Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение рецепторно-опосредуемого трансгенеза в клетки эмбрионов млекопитающихся доимплатационных стадий развития и анализ ДНК трансгенных животных

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение рецепторно-опосредуемого трансгенеза в клетки эмбрионов млекопитающихся доимплатационных стадий развития и анализ ДНК трансгенных животных"

на правах рукописи

¿г

л,

ИВАНОВА Маргарита Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДУЕМОГО ТРАНСГЕНЕЗА В КЛЕТКИ ЭМБРИОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДОИМПЛАНТАЦИОНЫХ СТАДИЙ РАЗВИТИЯ И АНАЛИЗ ДНК ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ.

(специальность 03.00.03. - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1998 г.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генной инженерии микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН Научные руководители - доктор биологических наук, профессор Народицкий Б.С. -доктор биологических наук, профессор Соболев A.C.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

Тарантул В.З.

кандидат биологических наук Рябых В.П.

Ведущая организация - Московский Государственный Университет им. Ломоносова, Биологический факультет.

Защита диссертации состоится" "_1998г.

в_часов на заседании Диссертационного

Совета Д.020.40.01. при ВНИИ сельскохозяйственой биотехнологии по адресу: 127550, г.Москва, ул.

Тимирязевская, д.42. С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " "_1998г.

Ученый секретарь Л

Диссертационного Совета, £ ¿^¿Сс^^ кандидат биологических наук Меликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Создание трансгенных животных привело к интенсивному развитию в течении последних 15 лет нового направления в биотехнологии - эмбриоинженерии, базирующегося на достижениях молекулярной биологии, генной инженерии, эмбриологии. В настоящее время созданы линии трансгенных лабораторных и сельскохозяйственных животных, которые используются как продуценты некоторых биологически активных веществ в фармакологии, в качестве моделей для изучения различных заболеваний и в других областях биотехнологии.

Для получения трансгенных животных сейчас наиболее широко применяют такие технологии, как микроинъекция в пронуклеус зиготы, использование рекомбинантных ретровирусных векторов, липосом, эмбриональных стволовых клеток. Но несмотря на значительные успехи данных методов в получении трансгенных животных, проблема низкой выживаемости эмбрионов, составляющей 10-20%, низкой эффективности переноса и интеграции чужеродного генетического материала, составляющей 0,2-5%, при высокой трудоемкости методов не решена и сегодня. Особенно актуален вопрос об эффективности существующих технологий переноса чужеродного генетического материала в эмбриональные клетки при получении трансгенных сельскохозяйственных животных, так как эмбрионы коров, овец, свиней не обладают прозрачной цитоплазмой и для определения локализации пронуклеусов перед микроинъекцией необходимы специальные предварительные манипуляции с зиготами. Кроме того, следует учитывать большие материальные затраты при получении трансгенного животного: например, стоимость трансгенного теленка достигает 500.000$.

Поэтому одна из задач современной генной эмбриоинженерии-создание метода, позволяющего снизить трудоемкость процесса введения чужеродной ДНК в эмбриональные клетки млекопитающих доимплантационных стадий развития.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка и изучение нового метода переноса чужеродного генетического материала в эмбриональные клетки, основанного на использовании механизма рецептор-опосредуемого эндоцитоза, позволяющего снизить трудоемкость способа доставки чужеродной ДНК, а также в изучении возможности вводить различный генетический материал в составе ДНК-переносящей конструкции на основе применения одних и тех же компонентов.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Разработать способ, позволяющий использовать рецептор-опосредуемый эндоцитоз для введения чужеродного генетического материала в эмбриональные клетки млекопитающих in vitro.

2. Определить эффективность трансгенеза с помощью ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы млекопитающих доимплантационных стадий развития in vitro.

3. Разработать способы доставки ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы мышей доимплантационнных стадий развития, не извлекая их из организма беременной самки.

4. Проанализировать состояние введенного чужеродного генетического материала в геноме эмбрионов на разных стадиях эмбриогенеза и у новорожденных.

Научная новизна и практическая значимость. Методом рецептор-опосредуемого трансгенеза было получено 24 эмбриона мыши постимплантационных стадий развития и один новорожденный с перенесенной чужеродной ДНК.

Впервые было показано, что рецептор-опосредуемый транспорт чужеродного генетического материала может быть применен не только для трансгенеза соматических клеток и тканей, но и для эмбрионов млекопитающих первых дней жизни.

Показана высокая эффективность транспорта ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы мышей, кроликов на стадиях зиготы, 2-бластомеров, морулы и бластоцисты и в эмбрионы овец на стадии морулы.

Установлено, что ДНК-переносящая конструкция не является токсичной для эмбрионов и выживаемость составляет 70%-90%, как и у контрольных животных, при культивировании in vitro.

Показано, что включение в состав ДНК-переносящей конструкции аденовирусов, способствующих выходу ДНК из эндосом, значительно облегчает процесс доставки генетического материала к ядру эмбрионов доимплантационных стадий развития.

Проведенные эксперименты показали возможность получения трансгенных животных непосредственно при введении ДНК-переносящей конструкции в организм беременной самки за счет транспорта чужеродного генетического материала в эмбрионы в полости организма, что, соответственно, повышает выживаемость эмбрионов.

Работа представляет не только научный, но также имеет практический интерес, так как разработанный метод доставки чужеродного генетического материала в эмбрионы, использующий механизм рецептор-опосредуемого эндоцитоза, может быть в дальнейшем использован для введения рекомбинантого гена в эмбрионы сельскохозяйственных животных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", " Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, включающего библиографических ссылок. Работа представлена на 113 машинописных листах, включая 5 таблиц и 25 рисунков.

Содержание работы.

Материалы и методы исследования. В экспериментальной части работы использовали ДНК-переносящие конструкции: (инсулин-полилизин)-плазмида-(стрептавидин-полилизин)-(биотинилированный аденовирус) или (инсулин-полилизин)-плазмида.

В составе ДНК-переносящей конструкции использовали плазмиды: pGL2CV ("Promega"), содержащая ген люциферазы под промотором SV40, pVK28VP7R и pVK28VP7D, содержащие ген VP7, кодирующий белок внешнего капсида ротавируса свиней, под промотором HCMV, pCMVLaLuc, содержащей гены лактальбумина и люциферазы под CMV промотором, и pCMVLuc, содержащей ген люциферазы под CMV промотором и аденовирусы: рекомбинантный аденовирус на основе Ad5 человека - Ad5neo, полученный от Dr.Gluzman (Cold Spring Harbor Lab., США) и аденовирусы птиц CELO, EDS76, полученные из государственного контрольного института (ВНГКИ).

В работе использовались следующие животные: мыши инбредной линии BALB/C и аутбредной линии SHK, кролики породы Шиншилла и овцы породы Романовская. Эмбрионы кроликов и овец были любезно предоставлены академиком РАСХН Эрнстом Л. К. (Всероссийский институт животноводства, Подольск, Россия).

Трансфекцию проводили в ЗООмкл среды M2(Sigma)+flHK-переносящая конструкция (при разведении 3:1), сверху раствор с эмбрионами покрывали слоем минерального масла (Sigma).

Эмбрионы культивировались с ДНК-переносящей конструкцией при 37° С в течении 3 часов.

Культивирование эмбрионов in vitro проводили по протоколам, ранее описанным Мерфи (Мерфи Д. и др., 1989).

После культивирования с ДНК-переносящей конструкцией эмбрионы анализировались методами: видео-интенсификационной микроскопии, полимеразной цепной реакции, гибридизации синтезированных продуктов ПЦР, а также путем блот-гибридизационного анализа ДНК.

Видео-интенсификациуга микроскопию проводили совместно с с.н.с. Розенкранцем A.A. и м.н.с. Смирновой O.A. в биофизической лаборатории (Институт сельскохозяйственной биотехнологии, Москва). Использовали камеру АТ200 (Photometries) с охлаждаемой ПЗС-матрицей и микроскоп Axioplan (Zeiss) с объективом 40х. Изображения выводили на экран компьютера и обрабатывали при помощи пакета программы PMIS фирмы Photometries.

Полимеразную цепную реакцию проводили по протоколу Инник М. (Innic М., 1990). Олигодезоксирибонуклеотиды синтезировали на автоматическом синтезаторе ASM102U ЗАО "Синтол".

Гибридизацию синтезированных ПЦР продуктов проводили согласно протоколам, описанным Маниатисом Т. (Maniatis Т. et al 1982).

Блот-гибридизационный анализ ДНК эмбрионов проводили с использованием Megaprime DNA labeling system (Amersham), согласно протоколу фирмы.

2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.1. Изучение транспорта ДНК-содержащей конструкции в эмбрионы млекопитающих на доимплантационных стадиях развития in vitro. Одним из необходимых условий для транспорта ДНК-переносящей конструкции в эмбриональные клетки является

наличие в составе ДНК-переносящей конструкции лиганда, интернализуемого клетками ранних эмбрионов. Известно, что экспрессия рецепторов инсулина и инсулиноподобных факторов роста (IGF-I и IGF-II) происходит в эмбрионах доимплантационных стадий развития и экзогенный инсулин способствует пролиферации клеток и морфологическому развитию эмбрионов.

На первом этапе работы транспорт конструкции (инсулин-полилизин)-ДНК в эмбриональные клетки посредством рецептор-опосредуемого эндоцитоза изучался с использованием метода видео-интенсификационной микроскопии. Инкубация мышиных эмбрионов с флуоресцентномеченной конструкцией (инсулин-полилизин)-ДНК показала, что ДНК-переносящая конструкция проникает в клетки и может накапливаться в бластомерах (рисунок 1) и что это накопление уменьшается при наличии избытка свободного инсулина в среде (рисунок 1, 2Ь и 2d), что указывает на рецептор-зависимый механизм накопления конструкции.

Видео-интенсификационные микрофотографии предимплан-тационных эмбрионов с этой ДНК-переносящей конструкцией не выявили сколько-нибудь заметного связывания этой конструкции с zona pellucida (рисунок 1). Идентичные результаты были получены и при использовании флуоресцентномеченной ДНК-переносящей конструкции (инсулин-полилизин)-ДНК -аденовирус.

Известно, что при рецептор-опосредуемом эндоцитозе поглощенный материал попадает в эндосомы, содержимое которых быстро закисляется и может подвергаться затем расщеплению кислыми гидролазами. В качестве компонента, способного вызывать выход содержимого из кислых эндоцитозных компартментов, с целью облегчения транспорта генетического материала по направлению к месту его доставки - ядру, использовали аденовирусы. При культивировании эмбрионов с ДНК-переносящей конструкцией, не содержащей аденовирус в своем составе, в эмбрионах чужеродный

генетический материал методом ПЦР не обнаруживался (96 часов развития), в то время как при культивировании эмбрионов с аденовирус-содержащей конструкции чужеродный генетический материал отчетливо детектировался (Таблица 1, эксперимент 1).

Рисунок 1.

ВИДЕО-ИНТЕНСИФИКАЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ.

Введение безвирусной ДНК-переносящей конструкции в мышиные эмбрионы. А и В - эмбрионы после 3 часов инкубации с 5нМ (инсулин-полилизин-РГГС)-плазмида конструкцией, с и И- эмбрионы после инкубации с свободным инсулином, Е и Р - контрольные эмбрионы (автофлюоресценция).

Таблица 1

Перенос генетического материала в клетки эмбрионов кролика in vitro, выявляемый методом ПЦР.

Конструкция Стадия развития при добавлении конструкции Время после инкубации, часов Количество эмбрионов в эксперименте Количество выживших эмбрионов Количество эмбрионов с перенесенной ДНК

Эксперимент 1

а зигота 96 8 4 2

b зигота 96 8 3 0

Эксперимент2

с зигота 51 9 6 6

d зигота 51 10 6 4

а. - (рСЬ2СУ)-(инсулин-рЦ-(С1решавидин-рЬ)-<А(15-пео)-концетрация 0.1нМ; Ь. -(рСЬ2С\0-(инсулин-рЦ-10нМ; е.- (рр12С\0-(инсулин-рЦЧстрегпавщин-рЬ)-(Ас15-пео)- 5нМ; ± -конструкция с, разведенная в 10 раз.

В ходе экспериментов было выявлено, что эффективность транспорта ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы зависит от стадии развития. При культивировании эмбрионов мыши на стадии зиготы с ДНК-переносящей конструкцией 1а (таблица 2) эффективность переноса чужеродной ДНК составила суммарно 80%, а при культивировании с ДНК-переносящей конструкции 16 - 70% (таблица 2) (анализировались эмбрионы стадии бластоциста). Высокий уровень транспорта ДНК-переносящей конструкции наблюдался и у эмбрионов кроликов на стадии зиготы. В то время как эффективность транспорта ДНК-переносящей конструкции при культивировании эмбрионов мыши стадии 2х бластомеров была ниже и составила 25% при использовании ДНК-переносящей конструкции 1а

и 26% при использовании ДНК-переносящей конструкции 16 (таблица 2). Результаты достоверны, р<0,01.

Таблица 2

Перенос генетического материала в клетки эмбрионов мыши in vitro, выявляемый методом ПЦР.

Конструкция Стадия развития при добавлении конструкции Время после инкубации, часов Количество эмбрионов в эксперименте Количество выживших эмбрионов Количество эмбрионов с ' перенесенной ДНК

Эксперимент 1

а зигота 3 2 2 2

а зигота 24 3 3 J

а зигота 48 12 12 9 (75%)

Эксперимент 2

а зигота 96 14 8 6 (75%)

б зигота 96 18 10 7 (70%)

Эксперимент 3

а 2 клеточная 3 12 12 5 (40%)

а 2 клеточная 72 10 10 1 (10%)

Эксперимент 4

б 2 клеточная 72 28 26 7 (26%)

1а. - (плазмида рСЬ2СУ)-(инсулин-рЬ)-(стре1павидин-рЬ)-(А<15-пео)-ко1шентрация 0.1нМ: 16. -(плазмида рСЬ2СУ)-(ннсулин-рЬ)-(стрегггавидин-рЬ)-(СЕЬО)-0.4 нМ.

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12

Рисунок 2.

Электрофореграмма продуктов ПЦР ДНК эмбрионов мыши стадии морула.

Культивировались эмбрионы с ДНК-лереносящей конструкцией а -(плазмида рС1_2С\/, 5 нМ)-(инсулин-полилизин, 25 нМ)-(стрептавидин-полилизин, 35 нМ)-(Ас15-пео, 33 пМ);

1 - р&_2С7, 2- отрицательный контроль ПЦР, 3- среда в которой отмывались эмбрионы ,4-11- ДНК эмбрионов, 12 - ДНК эмбриона, не культивировавшегося с ДНК-содержащей конструкцией.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 и 12 13 14 15 16 17

Рисунок 3.

Электрофореграмма продуктов ПЦР ДНК эмбрионов кролика.

Культивировались эмбрионы с ДНК-переносящей конструкцией с. (р02С\/, 5 нМ)-(инсулин-полилизин, 33 нМ)-(сгрептавидин-полипизин, 30 нМ)-(Ас!5-лео, 33 рМ); с!. -конструкция с, разведенная в 10 раз на стадии 2-бластомеров, в анализ брались через 51 час на стадии морула.

1-отрицательный контроль, 2-7 ДНК эмбрионов кролика, конструкция С, 8-отмывочная среда, 9-14 ДНК эмбрионов кролика, конструкция 0,15-отмывочная среда, 16-17-рС1_2СУ, 10"®. 10"7мкг.

При проведении трансформации ранних эмбрионов большое значение имеет поврёждающее воздействие и/или токсичность используемых компонентов. Как уже отмечено выше, инсулин является одним из нормальных факторов, регулирующих развитие эмбрионов. Полилизин не влияет на развите эмбрионов доимплантационных стадий развития. Например, полилизин в комлексе с ДНК может быть использован при микроинъекции ДНК в цитоплазму ранних эмбрионов (Page et ai., 1995). Для проверки токсичности аденовирусов на развитие ранних стадий эмбрионов мы методом микроинъекции вводили аденовирус (Ad5neo, Ad5 dl-312) в эмбрионы мыши и кролика на стадии зиготы под zona pellucida, в цитоплазму и в пронуклеус. Эмбрионы развивались в пределах нормы, выживаемость соответствовала средним показателям выживаемости эмбрионов после микроинъекции (30-40%). Выживаемость эмбрионов после культивировании с ДНК-переносящими конструкциями в среднем составляла 70%; в контрольных опытах (культивировании in vitro в среде М16 до стадии бластоцисты) выживаемость эмбрионов со стадии зиготы - 80%, со стадии 2-бпастомеров - 98%, что справедливо как для эмбрионов мышей, так и кроликов (таблицы 1,2).

2.2. Изучение транспорта ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы млекопитающих на доимплантационных стадиях развития in vivo. Одной из задач данного исследования являлась разработка метода доставки чужеродного генетического материала, позволяющая уменьшить трудоемкость процесса введения чужеродной ДНК в эмбрионы доимплантационных стадий развития. Для решения задачи мы разработали способы, позволяющие вводить чужеродный генетический материал в составе ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы стадий зиготы, морулы, бластоцисты, не извлекая эмбрионы из беременной самки, что невозможно при

использовании других методов введения чужеродной ДНК для получения трансгенных животных.

ДНК-переносящую конструкцию вводили, используя внутриматочный зонд (вводимый объем 40-50 мкл), или путем инъекции в один из рогов матки (полостная операция) самкам 3 и 4 дней беременности (вводимый объем 10 мкл), а также инъекцией в воронку одного из яйцеводов (менее 10 мкл) самкам 1 дня беременности (зиготы). Использование внутриматочного зонда самкам 3 дня беременности приводило к снижению количества беременных самок (25%), у контрольных животных (неоперированные) - 75% (результаты достоверны, р<0,01), (таблица 3). Если ДНК-переносящую конструкцию вводили с использованием внутриматочного зонда самкам 4 дня беременности, то суммарно у 53% самок сохранялась беременность. При введении ДНК-переносящей конструкции хирургическим путем самкам на 3 день беременности, доля беременных самок составила 71%. Операции на самках 4 дня беременности были неудачны, что, по-видимому, связано с началом подготовки ткани матки к имплантации, при этом известно, что повреждение структуры ткани может приводить к активизации иммунной системы животного. Поэтому мы сочли целесообразным использовать хирургическое введение ДНК-содержащей конструкции самкам 1 и 3 дней беременности (таблица 3).

Контрольной группе животных в ходе полостной операции вводили 10 мкл среды М2 в верхний отдел одного из рогов матки.

Для рецептор-опосредуемого трансгенеза эмбрионов в составе ДНК-переносящей конструкции использовали 3 варианта плазмид: рС1-2С\/, рСМ\/1.а1.ис, рСМ\/1ис, все данные плазмиды содержат репортерный ген светлячковой люциферазы.

Таблица 3.

Влияние введения ДНК-переносящей конструкции ¡n vivo на сохранение беременности.

Способ введения Срок беременности (стадия развития) Кол-во прооперирован ных/ беременных Кол-во эмбрионов и новорожденных Кол-во резорбций Коэффициент беременности %

Использование зонда 3 дня (морула) 24/6 59 2 25%

Использование зонда 4 дней (бласгоциста) 15/8 50 53%

Операция с конструкцией 1 день (зигота) 8/2 11 25%

Операция с конструкцией 3 дня (морула) 7/5 17 7 71%

Операция с конструкцией 4 день (бластооисга) 4/0 0%

Операция среда М2 3 день (морула) 6/3 19 50%

Операция среда М2 4 день (бласгоциста) 3/1 9 33%

контроль 9/7 43 75%

Примечание: коэффициент беременности - количество самок у которых сохранилась беременность после введения ДНК-содержашей конструкции к общему количеству беременных самок в эксперименте.

Компоненты ДНК-переносящей конструкции представлены ниже: 1а-(рС1-2С\/, 2,5 нМ)-(инсулин-полилизин, 25 нМ)-(стрептавидин-полилизин, 35 нМ)-(Ас!5-пео ЗЗрМ); 1Ь-(рС1_2С\/, 0,4 нМ)-(инсулин-полилизин, 6 нМ)-(стрептавидин-полилизин, 1,41 нМ)-(СЕ1-0, 7,04 рМ); 1с-(рС1.2С\/, 5 нМ)-(инсулин-полилизин, 33 нМ)-(стрептавидин-полилизин, 30 нM)-(Ad5-neo, 33 рМ); II а-(рСМУЬаЬис 2 нМ)-(инсулин-полилизин 58,6 нМ)-(стрептавидин-полилизин 24,9нМ)-(СЕ1.0); II Ь-(pCMVL.al.uc, 0,66 нМ)-(инсулин-полилизин19,4 нМ)-(стрептавидин-

полилизин 24,9 нМ)-(пошлизин 53 hM)-(CELO); II c-(pCMVLaLuc 3.6 нМ)-(инсулин-полилизин 228 нМ)-стрептавидин-полилизин 40 hM)-(EDS76); III (pCMVLuc 1.5 нМ, pVK28VP7,1,5нM)-(инcyлин-пoлилизин230,6нM)-(стрептавидин-полилизин 33,2 hM)-(EDS76). В конструкциях I и II вводимые плазмиды в кольцевой форме, в конструкции III - в линейной форме.

Анализ на трансгенность всех полученных эмбрионов на разных стадиях эмбриогенеза показал, что у 12% и 29% эмбрионов выявлен ген люциферазы после введения ДНК-переносящей конструкции pGL2CV-(HHcynnH-pL)-(CTpenTaBHflHH-pL)-Ad5neo в эмбрионы стадий морулы и бластоцисты соответственно. При введение ДНК-переносящих конструкций рСМ\Л-а1_ис-(инсулин-рЦ-(стрептавидин-pL)-CELO и pCMVLaLuc-(nHcynnH-pL)-(CTpenTaBHAHH-pL)-EDS76 самкам 3 дня беременности инъекцией в рог матки эффективность трансгенеза составила 33% и 28% соответственно, при использовании внутриматочного зонда 0% и 20% соответственно. Более подробные данные представлены в таблице 4. Следует отметить, что при введении ДНК-переносящей конструкции, содержащей pCMVLaLuc, было много погибших эмбрионов по сравнению с другими экспериментами, при этом 2 из 7 погибших эмбрионов были трансгенны.

При введении ДНК-переносящих конструкций рС1_2С\/-(инсулин-р!-)-(стрептавидин-р1_)-Ас15пео и pCMVLaLuc-(HHcynnH-pL)-

(стрептавидин-рЦ-СЕЬО самкам 1 дня беременности был выявлен 1 трансгенный эмбрион 19 дня развития из 5 полученных и проанализированных (рисунок 4) и 1 трансгенный эмбрион 15 дня развития из 4.

Все трансгенные эмбрионы имплантировались. со стороны прооперированного рога матки за исключением одного эмбриона, который имплантировался в нижней части неоперированного рога

матки. Эффективность трансгенеза рассчитывались исходя из всего количества полученных эмбрионов и новорожденных, поэтому данные об эффективности переноса чужеродного генетического материала являются заниженными.

Всего в процессе работы было получено 24 трансгенных эмбриона мыши на разных стадиях постимплантационного развития из 87 проанализированных и один трансгенный новорожденный из 39 полученных и проанализированных.

При хирургическом введении ДНК-содержащей конструкции самкам 3 дня беременности достаточно сложно точно локализовать место расположения эмбрионов. Если точно определить временной интервал, когда морулы переходят из яйцевода в рог матки, то эффективность трансгенеза оказывается высокой, что

подтверждается экспериментом с введением ДНК-переносящей конструкции рСМУ1аЫс-(инсулин-р1)-(стрептавидин-р1_)-СЕ1_0, когда все эмбрионы, имплантировавшиеся в прооперированном роге матки, были трансгенны (рисунок 5).

Так как транспорт ДНК-переносящей конструкции в клетки определяется наличием у них рецепторов инсулина, то клетки эндометрия (внутренняя поверхность ткани матки), которые, также содержат инсулиновые рецепторы, оказывались также трансфецированными. Поэтому анализ ДНК ткани матки был положителен на 5, 8, 11 день беременности и в некоторых случаях на 15 день беременности. Чужеродная ДНК в клетках эндометрия неинтегрирована и присутствует в эписомах (рисунок 5, дорожка 5). Полученные результаты согласуются с литературными данными (БоЬо1еу А-Б. е1 а1 1998), что экзогенная ДНК, вводимая ДНК-переносящей конструкцией, экспрессируется в соматических клетках в течении 1-2 недель и находится в эписомной форме.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 4.

Электрофореграмма продуктов ПЦР ДНК эмбрионов мыши 19 дня развития. ДНК-переносящая конструкция: (плазмида р02С\/ 2, 5 нМ)-(инсулин-полилизин, 25

нМ)-(стрептавидин-полилизин, 35 нМ)-(Ас!5-пео, 33 пМ). 1-2 , 3-4, 5-6 - ДНК эмбриона и ДНК плаценты данного эмбриона, 7-отрицательный контроль ДНК мыши, 8-положительный контроль рС1_2С\/.

1 2 3 4 5 6

Рисунок 5.

Анализ ДНК эмбрионов 12 дня развития методом блот-гибридизации.

ДНК-переносящая конструкция вводилась с использованием полостной операции самкам 3 дня беременности. Плазмида pCMVLaluc, рестрикгаза Eco RI.

1, 2, 3-ппазмида pCMVLaLuc концентрации 0,1 нг, 0,01 нг, 0.001 нг.

4 - ДНК 12 суточного эмбриона проба №11

5 - ДНК ткани матки

б - ДНК 12 суточного эмбриона проба №12.

Таблица 4.

Рецептор-опосредуемый трансгенез в клетки эмбрионов ¡n vivo.

Способ Компоненты Стадия Стадия Кол-во Кол-во %

¡ведения конструкции: развития при развития эмбрионов эмбрионов трансгенных

ДНК/аденовирус введении при анализе получено и с эмбрионов

конструкции ДНК про- перенесен

анализиро ной ДНК

еано

Использо- pGL2CV/ Морула 15 сут 8 1 12%

вание Ad5neo Бластоцисга 5 сут 8 3 37%

зонда Бластоциста 8 сут 8 3 37% ^

Бластоцисга 11сут 3 1 33%

Бластоциста 15 сут 6 3 50%

pGL2CV/

CEL0.2+ Бластоциста 8 сут 6 3 50%

pGL2CV/

CELO, 1,6- Бластоциста 8 сут 10 1 12%

pCMVLaLuc/

EDS Морула 15сут 5 1 20%

2р 1 50%

pCMVLaLuc/

CELO Морула 15сут 9 0

зерация pGL2CV/ Зигота 19 сут 5 1 20%

Ad5neo

pCMVLaLuc/ Зигота 15 сут 4 1 25%

CELO Морула 12 сут 2 2

pCMVLaLuc/ Морула 11 сут 7 2 28%

EDS 15сут 2 0

5р 1 20%

pCMVLuc/ Морула новорожд 39 1 2,5%

EDS

- погибшие эмбрионы (резорбции).

Нами было показано, что при введении плазмид кольцевой формы в составе ДНК-содержащей конструкции эффективность трансгенеза составляла 37%-50% (эмбрионы 8 дня развития), 28%-33% (эмбрионы 11 дня развития), 12%-20% (эмбрионы 15 дня развития) (различия по сравнению с эмбрионами 8-дня развития, достоверность, р<0,05), при этом ни один из 71 проанализированных новорожденных не был трансгенным.

Известно, что эффективность интеграции кольцевой формы плазмиды ниже, чем эффективность интеграции линейной формы (Brinster R.L et al 1985). При введении ДНК-содержащей конструкции III, в составе которой плазмида была линейной формы, нами был получен трансгенный новорожденный (рисунок 7).

Блот-гибридизационный анализ ДНК 11, 12 и 15 суточных эмбрионов выявил, что большая часть чужеродной ДНК не интегрируется (рисунки 5,6) и находится в эписомной форме. Последовательно в процессе клеточного деления неинтегрированная ДНК неравномерно распределяется между бластомерами, что соответственно приводит к уменьшению популяций клеток в который присутствует ДНК в эписомной форме, которая при этом со временем деградирует.

Известно, что при введении чужеродного гена в эмбрионы стадий морулы и бластоцисты наблюдается мозаичное распределение чужеродного материала и мозаицизм достигает 100% (Kubisch Н.М. et ai 1997). При этом в процессе эмбриогенеза наибольшая степень мозаицизма наблюдается к 18 дню развития, что приводит к низкой копийности интегрированной чужеродной ДНК (Canceco R.S. et al 1994) и, следовательно, к сложности при детектировании методом блот-гибридизации. Поэтому мы наблюдали, что количество детектируемой чужеродной ДНК уменьшалось по

мере анализа ДНК эмбрионов более поздних стадий развития (рисунки 5,6,7). Факт мозаичного распределения чужеродного генетического материала в эмбриональных клетках подтверждается также и тем, что в 6 эмбрионах, которые не являлись трансгенными, ДНК их околоплодных оболочек содержала чужеродный ген. (В эмбрионе мыши на стадии морулы только одна клетка из 32 формируется в эмбрион, а на стадии бластоцисты в формировании собственно зародыша участвуют 3 клетки ([\yiintz, 1970), а все остальные клетки формируют околоплодные оболочки).

Рисунок 6.

Анализ ДНК эмбриона 15 дня развития методом блот-гибридизации. ДНК-переносящая конструкция вводилась на 4 день беременности с помощью внутриматочного зонда. Плазмида pGL2control vector, ресгриктазы: EcoR1, HindiII-

1,2-pGL2control vector конценраций 0,01 нг, 0,001 нг., 3-ДНК 15суточного эмбриона,4-ДНК эмбриона, отрицательный контроль, 5-ДНК ткани матки 15 дня беременности.

3000-

2123 • 1900

1069

950 697

Рисунок 7.

Анализ ДНК новорожденной мыши методом блот-гибридизации.

1- ДНК новорожденного №16, 2-ДНК новорожденного (отрицательный контроль), 3-ДНК рСМ\Л.ис 0.1 рг, 4-ДНК рСМУ1_ис 1нг.

Одним из резервов увеличения эффективности получения трансгенных животных с помощью предлагаемого нами метода доставки генов в ранние эмбрионы является увеличение эффективности встраивания переносимого гена в геном хозяина, например, за счет использования линейной формы ДНК вместо кольцевой в составе ДНК-переносящей конструкции. Именно при

л

введении ДНК-переносящей конструкции рСМ\/1_ис-(инсулин-р1.)-(стрептавидин-р1.)-Е0576, где плазмида находится в линейной

форме, был получен трансгенный 1 новорожденный из 39 проанализированных.

Полученные данные доказывают принципиальную возможность использования рецептор-опосредуемого трансгенеза для доставки чужеродной ДНК в ранние эмбрионы млекопитающих. В дальнейшем мы предполагаем изучить вопрос оптимизации генетического вектора с целью увеличения эффективности интеграции вводимой ДНК. Используемая ДНК-переносящая конструкция может быть также упрощена, например, путем замены зндосомолитиков: вместо аденовирусов использовать амфипатические пептиды.

Выводы.

1. Впервые показано, что с помощью рецептор-опосредуемого трансгенеза возможен эффективный транспорт чужеродной ДНК в эмбрионы млекопитающих доимплантационных стадий развития in vitro.

2. Показана высокая эффективность транспорта ДНК-переносящей конструкции в эмбрионы мышей, кроликов на стадии зиготы, морулы, и в эмбрионы овец на стадии морулы (80-90%). ДНК-переносящая конструкция не токсична для эмбрионов, выживаемость составляет 70%-90%, в то время как в контроле выживаемость эмбрионов при культивировании in vitro 80%-98%.

3. Впервые показана возможность использования рецептор-опосредуемого трансгенеза в эмбрионы мышей доимплантационных стадий развития in vivo без извлечения эмбрионов из репродуктивных органов самки.

4. С использованием рецептор-опосредуемого трансгенеза получены трансгенные эмбрионы мышей разных стадий развития (от 8 до 19 дней), а также новорожденное трансгенное животное. С помощью ПЦР-амплификации и блот-гибридизации показано наличие чужеродной ДНК в геноме трансгенных животных на разных стадиях развития.

5. Показано, что трансгенные эмбрионы разных стадий эмбриогенеза и новорожденный мышонок, полученные в результате рецептор-опосредуемого трансгенеза, содержат в клетках чужеродную ДНК как в эписомной форме, так и в интегрированном с клеточной ДНК состоянии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Иванова М.М.. Народицкий Б.С. Экспресс-анализ ДНК эмбрионов доимплантационных стадий развития методом ПЦР.// Международная конференция "Актуальные проблемы биотехнологии в растениводстве, животноводстве и ветеринарии". Тезисы. Москва, 30-31 октября 1996, стр 31.

2. Иванова М.М., Лазарев В.Н. Современные методы ДНК-диагностики.// Лекции для студентов и аспирантов, -слушателей факультетов повышения квалификации и специалистов диагностических лабораторий.// МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, Москва, 1997, 19 с.

3. Иванова М.М.. Соболев A.C., Смирнова O.A., Розенкранц A.A., Никитин В.А., Народицкий Б.С. Введение чужеродного генетического материала методом рецептор-опосредуемого эндоцитоза в эмбрионы млекопитающих.// Международная конференция "ДНК технологии в животноводстве и ветеринарии". Тезисы. Киев. 20-21 ноября 1997, стр 26.

4. Соболев A.C., Розенкранц A.A., Иванова М.М.. Смирнова O.A., Никитин в.А., Народицкий Б.С., Эрнст Л.К. Способ получения трансгенных животных.// Патент РФ №2108714, 1996.

5. Иванова М.М., Лазарев В.Н. Использование метода полимеразной цепной реакции для амплификации и последующей детекции генетического материала в животноводстве и ветеринарии.// Современные методы биотехнологии в растеневодстве, животноводстве и

ветеринарии. Методические рекомендации.// Изд-во РАСХН, Москва, 1998, стр 59-80.

Сокращения:

pL-полилизин

FITC -изотиоцианат флуоресцеина

Гарнитура Times. Формат 60x90/16. Печать офсетная. Уч.-изд. л 1,0 Усл. печ. л 1,5. Тираж ЮОэкз.

"Биоинформсервис", 117984, Москва, ул. Вавилова 32. Отпечатано с готового оригинал-макета.