Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-цитогенетический анализ районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке у DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-цитогенетический анализ районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке у DROSOPHILA MELANOGASTER"

На правах рукописи УДК 575.224:595.773.4

ШАРАХОВ ИГОРЬ ВАЛЕНТИНОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РАЙОНОВ ПРИКРЕПЛЕНИЯ ХРОМОСОМ К ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКЕ У 01Ю50РН1и МЕУШО(ЗА5ТЕ1?

03.00.15 - генетика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск - 1995

Работа выполнена в НИИ биологии и биофизики Томского государственного университета, г. Томск

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор В.Н.Стегний, НИИ биологии и биофизики Томского государственного университета, г. Томск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор И.Ф. Жимулев, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук Л.В.Высоцкая,

Новосибирский государственнный университет, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт биологии развития

им. Н.К.Кольцова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится ¿е/ 1995 г.

на п заседании диссертационного совета Д-002.11.01

по а^щите"диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференцзале Института по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " " Ф € £/)£/<-Я 199 /т.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д.Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение интерфазных ядер выявило пространственную упорядоченость расположения хромосом. Бакную роль в фиксации трехмерной структуры ядра отводят прикреплениям хромосом к ядерной оболочке и эктопическим связям (Куличков, Еимулёв, 1976; Стегний, 1979, 1987,а,б, 1993; Shilov, Zhimulev, 1986; Глазков, 1988, а, б; Paddy et al., 1990; Жимулев, 1992). Выяснилось, что хромосом* контактируют с периферией посредством специфических гетерохроматиновых локусов (Стегний, 1979, 1987а; Shilov, Zhimulev, 1986; Hochstrasser, Sedat, 1987,а,б; Стегний, Шарахова, 1991; Жимулев, 1993). Одни прикрепления являются об-лигатныии и очень прочными, другие - высокочастотными и слабкми (Груздев, Кикнадзе, 1970; Quick, 1980; Hochstrasser et al., 1986). Реорганизация архитектоники ядер, происходящая в ходе онто- и филогенеза, была впервые обнаружена у малярийных комаров (Стегний, 1979, 1987,а,б). Исследования ядер соматических тканей у дрозофилы выявили тканевую специфику во взаимоотношениях менду хромоцентрсм. и периферией (Hochstrasser, Sedat, 1987, а). При анализе ядер генеративной ткани у дрозофил были обнаружены ткане- и видсспецифичные особенности взаиморасположения политенных хромосом (Стегний, Вассерлауф 1991,а,б, 199-1). Отсутствие локального хромоцентра (Стегний, Вассерлауф, 1991,а) и политенизация блоков прицентромерного гетерохроиатина (Mal'ceva, Zhimulev, 1993; Mal'ceva et al., 1995) в псевдопита-ющих клетках яичников D.melanog-aster позволяют использовать генеративную ткань в качестве удобной модели для изучения прикреплений политенных хромосом к ядерной оболочке: Очень вероятно, что реорганизация хромосомно-ламинных контактов, приводящая к изменении архитектоники ядра, может иметь отношение к механизмам тканевой дифференцировки и видообразования (Стегний, 1993). В связи с этим интересно выяснить, что происходит в месте i контакта хромосомы и ядерной оболочки на молекулярном уровне. Одни авторы считают, что белки, участвующие в компактизации ДНК гетерохроматина (Will, Bautz, 1980; Janes, Elgin, 1986; James et al., 1989), имеют сродство к компонентам мембран и, таким образом, обеспечивают прикрепление к ним хромосом (Жимулев, 1993). Другие полагают, что хромосомы прикрепляются за счет

спаривания тандемных повторов ДНК гетерохроматина в полимерной ламинной сети ядерной оболочки (Hochstrasser, Sedat, 1987,6; Hochstrasser et al., 1988). Поэтому наиболее актуальной является проблема существования в контактирующих с оболочкой хромосомных локусах специфических белков или последовательностей ДНК, непосредственно связывающихся с периферией ядра.

Дели и задачи исследования. Настоящая работа преследовала две цели: 1)получение и молекулярно-цитогенетический анализ ДНК из участков прикреплений хромосом к ядерной ламине; 2) выявление тканеспецифичных особенностей контактирования политенных хромосом с ядерной оболочкой в генеративной ткани у D.melano-gaster. Были поставлены следующие конкретные задачи.

1. Выделить и клонировать ДНК, ассоциированную с фракцией ядерных ламин.

2. Провести Сауэерн-дот-блот анализ ламинной ДНК.

3. Определить нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов и выявить мотивы, способные связываться in vitro с ламином.

4. Оценить хромосомную локализацию ламинных клонов относительно районов, контактирующих с ядерной периферией.

5. Оценить локализацию ламинной ДНК относительно добавочных блоков прицентромерного гетерохроматина в генеративной ткани и выявить особенности в их молекулярной организации.

6. Изучить локализацию и морфологию районов облигатного прикрепления политенных хромосом к ядерной оболочке в псевдопитающих клетках яичников линии ctu11.

Научная новизна. В настоящей работе впервые клонирована и охарактеризована специфическая ДНК, ассоциированная с ядерной ламиной D.melanogaster. Впервые продемонстрировано, что новая умеренноповторяющаяся M/SAR (matrix/scaffold associated regions) -последовательность, специфически связывающаяся с ламином in vitro, представлена в геноме двумя различающимися по длине популяциями HindiII-EcoRI-фрагментов, локализуется преимущественно в хромоцентре и контактирует с ядерной оболочкой. Впервые показаны различия в молекулярной организации между добавочными блоками прицентромерного гетерохроматина в псевдопитающих клетках яичников линии otu11. Впервые выявлены тканеспецифичные особенности контактирования политенных хромосом с ядерной оболочкой в генеративной ткани.

Практическая ценность. Результаты работы имеют важное вна-чение для дальнейшего исследования механизмов пространственной упорядоченности хромосом и её реорганизации в ходе онто- и филогенеза. Получение фрагмента ДНК, специфически связывающегося с ядерной ламиной, позволит использовать его для Р-трансформации в геном D.melanogaster. Это даст возможность создавать новые прикрепления хромосом к оболочке и тем самым моделировать реорганизацию ядерной архитектоники.

Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены стендовым сообщением на VII Всесоюзном совещании "Структура и функции хромосом", Пущино, 1991; устным докладом и тезисами на 1-й Всесоюзной конференции по генетике насекомых, Москва, 1991; стендовым сообщением на VI съезде Общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова, Минск, 1992; устным докладом и тезисами на Региональной научно-практической конференции, Томск, 1994; стендовым сообщением и тезисами на 1-м съезде ВОГИС, Саратов, 1994; тезисами на конференции "The Nuclear Matrix: Involvement in Replication, Transcription, Gene Splicing and Cellular Regulation" (Keystone Symposia on Molecular & Cellular Biology), Hilton Head Island, South Carolina, 1995.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи 2 кратких сообщения и 5 тезисов. 4 статьи находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение собственных экспериментальных данных, обсуждение результатов исследования, выводы и список литературы. Работа изложена на 120 страницах, включая 2 таблицы и 30 рисунков.

В обзоре литературы представлены данные о контактировании хромосом с ядерной оболочкой у различных групп организмов. Рассмотрены такие вопросы как частота, прочность, локусоспеци-]?ичность хромосомно-мембранных контактов. Описаны ткане- и ви-¡оспецифичные аспекты прикреплений. Показана роль гетерохрома-•ина в прикреплении хромосом к периферии ядра. Проанализированы овременные данные о молекулярном составе участков контакта ромосом с ядерной оболочкой.

Автор выражает искреннюю благодарность соавторам статей по >ме диссертации.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Линии дрозофил. Использованные линии мух (Kobel, Breugel, 1968; Жимулев и др., 1974; Zhimulev et al., 1976; King et al., 1978; Mal'ceva, Zhimulev, 1993) любезно предоставлены И.Ф.Жиму-левым, Н.И.Мальцевой и Р.К.Кингом.

Выделение и клонирование ламинной ДНК. Ядерные ламины выделяли из культуры клеток Кс D.melanogaster (Krachmarov et al., 1986, a). Не связанную с фракцией ламин ДНК переваривали ДНКа-зой I и удаляли центрифугированием в 2М NaCl. Защищенная ДНК была выделена из растворенных в SDS и обработанных протеиназой К ядерных ламин и клонирована в фаговом векторе XNM1149. Скрининг библиотеки и субклонирование в плазмиды проводили, используя стандартные методы (Маниатис и др.,1984).

Саузерн-дот-бдот гибридизация. Процедуры выполняли согласно руководствам (Маниатис и др., 1984; Kafatos, 1979; Glover, 1986) совместно с С.С.Богачевым.

Секвенирование и футпринтинг ДНК. Последовательное?! X20Dm0,9 определяли по методу Максама и Гилберта (1972) в модификации (Мазин и др., 1990). Секвенирование Х20р1,4 по метод; Сенжера (1977) и Ехо-Ш протекция ДНК ламином по методу Берге ра и Кимюеля (1989) были проведены С.С.Богачевым.

Гибридизация in situ. Препараты политенных хромосом слюн ных желез и псевдопитающих клеток дрозофил, а также гибридизацию с меченной ДНК делали стандартно (Gall, Perdue, 1971) coi местно с Э.М.Баричевой и Е.Р.Лалик.

Для лучшего выявления дисковой структуры политенные хром сомы окрашивали лактоацетоорсеином. Районы включений метки о ределяли согласно фотокартам политенных хромосом (Lefevr 1976; Mal'ceva et al., 1995).

Цитологические методы. Цдра псевдопитающих клеток яичнш изучали у 7-ми дневных гомозиготных самок линии otu11 D.mela gaster. Фиксированные яичники окрашивали лактоацетоорсеином накрывали покровным стеклом в капле 45% уксусной кислоты, раздавливая. Всего было детально проанализировано 250 ядер 40 самок линии otu11. Прикрепления хромрсом к ядерной оболе наблюдали в световой микроскоп Laboval 4. Для создания объе! го изображения использовали стереонасадку.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клонирование ДНК, ассоциированной с фракцией ядерных ла-мин. Из библиотеки ламинной ДНК нами был выделен А20р7 Есо-RI-фрагмент размером около 7,8 т.п.н. и клонирован в pUC18. Два находящихся в его составе соседствующих фрагмента были .субкло-нированы в плазмидных векторах : A20Dm0,9 - в pUC18, X20pl,4 -в Bluescript (Рис. 1).

„ EcoR I

EcoRI . X20Dm0,9 X20pl,4 I EcoR 1

-1, - , f— ■ - =1-—и-

pUCls pucis

Hind HI Hind III Hind III Hind III

'-1 X 20p7

1 kb

Рис. 1. Схема относительного расположения субклонированных фрагментов ДНК в клоне Х20р7.

Для подтверждения специфичности ламинной ДНК был использован метод выделения M/SAR-последовательностей (Luclerus et al., 1992). Из 0-3 часовых эмбрионов D.melanogaster С.С.Богачевым были выделены ядерные матриксы с использованием растворов с низкой ионной силой, детергента дииодсалицилата лития и двух наборов рестриктаз. Первый набор содержал EcoRI, HindiII и Ndel; второй - НаеШ, Pstl и Xbal. Как оказалось, в ядерных матриксах, обработанных двумя разными наборами рестриктаз, содержатся последовательности, гомологичные А20р1,4. Таким образом, нами впервые клонирована специфическая ДНК, ассоциированная с ядерным матриксом D-melanogaster.

Анализ нуклеотидной последовательности. 8 • HindJII-Bgll-фрагменте клона-X20DmO,9 содержатся 21 и 30 -п.н. d(GT/CA), 12 п.н. d(AT/TA). ССАА, TGGCA, GCCGCC - участки узнавания ядерных факторов (Каландадзе и др., 1989), пять инвертированных повторов. Открытых рамок считывания не обнаружено СРис. 2).

51acgggcaagc agcagtgctt ttgatcccgt tagttctaga tcgcga*act cgacgaggac 3'tgcccgttcg tcgtcacgaa aactagggca atcaagatct agcgct*tga gctgctcctg

120

5'gtcgcgatta CGCgtgtgta tgtgtgtgtg CgCtîCATGT taatxtcaac gtcgtcgaga 31cagcgctaat GCGcacacat acacacacac gccaagtaca attaaagttg cagcagctct

180

5'gcgtcgccac cacgc^gtat gtgtgaatat gtgtgtgtgt gtgtgtccAT gccgattcca 3'cgcagcggtg gtgcgtcata cacacttata cacacacaca cacacaGGTA cggctaaggt

240

5'tcatcgggtg caacagagtt caggcgcggg ggacgaggtt atgtcggcat ggcggctcgt 3'agtagc'ccac gttctctcaa gtccgcgccc cctgctccaa tacagccgta ccgccgagca

NFI

300

5'gatcaa!EA!I!A TATATATAcg cgttggcact tgtcgatgcg cctaccgggc gggcctc... з'ctagttATAT ATATATATgc gcaaccgtga acagctacgc ggatggcccg_cccggag...

NFI Spl

Рис. 2. Нуклеотидная последовательность Hindi II-Bgl¡-фрагмента клона A20Dm0,9. Стрелками обозначены инвертированные повторы. Выделены АТ-бокс и d(gt/ca).

Как известно, GT/CA-последовательности способны претерпевать конформационный переход из В- в Z-ДНК (Вашакидзе и др., 1990). В результате этого происходит плавление соседней ДНК и образование шпилечных структур (Dickinson et al, 1992). Кроме того, Z-ДНК способна связываться in vitro с мажорным белком ядерного матрикса ДНК-топоизомеразой II (Mattern et al., 1984). Поли-d(AT/TA), вероятно, способны изгибать молекулу ДНК (Widom, 1984), что может обеспечивать формирование петельных структур (локализация в основании петель) характерных для ламинной ДНК (Глазков, 1988,6). Интересно, что в ДНК, выделенной из культуры клеток р815 (Hancock, Hughes, 1982), а также клеток печени мыши (М.В.Глазков, личное сообщение) тоже обнаружили инвертированные повторы, поли-d(АТ/ТА) и участки узнавания ядерных факторов.

\20pl,4 фрагмент длиной 1327 н.п. не содержит открытых рамок считывания. А/Т-пары составляют 62,6%. Между 595 и 919 н.п. тандемно расположены 4 повторяющиеся последовательности (Рис.

3). Каждый повтор содержит АТАТТТ/С-бокс и последовательность, гомологичную консенсусу для связывания топоизомеразы II (Рис.

4). В последовательности встречаются поли(ёТ)*поли(с1А)-тракты.

EcoRI EcoRI

Nrul

Avail

BamHI Hlndlll

I,

Bipl

Bspl Bspl

I_I

0.25 kb

var. con.». X20pl,4

Biiv4MiJ REPEAT

Рис. 3. Рестриктная карта клона A20pl,4. Показано относительное расположение четырех тандемно повторяющихся последовательностей (REPEAT). Каждый повтор состоит из вариабельного (var.) и константного (const.) участков.

Для определения сайтов связывания с ламином был проведен ExolII-футпринтинг. Оказалось, что физически контактируют с ламином АТАТТТ/С-боксы, последовательности, гомологичные консенсусу ДНК-топоизомеразы II, константной части всех четырех тан-демных повторов, поли(dT)-тракты и А/Т-богатые районы вариабельной части трех тандемных повторов, а также АТ-богатые участки из зоны между 340 и 595 н.п. Причем с ламином способны связываться обе цепи ДНК. Кроме того, было обнаружено, что связывание с ламином индуцирует значительные изменения во вторичной структуре специфических сайтов \20р1,4, которые исчезают при увеличении количества ламина. По-видимому, ламин может взаимодействовать как непосредственно с последовательностями каждой цепи, так и со вторичной структурой А20р1,4, стабилизируя шпильки в этих позициях. С этой точки зрения объяснимо присутствие GT/CA-последовательностей в структуре клона \20Dm0,9, прилегающего к А20р1,4 (см. Рис. 1, 2). Как уже отмечалось, эти

простые повторы плавят ДНК и, тем самым, способствуют формированию шпилек. Взаимодействующая с лачином часть последовательности Х20р1,4 содержит М/БАЯ-элементы: поли(с1А)*поли(с!Т)-трак-ты, АТАТТТ-Оокси и сайты узнавания топоизомеразы II (Оаззег, ЬаешшИ, 1986; ВоиПказ, 1993) Последовательность клона Х20р1,4 является новой, так как не было выявлено значительной гомологии с ДНК других известных М/ЗАИ-фрагментов.

REPEAT 1 845-920 bp TTTGAATGTAAAGACATTTTTTTTATGT-----GTGATCC

REPEAT 2 766-844 bp TGA-ATGATGTTAACTTTTTATGTATATCATAAGTGATC С

REPEAT 3 682-765 bp TGAACTAGATTTATTTGTTTTGCTTATT'fATGTATGGTCC

REPEAT 4 595-681 bp TTACTGATTTATTGTTTAATTTCTTTCAATGTTGTGGTCC

REPEAT 1 REPEAT 2 REPEAT 3 REPEAT 4

cggtgccctttcagcgattgat cggtgccctttcagcgattgat cggtgtccat-cagcgattgatp

CGGTGCCTTTTCAGCGATTGATGTACACATATTCGGP

5tgcacasattcggtcr.c stgcacatattcggtckc

;tacacatatttggccrt fee

***** *

* ************* ******** ** **

REPEAT X REPEAT 2 REPEAT 3 REPEAT 4

agcac AACAT

Рис. 4. Нуклеотидная последовательность тандемных повторов клона Х20р1,4 (REPEAT 1-4). Основания, консервативные во всех четырех сегментах, отмечены звездочкой. АТАТТТ/С-боксы выделены жирным шрифтом. Фрагменты, гомологичные консенсусной последовательности для связывания с ДНК-топоизомеразой II, обведены рамкой. Подчеркнуты АТ-богатые участки, содержаще поли(с!Т)-тракты. Последовательность любезно предоставлена С.С.Богачевым.

Саузерн-дот-блот анализ. Для определения копийности ДНК клона Х20р1,4 в геноме дрозофилы был проведен количественный дот-анализ. Как показали расчеты, приблизительно 120 копий повторяющейся единицы присутствуют в гаплоидном геноме D.melano-gaster. Блот-гибридизация клона Х20р1,4 с суммарной ДНК выявила две повторяющиеся единицы размерами 2,0 и 2,2 т.и.н. (HindI-II-рестрикция) или 1,4 и 1,6 т.п.н. (HindiII+EcoRI-рестрикция). Повидимому, 2,0 и 2,2 мономеры содержат EcoRI-сайты, расположенные на одинаковом удалении от одного из концов фрагментов. При этом оставшийся 0,6 т.п.н. Hindi II-EcoRI-фрагмент не имеет

гомологии с Л20р1,4 (Pro. 5). Таким образом, в геномэ дрозофилы присутствуют две гомологичные Х20р1,4 популяции умеренных Hindi II-EcoRI-повторов различной длины.

Н--.<!!11 0.6 kb EccRI 1.6 kb Hinrflll

Рис. 5. Рестриктная карта Hir.dll 1-мономерсв генома дрозофилы. Прямоугольником выделены участки, гомологичные А20р1,4. Цифрами указаны размеры рестрккционных фрагментов в т.п.н.

Хромосомная локализация ДНК клона Л20р1,4. Способная связываться с ламином последовательность была локализована з хро-моцентре и районе 49Б хромосомы 2 О.ше1апоэаз1ег (Рис. 6). Детальный аланиз выявил В!;лючение метки в прицентромерных районах 20СВ Х-хромосоны, 40ЕР плеча 2Ь, 41АВ плеча проксимальной части района и 81 хромосомы 3 и районе 101 хромосомы 4. Таким образом, преимущественным местом локализации клонированной ла-минной ДНК дрозофилы является хромоцентр.

зв д

я ,

„г ° f'^ *

Ь 4MB I 2R 2L Ч •

Рис. 6. Гибридизация in situ меченной биотином ДНК клона А20р1,4 с политенными хромосомами слюнных желез личинок линии Oregon R D.melanogaster.

Как относятся эти локусы к ядерной оболочке? Хромоцентр всегда контактирует с ядерной периферией в слюнных железах, очень часто - в средней кишке, редко - в задней кишке, но не контактирует - в проторакзльных железах (Hochstrasser, Sedat, 1987, а). Центромерная ДНК связана с ламиной в интерфазных ядрах эмбрионов (Paddy et al., 1990). В отличие от хромоцентра район 49D не является контактным локусом (Hochstrasser, Sedat, 1987, б). Как объяснить различную внутриядерную локализацию двух локусов, если они оба содержат гомологичную функционально важную ДНК? Вероятно, в районе 49D содержится очень мало копий А20р1,4 для того, чтобы обеспечить контактирование с ламиной. С другой стороны, известно, что топоизомераза II является мажер-ным компонентом внутреннего ядерного матрикса и, возможно, играет в нем структурную роль (Berrios et al., 1985; Fisher, 1989). Поэтому внутриядерную локализацию 49D можно объяснить также специфическим взаимодействием с топоизомеразой II консен-сусной последовательности А20р1,4. При этом не понятно, почему один из локусов (хромоцентр) "выбрал" для связи периферический ядерный матрикс, а другой (49D) - внутренний. Тем не менее, этот выбор происходит в процессе дифференцировки тканей. Так, хромоцентр, по-видимому, связан с внутренним матриксом в ядрах проторакальных желез дрозофилы (Hochtrasser, Sedat, 1987, а). Кроме того, клон A20Dm0,9 был локализован только в хромоцентре. Возможно, соседство последовательностей, гомологичных A20Dm0,9 и А20р1,4, определяет способность хромоцентра, в отличие от района 49D, связываться с ламиной. Таким образом, различное отношение к ядерной оболочке районов, содержащих последовательности, гомологичные А20р1,4, может говорить о том, что наличие специфической'ламин-связывающейся ДНК является необходимым, но не достаточным условием прикрепления данного локуса к периферии ядра. Возможно, нужны специфические белки или соседство определенных последовательностей для обеспечения взаимодействия между ДНК и ламином in vivo.

Особенности молекулярной организации блоков прицентромер-ного гетерохроматина. При помощи гибридизации in situ клонов Dml2 (Kholodilov et al., 1988) и A20pl,4 с хромосомами псевдо-питающах клеток яичников линии otu11 нам удалось показать различия в молекулярной организации между блоками прицентромерного

гетерохроматина хромосомы 3, которые политенивированы в данной ткани (Ма1*сеуа, гМти1еу, 1993). Согласно полученным данным только дистальный блок района 80 содержит ДНК, гомологичную Е)т12. Но ни один из них не содержит ДНК, гомологичную А20р1,4. Добавочный блок района 81 гибридизуется с обоими клоками. При этом 0ш12 локализуется только в проксимальной части этого блока (Рис. 7). Таким образом, отдельные части реплицирующегося в генеративной ткани гетерохроматина содержат различные умеренные повторы ДНК, что, вероятно, отражается на тс участии в пространственной фиксации хромосом.

Рис. 7. Различия в молекулярной организации между добавочными блоками прицентромерного гетерохроматина хромоссмы 3 в псевдопитзющих клетках яичников линии о^11 П.те1апогазЬег. Отрезками показана локализация ДНК, гомологичной клонам &п12 и А20р1,4. Скобками обозначены три добавочных блока. Стрелкой показан участок, контактирующий с ядерной оболочкой.

Тканеспецифичвость прикреплений хромосом к ядерной оболочке в генеративной ткани. Ядра псевдопитзящих клеток яичников мутантной линии ойи11 оказались крайне удобной моделью для анализа- прикреплений хромосом к ядерной оболочке. Это связано с тем, что в генеративной ткани в отличие от соматических не наблюдается объединения прицентромерных районов в локальный хромо-центр (Таблица). Анализ ядер слюнных желез не позволяет выявить самостоятельное прикрепление к периферии каждой хромосомы. Поэтому нельзя исключить такой вариант, когда с оболочкой контактирует прицэнтромерный район только одной хромосомы, а прицент-рсмерные районы других хромосом оказываются лить притянутыми к

11

периферии ядра ва счет объединения в хромоцентр. Изучение псев-допитающих клеток показало, что именно каждая хромосома контактирует с ядерной оболочкой прицентромерным локусом.

Таблица. Тканеспецифичная организация хромоцентра О.те1апо&аз1ег

Тип клеток Структура хромоцентра Локализация хромоцентра относительно ядерной оболочки Литературный источник

Слюнные железы Локальный плотный Всегда присоединен к ядерной оболочке Ма^о^ е1 а1, 1984

Проторакаль-ные железы Локальный рыхлый С оболочкой не контактирует, расположен в глубине ядра НосЬзЬгаБэег е1 а1, 1987,а

Средняя кишка Обычно состоит из двух частей Каждая часть обычно, но не всегда находится на оболочке там ке

Задняя кишка Локальный, но прицентро-мерный район одного из плеч выпадает Редко контактирует с перифериен там же

Псевдопита-ищие клетки яичников Рассредоточенный, при-центромерные районы 3 и 4 хромосом соединены. Прицентромзрные районы всех хромосом всегда самостоятельно прикрепляются к разобщенным участкам ядерной оболочки Э'пагакЬоу е1 а1., 1995; Шарахов и др. в печати

Основываясь на данных по хромосомной локализации ДНК А20р1,4 и анализе недавленных ядер псевдопитающих клеток яичников можно предложить схему архитектоники ядер генеративной ткани (Рис. 8).

К-хромосома изгибается в слабой точке, которая представлена хромонемами, контактирующими с ядерной оболочкой. При зтом лишь некоторые участки хромонемы взаимодействуют с ламиной. Асинаптированные, как правило, гомологи в районе, расположенном проксимальнее слабой точки, связываются с ядерной оболочкой, а также с ядрышком на значительном расстоянии друг от друга. Оно может более, чем вдвое превышать ширину Х-хромосомы в других

12

рейонех. Ядрьшгяэ в псеэдопитнощия клетках ванимавг огносителвио больший объем ядра, чем з клетках слюнных желез.

Рис. 8. Схема взаиморасположения и облигатного прикрепления к ядерной оболочке прицентрсмерных районов вторичных поли-тенных хромосом в псевдопитающих клетках линии оЫ11 О.пе1апо-^аэЬег. Болыпими стрелками обозначены облигатно ассоциированные с ядерной ламиной специфические гетерохроматиновые локусы, содержащие последовательности, гомологичные ДНК Л20р1,4. Маленькими стрелками показаны контакт дистальной части прицентромер-ного района плеча 2К! с оболочкой и связь Х-хромосомы о ядрышком. N - ядрышко (изображено относительно уменьшенным).

Хромосома 2 прикрепляется к ядерной оболочке толстыми длинными фибриллами, составляющими проксимальную часть прицент-ромерного района плеча 2R, и тонкими короткими фибриллами, отходящими от его дистальной части. Постоянная связь с периферией прицентроыерного района плеча 2L не зарегистриравана.

Поскольку 3 и 4 хромосомы соединены в прицентромерной области, их контакты с ламиной пространственно сближены. При этом добавочные блоки прицентромерного гетерохроматина плеча 3L не контактируют с ламиной.

Полученные в работе данные говорят в пользу того, что об-лигатное прикрепление прицентромерных районов к ядерной оболочке осуществляется скорее не путем спаривания любых тандемных повторов ДНК в полимерной ламине (Hochstrasser et al., 1988), а за счет непосредственного связывания с ламиной специфических последовательностей, содержащихся в ДНК Х20р1,4. Однако для обеспечения прямого ДНК-ламин взаимодействия in vivo, по-видимому, необходимы достаточное количество копий специфических последовательностей, либо особая морфология хроматина, обеспечиваемая, вероятно, специфическими гетерохроматиновыми белками и/или окружающими последовательностями ДНК.

ВЫВОДЫ

В настоящей работе впервые получена и охарактеризована ДНК из участков прикреплений хромосом к ядерной ламине и выявлены тканеспецифичные особенности контактирования политенных хромосом с ядерной оболочкой в генеративной ткани у D.melanogaster.

1. Были выделены и клонированы специфические фрагменты ДНК, ассоциированные с фракцией ядерных ламин.

2. Саузерн-дот-блот анализ выявил в геноме дрозофилы две популяции Hindi II-EcoRI-умеренных повторов размерами 1,4 и 1,6 т.п.н., гомологичных клону Я20р1,4.

3. Анализ первичной структуры клона А20р1,4 выявил способные связываться с ламином in vitro M/SAR-элементы: АТАТТТ/С-боксы, консенсусы для узнавания ДНК-топоизомеразы II и поли(dА)*поли(dT) -тракты.

4. Установлено, что преимущественным местом локализации клонированной ламинной ДНК является хромоцентр, .облигатно кон-

тактирующий с ядерной оболочкой в слюнных лелеввх. ДНК, гомологичная А20р1,4, была локализована в прицентромерных районах 20CD, 40EF, 41АБ, проксимальной части 81, 101 и в районе 49D плеча 2R.

5. Показаны различия в молекулярной организации между тремя добавочными блоками прицентромерного гетерохроматина хромосомы 3 псевдопитающих клеток яичников. ДНК, гомологичная клону А20р1,4, была локализована только в блоке района 81. ДНК, гомологичная клону Dml2, была локализована в блоке района 81 и дис-тальном блоке района 80.

6. При анализе недавленных ядер псевдопитающих клеток яичников линии otu11 было обнаружено, что политенные хромосомы независимо и облигатно прикрепляются к разобщенным областям периферии при помощи прицентромерных локусов, имеющих тканеспеци-фичную морфологию.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Шарахов И.В. ДНК из участка прикрепления хромосом к ядерной оболочке у Drosophila melanogaster // Тезисы докладов 1-ой Всесоюзной конференции по генетике насекомых. Москва. 19-21 ноября 1991. С.115.

2. Шарахов И.В. Хромосомная локализация ДНК из ядерной оболочки Drosophila melanogaster // В сборнике: Экоген / Томск. 1992. N.1. С.1.1.4.

3. Шарахова М.В., Шарахов И.В. Изменение морфологии хромосом при прохождении популяции малярийного комара через "горлышко бутылки" // В сборнике: Зкоген / Томск. 1992. N 1. С. 1.1.2.

4. Шарахов И.В., Филиппова М.А., Строц О.В., Борисевич И.В., Богачев С.С., Баричева Э.М., Шилов А.Г. В-гетерохроматин Drosophila : молекулярная организация и функционирование. Характеристика последовательности ДНК из проксимального ß-гете-рохроматина, ассоциированного с ядерной оболочкой Drosophila melanogaster // Генетика. 1993. Т.29. N.3. С.393-402.

5. Байбородин С.И., Баричева Э.М., Богачев С.С., Борисевич И.В., Строц О.В., Филиппова М.А., Шарахов И.В., Шилов А.Г. В-гетерохроматин Drosophila : молекулярная организация и функционирование. Клонирование и молекулярно-биологический анализ

ХЕО фрагмента ДНК ив 0-гехерохрог.'.отипа Drosophila rnelonosester // Генетика. 1993. Т.29, N3. С.403-416.

6. Baiborodin S.I., Baricheva Е.М., Bogaohev S.S., Borise-vich I.V., Srotz 0.V., Filippova M.A., Sharakhov 1.4. A nralecu-lar and cytogenetic analysis of X20p7 frsament DNA from the proximal B-heterochromatin of Drosophila mslanogaster // Gsne. 1993. V.134. P.175-181.

7. Шарахов И.В. Прицентромерные районы хромосом, контактирующие с периферией ядра, содержат специфичьскуи последовательность ДНК // В кн.: Естественные науки. Региональная кауч-но-практическая конференция. Томок, декабрь 1994 г. Теэисы докладов / Тоыск. 1994. С.14.

8. Шарахов И.В., Лапик Е.Р. Идентификация районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке и хромгхх&шая ло;илизацля клока Х20р1,4 в псевдояитащих клетках яичников линии otu11 Drosophila malanogaster // Генетика. 1994. Т.30(приложение). С. 180-181.

9. Sharakhov I.V., Baricheva Е.М., Bogachev S.S., Fisher P.A., Lapik E.R. A specific DNA sequence is located in the loci of proximal B-heterochromatin which are always associated with the nuclear envelope of pseudonurse cells in Drosophila melano-gaster otu11 mutant strain //J. of Cellular Biochemistry. 1995. Supplement 21B Wiley-Liss, Inc., Mew York. P.131.

10. Bogachev S.S., Barisheva E.M., Berrios M., Borisevich I.V, Fisher P.A., Sharakhov I.V., Stuurman N. An M/SAR-containing element from Drosophila B-heterochromatin binds specifically to nuclear lamins in vitro and the nuclear envelope in situ//J. of Cellular Biochemistry.1995.Supplement 21B Wil-ly-Liss, Inc., New York. P.133.

11. Богачев С.С., Борисевич И.В., ®ишер П.А., Штурман Н., Шарахов И.В. В-гетерохроматин Drosophila : молекулярная организация и функционирование. Молекулярно-биологический анализ

. l,!AR/SAR последовательности ДНК из центромерного гетерохроматина Drosophila ir.elanogaster // Генетика. 1996. Т.32. (в печати).

12. Шарахов И.В., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Особенности прикрепления .политенных хромосом к ядерной оболочке в псев-допитащих клетках яичников Drosophila melanogaster // Генетика. 1996. Т.32 (в печати).

13. Шарахова М.В., Шар ахов И.В., Стегний В.Н. Органивация хромоцентра в слюнных железах малярийного комара Anopheles mes-seae Га11//Генетика.1996.Т.32 (в печати).

14. Baricheva Е.М., Berrios М., Bogachev S.S., Borisevich I.V., Lapik E.R., Sharakhov I.V., Stuurman N., Fisher P.A. DNA from Drosophila ö-heterochromatin binds specifically to nuclear lamin in vitro and the nuclear envelope in situ // Gene, 1996 (в печати).

Подписано к печати 21.12.95

Формат бумаги 60x90 1/16. Печ.л. 1. Уч. изд.л. 0,7 Тирах 100 экз. Заказ 8.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10