Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биологические аспекты взаимодействия ДНК и ядерного ламина D.melanogaster

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологические аспекты взаимодействия ДНК и ядерного ламина D.melanogaster"

РГ8 ОН 12 СЕН 1398

На правах рукописи УДК 577.2

БОГАЧЕВ Сергей Станиславович

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДНК И ЯДЕРНОГО ЛАМИНА О. те1апода81ег

Клеточная биология - 03.00.25

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск, 1998

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирск.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Дымшиц Г.М.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

доктор биологических наук, Мертвецов Н.П.

Институт биоорганической химии СО РАН, г.Новосибирск

доктор биологических наук, Назаренко С.А.

НИИ медицинской генетики РАМН г.Томск

Ведущее учреждение: Институт биологии развития

Н.К.Кольцова РАН, г.Москва

Защита состоится ' ' ° 4993 г. На

_заседании диссертационного совета по защите на

соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат диссертации разослан ■ (( • е-АС^ Г-* дЛ^ 1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

А. Д. Груздев

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что настоящая работа была проделана на дрозофиле, ее результаты выходят за пределы объекта исследования и могут быть рассмотрены в ракурсе общебиологических вопросов. В современной клеточной биологии существуют несколько проблем общего характера, понимание основополагающих моментов которых позволит моделировать в системе in vitro функциональную жизнеспособную объемную структуру, такую как клеточное ядро. В первую очередь это проблема внутренней организации структурных компонентов (ДНК, РНК, белков) ядра, их сопряженность с основными процессами ядерного метаболизма, а также их связь с событиями, протекающими при реконструкции ядра.

Выявление структур ДНК, РНК и белков, необходимых для поддержания функциональной внутренней архитектоники ядра, определяющей нормальную работу репликативной машины и механизмов синтеза и транспорта РНК, а также выявление компонентов, необходимых для корректной реконструкции ядерной оболочки, позволит в перспективе создать набор искусственных хромосом, самоорганизующихся в функциональное жизнеспособное ядро.

Проблема взаимодействия структурных компонентов ядра развивается как в направлении изучения взаимодействия хроматина и ядерной оболочки, так и в направлении анализа специфических комплексов между ДНК и белками ядерного матрикса. В последнее время была выделена так называемая M/SAR ДНК, обладающая следующими характеристиками: эта ДНК выделяется как составная часть ядерного матрикса, относится к А+Т- богатой ДНК, содержит "АД "Т„"- и "АТАТТТ- боксы. Специфические M/SAR последовательности располагаются в основании транскрипционных петель и являются участками, формирующими транскрипционно активную пространственную архитектуру хроматина. M/SAR ДНК описана для подавляющего большинства исследуемых организмов. Недавно была обнаружена фракция внутриядерного ламина и показано, что M/SAR ДНК

взаимодействует с ним в условиях in vitro. Эти два факта позволяют полагать, что контакт ДНК и ламина является важным не только для ориентации хромосом относительно ядерной оболочки, но и может быть необходимым фактором формирования функциональной топологии транскрипционных доменов внутриядерного хроматина. Участие M/SAR ДНК и ламина не только в креплении хромосом к ядерной оболочке, но и в пространственной организации ядерного скелета указывает на сложность взаимоотношений компонентов ядерного матрикса, их многофункциональность. Важная роль кариоскелета как в координации различных биохимических систем ядра, так и в определении пространственной упорядоченности в ядре, подчеркивает необходимость накопления данных, вскрывающих законы его функционирования.

Общеизвестно, что ДНК интерфазных хромосом имеет сложную пространственную организацию в объеме клеточного ядра. Можно выделить два уровня пространственной упорядоченности интерфазного хроматина. Во-первых, это ориентация хромосом относительно поверхности ядра и, следовательно, определение их положения внутри клетки. Этот уровень определяется взаимодействием хроматина и ядерной периферии. Во-вторых, это трехмерная организация внутриядерного хроматина, которая заключается в установлении независимых транскрипционных доменов и в создании регулируемого доступа к информации, хранящейся в ядерной ДНК. Экстрахромосомальный кариоскелет в значительной степени состоит из белков ядерного матрикса. За счет него создается и поддерживается форма ядра, а элементы хроматина организуются таким образом, что доступность ДНК становится оптимальной.

Взаимодействие кариоскелета и хроматина осуществляется за счет специфических районов на хромосомах. На цитологическом уровне ДНК интерфазных хромосом взаимодействует с двумя морфологическими структурами, определяемыми в ядре: ядерной оболочкой и внутренним ядерным матриксом [Luderus et al„ 1992]. В

состав ядерной оболочки входит образующий филаменты мажорный белок, называемый ламином, белки порового комплекса и некоторые другие протеины. Компонентный состав внутреннего кариоскелета практически неизвестен, за исключением Topo II и нескольких недавно описанных белков ядерного матрикса [Schaten et al., 1985; van Driel et al., 1991]. Последние работы [Luderus et al., 1992; Boy de la Tour, Laemmli, 1988; Mirkovitch et al., 1984; Rattner, 1992; Saitoh, Laemmli, 1994] четко определили линию в изучении M/SAR ДНК в ракурсе ее взаимодействия с белками внутреннего ядерного матрикса. Последовательности M/SAR ДНК, взаимодействующие с внутренним кариоскелетом, достаточно полно охарактеризованы на молекулярном уровне [см. обзор van Driel et al., 1992]. Установлено, что ядерный матрикс в комплексе с ДНК определяет петельную конформацию хроматина, обеспечивая транскрипционную активность соответствующих участков ДНК. Кроме того, в недавних работах было показано, что M/SAR ДНК играет значительную роль в формировании пространственной структуры метафазной хромосомы [Saitoh, Laemmli, 1994]. По вопросу

взаимодействия ДНК хромосом и ядерной оболочки также существует серия работ, в которых на цитологическом уровне определены районы контакта хромосом и ядерной периферии на примере политенных хромосом D. melanogaster [Hochstrasser et al., 1986; Hochstrasser, Sedat, 1987a, b; Paddy et al., 1990]. В этих работах указывается на то, что основным сайтом хромосом, ассоциированным с ламиной, является хромоцентр, содержащий повторяющиеся структуры а- и ß-гетерохроматина. Хромоцентр инвариантно контактирует с оболочкой в ядрах клеток слюнных желез, средней и задней кишки. Согласно последним данным, сателлитные последовательности а-гетерохроматина вовлечены в формирование кинетохорной пластинки. Одной из функций повторов ß-гетерохроматина является их участие в процессе трехмерной организации интерфазных хромосом. Следовательно можно полагать, что центромерный район хромосом

дрозофилы участвует и в метафазной, и в интерфазной активности хромосомы. Основываясь на результатах картирования сайтов контакта хромосом и ядерной оболочки дрозофилы, полученных в группе Седата, можно полагать, что расположенная в хромоцентре ДНК обладает своеобразными молекулярными свойствами, так как транспозиция ее на плечо хромосомы приводит к появлению в этом месте нового сайта контакта с ядерной оболочкой [Lifschytz, Harven, 1982]. В этом аспекте центромерный гетерохроматин может представлять собой удобную модель для анализа взаимодействия ДНК и ламины.

Как уже говорилось, одним из основных белковых компонентов ядерной оболочки является ламин, образующий сеть фибрилл, выстилающих внутреннюю поверхность ядерной периферии. До настоящего времени не описана ни одна последовательность ДНК, которая была бы изучена всесторонне на способность взаимодействия с ламином in vivo.

Поиск и анализ периферийных элементов ядерного скелета клеток D. melanogaster, участвующих в формировании пространственной структуры ядра, позволит, во-первых, ответить на вопрос о существовании специфической ДНК, контактирующей с ядерной оболочкой (отлична ли она от других последовательностей, описанных как M/SAR ДНК, взаимодействующих с внутренним белковым каркасом ядра, и какие белки ядерной периферии участвуют в этом контакте). Во-вторых, позволит выяснить характер взаимодействия ДНК и белков периферии и определить молекулярную организацию хроматина, вступающего в это взаимодействие.

Постулирование существования двух типов ДНК, взаимодействующих с внутренним ядерным матриксом и с ядерной оболочкой, ставит несколько проблемных вопросов: 1) Существуют ли специфические ядерные белки, определяющие взаимодействие ДНК и ядерной оболочки, и как они соотносятся с белками внутреннего кариоскелета?

2) Вовлечены ли специфические последовательности ДНК в это взаимодействие, то есть существует ли специфический мотив, обеспечивающий дифференцированное связывание с белками ядерной оболочки и белками кариоскелета?

3) Если такой мотив существует, то имеет ли он отношение к M/SAR ДНК, взаимодействующей с внутренним ядерным матриксом?

Иными словами, существует ли взаимозаменяемость компонентов кариоскелета?

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлся поиск и анализ ДНК, специфичной к периферийным элементам ядерного скелета клеток D. melanogaster, участвующих в формировании пространственной структуры ядра, выделение и характеристика последовательностей ДНК, связанных с ядерным ламином in vivo, а также анализ взаимодействия нуклеиновых кислот и ламина in vivo. Конкретными задачами данного исследования были:

1) Клонирование последовательностей ДНК центромерного гетерохроматина дрозофилы, связанных с ядерной ламиной in vivo.

2) Выявление в структуре клонированной ДНК сегмента, связывающегося с ламином in vitro.

3) Молекулярный и цитогенетический анализ ДНК сегмента, ассоциирующегося с ламином in vitro.

4) Биохимический анализ характера взаимодействия ламина и ДНК in vivo с использованием кросслинкующего агента и без него.

5) Клонирование сегментов ДНК, ассоциированных с ламином in vivo.

6) Контекстный и структурный анализ нуклеотидных последовательностей, ассоциированных с ламином in vivo.

Научно-практическое значение исследования. В результате проделанной работы впервые были выделены и охарактеризованы последовательности повторяющейся ДНК из центромерного района дрозофилы, за счет которых хромоцентр контактирует с ядерной оболочкой. По-видимому, именно эта ДНК определяет пространственную

ориентацию хромосом в объеме ядра и, следовательно, является необходимым фактором существования жизнеспособной архитектоники хроматина. Новым является описание сайта контакта тандемно организованного повтора и ядерной ламины. Характер ассоциации тандема и ламины позволяет говорить о возможном механизме движения хроматина по ламиновым филаментам.

Впервые выделены и охарактеризованы последовательности ДНК, ассоциированные с ламином in vivo. Показано, что все изученные ДНК относятся к структурам ядерного матрикса, что говорит об их потенциальном участии в организации скелета ядра.

Выявлен ранее неизвестный факт, что связь ламина и некоторых последовательностей ДНК /л vivo сохраняется в условиях жесткого лизиса и денатурации, определяемых биохимически для ковалентного взаимодействия. Установлено, что ламин ассоциирован с НК разного типа. Во-первых, это комплексы ламин-РНК, во-вторых, это ассоциаты ламина с молекулами ДНК, различные по степени устойчивости к условиям жесткого лизиса и денатурации.

В теоретическом плане была сформулирована гипотеза "плавающей центромеры", построена модель компактизации и выявлены формообразующие принципы при конденсации митотической хромосомы. Кроме того, на основании полученных результатов был разработан подход к конструированию искусственной хромосомы D. melanogaster.

Научная новизна исследования. Впервые выделена и изучена ДНК центромерного гетерохроматина D. melanogaster, способная к ассоциации с ядерной оболочкой. До выполнения этой работы не было информации о молекулярных особенностях этой ДНК, характера ее связи с ламином и ее цитогенетической локализации.

Впервые описаны последовательности ДНК, ассоциированные с ламином in vivo. Установлен новый факт существования связи между молекулами ДНК и ламином, различной по степени устойчивости к

жесткому лизису и денатурации. Впервые выявлено, что ламин ¡n vivo контактирует как с ДНК, так и с РНК-молекулами, при этом как А+Т-, так и G+C-богатые области НК вовлечены в зону контакта.

Развито представление о функциональной организации центромерного локуса хромосом D. melanogaster.

Впервые предложен возможный механизм обратимой укладки хроматина в митотическую хромосому.

Сформулирован принципиальный подход к созданию искусственной хромосомы дрозофилы.

Впервые выдвинуто предположение, что в ядре существует система посредников (ламины-M/SAR ДНК) между двумя компонентами кариоскелета (ядерным матриксом и ламиной), за счет которых осуществляются структурные преобразования в ядре.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международном симпозиуме "Трансмиссия хромосом и митоз", Ленинград, 1990; VII Всесоюзном совещании "Структура и функции хромосом", Пущино, 1991; Keystone Simposia "The nuclear matrix: involvement in replication, transcription, gene splicing and cellular regulation", 1994; Twentieth EMBO Annual Symposium "Genomes and chromosomes", Heidelberg, Germany, 1994; международном симпозиуме "Эволюция жизни на Земле", Томск, 1997; международной конференции "Современные концепции эволюционной генетики", Новосибирск, 1997; Keystone Symposia "Integrating cellular architecture/function and regulation. Architectural and functional dynamics of the nuclear matrix", 1998.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных данных, обсуждения (динамика хроматина) и списка литературы, изложенных на 241 странице машинописного текста. Работа иллюстрирована 2 таблицами, 59 рисунками и приложением. Список литературы включает 299 работ отечественных и зарубежных авторов.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Часть работы была проделана совместно с Шараховым И.В. Без активного вмешательства Якубова Л.А., Кокозы Е.Б., Велша Ф., Ашбурнера М. и Фишера П., а также без стечения некоторых обстоятельств история предлагаемого исследования была бы не возможна. За что я безгранично признателен этим людям. За время осуществления данного проекта большое количество людей так или иначе принимало в нем участие. В этой связи я хочу поблагодарить за помощь в осуществлении настоящей работы Байбородина С.И., Киселеву Е.В., Баричеву Э.М., Копыла С.А., Волкову Е., Шилова А.Г., Филиппову М.А., Борисевича И.В., Строц О.В., Себелеву Т.Е., Лалик Е.Р. и молодых сотрудников лаборатории молекулярной биологии клетки Бойкову Т.В., Лихачеву Е.В., Рогачева В.А. Особо хочется поблагодарить Катохина A.B., Батанина М. и Гетц В. за критические дискуссии по вопросам пространственной организации митотической хромосомы. Данная работа не могла бы быть выполнена без удивительного Пола Фишера и его лаборатории, в которой были получены основные результаты этого проекта. Огромное спасибо я говорю юному голландцу Нико Штурману, в плодотворных дискуссиях с которым родились основные концепции исследования. Я бесконечно благодарен Кикнадзе И.И. Именно она явилась вдохновителем идеи предлагаемого проекта. Не могу не поблагодарить Колесникова H.H., Таранина A.B. и Муллокандова М.Р., которые просто помогали мне "по жизни" в ходе работы над проектом. Очень большую помощь в оформлении печатных трудов мне оказывали Прасолов В.А. и Фадеева А.Н. За что я им также глубоко признателен. И наконец, данная работа поддерживалась следующими грантами и стипендиями: молодежный грант СО АН СССР 1990-1991; приоритетные направления генетики 1993-1998; РФФИ 1993-1998; Fogarty fellowship 1993-1994; грант лаборатории Фишера П.А. (Stony Brook USA) 1994-1995.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НК - нуклеиновые кислоты; M/SAR - последовательности ДНК, выделяемые совместно с ядерным матриксом; CREST - (различные типы коллагенозов - аутоиммунных заболеваний); нг - нанограммы; т.п.н. -тысяч пар нуклеотидов; SDS - додецил сульфат натрия; DTT -деитиотриетол; IAA - йодоацетамид; УФ - ультрафиолет; ТХУ -трихлоруксусная кислота; AT - антитела; IP - иммуноприцепитат; IgG -тяжелые цепи иммуноглобулинов; ям - ядерный матрикс; цгх -центромерный гетерохроматин.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Молекулярно-биологический анализ последовательностей ДНК Drosophila melanogaster, ассоциированных с ядерным ламином. Характер взаимодействия НК и ламина

Предлагаемая работа состоит из двух частей, объединенных общей идеей - анализом взаимодействия нуклеиновых кислот и ламина (ламины) D. melanogaster в условиях in vivo. В первой части работы впервые охарактеризовано взаимодействие ДНК центромерного гетерохроматина и ядерной ламины. Вторая часть работы является пионерской в вопросе анализа взаимодействия нуклеиновых кислот и белка ламина in vivo.

I. Характеристика последовательности ДНК из центромерного гетерохроматина D. melanogaster, связывающейся с ламином in vitro и локализующейся совместно с ядерной ламиной in situ и in vivo

Предлагаемая часть работы в своей исходной сути сводилась к выделению и анализу центромерных последовательностей in vivo, контактирующих с двумя типами антигенов: с CREST-антигенами и

ламином (ламиной). Такой выбор был сделан по следующим причинам: 1) до сих пор у D. melanogaster не известны последовательности ДНК, ассоциированные с белками кинетохора. Первоначально можно было предположить, что человеческие CREST - антитела, описанные как выявляющие кинетохорную пластинку у млекопитающих, имеют иммунологическое родство с антигенами кинетохора дрозофилы; 2) до момента начала работы не были описаны последовательности ДНК из центромерного района D. melanogaster, ответственные за контакт хроматина и ядерной периферии, хотя цитологические данные свидетельствовали о наличии такого контакта.

1.1. Поиск, выделение и первичный молекулярно-биологический анализ ДНК цгх ассоциированной с ламиной

В связи с поставленными задачами были сконструированы две библиотеки. Одна состояла из фрагментов ДНК, контактирующих с CREST-C31 антигеном, который у дрозофилы локализовался в район первичной перетяжки на метафазных хромосомах. Поскольку предполагалось, что ДНК цгх обогащена повторами различных классов, то скрининг библиотеки был проведен на тотальную ДНК дрозофилы. Было получено достаточно большое число позитивных сигналов гибридизующихся фагов. ДНК нескольких из них была выделена и локализована in situ на политенных хромосомах слюнных желез дрозофилы. Оказалось, что ДНК некоторых фагов, а именно Х.13, X 15, Х20, гибридизовалась с хромоцентром политенных хромосом.

Вторая библиотека была сконструирована из фрагментов ДНК, ассоциированных с ламиной. Поскольку нам были интересны сегменты ДНК именно цгх, которые контактируют с ламиной, вторая библиотека была скринирована на уже отобранные центромерные последовательности, выделенные из первой библиотеки. Оказалось, что библиотека, сконструированная из ламина-ассоциированной ДНК, обогащена фрагментами, гомологичными ДНК фага Х20. Фаговый

фрагмент состоял из двух EcoRI ДНК-сегментов размером 1,0 и 7,0 т.п.н. Основной вклад в перекрестную гибгидизацию вносил 7 т.п.н. (Х20р7) фрагмент, который был переклонирован в плазмидный вектор. Первичный молекулярно-биологический анализ ДНК Х20р7 выявил следующие его характеристики. Оказалось, что это сложный повтор, содержащий функционально различающуюся ДНК. Частичный сиквенс свидетельствовал о наличии в составе фрагмента структур, характерных для ДНК, ассоциированной с ламиной, описанной в литературе, мобильного элемента, рибосомальной вставки первого типа. Проведенная in situ гибридизация ДНК этого клона с ядрами слюнных желез и с политенными хромосомами питающих клеток D. melanogaster свидетельствовала о локализации гомологичной Я20р7 ДНК в районах контакта проксимального цгх и ядерной оболочки.

I.2. Я.20р1.4 ДНК-фрагмент, находящийся в составе исходного Х20р7 клона, связывается с ламином D. melanogaster in vitro

Происхождение и результаты проведенного анализа предполагали, что фрагмент ДНК Я20р7 содержит последовательность, специфически связывающуюся с ламином. Была предпринята попытка выделить зону контакта с ламином, используя метод седиментационного анализа. ДНК исходного Х.20р7-фрагмента гидролизовали Hindlll-рестриктазой, метили радиоактивной меткой и добавляли в реакционную смесь к полимеризующемуся ламину. В экспериментах был использован как ламин естественного происхождения, так и ламин, экспрессированный в бактериальной системе. Кроме того, к образцам добавляли конкурентную ДНК Е. coli в различной концентрации. Как показано на рисунке 1, из пяти Hindlll - фрагментов гибридной плазмиды один фрагмент Х20р1.4 проявлял специфичность связывания с ламином Dm0 при концентрации конкурентной ДНК в 200 раз превышающей концентрацию экспериментальной ДНК (рис. 1).

Рис1. А20р1.4 ДНК-фрагмент связывается специфически с очищенным ламином D. melanogaster, выделенным из эмбрионов. Ссдиментационный анализ ДНК-ламинового комплекса Х20р7-фрагмента ДНК, гидролизованного Hindlll. Специфическое связывание демонстрирует >.20р1,4-субфрагмент. Р - осадок после связывания с ламином. S - супернатант после связывания с ламином. В качестве конкурентной использовалась ДНК E.coli (0-1000 нг).

1.3. Я.20р1.4-фрагмент ДНК относится к умеренным повторам генома дрозофилы и представлен Hindlll-EcoRI-рестриктными мономерами длиной 1.4 и 1.6т.п.н.

Используя метод количественной дот-блот гибридизации, была оценена копийность Х20р1,4-фрагмента в геноме Drosophila. Результаты гибридизации свидетельствуют, что приблизительно 120 копий повторяющейся единицы присутствуют в гаплоидном геноме плодовой мушки. По результатам in situ гибридизации основным и преимущественным сайтом гибридизации Х20р1.4 является хромоцентр. Следовательно, описанный фрагмент можно отнести к классу умеренных повторов центромерного гетерохроматина D. melanogaster. Специфическое взаимодействие с ламином свидетельствует в пользу того, что новый центромерный повтор несет четко оформленную функциональную нагрузку. Southern-блот гибридизация, выполненная с суммарной ДНК D. melanogaster, позволила определить структурные единицы (рестриктные мономеры) этого повтора. Результаты гибридизации с 32Р меченным Я20р1.4-фрагментом ДНК выявили две

ДНК Е. coli (нг)

, О , 50 , 250 , 500 , 1000 PSPSPSPSPS

1.4- -

sat

• • «»

матрикса до и после повторной рестрикции. Два мажорных бэнда присутствуют в ДНК, связанной с ядерным матриксом (EHN) и соответствуют 1.4 т.п.н. EcoRI-Hindlll и 2.0 т.п.н. Hindlll-фрагментам, обнаруженным в эксперименте с суммарной ДНК. Интенсивность 1.6 и 2.2 т.п.н. фрагментов, гибридизующихся с Х20р1.4 в случае суммарной ДНК, гидролизованной EcoRI-Hindlll и Hindlll, варьирует от эксперимента к эксперименту. Гибридизационный паттерн EHN матриксной ДНК с повторной рестрикцией и без нее, по-видимому, одинаков. Это могло бы свидетельствовать о том, что все сайты рестрикции доступны для гидролиза ферментами при выделении ДНК ядерного матрикса. Однако следует отметить следующий факт. При выделении матрикса использовались EcoRI и Hindlll совместно, а значит при полной рестрикции только два фрагмента (1.4 и 1.6 т.п.н.) должны появляться, как это обнаруживается в случае с геномной ДНК. По-видимому, часть EcoRI сайтов остается после стабилизации блокированной белками

------ядерного матрикса (ламином?) in vitro, причем характер блокирования

таков, что даже после депротеинизации ДНК протеиназой К (PrK) EcoRI-сайты остаются недоступными для действия рестриктаз (паттерн гибридизации повторного гидролиза принципиально не отличается от исходной матриксной ДНК).

Набор гибридизующихся бэндов для второго типа матриксной ДНК (НРХ) полностью изменяется после повторной рестрикции с тем же самым набором рестриктаз. После этой повторной рестрикции только фрагменты длиной 300, 600 п.н. гибридизуются с Х20р1.4. В случае НРХ ДНК без повторной рестрикции отмечается набор гибридизующихся фрагментов, характерных для тандемной организации (лестница) повтора. Как было показано в дополнительных экспериментах, основной рестриктазой, дающей характерный для тандемной организации паттерн, является Haelll. Картина гибридизации соответствует тандемной организации повторов на отрезке хромосомы до 6-8 т.п.н. Интересно отметить, что характерная для тандемной организации "лестница"

отражает факт не сплошного блокирования всех НаеШ-сайтов в зоне тандема белками ядерного матрикса. Это свидетельствует о динамическом взаимодействии белков ядерного матрикса и мономеров тандемного повтора.

1.6. Картирование зоны связывания с ламином в структуре А.20р1.4 ДНК-фрагмента

Для выяснения области контакта с ламином были сконструированы несколько делеционных производных Я20р1.4 ДНК-фрагмента (далее делеции) и проведен седиментационный анализ этих делеций в сравнении с исходным Х20р1.4. Полученные результаты говорят о том, что район связывания с ламином картируется между 300 и 1000 нуклеотидами ¿20р1.4 ДНК-фрагмента. Этот район включает четыре тандемных повтора и незначительное количество добавочной А+Т-богатой ДНК. Более точно картирование было проведено с помощью ЕхоШ-протекции. В результате экспериментов было обнаружено, что все защищенные сайты локализуются между 350 и 905 нуклеотидами. Можно отметить, что 7 из 9 АТАТТТ-боксов локализуются в зоне критической для связывания, причем часть из них физически контактирует с ламином. Этот факт подчеркивает необходимость АТАТТТ-боксов для ДНК-ламин взаимодействия и согласуется с данными, где была показана важная роль этой ДНК для специфичности связывания с белками ядерного матрикса [для ссылок см. Богачев и др., 1996].

1.7. In situ локализация \20p1.4 ДНК-фрагмента на политенных хромосомах D. melanogaster

Гибридизация с политенными хромосомами ДНК клона Х20р1.4 выявила два места гибридизации: хромоцентр и район 49CD на правом плече хромосомы 2. Это первое указание, что MAR/SAR-структуры локализованы не совместно с геном, а в центромерном

гетерохроматине хромосом дрозофилы.

1.8. Цитогенетический анализ сайтов, контактирующих с ламиной ядерной оболочки на препаратах целых лолитенных ядер и на препаратах политенных хромосом лсовдопитающих клеток линии otu11 D. melanogaster.

На основании проведенного молекулярного анализа можно было предположить, что геномные последовательности, гомологичные А.20р1.4, так или иначе связаны с ламином в ядре. Для выяснения этого вопроса были проведены два независимых анализа, которые однозначно свидетельствовали о наличии специфических локусов, содержащих изучаемую последовательность и контактирующих с ламином ядерной оболочки в политенных ядрах слюнных желез линии Oregon R и псевдопитающих клеток линии otu 11 D. melanogaster.

Рис.2. Двойная совместная локализация Х20р1.4-фрагмента ДНК и ламина на лолитенных ядрах слюнных желез личинок 3 возраста D. melanogaster. Графическое изображение совмещенных имиджей. Четкий бэнд в средине изображения представляет собой район 49CD, сигнал похожий на треугольник, локализуется в хромоцентре.

1.8.1. Конфокальный анализ совместной ¡п вИи локализации Х20р1.4 и ламина на препаратах политенных ядер О. те1апода$1ег

Недавленые фиксированные препараты политенных ядер гибридизовали с ДНК Х20р1.4, меченой биотином, и обрабатывали моноклональными антителами против ламина. После этого, места

гибридизации и локализация ламина визуализировали обработкой вторыми соответствующими антителами [Baricheva et al., 1996]. Как и ожидалось, в каждом из проанализированных ядер выявлялось два места гибридизации. Один сайт, по форме напоминающий треугольник, соответствовал хромоцентру, и второй," в форме четкого бэнда, представлял район 49CD. Было проанализировано более 100 ядер. Полученные данные свидетельствовали о том, что хромоцентральный локус всегда располагается в непосредственной близости к ядерной периферии, тогда как бэнд 49 района занимает положение внутри ядра. Проведенный далее анализ оптических срезов трех индивидуальных ядер подтвердил локализацию двух гибридизационных сигналов. Кроме этого, в результате наложения двух изображений (сигналов гибридизации и локализации ламина) было показано, что сигнал, располагающийся в хромоцентре, перекрывается с сигналом периферийного ламина. На основании этих данных можно полагать, что последовательности, гомологичные Х,20р1.4, расположены в хромоцентре и ассоциированы с периферийным ламином in situ. При этом район 49 CD с ламином не перекрывается. В связи с этим была проведена серия in situ гибридизаций, направленных на выяснение вопроса присутствует ли сайт возможного связывания ламина в районе 49 CD. Для этих целей были использованы: делеция клона >.20р1.4 - D5, которая не содержит сайта связывания ламина, и делеция >.20p1.4D17(2), в которой присутствует полноразмерный сайт связывания ламина Drosophila. Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что обе делеции гибридизуются как с хромоцентром, так и с 49CD районом второй хромосомы. Исходя из имеющихся данных можно полагать, что для взаимодействия с ламином важна не только последовательность Я20р1.4, но какие-то другие факторы. Возможно, это несколько копий повтора, их тандемная или иная организация, физическая длина отрезка ДНК, содержащего Х20р1.4-повтор. Также важным в креплении к ламине могут быть фланкирующие район контакта

последовательности, конформация района крепления или же белковые факторы (рис. 2).

1.8.2. Локализация локусов хромосом, инвариантно контастирующих с ядерной оболочкой в политенных ядрах трофоцитов otu11 линии D. melanogaster

Первоначально были проведены эксперименты по картированию локусов, контактирующих с ламиной. Были использованы недавленые препараты политенных ядер. Оказалось, что все хромосомы, за исключением четвертой, независимо ассоциированы с ядерной оболочкой, причем сайты связывания расположены следующим образом: 2R, 3R и X имеют контакт с ламиной, 2L и 3L не имеют контакта. На всех проанализированных ядрах (30) только центромерные локусы имели контакт с ламиной. Очень редко наблюдалась связь с ламиной теломер и некоторых районов интеркалярного гетерохроматина. Результаты анализа ядер различного диаметра свидетельствовали о том, что наличие контакта не зависит от степени политении.

В результате проведенной in situ гибридизации оказалось, что \20p1.4 локализуется только в центромерном районе хромосом otu11, причем в сайтах, картированных как находящихся в контакте с ламиной.

Таким образом политенные хромосомы otu11, как и политенные хромосомы слюнных желез, содержат сайты связывания с ламиной. Как показали результаты исследования, сайты хромосом, связанных с ламиной, относятся к проксимальному центромерному гетерохроматину. В этих локусах в подавляющем большинстве случаев находятся

последовательности, гомологичные ламин-специфическому NIAR\SAR-клону Х20р1.4. Возможно, что не все области контакта определяются наличием ДНК, гомологичных Х20р1.4 (как это следует из результатов гибридизации с 41 районом 2R). Тем не менее, по-видимому, именно с участием этой последовательности

или определяемой ею структуры хроматина в конкретных локусах формируются устойчивые контакты хромосом и ядерной оболочки, и тем самым создается и поддерживается упорядоченная пространственная организация генетического материала.

ОБОЛОЧКА

хроматин

- ЮО кЬ -

Рис.3. Схема организации локуса цгх, контактирующего с ядерной ламиной.

1.9. Молекулярная организация покусов центромерного гетерохроматина хромосом дрозофилы, контактирующих с ядерной ламиной

Методом пульс-фореза в агарозном геле был определен набор БШ-фрагментов, содержащих весь пул ДНК, гомологичной Х20р1,4. Оказалось, что все 120 копий фрагмента содержатся в четырех фрагментах размером 35, 100, 130 и около 350 т.п.н. Результаты совместной гибридизации с сателлитом 1,686 свидетельствуют о соседстве этих двух повторов в фрагменте 350 т.п.н. Сопоставление данных предлагаемого раздела работы предполагает следующую организацию ДНК района контакта с ламиной. Около 120 копий \20p1.4 фрагмента ДНК располагаются в четырех локусах генома размером 350, 130, 100 и 35 т.п.н. Повтор может быть организован в локусах как тандемно (до 8 копий), так и дисперсно. При этом область тандема ассоциируется с ламиной таким образом, что разные по очереди

повторы в разных ядрах физически контактируют с белком. Это говорит о динамичном характере контакта элементов локуса и ламины. Возможно, что именно этот тип взаимодействия был отмечен в работе [Hochstrasser, Sedat, 1987а] (рис. 3). ■

I!. Взаимодействие ламина и нуклеиновых кислот D. melanogaster in vivo. Характеристика последовательностей ДНК генома D. melanogaster, связанных с ламином in vivo

Проблема взаимодействия хромосом и ядерной оболочки может быть сведена к вопросу о взаимодействии компонентов ламины и специфических участков ДНК хромосом. В предыдущем разделе был описан подход и охарактеризована специфическая центромерная ДНК последовательность, in vivo контактирующая с ламиной, связывающаяся с очищенным ламином in vitro, а также выявляемая в комплексе с ламиной in situ. Настоящая часть диссертации посвящена анализу взаимодействия ламина и нуклеиновых кислот дрозофилы и разработке подхода, позволившего выделить геномные последовательности D. melanogaster, связанные с ламином Dm in vivo. Совместно с этим мы попытались с различных сторон охарактеризовать выделенные НК-ламиновые комплексы.

Стандартная процедура выделения комплексов ДНК и ламина заключалась в следующем. Культуру клеток дрозофилы выращивали в присутствии бромодезоксиуридина (BrdU) и экспонировали под УФ с длиной волны 366 нм или же не обрабатывали BrdU и не подвергали действию УФ. Клетки лизировали, обрабатывали микрококковой нуклеазой (мкн) или ДНКазой, или РНКазой, в зависимости от проводимых исследований, и ламин иммунопреципитировали специфическими антителами. Фрагменты нуклеиновых кислот, ковалентно сшитые с белками и совместно преципитировавшиеся с ламином в случае обработки BrdU и УФ, далее метились 32Р-уАТФ при помощи Т4 - полинукпеотидкиназы. Фрагменты НК, остающиеся в

ассоциации с ламином после обработки нуклеазами, имели размер 50200 п.н., что не могло значимо повлиять на миграцию комплекса в SDS-ПААГ, поэтому мы использовали этот метод для анализа поведения НК-ламиновых комплексов, содержащих разные типы ламинов.

11.1. Выделение НК-ламиновых комплексов с использованием специфических антител против ламина D. melanogaster

Для выделения НК-ламиновых комплексов и анализа их состава необходимо было разработать процедуру лизиса, введения метки и иммунопреципитации материала ядер на аффинном сорбенте. Такая схема была нами разработана и стандартизирована [Rzepecki et al., 1998].

Здесь мне бы хотелось привести основную схему, по которой проводился анализ НК-ламиновых комплексов. Препараты ядер для проведения УФ - сшивки готовились согласно описанной в работе [Rzepecki et al., 1998] процедуре. Облученные УФ (+) и необлученные УФ (-) ядра лизировали в 10% SDS. Лизированные ядра кипятили 10 мин при 100° С. Следует отметить, что такая обработка является биохимическим тестом на ковалентное взаимодействие молекул. Далее белки ядерного экстракта редуцировали DTT и ацетилировали IAA. От избытка SDS избавлялись добавлением 5 кратного избытка Triton Х-100, после чего реакционную смесь разбавляли подходящим буфером дй концентрации SDS - 0.4 % и Triton Х-100 - 2%. Подготовленный таким образом ядерный лизат обрабатывали необходимыми ферментами (мкн, ДНКазой, РНКазой), и белки осаждали ТХУ. Образцы тщательно отмывали от тритона и растворяли в иммунопреципитационном буфере. Перед этой, процедурой готовился аффинный сорбент, представляющий собой конъюгат белок-А-сефарозы и AT против ламина D. mefanogaster. Комплексы ламина и НК иммунопреципитировали из ядерного лизата сорбцией на аффинном сорбенте в течение ночи и отмывали в соответствующем буфере. В зависимости от использованного фермента

образцы или обрабатывали щелочной фосфатазой с последующим кинированием 5'-концов 32Р АТФ, или же кинирование проводили сразу после отмывки иммунопреципитата. Следует отметить, что ферментативную обработку проводили непосредственно с иммунопреципитатом. Далее образцы лизировали в буфере нанесения и проводили электрофорез, Вестерн блот и радиоавтографию. Стандартная картина, являющаяся результатом этого подхода, приведена на рисунке 4. Хорошо видно, что при приблизительно одинаковом количестве 1Р-ламина образцы с Вг<Л) и УФ-облучением содержат больше метки, что говорит о сшивке ламина и НК. В данном конкретном случае лизированные ядра были обработаны микрококковой нуклеазой. В случае необработанного мкн лизата четкого бэнда ламина не формируется. Это связано с тем, что с ламином остается связанной статистически фрагментированная ДНК или РНК, и меченый материал с различной электроподвижностью образует дисперсное облако. Обе формы интерфазного ламина метятся при указанном подходе. Примечательным является факт, что независимо от включения ВгсШ и УФ обработки часть материала НК остается связанной с ламином после проведенных обработок (рис. 4). Мы решили, что условия лизиса, выбранного нами, достаточно грубы для удаления любых фрагментов НК, ассоциированных с ламином нековалентно. Для исключения нековалентного взаимодействия НК-ламиновый комплекс был дополнительно очищен хроматографией на гидроксилаппатите (ГАП) в присутствии 0.1% БРБ (\л/Л/). Как и ожидалось в случае обработки УФ, интенсивность мечения таким образом очищенного материала очень высокая. Тем не менее материал, содержащий ВгсШ без экспозиции УФ, даже в этом случае детектируемо метился. Нужно отметить, что количество нанесенного ламина приблизительно одинаковое. Природа данного явления непонятна и пока необъяснима. В данном контексте хотелось бы напомнить результаты экспериментов, проведенных в части 1, где мы показали, что ЕсоШ- сайты ДНК, гомологичной ДНК клона

Х20р1.4, остаются блокированные белками ям (ламином) даже после интенсивной депротеинизации РгК. То есть короткий пептид или остаток аминокислоты остается прикрепленным к ДНК Х20р1.4 в месте расположения ЕсоИ1-сайта. При этом НаеШ-сайты, которые также блокированы белками ям (ламином), становятся доступными для повторной ферментативной обработки. Мне кажется, что эти два явления имеют одну природу, объясняемую определенным типом взаимодействия ламина и НК.

II.2. Анализ состава НК в НК-ламиновом комплексе

Проведенные эксперименты свидетельствуют, что как РНК, так и ДНК молекулы находятся в ассоциации с ламином. Результат, представленный в работе свидетельствует о том, что наименьшее включение метки наблюдается после обработки мкн, по сравнению с необработанным комплексом. Как известно, мкн деградирует и РНК, и ДНК-молекулы. Обработка РНКазой А демонстрирует видимое снижение интенсивности мечения, которое, тем не менее, выше, чем для случая обработки ДНКазой. Денситометрический количественный анализ бэндов в аналогичном эксперименте показал, что повторная обработка мкн удаляет более 95%, РНКазой - 40% и ДНКазой I - 70% метки.

Н.З. Нуклеиновые кислоты ассоциированы с иитерфазным, но не с метафазным ламином

Для того, что бы проследить, что происходит со взаимодействием НК и ламина при дезинтеграции ядерной оболочки в процессе митоза, было проанализировано взаимодействие с НК растворимого ламина Оттц в сравнении с нерастворимым интерфазным ламином. Оказалось, что только интерфазный ламин Огт^ и От2 включал метку. Не было обнаружено детектируемого количества метки в случае метафазного ламина.

Рис. 4. Вестерн блот и радиоавтографический анализ того же блота после иммуноприцепитации ламина специфическими AT и мечением на частицах смолы. (1) - Вестерн блот-анализ ядерного лизата со специфическими AT против ламина. (2, 3) - Вестерн блот иммунопреципитата со специфическими AT против ламина. (4, 5) -радиоавтограф тех же самых блотов после мечения на частицах смолы. Лизат обработан микрококковой нуклеазой. Л-ламин; УФ-ультрафиолет.

(1.4. Ламин ассоциирован как с А+Т-, так G+C-богатыми областями ДНК in vivo

Ранее было многократно показано, что ламин Drosophila ассоциирован с А+Т-обогащенной ДНК [Bogachev et al., 1996; Luderus et al., 1992; Luderus eí al., 1994], при этом обе цепи ДНК вовлечены в это взаимодействие. Для оценки состава ДНК, находящейся в комплексе с ламином, клетки обрабатывали двумя антибиотиками, дистамицином и хромомицином. Известно, что дистамицин разрушает связь белков и А+Т-обогащенной ДНК, тогда как хромомицин разрушает связь белков и G+C-обогащенной ДНК [Van Dyke et al., 1982; Van Dyke, Dervan, 1983; Kas, Laemmli, 1992]. Хотя ни один из антибиотиков полностью не препятствовал включению метки, тем не менее оба приводили к значительному уменьшению интенсивности мечения по отношению к иммунореактивному материалу. Для клеток, инкубированных с дистамицином, уменьшение интенсивности мечения составляло 30%, для хромомицина 55%, для клеток, обработанных совместно обоими

антибиотиками, эта цифра составляла 81%. Полученный результат свидетельствует о том, что оба антибиотика воздействуют на взаимодействие ДНК и ламина, и что ламин контактирует как с А+Т- так и с G+C-богатыми районами ДНК in vivo.

Таким образом, интенсивное мечение ламина наблюдается после введения BrdU (BrdC) с последующим облучением клеток УФ. Также ламин метится в том случае, когда клетки не подвергались никакой обработке. Показано, что ламин связывается с ДНК in vitro и in situ. Полученные в настоящем исследовании данные находятся в согласии с результатами ранее проведенных работ, дополняя их тем фактом, что ламин ассоциирован с ДНК in vivo. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о том, что в М-фазе взаимодействие ламина и ДНК не идентифицируется. Мы полагаем, что для такого рода ассоциации необходима полимерная стадия ламина.

Результаты экспериментов по чувствительности комплекса к нуклеазным обработкам свидетельствуют, что как РНК, так и ДНК вовлечены во взаимодействие с ламином. 70% материала чувствительно к ДНКазе, 40% к РНКазе А. Кроме того, устойчивость к mung bean нуклеазе предполагает, что во взаимодействие вовлечены только двуцепочечные участки, тогда как устойчивость к РНКазе Н предполагает отсутствие в зоне ассоциации НК и ламина ДНК-РНК гибридов.

Обнаруженное мечение ламина без каких-либо предварительных обработок клеток свидетельствует в пользу предположения, что связь ламина и ДНК в условиях in vivo обладает определенными особенностями, определяющими сохранение контакта в условиях стандартного жесткого лизиса и денатурации. Кроме того, мечение ламина - процесс, крайне зависящий от фазы клеточного цикла. Митотический ламин Dmmit не метится, тогда как интерфазный (Dmi и Dm2) включает меченый изотоп.

Фотокросслинкирование между ДНК, содержащей Brdll, и белками возможно лишь в том случае, когда две молекулы располагаются друг относительно друга на расстоянии нескольких ангстрем [см. Simpson, 1979]. Следовательно, можно сделать вывод, что ламин тесно контактирует с НК in vivo. Негативный результат (отсутствие метки) для очень большого количества IgG, присутствующих в иммунопреципитате, говорит о специфическом мечении ламина.

В заключении мы хотим предложить модель организации клеточного ядра, которая удобна для объяснения различных процессов ядерного метаболизма.

Ядро содержит, как минимум, три топологически дискретных домена. 1) хроматин; 2) экстрахромосомальный кариоскелет; и 3) нуклеоплазму или диффузный внутриядерный домен..

Хроматин содержит всю ядерную ДНК клетки и, соответственно, всю информацию, закодированную в ней. Хроматин также содержит белки, вовлеченные в поддержание структуры ДНК на разных уровнях упаковки (гистоны, HMG др). Мы постулируем, что первичная функция клеточного ядра - это создание регулируемого доступа к информации, хранящейся в ядерной ДНК.

Экстрахромосомальный кариоскелет в значительной степени состоит из белков. За счет него создается и поддерживается форма ядра, а элементы хроматина организуются таким образом, что доступность ДНК оптимальна.

Растворимый внутриядерный домен содержит те молекулы, которые воздействуют на хроматин. Сюда относятся ДНК полимеразы и ассоциированные с ними факторы репликации, белки, модулирующие структуру хроматина, и все другие растворимые факторы нуклеоплазмы.

Мы полагаем, что эти домены взаимодействуют таким образом, что изменения в одном из них (например, кариоскелете), регулируют функционирование другого (например, хроматина). И, конечно же, физический контакт между белками кариоскелета и нуклеиновыми

кислотами, как показано в настоящем исследовании, с очевидностью предсказывается предлагаемой моделью.

11.5. Клонирование и контекстный анализ последовательностей ДНК, ассоциированных с ламином in vivo

В результате клонирования и анализа структуры фрагментов ДНК, ассоциированных с ядерным ламином в живой клетке, были отобраны 11 неперекрывающихся клонов, отвечающих процедуре клонирования. Длина полученных клонов колебалась от ~50 до 200 п.н. Проведенный анализ показал, что ограниченный набор блоков/боксов перекрывает весь пул анализируемых последовательностей так, что каждый фрагмент содержит от 12 до 18 перекрывающихся или неперекрывающихся блоков из числа (94), обнаруженных во всех клонах вместе, взятых. Блоки/боксы широко варьируют по характеру последовательности, размерам и частоте встречаемости и, вероятно, могут являться общей характеристикой анализируемой группы последовательностей и, возможно, необходимым компонентом связывания с ламином.

Для проверки возможности участия данных блоков в образовании связи с ламином было проведено их сравнение с последовательностями, для которых экспериментально показано взаимодействие с этим белком, а именно, с боксами в составе клона \20p1.4. В результате анализа было выявлено, что несколько коротких, но часто встречающихся блоков, высокогомологичны последним. Следует отметить, что анализируемая ДНК является типичной M/SAR: 59-78% состав AT, присутствие характерных для данного класса ДНК А„-, Тп- боксов, перемежающихся А/С; G/T- гомополимерными последовательностями. Несколько клонов содержат сайт узнавания Topo II.

Таким образом, на основании сравнительного анализа фрагменты ДНК, ассоциированные с ламином in vivo, имеют следующие характеристики:

1) ДНК всех клонов принадлежит к классу M/SAR.

2) При сравнении последовательностей выделен пул гомологичных, блоков до 25 п.н., более половины из которых встречаются в разных вариациях в практически всех клонах и могут быть объеденены в шесть групп с коровыми (консенсусными) последовательностями.

3) Блоки трех из обозначенных выше шести групп гомологичны блокам ДНК, находящимся в ассоциации с ламином.

4) Длинные треки А/Т - нуклеотидов, обнаруживаемые во всех без исключения последовательностях, предполагают, что выделенные фрагменты имеют аномальную, изогнутую структуру, что в конечном итоге может быть наиболее необходимым фактором для формирования связи ДНК и ламина.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что как ДНК, так и РНК молекулы ассоциированы с ядерным ламином (ламиной) D. melanogaster in vivo. Все выделенные и охарактеризованные последовательности, находящиеся в ассоциации с ламином (ламиной) in vivo относятся к классу M/SAR ДНК.

2. Ассоциация ДНК молекул и ламина характеризуется следующими особенностями:

■ как А+Т; так и G+C- участки ДНК вовлечены в ассоциацию с ламином;

■ как двуцепочечные, так и одноцепочечные участки ДНК находятся в непосредственном контакте с молекулой ламина;

в ассоциация ДНК и ламина имеет "арочный" характер;

в ламин ассоциирован с молекулами ДНК двумя "типами" связи: устойчивой и неустойчивой к условиям жесткого лизиса и денатурации;

3. Центромерный гетерохроматин ассоциирован с ламиной участком ДНК, состоящим из специфически связывающихся с ламином повторов, организованных тандемным образом.

4. Центромерный повтор ДНК, ассоциированный с ламиной, кластеризуется в специфических блоках добавочного гетерохроматина. ДНК центромерного гетерохроматина хромосомы 2, ассоциированная с ламиной, расположена справа от функциональной центромеры.

5. Область контакта ДНК центромерного гетерохроматина хромосом и ламины имеет характерные особенности молекулярной организации:

а каждая хромосома содержит по одному району контакта ДНК

центромерного гетерохроматина с ламиной. а район центромерного гетерохроматина, ассоциирующийся с

ламиной простирается на несколько десятков т.п.н. □ зона контакта образована специфическими, связывающимися с ламином умеренными центромерными повторами в количестве до 30 копий.

в в зоне контакта до 10 мономеров повтора организованы тандемно-дисперсным образом.

6. Тандемная организация мономеров в зоне контакта с ламиной позволяет предполагать механизм перемещения хроматина по ламиновым филаментам по типу движения "гусеницы пяденицы".

7. В ядре существует система посредников (ламины-М/вА!? ДНК) между двумя компонентами кариоскелета (ядерным матриксом и ламиной), за счет которых осуществляются структурные преобразования в ядре.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Likhacheva Е., Ovechkina Y., Rzepecki R., Kokoza E., Mozzherin D., Stuurman N., Fisher P.A., Bogachev S. Cloning of D. melanogaster DNA associated in vivo with nuclear lamin //Abstr. Keystone Simposia Mol. Cell Biol. 1998. P. 37.

2. Boikova Т., Kokoza E., Mozzherin D., Sharakhov I., Volkova E., Kopyl S„ Fisher P.A., Bogachev S. Localization of the functional centromere of D. melanogaster chromosome 2 using specific M/SAR centromeric repetitive DNA//Abstr. Keystone Simposia Mol. Cell Biol. 1998. P. 32.

3. Rzepecki R., Bogachev S., Kokoza E., Stuurman N., Fisher P.A. In vivo association of lamins with nucleic acids in Drosophila melanogaster II J.Cell Sei. 1998 V. 8. P. 121-129.

4. Шарахов И.В., Стегний B.H., Богачев C.C., Баричева Э.М., Лапик Е.Р., Фишер П.А. Структура блоков прицентромерного гетерохроматина хромосом 3 и 4 в псевдопитающих клетках яичников линии otu11 D. melanogaster II ДАН. 1997. Т. 353. №2. С. 281-283.

5. Шарахов И.В., Богачев С.С., Фишер П.А. Хромосомная локализация M/SAR ДНК клона Я.20р1.4 в слюнных железах D. melanogaster II Генетика. 1997. Т. 33. №2. С. 277-280.

6. Богачев С.С., Борисевич И.В., Фишер П.А., Штурман Н., Шарахов И.В. ß-Гетерохроматин Drosophila: Молекулярная организация и функционирование. Молекулярно-биологический анализ MAR/SAR последовательности ДНК из центромерного гетерохроматина Drosophila melanogaster II Генетика. 1996. Т. 32. №2. С. 240-251.

7. Baricheva Е., Berrios М„ Bogachev S„ Borisevich I., Lapik E„ Sharakhov I., Stuurman N.. Fisher P.A. DNA from Drosophila melanogaster ß-heterochromatin binds specifically to nuclear lamins in vitro and the nuclear envelope in situ II Gene. 1996. V. 171. P. 171-176.

8. Шарахов И.В., Стегний B.H., Богачев C.C., Баричева Е.М., Лапик Е.Р., Фишер П.А. Хромосомная локализация M/SAR ДНК клона Х20р1Л в

соматических и генеративных тканях Drosophila melanogaster II Цитология. Материалы симпозиума "Структура и функции клеточного ядра", Санкт-Питербург. 1997. Т. 39. №1. С. 119.

9. Шарахов И.В., ГрушкоО.Г., Богачев С.С. Филогенетические отношения в подгруппе Melanogaster рода Drosophila (Sophophora) на основе хромосомной локализации повторяющейся ДНК // Материалы 6 совещания диптерологов, посвященное 100 летию Штакельберга, Санкт-Питербург. 1997.

10. Bogachev S., Baricheva Е., Berrios М., Borisevich I., Fisher P., Sharakhov I., Siuurman N. An MAR/SAR-containing element from Drosiphila (3-yeterochromatin binds specifically to nuclear lamins in vitro and the nuclear envelovlope in situ //J. Cell. Biochem. Suplement21B. 1995. P. 133.

11. Sarakhov I.A., Baricheva E.M., Bogachev S.S., Fisher P.A., Lapik E.R. A specific DNA sequence is located in the loci of proximal p-heterochromatin, which are associated with the nuclear envelope in Drosophila melanogaster // J. Cell. Biochem. Suplement 21B. 1995. P. 131.

12. Шарахов И.В., Богачев С.С., Грушко О.Г., Макаров И.Л. Молекулярные механизмы эволюции пространственной упорядоченности генома II Материалы международного симпозиума "Эволюция жизни на земле", Томск. 1997.

13. Шарахов И.В., Рогачев В.А., Богачев С.С., Грушко О.Г., Фишер ПЛ. Организация последовательностей, гомологичных клону Х20р1.4, в геномах видов подгруппы Melanogaster // Материалы международной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения академика Д.К. Беляева, Новосибирск. 1997. С.400-402.

14. Шарахов И.В., Филиппова М.А., Строц О.В., Борисевич И.В., Богачев С.С., Баричева Э.М., Шилов А.Г. (5-Гетерохроматини Drosophila: Молекулярная организация и функционирование. Характеристика последовательности ДНК из проксимального (3-гетерохроматина, ассоциированного с ядерной оболочкой Drosophila melanogaster II Генетика. 1993. Т. 29. №3. С. 393-402.

15. Байбородин С.И., Баричева Э М„ Богачев С.С., Борисевич И.В., Строц О.В., Филиппова М.А., Шарахов И.В., Шилов А.Г. ß-Гетерохроматини Drosophila: Молекулярная организация и функционирование. Клонирование и молекулярно-биологический анализ Я20 фрагмента ДНК из ß-гетерохроматина Drosophila melanogaster II Генетика. 1993. Т. 29. №3. С. 403-416.

16. Baiborodin S.I., Baricheva Е.М., Bogachev S.S., Borisevlch I.V., Strotz O.V., Filippova M.A., Sharakhov I.A., Shilov A.6. A moleqular and cytogenetic analysis of X20p7 fragment DNA from the proximal ß-heterochromatin of Drosophila melanogaster II Gene. 1993. V. 134. P. 175-181.

17. Bogachev S.S., BarichSVa E.M., Berrios M„ Borisevich I.V., Fisher P.A., Sharakhov I.V., Stuurman N. An MAR/SAR-cmtaining element from Drosophila ß-heterochromatin bind specifically to nuclear lamin In vitro and the nuclear envelope in situ II Abstr. 12 EMBO annual simposium "Genomes and chromosomes", European moleqular biology laboratory, Heidelberg, Germany. 1994. P. 50.

18. Baiborodin S., Bogachev S., Chubykin V., Semenov M., Shilov A. Immunocytologycal characteristics CREST-reacted proteins of D. melanogaster II Материалы международного симпозиума "Трансмиссия хромосом и митоз", Ленинград. 1990.

19. Байбородин С.И., Баричева Э.М., Богачев С.С., Борисевич И.В. Человеческие аутоиммунные CREST-антитела реагируют с антигенами прицентромерного гетерохроматина хромосом D. melanogaster. II Материалы VII Всесоюзного совещания "Структура и функции хромосом", Пущино. 1991.

20. Батанин М.А., Богачев С.С., Катохин A.B. Молекулярная организация центромерного района хромосом высших эукариот (обзор) II Изв. Сиб. Отд. РАН. 1992. Вып.З. №4. С. 3-15.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Богачев, Сергей Станиславович, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи УДК 577.2 /

»У?

/

; V

< , V-

¿/ / ? I /

БОГАЧКВ

Сергей Станиславович (

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

ДНК И ЯДЕРНОГО ЛАМИНА О. meIanogaster

Клеточная биология - 03.00.25

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск, 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 6 Глава I. Обзор литературы. Организация эукариотического ядерного хроматина в

клеточном цикле 15

1.1. Структурно-функциональная организация митотической хромосомы 17

1.1.1. Модели трехмерной организации митотической хромосомы 17

1.1.2. Основные морфологические и функциональные домены митотической хромосомы 28

1.1.2.1. Хромосомный "бэндинг" и структура хроматина 29

1.1.2.2. Поверхностный домен 34

1.1.2.3. Теломерный домен. Функции теломеры 40

1.1.2.4. Центромерный домен 44

1.1.2.5. Митотическая хромосома. Формообразующие принципы 61

1.2. Пространственная и структурно-функциональная организация интерфазного хроматина 66 1.2.1. Пространственная компартментализация биохимических процессов, протекающих в клетке 66

1.2.2.1. Ядерный матрикс (скэффолд). Основные характеристики 67

1.2.2.2. MAR/SAR ДНК 68

1.2.2.3. Функции MAR/SAR 69

1.2.2.4. Структурные белки ядерного матрикса 70

1.2.3.1. Ламин и его свойства 79

1.2.3.2. Внутренний ядерный ламин 84

1.2.3.3. Функция ламина в реконструкции ядра 4 86

1.2.3.4. Ламин и репликация 89

1.2.3.5. ДНК-ламин взаимодействие. Уровни и возможные механизмы 91

Глава II. Материалы и методы 99

Глава III. Собственные данные. Молекулярно-биологический анализ последовательностей ДНК Ого$орЫ1а melanogaster, ассоциированных с ядерным ламином. Характер взаимодействия НК и ламина 102

III.1. Характеристика последовательности ДНК из центромерного гетерохроматина D. melanogaster, связывающейся с ламином in vitro и локализующейся совместно с ядерной ламиной in situ и in vivo 102

III. 1.1. Клонирование последовательностей ДНК D. melanogaster, ассоциированных с CREST-антигенами 102

III. 1.1.1. Человеческие CREST-антитела реагируют с ядерными белками D. melanogaster 104

III. 1.1.2. Электронно-микроскопическая локализация белков, реагирующих с CREST-антисыворотками на митотических хромосомах D. melanogaster 106

III. 1.1.3. Клонирование ДНК, ассоциированной с CREST C-31-специфическими белками D. melanogaster 109

IIL1.1.4. In situ гибридизация клонированных ДНК с политенными хромосомами D. melanogaster 109

III. 1.2. Последовательности ДНК D. melanogaster, ассоциированные с ядерной ламиной 111

III. 1.2.1. Клонирование ДНК, ассоциированной с ядерной ламиной 112

III. 1.3.1. Молекулярный анализ А,20р7-клонированного фрагмента ДНК 113

III. 1.3.2. Анализ нуклеотидной последовательности клона DmO.9 116

III. 1.3.3. Анализ нуклеотидной последовательности клона Dm270 117

III. 1.3.4. In situ гибридизация А20р7-фрагмента ДНК с препаратами ядер и хромосом питающих клеток D. melanogaster 118

III. 1.4.1. Ä,20pl.4 ДНК фрагмент, находящийся в составе исходного А,20р7 клона, связывается с ламином D. melanogaster in vitro 124

III.l .4.2. л20р1.4-фрагмент ДНК относится к умеренным повторам генома дрозофилы и представлен HindIII - EcoRI-рестриктами длиной 1.4 и 1.6 т.п.о. 128

III. 1.4.3. Анализ нуклеотидной последовательности Х20р 1,4-фрагмента ДНК 131

III.1.4.4. А20р1.4 ДНК-фрагмент выделяется вместе с ДНК ядерного матрикса D. melanogaster 13 6

III. 1.4.5. Картирование зоны связывания с ламином в структуре А,20р1.4 ДНК-фрагмента 141

III. 1.4.6. 600 п.н. А,20р1.4 фрагмента включающих 4 тандемных повтора, взаимодействует с ламином in vitro 141

III.l.4.7. In situ локализация 120p 1.4 ДНК-фрагмента на политенных хромосомах D.

melanogaster 150

III.1.5. Цитогенетический анализ сайтов, контактирующих с ламиной ядерной оболочки на препаратах целых политенных ядер и на препаратах политенных хромосом псевдопитающих клеток линии otul 1 D. melanogaster. Цитогенетический анализ центромерного гетерохроматина, содержащего ламин-ассоциированную ДНК 150

III. 1.5.1. Конфокальный анализ совместной in situ локализации Â20pl.4 и ламина на препаратах политенных ядер D. melanogaster 150

III. 1.5.2. Локализация локусов хромосом, инвариантно контактирующих с ядерной оболочкой, в политенных ядрах трофоцитов otul 1 линии D. melanogaster 154

III. 1.6. Цитогенетическое и комбинированное картирование некоторых районов центромерного гетерохроматина D. melanogaster 158

III. 1.6.1. Картирование блоков центромерного гетерохроматина политенных хромосом otul 1 с использованием специфических ДНК-проб 158

III. 1.6.2. Картирование функциональной центромеры хромосомы 2 D. melanogaster 161 III. 1.7. Молекулярная организация локусов центромерного гетерохроматина хромосом дрозофилы, контактирующих с ядерной ламиной 171

Заключение по 1 части 171

III.2. Взаимодействие ламина и нуклеиновых кислот D. melanogaster in vivo. Характеристика

последовательностей ДНК генома D. melanogaster, связанных с

ламином in vivo 173

111.2.1. In vivo введение BrdU в геномную ДНК Кс-культуры клеток D. melanogaster 175

111.2.2. In vivo УФ-ковалентное кросслинкирование ДНК культуры клеток Кс-

D. melanogaster, меченых BrdU 179

111.2.3. Выделение НК-ламиновых комплексов с использованием специфических антител против ламина D. melanogaster 179

111.2.4. Анализ состава НК в НК-ламиновом комплексе 185

111.2.5. Ламин Dmo, экспрессированный в бактериальной системе, который первоначально был денатурирован, не связывается специфически с ДНК в ходе иммунопреципитации 187

111.2.6. Нуклеиновые кислоты ассоциированы с интерфазным, но не с метафазным ламином 187

111.2.7. Ламин ассоциирован как с А+Т -, так и G+C - богатыми областями ДНК

invivo 189

111.2.8. Клонирование последовательностей ДНК, in vivo ассоциированных с ламином Dm 193

111.2.9. Контекстный анализ последовательностей ДНК, ассоциированных с ламином invivo 194 Заключение по 2 части 196 Глава IV. Динамика хроматина (точка зрения) 197 Выводы 205 PS 207 Список литературы 208 Приложения 230

ГЛАВА I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Несмотря на то, что настоящая работа была проделана на дрозофиле, ее результаты выходят за пределы объекта исследования и могут быть рассмотрены в ракурсе общебиологических вопросов. В современной клеточной биологии существуют несколько проблем общего характера, понимание основополагающих моментов которых позволит моделировать в системе in vitro функциональную жизнеспособную объемную структуру, такую, как, клеточное ядро. В первую очередь, это проблема внутренней организации структурных компонентов (ДНК, РНК, белков) ядра, их сопряженность с основными процессами ядерного метаболизма, а также их связь с событиями, протекающими при реконструкции ядра.

Выявление структур ДНК, РНК и белков, необходимых для поддержания функциональной внутренней архитектоники ядра, определяющей нормальную работу репликативной машины и механизмов синтеза и транспорта РНК, а также выявление компонентов, необходимых для корректной реконструкции ядерной оболочки, позволит в перспективе создать набор искусственных хромосом, самоорганизующихся в функциональное жизнеспособное ядро.

Проблема взаимодействия структурных компонентов ядра развивается как в направлении изучения взаимодействия хроматина и ядерной оболочки, так и в направлении анализа специфических комплексов между ДНК и белками ядерного матрикса. В последнее время была выделена, так называемая, M/S AR ДНК, обладающая следующими характеристиками: эта ДНК выделяется как составная часть ядерного матрикса, относится к А+Т богатой ДНК, содержит "Ап", "Тп" и "АТАТТТ" боксы. Специфические M/S AR-последовательности располагаются в основании транскрипционных петель и являются участками, формирующими транскрипционно активную пространственную архитектуру хроматина. M/S AR ДНК описана для подавляющего большинства исследуемых организмов. Недавно была обнаружена фракция внутриядерного ламина и показано, что M/SAR ДНК взаимодействует с ним в условиях in vitro. Эти два факта позволяют полагать, что контакт ДНК и ламина является важным не только для ориентации хромосом относительно ядерной оболочки, но и может быть необходимым фактором формирования функциональной топологии транскрипционных доменов внутриядерного хроматина. Участие M/S AR ДНК и ламина не только в креплении хромосом к ядерной оболочке, но и в

пространственной организации ядерного скелета, указывает на сложность взаимоотношений компонентов ядерного матрикса, их многофункциональность. Важная роль кариоскелета как в координации различных биохимических систем ядра, так и в определении пространственной упорядоченности в ядре, подчеркивает необходимость накопления данных, вскрывающих законы его функционирования.

Общеизвестно, что ДНК интерфазных хромосом имеет сложную пространственную организацию в объеме клеточного ядра. Можно выделить два уровня пространственной упорядоченности интерфазного хроматина. Во-первых, это ориентация хромосом относительно поверхности ядра и, следовательно, определение их положения внутри клетки. Этот уровень определяется взаимодействием хроматина и ядерной периферии. Во-вторых, это трехмерная организация внутриядерного хроматина, которая заключается в установлении независимых транскрипционных доменов и в создании регулируемого доступа к информации, хранящейся в ядерной ДНК. Экстрахромосомальный кариоскелет в значительной степени состоит из белков ядерного матрикса. За счет него создается и поддерживается форма ядра, а элементы хроматина организуются таким образом, что доступность ДНК становится оптимальной.

Взаимодействие кариоскелета и хроматина осуществляется за счет специфических районов на хромосомах. На цитологическом уровне ДНК интерфазных хромосом взаимодействует с двумя морфологическими структурами, определяемыми в ядре: ядерной

оболочкой и внутренним ядерным матриксом [Luderus et al., 1992]. В состав ядерной оболочки входит образующий филаменты мажорный белок, называемый ламином, белки порового комплекса и некоторые другие протеины. Компонентный состав внутреннего кариоскелета практически неизвестен, за исключением Topo II и нескольких недавно описанных белков ядерного матрикса [Schaten et al., 1985; van Driel et al., 1991]. Последние "■■/ работы [Luderus et al., 1992; Boy de la Tour and Laemmli, 1988; Mirkovitch et al., 1984; Rattner, 1992; Saitoh and Laemmli, 1994] четко определили линию в изучении M/SAR ДНК в ракурсе ее взаимодействия с белками внутреннего ядерного матрикса. Последовательности M/SAR ДНК, взаимодействующие с внутренним кариоскелетом, достаточно полно охарактеризованы на молекулярном уровне [см. обзор van Driel et al., 1992]. Установлено, что ядерный матрикс в комплексе с ДНК определяет петельную конформацию хроматина, обеспечивая транскрипционную активность соответствующих участков ДНК. Кроме того, в недавних работах было показано, что M/SAR ДНК играет значительную роль в

формировании пространственной структуры метафазной хромосомы [Saitoh and Laemmli, 1994].

По вопросу взаимодействия ДНК хромосом и ядерной оболочки также существует серия работ, в которых на цитологическом уровне определены районы контакта хромосом и ядерной периферии на примере политенных хромосом D. melanogaster [Hochstrasser et al., 1986; Hochstrasser and Sedat, 1987a,b; Paddy et al., 1990]. В этих работах указывается на то, что основным сайтом хромосом, ассоциированным с ламиной, является хромоцентр, содержащий повторяющиеся структуры а- и р- гетерохроматина. Хромоцентр инвариантно

контактирует с оболочкой в ядрах клеток слюнных желез, средней и задней кишке.4

Согласно последним данным, сателлитные последовательности а - гетерохроматина вовлечены в формирование кинетохорной пластинки. Одной из функций повторов ß -гетерохроматина является их участие в процессе трехмерной организации интерфазных хромосом. Следовательно можно полагать, что центромерный район хромосом дрозофилы участвует и в метафазной, и в интерфазной активности хромосомы. Основываясь на результатах картирования сайтов контакта хромосом и ядерной оболочки дрозофилы, полученных в группе Седата, можно полагать, что расположенная в хромоцентре ДНК обладает своеобразными молекулярными свойствами, так как транспозиция ее на плечо хромосомы приводит к появлению в этом месте нового сайта контакта с ядерной оболочкой [Lifschytz and Harven, 1982]. В этом аспекте центромерный гетерохроматин может представлять собой удобную модель для анализа взаимодействия ДНК и ламины.

Как уже говорилось, одним из основных белковых компонентов ядерной оболочки является ламин, образующий сеть фибрилл, выстилающих внутреннюю поверхность ядерной периферии. До настоящего времени не описана ни одна последовательность ДНК, которая была бы изучена всесторонне на способность взаимодействия с ламином in vivo.

Поиск и анализ периферийных элементов ядерного скелета клеток D. melanogaster, участвующих в формировании пространственной структуры ядра, позволит, во-первых, ответить на вопрос о существовании специфической ДНК, контактирующей с ядерной оболочкой (отлична ли она от других последовательностей, описанных как M/SAR ДНК, взаимодействующих с внутренним белковым каркасом ядра, и какие белки ядерной периферии участвуют в этом контакте). Во-вторых, позволит выяснить характер взаимодействия ДНК и белков периферии, и определить молекулярную организацию хроматина, вступающего в это взаимодействие.

и

Постулирование существования двух типов ДНК, взаимодействующих с внутренним ядерным матриксом и с ядерной оболочкой, ставит несколько проблемных вопросов:

1) Существуют ли специфические ядерные белки, определяющие взаимодействие ДНК и ядерной оболочки, и как они соотносятся с белками внутреннего кариоскелета?

2) Вовлечены ли специфические последовательности ДНК в это взаимодействие, то есть, существует ли специфический мотив, обеспечивающий дифференцированное связывание с белками ядерной оболочки и белками кариоскелета?

3) Если такой мотив существует, то имеет ли он отношение к M/SAR ДНК, взаимодействующей с внутренним ядерным матриксом? Иными словами существует ли взаимозаменяемость компонентов кариоскелета?

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлся поиск и анализ ДНК, специфичной к периферийным элементам ядерного скелета клеток D. melanogaster, участвующих в формировании пространственной структуры ядра, выделение и характеристика последовательностей ДНК, связанных с ядерным ламином in vivo, а также анализ взаимодействия нуклеиновых кислот и ламина in vivo.

Конкретными задачами данного исследования были:

1) Клонирование последовательностей ДНК центромерного гетерохроматина дрозофилы, связанных с ядерной ламиной in vivo.

2) Выявление в структуре клонированной ДНК-сегмента, связывающегося с ламином in vitro.

3) Молекулярный и цитогенетический анализ ДНК-сегмента, ассоциирующегося с ламином in vitro.

4) Биохимический анализ характера взаимодействия ламина и НК in vivo с использованием кросслинкующего агента и без него.

5) Клонирование сегментов ДНК, ассоциированных с ламином in vivo.

6) Контекстный и структурный анализ нуклеотидных последовательностей, ассоциированных с ламином in vivo.

Научно-практическое значение исследования.

В результате проделанной работы впервые были выделены и охарактеризованы последовательности повторяющейся ДНК из центромерного района дрозофилы, за счет которой хромоцентр контактирует с ядерной оболочкой. По-видимому, именно эта ДНК

определяет пространственную ориентацию хромосом в объеме ядра и, следовательно, является необходимым фактором существования жизнеспособной архитектоники хроматина. Новым является описание сайта контакта тандемно организованного повтора и ядерной ламины. Характер ассоциации тандема и ламины позволяет говорить о возможном механизме движения хроматина по ламиновым филаментам.

Впервые выделены и охарактеризованы последовательности ДНК, ассоциированные с ламином т vivo. Показано, что все изученные ДНК относятся к структурам ядерного матрикса, что говорит об их потенциальном участии в организации скелета ядра.

Выявлен ранее неизвестный факт, что связь ламина и некоторых последовательностей ДНК in vivo сохраняется в условиях жесткого лизиса и денатурации, определяемых биохимически для ковалентного взаимодействия. Установлено, что ламин ассоциирован с НК разного типа. Во-первых, это комплексы ламин -РНК, во-вторых, это ассоциаты ламина с молекулами ДНК, различные по степени устойчивости к условиям жесткого лизиса и денатурации.

В теоретическом плане была сформулирована гипотеза "плавающей центромеры", построена модель компактизации и выявлены формообразующие принципы конденсации митотической хромосомы. Кроме того, на основании полученных результатов, был разработан подход к конструированию искусственной хромосомы D. melanogaster.

Научная новизна исследования

Впервые выделена и изучена ДНК центромерного гетерохроматина D. melanogaster, способная к ассоциации с ядерной оболочкой. До выполнения этой работы не было информации о молекулярных особенностях этой ДНК, характера ее связи с ламином и ее цитогенетической локализации.

Впервые описаны последовательности ДНК, ассоциированные с ламином in vivo.

Установлен новый факт существования связи между молекулами ДНК и