ovary. // 1996. PNAS 93,5925-5930.

76. Kuroki Т., Trapasso F., Yendamuri S., Matsuyama A., et al. Allelic Loss on Chromosome 3p21.3 and Promoter Hypermethylation of Semaphorin 3B in Non-Small Cell Lung Cancer // 2003. Cancer Res. 63,3352 3355.

77. Lapidus R.G., Ferguson A.T., Ottaviano Y.L. et al. Methylation of estrogen and progesterone receptor gene 51 CpG islands correlates with lack of estrogen and progesterone receptor gene expression in breast tumors. // 1996. Clin Cancer Res. 2, 805810.

78. Lee W. H., Lee E. Y. The retinoblastoma gene: from its basic understanding as a signal mediator for growth find differentiation to its use in the treatment of cancer. // 1997. Gan To Kagaku Ryoho. 24,1368-1380.

79. Liang G., Carol E., Hung D. et al. DNA methylation differences associated with tumor tissues identified by genome scanning analisis. //1998. Genomics. 53,260-268.

80. Liu M.C., Gelmann E.P. P53 gene mutations: case study of a clinical marker for solid tumors. // 2002. Semin. Oncol. 29,246-257.

81. Lodygin D., Epanchintsev A., Menssen A., et al. Functional epigenomics identifies genes frequently silenced in prostate cancer. // 2005. Cancer Res. 65,4218-27.

82. Lupas A.N., Martin J. AAA proteins // 2002. Curr. Opin. Struct. Biol. 12(6), 746-753.

83. Martin K.J., Kwan C.P., Nagasaki K., et al. Down-regulation of laminin-5 in breast carcinoma cells // 1998. Mol Med. 4(9), 602-613.

84. Martin-Satue M., Blanco J. Identification of semaphorin E gene expression in metastatic human lung adenocarcinoma cells by mRNA differential display // 1999. J. Surg. Oncol. 72(1), 18-23.

85. Melki J.R., Vincent P.C., Brown R.D. HypermethylationofE-cadherin in leukemia.// 2000. Blood 95,10,3208-3213.

86. Meyyappan M., Wong H., Hull C., et al. Increased Expression of Cyclin D2 during Multiple States of Growth Arrest in Primary and Established Cells // 1998. Mol. Cell Biol. 18,3163-3172.

87. Miyakura Y., Sugano K., Konishi F., et al. Extensive methylation of hMLHl promoter region predominates in proximal colon cancer with microsatellite instability. // 2001. Gastroenterology. 121(6), 1300-9.

88. Miyamoto K., Asada K., Fukutomi Т., et al. Methylation-associated silencing of heparan sulfate D-glucosaminyl 3-0-sulfotransferase-2 (3-OST-2) in human breast, colon, lung and pancreatic cancers. // 2003. Oncogene. 22,274-280.

89. Moreira J., О hlsson G., R ank F., С elis J. Down-regulation of the Tumor Suppressor Protein 14-3-3<r is a sporadic event in cancer of the breast. // 2005. Mol. Cell. Proteomics, 4: 555 569.

90. Nessling M., Richter К., Schwaenen С., et al. Candidate genes in breast cancer revealed by microarray-based comparative genomic hybridization of archived tissue. // 2005. Cancer Res. 65(2), 439-447.

91. Nilius В., Wohlrab W. Potassium channels and regulation of proliferation of human melanoma cells //1992. J. Physiol. 445,537 548.

92. Nilsson 0., Chrysis D., Pajulo 0. et al. Localization of estrogen receptors-alpha and -beta and androgen receptor in the human growth plate at different pubertal stages. // 2001. J. Endocrinol 177,319-326.

93. Okano M., Bell D.W., Haber D.A., Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development // 1999. Cell. 99(3), 247-257.

94. Olek A., Oswald J., Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. // 1996. Nucleic Acids Res. 24,5064 5066.

95. Ottaviano Y.L., Issa J.P., Pari F.F., et al. Methylation of the estrogen receptor gene CpG island marks loss of estrogen receptor expression in human breast cancer cells // 1994. Cancer Res. 54,2552-2555.

96. Ozcelik H., To M.D., Couture J., et al. Preferential allelic expression can lead to reduced expression ofBRCAl in sporadic breast cancer. // 1998. Int. J. Cancer. 77,1-6.

97. Pancrazio J.J., Tabbara I.A., Kim Y.I. Voltage-activated K+ conductance and cell proliferation in small-cell lung cancer //1993. Anticancer Res. 13 (4), 1231-4.

98. Pardo L.A., Camino D., Sanchez A., Alves F., Bruggemann A., Beckh S. Oncogenic potential of EAG K+ channels. //1999. EMBO J. 18,5540 5547.

99. Parrella P., Poeta M., Altomare V., Fazio V. Nonrandom Distribution of Aberrant Promoter Methylation of Cancer-Related Genes in Sporadic Breast Tumors. // 2004. Clin. Cancer Res. 10, 5349.

100. Parker C., Rampaul R.S., Pinder S.E., et al. E-cadherin as a prognostic indicator in primary breast cancer. // 2001. Br. J. Cancer. 85,1958-1963.

101. Paulin R., Grigg G.W., Davey M.W., Piper A. A. Urea improves efficiency of bisulphite-mediated sequencing of 5 methylcytosine in genomic DNA. // 1998. Nucleic Acids Res. 26,5009-5010.

102. Raizis A.M., Schmitt F., Jost J.P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation//1995. Anal. Biochem. 226(1), 161-166.

103. Raman V., Martensen S.A., Reisman D., et al. Compromised HOXA5 function can limit p53 expression in human breast tumours. // 2000. Nature. 405,974-978.

104. Rathi A., Virmani A.K., Schorge J.O. et al. Methylation profiles of sporadic ovarian tumors and nonmalignant ovaries from high-risk women. // 2002. Clin Cancer Res. 8, 3324-3331.

105. Rein Т., Zorbas H., DePamphilis M.L. Active mammalian replication origins are associated with a high-density cluster of mCpG dinucleotides. // 1997. Mol. Cell. Biol. 17,416-426.

106. Rice J.C. and Futscher B.W. Transcriptional repression of BRCA1 by aberrant cytosine methylation, histone hypoacetylation and chromatin condensation of the BRCA1 promoter. // 2000. Nucleic Acids Res. 28,3233-3239.

107. Rice J.C., Ozcelik H., Maxeiner P., et al. Methylation of the BRCA1 promoter is associated with decreased BRCA1 mRNA levels in clinical breast cancer specimens. // 2000. Carcinogenesis. 21,1761-1765.

108. Rood В., Zhang H., Weitman D., Cogen P. Hypermethylation of HIC-1 and 17p Allelic Loss in Medulloblastoma. // 2002. Cancer Res. 62,3794.

109. Rush L.J., Dai Z., Smiraglia D.J., Gao X., Wright F.A., Caligiuri M.A., Plass C., et al. Novel methylation targets in de novo acute myeloid leukemia with prevalence of chromosome 11 loci // 2001. Blood. 97(10), 3226-3233.

110. Saitoh S. et al. p53 gene mutations in breast cancers in midwestern U.S. women: Null as well as missens-type mutations are associated with poor prognosis. // 1994. Oncogen. 9,2869.

111. Sakamuro D., Elliott K.J., Wechsler-Reya R., Prendergast G.C. BIN1 is a novel MYC-interacting protein with features of a tumour suppressor. // 1996. Nat. Genet. 14(1), 69-77.

112. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. // 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.

113. Sathyanarayana U.G., Padar A., Huang C.X., Suzuki M., et al. Aberrant Promoter Methylation and Silencing of Laminin-5-Encoding Genes in Breast Carcinoma // 2003. Clin. Cancer Res. 9,6389 6394.

114. Sathyanarayana U.G., Padar A., Suzuki M., Maruyama R., et al. Aberrant Promoter Methylation of Laminin-5-Encoding Genes in Prostate Cancers and Its Relationship to Clinicopathological Features // 2003. Clin. Cancer Res. 9,6395 6400.

115. Sathyanarayana U.G., Toyooka S., Padar A., Takahashi Т., et al. Epigenetic Inactivation of Laminin-5-encoding Genes in Lung Cancers // 2003. Clin. Cancer Res. 9,2665 2672.

116. Shapir В., Chakrabarty M., Cohn E.M., et al. Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease. // 1983. Cancer. 51, 2116-2120.

117. Sherr C.J., Weber J.D. The ARF/p53 pathway. // 2000. Curr.Opin.Genet.Dev., 10, 94-99.

118. Silva J., Silva J.M., Dominguez G. et al. Concomitant expression of pl6INK4a and pl4ARF in primary breast cancer and analysis of inactivation mechanisms. // 2003. J Pathol. 199,289-297.

119. Silva J.M., Dominguez G., Villanueva M.J., et al. Aberrant DNA methylation of the pl6/INK4a gene in plasma of breast cancer patients. // 1999. Br. J. Cancer. 80, 12621264.

120. Skryma R.N., Prevarskaya N.B., Dufy-Barbe L., et al. Potassium conductance in the androgen-sensitive prostate cancer cell line, LNCaP: involvement in cell proliferation. // Prostate-1997. Vol. 33, № 2. -P. 112-122.

121. Toyooka S., Toyooka K.O., Maruyama R., DNA methylation profiles of lung tumors. // 2001. Molecular Cancer Therapeutica 1,61-67.

122. Toyota M., Ho C., Ohe-Toyota M. et al. Inactivation of CACNA1G, a T-type calcium channel gene, by aberrant methylation of its 5' CpG island in human tumors. // 1999. Cancer Res. 59,4535-4541.

123. Tsutsumi M., Tsai Y.C., Gonzalgo M.L., Nichols P.W., Jones P.A. Early acquisition of homozygous deletions of pl6/pl9 during squamous cell carcinogenesis and genetic mosaicism in bladder cancer. // 1998. Oncogene. 17(23), 3021-7.

124. Umbricht C.B., Evron E., Gabrielson E., et al. Hypermethylation of 14-3-3 sigma (stratifin) is an early event in breast cancer. // 2001. Oncogene. 20,3348-3353.

125. Una J.A., Ferrando A.A., Velasco G., et al. Structure and expression in breast tumors of human TIMP-3, a new member of the metalloproteinase inhibitor family // 1994. Cancer Res. 54,2091-2094.

126. Ushijima T. Detection and interpretation of altered methylation patterns in cancer cells. // 2005. Nat. Rev. Cancer; 5(3), 223-31.

127. Ushijima Т., Morimura K., Hosoya Y., et al. Establishment of methylation-1д sensitive-representational difference analysis and isolation of hypo- and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors //1997. PNAS. 94,2284 -2289.

128. Varley J.M., Armour J., Swallow J.E., et al. The retinoblastoma gene is frequently altered leading to loss of expression in primary breast tumors. // 1989. Oncogen. 4,725729.

129. Warnecke P.M., Stirzaker C., Melki J.R., et al. Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphite-treated DNA // 1997. Nucleic Acids Res. 25,4422 4426.

130. Wechsler-Reya R., Sakamuro D., Zhang J., et al. Structural Analysis of the Human BIN1 Gene. Evidence for tissue-specific transcriptional regulation and alternate RNA splicing. // 1997. J. Biol. Chem. 272,31453-58.

131. Widschwendter M., Jones P.A. DNA methylation and breast cancirogenesis. // 2002. Oncogene 21, 5462-5482.

132. Woodfork K.A., Wonderlin W.F., Peterson V.A., Strobl J.S. Inhibition of ATP-sensitive potassium channels causes reversible cell-cycle arrest of human breast cancer cells in tissue culture //1995. J. Cell Physiol. 162(2), 163-71.

133. Xu X.C., Sneige N., Liu X., et al. Progressive decrease in nuclear retinoic acid receptor beta messenger RNA level during breast carcinogenesis // 1997. Cancer Res. 57,4992-4996.

134. Yan P.S., Perry M.R., Laux D.E., Asare A.L., Caldwell C.W., Huang Т.Н. CpG1.land Arrays: An Application toward Deciphering Epigenetic Signatures of Breast »

135. Cancer // 2000. Clin. Cancer Res. 6,1432 1438.

136. Yan P.S., Shi H., Rahmatpanah F., et al. Differential distribution of DNA methylation within the RASSF1A CpG island in breast cancer. // 2003. Cancer Res. 63, 6178-86.

137. Yoshida R., Kimura N., Harada Y., et al. The loss of E-cadherin, and -catenin expression is associated with metastasis and poor prognosis in invasive breast cancer. // 2001. Int. J. Oncol. 18,513-520.

138. Yu S.P., Yeh C.H., Gottron F., Wang X., Grabb M.C., Choi D.W. Role of the outward delayed rectifier K+ current in ceramide-induced caspase activation and apoptosis in cultured cortical neurons //1999. J. Neurochem. 73(3), 933-941.

139. Zaiss D.M.W., Standera S., Kloetzel P.-M., Sijts A.J.A.M. PI31 is a modulator of proteasome formation and antigen processing // 2002. PNAS. 99,14344 14349.

140. Zochbauer-Muller S., Fong K.M., Maitra A., et al. 5' CpG Island Methylation of the FHIT Gene Is Correlated with Loss of Gene Expression in Lung and Breast Cancer // 2001. Cancer Res. 61,3581-3585.

Информация о работе

Кузнецова, Екатерина Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.15

Диссертация

Идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы