Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-цитогенетический анализ чужеродной сателлитной ДНК in vivo и in vitro

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-цитогенетический анализ чужеродной сателлитной ДНК in vivo и in vitro"

На правах рукописи

СЛОМИНСКАЯ НАТАЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЧУЖЕРОДНОЙ САТЕЛЛИТНОЙ ДНК IN VIVO И IN VITRO

03.00.25- тстология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2005

Рабсиа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Паткин Евгений Львович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Смирнов Александр Федорович доктор медицинских наук Степанов Ростислав Павлович

Ведущая организация: Институт цитологии РАН (Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится в « /4» часов на заседании

диссертационного совета Д.001.022.02 при IV "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д.12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д.12.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.С. Петрова

г

ZI9P7SI

/Г озо (

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы

Произошедший за последние 20 лет прорыв в области молекулярной биологии,

завершившийся расшифровкой структуры геномов разных видов живых организмов, в том числе животных и человека, перевернул многие традиционные представления классической генетики. На сегодняшний день стала очевидна необходимость исследования функционального значения эпигенетических модификаций генома в регуляции генной экспрессии, процессах цитодифференцировки и возникновении геномных болезней, включая злокачественные новообразования. Известно, что эпигенетические модификации действуют подобно переключателям, контролирующим генную активность таким образом, что в отдельной клетке будут эксирессироваться только те гены, продукты экспрессии которых необходимы в данный момент. Более того, такие модификации обеспечивают "память" о генной активности, передающуюся в ходе последующих клеточных делений.

К основным эпигенетическим изменениям генома относятся мегилирование ДНК (Bird, 2002), обычно коррелирующее с "выключением" генной экспрессии, а также изменения структуры хроматина, обусловленные модификациями гистонов в составе нуклеосом (Lachner, Jenuwein, 2002; Hashimshony et al., 2003). Классическими примерами эпигенетической регуляции генной экспрессии у млекопитающих являются моноаллельпая экспрессия одной из X хромосом и геномный импринтинг. В первом случае имеет место случайное выключение одной из X хромосом в раннем эмбриогенезе (исключая клетки трофоэггодермы, в которых инактивируется ощовская Х-хромосома); во втором случае моноаллельная экспрессия отдельных генов зависит от пола родителя, от которого они были унаследованы. Кроме того, в после/шее время были выявлены различия в экспрессии между аллелями неимпринтированных аутосомных генов млекопитающих (Knight, 2004; Chess, 200$).

На сегодняшний день до конца не ясны молекулярные механизмы, лежащие в основе аллель-специфической экспрессии. Показано, что основную роль в эпигенетической регуляции моноаллельной экспрессии генов X хромосомы и импринтированных генов играют повторяющиеся последовательности ДНК (Cullen, 2004; Tupier и Gabellini, 2004). Причем, такие повторы могут быть локализованы как внутри генной последовательности (экзонах или нитронах), гак и вне генов В

. последнем случае действие noi гс^фц. ,^седних и, возможно,

БИБЛИОТЕКА i

отдаленных генов может осуществляться при участии интсрстициалыюго гстерохроматина (Dillon. Festenstein, 2002). Кроме влияния на возникновение аллель-специфической структуры хроматина, некодирующие повторы ДНК могут влиять на время репликации и расположение генов и хромосом в интерфазном ядре (Rizzi et al., 2004; Ensminger et al., 2004; Osborne et al., 2004).

Следует подчеркнуть, что существует определенная сложность в изучении описанных выше феноменов в природе, обусловленная вариабельностью как числа повторяющихся единиц в составе пучков повторов, так и их структуры. Кроме того, по крайней мере, для тринуклеотидных повторов и минисателлитов, показана как межгенерационная, так и соматическая нестабильность (Hsieh, Fire, 2000; Bois, 2003). В некоторых случаях наблюдается зависимость характера и степени нестабильности повторяющихся последовательностей ДНК от пола родителя (Гайцхоки, Паткин, 2000). Исходя из этого, трансгенные животные и культуры трансфектных клеток являются удобными моделями для исследования возможной роли повторяющихся ДНК в реализации межаллельных (межхромосомных) различий в экспрессии, обусловленных наличием в одной из гомологичных хромосом чужеродных нскодирующих сателлитных ДНК. При этом у гемизиготных по трансгенам животных можно исследовать межгенерационную нестабильность повторов, зависимость их возможной нестабильности и фенотипических проявлений от пола родителя и стадии развития носителя трансгена, а культуры трансфектных по сателлитным ДНК клеток позволяют оценить соматическую нестабильность и цитологические проявления инсерции.

Анализ родословных многих линий трансгенных как по кодирующей ДНК, так и по мини- и микросателлитам мышей показал, что одним из проявлений инсерции трансгена может быть отклонение от классического менделевского расщепления при межгенерационной передаче трансгена (Lyon, 2005). Кроме определения типа наследования трансгена, анализ родословных, особенно в сочетании с молекулярным и цитологическим анализом дает возможность оценить фенотипический эффект встроенных последовательностей ДНК, т.е. влияние трансгенов на экспрессию генов реципиентного организма.

Молекулярно-генетические исследования последних лет показали связь между межгенерационной нестабильностью микро- и минисагеллитных

последовательностей и возникновением ряда тяжелых нейромышечных и нейродегеперативных наследственных болезней человека (Гайцхоки, Паткин, 2000), а также эпилепсии, инсулинозаписимого диабета, эмбриональной летальности и многих других патологий (Bois, 2003). В то же время, на сегодняшний день идентифицировано только два наследственных заболевания, связанных с нарушениями в сателлитной ДНК - это ICF синдром (Xu et al, 1999) и синдром Робертса (Barbasa et al, 2000) В первом случае, нестабильность центромерной сателлитной ДНК обусловлена гипометилированием данной последовательности в раннем эмбриогенезе, которое приводит к аномальной хромосомной организации центромер, проявляющейся в виде цитологически регистрируемых пара- и перицентромерных перестроек (Xu et al, 1999) Во втором случае, изменения в а-сателлитной ДНК являются причиной нарушений в структуре гетерохроматина и асинхронной репликации этой ДНК в сестринских хроматидах. Кроме того, был описан случай амплификации а-сателлитной ДНК, приводящей к хромосомным перестройкам в опухолевых клетках (Gisselsson et al, 1999). Относительно небольшое количество описанных патологий, вызванных нестабильностью макросателлитной ДНК, может быть обусловлено, в первую очередь, методическими трудностями выявления структурных изменений сателлитной ДНК. Кроме того, даже незначительные, цитологически нерегистрируемые изменения в структуре макросателлитов могут быть существенными для нормального эмбрионального развития, и поэтому зародыши с мутантной сателлитной ДНК, вероятнее всего, будут нежизнеспособны.

Ранее в Отделе молекулярной генетики ИЭМ было показано, что в двух линиях мышей, трансгенных по повторяющейся единице бычьей центромерной сателлитной ДНК IV (Sat), не имеющей гомолога в мышином геноме, на протяжении 2-х поколений наблюдается межгенерационная структурная нестабильность трансгена (Попов и др., 2000, Сучкова и др., 2004,). Интересно отметить, чго в одной из линий происходило формирование эктопического интерстициального, выявляемого при помощи С-окрашивания гетерохроматина на одной из хромосом с интегрировавшим Sat (Попов и др., 2000). В то же время, не меньший интерес представляет характер наследования Sat-трансгена в дальнейших скрещиваниях, т.е. возможные отдаленные

последствия инссрции некодирующих гетерогенных по своему нуклеотидиому составу последовательностей ДНК.

Суммируя вышесказанное, можно сделать вывод, что иисерция чужеродных негомологичных сателлитных последовательностей в геном мышей и клеток мышиной эмбриональной карциномы, подобных клеткам ВКМ, дает возможность оценить относительную роль межгенерационной и соматической нестабильности таких ДНК в возникновении фенотипических нарушений, в том чпслс в формировании эктопического гетерохроматина, на ранних стадиях эмбриогенеза. Кроме того, исследование транссателлитных мышей позволяет выявить возможные зависимые от пола носителя транссателлита и пола родителя отличия в стабильности чужеродного сателлита и последствиях его интеграции. Учитывая, с одной стороны, твердо установленную связь между уровнем метилирования ДНК и эпигенетической регуляцией генной экспрессии, особенно моноаллельной, а с другой стороны, влияние метилирования на стабильность повторов (Nichol, Pearson, 2002), важно также исследовать уровень метилирования чужеродного сателлита как у трангненных по нему мышей, так и в траенфектных по нему клеточных клонах.

Таким образом, представляется актуальным комплексное исследование чужеродной сатеЛлитной ДНК in vivo, на примере трансгенных мышей как минимум на протяжении 4-6 поколений, и in vitro, на примере трансфертных клеточных клонов с различными сайтами интеграции и числом копий транссателлита. 1.2. Цель и задачи исследования

Целью работы явилось изучение особенностей межгенерационной и соматической передачи некодирующей повторяющейся ДНК на примере бычьей центромерной сателлитиой ДНК и связанных с этим эффектов у трансгенных мышей и в трансфертных клетках мышиной эмбриональной карциномы линии Г;<>.

В задачи работы входило:

1) определить особенности наследования Sat-трансгена в линии №21 трансгенных мышей;

2) исследовать возможные эффекты, вызванные Sat-инсерцией, у трансгснных животных;

3) определить характер метилирования Sat у трансгенных мышей и в трансфертных клетках F9;

4) картировать Sat у транегенных мышей и в трансфертных клонах F9;

5) изучить цитологически выявляемые эффекты в трансфектных клетках F9, вызванные интеграцией Sat;

6) сопоставить эффекты и поведение Sat-трансгена in vivo и In vitro.

1.3. Научная новизна исследования

Впервые показано, что чужеродная сатсллитная ДНК'характеризуется подобным импринтированному наследованием у трансгенных по ней мышей.

Чужеродная некодирующая сателлитная ДНК в гемизиготном состоянии приводит к повышенной частоте образования опухоли молочной железы у транегенных самок, а также к поведенческим нарушениям, не приводя при этом к фенотипическим отклонениям у трансгенных самцов.

Впервые показано, что в трансфектных по сателлитной ДНК клонах стволовых клеток эмбриональной карциномы F9 наблюдается полиморфизм по амплификации и элиминации сателлитной ДНК в зависимости от сайта ее интеграции и копийности. При амплификации транссателлита было выявлено формирование больших блоков эктопического гетсрохроматина ДНК клеток-реципиентов в одних случаях и последовательностью самого трансгена в другом.

1.4. Теоретическая и практическая значимость работы

Представленная работа по изучению поведения и последствий интеграции бычьей сателлитной ДНК в геном мыши in vivo и in vitro носит фундаментальный характер. Результаты исследования расширяют и дополняют сложившееся в настоящее время представление о нестабильном поведении повторяющихся последовательностей ДНК. Негативные фенотипические эффекты у гемизиготных но чужеродной некодирующей повторяющейся ДНК трансгенных мышей служат подтверждением тому, что повторяющаяся ДНК может влиять на экспрессию прилегающих к ней генов, т.е. выступать в качестве г/ис-регуляторной последовательности. Это указывает на важность исследования не только мутаций в кодирующих генах, но и различных повторяющихся последовательностей ДНК, особенно в гаметогенезе и раннем эмбриогенезе, в ходе дифференцировки клеток. Использование грансфектных клеток мышиной эмбриональной карциномы позволяет оценить поведение экзогенного сателлита и эффекты, вызванные его ннсерцией на хромосомном уровне, и указывает на необходимость комплексного исследования

повторяющихся последовательностей ДНК как in viro, так и in vitro для понимания возможных эффектов нестабильности такой ДНК на экспрессию генов.

Результаты данной работы могут быть особенно интересны для практического применения в области генной терапии с использованием культуры стволовых клеток мышей и человека.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту

1. Чужеродная сателлитная ДНК у трансгенных мышей в ряду поколений имеет разную стабильность в зависимости от пола прародителя.

2. В гемизиготном состоянии некодирующая центромерная бычья сателлитная ДНК приводит к повышенной частоте возникновения рака молочной железы, воспалительным процессам репродуктивной системы и каннибализму у трансгенных самок, не вызывая при этом каких-либо фенотипических отклонений у траснгенных самцов.

3. При трансфекции в клетки мышиной эмбриональной карциномы линии F9 бычья сателлитная ДНК интегрирует в различные участки генома в разных клонах, но, как правило, вблизи гетерохроматиновых районов.

4. Интегрировавшая в клетки F9 сателлитная ДНК способна к амплификации, приводя к неогетерохроматинизации соседних первоначально эухроматиновых участков хозяйской ДНК, не являясь при этом гетерохроматинизироваиной.

1.6. Личный вклад диссертанта

Диссертантом лично был проведен анализ трансгенных мышей линии №21 с 3-го по 5-с поколения, определено состояние метилирования чужеродного сателлита у трансгенных животных 1-5-го поколений и в трансфертных клетках F9, картирован транссателлит у трансгенных мышей и в трансфертных клонах, проведен молекулярно-цитогенетический анализ транссателлитных клонов F9. Автором самостоятельно выполнена статистическая обработка полученных результатов и подготовлен текст диссертации.

Автор признателен ст.н.с., к.б.н. Сучковой И.О. за определение копийности чужеродного сателлита у трансгенных мишей и в трансфектных клонах F9 и анализ 02-го поколений трансгенных мышей линии №21, н.с., к.б.н. Барановой Т.В. за предоставленные результаты молекулярно-цитогенетического анализа двух субклонов одного из трансфектных клонов клеток F9, д.м н. Забежинскому М А. за

проведение гистологического анализа опухолей молочной железы трансгенных самок.

1.7. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы из 309 источников, из них -296 зарубежных авторов. Текст диссертации иллюстрирован 23 рисунками и 1 таблицей.

1.8. Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ в отечественных журналах, а также в сборниках по материалам Всероссийских и Международных конференций. Материалы работы докладывались на Российских и Международных конференциях' 5-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей "Человек и его здоровье"(Санкт-Петербург, 2002); Ш-м съезде биохимического общества (Санкг-Петербург, 2002); XIV-м Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2002); 1-м съезде Общества клеточной биологии. (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003); Научно-практической конференции молодых ученых «Вчеш майбутнюго» (Одесса, 2003); 4"1 and 5lh European Cytogenetics Conference (Bologna, Italy, 2003; Madrid, Spain, 2005); Научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2005).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались мыши гибриды (CBAxC57/BL6) F| (питомник "Рапполово"). Бь-ла исследована линия №21 Sat-трансгенных мышей, полученных от гемизиготного по транссателлиту самца-фаупдера, который был получен в Отделе молекулярной генетики НИИЭМ РАМН методом микроинъекции чужеродной ДНК в мужской пронуклсус зигот (Gordon et al., 1980; Вайсман, Голинский, 1985). Для получения 5 поколений гемизиготных по Sat-последовательности мышей,

гранссателлитных особей скрещивали с контрольными мышами, а также проводили скрещивания между гемизиготными особями (F2 и F.|).

Культуру клеток эмбриональной карциномы мыши линии F9 получали из Банка клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Тератокарциномные клетки F9 котрансфецировалк плазмидами pBR322-Sat и pSV2nco. Трансфекцию проводили кальций-фосфатным методом (Хеймс, Хиггис, 1987).

Основным материалом для исследования экзогенной сателлитной ДНК служили образцы ДНК из тканей хвостов взрослых животных и новорожденных; ДНК трансфектных клеток мышиной эмбриональной карциномы линии F9; хромосомные препараты клеток костного мозга Sat-трансгенных мышей и клеток F9 Sat-трансфектных клонов; гистологические препараты опухоли молочной железы Sat-трансгенных самок. Исследованные трансгенные мыши и трансфектные клетки F9 были гемизиготными по чужеродной ДНК.

В качестве вектора для клонирования чужеродной ДНК использовали плазмиду pBR322, содержащую по Hind III сайту вставку 3,8 т.п.н. повторяющейся единицы сателлитной flHKlV Bos taurus. Клонирование, экстракцию рекомбинантной плазмиды pBR322/Sat и выделение Sat-вставки осуществляли, следуя методам, описанным (Маниатис и др., 1984). Геномную ДНК выделяли фенол-хлороформным методом (Маниатис и др., 1984).

Скрининг и анализ трансгенных мышей и трансфектных клеток осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР in vitro и ПЦР in situ), с использованием двух пар праймеров S'gcagtgcataaatatcaaaagg3' (PR1) и 5'gatcaggaggttgtagggaac3' (PR2); 5'cccactggalgccgaccctt3' (PR3) и 5'tcctttccglagccctcgtt3' (PR4), подобранных с помощью программы "Primer 1.0". ПЦР проводили в термоциклсре ("Cyclotemp") при следующих условиях- один цикл предварительной денатурации 94°С - 5мин.; 30 циклов - 94°С - 1 мин, 60 °С (для пары праймеров PR1/PR2) или S7°С (для пары праймеров PR1/PR2 и нары праймеров PR3/PR4) -!мин, 72 С - 1мин.; заключительный цикл синтеза 72°С - 9 мин Продукты амплификации разделяли электрофоре гически в 6% ПАЛГ с последующим окрашиванием 0,1% AgN03.

Анализ паггерна метилирования чужеродной сателлит ной ДНК проводили с помощью метил-чувствнтелыюй ПЦР с использованием рестриктаз-изошизомеров I Ipall и Mspl и праймеров PR3/PR4

Изучение локализации Sat-траисгена у трансгенных мышей и трансфертных клеток F9 проводили методом флуоресцентной гибридизации in situ ДНК/ДНК (FISH). В качестве зонда для FISH использовали рекомбинантную плазмиду pBR322/Sat. Мечение зонда биотином (Biotin-!6-dUTP, Boehringer, Mannheim) проводили стандартным методом ник-трансляции. Гибридизацию in situ ДНК/ДНК на метафазных хромосомах и интерфазных ядрах проводили по стандартной методике, включающей предобработку препаратов РПКазой А, пепсином и параформальдегидом. Концентрация ДНК зонда в составе гибридизационной смеси составляла 5-7нг/мкл. Для детекции гибридизаннонного сигнала использовали коныогаты авидин - флуоресцеин-изотиоцианата (ФИТЦ) (Vector Laboratories), стрептавидин-ФИТЦ (Boehringer, Mannheim) Препараты заключали под покровные стекла в раствор 90% глицерина/1 \PBS, содержащий йодистый пропидий (0,5-1,0 мкг/мл), 2,5% DABCO и DA PI (0.5 мкг/м л).

Препараты анализировали в центре БиНИИ «Хромас» на универсальном микроскопе Leica, оснащенном блоками светофильтров для ФИТЦ, DAPI, йодистого пропидия и компьютерной системой анализа изображения (программное обеспечение для проведения обработки изображения "Q-FISH"), при длине волны 460-490 им.

Дифференциальную окраску хроматид после культивирования в среде с БДУ (10'5 М), которое, кроме оценки уровня СХО, позволяет оценить продолжительность клеточного цикла, получали по методу Попова и Паткина ( Паткин и др., 1993).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью системного пакета программ «STATISTIKA-6».

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Наследование и последствия инсерции чужеродной сателлитной ДНК у трансгенных мышей

В нашей работе была изучена линия №21 трансгенных мышей, несущих бычью центромерную сателлитную ДНК, полученных от транссателлитного самца-фаундера

в результате скрещиваний с контрольными мышами шбридами F, (С В A v C57BL/6). Параллельно проводились скреи(ивания между контрольными мышами На протяжении 6 лет было получено и проанализировано 150 мышей в 5 поколениях. Метолом ПЦР с использованием 2-х пар праймеров, были выявлены 34 (22,7%) Sat-трансгенные мыши.

Ожидалось, что инъецированная в мышиные эмбрионы чужеродная ДНК интегрирует в хромосомы и стабильно передастся в следующих поколениях согласно законам Менделя. Однако анализ родословной данной линии показал отклонение от наследования чужеродного сателлита по Менделю уже в первом поколении F| (4,5% по сравнению с теоретически ожидаемыми 50%, р<0,05) (рис.1). В то же время, после прохождения Sat-последовательности через женский гамстогснез (самка Г|) происходило восстановление расщепления до теоретически ожидаемого (1:1) в F2 (52.9% Sat-носителей) и F3 (42,3%, по сравнению с ТО 50% при скрещивании трансгенного самца и контрольных самок, и 80%, по сравнению с ТО 75% при скрещивании трансгенных самца и самки F2 между собой).

Далее при передаче Sat от дедушки внукам (F2 —» F4, F3 —> F5) опять наблюдалось достоверное отклонение от расщепления 1:1 (16,7%, 10% и 20%, соответственно, р<0,05) и даже отсутствие трансгенных потомков в F4 (рис. 1).

Передача трансгена менее 50% потомства, в первую очередь, может объясняться двумя основными причинами:

1) негативным влиянием самого трансгена или возникающих инсерционных мутаций на жизнеспособность трансгенных гамет или эмбрионов В нашем случае эмбриональная летальность Sat-мышей была исключена, г к. сравнение плодовитости самок в исследуемой линии с контрольными не выявило достоверных различий. 4,8+1,3 (от 2 до 7 особей в помете), по сравнению с 5,0+1,8 (от 1 до 8 особей в помете) в контроле.

2) Второй причиной может быть наследуемая нестабильность трансгена при отсутствии негативного влияния на трансгенные особи. Причем, элиминация трансгена может происходить как в половых клетках, приводя к сниженной передаче трансгена, так и в соматических тканях трансгенных мышей, приводя к соматическому мозаицизму и ослабленному или даже полному отсутствию трансгенного сигнала.

Ранее (Лчконой И О на oeiion.iiimt анализа часичы ip;nicieiiiii>i\ постелей па рашых с i алиях эмбриона и, iioi о р.нннтя было пока ыио снижение час ioim фпнсгспммч эмбрионов в \оле pa mm мя (Сучкопа и лр, 2004). Так, qacioia ф.шсгеипыч эмбрионов на стали" бластоцисты соошегствопала 1еор<яически ожидаемой (М)"и), а среди П-in шейных эмбрионов и 3-х недельных мыша! наблюдалось достоверное снижение часпны грансгсиных носигслей (р-0,05). Таким образом. соответствие частоты Sat-ipani енных эмбрионов на стадии бластоцисты юоретнчеекм ожидаемой маски с исключает потерю трансгспа в половых клетках, а OICVTCTB1IC )мбр юнальноп леппыюсгн Sal-трансгенпых мышей говорит о том, что наиболее вероятной причиной уменьшения частоты Sat-фансгенных мышей могла бып, частичная или полная элиминация чужеродного стеллита, вызванная его соматической нестабильное!ыо «о время эмбриогенеза

С помощью тетрахорического пока ¡а геля связи нами была установлена связь между оютствием отклонения от ТОР и полом прародителя-носителя Saf независимо or пола родителя при наследовании Sal от дедушки количество фансгсшнл\ особей достоверно ниже теоретически ожидаемого В случае наследования от бабушки количество Sat-несущих мышей соответствует ТОР. (р 0.05). iаким образом, наблюдается так называемый положительный бабушкин >ффскт

Опнсынаемый нами положшс п.иый бабушкин }ффект (стабилизация фднссате гшга при наследовании внуками от бабушки и его нестабильность при передаче or дедушки) может бы и> обоснован различиями между мужским и женским гамстогепеюм. Во-первых, во время мужского таметотенеза происходит больше мшотическнх делений, чем во время женскою (Melaren. 1991); во-вторых, несмотря на jo, mi о чаще рскомбинашюниые события возникают в женском ме.йозе. в определенных ушетках кчюма рекомбинация происходит преимущественно в мужском 1амеюгснеэе (Kcarns et al. 2001); в-трстьих. у самцов установление импринтов происходит во время нредмейотических делений, а у самок - на стадии днплотсны (Murphy, Jirtle 2003. Reams el al, 2000).

Слсл>с1 oí метить, чк> шп.ециропаиный фрагмент Sat первоначально был пемсгилиронан Для изучения возможного de novo метилирования и изменений в картне мешлирования ípaiiccaic.T.iiiia и ряду поколений фаисгашых мышей с

Рисунок 1. Родословная Замрансгенных мышей. Заполненные серым цветом фигуры - носители трансгена (ф - трансгенные самки: Щ - трансгенные самцы; трансгенные особи, недостигшке половозрелого возраста); пустые фигуры - нетрансгенные самцы и

самки. Цифрами в фигурах указано количество мышей. Цифрами под фигурами указаны частоты трансгешшх особей; серая заливка -различия между теоретически ожидаемой и наблюдаемой частотой трансгенных мышей достоверны при р< 0.05

помощью метилчуьстни гелыюй ПЦР качественно был изучен характер метилирования Sat-трансгена в области с 558 по 1007 куклсотид, обогащенной CpG дипуклсотидами. Было выявлено преимущественно неметилированпое состояние данной области Sat. Так, среди 34 проанализированных Sat-трансгенных мышей 5 (14,7%) несли метилированный трансген При этом частота мышей с метилированным Sat варьировала от 0% в F,( до 25% в Г\ и F5. Отсутствие каких-либо закономерностей в метилировании чужеродного сателлита в области, обогащенной CpG динуклеотидами, на протяжении 5 поколений трансгенных мышей можно объяснить, в первую очередь, их смешанным генетическим окружением. Преимущественное не метилированное состояние Sat можно объяснить его невысокой копийностью (порядка 10 копий на геном мыши)(Сучкова и др., 2004).

У транссателлитных самцов, исследуемой нами линии, не было выявлено никаких фенотипических эффектов. В то же время, у 4 из 16 Sat-трансгенных самок (25,0±2,7%, по сравнению с 6,2±2,0% в контроле, р<0,05) были обнаружены опухоли молочной железы. Морфология опухолей оценивалась по критериям Международной ассоциации по изучению рака. Так, в нашем случае опухоли молочной железы представляли собой аденокарциномы с участками мелкоацинарного и солидного строения. Интересно отметить, что у самки F)№22 опухоль возникла во время третьей беременности в возрасте 15 месяцев; у F2№4 - через полгода после первых родов и лактации в возрасте 16 месяцев; у F3№12 - через 2 месяца после первых родов без лактации в возрасте 20 месяцев; у Fj№5 - сразу после первых родов без лактации в возрасте 26 месяцев. Таким образом, в ряду поколений наблюдалось возникновение опухоли молочной железы в более старшем возрасте и сокращение промежутка времени между родами и возникновением опухоли.

Для выявления нарушений хромосомного аппарата, часто возникающих при канцерогенезе, был проведен цитогенетический анализ метафазных хромосом клеток костного мозга транссателлитных самок как с опухолью молочной железы - F;j№12, так и без нее - F3№16 и F4№28. Однако, у всех трех самок не было обнаружено хромосомных аберраций.

Кроме генетических изменений при развитии опухолей, важное значение имеют эпигенетические модификации генома. Метил-чувствительная ПЦР показала, что экзогенный сателлит во всех опухолях был не метилирован, в то время как в

других тканях трансгенных самок он был как метилирован (у 2 мышей), так и не метилирован (у 2 мышей), о чем уже говорилось выше (рис 2)

Кроме того, для 14 самок Fb F3, F4 и F5 поколений был характерен каннибализм' самка Ft №22 загрызла третий помет, следует подчеркнув, чго именно во время третьей беременности у нее была обнаружена опухоль молочной железы; самки Fi№12, №15, №16, №27, Fs№5, №15 и №17 загрызли свой первый помет, кроме того, у F3№12 и Fj№S также были обнаружены опухоли молочной железы, о чем упоминалось выше; самки F3№22, №24 и №29 и Ff28 загрызли свой второй помет. У 4-х из всех перечисленных самок развивался воспалительный процесс из-за недостаточной родовой активности и разложения оставшихся в рогах матки эмбрионов, обнаруженных при вскрытии умерших самок. У контрольных самок такие явления не наблюдались.

Таким образом, фенотипические проявления Sat-инсерции зависели от пола Sat-ноентеля: не было выявлено видимых нарушений у самцов, а у самок возникали нарушения репродуктивной системы и поведения.

Картирование Sat-трансгена с помощью совмещения дифференциального G-окрашивания метафазных хромосом клеток костного мозга (22 метафазные пластинки) и флуоресцентной гибридизации in situ показало, что чужеродный сателлит локализован в интерстициальной области хромосомы 12 (12С1-С2) вблизи протяженного гетерохроматинового блока (рис. 3). Окрашивание с помощью DAPI установило локализацию гибридизационного сигнала на периферии интерфазных ядер и вне гетерохроматиновых блоков как в интерфазных ядрах, так и на метафазных хромосомах, что указывает на отсутствие гетерохроматинизации как самого чужеродного сателлита, так и прилегающих районов. Результаты компьютерного анализа показали, что в области предполагаемой интеграции Sat расположен ген РЛХ9, принадлежащий PAX семейству транскрипционных факторов,

принимающих в эмбриогенезе активное участие в формировании скелета и других органов, и кодирующая последовательность ДНК, подобная супрессору метастазовов рака молочной железы (breast cancer metastasis suppressor) - BRMSll. Кроме того, в субтеломерной области хромосомы 12 находится кластер малоизученных импринтированных генов Gtl2/Meg3, влияющих на жизнеспособность, регуляцию пренатального роста и формирование мезодермальных

и происходящих из клеток нервного гребня клеточных пулов Таким образом, нельзя исключи п> влияния Sat-инсерции на экспрессию генов данного хромосомного района

Рисунок 2. Результаты метилчупствитсльной Г1ЦР на ДИК Sat-трансгениых мышей Обра щы нанесены в следующем порядке. В - инкубация в буфере для рестрикции (без рестриктаз); М - пробы после рестрикции с Mspl, Н - пробы после рестрикции с Hpall с последующей ПЦР с праймерамн PR3/PR4. Нижний бэнд соответствует 449 п.н. Положительный контроль - рекомбинантная гшазмида pBR322-Sat, содержащая неметилированный Sal. Отрицательный контроль - ПЦР с праймерами PR3/PR4 без ДНК m - маркер

Я F, 12 Я F, 12 опухоль pBR322/Sat А А _Л_

900 bp 800 bp 600 bp

500 bp 400 bp 300 bp

Рисунок 3. Результаты совмещения гибридизации m su/u (FISH) ДНК/ДНК с биотинилированным Sat-эондом и дифференциального G-окрашивания метафачных хромосом клеток костного мо)га транссателлитных мышей А. Хромосомная локализация Sat, краситель лропидиум иодид, детекция гибрндизационного сигнала авилин-FITC; Б. G-окрашенные хромосомы транссателлитных мышей. В. Идентификация дифференциально окрашенной 12-й хромосомы с интегрировавшим Sat Стрелками указаны гибридизационные сигналы. Увеличение об !00х, ок 10х

А.

3.2. Молекулярно-цнтогенетический анализ трансфектных по бычьей сателлитной ДНК IV клеток мышиной эмбриональной карциномы линии Р9

Ранее в отделе молекулярной генетики ИЭМ совместно с ЦИН было получено 12 клонов Г-9, котрансфсцированных плазмидами рВЯ322-5а/ (содержащей 3.8 т.п н. повторяющуюся единицу сателлитной ДНК IV быка) и pSV2nco (кодирующей

нсомицин резистентный ген, для осуществления отбора гранфектантов) В данной работе представлены результаты исследования 4-х Sat-трансфектных клонов: Sat 7, Sat 10, Sat 12 (с порядка 10 копиями трансгена на геном) и Sat 11(с порядка 100 копиями трансгена на геном)

Основные характеристики описываемых Sat трансфертных клонов сведены в таблицу 1. Интересно отметить, что в трех клонах Sat интегрировал в прилегающий к гетерохроматиновым блокам район; для всех 4-х клонов была характерна неслучайная локализация Sat в интерфазном ядре - на периферии. Более того, в двух клонах (Sat 7 и Sat 11) Sat встроился в непарные хромосомы F9 (19 и X соответственно). Несмотря на отличия в копийности по Sat у всех клонов наблюдалось удлинение клеточного цикла. Кроме того, инссрция Sat не влияла на жизнеспособность клеток всех 4-х клонов. Показано отсутствие нарушений при дифференцировке в присутствии ретиноевой кислоты трансфертных клеток трех изученных клонов (к сожалению, не удалось оценить дифференцировку клеток клона №11).

В отличие от других Sat трансфертных клонов, Sat 11 первоначально имел два сайга интеграции чужеродного сателлита: один из которых располагался около центромеры, а другой - в интсрстициальной области одной из хромосом клеток F9 При дальнейшем культивировании (несколько пассажей) наблюдалось разделение клеточной популяции на 3 субкло'на: 1) для одного из них было отмечено распространение положительного гибридизациошюго сигнала вдоль хромосомы (рис. 4.а); 2) для другой части клеток - локальное концентрирование гибридизациошюго сигнала в интерстициальной области хромосомы (рис. 4.с); 3) в третьем субклоне не наблюдалось изменений в распределении Sat-положительных сигналов на хромосоме.

FISH без предварительной денатурации хромосом (которая позволяет выявить однонитевые разрывы в сайтах интеграции трансгена) клеток первого субклона Sat 11 с амплифицированным Sat выявили асимметричное расположение амплифицировавшегося Sat-положительного' сигнала на сестринских хроматидах. Полученные данные указывают на обогащенность данного хромосомного района однонитевыми разрывами ДНК Окрашивание с помощью DAPI показало формирование дополнительных ОЛРЬпозитивных хромосомных участков во всех 3-х субклонах клеток Sat 11, по сравнению с интактными клетками F9.

Таблица X»1.

Основные молекулярно-цитогенетические характеристики транссателличных клеток мышнной эмбриональной карциномы линии F9

i

i

I

Характеристика Sat 7 Sat 10 Sat 11 Sat 12

Метилирование Sat в области с 558 по 1007 нуклеотид - + - -

Копийность Sat около 10 около 10 около 100 около 10

Сайт интеграции (количество и расположение) 1, прицентро-мерный район хромосомы 19, вблизи 1 етерохромати-нового блока 1, прицеитро-мерный хромосомный район 2, X-хромосома вблизи гетерохроматиновых блоков 1 .субтеломер ный р-н хромосомы 16, вблизи гетерохроматиновых блоков

Цитологические изменения в сайте интеграции трансгена при дальнейшем культивировании - снижение числа Sat-положительных клеток + 3 субклона -

Локализация Sat-потожи-тельного сигнала в ннтер-фазном ядре на периферии на периферии на периферии на периферии

Формирование эктопического гетерохромттина - - + (как самим Sat -субклон 3, так и хозяйской ДНК 1,2 ск) -

Морфологические отличия между дифференцирующимися трансфектными н ннтиктными клетками F9 - - не изучены -

Удлинение клеточного цикла + + + +

Рисунок 4. Результаты гибридизации in situ (FISH) ДНК/ДНК с биотинилированным Sat-зондом. Хромосомная локализация Sat в клетках клона №11 после нескольких пассажей, краситель пропидиум иодид, детекция гибридизационного сигнала авидин-FITC (а, с), стрелками указаны гибридизационные сигналы; краситель DA PI (Ь, d), стрелками указаны участки эктопического гетерохроматина. Увеличение об.ЮОх, ок.Юх..

Следует отметить, что п первом и во втором субклопах чужеродный сателлит индуцировал формирование неогетерохроматина хозяйской мышиной ДНК. такой гетсрохроматин формировался между сайтом интеграции Sal и центромерным гетерохроматином (рис. 4.b, d).

Наблюдаемое нами явление неогетерохроматинизации в клетках клона Sat 11 (100 и более копий Sat на геном) согласуются с предположением что повторяющиеся последовательности ДНК (микро-, мини- и сателлиты) при достижении определенного размера/протяженности могут приводить к формированию эктопического гетерохроматина, который, в свою очередь, может приводить к замолканию прилегающих генов, так называемому "эффекту положения"(Нет'ко1Т, 2000; Гайцхоки, Паткин, 2000). Такой процесс может происходить во время последовательных делений недифферинцированных стволовых клеток зародышей млекопитающих на ранних сроках развития или во время культивирования стволовых клеток in vitro.

Следует отметить, что в одном из субклонов клеток клона №11 происходила ожидаемая нами «защитная» гетерохроматинизация самого Sat-трансгена В то же время, выявленные нами дополнительные DAPI-положительные блоки в двух других субклонах клеток Sat 11 локализовались исключительно между центромерным гетерохроматином и ближним сайтом интеграции Sat. Следовательно, можно предположить, что в данном случае происходило распространение вдоль хромосомы мышиной повторяющейся ДНК (ЛТ-богатой, DAPI-положительной) в ответ на интеграцию бычьей сателлитной GC-богатой, которая в данных субклонах была негетерохроматинизирована. Теоретически можно выделить несколько возможных вариантов для описания наблюдаемого эффекта. Во-первых, могла произойти дсконденсация центромерного гетерохроматина. Однако, в нашем • случае характер DAPI окрашивания был несколько иной, чем выявленный при деконденсации центромерного гетерохроматина под влиянием некоторых веществ in vivo (Vig, Willcourt, 1998), или при ICF синдроме (Hassan et al., 2001). Невелика также вероятность того, что интегрировавший Sat каким-то образом вызвал изменение обычного DAPI-ноложительного бэндинга: даже самые длинные хромосомы мыши не имеют так много DAPI-положительных бэндов в районах, окрашивающихся при дополнительной обработке DAPI (Yang et al., 2000;

Graphodatsky,1988), Таким образом, наиболее вероятно, чю первоначально эухроматиновые участки хромосомы перешли в гетерохроматиновое состояние, что, в свою очередь, и позволило выявить дополнительные DAPI-окрашенные области, и что этот процесс мог быть вызван относительно небольшой сателлитной последовательностью ДНК, независимо от специфичности последовательности ДНК в первоначально эухроматиновой области. Можно предположить, что в данном случае формировалась специфическая "хозяйская" ДНК-белковая структура высшего порядка под влиянием прилегающего повторяющегося встроенного Sat.

Таким образом, инсерция Sat в геном клеток F9 приводила к удлинению клеточного цикла, но не влияла на дифференцировку трансфектных клеток. Высокая копнйность Sat приводила к его соматической нестабильности и, следовательно, гетерогенности пула трансфектных клеток, a de novo метилирование Sat способствовало его элиминации из генома трансфектных клеток.

3.3. Сравнение эффектов, вызванных Sat-инсерцией, in vivo и in vitro

Суммируя все вышесказанное, становится очевидным, что встроенная чужеродная сателлитная ДНК характеризовалась нестабильным поведением при межгенерационной передаче в 5-ги поколениях трансгенных мышей. Случайный характер и преобладающий низкий уровень метилирования Sat-трансгспа согласовывались с его нестабильностью. Инссрция чужеродной сателлителлитной ДНК приводила к возникновению опухолей молочной железы у трансгенных самок Учитывая интеграцию Sat в ингерстициальную область хромосомы 12 мыши, содержащую гены Pax 9 и Brmsll, снижение или полное отсутствие экспрессии которых приводит к опухолеобразованию, можно предположить негативное влияние Sat на экспрессию этих генов.

Кроме того, в нашем случае для стабилизации Sat было необходимо его прохождение через женский гамстогенез, иначе наблюдалось достоверное снижение частоты грансгенных особей, а иногда и полное их отсутствие при наследовании от дедушки внуками (F2 —» F4, F3 —> F3). В то же время, многочисленные случаи каннибалтма, нарушения родовой деятельности, результатом чего являлось воспаление репродуктивной системы у трансгснных самок, и случаи рака молочной железы у части Sat-нссущих мышей привели к невозможности получения потомства, в том числе и трансгснного, и, таким образом, к тупиковости трансгснной линии №21

Аналогичная тенденция к элиминации наблюдалась и у час-и трансфсюшых клонов. Так, для клеток клона № 10 было характерно «выбрасывание» трансгеиа из генома клеток F9 в ходе последовательных пассажей. В то же время, распространение Sat в одном из субклонов клона №11 приводило к неогетерохроматинизации большей части хромосомы-носителя Sat, что при последующих пассажах могло бы привести к гетерохроматинизации всей хромосомы целиком, таким образом, исключить Sat из генома клеток F9.

Однако, в отличие от трансгенных мышей, Sat инсерцич не оказывала существенного влияния на жизнеспособность и дифференцировку трансфектных клеток, что частично можно объяснить интеграцией Sat в непарные хромосомы клеток F9.

Таким образом, Sat- грансгснная последовательность ДНК характеризовалась митотической нестабильностью и склонностью к элиминации in vivo, и склонностью как к элиминации, так и к амплификации in vitro. Анализ полученных нами результатов, дает основание предполагать, что Sat-инсерция, в большинстве случаев, приводила к не выявляемым цитологически изменениям в структуре хроматина в сайте интеграции и прилегающих к нему областях. Важно отметить, что все описанные эффекты наблюдались у гемизиготных по некодирующей последовательности ДНК трансгеиных мышей и трансфектных клеток.

В целом, полученные данные указывают на возможность использования недифференцированной клеточной культуры в качестве модели для изучения изменений в повторяющейся ДНК и возможных цитологических проявлений, сопутствующих таким изменениям и на необходимость проведения комплексных исследований т vivo (на трансгенных мышах при межгенерационной передаче) и in vitro (в культуре трансфектных клеток F9) для получения более полной картины оценки как отдаленных, так и на ранних стадиях эмбрионального развития последствий интеграции чужеродной повторяющейся последовательности ДНК в мышиный геном.

ВЫВОДЫ

1. Бычья центромерная сателлитная ДНК характеризуется подобным импринтированному наследованием (в зависимости от пола прародителя) у трансгенных по ней мышей.

2. У трансгенных самок Sat-пнссрция приводит к негашеным фснотиничсским эффектам: повышенной частоте возникновения рака молочной железы, нарушениям родовой дея!ельности, воспалительным процессам репродуктивной системы и каннибализму У трансгенных самцов не было выявлено фенотипическич отклонений от нормы.

3. В пяти поколениях трансгенных мышей метилирование Sai-последовательности у самцов и самок не зависело от пола родителя. Во всех опухолях Sat был не метилирован, независимо от его метилирования в остальных тканях

4. У трансгенных мышей Sat локализован в интерстициальной облааи хромосомы 12 (12С1-С2) вблизи крупного гетерохроматинового блока

5. В различных клонах трансфертных клеток мышиной эмбриональной карциномы линии F9 Sat-трансген интегрирует в районы, прилегающие к крупным гетерохроматиновым блокам. В интерфазных ядрах транссателлитных клеток F9 Sat локализован по периферии ядра, что характерно для транскрипционно неактивных районов.

6. Высококопийный Sat (порядка 100 копий на геном) приводит к неогетерохроматинизации ДНК клеток-реципиентов в прилегающих к нему участках, не являясь при этом гетерохроматинизированным.

7. Sat-трансгенная последовательность ДНК характеризуется соматической нестабильностью как in vivo, так и in vitro.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сучкова И.О., Баранова ТВ., Никитина Н.Я., Сломинская H.A. Импринтированный xapaiciep влияния экзогенной сателлитной ДНК на эмбриональное развитие трансгенных мышей. // 5-я Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье". Тезисы докладов. -2002.- С. 239-240.

2. Баранова Т.В., Сучкова И.О., Кустова М.Е., Кислякова Т.В., Сломинская H.A., Смирнов А Ф., Паткин ЕЛ. Нестабильность чужеродной сателлитной ДНК в клетках эмбриональной тератокарциномы F9. //III-й съезд биохимического общества. Тезисы научных докладов. СПб. - 2002,- С. 277-278.

3. Баранова Т.В , Сучкова И О., Кустова М.Е., Кислякова Т.В., Сломинская H.A., Смирнов А.Ф., Баранов А.С, Паткин Е.Л. Формирование неогетерохроматииа чужеродной сателлитной ДНК и его поведение в клетках эмбриональной тератокарциномы F9 // Цитология. Тезисы XIV Всероссийского совещания «Структура и функции клеточного ядра» г.С-Петербург. - 2002.- С. 860.

4. Сломинская Н.А., Ильина Н С. Богуш Е.Д, Семенычсна А.В, Сучоква И О., Паткин ЕЛ. Получение и цшогенетическнй анализ клонов клеток мышиной эмбриональной тсратокарциномы F9, трансфсктных по чужеродной сателлнтной ДНК // Цитология. Тезисы 1-го съезда Общества клеточной биологии. Т.45, №9. -2003,- С. 927.

5. Patkin Е., Baranova Т., Kisljakova Т., Slominskaja N., Suchkova I. Modeling оГ hetcrochromatin formation and its instability in transformed F9 cells // Annales de Genetique. - 2003.- V.46, № 2-3. - P. 213.

6. Сломинская H. А., Семенычева А. В., Сучкова И. О., Забежинский М. А., Паткин Е. Л. Образование опухоли молочной железы у мышей, трансгенных по сателлитной ДНК // Медицинская Генетика. Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» - 2003.-Т.2, №10 -С.440

7. Сломинская Н.А., Богуш Е.А., Ильина Н.С., Семёнычева А.В., Сучкова И.О., Паткин ЕЛ. Молекулярно-цитогснетический анализ траиссателлитного клона клеток мышиной эмбриональной тератокрациномы F9 // Научно-практическая конференция молодых ученых «Вчеш майбутнього» Тезисы докладов. Одесса.- 1 2003,- С.7.

8. Suchkova I.O., Baranova T.V., Kustova М.Е., Kisljakova T.V., Vassiliev V.B, Slominskaja N.A., Alenina N V., Patkin E.L. Bovine satellite DNA induces heterochromatinization of host chromosomal DNA in cells of transsatellite mouse embryonal teratocarcinoma // Цитология.-2004 -T 46, № 1.- С 53-61.

9. Сучкова И.О., Сломинская Н.А., Кустова М.Е., Баранова Т.В., Голубков В.И., Сорокин А.В., Васильев В.Б., Паткин Е.Л. Анализ нестабильности повторяющихся единиц чужеродной центромерной сателлитной ДНК у трансгенных мышей и в трансфертных клетках // Генетика,- 2004,- Т.4. №8.-С. 1-11.

10. Сломинская Н.А., Сучкова И.О.,Клинская Т.А.Забежинский М А. Паткин Е.Л. Возникновение опухоли молочной железы у траснгенных по бычьей сателлитной ДНК мышей // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. Материалы конференции. С-Петербург,- 2005.- С. 412-414.

11. Slominskaja N. Suchkova 1 Klinskaya T.Zabezhinsky M.Bader M.Patkin E. Phenotypic effects of foreign satellite DNA integration in mouse line // Chromosome Research Abstracts of 5-th Cytogenctical Conference. Madrid. - 2005.- P. 100.

t

Подписано в печать 20 И) 1)5 Формат 60x84/16 Бумага офсетная Печать офсетная. Уел печ л. 1,4. Тираж 100 эк! Закгп№66

Типография Издательства СПбГУ 199061, С-Петербург, Средний пр . 41.

*

т

î

г

Р20 1 1 7

PI 1Б Русский фонд

2006-4 18090