Исследование нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК на трансгенных мышах и трансфектных клетках эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9

Сучкова, Ирина Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК на трансгенных мышах и трансфектных клетках эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК на трансгенных мышах и трансфектных клетках эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9"

На нравах рукоииси

Сучкова Ирина Олеговна Р | & О Л

, с" гсоо

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ЭКЗОГЕННОЙ МИНИСАТЕЛЛИТНОЙ ДНК НА ТРАНСГЕННЫХ МЫШАХ И ТРАНСФЕКТНЫХ КЛЕТКАХ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ТЕРАТОКАРЦИНОМЫ МЫШИ ЛИНИИ ¥9

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор-академик Б. И. Ткаченко)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Евгений Львович Паткин Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Валерий Борисович Долго-Сабуров

доктор биологических наук Татьяна Борисовна Казакова

Ведущее научное учреждение - Санкт-Петербургский Государственный Университет

Защита диссертации состоится у'^&?.2000г. в часов на заседании

диссертационного совета К001.23.01. в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, Д.12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН (по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д.12).

Автореферат разослан ^Р ¿•¿¿да^^ОООг. Ученый секретарь

диссертационного совета К001.23.01.

доктор биологических наук Куликова О.Г.

Светлой памяти учителя биологии А.В.Артемьева посвящается ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Одной из фундаментальных проблем современной биологии остается выяснение мроды и функций сателлигных ДНК. В последние годы микро- и минисателлитные ДНК )л.я10тся объектами пристального изучения ввиду их роли в возннкновенни ряда :йромышечных и нейродегенеративных наследственных заболеваний человека, а также шлепсии, инсулин-зависимого диабета, некоторых форм рака и других патологий, ^условленных нестабильностью вышеназванных последовательностей ДНК (Bennett et al., >95; Kiaris et al., 1995; Mitas, 1997; Reddy, Housman, 1997; Djian, 1998). Однако до сих пор : установлены точные молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе ¡стабильности всех типов сателлигных ДНК. Предполагают, что изменения -пфосателлигных последовательностей возникают преимущественно вследствие ошибок >и синтезе ДНК за счет репликационного проскальзывания (Richards, Sutherland, 1994; mheim, Shibata, 1997; Ohshima, Wells, 1997), тогда как нестабильность минисателлитной НК является результатом генной конверсии и неравных обменов (Buard, Vergnaud,1994; ffreys et al., 1994; Haaf, Willard, 1997). Высказываются предположения о возможном шествовании прямой или обратной корреляции между метилированием ДНК и ¡стабильностью повторяющихся последовательностей. С одной стороны для некоторых )второв характерна повышенная вероятность образования вторичных структур ДНК и, едовательно, репликационного проскальзывания, если в них был метилирован цитозин acharias, 1993; Mitas et al., 1995), но с другой стороны описаны случаи, когда :тилирование ДНК, наоборот, предотвращало рекомбинационные процессы между 1ВТоряющимися последовательностями (Hsieh, Lieber, 1992; Liang, Jasin, 1995; Yoderet al., 97). В свою очередь необычные структуры ДНК, формируемые in vivo во время процессов, язанных с репликацией, репарацией и рекомбинацией, способны повышать вероятность de va метилирования (Smith et al., 1994; Chen et al., 1995; Smith, Crocitto, 1999). Кроме того, давно было описано аутосомно-рециссивное наследственное заболевание человека (JCF ндром), при котором, как предполагают, гипометилирование сателлитной ДНК едшествует хромосомной нестабильности (Ji et al., 1997; Qu et al., 1999; Xu et al., 1999).

В настоящее время остается в значительной степени не ясным период формирования менений высокоповторяющихся последовательностей в онтогенезе млекопитающих, ¿сказываются предположения, что изменения в микро- и минисателлитных ДНК могут зникать либо во время гаметогенеза (Buard et al., 2000; Stead et al., 2000), либо на ранних вдиях эмбрионального развития (Kelly et al., 1989; Gibbs et al., 1993). Также не понятны

механизмы влияния нестабильности минисателлитных и более крупных сателлитных ДНК i возникновение патологий человека. Не известно, возникает ли заболевание в резулыа нарушений структуры гена, которые обусловлены изменением размера и/или нуклеотидне последовательности сателлитных ДНК, локализованными внутри или за пределами данно1 гена, либо влияние ноент эпигенетический характер. Такая неясность обусловлена к; методическими трудностями исследования крупных повторяющихся последовательность ДНК, так и отсутствием животных, у которых встречались бы заболевания с симптомам эквивалентными вышеназванным наследственным болезням человека. По-видимому, ответ на указанные вопросы можно будет получить лишь при использовании модельнь: трансгенных животных и трансфектных эукариотических клеток, несущих в своем геноь экзогенные сателлитные ДНК различного типа. До сих пор в литературе не описан успешных результатов по получению трансгенных животных, в которых б воспроизводилась межгенерационная нестабильность минисателлитной и, тем боле сателлитной ДНК. Возможно, это было обусловлено неудачным выбором авторами тш минисателлита, а именно его состава и размера, либо тем, что они не проводили анал| потомства трансгенных животных на эмбриональных стадиях развития, когда могли бьп зарегистрированы изменения в нуклеотидной последовательности трансгена.

Дели и задачи исследования.

Цель данной работы состояла в изучении механизмов нестабильное! минисателлитной ДНК у грансгенных мышей и в трансфектных клетках эмбрионально тератокарциномы мыши F9. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1. Получить трансгенных мышей и трансфертные клетки эмбриональной тератокарцином мыши F9, несущих в своем геноме 3,8 т.п.н. повторяющуюся единицу сателлитно ДНК1У (Sat) крупного рогатого скота.

2. Провести компьютерный анализ нуклеотидной последовательности Sat-фрагмента дг оценки возможного влияния горячих точек рекомбинации и вторичных структур ДНК i нестабильность экзогенной минисателлитной ДНК.

3. Выяснить, существует ли взаимосвязь между нестабильностью чужеродно минисателлитной ДНК и ее метилированием.

4. Определить характер влияния нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК ( жизнеспособность трансгенных мышей и трансфектных клеток F9.

5. Сравнить влияние вторичных структур ДНК, горячих точек рекомбинации метилирования ДНК на межгенерационную и соматическую нестабильность чужеродно минисателлитной ДНК у трансгенных мышей и трансфектных клеток эмбрионально тератокарциномы мыши F9.

Научная новизна работы.

Впервые воспроизведена межгеперациомиая нестабильное! ь жкленной инисателлитной ДНК у траисгенных животных, которая имела выраженный енотипический эффект - пренатальную гибель трансгенных зародышей спустя как инимум одно поколение. Получена соматическая нестабильность чужеродной инисателлнтиой ДНК в культуре эукариотнческих клеток. Показано, что межгенерационная соматическая нестабильность экзогенной минисателлитной ДНК обусловлена 1утриаллелыюй межмолекулярной и/илн внутримолекулярной рекомбинацией, сследована взаимосвязь между паттерном метилирования экзогенной минисателлитной НК и межгенерационной и соматической нестабильностью.

Практическая значимость работы.

Созданные экспериментальные модели могут быть использованы для изучения еханизмов изменчивости минисателлитной ДНК и ее влияния на возникновение зследственных заболеваний человека, обусловленных межгенерационной нестабильностью жих последовательностей, а также для исследования механизмов регуляции активности :нов, дифференцировки клеток, процессов старения. Полученные трансгенные мыши и )ансфектные клетки эмбриональной тератокарциномы мыши Р9 могут быть использованы тя тестирования ксенобиотиков различной природы.

Апробация работы.

[атериалы диссертации были представлены на: Ш-й Всероссийской научно-технической жференции "Фундаментальные исследования в технических университетах", Санкг-етербург, Россия, 10-11 июня 1999г.; Ц-й Европейской цитогенетической конференции, ена, Австрия, 3-6 июля 1999 г.; ХШ-м Всероссийский симпозиум "Структура и функция 1еточного ядра", Санкт-Петербург, Россия, 19-20 октября 1999 г.; 10-й Европейской >нференции молодых ученых по биологии и медициие, Берлин, Германия, 20-23 октября )99 г.; 2-м съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Санкт-Петербург, зссия, 1 -5 февраля 2000 г.

Основные положения, выносимые на защиту: Трансгенные мыши и трансфектные клетки эмбриональной тератокарциномы Т9 могут быть использованы в качестве модельных систем для изучения молекулярных основ нестабильности минисателлитной ДНК.

Внутриаллельная межмолекулярная и/или внутримолекулярная рекомбинация лежит в основе межгенерационной и соматической нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК.

3. Межгенерационная нестабильность чужеродной минисателлитной ДНК приводит нарушению в эмбриональном развитии спустя как минимум одно поколение.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 138 страницах и. состоит из глав: введение, обзо литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение выводы. Работа иллюстрирована 33 рисунками, 9 таблицами. Список литературы содержи 274 работы на русском и английском языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались мыши гибриды (СВА х C57/BL6)Fi (питомник "Раниолово"; Были исследованы две линии мышей, трансгенных по 3,8 т.п.н. повторяющейся единиц сателлитной ДНК IV (Sal) крупного рогатого скота Bus laurus. (Skowronsky et al., 1984J Трансгенные мыши получены в Отделе молекулярной генетики НИИЭМ РАМН методо1> микроинъекции чужеродной ДНК в мужской пронуклеус зигот (Gordon et al., 1980; Вайсыан Голинский, 1985). Культуру клеток эмбриональной тератокарциномы мыши линии F1 получали из Банка клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) Тератокарциномным клеткам F9 котрансфецировали плазмиды pBR322-Sat и pSV2neo Трансфекцию проводили кальций-фосфатным методом (Хеймс,Хиггис,1987). Исследовании! трансгенные мыши и трансфектные клетки F9 были гемизиготными по экзогенной ДНК.

В качестве вектора дам клонирования чужеродной ДНК использовали плазмид; pBR322, содержащую но Hind III сайту Sat-вставку. Рекомбинантная плазмида была любезш предоставлена профессором А.Ф.Смирновым (ВНИИГРЖ, Санкт-Петербург). Клонирование экстракцию рекомбинантной плазмиды pBR322/Sat и выделение Sat-вставки осуществляли следуя методам, описанным (Маниатис и др., 1984).

Основным материалом для исследования нестабильности экзогенно> минисателлитной ДНК служили образцы ДНК трансфектных клеток эмбрионально! тератокарциномы F9, ДНК из хвостов взрослых животных и 9-14 дневных эмбрионов от скрещивания трансгенных мышей с нормальными мышами (СВА х C57/BL6)F). Первыь днем беременности считался день обнаружения вагинальной пробки. Геномную ДНР выделяли фенол-хлороформным методом (Маииатис и др., 1984).

Скрининг и анализ трансгенных мышей и трансфектных клеток осуществляли < помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР in vitro и ПЦР in situ), с использованием дву> пар праймеров 5'gcagtgcataaatatcaaaagg3' (PR1) и 5'gatcaggaggttgtagggaac3' (PR2) 5'cccactggatgccgaccctt3' (PR3) и 5'tcctttccgtagccctcgtt3' (PR4), подобранных с помощыс программы "Primer 1.0" (рис.1). ПЦР проводили в термоциклере ("Cyclotemp") прг

шедующих условиях: один цикл предварительной денатурации 94°С • 5мин.; 30 циклоп ->4°С - 1мин., 60 °С (для пары ираймеров РЯ1/РК2) или 57(,С (дня пары праймеров РЯ1/РК2 и ■ары праймеров РЯЗ/РЙ4) - 1мин., 72°С - 1мин.; заключительный цикл синтеза 72°С - 9 мин. 1родукты амплификации разделяли электрофоретически в 6% ПААГ с последующим жрашиванием 0.1% А^ЫО}.

4 PR3 (I0Q7)

PR2 (2357>а ,PR2 (2993)

■te-

С, D

Ьг

PR4 (558) 449 п.н.

PRI (1819/1831) E ■■ —F

526/538 пл.

PRI (2748) 245n.ii.

Рис. 1. Схема локализации праймеров, использованных для скрининга и анализа Ба!-

трансгенных мышей.

(ирными стрелками отмечены позиция и ориентация двух пар праймеров РШ/РШ и РЯЗ/РЯ4, олностыо комплементарных ДНК-мишени. Двойными стрелками отмечены позиция и ориентация Ш/РЯ2, частично комплементарных ДНК-мишени; тонкими вертикальными стрелками указаны айты рестрикции для \1spl и Нра11; жирными линиями изображены продукты амплификации при олной комплементарное™ праймеров РК1/РК2 и РЯЗ/РИ4 и ДНК-мишени, где А, В, С, Б - границы окализации ПЦР-продуетов; двойной линией отмечены продукты амплификации при частичной омплементарности праймеров РК1/РЯ2 и ДНК-мишени, где Е, И - границы локализации ПЦР-родуктов; цифрами в скобках отмечены порядковые номера нуклеотидов.

Анализ паттерна метилирования чужеродной сателлитной ДНК проводили с помощью етил-чувствительной ПЦР с использлванием рестриктаз-изошизомеров Hpall и Mspl и раймеров PR3/PR4. Праймеры PR3/PR4 конструировались так, чтобы внутри лплифицируемого фрагмента ДНК-матрицы оказывалось несколько сайтов рестрикции для Ispl/Hpall (Рис.1).

Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности Sat-фрагмента был роведен с помощью программы BLAST в базах данных GenBank ittp://www.ncbi.nlm.nih.gov), а также пакета программ LaserGene.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности 3,8 т.п.н. повторяющейся единицы сателлитной ДНК IV крупного рогатого скота.

Компьютерный анализ Sat-иоследовательности показал, что данна последовательность имеет в своем составе прямые, инвертированные, симметричны повторы различного нуклеотидного состава (рис.2). Однако ярко выражение периодичности, характерной для большинства микро-, мини- и сателлитных ДНК, в данно последовательности не обнаружено, за исключением лишь двух районов, где локализован! тандемно повторяющиеся ди- и тринуклеотидные повторы (CA/TG и CAG/CTG). Sal фрагмент содержит относительно эквивалентное количество каждого из четыре дезоксирибонуклеотидов (dAMP-23,5%; dTMP-25,6%; dCMP-24,8%; dGMP-25,9%), которы на протяжении сателлитного фрагмента образуют несколько ярко выраженных пиков AT - ¡ GC - богатых районов (рис. 3).

С целью выявления в Sat-фрагменте последовательностей, являющихся горячим точками рекомбинации, был проведен поиск участков, гомологичных им. Было установлено что исследуемый фрагмент ДНК достаточно насыщен сайтами, которые гомологичш горячим точкам рекомбинации (таблица 1). Кроме того, на протяжении всей Sal последовательности, за исключением лишь области приблизительно с 600 по 110 нуклеотид, состредоточено 481 сайтов узнавания топоизомеразой I (Topol) (a/tg/ct/at/a которые часто являются сайтами незаконной рекомбинации в соматических клетках (Hamad et al., 1993; McFarlane, Wilson, 1996).

Рис. 2. Распределение различных типов повторов в Sat-последовательности.

Цифрами обозначены порядковые номера нуклеотидов в Sat-фрагменте, вертикальные полосы и прямоугольники - области локализации повторов.

И IIIIIIHIИН 01111Ш11П1 IUI МИН II II НИ ВШИ ИНН I НИН И0НЦЦЩД симметричные

ниш in Ii im i hi urn Ii nmmiiHintmitii ainnmininmmiiiii и» инвертированные

mili fifi и i ммгц ■!! liimowMIIUHUIlM II HBIttMlM Hfl BffltltirP"— »**' " nnauup

11ПИЯПЛ1IBIHUII III 1ЯИЯ1Ц1111111111 III II (плЯМШТтППШиЯПШМ!) || lipÄMWC

500

1ГКХ)

1500 5000 ?Sno 3000 3500

Рис.3. Распределение четырех дезокирибонуклеотидов вдоль ЗаЫюследовательности.

доля

0.475

А+Т

I-1-1-1-1-1-1--т—

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Номера нуклеоти-доа в БаС

0.253 0

Таблица 1. Сайты внутри Sat-фрагмента, гомологичные некоторым горячим точкам

рекомбинации.

Консенсусная последовательность Название / Функция Литература Гомология Локализация в Sat Кол-во сайтов

Нить Нуклеотид с 5' конца

CCTGGTCO (CTGGAGG) Chi сайт-сигнал рекомбинации у E.coli (С hi-подобная последовательность) Smith et I..I98I; Boan et al., 1997 87,5% + 404, 617, 2231,2307, 2662 5

- 1290 1

TGTTTTTGG V(D)J-peKOM6HHaun-онные сигналы генов тяжелой цепи иммуноглобулинов. Boan et al., 1997 100% + 2180 1

CACAO IG 88,9% _ 120 1

100% 1633 1

GAGC 1(G) Рекомбннационные сигналы переключения классов иммуноглобулинов Boan et al., 1997 100% + На всем протяжении Sat-фрагмента 3 4

AUCI(ü) + 12 1S

TGAG(C) + 10 21

TGGG(G) + 27 21

GAGGTAGGA--GGCAG Горячая точка рекомбинации в главном комплексе гистосов-местимости мыши Wahls, Moore, 1998 68,7% + 404, 1718, 2429 3

CAGG (cagg)2j горячая точка рекомбинации гена главного комплекса гистосовме-стимости мыши -Eß Steinmetzetal., 1986 100% + На всем протяжении Sat-фрагмента; тандемов нет 24

- 30

GGCAGG Вносит вкладе . нестабильность ми-нисателлитов человека в зародышевой линии Boan etal., 1997 100% + 415, 863, 884, 2436 4

AGAGGTGUG--CAGG Коровая последовательность синтетического гипервариабельного миниса-теллита Wallis, Moore, 1998 68,7% + На всем протяжении Sat-фрагмента 19

- 8

TGGGAAAGGC TGGGATTGC TGGGAGGGC Некоторые из повторяющихся единиц не-гипервариабельного минисателлита человека MsH42 Boan et al.,1997 ~ 88% + На всем протяжении Sat-фрагмента 8

GTGACTGGC--CAGGAGG Повтор в гене арп хомячка (склонны к инсерциям/делециям) Wahls, Moore, 1998 68,7% + 1363 1

- 1249, 1413 2

(G)GGCA Повторяющаяся единица минисателлитов Нт2и(М5б1шО мыши Bois etal., 1998 100% + На всем протяжении Sat фрагмента 4

- 2

2. Скрининг и анализ трансгеппых мышей.

Для моделирования межгенерационной нестабильности экзогенной минисателлитной ЦИК были получены две линии (№ 10 и 21) 8а1-трансгенных мышей. Статистический анализ : помощью критерия Фишера с ср-преобразованием показал, что не наблюдается юстоверных отличий (при р=0,05) между двумя полученными линиями трансгенных мышей ;ак по проценту выживших после микроманипуляций зигот (21% и 21,6% соответственно), гак и по эффективности трансгеноза (7,94% и 2,22%). Анализируемые линии также юстоверно не различались по проценту взрослых трансгенных мышей р! (10,53% и 7,14%), а также трансгенных эмбрионов Р| (33,33%) (линия 21) и ¡-'2 (27,6%) (линия 10). Достоверные эазличия наблюдались лишь при сравнении процента трансгенных 32-х клеточных ¡ародышей (бластоцисты) (50,0%) и взрослых мышей (7,14%) Р| в линии 21.

Для выявления межгенерационной нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК 5ыла использована ПЦР с двумя парами праймеров РЯ1/РЯ2 и РЯЗ/РЯ4 (рис.1). В линии 10 у грансгенных мышей Ро и Р| были выявлены амплификаты в 245 п.н. и 526/538 п.н. при ;отжигаб0°С, тогда как у эмбрионов Рг при данной температуре отжига фрагмент в 526/538 п.н. те амплифицировался (рис.4 А). ПЦР-продукт 449 п.н. в этой линии мышей был обнаружен только у Ро и отсутствовал уже у мышей Р| (рис.4 Б), тогда как во второй линии трансгенных лышей (линия 21) данный фрагмент амплифицировался в Ро и Г|.

В линии 21 при 10ТЖИГ160°С синтезировался только фрагмент 245 п.н. (рис.5 А) в Ро и тогда как при 1игжига 57°С амплифицировались оба фрагмента (526/538п.н. и 245п.н.) у ¡)аундера, взрослой мыши Р| и фенотипически нормального эмбриона (12 день развития) тогда как у аномального эмбриона Р| (14 день развития) был выявлен только амплификат в 245 п.н. (рис.5 Б). В случае, когда ПЦР (1отаИга 57 °С) проводилась на 32-клеточных ¡ародышах Р|, также амплифицировался фрагмент в 245 п.н. В положительном контроле, <оторыми являлись рВЯ322/5а( и ДНК крупного рогатого скота, при любой из шшеназванных температур отжига синтезировались оба фрагмента.

Данные ПЦР могут косвенно указывать на постепенное в ряду поколений межгенерационное) снижение комплементарности между п рай мерам и и ДНК-мишенью, (оторое могло быть обусловлено различными типами мутаций, затрагивающими область )тжига праймеров с ДНК-матрицей (как точковыми мутациями, так и более крупными терестройками в исследуемой последовательности). С возможными перестройками, по-шдимому, также было связано и отсутствие амплификата в 449 п.н. в К) в линии 10. Хотя не кключено, что при межгенерационной передаче экзогенной минисателлитной ДНК могло троизойти уменьшение общего числа копий трансгена по сравнению с его первоначальным

значением, что в свою очередь снизило некое пороговое количество копий ДНК-матрицы, необходимое для эффективной ПЦР.

В пользу меж! операционной нестабильности экзогенной миписагеллитной ДНК говорит также тот факт, что в линии 10 у мышей Fi с помощью гибридизации in silu (FISH) был выявлен один сайт интеграции Sat, тогда как исходно у фаундера трансген был локализован в двух локусах. Вероятно, отсутствие второго FISH сигнала в Fi было обусловлено значительными перестройками в Sat-кластере, которые привели к снижению эффективности FISH гибридизации.

Рис. 4. Электрофореграммы продуктов амплификации (линия 10).

А). ПЦР ((„„„и 60 °С) с праймерами PR1/PR2, амплифицирующими фрагменты в 526/У38п.н. (верхний бэнд) и 245 н.н. (нижний бэнд); Б). 11ЦР (t„„HrsS7 °С) с праймерами PR3/PR4, дающими фрагмент в 449 п.н. (нижний бэнд). К-нетрансгенная мышь; Fo-самец-фаундер; Fi-трансгенная взрослая мышь первого поколения; Гг1раисгеммый эмбрион второго поколения; Bov.-крупный рогатый скот; pBR322/Sat-KOHGTpyKHHfl, использованная для клонирования; pBR322/Alul-MapKep размеров фрагментов.

pBR pBR pBR pBR

Рис.5. Электрофореграмма продуктов амплификации с праймерами PR1/PR2 (линия 21).

К-нетрансгенная мышь; Р0-фаундер; I*, 3*, 6, 8, 15, 17 и 22' - эмбрионы 12* и 14 дня развития и взрослая мышь1 первого поколение от скрещивания трансгенного самца ¡"о с нормальными самками; рВЯ322/5а[-конструкция, использованная для клонирования; Воу.-крупный рогатый скот. Верхний бэнд 526/538 п.н., нижний бэнд 245 п.н.

Следует отметить, что межгенерационная нестабильность экзогенной минисателлитнон ДНК имела фенотипический эффект. Так, в линии 21 в Р|, а в линии 10 в Рг помимо фенотипически нормальных трансгенных эмбрионов были выявлены отстающие в развитии и даже аномальные эмбрионы (рис.6), причем в процессе эмбриогенеза наблюдалось постепенное уменьшение доли трансгенных особей (рис.7), что может говорить в пользу постимплантационной летальности, а не гибели на уровне гамет или зигот.

Рис.6. 11-ти дневные фенотипически нормальный (А) и аномальный (Б) трансгенные эмбрионы Рг из одного помета от скрещивания нормальной самки (СВАхС57ВЬ/63) с трансгенным самцом Р^а! (линия 10).

Рис.7. Процент трансгениых особей, выявляемых в пренатапьный и постнатальный период.

бластоцисты эмбрионы взрослые мыши

(5 день эмбр. развития) (9-14 день эмбрионального развития)

линия 21 (Р|):-► 50,0%-* 33,3% -► 7,14%

линия 10 <Рг и Р|):-► 27,6% -► 10,53%

Анализ паттерна метилирования фрагмента экзогенной минисателлитной ДНК в двух исследуемых линиях трансгенных мышей был проведен с помощью метил-чувствительной ПЦР с целью выявления предполагаемой роли метилирования ДНК в возникновении нестабильности ЗаЬпоследоватсльности при межгенерационной передаче, а также его возможной роли в фенотипическом проявлении нестабильности чужеродной ДНК. Так, в линии 10 у самца-фаундера трансген был метилирован в области с 558 по 1007 нуклеотид, однако анализ паттерна метилирования в последующих поколениях мышей этой линии был не возможен ввиду отсутствия продуктов ПЦР-амплификации в данном районе, как предполагается, по-видимому, из-за возникших при межгенерационной передаче перестроек

в данной области. В линии 21, в огличие от линии 10, анализируемый участок чужеродной сателлитной ДНК не был метилирован у Ро, а также у фенотипически нормального эмбриона (12 день развития) и взрослой мыши р], хотя у аномального эмбриона И) (14 день развития) данный район был метилирован (рис.8).

Рис.8. Результаты метил-чувсгвительной ПЦР ЗаИрансгенных мышей линии 21.

3 - 12ти дневный фенотипически нормальный эмбрион И,; 15- 14ти дневный аномальный эмбрион И,; 22-вчрослая мышь Гь 17„-фаундер. Образцы нанесены в следующем порядке: пробы после рестрикции с Мэр!, с ПраМ и инкубации в буфере для рестрикции Ь (без рестриктаз) с последующей ПЦР с праймерами РЮ/Р114. Нижний бэнд соответствует 449 п.н.

3 15 22 F0 pBR322/Sat

Mspl. Hpall. L. Mspl. Hpall. L. Mspl. Hpall. L. Mspl. Hpall. L. Mspl. Hpall. L.

3. Молекулярно-генетические исследования трансфектных клеток эмбриональной теритокарциномы мыши линии F9.

Для исследования соматической нестабильности минисателлитной ДНК было получено 12 клонов мышиной эмбриональной тератокарциномы F9, ко-трансфецированных векторами pSV2neo и pBR322-Sat, из которых 11 клонов оказались трансфектными по экзогенной минисателлитной ДНК. Оказалось, что при ПЦР с Отжига 60 °С в двух из них (клоны № 1 и 6) синтезировался только 245 п.н. фрагмент, а в остальных клонах - фрагменты 526/538 п.н. и 245 п.н., тогда как при ton(!Hra 57°С во всех клонах амплифицировались оба фрагмента (таблица 2). Отсутствие амилификата могло быть вызвано теми же причинами, что и у трансгенных мышей, а именно нестабильностью Sat-последователыюсти, которая в данном случае имела место во время митотических делений. Кроме того, еще в одном из трансфектных клонов (клон №10) трансген был выявлен не во всех клетках (результаты гибридизации in situ - FISH), что может говорить об элиминации Sat-кластера или же о существовании перестроек в нем, которые сильно снижают эффективность гибридизации in situ. Остальные же клоны, вероятно, были стабильны или же изменения в Sat, произошедшие в них, просто не были зарегистрированы используемыми методами.

Исследование паперна метилирования экзогенной минисателлитпой ДНК трансфектных клеток мышиной эмбриональной тератокарциномы 1;9, проведенное с помощью метил-чувствительной ПЦР, показало, что 5а!-фрагмент в районе с 558 по 1007 нуклеотид был метилирован не во всех клонах, а только в № 3 и №10. Было обнаружено, что нестабильность экзогенной мшшеателлитной ДНК и/или ее метилирование в некоторых случаях приводили к гибели трансфектных клонов спустя ряд пассажей даже на неселективной среде (таблица 2).

Таблица 2. Результаты анализа клеток эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9, ко-трансфектных по векторами pSV2neo и pBR322-Sat.

Обозначения: * - наличие только 245 п.н. ПЦР продукта; **- наличие 526/538 п.н. и 245 п.н. продуктов амплификации; + - наличие 449 п.н. ПЦР продукта; - непроверенные клоны

Клопы / 2 3 5 6 7 8 9 10 и 12

ПЦР с п рай-мерами PRI/PR2 t S7 °Г

to™„,a60°C *

ПЦР с прай-мерами PR3/PR4 + + + + + + + + + + +

Метилирвание в обл. 558-1007 Sal есть Есть

"воспроизводимость клона" Погиб Погиб Погиб Погиб

FISH анализ: Кол-во сайтов интеграции - - - - - 1 - - 1 2 -

Распределение сигнала по клеткам в клоне - - - - - Во всех - - Не во всех Во всех -

Интенсивность сигнала - - - - - Слабый - - Средний Сильный -

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В основе изменений нуклеотидной последовательности могут лежать как внутримолекулярные (точковые мутации, репликационное проскальзывание, внутримолекулярные обмены), так и межмолекулярные (внутри- и межаллельные обмены) процессы (Jefferys et al., 1990; Jeffreys et al., 1991; Boan et al., 1998; Buard et al., 2000). Поскольку вероятность одинаковых изменений во всех копиях трансгена очень низка, то для того, чтобы не амплифицировались 526/538 п.н. и в 449 п.н. фрагменты, должна была

происходить рекомбинация, которая приводила бы к резкому уменьшению количества йаЬ копий, и, следовательно, отсутствию интересующих продуктов амплификации. Тем более, что в пользу возможного существования рекомбинации в экзогенной минисателлитной ДНК и между копиями трансгена говорят несколько фактов:

1. ЗаЬфрагменг обогащен горячими точками рекомбинации, прямыми и инвертированными повторами.

2. В один сайт преимущественно интегрирует несколько копий трансгена в ориентации "голова-хвост", "голова-голова", "хвост-хвост".

3. Наблюдаемый эффект (отсутствие 526/538 п.н. и 449 п.н. ГЩР-продуктов) у трансгенных мышей был обнаружен очень быстро (уже в Р| и Р2).

Так как анализируемый трансген находился в гемизиготном состоянии, то рекомбинация могла происходить между сестринскими хроматидами (внутриаллельный межмолекулярный обмен), между кластерами экзогенной минисателлитной ДНК, локализованными в негомологичных хромосомах или разных сайтах гомологичных хромосом (эктопическая рекомбинация), либо мог иметь место внутримолекулярный обмен. Возможность эктопической рекомбинации в рассматриваемых случаях исключена, поскольку это приводило бы к отсутствию трансгенных мышей Р| (либо к их стерильности) и гибели трансфектных клонов еще во время первого пассажа. Поэтому нестабильность экзогенной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей и в трансфектных клетках Р9, скорее всего, была обусловлена внутриаллельной межмолекулярной (СХО) и/или внутримолекулярной рекомбинацией. Возможность СХО и внутримолекулярной рекомбинации ранее была описана для негипермутабельного минисателлита человека МэН42 (Воап й а1., 1998), а также для гипермутабельных минисателлитов человека МБ205, М532, СЕВ1 (ЭеЬгаил'еге е1 а1„ 1999; Виагс! « а1„ 2000).

Вследствие того, что у крупного рогатого скота сателлитная ДНК1У низкополиморфна (Бкоитопзк! е1 а1., 1984; Смирнов и др., 1996), несмотря даже на содержание горячих точек рекомбинации, прямые и инвертированные повторы, можно предположить, что толчком в возникновении нестабильности фрагмента экзогенной сателлитной ДНК у трансгенных мышей послужило либо уменьшение общего количества повторов в тандеме по сравнению с исходной формой у крупного рогатого скота, либо это было обусловлено генетическим фоном, а, возможно, и видоспецифичными особенностями биохимического статуса клетки, которые, по-видимому, могли активировать содержащиеся в повторяющейся единице горячие точки рекомбинации. Ранее была установлена роль ДНК, фланкирующей повторы, в инициации нестабильности некоторых минисателлитных последовательностей (ВиШег, Ьо, 1986; ЭеЬгаишеге й а!„ 1999; Не е1 а1., 1999).

Поскольку была выявлена как межгенерационная, так и соматическая нестабильность Sat-последователыюсти, то изменения в экзогенной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей, по-видимому, могли иметь место либо во время гамето! енеза, либо в очень ограниченный период раннего эмбриогенеза. В литературе для многих минисателлитных последовательностей было описано образование новых аллелей при гаметогенезе (JefTreys et al., 1990; Murti et al., 1994; Buard et al., 2000; Stead et al., 2000) и во время первых делений дробления (Kelly et al., 1989; Gibbset al., 1993).

Метилирование экзогенной минисателлитной ДНК у фаундера в линии 10 и в трансфектных клонах №3 и №10 могло быть связано с одной из твердо установленных функций метилирования, а именно инактивированием различного рода "паразитических" как экзогенных, так и эндогенных последовательностей ДНК (Yoder et al., 1997; O'Neill et al., 1998). Хотя не исключено, что в данном случае метилирование чужеродной ДНК могло быть обусловлено сайтом интеграции или количеством копий трансгена, поскольку Sat-последовательность не была метилирована в остальных 9 трансфектных клонах F9, а также у фаундера в линии 21 трансгенных мышей. Можно предположить, что если метилирование экзогенной ДНК в трансфектных клетках происходило бы сразу после ее интеграции в геном, го метилировались бы и ген пео, и Sat (поскольку считается, что при ко-трансфекции различные конструкции интегрирует вместе в один сайт (Allen et al., 1994; Doerfler et al., 1998). Это в свою очередь привело бы к потере резистентности к антибиотику и, следовательно, отсутствию трансфектных клонов. Поэтому, метилирование экзогенной минисателлитной ДНК в трансфектных клетках F9, по-видимому, происходило в процессе митотических делений и, скорее всего, не затрагивало ген пео. Вероятно, у трансгенных мышей в линии 21 метилирование Sat у аномального эмбриона (№15) (рис.8) было результатом нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК. Не исключено, что вследствие перестроек могли произойти некие изменения в последовательности, которые повысили вероятность образования шпилек при синтезе ДНК за счет репликационного проскальзывания (при репликации, репарации, рекомбинации) в некоторых областях Sat (например, в GC-богатом районе или в (CAG)g/(CTG}9 микросателлитном участке), которые в свою очередь могли являться сайтами для de novo метилирования ДНК. Не исключено, что этом случае такие области Sat-фрагмента могли служить триггером для распространения метилирования вдоль Sat-последовательности, а может быть и за его пределы, приводя к инактивации или активации близлежащих генов. Ранее было выявлено, что ДНК-метилтрансферазы обладают способностью распознавать вторичные структуры и метилировать их de novo, что служит сигналом для привлечения ферментов системы репарации (рис.9) (Smith et al., 1994; Chen et al., 1995; Smith, Crocitto, 1999), также было

описано существование центров метилирования в геноме эукариот для Alu, В1 и SI повторов (Heller et al., 1995; Docrílcr et al., 1997; Yates et al., 1999; Arnaud et al., 2000).

Рис.9. Пострешшкационное метилирование ДНК и его вклад в возникновение перестроек (по Smith, Crocitto, 1999).

• — ДНК-метилтрансфераза (ДНК-МГ) млекопитающих; ■ — ферменты системы репарации; (а) - в клетке нет дефицита ДНК-МТ и система репарации в норме; (б) - дефицит ДНК-МТ в "динамическом сайте"; (в) - в клетке нег дефицита ДНК-МТ и система репарации в норме, но имеют место дупликации в "динамическом сайге".

-iiz„^fe = Й»'

; * а/ 1Г

"/.""Ж"" ?«• Ч £ А___ _А_

| • ^-^ ^_

ua«V">H „JiXJL/t— ь _-JUJ—ri

Так как образование шпильки и такой вариант de novo метилирования является случайным процессом, то доля потомков с метилированным и/или перестроенным Sat может быть различна в двух линиях трансгенных мышей и трансфектных клонах F9. Кроме того, вероятность образования шпилек в матричных ведущей и отстающей нитях различна, поэтому может отличаться и паттерн метилирования данной области ДНК в сестринских хроматидах, что в свою очередь, по-видимому, может также влиять на дифференцировку клеток, и приводить к нарушениям в эмбриональном развитии.

Таким образом, для экзогенной мкнисателлиткой ДНК у трансгенных мышей и в трансфектных клетках эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9 характерна нестабильность, в основе которой лежат внутриаллельные межмолекулярные (СХО) и/или внутримолекулярные обмены. Не исключено, что в данных экспериментальных системах, возможно, имела место как прямая, так и обратная корреляция между нестабильностью и метилированием (а в некоторых случаях и отсутствие таковой) Sat-фрагмента. При этом на вероятность как нестабильности, так и метилирования Sat-фрагмента могли оказывать влияние не только структура использованной в данной работе чужеродной ДНК и количество интегрированных копий трансгеиа, но и особенности сайта интеграции, с которыми безусловно связаны и наблюдаемые , фенотипические эффекты (постимплантационная эмбриональная летальность, отставание в развитии и уродства, гибель трансфектных клонов) (рис. 10).

Рис. 10. Схема, иллюстрирующая роль возможных молекулярно-генетических процессов, в

возникновении нестабильности $а1-последователыюсти, приводящей к фснотипическим изменениям у трансгенных мышей и трансфектных клеток эмбриональной тератокарциномы

мыши линии К9.

БИОХИМИЧЕСКИЙ^СТАТУС КЛЕТКИ

ВЫВОДЫ

1. Получены мыши, трансгенные по экзогенной минисателлитной ДНК, у которых обнаружена межгенерационная нестабильность данной последовательности.

2. В клетках эмбриональной тератокарциномы мыши Р9, трансфектных по экзогенной минисателлитной ДНК, выявлена соматическая нестабильность этой последовательности.

3. Межгенерационная и соматическая нестабильность экзогенной минисателлитной ДНК обусловлена внутриаллельной межмолекулярной и/или внутримолекулярной рекомбинацией.

4. Нестабильность чужеродной минисателлитной ДНК приводит к нарушению в эмбриональном развитии спустя как минимум одно поколение.

5. У трансгенных мышеи и в трансфсктиых клетках F9 обнаружена как метилированная, так и неметилированная форма экзогенной минисателлитной ДНК. Метилирование и нестабильности экзогеной минисателлитной ДНК коррелируют не во всех случаях.

6. Трансгенные мыши и трансфектные клетки эмбриональной тератокарциномы F9 могут быть использованы в качестве модельных систем для изучения молекулярных основ нестабильности минисателлитной ДНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кислякова 'Г.В., Лянгузова М.С., Струнникова М.А., Малашичева А.Б., Кустова М.Е., Сучкова И.О., Поспелов В.А., Паткин Е.Л. Физиологические однонитевые разрывы ДНК в клетках тератокарциномы мыши линии F9 и в клетках преимплантационных зародышей мыши. // Цитология.-2000.-т.42.-№3.-стр.284-285.

2. Попов A.B., Голубков В.И., Смирнов А.Ф., Бадер М., Сучкова И.О., Баранова Т.В., Сорокин А. В., Гайцхоки B.C., Паткин E.JI. Обнаружение трансгенных животных при помощи полимеразной цепной реакции in situ.// Цитология.-1999.-т.41.-№8.-стр.36-40.

3. Попов А. В., Смирнов А.Ф., Сучкова И.О., Баранова Т.В., Сорокин A.B., Гайцхоки B.C., Паткин Е.Л. Моделирование гетерохроматиновых районов у трансгенных мышей при переносе фрагмента сагДНК-lV Bos taurus L. // Генетика -2000.-т.36.-№8.-стр.930-935.

4. Попов А. В., Смирнов А. Ф., Паткин Е. Л., Сорокин А. В., Сучкова И. О. Необычные гетерохроматиновые районы у трансгенных мышей, содержащих сателлитную ДНК крупного рогатого скота. // 2-ой съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Санкт-Петербург, 1-5 февраля 2СОО.-Тезисы докладов сьезда.-2000.- т.1. -стр. 247-248.

5. Сучкова И.О., Струнникова М.А., Баранова Т.В., Огнева И.В., Голубков В.И., Сорокин A.B., Паткин Е.Л. Межгенерационная нестабильность чужеродной минисателлитной ДНК и ее влияние на эмбриональное развитие трансгенных мышей. // Цитология.-2000.-т.42.-стр.311.

6. Сучкова И.О., Струнникова М.А., Баранова Т.В., Огнева И.В., Голубков В.И., Сорокин A.B., Паткин Е.Л. Межгенерационная нестабильность чужеродной сателлитной ДНК у трансгенных мышей. // Ш-Всероссийская научно-техническая конференция "Фундаментальные исследования в технических университетах", Санкт-Петербург, 10-11 июня 1999г.-Материалы конференции.-1999.-е. 169-170.

7. Сучкова И.О., Струнникова М.А., Голубков В.И., Сорокин A.B., Паткин Е.Л. Моделирование нестабильности минисателлитной ДНК на трансгенных мышах. // 2-ой

съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Санкт-Петербург, 1-5 февраля 2000,-Тезнсы докладов сьезда.-2000,- т.2. - стр.238.

8. Popov Л., Baranova Т., Suclikova I., Smimov A., Golubkov V., Sorokin A., Patkin Е. The modelling of lielerochromalic regions in transgenic mice. // Cytogenet. Cell Genet.-1999.-voI.85.-p.95.

9. Suclikova I., Strunnikova M., Sorokin A., Golubkov V., Gaitskhoki V., l'atkin H. The effect of foreign satDNA integration on F2 transgenic embryo development. H C'ytogenet. Cell Genet.-1999.-vol.85.-p.I08.

10. Suchkova I. Intergenerational instability of foreign minisaleilite DNA in transgenic mice. // 10th European Students Conference for students and young doctors, Berlin, 20-23.10.99.-Abstract book.-1999.-p.172.

Благодарю всех сотрудников Отдела молекулярной генетики ПИИЭМ РАМН и лаборатории Молекулярных основ дифференцировки клеюк ЦИН РАН за оказанную помощь в выполнении диссертационной работы.

Работа поддержана грантом РФФИ №98-04-50002

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сучкова, Ирина Олеговна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура, особенности и функции сателлитных ДНК различного типа.

1.1.1. Микросателлитная ДНК.

1.1.2. Минисателлитная ДНК.

1.1.3. Сателлитная ДНК.

1.2. Молекулярные механизмы нестабильности сателлитных ДНК и период возникновения данного явления в онтогенезе.

1.3. Метилирование ДНК и нестабильность повторяющихся последовательностей.

1.4. Использование трансгенных животных в экспериментах по изучению in vivo различных типов сателлитных ДНК.

1.4.1. Трансгеноз как один из методов биологических исследований.

1.4.2. Исследование природы и функций сателлитных ДНК с помощью трансгеноза.

ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клонирование 3,8 т.п.н. фрагмента сателлитной ДНК1У Bos taurus.

2.1.1. ТрансформацияЕ. coli.

2.1.2. Выделение 3-,8 т.п.н. вставки (Sat) из плазмиды pBR322-Sat.

2.2. Получение трансгенных животных.

2.3. Трансфекция клеток эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9.

2.4. Выделение геномной ДНК.

2.5. Полимеразная цепная реакция.

2.5.1. ПЦР in vitro.

2.5.2. ПЦР in situ.

2.6. Определение паттерна метилирования экзогенной ДНК.

2.7. Флуоресцентная гибридизация in situ - FISH.

2.8. Статистическая обработка данных.

2.9. Компьютерный анализ.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1.Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности повторяющейся единицы сателлитной ДНК IV крупного рогатого скота Bos taurus.

3.2.Скрининг и анализ мышей, трансгенных по сателлитной ДНК IV крупного рогатого скота.

3.2.1. Результаты скрининга трансгенных животных.

3.2.2. Анализ межгенерационной нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК.

3.2.3. Анализ паттерна метилирования экзогенной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей.

3.3.Молекулярно-генетические исследования трансфектных клеток мышиной эмбриональной тератокарциномы F9.

3.3.1. Анализ соматической нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК в трансфектных клетках F9.

3.3.2. Анализ паттерна метилирования чужеродной минисателлитной ДНК в трансфектных клетках F9.

3.3.3. Результаты гибридизации in situ

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1.Причины выбора для исследования механизмов нестабильности минисателлитов

3,8 т.п.н. фрагмента сателлитной ДНК IV крупного рогатого скота.

4.2.Межгенерационная нестабильность экзогенной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей.

4.2.1. Причины отсутствия продуктов ПЦР амплификации у трансгенных мышей.

4.2.2. Предполагаемые механизмы нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей.

4.2.3. Исследование паттерна метилирования фрагмента экзогенной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей.

4.2.4. Причины фенотипического проявления межгенерационной нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей.

4.3.Исследование нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК в трансфертных клетках эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9.

4.3 Л.Возможные механизмы соматической нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК в трансфектных клетках F9.

4.3.2. Анализ паттерна метилирования фрагмента экзогенной минисателлитной ДНК в трансфертных клетках F9.

4.3.3. Влияние соматической настабильности экзогенной минисателлитной ДНК на жизнеспособность трансфертных клеток F9.

4.4. Период образования нестабильности экзогенной сателлитной ДНК в онтогенезе.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК на трансгенных мышах и трансфектных клетках эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9"

Исследование структурной организации генома эукариот в настоящий момент является одной из центральных проблем современной молекулярной биологии. В частности становится актуальным выяснение роли так называемой "эгоистичной" ДНК, значительная часть которой представлена многочисленной фракцией повторов, которые могут быть идентичными, либо иметь измененный нуклеотидный состав. Повторы могут быть представлены копиями относительно длинных нуклеотидных последовательностей, диспергированных по всему геному, либо образовывать кластеры тандемно повторяющихся единиц относительно простого нуклеотидного состава. К последней группе принадлежат так называемые сателлитные ДНК, среди которых в зависимости от длины и нуклеотидного состава повторяющейся единицы, а также от общего размера кластера различают микросателлиты, минисателлиты и собственно сателлитную ДНК (Jeffreys et al., 1987; Buard,Vergnaud, 1994; Buard, Jeffreys, 1997; Amarger et al., 1998).

He смотря на то, что геномы высших эукариот активно исследуются, однако до сих пор остается нерешенным вопрос о функциях сателлитных ДНК. Высказываются предположения о роли микро- и минисателлитов в регуляции активности генов, сплайсинге мРНК и посттрансляционном процессинге (Perutz et al., 1994; Krahe et al., 1995; Сломинский и др., 1997; Chiurazzi et al., 1998). Пока лишь точно установлена роль сателлитной ДНК в формировании гетерохроматина (Kunze et al., 1996).

Во всем мире в последние годы особое внимание уделяется исследованиям микро- и минисателлитных последовательностей ввиду их роли в возникновении ряда тяжелых нейромышечных и нейродегенеративных наследственных заболеваний человека, а также эпилепсии, инсулин-зависимого диабета, эмбриональной летальности и многих других патологий, обусловленных межгенерационной нестабильностью указанных повторов (Bennett et al., 1995; Kiaris et al., 1995; Mitas, 1997; Virtaneva et al., 1997; Djian, 1998). При этом, по крайней мере, для большинства нейромышечных и нейродегенеративных заболеваний человека, твердо установлена корреляция между общим размером кластера, имеющим тенденцию к последовательному удлинению или укорочению при межгенерационной передаче (динамические мутации), и тяжестью проявления заболевания, т.е. имеет место усиливающаяся при передаче из поколения в поколение степень тяжести и более раннее проявление болезни - так называемая антиципация (Krahe et al., 1995; Wu et al„ 1998).

Однако до сих пор не установлены точные молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе нестабильности всех типов сателлитных ДНК. Предполагают, что изменения микросателлитных последовательностей возникают преимущественно вследствие ошибок при синтезе ДНК за счет репликационного проскальзывания (Richards, Sutherland, 1994; Arnheim, Shibata, 1997; Ohshima, Wells, 1997), тогда как нестабильность минисателлитной ДНК является результатом генной конверсии и неравных обменов (Buard, Vergnaud, 1994; Jeffreys et al., 1994; Haaf, Willard, 1997). Высказываются предположения о возможном существовании прямой или обратной корреляции между метилированием ДНК и нестабильностью повторяющихся последовательностей. С одной стороны для некоторых повторов характерна повышенная вероятность образования вторичных структур ДНК и, следовательно, репликационного проскальзывания, если в них был метилирован цитозин (Zacharias, 1993; 'Mitas et al., 1995), но с другой стороны описаны случаи, когда метилирование ДНК, наоборот, предотвращало рекомбинационные процессы между повторяющимися последовательностями (Hsieh, Lieber, 1992; Liang, Jasin, 1995; Yoder et al., 1997). В свою очередь необычные структуры ДНК, формируемые in vivo во время процессов, связанных с репликацией, репарацией и рекомбинацией, способны повышать вероятность de novo метилирования (Smith et al., 1994; Chen et al., 1995; Smith, Crocitto, 1999). Кроме того, недавно было описано аутосомно-рециссивное наследственное заболевание человека (ICF синдром), при котором, как предполагают, гипометилирование сателлитной ДНК предшествует хромосомной нестабильности (Ji et al., 1997; Qu et al, 1999; Xuetal., 1999).

В настоящее время остается в значительной степени не ясным период формирования изменений высокоповторяющихся последовательностей в онтогенезе млекопитающих. Высказываются предположения, что изменения в микро- и минисателлитных ДНК могут возникать либо во время гаметогенеза (Buard et al., 2000; Stead et al., 2000), либо на ранних стадиях эмбрионального развития (Kelly et al., 1989; Gibbs et al., 1993). Также не понятны механизмы влияния нестабильности минисателлитных и более крупных сателлитных ДНК на возникновение патологий человека, т.к. такие последовательности преимущественно находятся вне генов, связанных с заболеванием. Не известно, возникает ли заболевание в результате нарушений структуры гена, которые обусловлены изменением размера и/или нуклеотидной последовательности сателлитных ДНК, локализованных внутри или за пределами данного гена, либо влияние носит эпигенетический характер. Такая неясность связана как с методическими трудностями исследования крупных повторяющихся последовательностей ДНК, так и отсутствием животных, у которых встречались бы заболевания с симптомами эквивалентными вышеназванным наследственным болезням человека. По-видимому, ответы на указанные вопросы можно будет получить лишь при использовании модельных трансгенных животных и трансфектных эукариотических клеток, несущих в своем геноме экзогенные сателлитные ДНК различного типа.

До сих пор в литературе не описано успешных результатов по получению трансгенных животных, в которых бы воспроизводилась межгенерационная нестабильность минисателлитной и, тем более, сателлитной ДНК. Возможно, это было обусловлено неудачным выбором авторами типа минисателлита, а именно его состава и размера, либо тем, что они не проводили анализ потомства трансгенных животных на эмбриональных стадиях развития, когда могли быть зарегистрированы изменения в нуклеотидной последовательности трансгена. 9

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение механизмов нестабильности минисателлитной ДНК у трансгенных мышей и в трансфектных клетках эмбриональной тератокарциномы мыши F9. Для достижения вышеобозначенной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить трансгенных мышей и трансфектные клетки эмбриональной тератокарциномы мыши F9, несущих в своем геноме 3,8 т.п.н. повторяющуюся единицу сателлитной ДНК1У (Sat) крупного рогатого скота.

2. Провести компьютерный анализ нуклеотидной последовательности Sat-фрагмента для оценки возможного влияния горячих точек рекомбинации и вторичных структур ДНК на нестабильность экзогенной минисателлитной ДНК.

3. Выяснить, существует ли взаимосвязь между нестабильностью чужеродной минисателлитной ДНК и ее метилированием.

4. Определить характер влияния нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК на жизнеспособность трансгенных мышей и трансфектных клеток F9.

5. Сравнить влияние вторичных структур ДНК, горячих точек рекомбинации и метилирования ДНК на межгенерационную и соматическую нестабильность чужеродной минисателлитной ДНК у трансгенных мышей и трансфектных клеток эмбриональной тератокарциномы мыши F9.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Сучкова, Ирина Олеговна

ВЫВОДЫ

2. В клетках эмбриональной тератокарциномы мыши F9, трансфектных по экзогенной минисателлитной ДНК, выявлена соматическая нестабильность этой последовательности.

5. У трансгенных мышей и в трансфектных клетках F9 обнаружена как метилированная, так и неметилированная форма экзогенной минисателлитной ДНК. Метилирование и нестабильности экзогеной минисателлитной ДНК коррелируют не во всех случаях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сучкова, Ирина Олеговна, Санкт-Петербург

1. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т., т.2-Пер.с англ. М.: Мир.-1988,-368с.

2. Баранов B.C., Кузнецова Т.В., Швед Н.Ю., Баранов А.Н. Пренатальная диагностика хромосомных болезней у плода. // Методические рекомендации Минздрава РФ. Санкт-Петербург. - 1995. - с. 4-20.

3. Беридзе Т.Г. Сателлитные ДНК. М.: Наука!- 1982. - 120с.

4. Гайцхоки B.C., Паткин E.J1. Сателлитные ДНК и болезни возможные механизмы: Тринуклеотидные повторы. // Генетика. - 2000.- т. 36. - №7. - стр. 869-886 (а)

5. Гайцхоки B.C., Паткин E.J1. Сателлитные ДНК и болезни возможные механизмы: Нестабильность минисателлитов. // Генетика. - 2000. - т. 36. - №8. (б)

6. Глебов O.K. Генетическая трансформация соматических клеток. Ленинград.: Наука. -1989.-351с.

7. Ивантер Э.В., Коросов А.В. Основы биометрии: введение в статистический анализ биологических явлений и процессов. Петрозаводск.: Изд-во Петрозаводского Гос. Унта. -1992. - 168с.

8. Иллариошкин С.Н., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д. Новый механизм мутации у человека: экспансия тринуклеотидных повторов. // Генетика. 1995. - т. 31. - стр. 14781489.

9. Маниатис Т, Фрич Э, Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. М.: Мир,- 1984. - 480 с.

10. П.Никитина Т.В, Назаренко С.А. Мутации в микросателлитных повторах ДНК и эмбриональная гибель у человека. // Генетика. 2000. -т.36. - №7. - стр.965-971.

11. Плохинский Н.А. Биометрия. М.: Изд-во МГУ. - 1970. - 368с.

12. Попов А.В, Голубков В.И, Смирнов А.Ф, Бадер М, Сучкова И.О., Баранова Т.В, Сорокин А.В, Гайцхоки B.C., Паткин E.J1. Обнаружение трансгенных животных при помощи полимеразной цепной реакции in situ. // Цитология. 1999. - т. 41. - №8. - стр. 693-697. (б)

13. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. М.:Наука,-1986.-432с.

14. Пузырев В.П, Степанов В.А. Патологическая анатомия генома человека. // Новосибирск.: Наука. 1997. - 223 с.

15. Серов O.JI. Перенос генов в соматические и половые клетки. Новосибирск.: Наука. -1985.-120с.

16. Скакун В.Н, Асеев М.В, Шауи А., Баранов B.C. Сравнительный анализ аллельного полиморизма трех коротких тандемных повторов в популяциях русских, узбеков, грузин. // Генетика. 1999. - т. 35. - №9. - стр. 1280-1288.

17. Сломинский П.А, Шадрина М.И, Лимборская С.А. Выявление белка, специфически связывающегося с триплетным повтором типа (CTG)n. // Генетика. 1997. - т. 31. -стр.45- 48.

18. Смирнов А.Ф, Павлова В.А, Слепцов М.К, Стекленев Е.П. Изменчивость сателлитной ДНК II и IV у крупного рогатого скота, некоторых представителей подсемейства bovinae и их гибридов. // Генетика. 1996. - т. 32. - №9. - стр. 1263-1269.

19. Степанов В.А., Пузырев В.П. Анализ аллельных частот семи микросателлитных локусов Y-хромосомы в трех популяциях тувинцев. // Генетика. 2000. - т. 36. - №2. - с.241-248.

20. Федоров Н.А. Структура ДНК и трансформация клеток. М.: Медицина. - 1983. - 160с.

21. Хеймс Б., Хиггинс С. Транскрипция и трансляция. Методы: Пер. с англ. М.: Мир.-1987. - 400с.

22. Adair D.M., Worsham P.L., Hill К.К., Klevytska A.M., Jackson P.J., Friedlander A.M., Keim P. Diversity in a variable-number tandem repeat from Yersinia pestis. // J. Clin. Microbiol. -2000.-vol. 38. -p. 1516-1519.

23. Ainscough J.F-X., Koide Т. Tada M., Barton S., Surani M. A. Imprinting of Igf2 and H-19 from 130kb YAC transgene. // Development. 1997. - vol. 124. - p. 3621-3632.

24. Allen N.D., Cran D.G., Barton S.C., Hettle S. Transgenes as probes for active chromosomal domains in mouse development. // Nature. 1989. - vol. 333. - p. 852-855.

25. Al-Shawi R., Kinnaird J., Burke J., Bishop J.O. Expression of a foreign gene at a line of transgenic mice is modulated by chromosomal position effect. // Mol. Cell Biol. 1990. - p. 1192-1198.

26. Amarger V., Gauguier D., Verle M., Apiou F., Pinton P. Analysis of distribution in the human, pig and rat genomes points toward a general subtelomeric origin of minisatellite structures. // Genomics. 1998. - vol. 52. - p. 62-71.

27. Andersen Т.Н., Nillsson-Tillgren T. A fungal minisatellite. // Nature. 1997. - vol. 387. -p.771.

28. Anderson K.V. Finding the genes that direct mammalian development. // Trends in Genetics.-2000. vol. 16. - №3. - p. 99-102.

29. Antequera F., Bird A. Namber of CpG islands and genes in human and mouse. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - vol. 90. - p. 11995-11999.

30. Armour J.A., Jeffreys A.J. Biology and application of human minisatellite loci. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1992. - vol. 2. - p. 850-856.

31. Arnaud P., Gaubely C., Pelissier Т., Deragon J-M. SINE retroposons can be used in vivo as nucleation centers for de novo methylation. // Mol. Cell. Biol. 2000. - vol. 20. - p. 3434-3441.

32. Arnheim N., Shibata D. DNA mismatch repair in mammals: role in desease and meiosis. // Curr. Opin. Genet. Develop. 1997. - vol. 7. - p. 364-370.

33. Arnold M., Appels R., Shaw S. The heterochromatin of grasshoppers from the Caelidia captiva species complex I. Sequence evolution and conservation in highly repeated DNA family. // Mol.Biol.Evol. 1986. - vol. 3. - №. 1 - p. 29-44.

34. Ashley C.T., Warren S.T. Trinucleotide repeat expansion and human disease. // Annu. Rev. Genet. 1995. - vol. 29. - p. 703-728.

35. Bagasra O., Seshamma Т., Pomerantz R. Polimerase chain reaction in situ: intra cellular amplificatio and detection of HIV-1 proviral DNA and other specific gene. // J. Immunol. Methods. 1993. - vol. 158.-p. 131-145.

36. Barsacchi-Pilone G., Battistoni R., Andronico F. et al. Heterochromatic DNA in Triturus (Amphibia, Urodela). A satellite DNA component of pericentric C-bands. // Chromosoma. -1986. vol. 93. - p. 435-446.

37. Basile M.A., Colacicco A.M., Venezia A., Kanduc D., Capursa A. Lymphosytic DNA hypermethylation in Alzhemer's diseases. // Biochemical Archives. 1997. - vol. 13. - p. 189193.

38. Beckmann J.S., Weber J.L. Survey of human and rat microsatellites. // Genomics. 1992. -vol. 12.-P.627-631.

39. Bednarik D.P. DNA methylation and retrovirus expression. //DNA methylation, Molecular biology and biological significance. / edt. by Jost J.P., Saluz H.P.- Basel, Boston, Berlin: Birkhauser.-1993.-p.300-329.

40. Bennett S.T., Lucassen A.M., Gough S.C.L., Powell E.E., Undlein D.E. Susceptibility to human type 1 diabetes at IDDM2 is determined by tandem repeat variation at the insulin gene minisatellite locus. // Nat. Genet.-1995.-vol.9.-p.284-292.

41. Bertoni L., Attolini C., Faravelli M., Simi S., Giulotto E. Intrachromosomal telomer-like DNA sequences in Chinese hamster. // Mamm. Genome. 1996. - vol. 7. - p. 853-855.

42. Bielinska В., Blaydes S.M., Buiting K., Krajewska-Walasek M., Brannan C.I. De novo deletions of SNRPN exson 1 early human and mouse embryos in a paternal to maternal imprint switch. // Nat.Genet. 2000. - vol. 25. - p. 74-78.

43. Bishop J., Smith P. Mechanism of chromosomal integration of microinjected DNA. // Mol. Biol. Med. 1989. - vol. 6. - p. 283-298.

44. Blake R.D., Wang J.Z., Beauregard L. Repetitive sequences families in Alces alces americana. // J. Mol. Evol. 1997. - vol. 44. - p. 509-520.

45. Boan F., Gonzalez A.I., Rodriguez J.M., Gomez-Marquez J. Molecular characterization of a new human minisatellite that is able to form single-stranded loops in vitro and recognized by nuclear proteins. // FEBS Letters. 1997. - vol. 418. - p. 251-257.

46. Boan F., Rodriguez J.M., Gomez-Marquez J. A non-hypervariable human minisatellite strongly stimulates in vitro intramolecular homologous recombination. // J. Mol. Biol. 1998. -vol. 278. - p. 499-505.

47. Bois P., Collick A., Brown J. et al. Human minisatellite MS32 (DIS8) displays somatic but not germline instability in transgenic mice // Human. Mol. Genet. 1997. - vol. 6. - p. 1565-1571.

48. Bois P., Stead J.D.H., Bakshi S., Williamson J., Neumann R., Moghadaszadeh В., Jeffreys A.J. Isolation and characterisation of mouse minisatellites. // Genomics. 1998. - vol. 50. - p. 317330.

49. Bonaccorsi S., Gatti M., Brendt K. et al. Transcription of asatellite DNA in two Y-chromosome loops of Drosophila melanogaster. // Chromosoma. 1992. - vol. 99. - p. 260266.

50. Bonaccorsi S., Lohe A. Fine mapping of satellite DNA sequences along the Y chromosome of Drosophila melanogaster: relationships between the satellite sequences and fertility factors. // Genetics. 1991. - vol. 129. - p. 177-189.

51. Bonnerot C., Grimbert G., Briand P., Nicolas J-F. Patterns of expression of position-dependent integrated transgenes in mouse embryo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - vol. 87. - p. 6331-6335.

52. Buard J., Vergnaud G. Complex recombination events at the hypermutable minisatellite CEB1 (D2S90). // EMBO J. 1994. - vol. 13. - p. 3293-3210.

53. Buard J., Jeffreys A.J. Big, bad minisatellites. //Nat. Genet. 1997. - vol. 15.-p.327-328.

54. Buard J., Bourdet A., Yardley J., Dubrova Y., Jeffreys A.J. Influences of array size and homogeneity on minisatellite mutation. // EMBO J. 1998. - vol. 17. - №12. - p. 3495-3502.

55. Buard J., Collick A., Brown J., Jeffreys A.J. Somatic versus germ line mutation processes at minisatellite CEB1 (D2S90) in human and transgenic mice. // Genomics. 2000. - vol. 65. - p. 95-103.

56. Buckland R.A. Sequence and evolution of related bovine and carpine satellite DNAs: Identification of a short DNA sequence potentially involved in satellite DNA amplification. // J. Mol. Biol. 1985. - vol. 186. - p. 25-30.

57. Burright E.N, Clark H.B, Servadio A. et al. SCA1 transgenic mice: a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleitide repeat. // Cell. 1995. - vol. 82.-p. 937-958.

58. Butner K.A, Lo C.W. High frequency DNA rearrangements associated with mouse centromeric satellite DNA. // J. Mol. Biol. 1986. - vol. 187. - p. 547-556.(a)

59. Carlson M, Brutlag D. A gene adjacent to satellite DNA in Drosophila melanogaster. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - vol. 75. - p. 5898-5902.

60. Carotti D, Funiciello S, Palitti F. Influence of pre-existing methylation on the de novo activity of eukaryotic DNA methyltransferase. // Biochemestry. 1998. - vol. 37. - p. 1101-1108.

61. Castancia M, Pickard B, Kelsey G, Reik W. Imprinting mechanisms. // Genome Res. 1998. -vol. 8.-p. 881-900.

62. Chen X, Marriapan S.V.S, Moyzis R.K, Bradbury E.M, Gupta G. Hairpin induced slippage and hypermethylation of the fragile X DNA triplets. // J. Biomolecular structure and dynamics. 1998. - vol. 15. - №4. - p. 745-756.

63. Chiurazzi P, Pomponi G, Willemsen R, Oostra B.A, Neri G. In vitro reactivation of the FMR1 gene involved in fragile X syndrome. // Hum. Mol. Genet. 1998. - vol. 7. - p. 109-113.

64. Collinge J. Human prion diseases and bovine spongiform encephalopathy (BSE). // Human Mol. Genet. 1997. - vol. 6. - p. 699-705.

65. Colot V., Rossignol J-L. Eukaryotic DNA methylation as an evolutionary device. // BioEssay. -1999.-vol. 21. -p. 402-411.

66. Cossee M., Schmitt M., Campuzano V. et al. Evolution of the Friedreich's ataxia trinucleotide repeat expansion: Founder effect and premutations. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. -vol. 94. - p. 7452-7457.

67. Counts J.L., Goodman J.I. Alterations in DNA methilation may play a variety of roles in carcinogenesis. // Cell. 1995. - vol. 83. - p. 13-15.

68. Cryderman D., Cuaycong M., Elgin S., Wallrath L. Characterization of sequences assotiated with position-effect variegetion at pericentric sites in Drosophila heterochromatin. // Chromosoma. 1998. - vol. 107. - p. 277-285.

69. Csink A.K., Henikoff S. Something from the evolution and utility of satellite repeats. // Trends in Genetics. 1998. - vol. 14. - №5. - p. 200-204.

70. Dallas J.F. Detection of DNA fingerprints of cultivated rice by hybridization with a human minisatellite probe. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - vol. 85. - p. 6831-6835.

71. Darlow J.W., Leach D.R.F. Secondary structures in d(CGG) and d(CCG) repeat tracts. // J. Mol. Biol. 1998. - vol. 275. - p. 3-16.

72. Debrauwere H., Buard J., Tessier J., Aubert D, Vergnaud G., Nicolas A. Meiotic instability of human minisatellite СЕВ I in yeast requires DNA double-strand breaks. // Nat. Genet. 1999. -vol. 23.-p. 367-371.

73. Diaz M., Barsacchi-Pilone G., Mahon K. et al. Transcripts from both strands of a satellite DNA occur on lampbrush chromosome loops of the newt Natophtthalmus. // Cell. 1981. - vol. 24. -p.649-659.

74. Dimitri P. Constitutive heterochromatin and transposable elements in Drosophila melanogaster. // Genetics. 1997. - vol. 100. - p. 85-93.

75. Djian P. Evolution of simple repeats in DNA and their relation to human disease. // Cell. -1998. vol. 94. - p. 155-160.

76. Dobie K.W., Mehtali M., McClenaghan M., Lathe R. Variegated gene expression in mice. // Elsevier Trends J. 1997. - vol. 13. - №4. - p. 127-130.

77. Doerfler W., Schubbert R., Heller H., Kammer C., Remus R et al. Integration of foreign DNA and its consequences in mammalian systems. // Trends in Biotechnology. 1997. -vol. 15. - p. 297-301.

78. Dorer D.R. Do transgene arrays form heterochromatin in vertebrates. // Transgen. Res. 1997. -vol. 6.-p. 3-10.

79. Dorer D.R., Henikoff S. Transgene repeat arrays interact with distant heterochromatin and cause silencing in cis and trans. // Genetics. 1997. - vol. 147.

80. Dronkert M.L.G., Beverloo H.B., Johnson R.D., Jasin M. Mouse RAD54 affects DNA double-strand break repair and sister chromatid exchange. // Moll.Cell Biol. 2000. - vol. 20.-p. 31473156.

81. Dunham I., Lengauer C., Cremer T. et al. Rapid generation of chromosome-specific alphoid DNA probes using the polymerase chain reaction. // Hum. Genet. 1992. - vol. 88. - p. 457462.

82. Eichler E.E., Holden J.J.A., Popovich B.W. et al. Length of uninterrupted CGG repeats determines instability in the FMR1 gene. //Nat. Genet. 1994. - vol. 8. - p. 88-94.

83. Epplen J.T., Maueler W., Santos E.J.M. On GATAGATA and other "junk" in the barren stretch of genomic desert. // Cytogenet. Cell Genet. 1998. - vol. 80. - p. 75-82.

84. Epstein L., Makoa K, Gall J. Transcription of satellite DNA in the newt. // J. Cell. Biol. 1986. -vol. 103.-№4.- p. 1137-1147.

85. Erickson R., Wolfe J., Darling S. et al. Cloning centromeric sequences from the human Y chromosomes. // Amer. J. Hum.Genet. 1984. - vol. 36. - № 4. - p. 136.

86. Erlich A.H. PCR Technology. Principles and applications for DNA amplification. N-Y., London, Tokyo, Melburn, Hong kong.: M. Stockton press. 1989. - 241 p.

87. Fanti L., Dorer D.R., Barloco M., Henikoff S., Pimpinelli S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. // Chromosoma. 1998. - vol. 107. - p. 286-292.

88. Fasullo M.T., Davis R.W. Recombination substrates designed to study recombination between unique and repetitive sequences in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - vol. 84. - p. 6215-6219.

89. Freudenreich C.T., Kantrow S.M., Zakian V. A. Expansion and length-dependent fragility of CTG repeats in yeast. // Science. 1998. - vol. 279. - p. 853-856.

90. Fry M., Loeb L. A. The fragile X syndrome d(CGG)n nucleotide repeats form a stable tetrahelical structure. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1994. - vol. 91. - p. 4950-4954.

91. Gacy A.M., McMurray T.M. Influence of hairpins on template reannealing at trinucleotide repeat duplexes: a model for slipped DNA. // Biochemistry. 1998. - vol. 37. - p. 9426-9434.

92. Galli A., Schiestl R.H. Effects of DNA double-strand and single-strand breaks on intrachromosomal recombination events in cell-cycle-arrested yeast cells. // Genetics. 1998. -vol. 149.-p. 1235-1250.

93. Georges M., Lequarre A-S., Castelli M. et al. DNA fingerprinting in domestic animals using four different minisatellite probes. // Cytogenet. Cell Genet. 1988. - vol. 47. -p. 127131.

94. Georges M., Lathrop M., Hilbert P., Marcotte A., Schwers A., Hanset R. On the use of DNA fingerprints for linkage studies in cattle. // Genimics.-1990.-vol.6.-p.461-474.

95. Gibbs M., Collick A., Kelly R.G., Jeffreys A.J. A tetranucleotide repeat mouse minisatellite displaying substantial somatic instability during early preimplantation development. // Genomics. 1993. - vol. 17. - p. 121-128.

96. Gordenin D.A., Kunkel T.A., Resnick M.A. Repeat expansion all in a flap. // Nat.Genet. -1997.-vol. 16.-p. 116-118.

97. Gordon J.W., Scandos G.A., Plotkin D.J., Barbosa J.A., Ruddle F.H. Genetic transformation of mouse embryo by microinjection of purified DNA. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. - vol. 77. - p. 7380-7384.

98. Gourdon G., Radvanyi F., Lia A-S. et al. Moderate intergenenerational and somatic instability of a 55-CTG repeat in transgenic mice. // Nat.Genet. 1997. - vol. 15. - p. 190192.

99. Grady D., Ratliff R., Robinson D. et al. Hihgly conserved repetitive DNA sequences are present at human centromeres. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - vol. 89. - p. 1695-1699.

100. Green M, Krontiris T.G. Allelic variation of reporter gene activation by the minisatellite. // Genomics. 1993. - vol. 17. - p. 429-434.

101. Guy L-G, Kothary R, Wall L. Position effects in mice carrying a lacZ transgene in cis with the (3-globin LCR can be explained by a graded model. // Nucl. Acids Res. 1997. - vol. 25. - p. 4400-4407.

102. Haaf T, Warburton P, Willard H. Integration of human a satellite DNA into simian chromosomes: centromere protein binding and disruption of proper chromosomal segregation. // Cell. 1992. - vol. 70. - p. 681-696.

103. Haaf T, Willard H.F. Chromosome-specific a-satellite DNA from the centromere of chimpanzee chromosome 4. // Chromosoma. 1997. - vol. 106. - p. 226-232.

104. Haber J.E. Exploring the pathways of homologous recombination. // Current Opinion Cell Biol. 1992. - vol. 4. - p. 401-412.

105. Haber J.E. Recombination: frank view of exchanges and vice versa. // Current Opinion in Cell Biology. 2000. - vol. 12. - p. 286-292.

106. Hamada H, Petrino M.G, Kakunaga T. A novel repeated element with Z-DNA-forming potential is widely found in evolutionarily diverse eukaryotic genomes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - vol. 79. - p. 6465-6469.

107. Hamada T, Sasaki H, Seki R, Sasaki Y. Mechanism of chromosomal integration of transgenes in microinjected mouse eggs: sequence analysis of genome-transgene and transgene-transgene junctions at two loci. // Gene. 1993. - vol. 128. - p. 197-202.

108. Hancock J.M. Simple sequences and the expanding genome. // BioEssays. 1996. - vol. 18. - №5. - p. 421-425.

109. Hanotte О., Burke Т., Armour J.A.L. Jeffreys A.J. Hypervariable minisatellite DNA sequences in the Indian peafowl Pavo cristatus. // Genomics. 1991. - vol. 9. - p. 587-597.

110. Harrington J.J., Bokkelen G.V., Mays R.W., Gustashaw K., Willard H.F. Formation of de novo centromeres and construction of first-generation human artificial microchromosomes. // Nat. Genet. 1997. - vol. 15. - p. 345-355.

111. Harris S., Moncrieff C., Jhonson K. Myotonic distrophy: will the real gene please step forward. // Hum. Mol. Genet. 1996. - vol. 5. - p. 1417-1423.

112. He Q., Cederberg H., Armour J.A.L., May C.A. Rannug U. Cis-regulation of inter-allelic exchanges in mutation at human minisatellite MS205 in yeast. // Gene. 1999. - vol. 232. - p. 143-153.

113. Heartlein M.W., Knoll J.H.M., Latt S.A. Chromosome instability associated with human alphoid DNA transfected into Chinese hamster genome. // Moll. Cell. Biol. 1988. - p. 36113618.

114. Heim S., Mitelman F. Tumors of the breast, in: Cancer Cytogenetics. Wiley-Liss.-New York. - 1995.-p. 369-388.

115. Hendrich В., Bird A. Identification and characterization of family of mammalian methyl-CpG binding proteins. // Mol. Cell Biol. 1998. - vol. 18. - p. 6538-6547.

116. Higgins M., Wang H., Shtrounos L. et al. Organization of repetitive human 1,8 kb sequence localized in the heterochromatin of chromosome 15. // Chromosoma. 1985. - vol. 93. - p. 7786.

117. Holmes A.M., Haber J.E. Double-strand break repair in yeast requires both leading and lagging strand DNA polimerases. // Cell. -1999. vol. 96. - p. 415-424.

118. Hsieh C-L., Lieber M.R. CpG methylated minichromosom.es become inaccessible for V(D)J recombination after undergoing replication. // EMBO J. 1992. - vol. 11. - p. 315-325.

119. Hsu D-W., Lin M-J., Lee T-L., Wen S.C., Chen X., Shen C.K.J. Two major forms of DNA(cytosine-5)methyltansferase in human somatic tissues. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1999.-vol. 96.-p. 9751-9756.

120. Imai H., Nakagama H., Komatsu K., Shiraishi Т., Fukuda H. Minisatellite instability in severe combined immunodeficiency mouse cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - vol. 94.-p. 10817

121. Jaworski A., Rosche W.A., Gellibolian R, Kang S. et al. Mismatch repair in Escherichia coli enhances instability of (CTG)n triplet repeats from human hereditary diseases. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - vol. 92. - p. 11019-11023.

122. Jeanpierre M., Turleau C., Aurias A., Prieur M., Ledeist F., Fischer A., Viegas-Pequignot E. An embryonic-like methylation pattern of classical DNA is observed in ICF syndrome. // Hum. Mol. Genet. 1993. - vol. 2. - p. 731-735.

123. Jeffreys A.J., Wilson V., Kelly R. et al. Mouse DNA fingerprints: Analysis of chromosome localization and germ-line stability of hypervariable loci in recombinant inbred strains. //Nucl. Acids Res. 1987. - vol. 15. - p. 2823-2836.

124. Jeffreys A.J., Neumann R., Wilson V. Repeat units sequence variation in minisatellites: a novel soufce of DNA polymorphism for studying variation and mutation by single molecule analysis. // Cell. 1990. - vol. 60. - p. 473-485.

125. Jeffreys A.J., MacLeod A., Tamaki K, Neil D.L., Monckton D.G. Minisatellite repeats coding as a digital approach to DNA typing. //Nature. 1991. - vol. 354. - p. 204-209.

126. Jeffreys A.J., Tamaki K., MacLeod A., Monckton D.G., Neil D.L., Armour J.A.L. Complex gene conversion events in germ line mutation at human minisatellite. // Nat. Genet. -1994.-vol. 6.-p. 136-145.

127. Jeffreys A.J., Neuman R. Somatic mutation processes at a human minisatellite. // Hum. Mol. Genet. 1997. - vol. 6. - №1. - p. 129-136.

128. Ji W., Hernandez R„ Zhang X-Y., Qu G-Z., Frady A., Varela M., Ehrlich M. DNA demethylation and pericentromeric rearrangements of chromosome 1. // Mutat. Res. 1997. -vol.379.-p. 33-41.

129. Jodice C., Frontall M., Persichetti F.et al. Effect of trinucleotide repeat length and parental sex on phenotype variation in Spinocerebellar Ataxia 1 // Amer. J. Hum. Genet. 1994. - vol. 54-p. 959-965.

130. John В., Miclos G. Functional aspects of satellite DNA and heterochromatin. // Int. Rev. Cytol. 1979.-vol. 50.-p. 1-114.

131. Johnson K.R., Sweet H.O., Donahue L.R., Ward-Bailey P., Davisson M.T. A new spontaneous mouse mutation of Hoxdl3 with a polyalanine expansion and phenotype similar to human synpolydactyly. // Hum. Mol. Genet. 1998. - vol. 7. - p. 1033-1038.

132. Jones P.L., Veenstra G.J.C., Wade RA., Vermaak D., Kass S.U. et al. Methylation DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription. // Nat. Genet. 1998. - vol. 19. -p. 187-191.

133. Jones P.A. The DNA methylation paradox. // Trends in Genetics 1999. - vol. 15. - №1. -p. 34-37.

134. Julier C., Gouyon В., Georges M., Guenet J-L., Nacamura Y., Avner P. Minisatellite linkage maps in the mouse by cross-hybridization with human probes containing tandem repeats. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - vol. 87. - p. 4585-4589.

135. Kafri Т., Gao X., Razin A. Mechanistic aspects of genome-wide demethylation in the preimplantation mouse embryo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - vol. 90. - p. 1055810662.

136. Kato S., Anderson A., Camerini-Otero D. Foreign DNA introduced by calcium phosphate is integrated into repetitive DNA elements of the mouse L cell genome. // Mol. Cell Biol. -1986.-vol. 6.-p. 1787-1795.

137. Kelly R., Bulfield G., Collick A., Gibbs M., Jeffreys A.J. Characterization of highly unstable mouse minisatellite locus: evidence for somatic mutation duiung early development. // Genomics. 1989. - vol. 5. - p. 844-856.

138. Keshet I., Lieman-Hurwitzi J., Cedar H. DNA methylation affects the formation of active chromatin. // Cell. 1986. - vol. 44. - p. 535-543.

139. Kiaris H., Ergazaki M., Spandidos D. Instability at the H-ras minisatellite is associated with the spontaneous abortion of the embryo. // Biochem. Bioph. Res. Comm. 1995. - vol. 214. -№3. - p. 788-792.

140. Kipling D., Ackford H.E., Taylor B.A., Cooke H.J. Mouse minor satellite DNA genetically maps to the centromere and is phisically linked to teh proximal telomere. // Genomics. 1991. -vol. 11.-p. 235-241.

141. Klement I.A., Skinner P. J., Kaytor M.D.et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation: role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. // Cell. 1998. -vol. 95.-p. 41-53.

142. Koob M.D., Moseley M.L., Schut L.J. et al. An untranslated CTG expansion causes a novel form of spinocerebellar ataxia SCA8. // Nat. Genet. 1999. - vol. 21. - p. 379-384.

143. Korneluk R.G. Narang M.A. Anticipating anticipation. // Nat. Genet. 1997. - vol. 15. - p. 119-120.

144. Krahe R, Ashizawa T, Abbruzzese C, Roedei E, Carango P, Giacanelli M. Effect of myotonic dystrophy trinucleotide repeat expansion on DMPK transcription and processing. // Genomics. 1995. - vol. 28. - p. 1-14.

145. Krontiris T.G, Devlin B, Karp D.D.et al. An association between the risk of cancer and mutation in the HRAS minisatellite locus. //N. Engl. J. Med. 1993. - vol. 329. - p. 517-523.

146. Kroutil L.C, Register K, Bebenek K, Kunkel T.A. Exonucleolytic profreading during replication of repetitive DNA. // Biochemistry. 1996. - vol. 35. - p. 1046-1053.

147. Kunst C.B, Warren S.T. Cryptic and polar variation of the fragile X repeat could result in redisposing normal alleles. // Cell. 1994. - vol. 77. - p. 853-861.

148. Kunze B. Copy numbers of a clustered long-range repeat determined С band stainig. // Cytogenet.Cell Genet. 1996. - vol. 73. - p. 86-91.

149. Laayoun A, Smith S.S. Methylation of slipped duplexes, snapbacks and cruciforms by human DNA (cytosine-5)methyltransferase. // Nucl. Acids Res. 1995. - vol. 23. - p. 15841589.

150. Lafreniere R.G, Rochefort D.L, Chretien N. et al. Unstable insertion of the 5' flanking region of the cysrtatin В gene is the most common mutation in progressive myoclonus epilepsy type 1, EPM1. //Nat. Genet. 1997. - vol. 15. - p. 298-302.

151. Lambert S, Saintigny Y, Delacote F, Amiot F, Chapcot B. Analysis of intrachromosomal homologous recombination in mammalian cells, using tandem repeat sequences. // Mut. Res.-1999.-vol. 433.-p. 159-168.

152. Lau Y, Kau Y. Isolation of the transcribed sequence from the Y chromosome. // Amer. J. Hum. Genet. 1984. - vol. 4. - p. 144.

153. Lavedan C, Grobczyk E, Usdin K, Nussbaum R.L. Long uninterrupted CGG repeats within the first exon of the human FMR1 gene are not intrinsically unstable in transgenic mice. // Genomics. 1998. - vol. 50. - p. 229-240.

154. Lei M., Oh S.P., Okano M., Jutteemann R., Gass K.A., Li E. De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells. // Development. 1996. - vol. 122. -p. 3195-3205.

155. Levinson G., Gutman G.A. Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution. // Mol. Biol. Evol. 1987. - vol. 4. - p. 203-221.

156. Li E., Bestor Т.Н., Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene resalts in embryonic lethality. // Cell. 1992. - vol. 69. - p. 915-926.

157. Liang F., Jasin M. Studies on the influence of cytosine methylation on DNA recombination and endjoining in mammalian cells. // J. Biol. Chem. 1995. - vol. 270. - p. 23838-23844.

158. Lin I.G., Tomzynski T.J., Ou Q., Hsieh C-L. Modulation of DNA binding protein affinity directly affects target site demethylation. //Moll. Cell Biol. 2000. - vol. 20. - p. 2343-2349.

159. Lohe A., Hilliker A., Roberts P. Mapping simple repeated DNA sequences in heterochromatin of D. melanogaster. //Genetics. 1993. - vol. 137. - p. 1149-1174.

160. Lucassen A.M. Susceptibility to Insulin dependent diabetes mellitus maps to a 4.1 kb segment of DNA spanning the insulin gene and associated VNTR. // Nat.Genet. 1993. - vol. 4.-p. 305-310.

161. Mahon K.A., Overbeek P.A., Westphal H. Prenatal lethality in a transgenic mouse line is the resalt of a chromosomal translocation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - vol. 85. - p. 1165-1168.

162. Mangiarini L., Sathasivam., Seiler M. et al. Exon 1 of the HD gene with an expanded С AG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. // Cell. 1996.-vol. 87.-p. 493-506.

163. Manuelidis L. Heterochromatic features of an 11 -megabase transgene in brain cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1991. vol. 88. - p. 1049-1053.

164. Maraschio P., Cortinovis M., Dainotti E., Tupler R., Tiepolo L. Interphase cytogenetics of the ICF syndrome. // Ann. Hum. Genet. 1992. - vol. 56. - p. 273-278.

165. Mark W.H., Signorelli K., Blum M., Kwee L., Lacy E. Genomic structure of the locus associated with an insertional mutation in line 4 transgenic mice. // Genomics. 1992. - vol. 13. -p. 159- 166.

166. Martorell L., Monckton D.G., Gamez J.et al. Progression of somatic CTG repeats lenght heterogeneity in the blood cells of myotonic dystrophy patients. // Hum. Mol. Genet. 1998. -vol.7.-p. 307-312.

167. Mayer-Jung C., Moras D., Timsin Y. Hydration and recognition of methylated CpG steps in DNA. // EMBO J. 1998. - vol. 17. - p. 2709 - 2718.

168. McFarlane M., Wilson J.B. A model for the mechamism of precise integration of a microinjected transgene. // Transgen. Res.-1996. vol. 5. - p. 171-177.

169. McMurray C.T. DNA secondary structure: A common and causative factor for expansion in human disease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - vol. 96. - p. 1823-1825.

170. Meselson M.S., Radding C.M. A general model for genetic recombination. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. - vol. 72. - p.358-361.

171. Miniou P., Jeanpierre M., Blanquet V., Sibella V., Bonneau D et al. Abnomal methylation pattern in constitutive and facultative (X inactive chromosome) heterochromatin of ICF patients. // Hum. Mol. Genet. 1994. - vol. 3. - p. 2093-2102.

172. Mitas M., Yu A., Dill J., Haworth I.S. The trinucleotide repeat sequence d(CGG)ni5 forms a heat-stable hairpin containing Gsyn-Gantl base pairs. // Biochemistry. 1995. - vol. 34. - p. 12803-12811.

173. Mitas M. Trinucleotide repeats associated with human disease. // Nucl. Acids Res. 1997. -vol. 25. - p. 2245-2253.

174. Monckton D.G., Coolbaugh M.I., Ashizawa K.T.et al. Hypermutable myotonic dystrophy CTG repeats in transgenic mice. //Nat.Genet. 1997. - vol. 15. - p. 193-196.

175. Monk M., Adams R.P., Rinaldi A. Decrease in DNA methylase activity during preimplantation development in the mouse. // Development. 1991. - vol. 112. - p. 189-192.

176. Morin P.A., Mahboubi P., Wedel S., Rogers J. Rapid screening and comparison of human microsatellite markers in baboons: allele size is conserved, but allelle number is not. // Genomics. 1998. - vol. 53. - p. 12-20.

177. Murti J.R., Bumbulis M., Schimenti J.C. Gene conversion between unliked sequences in the germline of mice. // Genetics. 1994. - vol. 137. - p. 837-843.

178. Nag D.K., Kurst A. A 140-bp-long palindromic sequence induces double-strand breaks during meiosis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. // Genetics. 1997. - vol. 146. - p. 835847.

179. Nasar F., Jankowski C., Nag D.K. Long palindromic sequences induce double-strand breaks during meiosis in yeast. // Moll.Cell. Biol. 2000. - vol. 20. - p. 3449-3459.

180. Nilsson E., Lendahl U. Transient expression of a human P-actin promoter/lacZ gene introduced into mouse embryos correlates with a low degree of methylation. // Mol. Reproduc. Devel. 1993. - vol. 34. - p. 149-157.

181. Noguiez P., Jaulin C., Plaz F., Khelil M., Viegas-Pequignot E., Amor-Gueret M. No relationship between genetic instability in Bloom's syndrome and DNA hypomethylation of some major repetitive sequences. // Hum.Genet. 1993. - vol. 92. - p. 57-60.

182. O'Neill R.J.W., O'Neill M.J., Graves J.A.M. Undermethylation associated with retroelement activation and chromosome remodelling in an interspecific mammalian hybrid. // Nature. 1998. - vol. 393. - p. 68-72.

183. Ohlsson R., Tycko В., Sapienza C. Monoallelic expression: 'there can only be one'. // Trends in Genetics. 1998. - vol. 14. - p. 435-438.

184. Ohshima K., Wells R.D. Hairpin formation during DNA synthesis primer realignment in vitro in triplet repeats sequences from human hereditary disease genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - vol. 272. - p. 16798-16806.

185. Okano M., Xie S., Li E. Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine5)methyltransferases. //Nat. Genet. 1998. - vol. 19. - p. 219-220.

186. Oostra B.A., Willems P,J. A fragile gene. // BioEssay. 1995. - vol. 17. - p.941-947.

187. Panning В., Dausman J., Jaenisch R. X chromosome inactivation is mediated by Xist RNA stabilization. // Cell. 1997. - vol. 90. - p. 907-916.

188. Paques F., Leung W-Y., Haber J.E. Expansions and contractions in tandem repeat indused by double-strand break repair. // Mol. Cell Biol. 1998. - vol. 18. - p. 2045-2054.

189. Parsons R., Li G-M., Longley M.J., Fang W. et al. Hypermutability and mismatch repair deficiency in RER+ tumor cells. // Cell. 1993. - vol. 75. - p. 1227-1236.

190. Patkin E.L., Kustova M.E., Dyban A.P. Spontaneous sister-chromatids differentiation (SCD) and sister-chromatid exchanges (SCEs) in chromosomes of mouse blastocyst. // Cytogen. Cell Genet. 1994. - vol. 66. - p. 31-32.

191. Perret J., Shia Y-C., Fries R., Vassart G., Georges M. A polymorphic satellite sequence maps to the pericentric region of the bovine Y chromosome. // Genomics. 1990. - vol. 6. - p. 482-490.

192. Perutz M.F., Johnson Т., Suzuki M., Finch J.T. Glutamine repeats as polar zippers: their possible role in inherited neurodegenerative disease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -vol. 91.-p. 5355-5358.

193. Petruska J. Hartenstine MJ. Goodman MF. Analysis of strand slippage in DNA polymerase expansions of CAG/CTG triplet repeats associated with neurodegenerative disease. // J. Biol. Chem. 1998. - vol. 73. - p. 5204-5210.

194. Phelan C.M., Rebbeck T.R., Weber B.I. et al. Ovarian cancer risk in BRCA1 carriers is modified by the HRAS1 variable number of tandem repeat (VNTR) locus. // Nat.Genet. -1996.-vol. 12.-p. 309-311.

195. Promega protocols and applications guide. Promega, Medison, USA. 1990. - p. 40-41.

196. Qu G., Dubeau L., Narayan A., Yu M.C., Ehrlich M. Satellite DNA hypomethylation vs. overal genomic hypomethylation in ovarian epithelial tumors of different malignant potential. //Mut. Res. 1999. - vol. 423(1-2). - p. 91-101.

197. Ranum L., Rasmussen P.F., Benzow K.A.et al. Genetic mapping of a second myotonic dystrophy locus. //Nat. Genet. 1998. - vol. 19. - p. 196-198.

198. Razin A., Cedar H. DNA methilation and embryogenesis. // DNA methylation. Molecular biology and biological significance. / edt. by Jost J.P., Saluz H.P.- Basel, Boston, Berlin: Birkhauser. 1993. - p. 343-357.

199. Reddy P.H., Williams M., Charles M.et al. Behavioural abnormalities and selective neuronal loss in HD transgenic mice expressing mutated full-length HD cDNA. // Nat.Genet. -1998. vol. 20. - p. 198-202.

200. Reddy S., Smith D.B., Rich M. et al. Mice lacking the myotonic dystrophy protein kinase develop a late onset progressive myopathy. //Nat. Genet. 1996. - vol. 13. - p. 325-334.

201. Reis R.J.S., Srivastava A., Beranek D.T., Goldstein S. Human alphoid family of tandemly repeated DNA: sequence of cloned tetrameric fragments and analysis of familial divergence. // J. Mol. Biol. 1985.-vol. 186. - p. 31-41.

202. Reyniers E., Vits L., De Boulle K. et al. The full mutation in the FMR-1 gene of fragile X patients is absents in their sperm. // Nat.Genet. 1993. - vol. 3. - p. 143-146.

203. Richards R.I. and Sutherland, G.R. Dynamic mutation: A new class of mutation causing human disease. // Cell. 1992. - vol. 70. - p. 709-712

204. Richards R.I., Sutherland G.R. Simple repeat DNA is not replicated simply. // Nature Genet. 1994. - vol. 1. - p. 257-260.

205. Richards R.I., Sutherland G.R. Dynamic mutation: possible mechanism and significance in human disease. // Trends in Biochem. Sci. 1997. - vol. 22. - p. 432-436.

206. Richardson C., Moynahan M.E., Jasin M. Double-strand breaks repair by interchromosomal recombination: supression of chromosomal translocations. // Genes and Development. 1998. - vol. 12. - p. 3831-3842.

207. Robertson G., Garrick D., Wu W., Kearns M., Martin D., Whitelaw E. Position-dependent varigation of globin transgene expression in mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - vol. 92. - p. 5371-5375.

208. Robertson K.D., Uzvolgyi E., Liand G., Talmadge C., Sumegi J., Jones P.A. The human methyltransferases (DNMTs)l, 3a, 3b: coordinate mRNA expresion in normal tissues and overexpression in tumors. // Nucl. Acids Res. 1999. - vol. 27. - p. 2291-2298.

209. Rothuizen J., Wolfswinkel J., Lenstra J.A. The incidence of mini- and microsatellite repetitive DNA in the canine genome. // Theor. Appl. Genet. 1994. - vol. 89. - p. 403-406.

210. Royle N.J., Clarkson R.E., Wong Z., Jeffreys A.J. Clustering of hypervariable minisatellites in the proterminal regions of human autosomes. // Genomics. 1988. - vol. 3. - p. 352-360.

211. Saluz H., Jost J-P. Major techniques to study DNA methylation. // DNA methylation. Molecular biology and biological significance. / edt. by Jost J.P., Saluz H.P.- Basel, Boston, Berlin: Birkhauser. 1993. - p. 11-26.

212. Samadashvily G.M. Trinucleotide repeats affect DNA replication in vivo. // Nat.Genet. -1997,- vol. 17.-p. 298-304.

213. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory mannual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 1989. - vol. 1. - p. 182-184.

214. Saudou F., Finkbeiner S., Devys D., Greenberg M.E. Huntington acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranulear inclusions. // Cell. 1998.-vol. 95.-p. 56-66.

215. Schmidt-Kastner P.K., Jardine k., Cormier M., McBurney M.W. Genes transfected into embryonal carcinoma stem cells are both lost and inactivated at high frequency. // Somat. Cell Mol. Genet. 1996. - vol. 22. - p. 383-392.

216. Shemer R., Birger Y., Dean W.L., Reik W., Rigges A.D., Rasin A. Dynamic methylation adjustment and counting as part of imprinting mechanisms. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996.-vol. 93.-p. 6371-6376.

217. Shulman M.J., Collins C., Connor A., Read L.R., Baker M.D. interchromosomal recombination is suppressed in mammalian somatic cells. // EMBO J. 1995. - vol. 14. - p. 4102-4107.

218. Simi S, Attolini C, Giulotto E. Intrachromosomal telomeric repeats and stabilization of truncated chromosomes in V79 Chinese hamster cells. // Mut. Res. 1998. - vol. 397. - p. 229233.

219. Simmen M.W, Leitgeb S, Charlton J, Jones S.J.M, Bird A. Nonmethylated transposable elements and methylated genes in a Chordate genome. // Science. 1999. - vol. 283. - p. 11641167.

220. Singer R.H. Triplet-repeat transcripts: a role for RNA in disease. // Science. 1998. - vol. 280. - p. 696-697.

221. Skowronski J, Plucienniczak A, Bednarek A, Jaworski J. Bovine 1.709 satellite: recombination hotspots and dispersed repeated sequences. // J. Mol. Biol. 1984. - vol. 177. -p. 399-416.

222. Smith G.R, Kunes S.M, Schultz D.W, Taylor A., Triman K.L. Structure of Chi hotspots of generalized recombination. // Cell. 1981. - vol. 24. - p. 429-436.

223. Smith S.S, Laayoun A, Lingeman R.G, Baker D.J. Riley J. Hypermethylation of telomere-like foldbacks at codon 12 of the human c-Ha-ras gene and the trinucleotide repeat of the FMR1 gene of fragile X. // J. Mol. Biol. 1994. - vol. 243. - p. 143-151.

224. Smith S.S, Baker D.J. Stalling of human methyltransferase at single-strand conformers from the Huntington's locus. // Bioch. Bioph. Res. Comm. 1997. - vol. 234. - p. 73-78.

225. Smith S.S, Crocitto L. DNA methylation in eukaryotic chromosome stability revisited: DNA methyltransferase in the management of DNA conformation space. // Molecular Carcinogenesis. 1999. - vol. 26. - p. 1-9.

226. Sprecher C.J, Puers C, Lins A.M., Schumm J.W. General approach to analysis of polymorphic short tandem repeat loci. // BioTechniques. 1996. - vol. 20. - p. 266-276.

227. Spruck C.H., Rideout W.M., Jones P.A. DNA methylation and cancer. // DNA methylation. Molecular biology and biological significance. / edt. by Jost J.P., Saluz H.P.- Basel, Boston, Berlin: Birkhauser. 1993. - p. 487-509.

228. Stead J.D., Jeffreys A.J. Allele diversity and germline mutation at the insulin minisatellite. // Hum. Mol. Genet. 2000. - vol. 9. - №5. - p. 713-723.

229. Steinmetz M., Stephan D., Lindahl K.F. Gene organization and recombination hotspots in the murine major histocompatibility complex. // Cell. 1986. - vol. 44. - p. 895-904.

230. Sutherland G.R., Richards R.I. Simple tandem DNA repeats and human genetic disease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - vol. 92. - p. 3636-3641.

231. Sved J., Bird A. The expected equilibrium of the CpG dinucleotide in vertebrate genomes under a mutation model. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - vol. 87. - p. 4692-4696.

232. Szostak J.W., Orr-Weaver T.L., Rothstein R.J., Stahl F.W. The double-strand breaks repair model for recombination. // Cell. 1983. - vol. 33. - p. 25-35.

233. Teubner В., Schulz W.A. Exemption of satellite DNA from demethilation in immortalized differentiated derivatives of F9 mouse embryonal carcinoma cells. // Exper. Cell Res. 1994. -vol.210, - p. 192-200.

234. Trepicchio W., Krontiris T. Members of the rel/NF-kB familiy of transcriptional regulatory factors bind the HRAS1 minisatellite DNA sequence. // Nucl. Acids Res. 1992. - vol. 20. - p. 2427-2434.

235. Trinh T.Q. Sinden R.R. PreferentialDNA secondary structure mutagenesis in the laggingstrand of DNA replication in E.coli. II Nature. -1991. vol. 352. - p. 544-547.Q

236. Usdin K., Woodford K.J. CGG repeats associated with DNA instability and chromosome fragility from structures that block DNA synthesis in vitro. // Nucl. Acids Res. 1995. - vol. 23. - p. 4202-4209.

237. Valgeirdottir К., Hammer M., Petty A., He T. DNA: A family of mosaic repeated sequences specific for heterochromatin in Drosophila melanogaster. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - vol. 87. - p. 7998-8002.

238. Varadaraj K., Skinner D.M. Cytoplasmic localization of transcripts of a complex G+C-rich crab satellite DNA. // Chromosoma. 1994. - vol. 103. - p. 423-431.

239. Vergnaud G., Moriat D., Apiou F., Aurias A., Lauthier V. The use syntetic tandem repeats to isolate new VNTR loci: cloning of a human hypermutable sequence. // Genomics. 1991. -vol. 11. - p. 135-144.

240. Virtaneva K., Amato E.D., Miao J., Koskiniemi M., Norio R. Unstable minisatellite expansion causing recessively inherited myoklonus epilepsy, EPM1. // Nat.Genet. 1997. -vol. 15.-p. 393-396.

241. Wahls W.P., Moore P.D. Recombination hotspot activity of hypervariable minisatellite DNA requires minisatellite DNA binding proteins. // Som. Cell Mol. Genet. 1998. - vol. 24. -p. 41-51.

242. Wang Y-H., Gellibolian R., Shimizu M.et al. Long CCG triplet repeat blocks exclude nucleosomes: a possible mechanism for the nature of fragile sites in chromosomes. // J. Mol. Biol. 1996.-vol. 263.-p. 511-518.

243. Warburton P., Cooke H. Hamster chromosomes containing amplified human a-satellite DNA show delayed sister chromatid separation in the absence of de novo kinetochore formation. // Chromosoma. 1997. - vol. 106. - p. 149-159.

244. Weinreb A., Katzenberg R., Gilmore G.L., Birshtein B. Site of unequal sister chromatid exchange contains a potential Z-DNA-forming tract. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. -vol. 85.-p. 529-533.

245. Wells R.D. Molecular basis of genetic instability of triplet repeats. // J. Biol. Chem. 1996. -vol. 271.-p. 2875-2878.

246. Wheeler V.C., Auerbach W., White J.K., Srinidhi J., MacDonald M.E. et al. Length-dependent gametic CAG repeat instability in the Huntington's disease knock-in mouse. // Hum. Mol. Genet. 1998.-vol. 8(1). - p. 115-122.

247. Wierld M., Dominska M., Petes T.D. Microsatellite instability in yeast dependence on the length of the microsatellite. // Genetics. 1997. - vol. 146. - p. 769-779.

248. Wohrle D., Hennig I., Vogel W., Steibach P. Mitotic stability of fragile X mutations in differentiated cells indicates early post-conceptional trinucleotide repeat expansion. // Nature Genetics. 1993. - vol. 4. - p. 140-142

249. Wong Z., Wilson W., Jeffreys A.J., Thein S.L. Cloning a selected fragment from a human DNA 'fingerprint': isolation of an extremely polymorphic minisatellite. // Nucl. Acids Res.-1986.-vol. 14.-p. 4605-4616.

250. Woychik R.P., Alagramam K. Insertional mutagenesis in transgenic mice generated by the pronucleare microinjection procedure. // Int. J. Dev. Biol. 1998. - vol. 42. - p. 1009-1017.

251. Wu J., Issa J-P., Harman J., Bassett D.E., Nelcin B.D., Baylin S.B. Expression of an exogenous eukaryotic DNA methyltransferase gene induces transformation of NIH 3T3 cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - vol. 90. - p. 8891-8895.

252. Wu M-J., Chow L-Wu., Hsieh M. Amplification of GGA/TTC triplet repeat in vitro: preferential expression of (TTC)n strand. // Biochemica and Biophysica Acta. 1998. - vol. 1407.-p. 155-162.

253. Wu Z., Murphy C., Gall J. A transcribed satellite DNA from the bullfrog Rana catesbeiana. // Chromosoma.-1986.-vol.93.-p.291-297.

254. Xie S., Wang Z., Okano M., Nogami M., Li Y., He W.W. et al. Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family. // Gene. 1999. - vol. 236. - p. 8795.

255. Xu G-L., Bestor Т.Н., Bourc'his D., Hsich C-L., Russo J.J., Viegas-Pequignot E. Chromosome instability and immunodeficiency syndrome caused by mutations in a DNA methyltransferase gene. //Nature. 1999. - vol. 402. - p. 187-191.

256. Xu X., Peng M., Fang Z. The direction of microsatellite mutations is dependent upon allele length. // Nat.Genet. 2000. - vol. 24. - p. 396-399.

257. Yates P.A., Burman R.W., Mummaneni P., Krussel S., Turker M.S. Tandem B1 elements located in a mouse methylation center provide a target for de novo DNA methylation. // J. Biol. Chem. 1999. - vol. 274. - p. 36357-36361.

258. Yoder J.A., Walsh C.P., Bestor Т.Н. Cytosine methylation and the ecology of intergenomic parasites. // Trends in Genetics. 1997. - vol. 13. - №8.

259. Yu A., Dill J., Wirth S.S., Huang G., Lee V.H., Haworth I.S., Mitas M. The trinucleotide repeat sequence d(GTC)i5 adopts a hairpin conformation. // Nucl. Acids Res. 1995. - vol. 23. - p. 2706-2714.

260. Yu S., Mangelsdorf D., Hewett D., Hobson L., Baker E. Human chromosomal fragile site FRA16B is an amplified AT-rich minisatellite repeat. // Cell. 1997. - vol. 88. - p. 367-374.137

261. Zacharias W. Methylation of cytisine influences the DNA structure. 11 DNA methylation. Molecular biology and biological significance. / edt. by Jost J.P., Saluz H.P. Basel, Boston. Berlin: Birkhauser. - 1993. - p. 27-38.138

Информация о работе

Сучкова, Ирина Олеговна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Исследование нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК на трансгенных мышах и трансфектных клетках эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы