Jedi и другие гены, участвующие в регуляции дифференцировки и самоподдержания стволовых и прогениторных клеток крови

Розов, Федор Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Jedi и другие гены, участвующие в регуляции дифференцировки и самоподдержания стволовых и прогениторных клеток крови
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Jedi и другие гены, участвующие в регуляции дифференцировки и самоподдержания стволовых и прогениторных клеток крови"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТД

На правах рукописи

РОЗОВ ФЕДОР НИКОЛАЕВИЧ

ЦЕй! И ДРУГИЕ ГЕНЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В РЕГУЛЯЦИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И САМОПОДДЕРЖАНИЯ СТВОЛОВЫХ И ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

\Ь о

003160865

Работа выполнена и Лаборатории молекулярной биолога и развития Института молекулярной биологии В.А. Энгельгардта РАН, г. Москва,

Научны» руководитель: доктор биологических наук A.B. Белявский

Официальные оппоненты: доктор биологических паук, профессор

Е.Е.Егоров (Институт молекулярной биологии им. В .А. Энгельгардта РАН)

кандидат биологических наук М.А.Эрпглер (Государственное учреждение Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук)

Ведущая организация: Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова

РАН

Защита диссертации состоится « '<г» рЛгТТ№С007 г. на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологик им. В.Л, Энгельгардта РАН по гшресу 1 ¡9991, Москва, ул. Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В,А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан «Jj? » 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

Крицын

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность птблемы. Регуляция процессов дифференцировки и гомеостаза в клеточных системах является одной из ключевых проблем современной биологии Механизмы, позволяющие клеткам сохранять свой фенотип и пролиферировать с необходимой скоростью, интенсивно изучаются, однако во многом по-прежнему остаются неизвестны Особый интерес представляет гемопоэтическая система, являющаяся наглядной моделью того, как в течение всей жизни организма небольшое количество стволовых клеток обеспечивает организм всеми необходимыми элементами крови, адаптируясь к его потребностям

Поддержание и размножение стволовых клеток крови (СКК) ex vivo представляет собой важную задачу при лечении многочисленных заболеваний системы кроветворения (Sauvageau et al, 2004) На протяжении многих лет делались попытки размножения СКК путем культивирования в присутствии коктейлей ростовых факторов, однако полученные таким образом культуры не содержали достаточного числа клеток, способных к долговременному восстановлению гемопоэза в организме (Robmson et al, 2005) Становится все более очевидным, что для достижения успеха в этой области необходимо учитывать данные последних лет о регуляции свойств СКК локальными стромальными факторами Стволовые клетки находятся в тесном взаимодействии со своим микроокружением, образующим так называемую «нишу» Нишу для СКК образуют остеобластные, а также, возможно, эндотелиальные клетки (Calvi et al ,2003 Zhang et al, 2003, Kiel et al, 2005) В настоящее время идентифицированы многие белковые факторы и сигнальные пути, задействованные в поддержании СКК в недифференцированном состоянии Вместе с тем, необходимость дальнейшего изучения молекулярных механизмов регуляции процесса самоподдержания стволовой клетки очевидна

Данная работа пополняет современные представления о молекулярных процессах, происходящих внутри ниши стволовых и прогениторных клеток и открывает перспективы для создания оптимальных условий для т vitro культивирования и вирусной трансдукции СКК с использованием стромальных культур, несущих стимулирующие гемопоэз мембранносвязанные факторы

Цель и задачи исследования Целью данной работы являлась идентификация новых генов, принимающих участие в регуляции самоподдержания стволовых клеток крови, а также детальное изучение роли в этих процессах отдельных охарактеризованных ранее белков Для выполнения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1) Изучить роль гена Jedi в процессах поддержания гемопоэтических предшественников

2) Произвести анализ экспрессии некоторых ключевых генов, ответственных за самоподцержание и дифференцировку СКК, в стромальных линиях, полученных из костного мозга мыши

3) Оценить влияние оверэкспрессии белка Jaggedl в линии фибробластов NIH3T3 на гемопоэз т vitro в системе совместного культивирования

Научная новизна и практическая иенность работы Обнаружен новый ген Jedi, экспрессирующийся в ранних кроветворных предшественниках, и показано его

участие в регуляции дифференцировки кроветворных предшественников и передаче сигнала через рецепторы Notch Также продемонстрировано позитивное влияние оверэкспрессии белка Jaggedl в стромальном подслое на колониеобразующие предшественники в системе т vitro

Проведенные исследования позволяют обогатить современные представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе биологии стволовых и прогениторных клеток Результаты представленной работы открывают перспективы для создания оптимальных условий для in vitro культивирования и вирусной трансдукции СКК с использованием стромальных культур, несущих стимулирующие гемопоэз мембранносвязанные факторы Результаты работы демонстрируют возможность получения клеточных линий, поддерживающих кроветворные предшественники in vitro, из клеток, исходно такой активностью не обладающих, с помощью относительно простых генетических манипуляций

Апвобаиия работы. Результаты работы были доложены на следующих конференциях

ХШ Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-9 февраля 2001, Ш съезд физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс, 19-23 сентября 2005, 1-я Международная конференция им Энгельгардга по молекулярной биологии, 28 ноября-2 декабря 2004, Суздаль; 47-й съезд Американского общества гематологов, 10-13 декабря 2005, Атланта, США

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ

Структура и объем работы. Диссертация содержит разделы введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы ( /¿¿.ссылки) Работа изложена на /315 страницах, содержит / таблиц и 31 рисунков

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ранее в лаборатории Молекулярной биологии развития ИМБ в ходе экспериментов по дифференциальному фингерпринтированию генной экспрессии был идентифицирован фрагмент гена с рабочим названием Styl (Ivanova and Belyavsky, 1995, Shmelkov et al, 2001) По данным предварительных экспериментов, Styl обладал высоким уровнем экспрессии в примитивных клетках костного мозга. Впоследствии ген получил название Jedi

Мы проанализировали экспрессию Jedi в гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках с помощью Саузерн блот габридизации с амплифицированными кДНК библиотеками, представленными 3' концами кДНК из сортированных клеток различных фракций костного мозга, как описано ранее (Zinovyeva et al, 2000) Наиболее высокий уровень экспрессии мРНК Jedi был обнаружен во фракции Rho'/Rho(Ver)+, соответствующей гемопоэтическим

предшественникам с кратковременной репопулирующсй активностью, более низкий уровень экспрессии - во фракции КЬо*/КЬо(\'ег)+ (клетки с долговременной репопулирующей активностью). Еще более низкая экспрессия была обнаружена в клетках Я.Ьо1'1'11 (фракция олнгоп отентных прешествсн ников), в то время как экспрессия в клетках (компилированные предшественники)

практически отсутствовала (Рисунок 1),

•I - Jedi

дифферент up овка

соответственно.

Рисунок 1. Экспрессия 1еШ в субпопуляциях клеток костного мозга мыши. Данные Саузсрн б;ют гибридизации с препаратами кДНК. №>7Шю{Уег)~, ЮюТЮю^ег)4, Ию*1", клетки костного мозга соответствуют СКК с долговременной релопулирующей активностью, СКК с кратковременной релопулирующей активностью, мультнпотенетным предшественникам и

коммн тированным предшественникам.

Изучение нового белка Jedi, содержащего множественные повторы эпидермального фактора роста и подобный домен

Клонирование кДНКУеЛ'

Скринарование библиотеки кДНК (OriGcne с DNA library) с целыо идентифицировать более длинные транскрипты, соответствующие исходному фрагменту Styl, полученному в ходе дифференциального фингерпринтироваяия, выявило 5 позитивных клонов, 2 из которых (Е7 and F4), с более длинными 5' областями, были взяты для дальнейшего изучения.

Белок, кодируемый клоном El (Рисунок 2 А), представляет собой трансмембран пуго молекулу с большим внеклеточным доменом в 753 аминокислоты и внутриклеточным доменом в 258 аминокислоты. Белок имеет существенную структурную гомологию с лигандами Notch из семейств Jagged и Delta (наличие 14 EGF повторов и DSL-подобного домена). (Рисунок 2Б). На основе сходства с белками Jagged и Eelta клонированная кДНК бььла названа нами Jedi.

1 к plc PLLLLALGLWjTGTLHSNDPHVC т fwe s FTTTTK ss hl r p лидерный пептид 15 f sll p ae sc hr pwbdphtc aqptwyrtvyrqwkmds rprlq

88 ccrgyy eskgac vplc AQ ec VKG КС V a phqc QC apgwrggdc S dsl

131 secapgmwgpqcdkfchcgnnsscbpksgacfcpsglqppncl egf-¡.ike i

174 QPCPAGHYGP ACQF DCQC YG - A5CD PQDG AC FC PPGRAG P SCN EGF-like 2

216 VPCSQGTDGPPCPRTYPCCWGGVPiJOSQGSCSCPPGWMGVICS EGF-like 3

259 LPCPEGFHGPNCTQECRCHNGGLCDRFTGQCHCAPGYIGDRCQ EGF

302 EECPVGRFGQDCAETCDCÄPGARCFPANGACLCEHGI/TGDRCTE EGF'

346 KLCPDGRYGLSCQEPOTCDPEHSLSCHPMHGECSCQPGWAGLHCN EGF'

391 ESCPQDTHGPGCQEHCLCLHGGLCLADSGLCRCAPGyTGPHCA EGF'

434 NLCPPDTiGINCSSRCSCENAIACSPIDGTCICKEGWQRGNCS EGF'

477 VPCPLGTWGFNCNASCQCAHDGVCSPQTGACTCTPGWHGAHCQ EGF'

520 LPCPKGQFGEGCASVCDCDHSDGCDPVHGQCRCQAGWMGTRCH EGF-

563 LPCPEGFWGANCSNTCTCKNGGTCVSBNGNCVCAPGFRGPSCQ EGF

606 RPCPPGRYGKRCVQCKCKHNHSSCHPSDGTCSCLAGWTGPDCS EGF

649 EACPPGHWGLKCSQLCQCHHGGTCHPQDGSCXCTPGWTGPNCL EGF-

692 EGCPPRMFGVNCSQLCQCDLGEMCHPQTGACVCPPGHSGADCK EGF-

735 MGSQESFTIMPTSPVTHNSLGAjyiGIAVLGTLWALXALFIGjYRQ TM 780 WQKGKEHEHLAVAYSTGRLDGSDYVMPDVSPSYSHYYSNPSYHTL 825 SQCSPNPPPPNKVPGSQLFVSSQAPERPSRAHGRENHVTLPADW 869 KHRREPHERGASHLDRSYSCSYSHRNGPGPFCHKGPISEEGLGAS 914 VMSLSSENPYATIRDLPSLPGEPRESGYVEmGPPSVSPPRQSLH

959 LRDROOROLOPORDSGTYEOPSPLSHNEESLGSTPPLPPGLPPG9 PEST 1004 YDSPKNSHIPGHYDLPPVRHPPSPPSRRODR

-like -like -like -like -like -like -like 10 -like 11 -like 12 -like 13 •like 14

Delta CDLNYYGSGCAKFCRPRDDSFGHSTCSETGEILCLTGWQGDYC

LAG2 CARNYFNGRCENFCDAHLAKAARKRCDAMGRLRCDIGWMGPHC

APX1 CSSNYHGKRCNRYCIA-UAKL-HWECSTHGVRRCSAGWSGEDC

hJaggedl CDDYYYGFGCNKFCRPRDDFFGHYACDQNGNKTCMEGWMGPEC

mJagged2 CDENYYSATCNKFCRPRHDFFGHYTCDQYGNKACMDGWMGKEC

KlDlll CDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGDRGEKMCDPGWKGQYC

XD112 CDEHYYGDSCSDYCRPRDDNFGHYTCDEQGNRLCMSGWKGEYC

mDl 13 CEPPAVGAACARLCRSRSAP---SRCG- PGLRPCTPF- - PDEC

1Ш113 CAP-LEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLC

mD114 CSDNYYGDNCSRLCKKRNDHFGHYVCQPDGNLSCLPGWTGEYC

Jedl CCRGYYESRGACVPLCAQE-CVHGRCVAPNQCQCAPGWRGGDC

MEGF10 CCPGFYESGEMCVPHCADK-CVHGRCIAPNTCQCEPGWGGTNC

MEGF11 CCPGYYESGDFCIPLCTEE-CVHGRCVSPDTCHCEPGWGGPDC

консенсус CY CC HCGCGWGC

Рисунок 2 Предсказанная аминокислотная (ак) последовательность Jedi (номер в базе данных GenBank • AF444274') Лидерный пептид (ак 1-19) и DSL домен (ак 89-130) подчеркнуты EGF повторы 1-14 указаны на правой стороне последовательности Консервативные аминокислоты EGF повторов отмечены серым цветом Трансмембранный домен (ак 757-775) обведен рамкой Последовательность PEST (ак 984-1007) подчеркнута двойной линией Б. Сравнение DSL доменов различных лигандов Notch с соответствующими районами Jedi/MEGF белков D melanogaster Delta (Х06289). С elegans Lag-2 и АРХ-1 (Х77496 and U50143. соотв), человеческий Jagged 1 (U61276). мышиный Jagged 2 (MN 010588). мьшшный Dill (AB0S04S7). X laevis D112 (S74210). мышиный и человеческий D113 (NM 007866 и NM 016941. соотв ), мышиный D114 (ХМ 123881). человеческий MEGF10 (АВ058676) и человеческий MEGF11 ((АВ058677) и (ВС029999))

Анализ экспрессии Jedi

Мы изучили тканевое распределение мРНК Jedi в тканях взрослого организма, используя Нозерн блот гибридизацию и ОТ ПЦР (Рисунок 3)

Рисунок 3. Данные 5 В Нозерн б лог

43 гибридизации пробы,

соответствующей мРИК Ши с тотальной РНК из тканей мыши.

Максимальный уровень экспрессии был обнаружен нами в почках и сердце, более низкий уровень экспрессии детектировался в легких, селезенке, печени, селезенке, семенниках, коже и желудке. Слабая экспрессия была обнаружена в тимусе, мышцах и тонком кишечнике. Сигнал был представлен тремя полосами разного молекулярного веса (3.6, 4.3 и 5.8 т.п.о.). Клон Е7, имеющий размер 4290 п,о,, вероятнее всего соответствует полосе 4,3 т.п.о. Две другие полосы, вероятно, являются различными сплайс вариантами мРНК Jedi.

Кроме того, мы изучили экспрессию Jedi в некоторых гемопоэтических и стромальных линиях, используя проточную цнгометряю и антитела против Jedi. Экспрессия белка была обнаружена лишь в сгромальной линии AFT024 из эмбриональной печени (Moore et al., 1997).

Выживание колоннеобразуюпшх клеток на монослое фибраб ластов, зкспресснруюшк* Jedi

Линия AFT024, единственная из исследованных нами эксцрессирующая Jedi, известна своей способностью поддерживать долговременно репопулируюцше клетки костного мозга (Moore et al„ 1997), Этот факт указывает на возможную роль Jedi в стромальной регуляции гемопоэза. Мы исследовали влияние оверэкспрессии белка Jedi в клетках КШ ЗТЗ на способность этих клеток к поддержанию гемопоэза. Используя рстровирусный перенос генов, мы получили производные клеток NIH ЗТЗ, экспрессирующие либо гюлноразмерную форму Jedi- NIH 3T3-FL или мембранносвязанную форму КШ ЗТЗ-МТ. Контрольная линия NLH ЗТЗ SFG была получена при помощи трансдукции пустым вектором pSFG.

Для того, чтобы оценить эффект Jedi в поддержании гемоп о этических предшественников, мьппииые клетки костного мозга культивировали на монослое из трансдупированных описанными выше векторами фибробластов в отсутствие экзогенно добавленных цитокинов. Колони еобразование оценивали для неадгезивной фракции клеток, собранных в интервале от 2 до 12 дней после начала культивирования. Было показано существенное уменьшение числа предшественников в варианте с фибробластами, экс пресс и рута щими

полноразмерный белок 1е&, в отличие от мембранносвязанной формы и пустого вектора (рисунок 4)

-- -1М1НЗТЗ-МТ

Время культивирования,дни

колониеобразующих клеток

Рисунок 4 Совместное культивирование моноядерных клеток костного мозга с контрольными клетками МН-ЗТЗ-ЗБО, МН-ЗТЗ-И, или МН-ЗТЗ-МТ Культивирование клеток на подслое, несущем

мембранносвязанную форму ^ск или пустой вектор, не приводит к существенным эффектам, в то время как полноразмерная форма 1еД вызывает существенное уменьшение содержания

Через 9 и 12 дней общее число колоний в МН ЗТЗ-ЕЬ культурах было в 3 8 и 4 9 раз ниже, чем в контрольном варианте Эти результаты свидетельствуют о том, что экспрессия 1еЛ в клетках стромального окружения существенно уменьшает число неадгезивных миелоидных предшественников

Сходные результаты нами были также получены при оверэкспрессии полноразмерной формы 1е<11 в клетках линии М55 В данной системе оценивалась общая продукция неадгезивных клеток через 8 и 13 дней, а также влияние .ГеЛ на образование миелоидных колоний в полутвердой среде через 13 дней совместного культивирования Результаты приведены на рисунках 5А и 5Б

Для того, чтобы проверить, является ли полученный эффект результатом прямого клеточного контакта, или же эффект опосредован какими-либо растворимыми факторами, мы культивировали моноядерные клетки костного мозга, отделенные от монослоя трансдуцированных фибробластов при помощи мембраны Тгап8\уе11, непроницаемой для клеток, но проницаемой для белковых факторов Колониеобразование клеток, культивированных с Тгаш\уе11 в течение 8 дней, не отличалось существенно в лунках с клетками МОНЗТЗ-ЗБО и МШЗТЗ-И,

Данный результат свидетельствует о том, что эффект от оверэкспрессии 1еД в клетках №Н ЗТЗ на способность предшественников к колониеобразованию не

связан, по-видимому, с растворимыми факторами и требует прямого клеточного контакта

А. Б

! ДО! У5 8^1 У5 8дн 13дн дн 13 дн

рВаЬе ЛеЛ-\/5

Рисунок 5. А Общее число жизнеспособных неадгезивных клеток при культивировании тотальной фракции клеток костного мозга мыши на подслое фибробластов М55, стабильно экспрессирующих белок 1еЛ-У5 или несущих контрольный вектор рВаЬе Представлены данные через 8 и 13 дней совместного культивирования Б. Влияние оверэкспрессии Лес1] в стромальном подслое на способность гемопоэтических клеток к колониеобразованию Клетки анализировали в полужидкой среде, содержащей метилцеллюлозу, спустя 8 дней совместного культивирования с фибробластами М85, несущими либо пустой вектор, либо кДНК 1ес!ьУ5

Полученные данные, свидетельствующие о негативном влиянии 1еск на колониеобразование, можно объяснить подавлением дифференцировки стволовых клеток и ранних предшественников в поздние колониеобразующие предшественники Для проверки данной гипотезы мы произвели подсчет клеток с высоким пролиферативным потенциалом (НРР) и покоящихся НРР (НРР^) в системах совместного культивирования моноядерных клеток костного мозга с клетками №1ЗТЗ-БРО, МН ЗТЗ-МТ или МН ЗТЗ-РЬ

Полученные результаты показывают, что экспрессия НЦ но не МТ формы 1еЛ, на поверхности стромальных клеток приводит к приблизительно двухкратному снижению неадгезивных НРР, в то время как число покоящихся НРР было снижено в еще большей степени

Таким образом, экспрессия на стромальных клетках приводит

уменьшению как ранних, так и поздних неадгезивных миелоидных предшественников, в то время как исследованная нами мембранносвязанная

форма белка, не содержащая внутриклеточного домена, не обладала таким аффектом.

Рисунок й. Влияние оверэкспрессии .1сс1] на выживание гемопоэтических клеток с высоким про лиф ерати вл ьш потенциалом.

Jedi и передача сигнала через рецепторы Notch

Наличие элементов структурного сходства (в первую очередь, DSL домена и EOF повторов) между Jedi и лигандами Notch предполагает возможность участия Jedi з пути передачи сигнала через рецепторы Notch. В качестве модельной системы нами была выбрана система совместного культивирования (Moloney et а!., 2000). Клетки NIH ЗТЗ, стабильно экспрессирующие JaggedJ или Jedi (ЗТЗ-Jagged, ЗТЗ-Jedi), выращивали до субконфлуэнтного м око слоя, после чего к ним добавляли клетки СНО-К1, транзиентно экспресс ирующие репортерную плазмиду CBF-iuc и контрольную плазмиду pRl^-CMV. Совместное культивирование с ЗТЗ-Jagged приводило к примерно четырехкратному увеличению активности репортеркой пла-змиды (Рис. 7А), в то время как клетки, экспрессирутощие Jedi-V5, наоборот, вызывали ] .5 кратное снижение активности промотора (Рис. 7Б).

Результат по негативному влиянию Jedi па передачу сигнала через рецептор Notchl был подтвержден нами на клетках NUI ЗТЗ, экспрессирующих варианты белков, слитых на С-конце с эпитопом V5 {3T3-Jagged-V5 и 3 ТЗ - J edi- V 5) (Рис. 7Б). Иммуноблоттанг с антителами против V5 показал, что оба белка экспресс ируются примерно на одном уровне (данные не показаны), а клетки 3"I3-Jagged-V5 способны к активации репортер ной плазмиды, хотя и в меньшей степени, чем исходный белок.

£ i О X ,

S I 1 Е 1

5 Z £ S V ■ вектор

¡i ь О Jagged1

с % ti X

5 I t !

i £ i I :

Ш Вектор njajgedV5H¡s6 OJedJVSHIsE

■ COSI

□ sJaggedMychiKÜ

ElsJagSedMysHisB □ »JHJlí/^HiSB

CénOK ■raavt^a

nnsavoue

Рисунок 7. Анализ участия Jodi в передаче сигнала через рецепторы Notch с использованием системы совместного культивирования. Л. Клетки N111 ЗТЗ (релортерпые клетки), ко-транс фецированныс плазм идами, кодирующими полноразмерный белок Notchl. CBFl -lúe и pRL-CMV, совместно культивировали либо с контрольными клетками NIH ЗТЗ (траисдуцированлыми вектором pBabe), либо с клетками, стабильно экспрессирующими J agged 1 В Эксперимент аналогичен А, за исключением того, что в качестве репортерных клеток использовали клетки CHO-Kt, транс фецированные шшмидами CBFl-luc и pRL-CMV, а ко-культивированные с ними клетки NIH-3T3 стабильно экспресс про нал и белки Jaggcd 1 или Jcdi, слитые на С-конце с эиитопом V5. Во всех экспериментах результаты показаны в виде относительной активности люциферазы, отражающей активацию, вызываемую опытными образцами по сравнению с контрольными. В, Г. Анализ эффектов внеклеточного домена Jedi (sJedi) на передачу сигнала через рецепторы Notch. В, Клетки НЕК 293 ко-трансфецировали плазм идам и, кодирующими полноразмерный белок Notchl, CBFl-luc и pRL-CMV, и инкубировали в среде, кондиционированной либо контрольными клетками COSI, либо COSI, транзиентно зкспрессирующими sJecii или sJaggedl Г. Эксперимент был выполнен аналогично «В», за исключением того, что клетки инкубировали с частично очищенными белками sJecii Мус Н i só или sJaggedMycHisó (фактор обогащения составлял примерно 1000 в обоих случаях).

Мы также исследовали несколько стромальных клеточных линий, полученных из костного мозга мышей, дефицитных по фактору некроза опухоли Получение этих клеточных линий подробно описано в работе (Нифонтова с соавт, 2004) Исследованные 7 линий культивировали в следующих условиях 1 и 2 - на стандартной для ДККМ среде Фишера с гидрокортизоном, 3-7 - в среде ДМЕМ с дексаметазоном и другими добавками для остеогенной дифференцировки

Во всех полученных культурах в первую очередь были проанализирована экспрессия маркеров костной дифференцировки - остеокальцина и остеопонтина

А Б

□остеокальцин Яостеопонтин

П п

л — п. II--п _

1 2 3 4 5

7 8 9 10

Рисунок 9. А. Экспрессия мРНК остеокальцина и остеопонтина в исследованных культурах клеток 1-7 - стромальные линии из костного мозга мышей, дефицитных по ФНО, 8-первичная культура стромы костного мозга, 9-МБ5, 10 -тотальный костный мозг Приведены данные полуколичественного ОТ ПЦР, нормированные по трем генам «домашнего хозяйства» Б. Экспрессия мРНК Jedl в исследованных культурах клеток Обозначение - как на рисунке А

Как видно из рисунка, линии №3 и №5 отличались относительно более высоким уровнем экспрессии обоих маркеров Экспрессия /есй коррелировала с экспрессией этих маркеров и также была высока в линиях №3 и №5 Эти данные являются еще одним свидетельством в пользу участия 1есЬ в остеобластной дифференцировке и его потенциальной роли в формировании ниши стволовой клетки в костном мозге с участием остеобластов

Изучение экспрессии генов, влияющих на поддержание кроветворения, в клетках стромальных клеточных линий

Культивирование стволовых клеток крови (СКК) ex vivo представляет собой важную задачу при лечении многочисленных заболеваний системы кроветворения (Sauvageau et al, 2004) Стволовые клетки находятся в тесном взаимодействии со своим микроокружением, образующим так называемую «нишу» Необходимость дальнейшего изучения молекулярных механизмов регуляции процесса самоподдержания стволовой клетки очевидна

Эксперименты по выяснению вклада Jedi в передачу сигнала через рецепторы Notch были также выполнены нами с использованием другой модели В этой серии опытов клетки НЕК293, транзиентно экспрессирующие рецептор Notch и репортераую плазмиду CBF-luc, инкубировали либо с кондиционированной средой от клеток-продуцентов исследуемых белков (Рис 7В), либо с частично очищенными из клеток COSI рекомбинантными белками sJaggedMycHisó и sJediMycHisó (Рис 7Г) В качестве положительного контроля в данной системе мы также использовали трансфекцию клеток НЕК293 плазмидой, содержащей секретируемую форму Jaggedl, для которой ранее было показано негативное действие на мишени Notch (Small et al, 2001) Подобная инкубация в обоих случаях также приводила к снижению активности репортерного конструкта (Рис 7Г)

Итак, в использованных нами моделях Jedi приводит к подавлению эндогенной передачи сигнала через рецепторы Notch, что выражается в снижении активности промотора-мишени Notch Механизмы такого подавления в настоящее время нам неизвестны, но, возможно, Jedi связывается с рецепторами Notch, конкурируя тем самым с другими лигандами Для выяснения этого требуются дополнительные эксперименты по конкурентному связыванию

Jedi и остеобластная дифференцировка

По современным представлениям, остеобласты являются одним из главных компонентов ниши стволовой клетки, определяя локализацию и выход гемопоэтических клеток из ниши, а также процессы их самоподдержания и дифференцировки (Calvi et al, Zhang et al, 2003) Полученные нами эффекты Jedi в выживании гемопоэтических колониеобразующих предшественников, а также высокий уровень экспрессии этого белка в первичной строме костного мозга, служили предпосылкой к проверке возможной корреляции между экспрессией этого белка и дифференцировкой культуры в остеобластном направлении

Мы проанализировали экспрессию мРНК Jedi в первичной культуре мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга, подвергнутой in vitro остеобластной стимуляции Для этого подученную культуру МСК дифференцировали в присутствии глицерофосфата натрия и аскорбиновой кислоты В обеих популяциях анализировали экспрессию Jedi

Рисунок 8.

Экспрессия Jedl в тотальной фракции клеток костного мозга, первичной культуре стромы костного мозга и культурах МСК, измеренные методом ОТ ПЦР ("1еЛ28", "СРШ28" -28 циклов ПЦР), "1есЬ32"- 32 цикла ПЦР

& jf JJ jf & «sr Ф &

Jedi 28

Jedi _

32 -

GPDH^ mmív ^Л^ЙЛШ^йнйШ^

Фактор некроза опухолей (ФИО) является важным регулятором как СКК, так и стромальных клеток. В суспензионной фракции длительной культуры костного мозга (ДККМ) мышей, дефицитных по ФНО, выявляются незрелые стромальные клетки-предшественники, никогда не обнаруживаемые в ДККМ мышей дикого типа (Нифонтова с соавт, 2004) Эти клетки способны образовывать прикрепленные клеточные линии, часть из которых была проверена ранее на способность поддерживать кроветворение Все протестированные ФНО линии в различной степени поддерживали кроветворение т vitro в течение 10 недель

В данной части работы полученные стромальные клеточные линии были использованы для анализа экспрессии генов, регулирующих процессы самоподдержания и дифференцировки СКК В качестве клеток сравнения использовали подслой прилипающих клеток (ППК) ДККМ дикого типа, а также две клеточные линии - линия MS5, также полученная из ДККМ и поддерживающая рост ранних кроветворных предшественников, образующих области булыжника (КООБ), а также линия NIH ЗТЗ, обладающая низкой способностью к поддержанию кроветворения Экспрессию анализировали методом полуколичественного ОТ ПЦР Исследуемые гены были условно разбиты нами на 3 группы на основании их участях в процессах, регулирующих поведение СКК

Группа 1: гены адгезии и хоуминга

На рисунке 10 представлен анализ экспрессии некоторых генов, участвующих в регуляции процессов адгезии и хоминга СКК, в клонированных клеточных линиях, полученных от ФНО" мышей, а также в фибробластах MS5 и NIH3T3

Рисунок 10. Относительный уровень экспрессии генов адгезии и хоуминга в ФНО" клеточных линиях, MS5 и NIH ЗТЗ По оси абсцисс - анализируемые гены, по оси ординат - относительный уровень экспрессии Экспрессия в ППК принята за 1 Столбцы для ФНО" клеточных линий обозначают средний арифметический уровень экспрессии, точками обозначены уровни экспрессии для отдельных линий Данные приведены в логарифмической шкале

Уровень экспрессии в N-кадгерина в ФНО" клеточных линиях в 16 раз превышает таковой в ППК Этот белок отвечает за прикрепление СКК к остеобластам в кроветворной нише и взаимодействует с ß-катенином, повышение его экспрессии коррелирует с увеличением количества СКК в костном мозге (Zhang et al, 2003) Экспрессия генов, отвечающих за хоминг и состояние покоя СКК в костном мозге (ICAM, Jaggedl, Deltal), не отличается значительно в изучаемых клеточных линиях, ППК и MS5, в то время как в линии NM ЗТЗ экспрессия Jaggedl понижена Экспрессия генов белков внеклеточного матрикса, таких как остеопонтин (OPN), удерживающий СКК в нише и являющийся негативным регулятором их пролиферации (Nilsson et al, 2005), увеличена в клетках линий в среднем в 10 раз Описанные изменения говорят о том, что полученные линии ФНО" клеток имеют родство с остеобластами и, предположительно, могут поддерживать жизнеспособность ранних СКК Значительный интерес представляют также результаты по гену Kirre, кодирующему белок, необходимый для поддержания СКК Уровень экспрессии гена достоверно (в 4-5 раз) увеличен в ФНО' клетках по сравнению с ППК, и более чем в 120 раз повышен в линии MS5, при этом экспрессия SDF1 и в ФНО" линиях, и в MS5 снижена по сравнению с ППК Эти данные указывают на то, что поддержание КООБ линией MS5 и ФНО" линиями может быть связано с увеличенной экспрессией Kirre

Группа 2: Ростовые факторы и цитокины

Кондиционированные среды от всех полученных линий способны поддерживать рост колоний в полужидких средах в пределах от 40 до 130 % от контроля (смеси кондиционированных сред от линий WEHI ЗВ и L929) Анализ генной экспрессии показывает, что в некоторых линиях в несколько раз повышена экспрессия цитокинов, действующих на ранние стадии гемопоэза TP О, Ил-6, Ил-11 и FLT3 лиганда (рисунок 11), важное исключение при этом составляет SCF, уровень которого, напротив, снижен

Рисунок 11. Относительный уровень экспрессии генов ростовых факторов и цитокинов в клеточных линиях, полученных из ДККМ ФНО-дефицитных мышей и МЭ5 Обозначения - как на рисунке 10

Уровень экспрессии факторов, стимулирующих рост колоний в полужидких средах, не отличается в среднем от ППК, что соответствует данным, полученным с кондиционированными средами В линии N111 ЗТЗ был обнаружен заметный уровень экспрессии ТРО, О-СвБ, М-СвБ и БОР-7

Группа 3: Прочие ростовые факторы

Мы также проанализировали экспрессию ряда «неклассических» стромальных факторов, многие из которых в раннем развитии выполняют функцию морфогенов (рисунок 12)

Уровень экспрессии двух членов семейства Hedgehog, участвующих в дифференцировке тканей в раннем онтогенезе, незначительно варьирует в линиях и существенно не отличается от экспрессии в ППК Гены семейства Wnt, продуцируемые стромой кроветворных органов, влияют на пролиферацию, самоподдержание и функционирование СКК Повышенный уровень экспрессии в клетках ФИО был выявлен для трех генов - Wntl, Wnt5a, и в особенности WntlOb Экспрессия Wnt2b и Wnt3a, наоборот снижена по сравнению с ППК Характерно, что экспрессия большинства генов Wut снижена в клетках MS5 и NIH ЗТЗ

Рисунок 12 Относительный уровень экспрессии генов семейства ^тА и прочих ростовых факторов в клеточных линиях, полученных из ДККМ ФНО-дефицитных мышей и МБ5 Обозначения - как на рисунке 10

Для отдельных изученных генов нами был отмечен очень широкий разброс значений экспрессии между клонами Так, экспрессия гемопоэтических ростовых факторов - M-CSF, G-CSF, ТРО была до 6 раз выше по сравнению с ППК, экспрессия ИЛ-6, ИЛ-11 и Flt3 лиганда также значительно варьировала Подобные различия могут свидетельствовать о широком диапазоне экспрессии этих генов в разных клетках микроокружения m vivo Полученные нами данные наиболее хорошо согласуются с моделью, по которой поддержание ранних кроветворных клеток является интегральной функцией, зависящей от ряда факторов Вероятно, достижение сходного уровня поддержания гемопоэза различными типами и клонами клеток могут достигаться за счет экспрессии различных сочетаний позитивных регуляторов гемопоэза. Значительный вклад факторов адгезии в процессы, регулирующие жизнедеятельность СКК, косвенно подтверждается нашими данными по экспрессии этих молекул в линиях MS5 и NIH ЗТЗ Низкую поддерживающую активность клеток NIH ЗТЗ по сравнению с другими исследованными клетками можно объяснить, на основании наших данных, сниженной экспрессией N-кадгерина, остеопонтина, Kirre, Jagged, Delta и ранних цитокинов

Следует отметить, что возможности модификации стромальных клеток т vitro с целью повлиять на поддержание ими функционально полноценных СКК используются в настоящее время в недостаточной степени, однако полученные нами результаты выявляют, на наш взгляд, перспективные пути конструирования стромальных линий, оптимальным образом поддерживающих кроветворение

Возможности этого направления были исследованы в последней части данной работы

Влияние экспрессии белка Jaggedl в стромальном подслое на поддержание кроветворных предшественников в системе ко-культивирования in vitro

В последнее время появились прямые доказательства участия пути передачи сигнала через рецепторы Notch в регуляции судьбы СКК внутри их ниш (Calvi et al, 2003, Zhang et al, 2003, Duncan et al, 2005)

Данная часть работы посвящена изучению возможного использования белка Jaggedl для конструирования клеточных линий, способных к поддержанию кроветворения т vitro

Для этого мы создали ретровирусные конструкции, экспрессирующие кДНК Jaggedl Проведенные нами предварительные эксперименты не выявили существенного увеличения гемопоэз-поддерживакяцей активности в тотальной культуре клеток NIH ЗТЗ после ретровирусной трансдукции Jaggedl и селекции на неомицине Вероятной причиной этого может быть относительно низкий уровень экспрессии Jaggedl в тотальной культуре Поэтому в дальнейшем для экспериментов по совместному культивированию отбирали индивидуальные клеточные клоны с высокой экспрессией Jaggedl Для этого был создан конструкт, экспрессирующий белок Jaggedl, слитый с эпитопом V5 на С-конце (Jaggedl-V5) После ретровирусной трансдукции и селекции был получен ряд клеточных клонов, в каждом из которых уровень экспрессии Jaggedl-V5 оценивали с помощью иммуноблоттинга с последующей визуализацией белка с помощью антител к V5 Дальнейшая работа осуществлялась с использованием трех клонов (Jagged#3, Jagged#13 и Jagged#21), экспрессирующих хорошо детектируемые иммуноблоттингом количества Jaggedl-V5

Для оценки пролиферации клеток костного мозга на подслое фибробластов NIH3T3, экспрессирующих Jaggedl-V5, тотальную фракцию клеток костного мозга культивировали в течение 4 недель в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки в качестве единственного источника ростовых факторов В ходе такого культивирования были отмечены весьма значительные различия в способности клонов к поддержанию гемопоэтических клеток (Рисунок 13)

Рисунок 13. Влияние оверэкспрессии Jaggedl в клетках NIH ЗТЗ на их способность поддерживать гемопоэз in vitro Показаны результаты анализа

способности трех

клеточных клонов,

экспрессирующих Jaggedl, и контрольного клона (пео) поддерживать продукцию гемопоэтических клеток

Время культивирования, недели

Наибольшей поддерживающей способностью обладал клоп Jagged#21, при культивировании на котором число ядерных клеток было максимально через 3 недели культивирования. При этом в контроле (культивирование на клетках ТЛН ЗТЗ, тран еду циро ванных пустым вектором) образование гемопоэтических клеток к этому сроку уже полностью прекращалось. Промежуточной способностью обладал клон .1а{>Ёес)#13, в то время как клон Jagged#3 не отличался существенно от контрольных клеток, несущих пустой вектор.

Морфологически такие отличия между клопами выражались в появлении большого числа крупных адгезивных скоплений клеток, вероятно, являющихся индивидуальными клонами-потомками отдельных кроветворных предшественников (Рисунок 14). Клон ,Tagged#3 и контрольные клетки практически не содержали таких адгезивных скоплений.

Рисунок 3 4. Морфология клеток костного мозга после их культивирования с клонами NIH ЗТЗ. экспрессирующими Jaggedl, в течение 7 дней.

Для проверки способности полученных клонов поддерживать кроветворные предшественники нами был поставлен эксперимент по опенке колониеобразующей активности клеток. Наши данные свидетельствуют о том, что клон Jagged#21 обладает существенно более высокой способностью стимулировать колонисобразование /л vitro по сравнению с остальными клонами. В частности, после 16 дней культивирования на подслое уровень поддержания колониеобразующей активности был более чем в 100 раз выше для клона Jagged#21 по сравнению с контролем (Phcjdok 15).

Рисунок 15. Сравнение способности клонов NIH ЗТЗ, экспресс ирующих Jaggedl, и контрольного клона (neo) к поддержанию колониеобразующих м иелои дных предшественников. ¡ío-культивированне клеток костного мозга с клонами N1H ЗТЗ проводили в течение 16 дней; колон необразующую активность анализировали после 11 дней культивирования в метил целлюлозе.

Jagsetfc* 13 В Ja£3«J#21 □ Jaggeti#3

В описанных экспериментах мы анализировали эффект от оверэкспрессии Jagged 1 в клетках NIH ЗТЗ, исходно не способных к поддержанию гемопоэза, на кроветворение in vitro Полученные нами данные свидетельствуют о том, что оверэкспрессия Jaggedl может кардинально усилить функцию поддержания кроветворных предшественников стромальными клетками в системе ко-культивирования Этот факт согласуется с современными представлениями о ключевой роли передачи сигнала через рецепторы Notch в регуляции гемопоэза Тем не менее, наши результаты вносят в эта представления существенные коррективы, поскольку показывают, что высокий уровень экспрессии Jaggedl в клетках подслоя сам по себе еще недостаточен для возникновения поддерживающей гемопоэз активности

В заключение следует отметить, что полученные в работе данные дополняют современные представления о функционировании ниши стволовых и прогениторных клеток и вкладе отдельных молекулярных путей в регуляцию самоподдержания кроветворных клеток Данная работа вносит вклад в изучение возможности «модификации» кроветворного окружения и решения проблемы экспансии кроветворных предшественников и стволовых клеток т vitro

Выводы

1 Идентифицирован новый ген Jedi, кодирующий трансмембранный беклок, содержащий лидерный пептид, 14 повторов эпидермального фактора роста и DSL-подобный домен во внеклеточной части

2 Показано, что Jedi экспрессируется в гемопоэтических клетках с кратковременной репопулирующей активностью и в меньшей степени - в клетках с кратковременной репопулирующей активностью.

3 Оверэкспрессия Jedi в стромальных линиях МН ЗТЗ и MSS негативно влияет на выживание колониеобразующих гемопоэтических миелоидных предшественников в системе ко-культивирования in -vitro Данный эффект требует непосредственного физического контакта гемопоэтических и стромальных клеток

4 Продемонстрировано ингибирование активности мишеней Notch как при трансфекции конструктами, несущими полноразмерную кДНК Jedi, так и при инкубации клеток с растворимым белком Jedi

5 Анализ экспрессии генов, участвующих в регуляции гемопоэза, в стромальных линиях, полученных из костного мозга мышей с инактивацией гена фактора некроза опухолей, показал высокий уровень экспрессии генов N-cadhenn, osteopontm, Kirre, ТРО, IL6, IL11 и Flt3L в этих линиях Показаны большие различия в экспрессии исследованных генов между клеточными линиями, отличающимися сходными способностями к поддержанию гемопоэза.

6 Получены клеточные линии, стабильно экспрессирующие белок Jaggedl Показано более чем 100-кратное увеличение числа миелоидных колоний при культивировании клеток костного мозга на одном из клеточных клонов, экспрессирующих Jaggedl, по сравнению с контролем Высокий уровень экспрессии Jaggedl в клетках подслоя, однако, сам по себе еще недостаточен для возникновения поддерживающей гемопоэз активности

Работы, опубликованные по теме диссертации Статьи

1 Розов ФН, Нифонтова ИН, Белявский АВ, Дризе НИ Изучение экспрессии генов, влияющих на поддержание кроветворения, в клетках стромальиых линий, полученных от мышей, дефицитных по ФНО Доклады Академии Наук 2006, Т 48 №2 с 1-4

2 Розов ФН, Белявский АВ Влияние экспрессии белка Jaggedl в стромальном подслое на поддержание кроветворных предшественников в системе ко-культивирования in vitro Клеточные технологии в биологии и медицине 2007, №2 с 78-82

3 Knvtsov AV, Rozov FN, Zmovyeva MV, Hendrikx PJ, Visser JW, Belyavski AV Jedi-a novel transmembrane protein expressed m early hematopoietic cells J Cellular Biochem 2007, V 101 P 767-784

Тезисы

4 Розов ФН, Морина ГВ, Равчеева АБ, Зиновьеева MB, Белявский АВ Поиск генов, эспрессирукяцихся на ранних стадиях гемопоэза мыши, при помощи анализа библиотек кДНК. ХШ Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва 7-9 февраля 2001 С 55

5 Розов ФН, Кривцов АВ, Зиновьева MB, Белявский АВ Jedi-новый белок, содержащий множественные повторы эпидермального фактора роста, экспрессирукяцийся в ранних гемопоэтических предшественниках Научные труды Ш съезда физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс 19-23 сентября 2005. С 115

6 Knvtsov AV, Rozov FN, Hendrikx PJ, Jiang Y, Visser JW, Belyavski AV Jedi, a novel protein containing multiple EGF-like repeats and expressed m early hematopoietic cells 7th international Engelhaidt conference on molecular biology. Nov 28-Dec 2,2004, Suzdal, Russia.

7 Nifontova IN, Rosov FN, Behavsky AV, and Dnze NJ Properties of MSC Derived Stromal Cell Lines Developed from Bone Marrow of TNF Knockout Mice 47 ASH Annual Meeting Abstracts Dec 10-13 2005, Atlanta, USA, 106 Abstract 4302

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от Ü 1.12,99 г. Подписано к нечата 04.09.2007 г. Формат 60x90 J/16, Усл.печ.л, J ,25, Тираж 100 экз. Заказ 412, Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 1J9992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им, М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Розов, Федор Николаевич

Оглавление.

Основные использованные обозначения и сокращения.

Введение.

1. Актуальность проблемы.

2. Цель работы.

3. Основные задачи.

4. Научная новизна и практическое значение работы.

5. Основные положения, выносимые на защиту.

6. Благодарности.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Современные представления о гемопоэзе.

1.2. Ниша стволовой клетки костного мозга.

1.2.1. Ниша стволовой клетки в эндостале.

1.2.2. Васкулярная ниша СКК.

1.3. Сигнальные пути, регулирующие самоподдержание и дифференцировку СКК и клеток-предшественников.

1.3.1. Передача сигнала через рецепторы Wnt.

1.3.2. Ангиопоэтины и передача сигнала через рецепторы Tie.

1.3.3. Транскрипционные факторы группы НОХ.

1.3.4. Молекулы Hedgehog и передача сигнала через рецепторы

1.3.5. Белок Kirre/NEPH2.

1.3.6. Рецепторы FGF.

1.3.7. Адгезионные взаимодействия гемопоэтических клеток со стромальным окружением.

1.4. Передача сигнала через рецепторы Notch и их роль в гемопоэзе.

1.4.1. Роль рецепторов Notch в дифференцировке клеток. Гомотипические и гетеротипические модели взаимодействия.

1.4.2. Молекулярный механизм передачи сигнала через рецепторы Notch.

1.4.3. CSL-независимый путь.

1.4.4. Рецепторы Notch в гемопоэзе.

1.4.5. Лиганды Notch в гемопоэзе.

1.4.6. Растворимые и иммобилизованные лиганды Notch.

1.5. Проблема экспансии стволовых клеток in vitro.

1.6. Анализ генной экспрессии микроокружения стволовой клетки.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Методы культуры клеток.

2.1.1. Клеточные линии.

2.1.2. Получение популяций гемопоэтических клеток костного мозга.

2.1.3. Получение культуры первичной стромы и прикрепленных клеточных линий из ДККМ мышей, дефицитных по ФНО-а.

2.1.4. Дифференцировка миобластов, мезенхимальных стволовых клеток и первичной культуры стромы костного мозга.

2.1.5. Ретровирусные конструкты и супернатанты.

2.1.6. Ретровирусная трансдукция клеток NIH ЗТЗ и MS5.

2.1.7. Совместное культивирование для анализа передачи сигнала через рецепторы Notch.

2.1.8. Анализ способности гемопоэтических клеток к колониебразованию.

2.1.9. Ретровирусная трансдукция моноядерных костного мозга.

2.1.10. Культивирование моноядерных клеток костного мозга с трансдуцированными ретровирусами клетками линии NIH ЗТЗ и MS5.

2.1.11. Окрашивание клеток и FACS анализ.

2.2. Молекулярные методы.

2.2.1. ПЦР амплификация.

2.2.2. Полуколичественная ОТ ПЦР.

2.2.3. Саузерн-блот гибридизация.

2.2.4. Нозерн-блот гибридизация.

2.2.5. Манипуляции с ДНК, клонирование ДНК.

2.2.6. Экспрессия и очистка белков.

2.2.7. Получение поликлональных антител к Jedi.

2.2.8. Получение амплифицированных библиотек кДНК из тканей мыши.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1 .Структурно-функциональный анализ нового гена Jedi.

3.1.1. Клонирование кДНК и анализ первичной структуры белка

Jedi.

3.1.2. Анализ экспрессии Jedi.

3.1.3. Выживание колониеобразующих клеток на монослое фибробластов, экспрессирующих Jedi.

3.1.4. Jedi и передача сигнала через рецепторы Notch.

3.1.5. Jedi и остеобластная дифференцировка.

3.2. Изучение экспрессии генов, влияющих на поддержание кроветворения, в клетках стромальных клеточных линий.

3.2.1. Гены адгезии и хоуминга.

3.2.2. Ростовые факторы и цитокины.

3.2.3. Прочие ростовые факторы.

3.3. Влияние экспрессии белка Jaggedl в стромальном подслое на поддержание кроветворных предшественников в системе ко-культивирования in vitro.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Jedi и другие гены, участвующие в регуляции дифференцировки и самоподдержания стволовых и прогениторных клеток крови"

Регуляция процессов дифференцировки и гомеостаза в клеточных системах является одной из ключевых проблем современной биологии. Механизмы, позволяющие клеткам сохранять свой фенотип и пролиферировать с необходимой скоростью, интенсивно изучаются, однако во многом по-прежнему остаются неизвестны. Особый интерес представляет гемопоэтическая система, являющаяся наглядной моделью того, как в течение всей жизни организма небольшое количество стволовых клеток обеспечивает организм всеми необходимыми элементами крови, адаптируясь к его потребностям.

Поддержание и размножение стволовых клеток крови (СКК) ex vivo представляет собой важную задачу при лечении многочисленных заболеваний системы кроветворения (Sauvageau et al., 2004). На протяжении многих лет делались попытки размножения СКК путем культивирования в присутствии коктейлей ростовых факторов, однако полученные таким образом культуры не содержали достаточного числа клеток, способных к долговременному восстановлению гемопоэза в организме (Robinson et al., 2005). Становится все более очевидным, что для достижения успеха в этой области необходимо учитывать данные последних лет о регуляции свойств СКК локальными стромальными факторами. Стволовые клетки находятся в тесном взаимодействии со своим микроокружением, образующим так называемую «нишу». Нишу для СКК образуют остеобластные, и, вероятно, эндотелиальные клетки (Calvi et al.,2003 Zhang et al., 2003, Kiel et al., 2005). В настоящее время идентифицированы многие белковые факторы и сигнальные пути, задействованные в поддержании СКК в недифференцированном состоянии. Вместе с тем, необходимость дальнейшего изучения молекулярных механизмов регуляции процесса само поддержания стволовой клетки очевидна,

Данная работа пополняет современные представления о молекулярных процессах, происходящих внутри ниши стволовых и прогениторных клеток, и открывает перспективы для создания оптимальных условий для in vitro культивирования и вирусной трансдукции СКК с использованием стромальных культур, несущих стимулирующие гемопоэз мембранносвязанные факторы.

2. Цель работы

Целью данной работы являлась идентификация новых генов, принимающих участие в регуляции самоподцержания стволовых клеток крови, а также детальное изучение роли в этих процессах отдельных охарактеризованных ранее белков

3. Основные задачи

1) Изучить роль гена Jedi в процессах поддержания гемопоэтических предшественников.

2) Произвести анализ экспрессии некоторых ключевых генов, ответственных за самоподцержание и дифференцировку СКК, в стромальных линиях, полученных из костного мозга мыши.

3) Оценить влияние оверэкспрессии белка Jagged 1 в линии фибробластов NIH3T3 на гемопоэз in vitro в системе совместного культивирования.

4. Научная новизна и практическое значение работы

Обнаружен новый ген Jedi, экспрессирующийся в ранних кроветворных предшественниках, и показано его участие в регуляции дифференцировки кроветворных предшественников и передаче сигнала через рецепторы Notch. Также продемонстрировано позитивное влияние оверэкспрессии белка Jagged1 в стромальном подслое на колониеобразующие предшественники в системе in vitro.

Проведенные исследования позволяют обогатить современные представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе биологии стволовых и прогениторных клеток. Результаты представленной работы открывают перспективы для создания оптимальных условий для in vitro культивирования и вирусной трансдукции СКК с использованием стромальных культур, несущих стимулирующие гемопоэз мембранносвязанные факторы. Результаты работы демонстрируют возможность получения клеточных линий, поддерживающих кроветворные предшественники in vitro, из клеток, исходно такой активностью не обладающих, с помощью относительно простых генетических манипуляций.

5. Основные положения, выносимые на защиту

1 .Идентифицированный ген Jedi экспрессируется в гемопоэтических клетках с кратковременной репопулирующей активностью и в меньшей степени - в клетках с кратковременной репопулирующей активностью.

2.0верэкспрессия Jedi в фибробластах NIH ЗТЗ негативно влияет на выживание колониеобразующих гемопоэтических миелоидных предшественников в системе ко-культивирования клеток in vitro. Данный эффект требует непосредственного физического контакта гемопоэтических и стромальных клеток.

3.Jedi ингибирует активности мишеней Notch как при трансфекции конструктами, несущими полноразмерную кДНК Jedi, так и при инкубации клеток с растворимой формой белка.

4.Гены N-Cadherin, osteopontin, Kirre, ТРО, IL6, IL11 и Flt3L экспрессируются на высоком уровне в стромальных линиях, полученных из костного мозга мышей с инактивацией гена фактора некроза опухолей; наоборот, уровень экспрессии гена SCF снижен во всех линиях.

5.Стабильная экспрессия белка Jaggedl.B фибробластах NIH ЗТЗ приводит к более чем 100-кратному увеличению числа миелоидных колониеобразующих клеток при культивировании клеток костного мозга на одном из клеточных клонов, экспрессирующих Jagged 1. В то же время, высокий уровень экспрессии Jagged 1 в клетках подслоя сам по себе еще недостаточен для возникновения поддерживающей гемопоэз активности.

6. Благодарности

В первую очередь хочу выразить искреннюю благодарность своему научному руководителю, заведующему лабораторией Молекулярной биологии развития Александру Вадимовичу Белявскому, за чуткое руководство и постоянную помощь в освоении методик, проведении исследований, интерпретации полученных данных и оформлении работы; всем бывшим и настоящим сотрудникам лаборатории Молекулярной биологии развития за теплую атмосферу, постоянное внимание и поддержку; сотрудникам лаборатории Физиологии кроветворения Гематологического Научного Центра Российской Академии Медицинских Наук Нине Иосифовне Дризе, Максиму Александровичу Эршлеру, Ирине Николаевне Нифонтовой и Дарье Александровне Свинаревой за плодотворное сотрудничество и помощь в интерпретации и оформлении полученных результатов, а также всем коллегам и сотрудникам Института Молекулярной биологии РАН за постоянную поддержку и помощь на всех этапах работы. Также хочу выразить большую благодарность Центру медицинских исследований Университета Осло за финансовую поддержку научных исследований.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Розов, Федор Николаевич

Выводы

1. Идентифицирован новый ген Jedi, кодирующий белок, содержащий лидерный пептид, 14 повторов эпидермального фактора роста и DSL-подобный домен во внеклеточной части.

2. Jedi экспрессируется в гемопоэтических клетках с кратковременной репопулирующей активностью и в меньшей степени - в клетках с кратковременной репопулирующей активностью.

3. Оверэкспрессия Jedi в стромальных линиях NIH ЗТЗ и MS5 негативно влияет на выживание колониеобразующих гемопоэтических миелоидных предшественников в системе ко-культивирования in vitro. Данный эффект требует непосредственного физического контакта гемопоэтических и стромальных клеток.

4. Jedi оказывает ингибирующее действие на активности мишеней Notch как при трансфекции конструктами, несущими полноразмерную кДНК Jedi, так и при инкубации клеток с растворимым белком Jedi.

5. Показан высокий уровень экспрессии генов N-cadherin, osteopontin, Kirre, ТРО, IL6, IL11 и FltSL в стромальных линиях, полученных из костного мозга мышей с инактивацией гена фактора некроза опухолей, уровень экспрессии гена SCF, напротив, был снижен во всех линиях. Показаны большие различия в экспрессии исследованных генов между клеточными линиями, отличающимися сходными способностями к поддержанию гемопоэза.

6. Получены клеточные линии, стабильно экспрессирующие белок Jagged 1. Показано более чем 100-кратное увеличение числа миелоидных колоний при культивировании клеток костного мозга на одном из клеточных клонов, экспрессирующих Jagged 1, по сравнению с контролем. Высокий уровень экспрессии

Jagged 1 в клетках подслоя, однако, сам по себе еще недостаточен для возникновения поддерживающей гемопоэз активности.

Печатные работы Статьи

1. Розов ФН, Нифонтова ИН, Белявский АВ, Дризе НИ. Изучение экспрессии генов, влияющих на поддержание кроветворения, в клетках стромальных линий, полученных от мышей, дефицитных по ФНО. Доклады Академии Наук. 2006, Т.48. №2. с. 1-4.

2. Розов ФН, Белявский АВ. Влияние экспрессии белка Jaggedl в стромальном подслое на поддержание кроветворных предшественников в системе коку льтивирования in vitro. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007, №2. с. 78-82.

3. Krivtsov AV, Rozov FN, Zinovyeva MV, Hendrikx PJ, Visser JW, Belyavski AV. Jedi-a novel transmembrane protein expressed in early hematopoietic cells. J. Cellular Biochem. 2007, V.101. P.767-784.

Тезисы

4. Розов ФН, Морина ГВ, Равчеева АБ, Зиновьеева MB, Белявский АВ. Поиск генов, эспрессирующихся на ранних стадиях гемопоэза мыши, при помощи анализа библиотек кДНК. XIII Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва. 7-9 февраля 2001. С. 55.

5. Розов ФН, Кривцов АВ, Зиновьева MB, Белявский АВ. Jedi-новый белок, содержащий множественные повторы эпидермального фактора роста, экспрессирующийся в ранних гемопоэтических предшественниках. Научные труды Ш съезда физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс. 19-23 сентября 2005. С.115.

6. Krivtsov AV, Rozov FN, Hendrikx PJ, Jiang Y, Visser JW, Belyavski AV. Jedi, a novel protein containing multiple EGF-like repeats and expressed in early hematopoietic cells. 7th international Engelhardt conference on molecular biology. Nov 28-Dec. 2,2004, Suzdal, Russia.

7. Nifontova IN, Rosov FN, Beliavsky AV, and Drize NJ. Properties of MSC Derived Stromal Cell Lines Developed from Bone Marrow of TNF Knockout Mice. 47 ASH Annual Meeting Abstracts. Dec. 10-13 2005, Atlanta, USA, 106: Abstract 4302.

Заключение.

Изучение биологии стволовых и прогениторных клеток крови, а также клеток их микроокружения, имеет огромный интерес, как с прикладной, так и с теоретической точек зрения. Молекулярные механизмы, регулирующие процессы самоподцержания и дифференцировки этих клеток, являются предметом пристального изучения. Культивирование СКК in vitro в присутствии коктейлей ростовых факторов обычно приводит к их быстрой потере, что выражается в значительном снижении числа клеток, способных к долговременному восстановлению гемопоэза в организме (Robinson et al., 2005). В то же время, СКК имеют большое значение для практической медицины, поскольку играют определяющую роль при трансплантациях костного мозга и могут быть использованы, при условии адекватного развития технологии, для коррекции врожденных и приобретенных заболеваний кроветворной и иммунной систем с помощью введения в эти клетки терапевтических генов (Sadelain et al., 2005). Для достижения успеха в этой области необходимо учитывать, что состояние и судьба СКК зависят в значительной степени от взаимодействия с компонентами их стромального окружения, формирующими «нишу» стволовой клетки.

Представленная работа посвящена клонированию и изучению функций одного из генов, вовлеченных в регуляцию состояния стволовых и прогениторных клеток костного мозга мыши. Приведенные нами данные позволяют сделать вывод об участии гена Jedi в регуляции состояния «ниши» стволовой клетки и тонкой настройки передачи сигнала через рецепторы Notch.

Возможности «усовершенствования» стромальных клеток с целью создания системы поддержания СКК in vitro и введения в них экспрессионных конструктов используются в настоящее время довольно слабо. Наша работа доказывает, что с помощью относительно простых генетических манипуляций можно получать клеточные линии, поддерживающие кроветворные предшественники in vitro, из клеток, исходно такой активностью не обладающих. Результаты представленной работы открывают перспективы создания оптимальных условий для in vitro культивирования и вирусной трансдукции СКК с использованием стромальных культур, несущих стимулирующие гемопоэз мембранносвязанные факторы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Розов, Федор Николаевич, Москва

1.Нифонтова ИН, Ольшанская ЮВ, Дризе НИ. Бюлл. эксп. биол. мед. 2004. Т.138. С. 284-289.

2. Abdallah ВА, Jensen СН, Gutierrez G, Leslie R, Jensen TG, Kassem M. Regulation of human skeletal stem cells differentiation by Dlkl/Pref-1. J Bone Miner Res. 2004.19 (5): 841-852.

3. Aiuti A, Tavian M, Cipponi A, Ficara F, Zappone E, Hoxie J, Peault B, Bordingnon C. Expression of CXCR4, the receptor for stromal cell-derived factor-1 on fetal and adult human lymphohematopoietic progenitors. Eur J Immunol. 1999. 29:18231831.

4. Amsellem S, Pflumio F, Bardinet D, Izac B, Charneau P, Romeo PH, Dubart-Kupperschmitt A, Fichelson S. Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells by direct delivery of the HOXB4 homeoprotein Nat Med. 2003. Nov 9(11):1423-1427.

5. Arai F, Hirao A, Ohmura M, Sato H, Matsuoka S, Takubo K, Ito K, Koh GY, Suda T. Tie2/Angiopoietin 1 signaling regulates HSC quiescence in a bone marrow niche Cell. 2004. 118:149-161.

6. Artavanis-Tsakonas S, Matsuno K, Fortini ME Notch signaling. Science. 1995. 268(5208): 225-232.

7. Audet J, Miller CL, Eaves CJ, Piret JM. Common and distinct features of cytokine effects on hematopoietic stem and progenitor cells revealed by dose-response surface analysis. Biotechnol Bioeng. 2002. 80(4): 393-404.

8. Audet J, Miller CL, Rose-John S, Piret JM, Eaves CJ. Distinct role of gpl30 activation in promoting self-renewal divisions by mitogenically stimulated murine hematopoietic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2001. 98(4): 1757-1762.

9. Baladron V, Ruiz-Hidalgo MJ, Nueda ML, Diaz-Guerra MJ, Garcia-Ramirez JJ, Bonvini E, Gubina E, Laborda J. dlk acts as a negative regulator of Notchl activation through interactions with specific EGF-like repeats. Exp Cell Res. 2005. 303(2):343-359.

10. Barletta GM, Kovari IA, Verma RK, Kerjaschki D, Holzman LB. Nephrin and Nephl co-localize at the podocyte foot process intercellular junction and form cis hetero-oligomers. J Biol Chem. 278 (21): 19266-19271.

11. Bennett CN, Longo KA, Wright WS, Suva LJ, Lane TF, Hankenson KD, MacDougald OA. Regulation of osteoblastogenesis and bone mass by WntlOb. Proc Natl Acad Sci USA. 2005.102: 3324-3329.

12. Beresten SF, Stan R, van Brabant AJ, Ye T, Naureckiene S, Ellis NA. Purification of overexpressed hexahistidine-tagged BLM N431 as oligomeric complexes. Protein Expr Purif. 1999. 17:239-248.

13. Bhardwaj G, Murdoch B, Wu D, Baker DP, Williams KP, Chadwick K, Ling LE, Karanu FN, Bhatia M. Sonic hedgehog induces the proliferation of primitive human hematopoietic cells via BMP regulation. Nat Immunol. 2001. 2(2): 172-180.

14. Bhatia R, McGlave P, Verfaille C. Treatment of marrow stroma with interferonalpha restores normal beta 1 integrin-dependent adhesion of chronic myelogenous leukemia hematopoietic progenitors: role of MIP-1 alpha. J Clin Invest. 1995. 96: 931-939.

15. Bi Y, Stuelten CH, Kilts T, Wadhwa S, Iozzo RV, Robey PG, Chen X. Extracellular Matrix Proteoglycans Control the Fate of Bone Marrow Stromal Cells J. Biol. Chem. 2000. 280 (34): 30481-30489.

16. Bigas A, Martin DI, Milner LA Notchl and Notch2 inhibit myeloid differentiation in response to different cytokines. Mo.l Cell. Biol. 1998. 18(4):2324-2333.

17. Bray S, Furriols M. Notch pathway: making sense of suppressor of hairless.Curr Biol. 2001.11(6): 217-221

18. Bush G, diSibio G, Myamoto A, Denault J-B, Leduc R, Weinmaster G. Ligand-induced signaling in the absence of furin processing of Notch. Dev. Biol. 2001. 229: 494-502

19. Calvi LM, Adams GB, Weibrecht KW, Weber JM, Olson DP, Knight MC, Martin RP, Schipani E, Divieti P, Bringhurst FR, Milner LA, Kronenberg HM, Scadden DT. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 2003. 425: 841-846.

20. Chomczynski P, Sacchi N Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal.Biochem. 1987. 162: 156-159.

21. Coombe DR, Watt SM, Rarish CR. Mac-1 (CDlib/CD 18) and CD45 mediate the adhesion of hematopoietic progenitor cells to stromal cell elements via recognition of stromal heparan sulfate. Blood. 1994. 84: 739-752.

22. Crean SM, Meneski JP, Hullinger TG. N-linked sialyted sugar receptors support haematopoietic cell-osteoblast adhesions. Br J. Haematology. 2004.124: 534-546.

23. Curry JL, Trentin JJ, Wolf N. Hemopoietic spleen colony studies. II. Erythropoiesis. J. Exp. Med. 1967. 125. 707-720.

24. Dallas MH, Varnum-Finney B, Delaney C, Kato K, Bernstein ID. Density of the Notch ligand Deltal determines generation of B and T cell precursors from hematopoietic stem cells. J. Exp. Med. 2005. 201 (9>: 1361-1366.

25. De Haan G, Weersing E, Dontje B, van Os R, Bystrykh LV, Vellenga E, Milner G. In vitro generation of long-term repopulating hematopoietic stem cells by fibroblast growth factor-1. Developmental Cell. 2003. 4; 241-251.

26. Deguchi Y, Moroney FM, Kehrl JH. Expresion of HOX2-3 homeobox gene in human lymphocytes and lymphoid tissues. Blood. 1991. 78. 445-450.

27. Delaney C, Varnum-Finney B, Aoyama K, Brashem-Stein C, Bernstein ID. Dose-dependent effects of the Notch ligand Deltal on ex vivo differentiation and in vivo marrow repopulating ability of cord blood cells. Blood. 2005. 106(8):2693-2699.

28. Delehanty LL, Mogass M, Gonias SL, Racke FK, Johnstone B, Goldfarb AN. Stromal inhibition ofmegakaryocytic differentiation is associated with blockade of sustained Rap 1 activation. Blood. 2003.101: 1744-1751.

29. Duncan AW, Rattis FM, DiMascio LN, Congdon KL, Pazianos G, Zhao C, Yoon K, Cook JM, Willert K, Gaiano N, Reya T. Integration of Notch and Wnt signaling in hematopoietic stem cell maintenance. Nat. Immunol. 2005. 6(3):314-22.

30. Ellisen LW, Bird J, West DC, Soreng AL, Reynolds TC, Smith SD, Sklar J. TAN-1, a human homolog of the Drososhila Notch gene, is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms. Cell. 1991. 66(4): 649-661.

31. Ferrell CM, Dorsam ST, Ohta H, Humphries RK, Derynck MK, Haqq C, Largman C, Lawrence HJ. Activation of stem-cell specific genes by HOXA9 and HOXAIO homeodomain proteins in CD34+ human cord blood cells. Stem Cells. 2005. 23: 644-655.

32. Fitzgerald K, Greenwald I. Interchangeability of Caenorhabditis elegans DSL proteins and intrinsic signalling activity of their extracellular domains in vivo .Development. 1995. 121(12): 4275-82.

33. Fortini ME. Gamma-secretase-mediated proteolysis in cell-surface-receptor signalling. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002. 3(9): 673-684.

34. Fortunel N, Hatzfeld J, Kisselev S. Release from quiescence of primitive human hematopoietic stem/progenitor cells by blocking their cell-surface TGF-beta type II receptor in a short-term in vitro assay. Stem Cells. 2000.18: 102-111.

35. Fraser CC, Eaves CJ, Szilvassy SJ, Humphries RK. Expansion in vitro of retrovirally marked totipotent hematopoietic stem cells. Blood. 1990. 76(6): 10711076.

36. Fraser CC, Szilvassy SJ, Eaves CJ, Humphries RK. Proliferation of totipotent hematopoietic stem cells in vitro with retention of long-term competitive in vivo reconstituting ability. Proc. Nat.l Acad. Sc.i USA. 1992. 89(5):1968-1972.

37. Gong, JK. 1978. Endosteal marrow: a rich source of hematopoietic stem cells. Science 199:1443-1445.

38. Graham A, Papalopulu N, Krumlauf R The murine and Drosophila homeobox clusters have common features of organization and expression. Cell. 1989. 57: 367-378.

39. Hardy C, Minguell J. Modulation of the adhesion of hemopoietic progenitor cells to the RGD site of fibronectin by interleukin 3. J. Cel.l Physiol. 1995.164: 315-323.

40. Hasserjian RP, Aster JC, Davi F, Weinberg DS, Sklar J. Modulated expression of Notchl during thymocyte development. Blood. 1996. 88 (3): 970-976.

41. Hicks C, Johnston SH, diSibio G, Collaso A, Vog TF, Weinmaster G. Fringe differentially modulates Jaggedl and Deltal signaling through Notchl and Notch2. Nature Cell. Biol. 2000. 2(8). 515-520.

42. Hsieh JJ, Henkel T, Salmon P, Robey E, Peterson MG, Hayward SD. Truncated mammalian Notchl activates CBFl/RBPJk-repressed genes by a mechanism resembling that of Epstein-Barr virus EBNA2. Mol. Cell. Biol. 1996. 16: 952-959.

43. Hukriede NA, Gu Y, Fleming RJ. A dominant-negative form of Serrate acts as a general antagonist of ligand-dependent Notch activation. Development. 1997. 124(17): 3427-3437.

44. Iscove NN, Nawa K. Hematopoietic stem cells expand during serial transplantation in vivo without apparent exhaustion. Curr .Biol. 1997. 7(10): 805-808.

45. Ivanova NB, Belyavsky AV. Identification of differentially expressed genes by restriction endonuclease-based gene expression fingerprinting. Nucleic Acids Res. 1995. 23: 2954-2958.

46. Jacobsen FW, Veiby OP, Stokke T, Jacobsen S J. TNF-alpha bidirectionally modulates the viability of primitive murine hematopoietic progenitor cells in vitro. J. Immunol. 1996. 157(3): 1193-1199.

47. Jones P, May G, Healy L, Brown J, Hoyne G, Delassus S, Enver T. Stromal expression of Jagged 1 promotes colony formation by fetal hematopoietic progenitor cells. Blood. 1998.92(5): 1505-1511

48. Kiel MJ, Yilmaz OH, Iwashita T, Yilmaz OH, Terhorst C, Morrison SJ. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 2005.121(7): 1109-1121.

49. Kiger AA, White-Cooper H, Fuller MT. Somatic support cells restrict germlone stem cell self-renewal and promote differentiation. Nature. 2000. 407: 750-754.

50. Koch U, Yuan JS, Harper JA, Guidos CJ. Fine-tuning Notchl activation by endocytosis and glycosylation. Seminars in Immunology. 2003.15: 99-106.

51. Kojika S and Griffin JD. Notch receptors and hematopoiesis. Exp. Hematol. 2001. 29:1041-1052.

52. Kongsuwan K, Webb E, Housiaux P, Adams JMExpression of multiple homeobox genes within diverse mammalian haematopoietic lineages. EMBO J. 1988. 7: 12311238.

53. Kopp HG, Avecilla ST, Hooper AT, Rafii S. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. Physiology (Bethesda MD). 2005. 20: 349-356.

54. Krosl J, Austin P, Beslu N, Kroon E, Humphries RK, Sauvageau G. In vitro expansion of hematopoietic stem cells by recombinant TAT-HOXB4 protein. Nat. Med. 2003.9(11): 1428-1432.

55. LauringAS and Overbaugh J. Evidence that an IRES within the Notch2 coding region can direct expression of a nuclear form of the protein. Mol. Cell. 2000. 6: 939-945.

56. Lawrence HJ, Helgason CD, Sauvageau G, Fong S, Izon DJ, Humphries RK, Largman CI. Mice bearing a targeted interruption of the homeobox gene HOXA9 have defects in myeloid, erythoid and lymphoid hematopoiesis. Blood. 1997. 89: 1922-1930.

57. Lord BI, Testa NG and Hendry JH. The relative spatial distributions of CFUs and CFUc in the normal mouse femur. Blood. 1975.46:65-72.

58. Luo B, Aster JC, Hasserjian RP, Kuo F, Sklar J. Isolation and functional analysis of a cDNA for human Jagged2, a gene encoding a ligand for the Notch receptor. Mol. Cell. Biol. 1997. 17: 6057-6067

59. Magli MC, Langman C, Lawrence HJ. Effects of HOX homeobox genes in blood cell differentiation. J. Cell Physiology. 1997.173:168-177.

60. Maloney MA and Patt HM. On the origin of hematopoietic stem cells after local marrow extirpation. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1975. 149: 94-97.

61. Martin MA, Bhatia M. Analysis of the human fetal liver hematopoietic microenvironment. Stem Cells Dev. 2005. 14(5): 493-504.

62. Miller CL, Eaves CJ. Expansion in vitro of adult murine hematopoietic stem cells with transplantable lympho-myeloid reconstituting ability. Proc. Natl. Acad. Sci. U SA. 1997. 94(25): 13648-13653.

63. Milner LA, Bigas A. Notch as a mediator of cell fate determination: evidence and speculation. Blood. 1999. 93(8): 2431-2448.

64. Milner LA, Bigas A, Kopan R, Brashem-Stein C, Black M, Berstein ID, Martin DIK. Inhibition of granulocytic differentiation by mNotchl. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. 93: 13014-13019.

65. Moloney DJ, Panin VM, Johnston SH. Fringe is a glycosyltransferase that modifies Notch. Nature. 2000. 406: 369-375.

66. Moore KA, Ema H, Lemischka IR. In vitro maintenance of highly purified, transplantable hematopoietic stem cells. Blood. 1997. 89(12): 4337-4347.

67. Moore KA, Pytowski B, Witte L, Hicklin D, Lemischka IR. Hematopoietic activity of a stromal cell transmembrane protein containing epidermal groth factor-like repeat motifs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997.94(8). 4011-4016.

68. Morrison SJ, Perez SE, Qiao Z, Verdi JM, Hicks C, Weinmaster G, Anderson DJ. Transient Notch activation initiates an irreversible switch from neurogenesis to gliogenesis by neural crest stem cells. Cell. 2000.101: 499-510.

69. Morrison SJ, Uchida N, Weissman IL. The biology of hematopoietic stem cells. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1995. 11: 35-71.

70. Murdoch B, Chadwick K, Martin M, Shojaei F, Shah KV, Gallacher L, Moon RT, Bhatia M. Wnt-5A augments repopulating capacity and primitive hematopoietic development of human blood stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. 100: 3422-3427.

71. Nagasawa T, Hirota S, Tachibana K, Takakura N, Nishikawa S, Kitamura Y, YoshidaN, Kikutani H, Kishimoto T. Defects of B-cell lymphopoiesis and bonemarrow myelopoiesis in mice lacking the CXC chemokine PBSF/SDF-1. Nature. 1996.382: 635-638.

72. Nagase T, Nakayama M, Nakajima D, Kikuno R, Ohara 0. Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. XX. The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which code for large proteins in vitro. DNA Res. 2001. 8: 85-95.

73. Nilsson SK, Dooner MS, Tiarks CY, Weier HU, Quesenberry PJ. Potential and distribution of transplanted hematopoietic stem cells in a nonablated mouse model. Blood. 1997. 89:4013-4020.

74. Nilsson SK, Dooner MS, Weier HU, Frenkel B, Lian JB, Stein GS, Quesenberry PJ. Cells capable of bone production engraft from whole bone marrow transplants in nonablated mice. J. Exp. Med. 1999. 189(4):729-34.

75. Nilsson SK, Johnston HM, and Coverdale JA. Spatial localization of transplanted hemopoietic stem cells: inferences for the localization of stem cell niches. Blood. 2001.97: 2293-2299.

76. Nye JS, Kopan R. Developmental signaling. Vertebrate ligands for Notch. Current Biology. 1995. Sep 1. 5(9). 966-969.

77. Ohno N, Izawa A, Hattori M, Kageyama R, Sudo T. dlk inhibits stem cell factor-induced colony formation of murine hematopoietic progenitors: Hes-1 -independent effect. Stem Cells. 2001. 19(1): 71-79.

78. Ordentlich P, Lin A, Shen C, Blaumueller C, Matsuno K, Artavanis-Tsakonas S, Kadesch T. Notch inhibition of E47 supports the evidence of a novel signaling pathway. Mol. Cell. Biol. 1998. 18(4): 2230-2239

79. Ornitz DM, Itoh N. Fibroblast growth factors. Genome biol. 2001. 2(3): 3001-3012.

80. Parks AL, Klueg KM, Stout JR, Muskavitch MAT. Ligand endocytosis drives receptor dissociation and activation in the Notch pathway. Development. 2000. 127:1373-1385.

81. Patt HM and Maloney MA. Bone formation and resorption as a requirement fro bone marrow development. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1972. 140: 205-207.

82. Peled A, Petit I, Kollet O, Magid M, Ponomaryov T, Byk T, Nagler A, Ben-Hur H, Many A, Shultz L, Lider O, Alon R, Zipori D, Lapidot T. Dependence of human stem cell engraftment and repopulation of NOD/SCID mice on CXCR4. Science. 1999.283:845-848.

83. Pineault N, Helgason CD, Lawrence HJ, Humphries RK. Differential expression of HOX, Miesl and Pbxl genes in primitive cells throughout murine hematopoietic ontogeny. Exp Hematol. 2002. 30: 49-57.

84. Pui JC, Allman D, Xu L Notch expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 1999. 11: 299-308.

85. Puri MC and Bernstein A. requirement for the TIE family of receptor tyrosine kinases in adult but not fetal hematopoiesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003.100: 12753-12758.

86. Qi H, Rand MD, Wu X, Sestan N, Wang W, Rakic P, Xu T, Artavanis-Tsakonas S. Processing of Notch ligand Delta by the metal loprotease Kuzbanian. Science. 1999. 283(5398): 91-94.

87. Reya T, Duncan AW, Ailles L, Domen J, Scherer DC, Willert K, Hintz L, Nusse R, Weissman IL, A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 2003. 423(6938): 409-414.

88. Robey E, Chang D, Itano A, Cado D, Alexander H, Lans D, Weinmaster G, Salmon P. An activated form of Notch influences the choice between CD4 and CD8 T cell lineages. Cell. 1996. 87(3): 483-494.

89. Robinson S, Niu T, de Lima M, Ng J, Yang H, McMannis J, Karandish S, Sadeghi T, Fu P, del Angel M, O'Connor S, Champlin R, Shpall E. Ex vivo expansion of umbilical cord blood. Cytotherapy. 2005. 7(3): 243-250.

90. Roecklein BA, Torok-Storb B. Functionally distinct human marrow stromal cell lines immortalized by transduction with the human Papilloma virus E6/E7 genes. Blood. 1995. 85(4): 997-1005.

91. Rose DM, Cardarelli PM, Cobb RR, Ginsberg MH. Soluble VCAM-1binding to alpha4 integrins is cell-type specific and activation dependent and isdisrupted during apoptosis in T cells. Blood. 2000. 95(2): 602-609.

92. Sadelain M., Lisowski L., Samakoglu S. Rivella A, May C, Riviere I.

93. Progress toward the genetic treatment of the beta-thalassemias. Ann. N Y. Acad. Sci.2005. 1054:78-91.

94. Sambrook J., Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2001.

95. Sauvageau G, Iscove NN, Humphries RK. In vitro and in vivo expansion of hematopoietic stem cells.Oncogene. 2004. 23 (43):7223-7232.

96. Schrofleld R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. Blood Cells. 1978. 4: 7-25.

97. Shawber C, Boulter J, Lindsell CE, Weinmaster G. Jagged2: A Serrate-like gene expressed during rat embryogenesis. Dev. Biol. 1996 a. 180(1): 370-376.

98. Shawber C, Nofziger D, Hsieh JJ, Lindsell C, Bogler O, Hay ward D, Weinmaster G. Notch signaling inhibits muscle cell differentiation through a CBF1-independent pathway. 1996b. 122(12):3765-3773.

99. Shen WF, Largman C, Lowney P, Corral J, Detmar K, Hauser CA, Simonovitch TA, Hack FM, Lawrence HJ Lineage-restricted expression of homeobox-containing genes in human hematopoietic cell lines. Procl. Nat. Acad. Sci USA. 1989. 86: 8536-8540.

100. Shimizu K, Chiba S, Kumano K, Hosoya N, Takahashi T, Kanda Y, Hamada Y, Yazaki Y, Hirai H. Mouse jaggedl physically interacts with notch2 and other notch receptors. Assessment by quantitative methods. J. Biol. Chem. 1999. 274(46):32961-32969.

101. Shmelkov SV, Visser JW, Belyavsky AV. Two-dimensional gene expression fingerprinting. Anal. Biochem. 2001.290(1): 26-35.

102. Shroeter EH, Kisslinger JA, Kopan R Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolitic release of intracellular domain. Nature. 1998. 393(6683): 382-386

103. Simmons PJ, Zannettino A, Gronthos S, Leavesly D. Potential adhesion mechanisms for localization of hematopoietic progenitors to bone marrow stroma. Leuk. Lymphoma. 1994.12(5-6): 353-363.

104. Slanicka KM, Nissen C, Manz CY. The membrane-bound isoform of stemcell factor synergizes with soluble flt3 ligand in supporting early hematopoietic cellsin long-term cultures of normal and aplastic anemia bone marrow. Exp. Hematol. 1998.26: 365-373.

105. Staal FJ, Clevers HC. Regulation of lineage commitment during lymphocyte development. Int. Rev. Immunol. 2001. 20(l):45-64.

106. Stein MI, Zhu J, Emerson SG. Molecular pathways regulating the self-renewal of hematopoietic stem cell. Exp. Hematol. 2004. 32 (12): 1129-1136.

107. Stier S, Cheng T, Dombrowski D, Carlesso N and Scadden DT. Notchl activation increases hematopoietic stem cell self-renewal in vivo and favors lymphoid over myeloid lineage outcome. Blood. 2002. 99: 2369-2378.

108. Struhl G, Adachi A. Nuclear access and action of notch in vivo. Cell. 1998. 93:649-660.

109. Striinkelnberg M, Bonengel B, Moda LM, Hertenstein A, Gert de Couet H, Ramos RGP and Fischbach K-F. Rst and its paralogue kirre act redundantly during embryonic muscle development in Drosophila. Development. 2001.128. 4229-4239

110. Suda T, Arai F, Hirao A. Hematopoietic stem cells and their niche. Trends in immunology. 2005.26(8): 426-433.

111. Sun X and Artavanis-Tsakonas S. Secreted forms of Delta and Serrate define antagonists of Notch signaling in Drosophila. Development. 1997. 124(17): 3439-3448.

112. Taichman RS Blood and bone: two tissues whose fates are intertwined to create the hematopoietic stem-cell niche. Blood. 2005. 105 (7): 2631-2639.

113. Taichman, RS and Emerson SG. The role of osteoblasts in the hematopoietic microenvironment. Stem Cells. 1998.16: 7-15.

114. Tamura S, Morikawa Y, Hisaoka T, Ueno H, Kitamura T, Senba E. Expression of mKirre, a mammalian homolog of Drosophila kirre, in the developing and adult mouse brain. Neuroscience. 2005.133(3):615-624.

115. Teixido J, Hemler ME, Greenberger J, Anklesaria P. Role of betal and beta2 integrins in the adhesion of human CD34 hi stem cells to bone marrow stroma. J. Clin. Invest. 1992. 90:358-367.

116. Thorsteinsdottir U, Mamo A, Kroon E, Jerome L, Bijl J, Lawrence HJ, Humphries K, Sauvageau G. Overexpression of the myeloid leukemia-associated HoxA9 gene in bone marrow cells induced stem cell expansion. Blood. 2002. 99: 121-129.

117. Varnum Finney B, Xu L, Brashem-Stein C, Nourigt C, Flowers D, Bakkour S, Pear WS, Bernstein ID. Pluripotent, cytokine-dependent, hematopoietic stem cells are immortalized by constitutive Notchl signaling. Nature Medicine. 2000. 6: 12781281.

118. Varnum-Finney B, Brashem-Stein C, Bernstein ID. Combined effects of Notch signaling and cytokines induce a multiple log increase in precursors with lymphoid and myeloid reconstituting ability. Blood. 2003.101 (5): 1784-1789.

119. Varnum-Finney B, Purton LE, Yu M, Brashem-Stein C, Flowers D, Staats S, Moore KA, Le Roux I, Mann R, Gray G, Artavanis-Tsakonas S, Bernstein ID. Blood. 1998. .91(11): 4084-4091.

120. Verfaille CM. Adhesion receptors as regulators of the hematopoietic process. Blood. 1998. 92: 2609-2612.

121. Vielle-Grosjean I, Roullot V, Courtois G. Lineage and stage-specific expression of HOX1 genes in the human hematopoietic system. Biochem Biophys. Res. Commun. 1992. 183:1124-1130.

122. Visnjic D. Kalajzic I, Gronowicz G, Aguila HL, Clark SH, Lichtler AC, Rowe DW. Conditional ablation of the osteoblast ineage in Col2.38k transgenic mice. J. Bone Miner.Res. 2001.16:2222-2231.

123. Visnjic D, Kalajzic I, Rowe DW Katavic V, Lorenzo J, Aguila HL. Hematopoiesis is severely altered in mice with an induced osteoblast deficiency. • Blood. 2004. 103:3258-3264.

124. Walker L, Carlson A, Tan-Pertel HT, Weimaster G, Gasson J. The Notch receptor and its ligands are selectively expressed during hematopoietic development in the mouse. Stem Cells. 2001. 19: 543-552

125. Walker L, Lynch M, Silverman S. The Notch/Jagged pathway inhibits proliferation of human hematopoietic progenitors in vitro. Stem Cells. 1999. 17: 162171.

126. Washburn T, Schweighoffer E, Gridley T, Chang D, Fowlkes BJ, Cado D, Robey E. Notch activity influences the ab versus gd T cell lineage decision. Cell. 1997. 88: 833.

127. Weisel KC, Moore MA. Genetic and functional characterization of isolated stromal cell lines from the aorta-gonado-mesonephros region.Ann. N Y. Acad. Sci. 2005. 1044: 51-1049.

128. Wharton KA, Johansen KM, Xu T Nucleotide sequence from the neurogenic locus implies a gene product that shares homology with proteins containing EGF repeats. Cell. 1985.43 (3): 567-581.

129. Willert K, Brown JD, Danenberg F., Duncan AW., Weismann IL., Reya T., Yates JR., Nusse R. Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors. 2003. 423(6938):448-452.

130. Wilson A and Trumpp A. Bone marrow haematopoietic stem-cell niches. Nature reviews. Immunology. 2006. 6: 93-106.

131. Wittenberger T, Steinbach OC, Authaler A, Kopan R, Rupp RAW. MyoD stimulates Delta-1 transcription and triggers Notch signaling in the Xenopus gastrula. The EMBO J. 1999. 18(7): 1915-1922.

132. Wsahburn T, Schweighoffer E, Gridley T Notch activity influences the alphabeta versus gammadelta T cell lineage decision. Cell. 1997. 88: 833-843

133. Xie T, Sprandling AC. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. 2000. 290: 328-330.

134. Yan XQ, Lacey DL, Saris C. Ectopic overexpression of c-mpl by retroviral-mediated gene transfer suppressed megakaryopoiesis but enhanced erythropoiesis in mice. Exp Hematol. 1999. 27:1409-1417.

135. Yun TJ, Bevan MJ. Notch-regulated ankyrin-repeat protein inhibits Notch 1 signaling: multiple Notchl signaling pathways involved in T cell development. J Immunol. 2003.170(12):5834-5841.

136. Zhang J, Niu C, Ye L, Huang H, He X, Tong WG, Ross J, Haug J, Johnson T, Feng JQ, Harris S, Weidemann LM, Mishina Y, Li L. Nature. 2003. 425:836-841.

137. Zhang X-B, Beard BC, Trobridge G, Hackman R, Bryant E, R. Humphries K., Kiem H-P. Development of Leukemia after HOXB4 Gene Transfer in the Canine Model.Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), 2006. 108: 204.

138. Zinovyeva MV, Zijlmans JM, Fibbe WE, Visser JW, Belyavsky AV. Analysis of gene expression in subpopulations of murine hematopoietic stem and progenitor cells. Exp Hematol. 2000. 28:318-334

139. Zweifel ME, Leahy DJ, Barrick D Structure and Notch receptor binding of the tandem WWE domain of Deltex. Structure. 2005.13(11): 1599-1611.

140. Zhang X-B, Schwartz JL, Humphries RK, Kiem H-P. Effects of HOXB4 overexpression on ex vivo expansion and immortalization of hematopoietic cells from different species. Stem cells. 2007.25:2074-81.

Информация о работе

Розов, Федор Николаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Jedi и другие гены, участвующие в регуляции дифференцировки и самоподдержания стволовых и прогениторных клеток крови - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы